CN102533647B

CN102533647B - 一种诱导干细胞神经分化的方法

Info

Publication number: CN102533647B
Application number: CN201210001817.1A
Authority: CN
Inventors: 李廷玉; 毕杨; 龚敏; 陈洁; 魏小平; 张贇
Original assignee: Childrens Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: Yeacell Biotechnology, Inc.
Priority date: 2012-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2032-01-05
Also published as: CN102533647A

Abstract

本发明使用全反式维甲酸（all-transretinoicacid,ATRA)作为诱导剂，改良神经诱导培养基（modifiedneuronalinductionmedium,MNM）作为培养基处理干细胞，能有效促进干细胞神经分化，提高分化率和存活率，制备更具神经元功能的神经样细胞，为神经细胞的发育研究提供了一个较好的体外模型，为干细胞用于临床治疗神经系统疾病提供强有力的依据。

Description

一种诱导干细胞神经分化的方法

技术领域

本发明涉及细胞工程技术，涉及一种促进干细胞神经分化的体外诱导方法。

背景技术

神经系统难治性疾病多由于神经系统损伤导致大量神经元结构和功能的缺失，传统的观点认为神经细胞缺乏再生能力，无法产生新的神经元建立突触联系，神经损伤不可逆转。而近年来研究发现，将干细胞移植到病损或受伤的脑组织中，可产生新的神经细胞，从结构及功能上对神经系统进行修复和改善。干细胞尤其是成体干细胞作为一种新型的生物治疗方法是医学发展史上一个开创性的探索。

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是存在于骨髓、外周血和脐血等组织中的一类具有自我更新及跨胚层分化能力的干细胞，体外研究发现，MSCs在特定的诱导环境下可分化为神经样细胞，动物实验也显示骨髓间充质干细胞移植可在中枢神经系统内存活并能分化为有功能的神经样细胞[1]。MSCs取材和体外扩增方便，不受伦理学的限制，具有免疫耐受的优势，体内移植易于控制，为神经系统疾病治疗带来了新的希望。如何提高MSCs的神经分化效率及功能替代作用是MSCs用于神经系统疾病治疗的关键。

目前，MSCs体外定向成神经诱导有化学诱导法、神经营养因子诱导法、神经细胞共培养法等，这些方法均可实现对MSCs的定向成神经诱导，但各有优劣。其中，Woodbury化学诱导法是目前常用的诱导大鼠MSCs成神经分化的方法，MSCs在体外各种化学诱导剂及生长因子培养条件下向神经样细胞的转化率高达50%-90%，但分化后的细胞多只证实具有神经细胞形态及表面标志的表达，是否具有成熟的神经细胞功能还鲜有报道，且诱导后的神经样细胞极易发生调亡，存活时间短。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种诱导干细胞神经分化的方法，能有效促进干细胞神经分化。

本发明的另外一个目的在于提供一种表达相关神经标志蛋白，并具有神经元细胞功能的神经样细胞。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于使用全反式维甲酸（all-trans- Retinoic Acid，ATRA)作为诱导剂，改良神经诱导培养基（modified neuronal induction medium, MNM）作为培养基处理干细胞。

为了更有效的促进干细胞神经分化，所述ATRA的浓度优选为1μM。更优选地，所述ATRA诱导时间为24小时。

进一步地，为了提高干细胞向神经元定向分化的分化率和存活率，所述MNM的配方为2%DMSO，200μM BHA，25mM KCL，2mM丙戊酸，8μM forsklin，lμM 氢化可的松和5μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养液。分化率能达到86%，存活率能达到近100%。

