CN105505860B - 一种食管上皮干细胞的分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤为：首先，取食管黏膜组织及附着的上皮，去除肌肉组织，取黏膜上皮组织的基底层并剪成碎片，消化离心，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；然后，加入添加有HEPES、碳酸氢钠、L‑谷氨酸、FBS、EGF、胰岛素、氢化可的松、霍乱弧菌毒素、转铁蛋白、BPE、类维生素A、细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham’s F‑12培养液；最后，将含有细胞悬液的培养瓶、培养板或培养皿放入37℃孵箱中培养，10～14天即可形成单层上皮干细胞。本发明操作简便，安全性好，分离得到食管上皮干细胞，干细胞的活性高，在组织工程和再生医学领域应用前景良好。

Description

一种食管上皮干细胞的分离培养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，涉及干细胞分离培养技术，尤其是涉及一种食管上皮干细胞的分离培养方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)和成体干细胞(Adult Stem Cells, ASCs)。胚胎干细胞的增殖与分化是构成个体发育的基础，由单个的受精卵发育成具备各种组织器官的个体；而成体干细胞可进一步分化为复杂的组织器官，其研究几乎涉及所有的生命科学和生物医药领域，具有光明的发展前景。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞 (Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞是机体生长和发育的起源细胞，具有持久自我更新、高度增殖分裂、多向分化潜能和对疾病损伤具有反应能力的细胞群体。由于其独特的生物学特性和功能，使之成为生命科学和生物医药领域最引人注目的研究热点之一。
食管的黏膜上皮是由一群复杂而有高度组织化的未角化复层扁平上皮排列而成。食管上皮可分为两个带：一是基底带，包括几层小的嗜碱性细胞，另一是分化带，包括多层规则排列的分化的鳞状上皮。基底带中贴紧基底膜的一层细胞称为基底层，覆盖其上的数层称上皮基底层。在解剖学上基底层可以进一步的分为两种成分：一种是扁平的称乳头间基底层（the interpapillary basal layer，IBL），另一种是覆盖在乳头表面的，称乳头基底层（the papillary basal layer，PBL）。只有基底带的细胞才有分化能力，并且这种分化是以细胞从基底层移向食管腔面完成的，细胞的迁移、分化起始与分化标志物的表达结果有关。相对于IBL，PBL中的细胞分裂是比较均匀的，可产生2个子细胞紧贴基底膜，相反地，在IBL中细胞分裂本质上是不均匀的，其细胞分裂主要发生于基底膜的右角，产生一个停留于基底层的子细胞及一个进入基底上层的子细胞。因此，IBL中的细胞就相当于食管上皮干细胞。
研究表明，人食管上皮细胞的原代培养方法研究较多，但目前未有研究食管上皮干细胞分离培养方法的报道。食管上皮干细胞具有旺盛的增殖分化能力，在维持食管粘膜屏障结构、功能的完整性、以及食管粘膜的损伤修复中起着至关重要的作用。而食管干细胞培养方法的建立，对于研究食管粘膜的增生与分化细胞以及食管肿瘤的发生发展具有重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种食管上皮干细胞的分离培养方法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种食管上皮干细胞的分离培养方法，其包括以下步骤：
步骤1、取食管黏膜组织及附着的上皮，去除肌肉组织，取黏膜上皮组织的基底层并将其剪成碎片，消化离心，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中；
步骤2、加入添加有10～20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（HEPES）、2～5mmol/L碳酸氢钠、2～5mmol/L L-谷氨酸、体积分数2～5％的胎牛血清（FBS）、20～30ng/mL人表皮生长因子（EGF）、3～6mg/mL胰岛素、50～150mmol/L氢化可的松、0.05～0.2mg/mL霍乱弧菌毒素、4～6mg/mL转铁蛋白、20～40mg/mL牛垂体提取物(BPE)、0.01～0.02mmol/L类维生素A、8～25mmol/L细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham’s F-12培养液；
