CN103018457A

CN103018457A - 一种人类pmscs体外免疫调控淋巴细胞分子机制的检测方法

Info

Publication number: CN103018457A
Application number: CN 201210506446
Authority: CN
Inventors: 徐杰; 房文峰; 朱爱华
Original assignee: 吴卫江
Priority date: 2012-12-02
Filing date: 2012-12-02
Publication date: 2013-04-03

Abstract

本发明提出一种人胎盘来源的MSCs体外表现为抑制T细胞活性及增殖作用机制的检测方法。鉴于协同共刺激分子在T细胞活化增殖中所起的重要作用，本发明大胆推测胎盘来源的MSCs体外表现出对T细胞负性调控作用可能系其高表达负性协同刺激分子PD-L1有关，首先通过实验验证PMSCS对活化T细胞具有明显抑制作用，再以负性协同刺激分子PD-L1为切入点，通过流式细胞仪检测、免疫荧光染色、3H-TdR掺入法、ELISA等实验分析PD-L1在PMSCS介导的T细胞体外增殖抑制作用中所扮演的角色，从而验证PD1-PD-L1分子通路是PMSCS体外调节T细胞免疫耐受的主要信号机制。

Description

一种人类PMSCS体外免疫调控淋巴细胞分子机制的检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术及免疫学领域，特别涉及一种人类PMSCS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法。

背景技术

协同共刺激分子在T淋巴细胞的活化增殖中起到很重要的作用。“协同刺激信号”是1970年由Bretseher和Cohn在T细胞活性双信号模型的基础上提出的，

即除了通过APC递呈MHC处理过的抗原给抗原特异性T细胞提供第一个信号外，还需协同刺激分子作为辅助信号的协同作用，达到生理活化阈值后才能使T细胞产生正常的免疫调节机制。如果缺乏协同共刺激分子的第二信号，将会导致调节性T细胞的无反应性或特异性免疫耐受。B7家族是唯一能从APC单向传送信号至T细胞的协同共刺激分子，PD-L1是B7家族一个重要的负性协同刺激分子，抑制T细胞的活化增殖，在机体免疫应答中发挥了重要的调节作用。

以往的实验已经验证了PMSCS低表达HLA-DR，并对活化的T细胞具有抑制作用，但PMSCS是否表达与T细胞活化或抑制相关的协同刺激分子以及其中的机理，未见相关的文献报道。以负性协同刺激分子PD-L1为切入点，通过流式细胞仪检测、免疫荧光染色、³H-TdR掺入法、ELISA等实验分析PD-L1在PMSCS介导的T细胞体外增殖抑制作用中所扮演的角色，从而验证PD1-PD-L1分子通路是PMSCS体外调节T细胞免疫耐受的主要信号机制。

发明内容

本发明提出一种人类PMSCS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，首先在体外分离及培养人PMSCS,应用免疫荧光染色方法检测PMSCS表面负性协同刺激分子PD-L1的表达，通过PD-L1mAb阻断实验，PMSCS与T细胞体外共培养观察T细胞增殖及细胞周期、细胞因子分泌情况等证实其对T淋巴细胞的抑制作用及内在的分子机制，整个验证过程将包括如下步骤:

S1：PMSCS分离培养与鉴定；取足月剖腹产胎儿的胎盘(按医院规定，并经家属同意)，取胎盘胎儿面的蜕膜组织，用HankS冲洗3次，去除血迹，将胎盘组织剪成1mm³,-一2mm³碎片，加入0．1％Ⅳ型胶原酶，37℃水浴消化30min，用DMEM中和并充分吹打，过100目筛网、研磨、收集细胞悬液，以1200rpm／min离心5min，加入完全培养基(含L-DMEM，10％FBS)，置于37℃、5％C02、饱和湿度的C02培养箱培养，每3-4d进行换液，待细胞生长铺满至瓶底80％-90％时传代，以后按常规方法传代、冻存。培养三代以后的细胞用于实验。用于实验之前的细胞进行流式细胞仪检测细胞表型，先将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS液调整细胞浓度为1x10⁶／ml。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29．FITC、CD34一FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE、置4°C孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。

