CN114304065A - 一种阻断il-8联合抗pd-1抗体治疗胃癌的动物模型构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种阻断IL‑8联合抗PD‑1抗体治疗胃癌的动物模型构建及应用。本发明将人PBMCs过继到免疫缺陷小鼠NCG体内，并皮下注射CXCR1/2敲除的人源性胃癌细胞（HGC‑27），并用胃癌患者来源间充质干细胞（GCMSCs）上清作用，在动物模型体内实现三大人源化，更加接近真实人体内环境，有利于研究人源性IL‑8在抗PD‑1免疫治疗中的作用。可应用在开发IL‑8信号通路阻断剂联合免疫检查点阻断（ICB）治疗的临床前评估产品中，起到改善肿瘤免疫微环境，提高胃癌治疗预后的作用。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及一种阻断IL-8联合抗PD-1抗体治疗胃癌的动物模型构建及应用。
背景技术
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其预后差，进展期胃癌的5年生存率仅为5％-20％。目前，进展期胃癌抗PD-1治疗临床疗效不理想，有效率不足30%，提高免疫治疗有效率是胃癌免疫治疗中亟待解决的问题。合理的动物模型是探索抗PD-1耐药机制的实验基础。目前已报道了一些免疫系统人源化小鼠（Hu-PBMCs）模型用于探究肿瘤抗PD-1治疗相关作用机制。由于在小鼠基因组中缺乏人白细胞介素-8（IL-8）同源物，在临床前模型中难以研究IL-8相关免疫治疗耐药的机制基础。间充质干细胞（GCMSCs）是胃癌微环境重要组成成份。GCMSCs 在通过旁分泌作用影响肿瘤免疫环境。目前，尚未有涉及肿瘤相关间充质干细胞及IL-8的报道，GCMSCs来源的IL-8对胃癌抗PD-1治疗的作用及机制尚不清楚。
发明内容
本发明旨在探究阻断IL-8联合抗PD-1治疗提高胃癌免疫治疗疗效的可行性。针对现有技术中存在的不足，在原有Hu-PBMCs模型基础上，兼顾肿瘤基质细胞的影响，构建了一种阻断IL-8联合抗PD-1抗体治疗胃癌的动物模型NCGhPBMC小鼠胃癌异种移植模型，进而探究了胃癌间质来源IL-8对胃癌抗PD-1免疫治疗的影响。
为达到上述目的，本发明采取如下技术手段：
本发明提供了一种NCGhPBMC小鼠异种移植模型的构建方法，具体包括如下步骤：
（1）从胃癌组织中分离出GCMSCs细胞进行传代培养得到GCMSC-CM；
（2）分离人PBMCs，并将过继到免疫缺陷小鼠体内，流式细胞术检测小鼠外周血中人CD45+ 细胞比例大于25%，得到NCGhPBMC小鼠；
（3）第 0 天开始NCGhPBMC小鼠皮下注射CXCR1/2敲除的人源性胃癌细胞HGC-27，第7天瘤周注射步骤（1）制备的GCMSC-CM；
（4）第 8 天开始，腹腔注射PD-1单抗，检测肿瘤生长状态，在第 21 天安乐死小鼠，构建得到NCGhPBMC小鼠异种移植模型。
进一步地，步骤（1）中所述的传代培养为待GCMSCs细胞中长梭状细胞融合度到达80%以上后进行0.25%胰酶消化。
步骤（2）中所述的免疫缺陷小鼠为NCG小鼠。
步骤（3）中所述瘤周注射的注射量为200 µL。
步骤（4）中所述PD-1单抗的注射量为10 mg/kg。
本发明还提供了一种NCGhPBMC小鼠胃癌异种移植模型，所述的小鼠胃癌异种移植模型为将人PBMCs过继到免疫缺陷小鼠NCG体内，并皮下注射CXCR1/2敲除的人源性胃癌细胞，与胃癌来源间充质干细胞GCMSCs上清作用后构建的小鼠胃癌异种移植模型。
本发明还提供了一种Hu-PBMCs动物模型在人源性IL-8在抗PD-1抗体药效和免疫相关评价中的应用。
进一步的，所述的NCGhPBMC小鼠胃癌异种移植模型为将人PBMCs过继到免疫缺陷小鼠NCG体内，并皮下注射CXCR1/2敲除的人源性胃癌细胞，与胃癌来源间充质干细胞GCMSCs上清作用后构建的移植模型。
进一步的，所述的源性胃癌细胞为HGC-27。
进一步地，所述的应用为评估阻断IL-8联合抗PD-1治疗胃癌的效果的产品中。
优选的，所述应用为获取阻断IL-8联合抗PD-1治疗胃癌效果的辅助评估信息的收集评估产品中，所述的评估为临床前试验评估。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
