CN106834217B

CN106834217B - 一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用

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Publication number: CN106834217B
Application number: CN201710252018.4A
Authority: CN
Inventors: 肖建辉; 田亚冰
Original assignee: Affiliated Hospital of Zunyi Medical University
Current assignee: Affiliated Hospital of Zunyi Medical University
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2017-04-18
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2037-04-18
Also published as: CN106834217A

Abstract

本发明涉及一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法，该方法为在人羊膜上皮细胞培养过程中添加营养组合物，该营养组合物主要包括透明质酸、表皮细胞生长因子、维生素C、GlutaMAX™‑I添加剂、β‑巯基乙醇、甘氨酸、L‑丙氨酸、L‑天冬氨酸、L‑天冬酰胺、L‑谷氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸等，其能显著促进人羊膜上皮细胞增殖，减少倍增时间，并维持人羊膜上皮细胞的细胞表面标志物表达、多向分化潜能和免疫耐受等生物学特性，而且还能显著增强人羊膜上皮细胞干性相关基因和免疫抑制因子的表达水平。因此，本发明营养组合物作为人羊膜上皮细胞增殖调节剂优势特色明显，对缓解再生医学领域种子细胞数量不足具有重要的临床意义。

Description

一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用

技术领域

本发明属于干细胞生物技术领域，特别涉及一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用。

背景技术

人羊膜上皮细胞是来源于胎盘的羊膜组织的上皮层，因羊膜属于分娩后的废弃物，故其不涉及医学伦理和法律问题。而且，人羊膜上皮细胞具有未分化的胚胎干细胞特性，能表达所有胚胎干细胞的分子标志物，具有向三个胚层组织分化潜能。且因其缺乏端粒酶，而规避了移植后的致瘤风险。人羊膜上皮细胞还不表达HLA抗原，移植后无免疫排斥反应，具有优良的移植免疫耐受特点，且能分泌多种免疫抑制因子和炎症抑制因子，抑制宿主T细胞免疫应答和炎性反应，避免了移植后的免疫排斥与炎症发生（Cell Transpl 2011;20:523-534；Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005;46:900-907）。因此，人羊膜上皮细胞是干细胞与再生医学领域的理想种子细胞新资源。

人羊膜上皮细胞来源便利，但因产妇个体差异也易导致所制备的干细胞质量参差不齐，影响临床使用效果。因此，类似其它来源干细胞的临床应用，人羊膜上皮细胞也无法回避临床应用所需足够的待移植供体细胞数量。通常，每张羊膜分离的上皮细胞有限，最多约2 × 10⁸个，仍需通过体外连续扩增才能达到临床所需的细胞数量级。但是，由于人羊膜上皮细胞缺乏端粒酶，体外扩增能力受到先天限制，较早进入衰老期，在常规体外扩增条件下，人羊膜上皮细胞只能传至5～6代。而且，在传代过程中，极易发生上皮-间质转化，从原代（P0）细胞到第5代(P5)细胞逐渐丧失其上皮特性，呈现间质表型。即上皮细胞的极性和表型丧失，呈现间质细胞表型及迁徙、侵袭特性。进而对人羊膜上皮细胞的生物学特性及功能存在潜在影响。因此，如何实现人羊膜上皮细胞体外高效扩增，并维持其自我更新、多向分化及免疫耐受等优良的生物学特性，已成为再生医学领域亟待解决的问题。Tamama 等的研究表明，表皮细胞生长因子EGF可促进人骨髓间充质干细胞（Stem Cells, 24(3): 686-695, 2006）；利用SFC、IL-3和IL-6等细胞因子，能使人骨髓间充质干细胞的增殖数量提高9倍（Stem Cells, 2006; 24(9): 2052-2059）；相比胎牛血清，人AB血清和凝血酶激活的富含血小板的血浆用于扩增人脂肪间充质干细胞，增殖倍率提高了2倍（Stem Cells, 2007;25(5): 1270-1278）。但是，国内外至今尚无促进人羊膜上皮细胞体外扩增的诱导剂或诱导方法方面的相关报道。

