CN102618497A - 利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，通过人骨髓间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞非接触式共培养而使所述人骨髓间充质干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞；与现有技术相比，本发明通过人骨髓间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞非接触式共培养而使所述人骨髓间充质干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，分化的视网膜色素上皮细胞具有原代视网膜色素上皮细胞的重要表型和生理功能，而且分化时间短、分化效率高、在培养过程中无诱导细胞的混杂污染。

Description

利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法。

背景技术

视网膜变性疾病是一类严重的致盲性疾病，主要包括视网膜色素变性(Retinal pigment degeneration，简称RP)和年龄相关性黄斑变性(Agerelatedmacular degeneration，简称AMD)等。此类疾病发病机理不明、有效防治手段有限，严重危害患者的生活质量，每年在全球范围内造成数千亿计的巨大损失。此类疾病的病理过程均是因视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium，简称RPE)的变性死亡所引致。故应用RPE细胞进行替代性移植治疗成为治疗此类疾病的重要手段，但RPE细胞来源有限，限制了移植治疗的临床应用。

目前人胚胎干细胞诱导分化的RPE细胞成为了细胞移植治疗的研究热点，已有大量离体及在体实验证明该细胞具有类似甚至优于原代分离的人的RPE细胞。但胚胎干细胞用于人体仍然存在伦理和免疫排斥的问题，且胚胎干细胞诱导分化成色素上皮细胞存在分化效率较低、时间较长等不足。

近年来，为寻找自体来源的细胞有人尝试将人脂肪间充质干细胞在离体条件下诱导分化为RPE细胞，采用的方法是通过离心获取原代培养一周的RPE细胞的培养液上清作为条件培养液诱导人脂肪间充质干细胞进行分化，该方法诱导出的细胞具有RPE细胞的表型，但不具备RPE细胞典型的色素颗粒，也还尚未对该细胞进行功能学的检测，另外，离心获取的条件培养液仍可能混有原代细胞而导致细胞混杂污染。

因此，需要一种诱导分化自体来源细胞为RPE细胞的方法，使分化的RPE细胞具有原代RPE细胞的重要表型和生理功能，而且分化时间短、分化效率高、在培养过程中无诱导细胞的混杂污染。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供一种人的骨髓间充质干细胞(Mesenchymalstem cells，简称MSC)诱导分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)的方法，分化的RPE细胞具有原代RPE细胞的重要表型和生理功能，而且分化时间短、分化效率高、在培养过程中无诱导细胞的混杂污染。

本发明提供了一种利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，将人骨髓间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞非接触式共培养诱导所述人骨髓间充质干细胞分化。

优选的，所述非接触式共培养采用的视网膜色素上皮细胞为原代视网膜色素上皮细胞；视网膜色素上皮细胞的原代细胞比传代细胞具有更强的蛋白表达及分泌能力，比如视网膜色素上皮细胞的第3代传代细胞几乎丧失了表达诸如RPE65蛋白等重要功能蛋白的能力。

优选的，所述非接触式共培养包括如下步骤：

a.接种人骨髓间充质干细胞于细胞培养孔板中，加入培养液，放置培养至细胞贴壁，弃孔板中的培养液；

b.接种视网膜色素上皮细胞于Transwell小室中；

c.将步骤b中的Transwell小室置于步骤a中的孔板中，加入培养液，形成非接触式共培养体系，放置培养，并定期更换培养液至细胞分化；

d.将步骤c中分化的细胞进行消化传代。Transwell小室是一类有通透性的杯状的装置，杯子底层有一张通透性膜，膜上有微孔，孔径大小有0.1-12.0μm，而杯子其余部分材料与普通孔板相同。将Transwell小室放入细胞培养孔板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以膜相隔。培养于普通培养板中的原代RPE细胞在离体培养一周后蛋白表达及分泌能力急剧下降，而极性生长于膜上的RPE细胞相比培养于塑料培养板中的RPE细胞能更好的维持蛋白表达和分泌各种因子的能力，即微孔膜能够为RPE细胞的极性生长提供良好的基础，因此采用Transwell小室具有较传统培养方式收集的条件培养液更好的诱导分化微环境。本发明采用Transwell小室的非接触式共培养的培养方式为人MSC提供了定向分化微环境，且避免了诱导细胞的混杂污染。

优选的，步骤a中：所述人骨髓间充质干细胞采用第3-6代传代细胞；所述接种人骨髓间充质干细胞采用的接种密度为每孔2×10⁴细胞；所述培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液。

