CN105087466B - 诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法。本发明在基础培养液中添加表皮生长因子和胰岛素，从而提高hUC‑MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率。并且，该培养液中不含有异源血清，降低了风险。而本发明提供的方法将脐带间充质干细胞和羊膜上皮细胞共培养，能够显著提高分化百分率且所需培养周期较短。采用的脐带间充质干细胞来自脐带和胎盘，来源广泛，不受伦理和法理限制。

Description

诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法。

背景技术

角膜上皮细胞层位于角膜外表面，由4～5层非角化鳞状上皮细胞组成，在维持眼表稳态以及角膜透明度中发挥重要作用。健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件。结构与功能健全的角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的主要来源，多种致病因素如眼外伤、手术创伤、炎症、药物毒性均可造成角膜缘损伤，造成角膜缘干细胞功能障碍，导致上皮细胞缺失，从而导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险。因此，通过体外培养获得大量用于角膜修复的上皮细胞这一难题亟待解决。

临床研究表明，通过体外培养自体角膜缘干细胞作为角膜上皮修复的种子细胞取得了良好疗效。角膜缘干细胞同其它干细胞一样具有分化程度低、细胞周期长、高度增殖潜能、自我更新能力和应激增殖等特征，并且研究发现体外培养的角膜缘干细胞可能会失去部分抗原性，有利于临床移植。也有研究表明，通过建立角膜上皮细胞系(cornealepithelial cell line)能够长期稳定地为不同研究目的提供所需的细胞，如上皮的增殖、分化、眼科用药的测试、角膜疾病新的治疗方法的开发等等。

但是，自体角膜缘干细胞体外连续培养所要求的培养液成分复杂，细胞不稳定易分化，细胞不能持续扩增，细胞表型发生改变，所以每次移植都要在患者或其家属的正常角膜上取下部分角膜缘组织进行体外培养，操作繁琐，且给患者带来二次痛苦，并且有研究者发现当取供眼角膜缘组织大于三分之二时，将造成健眼的眼表疾病和视力不可逆的下降，使得大多数患者难以接受。因此，非常有必要寻找新的自体和异体移植的细胞来源。

脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等优点，并且，脐带间充质干细胞不受任何伦理及法理限制，因而吸引了众多的研究者。但是，体外诱导hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化十分困难。

因此，建立体外诱导hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的有效方法十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法，本发明提供的诱导培养基能够和诱导方法能够成功将hUC-MSCs诱导分化为角膜上皮细胞，诱导分化率可达26％。

本发明提供的诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基，包括基础培养液、表皮生长因子和胰岛素。

表皮生长因子(EGF)能够促进表皮细胞的分裂，胰岛素能够促进细胞对葡萄糖、氨基酸的代谢，提高细胞的生长状态。本发明在基础培养液中添加表皮生长因子和胰岛素，从而提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率。实验表明，添加表皮生长因子和胰岛素的实验组hUC-MSCs向角膜上皮细胞的分化率可达26％，而不添加表皮生长因子或胰岛素的对照组分化率仅为5.47％。说明通过添加EGF和胰岛素能够显著提高hUC-MSCs向角膜细胞分化的效率。

在本发明的实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为(5～25)：(5000～25000)。

在一些实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为2:3000～3:2000。

在其中一个实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为1:1000。

在本发明的实施例中，表皮生长因子的含量为5ng/mL～25μg/mL；胰岛素的含量为5ng/mL～25μg/mL。

在一些实施例中，表皮生长因子的含量为5ng/mL；胰岛素的含量为5μg/mL。

在一些实施例中，表皮生长因子的含量为10ng/mL；胰岛素的含量为10μg/mL。

在一些实施例中，表皮生长因子的含量为10ng/mL；胰岛素的含量为15μg/mL。

在一些实施例中，表皮生长因子的含量为15ng/mL；胰岛素的含量为10μg/mL。

在一些实施例中，表皮生长因子的含量为25ng/mL；胰岛素的含量为25μg/mL。

在本发明的实施例中，基础培养液为人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为(50～60):(44～50)。

在一些实施例中，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为55:45。

本发明所用的人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。其中，人干细胞无血清培养基适宜培养干细胞，本发明采用的人干细胞无血清培养基为Lonza UltraCULTURE^TM。角朊细胞无血清培养基适宜培养上皮细胞，本发明采用的角朊细胞无血清培养基为KSFM培养液。本发明采用的基础培养液皆不含有异源血清，降低了动物源血清给人体带来的风险。