步骤3、将含有细胞悬液的培养瓶、培养板或培养皿放入37℃孵箱中培养，2～3天可见到细胞贴壁，之后隔天更换一次培养液以去除杂质细胞的影响，10～14天即可形成单层上皮干细胞。
上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤1中，消化的方法是：将碎片加入含有0.1～0.3%胶原酶I 型、0.1～0.3%链酶蛋白酶和0.5～1.0mg/ml脱氧核糖核酸酶I的Ham’s F12-DMEM 1/1溶液中，37℃恒温消化2～4h，离心后过滤，即得细胞。
进一步地，上述的Ham’s F12-DMEM 1/1溶液中，还含有10～20mg/ml牛血清蛋白（BSA），以保护细胞免受机械和酶作用的损伤，还有去毒化的作用。
上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤1中，包被在培养瓶上的基质为胶原酶、牛血清白蛋白中的一种或两种组合。
上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤1中，培养瓶、培养板或培养皿包被的方法为：加入含0.1～0.5mg/mL牛血清白蛋白（BSA ）和/或30～50ug/mL胶原酶Ⅰ的EBSS培养液，完全覆盖培养瓶、培养板或培养皿底部即可，在37℃恒温孵箱中孵育1～2 小时，孵育完后吸弃培养液，用无菌 PBS清洗3～5次。由于包被的基质中含有胶原酶和蛋白等成分，能促进干细胞较快地贴壁和生长。
上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤2的培养液中，细胞信号通路抑制剂含有：浓度为 5～10mM的ROCKi、浓度为 1～5mM 的TGF-β抑制剂A83-01、浓度为1～5mM的BMP抑制剂DMH1、浓度为1～5mM的GSK抑制剂CHIR99021。
上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤2的培养液中还含有抗生素，抗生素为0.25～0.5mg/mL两性霉素B和200～400mg/mL青霉素/链霉素液。
上述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其步骤2中的培养液中添加有12～16mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（HEPES）、3～4.5mmol/L碳酸氢钠、3～4.5mmol/LL-谷氨酸、体积分数2～4％的胎牛血清（FBS）、23～27ng/mL人表皮生长因子（EGF）、4～5.5mg/mL胰岛素、70～130mmol/L氢化可的松、0.1～0.18mg/mL霍乱弧菌毒素、4.5～5.5mg/mL转铁蛋白、25～35mg/mL牛垂体提取物(BPE)、0.01～0.02mmol/L类维生素A、10～20mmol/L细胞信号通路抑制剂。
一种食管上皮干细胞的分离培养液，其为添加有10～20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（HEPES）、2～5mmol/L碳酸氢钠、2～5mmol/L L-谷氨酸、体积分数2～5％的胎牛血清（FBS）、20～30ng/mL人表皮生长因子、3～6mg/mL胰岛素、50～150mmol/L氢化可的松、0.05～0.2mg/mL霍乱弧菌毒素、4～6mg/mL转铁蛋白、20～40mg/mL牛垂体提取物(BPE)、0.01～0.02mmol/L类维生素A、8～25mmol/L细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham’s F-12培养液。
上述的食管上皮干细胞的分离培养液中，细胞信号通路抑制剂含有：浓度为 5～10mM的ROCKi、浓度为 1～5mM 的TGF-β抑制剂A83-01、浓度为1～5mM 的BMP抑制剂DMH1、浓度为1～5mM的GSK抑制剂CHIR99021。
上述的食管上皮干细胞的分离培养液中，其还含有抗生素，抗生素为0.25～0.5mg/mL两性霉素B和200～400mg/mL青霉素/链霉素液。