而且，借助细胞因子或其它外源诱导因子，促进干细胞体外扩增，其临床应用存在免疫原性、化学毒性等安全性问题，有较大的应用风险性。再者，通常细胞因子价格极其昂贵，限制了其用于临床。因而，发掘价廉易得、安全可靠、低毒高效的促干细胞体外扩增的诱导剂，或建立安全、可行、高效的诱导方法，对干细胞的临床应用具有巨大的现实意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种安全、高效、经济的促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法。

一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法，其具体步骤为：

(1) 经产前检查排除乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒和获得性免疫综合征的健康产妇知情同意，获取足月剖宫产新鲜胎盘。无菌条件下，剥离羊膜组织。然后采用机械-酶法分离制备人羊膜上皮细胞。即用新鲜配制的含青霉素和链霉素的D-Hank’s液反复冲洗羊膜组织，除去残留血渍，剪碎羊膜，加入含0.02%EDTA的 0.05% 胰蛋白酶溶液，37℃，200rpm旋转消化10 min，弃去消化液，再加入新鲜消化液，37℃，200rpm旋转消化30 min，300目不锈钢网过滤，收集单细胞悬液，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化。同理处理2次，合并收集的单细胞悬液，1500 rpm离心10 min，弃上清，细胞沉淀含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重新悬浮，制备得到原代人羊膜上皮细胞。2%台盼蓝染色检测细胞活力，取部分样品作进行细胞表型鉴定；

(2) 把原代人羊膜上皮细胞按一定密度种于培养瓶中，培养基是含10%胎牛血清的低糖DMEM，在35～37 ℃，含1～10% CO₂及85～100%空气饱和湿度恒温培养箱内进行原代细胞培养，并在其中添加营养组合物，每1～3天换一次培养基和营养组合物。待培养板或培养瓶中细胞生长融合度达到80～90%，用含0.02%EDTA的 0.125% 胰蛋白酶溶液，37℃孵育2～5min，显微镜下观察消化程度，及时用含10% FBS 的培养基终止消化，1500r/min，离心5min，弃上清，培养基重悬。再按一定密度种于培养瓶中，加入营养组合物，每1～3天换一次培养基和营养组合物，进行传代培养；

(3) 所述的促进人羊膜上皮细胞体外扩增的营养组合物为透明质酸、表皮细胞生长因子、维生素C、GlutaMAX™-I添加剂、β-巯基乙醇、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸；

(4) 所述营养组合物中透明质酸浓度范围为0.01～10 mg/mL，表皮细胞生长因子的浓度范围1～20 ng/mL，维生素C的浓度范围为0～100 µg/mL，GlutaMAX™-I添加剂的浓度范围0～2%体积比系数、β-巯基乙醇的浓度范围0～2%体积比系数、甘氨酸的浓度范围为1～15 mg/mL、L-丙氨酸的浓度范围1～18 mg/mL、L-天冬氨酸的浓度范围1～27 mg/mL、L-天冬酰胺的浓度范围1～27 mg/mL、L-谷氨酸的浓度范围1～30 mg/mL、L-脯氨酸的浓度范围1～23 mg/mL、L-丝氨酸的浓度范围1～21 mg/mL。

所述人羊膜原代上皮细胞是从足月产妇剖宫产胎盘剥离的羊膜中分离所得。

所述营养组合物各因子可单独或组合使用于促人羊膜上皮细胞增殖。

所述促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法可应用于其它人源性上皮细胞。

本发明建立了一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法，该方法操作方便，安全性好，扩增效果显著。其中的营养组合物直接作用体外培养的原代和不同代数的人羊膜上皮细胞，可在不同时间观察其促人羊膜上皮细胞增殖的情况。与阴性对照相比，该营养组合物可显著促人羊膜上皮细胞增殖，明显减少G0/G1期细胞比例，增加S期和G2/M期细胞比例，缩短其群体倍增时间。而且该营养组合物能很好维持人羊膜上皮细胞的表面标志物表达、多向分化潜能和免疫耐受等生物学特性，促进其干性相关基因和免疫抑制因子的表达。