优选的，步骤b中：所述视网膜色素上皮细胞为猪视网膜色素上皮细胞；所述接种视网膜色素上皮细胞采用的接种密度为每孔2×10⁴细胞；所述Transwell小室使用的膜孔径为1.0μm。与步骤a中人骨髓间充质干细胞的接种密度一致，上下室中采用基本等量的细胞，以利于形成浓度适宜的诱导分化微环境。1.0μm孔径相较于0.4μm孔径的膜具有更好的透明性，可以在倒置显微镜下通过调焦直接观察RPE细胞的生长状态。

优选的，步骤c中：所述培养液为含20％胎牛血清的DMEM/F12培养液；所述加入培养液为向Transwell上室加入1份培养液，向Transwell下室加入3份培养液；所述定期更换培养液为放置培养5-7天后首次更换培养液，首次更换后每2-3天更换一次。培养液中20％的胎牛血清相对10％的胎牛血清，其浓度高于常规血清，有促进细胞分化的作用。

优选的，步骤a或/和步骤c中所述放置培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行。

优选的，步骤c中所述定期更换培养液为放置培养7天后首次更换培养液，首次更换后每2.5天更换一次至14天。该方法两周的时间即完成对人MSC向RPE细胞的诱导，且经检测，诱导效率大于90％。

优选的，步骤d中所述消化传代用胰酶按1∶2消化传代。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明通过人骨髓间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞非接触式共培养而使所述人骨髓间充质干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，分化的RPE细胞具有原代RPE细胞的重要表型和生理功能，而且分化时间短、分化效率高、在培养过程中无诱导细胞的混杂污染。

附图说明

图1A-1D为本发明人骨髓间充质干细胞诱导前后的细胞形态变化示意图；

图2A-2I为本发明人骨髓间充质干细胞诱导前后的免疫组化荧光鉴定示意图；

图3为本发明人骨髓间充质干细胞诱导前后的视网膜色素上皮细胞相关基因的表达水平柱状图；

图4A-4C为本发明人骨髓间充质干细胞诱导前后吞噬感光细胞外节段示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图来详细说明本发明，这些实施例和附图仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明不限于下述实施方式或实施例，凡不违背本发明精神所做出的修改及变形，均应包括在本发明范围之内。

本实施例中，所述非接触式共培养采用的视网膜色素上皮细胞为原代视网膜色素上皮细胞，当然也可以采用传代培养的视网膜色素上皮细胞，均能够实现发明目的，但采用原代视网膜色素上皮细胞效果较佳。

本实施例中，所述非接触式共培养包括以下步骤：

a.接种人骨髓间充质干细胞于细胞培养孔板中，加入培养液，放置培养至细胞贴壁，弃孔板中的培养液；

本步骤中，所述人骨髓间充质干细胞采用第3代传代细胞；所述接种人骨髓间充质干细胞采用的接种密度为每孔2×10⁴细胞；所述培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，本培养液为外购成品；所述放置培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行；

b.接种视网膜色素上皮细胞于Transwell小室中；

本步骤中，所述视网膜色素上皮细胞为猪视网膜色素上皮细胞；所述接种视网膜色素上皮细胞采用的接种密度为每孔2×10⁴细胞；所述Transwell小室使用的膜孔径为1.0μm；

c.将步骤b中的Transwell小室置于步骤a中的孔板中，加入培养液，形成非接触式共培养体系，放置培养，并定期更换培养液至细胞分化；

本步骤中，所述培养液为含20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，所述加入培养液为向Transwell上室加入1ml培养液，向Transwell下室加入3ml培养液；所述定期更换培养液为放置培养7天后首次更换培养液，首次更换后每2.5天更换一次至14天；所述放置培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行。经检测，诱导效率为95％。

d.将步骤c中分化的细胞进行消化传代；所述消化传代用胰酶按1∶2消化传代。通过上述诱导方法，2周的时间即可完成对人MSC向RPE细胞的诱导，如图1A-图1D所示人MSC诱导前后的细胞形态变化，图1A为诱导前的人MSC细胞形态，呈长梭形；图1B为共培养诱导7天的人MSC细胞形态，呈纺锤形、梭形，增殖迅速，细胞内出现色素颗粒；图1C为共培养诱导14天的人MSC细胞形态，呈多边形，细胞内有大量色素颗粒，与原代RPE细胞形态特征一致，说明人骨髓间充质干细胞成功诱导分化为RPE细胞；图1D为分化的RPE细胞传代一次后的形态，仍呈多边形，细胞内充满色素颗粒，即该细胞可传代培养。