在本发明的实施例中，本发明提供的培养基中还包括青霉素和链霉素。

在一些实施例中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为100U/mL。

本发明还提供了诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，将脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞共培养；培养的培养基为本发明提供的培养基。

在本发明的实施例中，共培养为间接共培养。

细胞共培养技术是将两种或两种以上的细胞共同培养于同一环境中的技术，由于其具有更好的反映体内环境的优点，因此被应用于现代细胞研究中。间接共培养体系即将2中或2中以上的细胞分贝接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境中，是不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触。间接共培养可采用transwell小室。

本发明通过实验表明，将脐带间充质干细胞和羊膜上皮细胞共培养，7天后脐带间充质干细胞部分呈分化趋势，细胞呈散在分布，经检测，hUC-MSCs分化为角膜上皮细胞的分化率可达26％。而没有进行共培养的且不添加生长因子的对比例中hUC-MSCs的分化率为2.7％；采用本发明提供培养基而不进行共培养的对比例中hUC-MSCs的分化率为7.95％；培养基中不添加生长因子但采用共培养的对比例中，hUC-MSCs的分化率为5.47％。可见，本发明提供的方法能够将hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率提高近10倍，该效果具有显著性差异(p<0.01)。

本发明提供的培养基包括基础培养液、表皮生长因子和胰岛素。

在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞的个数比为(1～1.5):(4～6)。

在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞为第3～5代；所述羊膜上皮细胞为第2代。

在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞的原代分离方法为组织块培养法；羊膜上皮细胞的原代分离方法为酶消化法。

具体的，hUC-MSCs的原代分离方法包括以下步骤：

步骤1：将脐带用含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次，以体积分数为75％的乙醇水溶液浸泡1min～2min后，去除脐带外膜和血管；

步骤2：以人干细胞无血清培养液培养，培养条件为5％CO₂、37℃、湿度95％；第5～7天半量换培养基，继续培养12～14天后全量换液去掉组织块，收集细胞传代培养。

具体的，羊膜上皮细胞的原代分离方法包括以下步骤：

步骤1：将羊膜用含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次后，破碎，以质量分数为0.25％胰蛋白酶消化；

步骤2：以胶原酶Ⅱ和Dnas酶消化后，培养。

胶原酶Ⅱ的浓度为2.5g/L；Dnas酶的浓度为0.05g/L；消化的条件为37℃，200rpm震荡，时间为15min～30min。

培养的培养液为包含表皮生长因子的角朊细胞无血清培养基；其中表皮生长因子的浓度为10ng/mL～15ng/mL。

培养的接种密度为1×10⁷个/L。

培养的条件为5％CO₂、37℃、湿度95％培养2h后，去除未贴壁的细胞后继续培养24小时。

在本发明的实施例中，共培养的时间为7天。

本发明提供了诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法，本发明在基础培养液中添加表皮生长因子和胰岛素，从而提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率。并且，该培养液中不含有异源血清，降低了风险。而本发明提供的方法将脐带间充质干细胞和羊膜上皮细胞共培养，能够显著提高分化百分率且所需培养周期较短。采用的脐带间充质干细胞来自脐带和胎盘，来源广泛，不受伦理和法理限制。

附图说明

图1示经传递3～5代的hUC-MSCs细胞形态(100×)；

图2-a示原代培养12h的羊膜上皮细胞形态(40×)；

图2-b示传代培养12h的羊膜上皮细胞形态(40×)；

图2-c示传代培养24h的羊膜上皮细胞HE染色结果(100×)；

图2-d示传代培养24h羊膜上皮细胞以CK7为抗体免疫组化鉴定(100×)；

图2-e示传代培养24h羊膜上皮细胞以CK8为抗体免疫组化鉴定(100×)；

图2-f示传代培养24h羊膜上皮细胞以CK18为抗体免疫组化鉴定(100×)。

具体实施方式

本发明提供了诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基和方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

本发明实施例中用于角膜上皮细胞鉴定的抗体为AE1和AE5，它们都是细胞角蛋白抗体。AE1可以识别相对分子质量分别为56500、50000、48000和40000的酸性细胞角蛋白,能与角膜上皮细胞的一种相对分子质量为48000的酸性角蛋白发生反应,与波形蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白等丝状蛋白无交叉反应。AE5能够与角膜上皮细胞的角蛋白K3(相对分子质量为64000)特异性结合,与人、兔、牛的角膜上皮细胞有反应,而与皮肤上皮细胞无交叉反应。细胞角蛋白K3是分化状态较高的角膜上皮细胞的标志蛋白。因此,如果细胞AE1和AE5的免疫组化染色阳性时,那么这种细胞为角膜上皮细胞。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1脐带间充质干细胞的分离培养