附图说明

图1为本发明中人羊膜上皮细胞的形态特征；

A：P0代（×200）; B：P1代（×200）; C：P2代( ×200）; D：P3代（×200）

图2A、图2B为本发明中营养组合物对人羊膜上皮细胞增殖的影响；（其中：A为细胞群体倍增时间；B为细胞生长曲线）

图3为本发明中营养组合物对人羊膜上皮细胞增殖相关基因及干性基因表达的影响；（* P < 0.05 代表显著，** P < 0.01 代表非常显著）

图4为本发明中营养组合物对人羊膜上皮细胞生物学特性的影响；

A：细胞形态变化( ×100）; B：上皮细胞特异性蛋白CK19表达变化（×400）；C:细胞表面标志物CD分子变化

图5为本发明中营养组合物对人羊膜上皮细胞免疫特性及多向分化能力影响；A：免疫抑制因子IL-10; B:免疫抑制因子MIF和TGF-β1; C:成骨、成软骨细胞分化；（* P <0.05 代表显著，** P < 0.01 代表非常显著）。

具体实施方式

下面通过附图对本发明作进一步详述。

实施例1：人羊膜上皮细胞的分离制备、形态学及表型特征

从新鲜胎盘组织无菌剥离羊膜，用新配制的含双抗（青霉素终浓度100U/mL，链霉素终浓度0.1mg/mL）的D-Hank’s液反复冲洗以去除残留血渍，剪碎羊膜，加入含0.02%EDTA的0.05% 胰蛋白酶消化液，37℃，200 rpm旋转消化10 min，弃去消化液，再向羊膜组织加入新鲜消化液，37℃，200 rpm旋转消化30 min，300目不锈钢网过滤，收集单细胞悬液，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化。同理处理2次，合并收集的单细胞悬液，1500 rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重新悬浮，制备得到原代人羊膜上皮细胞。然后，按一定密度种于培养瓶，于37℃，含5% CO₂及空气饱和湿度下进行原代（P0）人羊膜上皮细胞培养。每隔1～3天换一次培养基。待培养板或培养瓶中细胞生长融合度达到80及以上融合度，用含0.02%EDTA的 0.125% 胰蛋白酶溶液，37℃孵育2～5min，显微镜下观察消化程度，及时用含10% FBS 的培养基终止消化，1500r/min，离心5min，弃上清，制备的细胞为P0代细胞。培养基重悬P0代细胞，再按一定密度种于培养瓶中，每1～3天换一次培养基，在上述条件下培养，每天均用倒置显微镜观察细胞生长情况，当细胞生长至80%及以上融合度时，同上消化制备的细胞为P1代人羊膜上皮细胞。然后将细胞重悬于培养基中，按一定密度种于培养瓶中，继续传代培养；取P2细胞(1×10⁶/mL)悬液200μl，按组合方案加10μl荧光素标记的CD29、CD34、CD44、CD45、CD49f、CD71、CD73、CD80、CD86、CD326、E-cad和HLA-DR的抗体振荡混匀，室温避光孵育25 min，每管加入2mL含0.1%NaN₃的PBS，振荡混匀，1000rpm离心5min，弃上清，振荡悬浮细胞。每管加入200μl含1％多聚甲醛PBS，混匀，2～8ºC避光放置，24小时内用流式细胞仪检测分析。每份样品的采集细胞数≥10⁴个，用CellQuest软件进行表型分析。同型对照抗体为相应的荧光素标记的小鼠IgG；分别取P2代人羊膜上皮细胞制备细胞爬片，进行波形蛋白和CK19免疫荧光染色，具体步骤为：取出细胞爬片，用PBS震荡洗涤2～3次，每次5 min。室温条件下，用4%多聚甲醛固定10min，PBS冲洗3次，每次5 min。然而滴加0.3%Triton-X100，室温下作用15~20min，增加细胞的通透性，PBS漂洗。加封闭液（PBS/1%BSA），室温下孵育30min，封闭非特异性抗原，再PBS冲洗3次，每次5min。分别滴加抗波形蛋白单抗（一抗）或鼠抗人CK19抗体（一抗），空白对照组加PBS，37℃孵育30min，PBS冲洗3次，每次5 min。滴加3% H₂O₂作用10 min，封闭非特异性抗原；再滴加鼠兔通用型二抗，37℃孵育30 min；DAB显色3-5 min，D-PBS清洗；苏木素复染30s，D-PBS清洗，于倒置显微下镜观察并拍照。