更进一步地，所述干细胞为骨髓间充质干细胞。具体的说，所述骨髓间充质干细胞来源于大鼠。

上述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于由以下步骤组成：

1.分离培养及鉴定原代大鼠MSCs

2.诱导原代大鼠MSCs分化：加入ATRA进行预诱导24小时，再加入MNM诱导24小时。

1.分离培养及鉴定原代大鼠MSCs：取SPF级4～8周龄SD大鼠，取股骨，5ml空针吸取DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，离心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青链霉素完全培养基吹打，按3×10⁶个/瓶的浓度接种在底面积25cm² 的的塑料培养瓶中，置于37℃, 5%CO2湿化孵箱中培养，24小时后倾去上清液及未贴壁细胞，加入新鲜培养液。随后每3天换液。细胞融合度达80%后胰蛋白酶消化离心，按1：2或1：3的浓度传代，3-5代细胞用于实验。流式细胞技术检测CD106、CD90、CD45、CD34等干细胞标志。

2.MSCs神经诱导方案的优化：MSCs以3×10⁵/ml浓度接种于培养瓶，培养皿或细胞孔板中，6-8小时细胞贴壁后加入终浓度为0-100μM的ATRA进行预诱导，24小时后全量换液去除预诱导液，D-hank’s 洗细胞2-3次，尽量去除残留血清，加入MNM诱导24小时。光镜下观察细胞存活情况及神经样细胞的形态，计算神经分化效率。Real-time PCR 检测神经细胞相关标志的表达水平，胎盘蓝染色实验检测分化后神经样细胞的存活率，确定最佳诱导方案。

3.诱导后神经样细胞的鉴定：免疫荧光检测NESTIN、NES、MAP-2、NF等神经元标志GFAP、CD68、BNDF等神经表面标志。全细胞膜片钳检测细胞静息电位，钙影像测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。

一种具有一定神经元功能的神经样细胞，由上述诱导干细胞神经分化的方法制得。

本发明的有益效果

1. 本发明诱导干细胞向神经样细胞分化的效率提高22.66%，干细胞向神经样细胞分化后的存活率提高12.58%，同时具有较高的分化率和存活率。

2. 本发明诱导干细胞更容易向神经元而不是胶质神经细胞分化，分化后的神经样细胞更具有神经元功能。为神经细胞的发育研究提供了一个较好的体外模型，为干细胞用于临床治疗神经系统疾病提供强有力的依据。

附图说明

图1是原代大鼠MSCs的细胞形态：1. 光镜，2. H.E染色（100×）

图2是流式细胞技术检测第3代MSCs的干细胞表面标志CD106，CD90，CD45，CD34

图3是MSCs经不同浓度ATRA预诱导24小时再MNM神经诱导24小时的神经样细胞光镜图

图4是 MSCs经不同浓度ATRA预诱导后MNM神经诱导24小时NESTIN ,NSE,MAP-2的real-time PCR 检测图

图5是MSCs分化的神经样细胞的神经元及神经胶质细胞相关标志NESTIN，NSE，MAP-2，GFAP，CD68 RT-PCR检测图

图6 是MSCs分化的神经样细胞的神经元及神经胶质细胞相关标志NESTIN,NSE,MAP-2,GDNF的免疫荧光检测图

图7是1μM ATRA预诱导联合MNM诱导MSCs成神经样细胞过程中NETIN、NSE表达的Western blot检测图

图 8是MSCs及诱导后神经样细胞的细胞静息膜电位比较图

图9是MSCs及诱导后神经样细胞的胞内钙离子浓度比较图

图10是MSCs及诱导后神经样细胞的8分钟动态跟踪340nm/380nm 荧光强度比值图

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。

本发明实施例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》（Sambrook和Russell,2001）