S2：免疫荧光染色法检测PMSCS中PD-L1表达；将以多聚赖氨酸处理的盖玻片置于六孔培养板中，取3代以后的细胞种于此六孔板中。1～2d后吸取培养基，加入4％的多聚甲醛固定细胞，用PBS冲洗后，加入抗人PD-L1mAb后置于湿盒中4°C过夜，冲洗后再加入PE荧光二抗，置室温1h，最后加入Hoechst33258五分钟。用50％甘油封片，用荧光显微镜观察。

S3：PD-L1mAb阻断PMSCS对T细胞增殖的抑制作用检测；将3代后的PMSCs用丝裂霉素(10ng／ml)处理，PBS洗三遍，接种于96孔板中1x10⁴／孔，每孔加入T细胞1x10⁵／孔，同时加入PHA(50μg／ml)，实验分为8组：T、T+PHA、T+PHA+PMSCs、T+PHA+PMSCs+antiPDL1、T+PHA+PMSCs+mlgG组；PBMC1、PBMC2、PBMC1+PBMC2、PBMC1+PBMC2+PMSCs、PBMC1+PBMC2+PMSCs+PD-L1、PBMC1+PBMC2+PMSCs+mlgG将细胞于37°C、5％C02条件下培养72h。在结束前18h加入³H-TdR(1μCi／孔)，收集细胞，用β液体闪烁计数仪检测cpm值，根据cpm值的大小，进行分析比较。

S4：PMSCS与T细胞体外共培养及PD-L1阻断实验；取三代后的PMSCs，用10ug／ml的丝裂霉素处理1h，胰酶消化，洗涤5遍，用含

有10％FBS的LG-DMEM完全培养基调整浓度为1．0×10⁵／孔，接种于24孔培养板中。接种T细胞7x10⁶／ml，加入PHA(30μg／ml)或和PD-L1mAb(10μg／ml)同时加入。实验分组为T、T+PMSCs、T+PHA+PMSCs、T+PHA+PMSCs+PD-L1、

T+PHA+PMSCs+mlgG、PMSCs。24h后观察细胞形态。

S5：T细胞活性早期标志CD69的检测；24h后收集各组细胞，调整细胞密度，加入CD4-FITC、CD69-PE表记的抗体，进行双标。4°C避光，30分钟，PBS洗两遍，上机检测。

S6：PMSCS对活化T细胞周期影响的检测；收集上述细胞，PBS洗涤后，70％酒精固定过夜。PBS洗三遍，加入细胞周期染液(PI50μg／ml、RNA酶50μg／ml)0．5ml，37°C孵育30min，流式细胞仪分析。

S7：PMSCS对活化T细胞细胞因子分泌影响的检测；将上述细胞上清收集并分装保存，-20℃～-80℃保存待检。IFN-γ、IL-10的检测采用ELISA法，步骤按照试剂盒说明书操作。

所述实验流程中所使用的人外周血T淋巴细胞分离纯化的步骤具体如下：

取健康人外周血(血样来自自愿者)用淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞，贴壁2h后，吸出富集的T细胞，再经磁珠分选纯化。纯化后的T细胞纯度达95％以上。

本发明以免疫调控信号机制作为出发点，对PMSCS在体外所表现出来的免疫抑制特性其内在的分子机制作了探讨，从而成功地明确了负性协同刺激分子PD-L1—PD1分子信号通路是主要的调控位点，该发明为进一步深入探讨机体的复杂免疫调控网络提供了很好的线索。