由于在小鼠基因组中缺乏人IL-8同源物，在临床前模型中难以研究IL-8相关免疫治疗耐药的机制基础。本发明将人PBMCs过继到免疫缺陷小鼠（NCG）体内，并皮下注射CXCR1/2敲除的人源性胃癌细胞（HGC-27），并用胃癌患者来源间充质干细胞（GCMSCs）上清作用，在动物模型体内实现三大人源化，更加接近真实人体内环境，有利于研究人源性IL-8在抗PD-1免疫治疗中的作用。基于本发明的发现，可应用在开发IL-8信号通路阻断剂联合免疫检查点阻断（ICB）治疗的临床前评估产品中，起到改善肿瘤免疫微环境，提高胃癌治疗预后的作用。
附图说明
图1是间充质干细胞的培养图；
图2是胃癌组织间充质干细胞的鉴定图；
图3是胃癌组织中分离出的GCMSCs细胞进行流式细胞术鉴定表面分子标志物的实验结果图；
图4是NCGhPBMC皮下荷瘤模型构建示意图；
图5是各组NCGhPBMC荷瘤小鼠肿瘤生长曲线图；
图6是各组NCGhPBMC荷瘤小鼠肿瘤重量图；
图7是NCGhPBMC荷瘤小鼠肿瘤内CD8+T细胞浸润比例对比图。
具体实施方式
本发明公开了一种NCGhPBMC小鼠异种移植模型构建方法及其在胃癌阻断IL-8联合抗PD-1治疗中应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。
材料及试剂：
胃癌组织来自于镇江市第一人民医院，使用前去除胃癌组织的坏死区；
健康人静脉血样本来自镇江市中心血站；CXCR1/2敲除型的 HGC-27 细胞购自赛业科技有限公司；NOD/ShiLtJGpt- Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt小鼠模型购自南京集萃药康有限公司；PD-1单抗购自于美国默沙东公司。
实施例1：人胃癌组织间充质干细胞（GCMSCs）的分离及鉴定
胃癌组织在无菌条件下使用75%乙醇溶液冲洗30 s。胃癌组织块经 PBS冲洗后浸没于含 10000 U/mL 青霉素和链霉素的 PBS 溶液中 15 min。胃癌组织浸没于含 10%胎牛血清（FBS） 的α-MEM（Gibco）保持湿润。无菌眼科剪和镊子将胃癌组织剪成约为1mm3 的小块并贴附于细胞培养皿内。培养皿倒扣于 37℃、5% CO2 细胞培养箱内30 min。缓慢滴加含10% FBS 的α-MEM 使其完全浸没胃癌组织。胃癌组织于37℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱内培养。组织块每两天显微镜下观察一次，每三天更换一次培养液。待长梭状细胞融合度到达 80%进行0.25%胰酶消化，传代培养。
图1是间充质干细胞的培养图（比例尺：100 μm）；由图1可见，胃癌组织贴壁培养约一周后，组织块周围有梭形细胞生长。从新鲜胃癌组织中分离出长梭形的GCMSCs。
对分离出的GCMSCs细胞进行鉴定。通过成脂诱导分化试剂盒（BI 公司）诱导MSCs向脂肪细胞分化、成骨诱导分化试剂盒（BI 公司）诱导MSCs向成骨细胞分化，在21天、28天分别用油红O和茜素红染色。图2是胃癌组织间充质干细胞的鉴定图；其中，A是成脂分化实验图，B是成骨分化实验图（比例尺均为20 μm）；由图2可见，MSCs细胞胞质产生多个大小不一的脂肪滴、茜素红染色可见骨钙结节形成。由此可知，从胃癌组织分离的长梭形细胞具有被诱导分化为脂肪细胞和骨细胞的能力。
采用流式细胞术检测 GCMSCs 中人 CD45、CD19、CD34、CD90、CD29 和CD105 的表达情况。对GCMSCs细胞表面抗原分子进行检测后发现，从胃癌组织中分离出的GCMSCs细胞表达 CD105、CD90 和 CD92，不表达 CD45、CD34 和 CD19。图3是胃癌组织中分离出的GCMSCs细胞进行流式细胞术鉴定表面分子标志物的实验结果图；由图3可见，CD45、CD19、CD34阳性率<1%，CD90、CD29、CD105阳性率>85%。
以上结果表明，从新鲜胃癌组织中分离的GCMSCs细胞符合间充质干细胞特征。将上述分离得到的GCMCSs（以下统称GCMSC-CM）在体外37℃、5% CO2、含10% FBS 的α-MEM培养基培养48h，收集上清，-80℃保存备用。
实施例2：人外周血单个核细胞（PBMCs）的分离
（1）在肝素瓶（BD biosciences）中收集健康人静脉血样本，轻轻翻转几次管子使其充分与抗凝剂混合；
（2）PBS （0.02 M，pH 7.2）与静脉血样本等体积混合，转入15mL 康宁离心管（Corning）；