结果如图1所示，人羊膜上皮细胞的原代细胞形态不一，培养48h后，有少量细胞贴壁，3d后贴壁细胞数量迅速增多，形态多呈卵圆形和三角形（图1A）。传代培养后较原代容易贴壁，且增殖速度加快，4-5d细胞汇合率可达90%以上，形态呈卵圆形，铺路石样生长（图1B）。P1和P2代细胞形态几无变化（图1C），但传至P3代细胞，有少数细胞呈梭形，有上皮-间质化细胞形态特征（图1D）。免疫细胞化学染色结果显示，人羊膜上皮细胞表达CK19，不表达波形蛋白（图4B）。FCM检测结果提示，P2代人羊膜上皮细胞高表达CD29、CD73、 CD166，低表达CD44，不表达 CD34、CD45、HLA-DR等细胞表面分子（图4C）。因此，所分离的目标细胞具有典型的人羊膜上皮细胞表型特征。

实施例2：营养组合物对人羊膜上皮细胞增殖的影响

取处于对数生长期的P1 代人羊膜上皮细胞，消化并重悬后进行细胞计数，以1.0×10⁴ cells /孔种于96孔板，48 h后更换培养基，设置对照组和营养组合物组（其中300kDa透明质酸的剂量为1 mg/mL浓度梯度, 表皮细胞生长因子的浓度为10 ng/mL，维生素C的浓度为50 µg/mL，GlutaMAX™-I添加剂的浓度为1%体积比系数、β-巯基乙醇的浓度为1%体积比系数、甘氨酸的浓度为7.5 mg/mL、L-丙氨酸的浓度为8.9mg/mL、L-天冬氨酸的浓度为13.2mg/mL、L-天冬酰胺的浓度为13.3mg/mL、L-谷氨酸的浓度为14.7mg/mL、L-脯氨酸的浓度为11.5mg/mL、L-丝氨酸的浓度为10.5 mg/mL。)，每个实验组5个复孔，每两天更换新鲜培养基（100 uL/孔）。采用CCK-8检测细胞增殖情况。即在检测时间点，每孔加入10 uL的CCK-8试剂，继续培养2 h后将板取出，用酶标仪于450 nm处检测各孔的OD值。连续检测9天，并绘制各组细胞的生长曲线。根据OD值、标准曲线公式和下列公式计算各组细胞的群体倍增时间（doubling time, DT）。营养组合物加入后48 h时的细胞数量进行增殖量效评价。

DT=t×log2/(logNt－logN₀)^[11]

（t为加入营养组合物后的培养时间，N₀为加入营养组合物时的细胞数，Nt为加入营养组合物 t时间后的细胞数量）

取处于对数生长期的P1代人羊膜上皮细胞，以7.8×10⁵cells/瓶的细胞密度接种于T₂₅培养瓶，3天后更换新鲜培养基，设置对照组和营养组合物给药组。于细胞对数生长期时，常规方法消化、离心、D-PBS清洗、离心收集细胞，用预冷的70%乙醇固定细胞，4 °C过夜，离心，弃固定液后D-PBS清洗，再离心后用碘化丙啶（PI）避光单染30分钟，采用FCM检测细胞，进行DNA倍体分析其细胞周期变化。