将脐带(乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性)置于含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS中漂洗2次，加入预冷的75％酒精，浸泡1-2min，期间不停翻动脐带；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用组织剪将脐带剪成2mm左右的小段，每段用眼科剪纵向开，用血管钳去除脐带内三根血管(两条动脉，一条静脉)，同时去除脐带外膜；将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm3大小的组织块，取适量放入直径为10cm的无菌培养皿中，覆盖70％培养皿的底面积。加入LONZA人干细胞无血清培养液(Lonza UltraCULTURE^TM)，5％CO₂、37℃、湿度为95％的CO₂培养箱中培养。第5天～7天半量换培养基，继续培养12天～14天左右全量换液去掉组织块同时收集细胞传代培养。

经传递3～5代的hUC-MSCs细胞形态如图1所示，hUC-MSCs生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。

取第3代对数生长期细胞，细胞分离液消化，流式细胞术检测表面抗原CD 105、CD45、CD34、CD31、CD40、CD29、CD44、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样本分析6000～8000个细胞。结果如表1所示：

表1第3代hUC-MSCs细胞表面标志物表达阳性率

经流式细胞术检测，如表1所示，第3代hUC-MSCs高表达CD105、CD44和CD29，低表达或不表达HLA-DR、CD31、CD45、CD40和CD34等标记物。

实施例2羊膜上皮细胞制备

人羊膜取自健康产妇(乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性),将羊膜置于含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS中漂洗2次,将其剪成约30-50cm²大小的组织块,加入足够量0.25％胰蛋白酶消化液,在37℃、200R恒温振荡器中消化15～30min,每10min取出用手剧烈摇晃，2000rpm离心5min,再加入足够2.5g/L胶原酶Ⅱ+0.05g/L Dnas酶,在37℃下消化4h,离心,再加入含角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-freemedium,KFSM),10-15ng/ml表皮生长因子(EGF)的培养液,吹打均匀,以1×10⁷个/L接种于直径为10cm的培养皿中,置体积分数为5％CO2、37℃细胞培养箱内培养2h后轻轻将未贴壁的细胞吸出,因羊膜上皮细胞贴壁较慢,混杂的间充质细胞或成纤维细胞贴壁较快,这时吸出重新培养的细胞(即差异黏附法获得的细胞)90％以上是羊膜上皮细胞。继续培养至细胞融合达到80％～90％后，传代。原代培养12h的细胞镜下观察如图2-a所示(40倍)。传代培养12h的细胞镜下观察如图2-b所示(40倍)。将第2代羊膜上皮细胞培养24h后取出(经HE染色镜下观察如图2-c，放大100倍),免疫组化鉴定细胞角蛋白CK7(图2-d)、CK8(图2-e)和CK18(图2-f)。

结果表明，镜下观察第2代羊膜上皮细胞呈圆形、透亮、折光性较强、富有立体感。经差异黏附法培养的原代细胞90％以上为人羊膜上皮细胞，混杂的间充质细胞或成纤维细胞较少,在接种12h内可下沉贴壁生长,2d后细胞进入指数生长期,细胞数量明显增多,呈不规则的多角形,4～5d左右90％细胞融合成片,形成单层(见图2-a)。传代的人羊膜上皮细胞能较快贴壁,接种4～6h后即可贴壁并开始生长,接种24h后细胞生长加速,细胞扁平变大,细胞核清晰,位于胞质中央。3～d左右细胞90％融合,呈典型的铺路石样外观(见图2-c)。苏木素伊红染色,可见细胞大小较均一,呈不规则的多角形,胞质丰富,胞核蓝染,圆形,核膜清晰,核仁明显,可见2～3个核分裂(图2-c)。免疫组化鉴定，本实施例培养的人羊膜上皮细胞的胞浆中见CK7、CK8、CK18单克隆角蛋白抗体染色阳性,胞浆呈棕黄色,胞核呈蓝紫色。表明成功分离培养了羊膜上皮细胞。