（3）康宁离心管内加入与外周血等体积的 Ficoll 分离液，经PBS 稀释后的外周血在 Ficoll 分离液上层（缓慢滴加防止与 Ficoll 分离液混合）。
（4）800 × g，20 min 离心（缓慢升速缓慢降速）。
（5）使用滴管将最上层血浆吸除，缓慢吸出血浆下的白膜层（PBMCs 所在位置）。
（6）分离出的PBMCs经PBS 洗涤2次，重悬，备用。
实施例3 NCGhPBMC小鼠胃癌异种移植模型的构建
将CXCR1/2敲除型的 HGC-27 细胞（CXCR1/2 KO）放入含有10%FBS（BI）的RPMI1640 培养基（Gibco）中，置于37℃和5% CO2的培养箱中培养，每两天换液一次，待80%细胞汇合度左右传代备用。
取4-8 周龄的 NOD/ShiLtJGpt- Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt（NCG）小鼠，每只 NCG小鼠腹腔中移植 1 × 107 个实施例2分离得到人 PBMC。移植后 7 天，流式细胞术检测小鼠外周血中人CD45+ 细胞比例，比例大于25%认为可以较好模拟体内肿瘤免疫环境，得到NCGhPBMC 小鼠用于后续荷瘤实验。
为了研究阻断 GCMSCs 来源 IL-8 信号对提高 PD-1 抗体的胃癌治疗效果。取42只NCGhPBMC 小鼠，随机分为7组（n = 6 只/ 组），分别为：WT（对照组），GCMSC，IgG（对照组），PD-1，GCMSC-CM+PD-1，CXCR1/2 KO +GCMSC-CM和CXCR1/2 KO +GCMSC-CM+PD-1（NCGhPBMC小鼠异种移植模型组）。各组小鼠处理方式如表1所示。
表1. 小鼠处理方式对照表
| 分组 | 处理方式 |
| WT（野生型） | 野生型HGC-27 细胞3×10<sup>6</sup>个/只注射于 NCG<sup>hPBMC</sup>小鼠皮下，每2天用游标卡尺测量一次肿瘤体积。 |
| GCMSC | 野生型HGC-27 细胞3×10<sup>6</sup>个/只注射于 NCG<sup>hPBMC</sup>小鼠皮下，每2天用游标卡尺测量一次肿瘤体积。从第 7 天开始，瘤周每 2 天一次注射 200 µL 的GCMSC-CM。 |
| IgG | 野生型HGC-27 细胞3×10<sup>6</sup>个/只注射于NCG<sup>hPBMC</sup>小鼠皮下，每2天用游标卡尺测量一次肿瘤体积。从第 8 天开始，腹腔注射IgG同型单抗（10 mg/kg）。 |
| PD-1 | 野生型HGC-27 细胞3×10<sup>6</sup>个/只注射于NCG<sup>hPBMC</sup>小鼠皮下，每2天用游标卡尺测量一次肿瘤体积。从第 8 天开始，腹腔注射PD-1单抗（10 mg/kg）。 |
| GCMSC-CM+PD-1 | 野生型HGC-27 细胞3×10<sup>6</sup>个/只注射于 NCG<sup>hPBMC</sup> 小鼠皮下，每2天用游标卡尺测量一次肿瘤体积。从第 7 天开始，瘤周每 2 天一次注射 200 µL 的GCMSC-CM。从第 8 天开始，腹腔注射PD-1单抗（10 mg/kg）。 |
| CXCR1/2 KO +GCMSC-CM | CXCR1/2 敲除型HGC-27 细胞3×10<sup>6</sup>个/只注射于 NCG<sup>hPBMC</sup> 小鼠皮下，每2天用游标卡尺测量一次肿瘤体积。从第 7 天开始，瘤周每 2 天一次注射 200 µL的GCMSC-CM。 |
| CXCR1/2 KO +GCMSC-CM+PD-1 | CXCR1/2 敲除型HGC-27 细胞3×10<sup>6</sup> 个/只注射于 NCG<sup>hPBMC</sup> 小鼠皮下，每2天用游标卡尺测量一次肿瘤体积。从第 7 天开始，瘤周每 2 天一次注射 200 µL的GCMSC-CM。从第 8 天开始，腹腔注射PD-1单抗（10 mg/kg）。 |
将所有小鼠在第 21 天被安乐死，并立即收集肿瘤，称重并进行分析。数据用平均值 ± SEM 表示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；n = 6。