结果提示，人羊膜上皮细胞增殖约在3天后，即进入对数生长期，约第7天开始停止生长进入平台期；细胞进入指数生长期后（第3天时）加入营养组合物（300 kDa透明质酸 1mg/mL）时，其细胞群体倍增时间大大缩短，为49.04 h，明显小于对照组55.7 h（图2A）。从细胞生长曲线看，给药组的细胞增殖更强，其在细胞进入增殖平台期后延续时间更长（图2B）。细胞周期分析结果提示（如表1所示），人羊膜上皮细胞给药后，G0/G1期细胞显著减少，而S期的细胞显著增加，G2/M期细胞也有较大增加，进一步佐证了营养组合物能促进人羊膜上皮细胞的增殖。

表1. 营养组合物对人羊膜上皮细胞细胞周期的影响（* P < 0.05 代表显著，**P < 0.01 代表非常显著）

实施例3：营养组合物对人羊膜上皮细胞增殖相关基因及干性基因转录水平的影响

取对数生长期的P1人羊膜上皮细胞，以3×10⁵cells/孔的细胞密度接种于6孔板，3天后更换新鲜培养基，设置对照组和营养组合组（300 kDa透明质酸 1 mg/mL），继续培养48 h后。按试剂盒说明提取总RNA，逆转录合成cDNA，即将各组总RNA浓度统一调整至50 ng/µL，反应条件：37℃，15min；85℃，5s。逆转录产物（cDNA）冻存于-80℃备用。实时荧光定量PCR，反应条件为：95℃，预变性30 s，然后PCR40个循环（95℃变性5 s； 60℃退火30 s），95℃，15 s；65℃， 5 s；60℃开始，每0.5℃采集1次荧光，每次10 s。计算目的基因的相对表达量，以Ct值为统计参数计算下列数据：ΔCt_给药=(Ct_给药-Ct_-actin)_给药，ΔCt_对照=(Ct_给药-Ct_-actin)_对照，ΔΔCt =ΔCt_给药-ΔCt_对照，目的基因的相对表达=2^-△△Ct。检测增殖相关基因PCNA和Ki67以及干性相关基因Nanog、Sox-2和Oct4的转录水平。结果见图3，营养组合物对增殖相关基因Ki67无明显影响，但能显著提高增殖细胞核抗原PCNA基因的转录水平，维持乃至增强人羊膜上皮细胞干性，显著提升Nanog、Sox-2两个干性基因的转录水平。

实施例4：营养组合物对人羊膜上皮细胞生物学特性的影响

将处于对数生长期P1 人羊膜上皮细胞，以7.8×105 cells/瓶接种于T25培养瓶，3天后更换培养液，设置对照组和营养组合物给药组，48 h后，用倒置显微镜比较观察细胞形态变化，采用免疫细胞化学法检查角蛋白CK19和波形蛋白的表达变化，以及采用流式细胞仪检测细胞表面标志的表达变化；取对数生长期的P1人羊膜上皮细胞，以7.8×105cells/瓶接种于T25培养瓶，3天后更换培养液，设置对照组和营养组织物给药组，每个培养瓶中加4 mL相应的培养液，继续培养48 h后，取各组细胞培养上清液，采用ELISA法测定免疫抑制因子IL-10、MIF和TGF-β1等的表达情况；将对数生长期的P1人羊膜上皮细胞，以3.6×105 cells/孔接种于6孔板，设置对照组和营养组织物给药组，置于37℃恒温培养箱（5%CO2饱和湿度）内进行培养，3天后，分别更换成骨诱导分化培养基、成软骨诱导分化培养基，继续培养，3天换一次分化培养基，并观察细胞形态的变化，于诱导分化第21天时，采用茜素红S染色检测成骨诱导结果，用阿利新蓝染色检查成软骨诱导结果。