实施例1

第一步，分离培养及鉴定原代大鼠MSCs：取SPF级4～8周龄SD大鼠，无菌条件下取股骨，5ml空针吸取DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，离心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青链霉素完全培养基吹打，按3x10⁶个／瓶的浓度接种在25cm² 的塑料培养瓶中，置于37℃, 5%CO₂湿化孵箱中培养，24小时后倾去上清液及未贴壁细胞，换液后，可见rMSCs呈散在的细胞集落样生长，细胞个体呈扁平梭形，集落中央的细胞形态较圆，集落边缘的细胞为扁平梭形。4～5天左右细胞数量明显增加，集落逐渐扩大。6～7天细胞基本铺满瓶底，形态较均一呈梭形且呈漩涡状生长（见图1）。传代细胞均匀分布，生长迅速，约3～4天可铺满瓶底，细胞多呈梭形，漩涡状生长。MSC传至第3代，流式细胞技术检测大鼠MSCs的细胞表面标志：取接近融合的第3代MSCs，用胰酶消化后，PBS洗涤3次，制成1×10⁶/ml的单细胞悬液。取100 μl细胞悬液5管：a管为标准对照，加IgG1-FITC单克隆抗体，b管加CD34-FITC单克隆抗体，c管加CD45-PE单克隆抗体，d管加CD90-PE单克隆抗体，e管加CD106-PE单克隆抗体，室温反应30 min，流式细胞仪 (FACSCanto TM Ⅱ system，BD Biosciences)检测。CellQuest Pro software (BD Biosciences) 分析结果显示：99%以上的MSC表达CD106、CD90，几乎不表达CD45和CD34（见图2），提示分离获得的骨髓间充质干细胞纯度较高，且没有骨髓造血干细胞混杂。

第二步，不同浓度ATRA预诱导联合MNM对骨髓间充质干细胞神经分化的作用：

细胞培养及诱导神经分化：采用3-5代的MSCs，初始密度为50%接种于培养瓶或24孔板，DMEM/F12/10%FBS完全培养基培养，4-5小时细胞贴壁后分别加入终浓度为0.01、0.1、1、10、100μM的ATRA，预诱导24小时后，弃去完全培养基，D-hank’s液洗细胞两次，加入MNM神经诱导液（含2% DMSO，200 μM BHA，20 mM KCL，1.6 mM丙戊酸，8 μM Forskolin，0.8 μM氢化可的松，4 μg/ml胰岛素的DMEM/F12无血清培养基）诱导细胞24小时，无ATRA预诱导，仅MNM神经诱导24小时设为对照组。

光镜下观察细胞形态，计算分化效率：加入预诱导液24 小时内，细胞形态未见明显改变。更换MNM诱导后在倒置显微镜下观察，诱导1 小时即可见部分细胞胞体开始收缩，折光性增强，并逐渐伸出突起，向神经细胞形态转变，随时间推移，细胞胞体收缩更加明显，突起增多增长。预诱导的ATRA浓度在0.01-10μM范围内，ATRA浓度越高，神经样细胞分化效率越高，呈双极或多极神经元细胞形态，神经元胞体直径越大，轴突更长（图3，表1， * p<0.05）。100Μm ATRA预诱导处理的MSC神经分化迅速，但24小时大部分细胞死亡，无法计算神经分化效率。

诱导后神经样细胞的存活率：在倒置显微镜下动态观察各诱导阶段细胞状态，未经ATRA预诱导的细胞24小时后可观察到部分神经元表型细胞逐渐脱壁、漂浮、死亡，36小时大部分神经样细胞死亡。台盼蓝染色计算细胞存活率：胰酶消化贴壁细胞，收集贴壁及漂浮细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。细胞悬液与0.08%台盼蓝溶液以1:1混合混匀，加10ul细胞混合液入计数板，镜下观察，蓝色为死细胞，拒染呈无色透明状为据染的活细胞。在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。计算细胞存活率(%)= 活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。ATRA预诱导浓度在0.01-1μM，神经样细胞24小时的存活率明显增高，而ATRA浓度高于10μM后，神经样细胞的死亡率反而高于未预诱导组（见图3，表1，* p<0.05）。

下表(表1)是不同浓度ATRA预诱导24小时再MNM神经诱导24小时后MSC的神经分化效率，神经元胞体直径，轴突长度和细胞死亡率（*p<0.05 vs MNM单独培养组）