图4是NCGhPBMC皮下荷瘤模型构建示意图。图5是各组NCGhPBMC荷瘤小鼠肿瘤生长曲线图；图6是各组NCGhPBMC荷瘤小鼠肿瘤重量图，图中+/-表示处理因素有/无。由图5、图6可见，NCGhPBMC小鼠异种移植模型组小鼠肿瘤体积最小、肿瘤重量最轻，CXCR1/2缺失完全逆转了GCMSC-CM 诱导的肿瘤生长，完全恢复了 GCMSC-CM 抑制的PD-1 抗体的抗肿瘤作用。图7是NCGhPBMC荷瘤小鼠肿瘤内CD8+T细胞浸润比例对比图；图中，+/-表示处理因素有/无。由图7可见，NCGhPBMC小鼠异种移植模型组小鼠的CD8+T细胞浸润数量最高，而浸润比例越高，说明治疗效果越好。基于上述可见，本发明提供的NCGhPBMC小鼠异种移植模型可以评估阻断IL-8联合抗PD-1治疗胃癌的效果。用于获取阻断IL-8联合抗PD-1治疗胃癌效果的辅助评估信息的收集产品，应用在阻断IL-8联合抗PD-1治疗胃癌的评估产品中，所述的评估为临床前试验评估。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (10)
1.一种NCGhPBMC小鼠胃癌异种移植模型的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）从胃癌组织中分离出GCMSCs细胞进行传代培养得到GCMSC-CM；
（2）分离人PBMCs，并将过继到免疫缺陷小鼠体内，流式细胞术检测小鼠外周血中人CD45+ 细胞比例大于25%，得到NCGhPBMC小鼠；
（3）第 0 天开始NCGhPBMC小鼠皮下注射CXCR1/2敲除的人源性胃癌细胞HGC-27，第7天瘤周注射步骤（1）制备的GCMSC-CM；
（4）第 8 天开始，腹腔注射PD-1单抗，检测肿瘤生长状态，在第 21 天安乐死小鼠，构建得到NCGhPBMC小鼠异种移植模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中所述的传代培养为待GCMSCs细胞中长梭状细胞融合度到达 80%以上后进行0.25%胰酶消化。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中所述的免疫缺陷小鼠为NCG小鼠。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中所述瘤周注射的注射量为200 µL。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（4）中所述PD-1单抗的注射量为10 mg/kg。
6.一种NCGhPBMC小鼠胃癌异种移植模型，其特征在于，所述模型为将人PBMCs过继到免疫缺陷小鼠NCG体内，并皮下注射CXCR1/2敲除的人源性胃癌细胞，与胃癌来源间充质干细胞GCMSCs上清作用后构建的小鼠胃癌异种移植模型。
7.NCGhPBMC小鼠胃癌异种移植模型在阻断人源性IL-8联合抗PD-1疗效和免疫相关评价中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的人源性胃癌细胞为HGC-27。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用为评估阻断IL-8联合抗PD-1治疗胃癌效果的产品中。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的应用为获取阻断IL-8联合抗PD-1治疗胃癌效果的辅助评估信息的收集产品中。
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Cited By (1)
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| WO2024021059A1 (en) * | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Jinfeng Laboratory | Non-human mammalian model expressing il-8 and use thereof |
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| CN109182271A (zh) * | 2018-09-21 | 2019-01-11 | 上海美峰生物技术有限公司 | 基于类器官方法构建正常免疫小鼠人胃癌移植瘤模型的方法和应用 |
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