由于采用如上所述的技术方案，本发明具有如下优越性：
由于人食管上皮组织分离获得的干细胞数量较少，易分化和凋亡亦将导致细胞死亡，因此食管干细胞原代培养较难获得成功。本发明通过对细胞信号通路抑制剂和培养液的成分及用量的合理选择和配合，分离培养得到了原代食管干细胞，培养液利用微量成分相辅相成、综合作用，具有促进干细胞增殖和分裂，利于细胞贴附及抑制间质细胞的干扰，细胞信号通路抑制剂能够促进干细胞增殖，抑制多向分化潜能，延续细胞活性，稳定遗传。
本发明的分离方法，其操作简便，安全性好，分离得到食管上皮干细胞，干细胞的活性高，在组织工程和再生医学领域应用前景良好。
附图说明
图1是人体正常食管干细胞成功培养的细胞形态和生物标记的鉴定；图中，A为人体正常食管上皮干细胞在P12的明视野图像，左侧是100x放大，右侧是200x放大，左、右侧的scale bar分别为100 mM和50mM；B为人体正常食管上皮干细胞（P12)的荧光免疫图片，分别显示了表达P63、SOX2 、CK5等常规食管干细胞的表达因子，scale bar为50mM；
图2是小鼠正常食管干细胞成功培养的细胞形态和biomarker的鉴定；图中，A为小鼠正常食管干细胞在P2和P20的明视野图像，scale bar为100mM；B为小鼠正常干细胞（P12)的荧光免疫图片，分别显示表达P63、SOX2、CK5常规食管干细胞的表达因子，scale bar为50mM；
图3是多次传代后小鼠正常食管干细胞的分化功能鉴定；图中，A为分化组织的H&E图片；B为荧光免疫图片，显示了分化组织具有正常的生物分化标记P63和CK13，scale bar为20 mM。
具体实施方式
参照以下实施例可以对本发明作进一步详细说明；但是，以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1
人食管上皮干细胞的分离培养与鉴定
1.1 分离培养
(1)、取材：无菌条件下切除69岁男性的弃置的食管正常上皮组织，置于内含青霉素l00 ug /mL和链霉素100 ug/mL的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）/生理盐水溶液的无菌管内，立即带回实验室；
(2)、分离：用含200μg/mL青霉素/链霉素的 PBS 冲洗食管上皮组织 3～5遍，并去除出血组织、坏死组织及纤维血管组织；在超净工作台下，用无菌眼科剪、眼科镊将组织修剪成0.5～1mm3的小块，而后加入含有0.1%胶原酶I 型、0.1%链霉蛋白酶和0.5mg/ml脱氧核糖核酸酶I的消化液的离心管中，再将离心管放入37℃培养箱恒温消化2h，之后消化混合液通过200目细胞筛过滤后离心，1000rpm离心5min后弃上清，收集细胞沉淀。
(3)、将细胞铺于包被过的培养瓶/培养皿中，培养瓶/培养皿在使用前先用含0.1mg/mL BSA 和30ug/mL胶原酶Ⅰ的 EBSS培养液包被2.5小时，吸弃培养液，无菌PBS清洗3次。
(4)、并添加含有15 mmol/L HEPES、3.6 mmol/L碳酸氢钠、4 mmol/L L-谷氨酸、体积分数2％的FBS、20ng/mL EGF、3mg/mL胰岛素、60mmol/L 氢化可的松、0.1mg/mL霍乱弧菌毒素、4mg/mL转铁蛋白、20mg/mL BPE、0.01mmol/L类维生素A、5mmol/L的ROCKi、1mmol/L 的TGF-β抑制剂A83-01、2mmol/L 的BMP抑制剂DMH1、1mmol/L的GSK抑制剂CHIR99021的DMEM/Ham’s F-12培养液。
(5)、将含有细胞悬液的培养瓶/培养皿放入37℃孵箱中培养，每天观察细胞生长情况，并拍照记录，通常干细胞2～3天即可贴壁，10～14天可形成单层上皮干细胞。
(6)、以后每天观察细胞生长情况和培养液的颜色变化，同时观察培养液是否有污染，每2～3天换液一次，以满足细胞生长所需的营养。
1.2 鉴定：
对分离培养得到的干细胞进行鉴定：包括形态学鉴定和功能鉴定。
(1)、形态学鉴定
在倒置显微镜下观察细胞的形态结构。
(2)、免疫荧光鉴定干细胞Biomarker
制备细胞爬片，细胞长满至70％～80％融合时取出，用4％多聚甲醛固定20min，然后用含0.3％Triton X-100的PBS透化10min，并用含有5％牛血清白蛋白的PBS溶液中止反应，然后在4℃一抗过夜，PBS洗涤3次后，在室温下细胞孵育二抗1h。细胞核用DAPI 染色。