实施例3：

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4-6×10⁵/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1-1.5×10⁵/孔。每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，5ng/ml表皮生长因子(EGF)，5ug/ml胰岛素的完全培养液。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见少许AE1抗体DAB着色细胞。呈散在分布，而且细胞着色较淡。AE5抗体淡着色。

实施例4：

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4-6×10⁵/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1-1.5×10⁵/孔。每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ug/ml胰岛素的完全培养液。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见大量AE1抗体DAB着色细胞。呈散在分布，而且细胞着色最深。AE5抗体淡着色。

实施例5：

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4-6×10⁵/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1-1.5×10⁵/孔。每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，15ug/ml胰岛素的完全培养液。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见较多AE1抗体DAB着色细胞。呈散在分布，而且细胞着色较深。AE5抗体淡着色。

实施例6：

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4-6×10⁵/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1-1.5×10⁵/孔。每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，15ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ug/ml胰岛素的完全培养液。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见较多AE1抗体DAB着色细胞。呈散在分布，而且细胞着色较深。AE5抗体淡着色。

实施例7：

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4-6×10⁵/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1-1.5×10⁵/孔。每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养基(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，25ng/ml表皮生长因子(EGF)，25ug/ml胰岛素的完全培养液。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。AE1免疫组化染色结果表明，可见少许AE1抗体DAB着色细胞。呈散在分布，而且细胞着色较淡。AE5抗体淡着色。

对比例1：

选取增殖对数期3-5代hUC-MSCs接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，接种密度为1～1.5×10⁵/ml；每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养液(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，偶见AE1抗体DAB着色细胞。呈散在分布，而且细胞着色很淡。AE5抗体DAB无着色。

对比例2：

取增殖对数期的第3-5代hUC-MSCs和第2代羊膜上皮细胞，接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的Transwell共培养体系中，上室植入羊膜上皮细胞接种密度为4-6×10⁵个/孔，下室植入hUC-MSCs，接种密度为1-1.5×10⁵/孔。每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养液(Lonza UltraCULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，偶见AE1抗体DAB着色细胞。呈散在分布，而且细胞着色很淡。AE5抗体DAB无着色。

对比例3：

选取增殖对数期3-5代hUC-MSCs接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，接种密度为1～1.5×10⁵个/ml；每孔加入2.5ml含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，体积分数为55％LONZA人干细胞无血清培养液(Lonza Ultra CULTURE^TM),45％角朊细胞无血清培养基(Keratinocyte serum-free medium,KFSM)的培养液，10ng/ml表皮生长因子(EGF)，10ug/ml胰岛素的完全培养液。每隔2-3天更换新的培养液。培养7天后取出细胞爬片,按照免疫组化染色SP法试剂盒的说明书进行细胞角蛋白AE1和AE5的免疫组化染色,DAB显色。免疫组化染色结果表明，可见较多AE1抗体DAB着色细胞,。呈散在分布，而且细胞着色较深。AE5抗体淡着色。

实施例8

对实施例3～7及对比例1～3所得细胞经免疫组化检测后，对AE1、AE5染色的细胞进行计数，计算出两组的分化率进行比较。每组取样3次，分别检测后统计数据。

诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％。

统计结果如表2：

表2各组细胞分化率

注：同列肩标不同字母表示具有显著性差异(p<0.01)

实验表明，将脐带间充质干细胞和羊膜上皮细胞共培养，7天后脐带间充质干细胞部分呈分化趋势，细胞呈散在分布，经检测，hUC-MSCs分化为角膜上皮细胞的分化率可达26％。而没有进行共培养的且不添加生长因子的对比例中hUC-MSCs的分化率为2.7％；采用本发明提供培养基而不进行共培养的对比例中hUC-MSCs的分化率为7.95％；培养基中不添加生长因子但采用共培养的对比例中，hUC-MSCs的分化率为5.47％。可见，本发明提供的方法能够显著提高hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的百分率(p<0.01)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的培养基，其特征在于，由基础培养液、表皮生长因子和胰岛素组成；

所述表皮生长因子的含量为5ng/mL～25ng/mL；所述胰岛素的含量为5μg/mL～25μg/mL；

所述基础培养液为人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基，所述人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为(50～60):(44～50)。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，还包括青霉素和链霉素。

3.诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，其特征在于，将脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞共培养；所述培养的培养基如权利要求1～2任一项所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述共培养为间接共培养。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞与羊膜上皮细胞的个数比为(1～1.5):(4～6)。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为第3～5代；所述羊膜上皮细胞为第2代。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述共培养的时间为7天。