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：

图1为人类PMSCS体外培养形态的显微放大图；

图2为流式细胞仪测定PMSCS表面协同刺激分子的表达情况；

图3为PD-L1mAb部分阻断PMSCS对T细胞增殖的抑制效应；

图4为PD-L1mAb部分逆转PMSCS对MLR中T细胞增殖的抑制作用；

图5为PD-L1mAb部分逆转PMSCS对T细胞活化增殖的抑制效应；

图6为PD-L1mAb部分逆转PMSCS对活化T细胞周期的阻滞；

图7为PD-L1mAb调节PMSCS对T细胞体外细胞因子的分泌；

图8为整个实验验证过程流程示意图；

具体实施方式

本发明的一种人类PMSCS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，其研究目的是进一步了解人类胎盘来源间充质细胞免疫调控能力及其可能的效应机制，为该技术最终应用于临床、拓展其临床应用适应症提供理论依据。

本实验采用的材料和设备包括倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、CO2培养箱(法国Jouan公司)、恒温离心机(法国Jouan公司)、流式细胞仪(美国Beckman．Coulter公司)、培养瓶和培养板(美国Cotingcostar公司)、β液体闪烁计数仪(瑞典Pharmacia，Uppsala公司)、LG—DMEM培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，DMEM(Gibco公司)，鼠抗人PD1、CD80、CD83、CD86、CD4、CD69克隆抗体(eBioscienee公司)，鼠抗人B7H3mAb、PD-L1mAb。(苏大研究所研制)，(sigma公司)，PI(sigma公司)，IL一2ELISA试剂盒(R&D公司)，IFN一7ELISA试剂(R&D公司)，IL一10ELISA试剂盒(R&D公司)，兔抗鼠PE荧光二抗(上海业力生物科技有限公司)、³H-TdR(中国科学院原子能研究所)，Hoechst33258(Sigma公司)。

PMSCS分离培养与鉴定；取足月剖腹产胎儿的胎盘(按医院规定，并经家属同意)，取胎盘胎儿面的蜕膜组织，用Hanks冲洗3次，去除血迹，将胎盘组织剪成1mm³-一2mm³碎片，加入0．1％Ⅳ型胶原酶，37℃水浴消化30min，用DMEM中和并充分吹打，过100目筛网、研磨、收集细胞悬液，以1200rpm／min离心5min，加入完全培养基(含L-DMEM，10％FBS)，置于37℃、5％C02、饱和湿度的C02培养箱培养，每3-4d进行换液，待细胞生长铺满至瓶底80％-90％时传代，以后按常规方法传代、冻存。培养三代以后的细胞用于实验。用于实验之前的细胞进行流式细胞仪检测细胞表型，先将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS液调整细胞浓度为1x10⁶／ml。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29-FITC、CD34一FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE、置4°C孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。

PD-L1mAb阻断PMSCS对T细胞增殖的抑制作用检测；将3代后的PMSCs用丝裂霉素(10ng／ml)处理，PBS洗三遍，接种于96孔板中1x10⁴／孔，每孔加入T细胞1x10⁵／孔，同时加入PHA(50μg／ml)，实验分为8组：T、T+PHA、T+PHA+PMSCs、T+PHA+PMSCs+antiPDL1、T+PHA+PMSCs+mlgG组；PBMC1、PBMC2、PBMC1+PBMC2、PBMC1+PBMC2+PMSCs、PBMC1+PBMC2+PMSCs+PD-L1、PBMC1+PBMC2+PMSCs+mlgG将细胞于37°C、5％C02条件下培养72h。在结束前18h加入³H-TdR(1μCi／孔)，收集细胞，用β液体闪烁计数仪检测cpm值，根据cpm值的大小，进行分析比较。

实验结果分析：

PMSCS培养结果：原代培养的胎盘细胞首次换液后，出现形如鹅卵石状组织贴壁，一周后可见梭形细胞呈单个散在存在、多个细胞呈集落样或与其它圆形、扁平形、多边形等细胞交织呈混杂性集落生长，梭形细胞生长缓慢，经13次换液后，混杂细胞脱落，留下形态均一的梭形细胞，第15d，梭形细胞增殖加快，至25-35d，原代细胞可铺满瓶底达80％以上。经胰酶消化，传代细胞在12h内完全贴壁、伸展，呈长梭形。骨髓经分离培养48h首次换液后，可见有散在行成集落的细胞贴壁，5d后细胞增殖速度加快，一般约15d后细胞可铺满板底达80％以上。