实验中使用的抗体如下：山羊抗Sox2 多克隆抗体 (R&D公司)，兔抗 P63多克隆抗体 (Genetex公司)，鼠抗P63多克隆抗体 (Santa Cruz公司)，兔抗 CK5多克隆抗体 (abcam公司)，鼠抗CK5单克隆抗体 (DAKO公司)，鼠抗CK13单克隆抗体 (Thermo公司)，用奥林巴斯ix81倒置荧光显微镜观察记录。
2. 实验结果
(1)、细胞形态观察所示：
人体正常食管干细胞从无任何病变的食管组织中提取，细胞在含有细胞信号通路抑制剂的培养液中传代培养，细胞传代比例为1：10。
如图 1中的A 图片所示，人体正常食管干细胞在P12的明视野图像，左侧是100x放大，右侧是200x放大。在倒置相差显微镜下，贴壁细胞呈细小梭形状，即典型的上皮细胞形态。
(2)、免疫荧光结果显示：
如图 1中的B 图片所示，人体正常食管干细胞（P12) 的免疫荧光图片，图片显示本发明分离得到的细胞表达P63、SOX2常规食管干细胞的标记物。
实验结果说明，本发明的分离培养方法可以分离培养得到的是正常食管干细胞。
实施例2
小鼠食管上皮干细胞的分离培养与鉴定
1. 细胞分离培养
所有的动物研究完全按照实验级动物标准执行。从小白鼠取出正常食管组织，用含有抗生素的PBS 冲洗3次。无菌条件下，用无菌眼科剪、眼科镊将食管组织中的出血组织和坏死组织去除，并剪碎成0.5～1mm3的小块，而后加入含有0.1%链霉蛋白酶和0.5 mg/ml脱氧核糖核酸酶 I的消化液的离心管中。37℃恒温消化3h，过滤离心，收集细胞沉淀。
将细胞用培养液重悬置于铺有包被溶液的培养瓶/培养皿中卧式培养，培养瓶/培养皿在使用前先用含0.3mg/mL BSA和40ug/mL胶原酶Ⅰ的 EBSS培养液包被2小时，吸弃培养液，无菌PBS清洗5次。
添加含有20 mmol/L HEPES、4.5 mmol/L碳酸氢钠、5 mmol/L L-谷氨酸、体积分数5％的FBS、25ng/mL EGF、5mg/mL胰岛素、100mmol/L 氢化可的松、0.15mg/mL霍乱弧菌毒素、6mg/mL转铁蛋白、30mg/mL BPE、0.02mmol/L类维生素A、5mmol/L的ROCKi、1mmol/L 的TGF-β抑制剂A83-01、1mmol/L 的BMP抑制剂DMH1、1mmol/L的GSK抑制剂CHIR99021的DMEM/Ham’sF-12培养液。
将含有细胞悬液的培养瓶/培养皿放入37℃孵箱中培养，每天观察细胞生长情况，并拍照记录，通常干细胞2～3天即可贴壁，10～14天可形成单层上皮干细胞。干细胞长满瓶壁，胰酶消化离心按照1:10的比例传代。
对分离培养得到的干细胞进行鉴定：包括形态学鉴定和功能鉴定。
2、检测
2.1 形态学和免疫荧光检测
(1)、形态学观察
在荧光倒置显微镜下观察不同代数食管干细胞的形态结构。
(2)、免疫荧光鉴定干细胞生物标志物
用4％多聚甲醛固定20min，然后用含0.3％TritonX-100的PBS透化10min，并用含5％牛血清白蛋白的PBS溶液中止反应，然后在4℃下过夜温育初级抗体，在PBS中洗涤3次后，细胞与二次抗体在室温下孵育1小时。细胞核都经 DAPI染色。
实验中使用的抗体如下：山羊抗Sox2 多克隆抗体 (R&D公司)，兔抗 P63多克隆抗体 (Genetex公司)，鼠抗P63多克隆抗体 (Santa Cruz公司)，兔抗 CK5多克隆抗体 (abcam公司)，鼠抗CK5单克隆抗体 (DAKO 公司)，鼠抗CK13单克隆抗体 (Thermo公司)，用奥林巴斯ix81倒置荧光显微镜观察和拍照。
(3)、Transwell实验鉴定干细胞的分化功能
用含0.1mg/mLBSA和30ug/mL胶原酶Ⅰ的EBSS培养液和2% Growth Factor Reduced（GFR）Matrigel基底膜基质混合液过夜包被0.4mM Transwell膜。第二天去除包被液，并将Transwell 膜晾干。将消化后的食管上皮干细胞以>6000 cells/mm2的密度铺于膜，在细胞贴壁12h后，移除多余细胞，剩余的细胞用完全Pneumacult-ALI 培养液进行预处理，并充满上下小室。第二天ALI培养液仅仅加在下层小室用于启动气道液体接口，然后每天换液直到出现分化。为了标记分化markers，在室温下用4% PFA固定细胞10min，然后用PBS+0.2%Triton冲洗和透化。细胞膜是用全量染色或在OCT下用4～7mm冷冻/石蜡块包埋。
3、结果：
(1)、细胞培养形态学观察结果：
小鼠正常食管干细胞从B57-C6小鼠中分离提取并在含有细胞信号通路抑制剂的培养液中传代培养，细胞传代比例为1：10。