进一步对共培养诱导前后的人MSC作免疫组化鉴定，如图2A-图2I所示，诱导后的细胞具有与原代视网膜色素上皮细胞表达重要功能蛋白如胞内视黄醛结合蛋白(CRALBP)、RPE65蛋白、紧密连接蛋白(ZO-1)的能力。图2A和图2B分别为人MSC诱导前、后的CRALBP蛋白免疫组化荧光鉴定图，图2C为原代RPE细胞鉴定图，说明经诱导有CRALBP蛋白的表达；图2D和图2E分别为人MSC诱导前、后的RPE65蛋白免疫组化荧光鉴定图，图2F为原代RPE细胞鉴定图，说明经诱导有RPE65蛋白的表达；图2G和图2H分别为人MSC诱导前、后的ZO-1蛋白免疫组化荧光鉴定图，图2I为原代RPE细胞鉴定图，说明经诱导有ZO-1蛋白的表达。

对6个RPE细胞相关基因在诱导前后的人MSC中的表达水平做了检测，诱导后的细胞中这6个基因的表达水平上调，如图3所示，横坐标为6个基因，分别是RPE65、Bestropin、PEDF、PMEL17、CRALBP、PAX6，纵坐标为基因的表达水平，黑色柱表示诱导后的基因表达水平，白色柱表示诱导前的基因表达水平，柱越高即表达水平越高。进一步说明人MSC成功分化为RPE细胞。

人MSC培养诱导前后吞噬感光细胞外节段4小时如图4A-图4C所示，图4A和图4B分别为诱导前、后吞噬感光细胞外节段荧光图，图4C为原代RPE细胞吞噬感光细胞外节段荧光图，说明人MSC经诱导提高了吞噬感光细胞外节段能力。

上述对诱导后的细胞的表型和功能鉴定，证明分化的RPE细胞具有原代RPE细胞的重要表型和生理功能，其分化时间短，诱导效率大于90％，且无诱导细胞的混杂污染。对于非接触式共培养步骤a中，人骨髓间充质干细胞可在第3-6代中进行选择，经试验得知，均能够实现发明目的，但第3代具有更加的效果；步骤c中，定期更换培养液可为放置培养5-7天后首次更换培养液，首次更换后可每2-3天更换一次，均能够实现发明目的，但放置培养7天后首次更换培养液，首次更换后每2.5天更换一次效果最佳。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：将人骨髓间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞非接触式共培养诱导所述人骨髓间充质干细胞分化。

2.根据权利要求1所述的利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：所述非接触式共培养采用的视网膜色素上皮细胞为原代视网膜色素上皮细胞。

3.根据权利要求1或2所述的利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：所述非接触式共培养包括以下步骤：

a.接种人骨髓间充质干细胞于细胞培养孔板中，加入培养液，放置培养至细胞贴壁，弃孔板中的培养液；

b.接种视网膜色素上皮细胞于Transwell小室中；

c.将步骤b中的Transwell小室置于步骤a中的孔板中，加入培养液，形成非接触式共培养体系，放置培养，并定期更换培养液至细胞分化；

d.将步骤c中分化的细胞进行消化传代。

4.根据权利要求3所述的利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤a中：所述人骨髓间充质干细胞采用第3-6代传代细胞，所述接种人骨髓间充质干细胞采用的接种密度为每孔2×10⁴细胞，所述培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液。

5.根据权利要求4所述利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤b中：所述视网膜色素上皮细胞为猪视网膜色素上皮细胞，所述接种视网膜色素上皮细胞采用的接种密度为每孔2×10⁴细胞，所述Transwell小室使用的膜孔径为1.0um。

6.根据权利要求5所述利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤c中：所述培养液为含20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，所述加入培养液为向Transwell上室加入1份培养液，向Transwell下室加入3份培养液，所述定期更换培养液为放置培养5-7天后首次更换培养液，首次更换后每2-3天更换一次。

7.根据权利要求6所述的利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤a或/和步骤c中所述放置培养是在37℃和5％CO₂培养箱中进行。

8.根据权利要求7所述的利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤c中所述定期更换培养液为放置培养7天后首次更换培养液，首次更换后每2.5天更换一次至14天。

9.根据权利要求8所述的利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，其特征在于：步骤d中所述消化传代用胰酶按1∶2消化传代。

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