图4的结果表明，人羊膜上皮细胞经营养组合物处理后，其形态特征并无变化，仍然呈三角至卵圆形，铺路石状排列（图4A）,而且仍然高表达上皮细胞标志物CK19蛋白，不表达间充质细胞标志物波形蛋白（图4B）。另外，FCM 检测细胞表面分子标志物的结果提示（图4C），人羊膜上皮细胞经营养组合物处理后，仍然高表达CD29、CD73和 CD166，低表达CD44，不表达CD34、CD45和HLA-DR。因此，促人羊膜上皮细胞增殖的营养组合物，不会改变人羊膜上皮细胞的形态特征和特异性细胞表面标志。另外，人羊膜上皮细胞经营养组合物处理后，其多向分化能力也为受到影响，图5C的结果提示，人羊膜上皮细胞经营养组合物处理后，其仍然具有较强的向成骨细胞和软骨细胞分化的能力。而且，人羊膜上皮细胞经营养组合物处理后，其表达分泌免疫抑制因子IL-10(图5A)和TGF-β1(图5B)的能力也显著增强(图5A和5B)。因此，本发明营养组合物作为人羊膜上皮细胞促增殖调节剂具有优势特色明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均就在包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法，具体的具体步骤为：

(1) 经产前检查排除乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒和获得性免疫综合征的健康产妇知情同意，获取足月剖宫产新鲜胎盘；无菌条件下，剥离羊膜组织，然后采用机械-酶法分离制备人羊膜上皮细胞；即用新鲜配制的含青霉素和链霉素的D-Hank’s液反复冲洗羊膜组织，除去残留血渍，剪碎羊膜，加入含0.02%EDTA的 0.05% 胰蛋白酶溶液，37℃，200rpm旋转消化10 min，弃去消化液；再加入新鲜消化液，37℃，200rpm旋转消化30 min，300目不锈钢网过滤，收集单细胞悬液，加入含10%胎牛血清的培养基终止消化；同理处理2次，合并收集的单细胞悬液，1500 rpm离心10 min，弃上清，细胞沉淀含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重新悬浮，制备得到原代人羊膜上皮细胞；2%台盼蓝染色检测细胞活力，取部分样品作进行细胞表型鉴定；

(2) 把原代人羊膜上皮细胞按一定密度种于培养瓶中，培养基是含10%胎牛血清的低糖DMEM，在35～37℃，含1～10% CO₂及85～100%空气饱和湿度恒温培养箱内进行原代细胞培养，并在其中添加营养组合物，每1～3天换一次培养基和营养组合物；待培养板或培养瓶中细胞生长融合度达到80～90%时，用含0.02%EDTA的 0.125% 胰蛋白酶溶液，37℃孵育2～5min，显微镜下观察消化程度，及时用含10% FBS 的培养基终止消化，1500r/min，离心5min，弃上清，培养基重悬；再按一定密度种于培养瓶中，加入营养组合物，每1～3天换一次培养基和营养组合物，进行传代培养；

其特征在于：所述营养组合物由以下组分构成：透明质酸的浓度范围为0.01～10 mg/mL，表皮细胞生长因子的浓度范围为1～20 ng/mL，维生素C的浓度范围为0～100 µg/mL，GlutaMAX™-I添加剂的浓度范围为0～2%体积比系数、β-巯基乙醇的浓度范围为0～2%体积比系数、甘氨酸的浓度范围为1～15 mg/mL、L-丙氨酸的浓度范围为1～18 mg/mL、L-天冬氨酸的浓度范围为1～27 mg/mL、L-天冬酰胺的浓度范围为1～27 mg/mL、L-谷氨酸的浓度范围为1～30 mg/mL、L-脯氨酸的浓度范围为1～23 mg/mL、L-丝氨酸的浓度范围为1～21 mg/mL。