如图 2中的A 图片所示，小鼠正常食管干细胞在P2和P20的明视野图像。贴壁细胞呈细小梭形状，为典型的上皮细胞形态。以集落生长，可正常生长至P20代，这说明食管干细胞的增殖能力很强。
(2)、免疫荧光结果显示：
如图2中的B图片所示，小鼠正常食管干细胞（P12)的免疫荧光图片，显示其表达常规食管干细胞marker P63、SOX2、CK5。
(3)、Transwell实验结果显示：
如图3中的A图片所示：小鼠正常干细胞（P12)分化组织的H&E图片；如图 3中的B图片所示：荧光免疫颜色显示分化组织具有正常的分化biomarker P63、SOX2、CK5。这说明传代培养的小鼠食管干细胞具有正常的分化功能。在体外适当的分化方法和条件下，能够产生类似于体内食管组织相似的3维结构。
实验结果证明，本发明分离培养的细胞具有上皮细胞形态，并表达干细胞标记物，在体外适当的分化方法和条件下，能够向食管组织结构分化。证实了本发明方法可分离培养得到的是正常食管干细胞，无论是人还是小鼠等物种都可以通过此法获得正常食管干细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种食管上皮干细胞的分离培养方法，其特征是：其包括以下步骤：
步骤1、取食管黏膜组织及附着的上皮，去除肌肉组织，取黏膜上皮组织的基底层并将其剪成碎片，将碎片加入含有0.1～0.3％胶原酶I型、0.1～0.3％链酶蛋白酶和0.5～1.0mg/ml脱氧核糖核酸酶I的Ham’s F12-DMEM 1/1溶液中，37℃恒温消化2～4h，过滤后离心，即得细胞，将获得的细胞铺于包被有基质的培养瓶、培养板或培养皿中，包被在培养瓶、培养板或培养皿上的基质为胶原酶、牛血清白蛋白中的一种或两种组合；
步骤2、加入添加有10～20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸、2～5mmol/L碳酸氢钠、2～5mmol/L L-谷氨酸、体积分数2～5％的胎牛血清、20～30ng/mL人表皮生长因子、3～6μg/mL胰岛素、50～150μmol/L氢化可的松、0.05～0.2μg/mL霍乱弧菌毒素、4～6μg/mL转铁蛋白、20～40μg/mL牛垂体提取物、0.01～0.02μmol/L类维生素A、8～25μmol/L细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham’s F-12培养液；细胞信号通路抑制剂含有：浓度为5～10μM的ROCKi、浓度为1～5μM的TGF-β抑制剂A83-01、浓度为1～5μM的BMP抑制剂DMH1、浓度为1～5μM的GSK抑制剂CHIR99021；
步骤3、将含有细胞悬液的培养瓶、培养板或培养皿放入37℃孵箱中培养，2～3天可见到细胞贴壁，10～14天即可形成单层上皮干细胞。
2.根据权利要求1所述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其特征是：其Ham’s F12-DMEM 1/1溶液中还含有10～20mg/ml牛血清蛋白。
3.根据权利要求1所述的食管上皮干细胞的分离培养方法，其特征是：其步骤1中，培养瓶、培养板或培养皿包被的方法为：加入含0.1～0.5mg/mL牛血清白蛋白和/或30～50μg/mL胶原酶Ⅰ的EBSS培养液，完全覆盖培养瓶、培养板或培养皿底部即可，在37℃恒温孵箱中孵育1～2小时，孵育完后吸弃培养液，用无菌PBS清洗3～5次。
4.一种食管上皮干细胞的分离培养液，其特征是：其为添加有10～20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸、2～5mmol/L碳酸氢钠、2～5mmol/L L-谷氨酸、体积分数2～5％的胎牛血清、20～30ng/mL人表皮生长因子、3～6μg/mL胰岛素、50～150μmol/L氢化可的松、0.05～0.2μg/mL霍乱弧菌毒素、4～6μg/mL转铁蛋白、20～40μg/mL牛垂体提取物、0.01～0.02μmol/L类维生素A、8～25μmol/L细胞信号通路抑制剂的DMEM/Ham’s F-12培养液；细胞信号通路抑制剂含有：浓度为5～10μM的ROCKi、浓度为1～5μM的TGF-β抑制剂A83-01、浓度为1～5μM的BMP抑制剂DMH1、浓度为1～5μM的GSK抑制剂CHIR99021。
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