PMSCS表型分析：流式细胞仪检测结果显示PMSCs不表达CD80、CD83、CD86等协同刺激分子，PMSCs高表达PD-L1。

PMSCs对T细胞的体外增殖抑制作用及其PD-L1表达的相关性：PMSCs对T细胞体外均有增殖明显的抑制作用(P<0．05)。而在有PD-L1mAb的阻断作用条件下，可部分逆转PMSCs阻断T细胞体外增殖的抑制效应(P<0．05)；同样在混合淋巴反应实验中，显示了在有PD-L1mAb的阻断作用下，可部分逆转MLR中的T细胞在PMSCs的抑制作用。

PD-L1mAb部分逆转PMSCS对活化T细胞周期的阻滞作用：用流式细胞术检测在有PMSCs存在的情况下，对PHA激发的T细胞周期进行分析。结果显示，当T细胞被PHA所激发时G0／G1期细胞数明显下降，S期细胞数上升；当PMSCs与被PHA活化的T细胞共培养时，G0／G1期细胞数上调，S期细胞数下调；而在PD-L1mAb作用下，它能减弱PMSCs对T细胞周期的抑制作用。

PD-L1mAb调节PMSCS对T细胞体外细胞因子的分泌作用：ELISA法检测PHA作用下，活化T细胞在PMSCs存在下，并在antiPD-L1mAb抑制作用下，细胞的培养上清中的IFN-γ的含量结果显示，24小时后各组细胞上清的IFN-γ水平也有显著性差异变化：在PHA作用下活化T的细胞分泌，IFN-γ的分泌量明显升高为430pg／ml，当PMSCs存在时，细胞因子IFN-γ量继续增高，上升至895pg／ml。当用抗体PD-L1阻断时，IFN-γ,分泌量下降至503pg／ml，但是比活化T细胞量还要略高。同时PMSCs自身也分泌部分IFN-γ，分泌量为86pg／ml。在不同时相的检测结果显示，各组的IFN-γ随着时间增加，分泌量增加。IL-10检测结果显示，PMSCs与PHA激发T细胞共培养体系中IL-10分泌量上调至130pg／ml，与无PMSCs存在时363pg／ml相比具有显著性差别，而当抗体PD-L1阻断时，IL-10分泌下降，分泌量为176pg／ml，但还是比单纯活化T细胞的分泌IL-10的量略高。在不同时相的检测结果显示，各组IL-10随着时间增加，分泌量有所下降。由此提示胎盘源MSCs表达的负性协同刺激分子PD-L1参与了PMSCs负性免疫调节作用。

本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。

Claims

1.一种人类PMSCS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，其包括下述步骤：

S1：PMSCS分离培养与鉴定；

S2：免疫荧光染色法检测PMSCS中PD-L1表达；

S3：PD-L1mAb阻断PMSCS对T细胞增殖的抑制作用检测；

S4：PMSCS与T细胞体外共培养及PD-L1阻断实验；

S5：T细胞活性早期标志CD69的检测；

S6：PMSCS对活化T细胞周期影响的检测；

S7：PMSCS对活化T细胞细胞因子分泌影响的检测。

2.如权利要求1所述的一种人类PMSCS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，其中所述步骤1PMSCS的分离及培养过程如下：取足月破腹产胎儿的胎盘，取胎儿面的蜕膜组织，机械分散后用胶原酶消化，100目筛网过滤后形成单细胞悬液，离心后加入全培养基，37℃,5%CO₂条件下静置培养，待细胞生长铺满瓶底80%-90%时进行传代，培养三代后的细胞用于实验。

3.如权利要求1所述的一种人类PMSCS体外免疫抑制作用分子机制的检测方法，其中所述步骤3开始使用的人外周血T淋巴细胞的分离纯化方法如下：取健康人外周血用淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞，贴壁后吸出富集的T细胞，再经磁珠分选纯化，纯化后的T细胞纯度达到95%以上。