Real-time PCR检测诱导后神经样细胞的神经相关蛋白表达：MNM诱导24小时后，提取各组细胞总RNA，逆转录为cDNA，进行real-time PCR扩增(PCR反应体系20 μl：2 μl cDNA模板，330 ng/μl primers各0.5 μl，2×SYBR Green反应液10 μl，加水至20 μl；PCR参数：94℃ 3 min；94℃ 10 s，54℃20 s，72℃ 20 s，40 循环；溶解曲线 65℃~95℃ 每5s增加0.5℃，读板)，同时做GAPDH为内参平行管，检测神经标志蛋白表达水平，结果显示显示：1μM ATRA预诱导后再神经诱导的细胞最高的表达神经相关标志NESTIN、NSE、MAP-2（见图4）。

第三步 1μM ATRA预诱导联合MNM 体外诱导MSCs神经分化的鉴定：

从不同浓度ATRA预诱导对MSC神经分化作用的结果来看，我们选择了神经分化效率最高，细胞存活最高的ATRA诱导浓度1μM进行预诱导，方法同第二步。

MNM诱导后24小时进行Real-time PCR及免疫荧光检测分化后细胞的神经标志蛋白表达。Real-time PCR方法同第二步。免疫荧光方法：在24孔板中同上设置各诱导组，吸弃培养基，PBS洗涤一次，加500 μl甲醇/孔，-20℃固定15 min；5%牛血清白蛋白500 μl/孔，室温封闭1h；各神经标志蛋白一抗(1:500稀释于PBS)4℃摇动孵育过夜；Dylight488标记的二抗(1:1000稀释于PBS)室温摇动孵育30 min；PBS 洗涤5 min×3次，立即置于倒置荧光显微镜下观察照相，Image J软件测定荧光灰度值。Real-time PCR及免疫荧光结果显示ATRA预诱导+MNM诱导的神经样细胞较MNM单独诱导能更高的神经元表面标志NESTIN、NSE及MAP-2，而神经胶质细胞表面标志GFAP、CD68及GDNF表达下降，提示ATRA预诱导促进MSCs在后续的环境中向神经元而不是胶质神经细胞分化。ATRA单独预诱导不引起MSCs的形态改变，和成熟神经元表面标志的表达，仅神经干细胞NESTIN的表达稍有增加（见图5、图6）。

Western blot检测诱导过程中Nestin和NSE表达的变化：在6孔板中接种MSCs，1μM ATRA预诱导联合MNM诱导，于ATRA预诱导后24小时，MNM诱导后3、6、9、18、24、36小时提取总蛋白，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，每组蛋白上样量一致，80V转膜1 h至PVDF膜。用5%脱脂奶粉室温封闭1~2 h，加入抗Nestin、NSE 一抗(1:200)或β-actin抗体(1:200)，4℃过夜；洗膜，加入HRP标记的二抗(1:2000)，室温30 min；ECL发光，用Image Pro Plus 6.0软件分析灰度值。结果显示，该方案诱导MSCs体外分化过程中，NSE的表达逐渐增高，而NESTIN表达先增高，于MNM诱导后18小时达顶峰，随后下降，NSE和NESTIN的表达趋势符合神经元的发育中的表达模式，该诱导方法为神经细胞的发育研究提供了一个较好的体外模型。（见图7）

第四步 MSCs诱导后神经样细胞的功能检测

全细胞膜片钳检测细胞静息电位：神经分化组选取折光性强、带有两个或多个长突起、胞体较圆的神经样细胞进行实验。微电极外径1.2mm、内径0.5mm，冲灌电极内液。电阻为2～5M，采样频率10 kHz，低通滤波为1 kHz。采用高阻抗封接技术，负压打孔，形成细胞钳制。用AXOPATCH 200B放大器常法进行全细胞记录。对照组MSCs静息膜电位为-10.48±2.75mV，经MNM诱导后所得神经元样细胞静息膜电位明显增高，为-31.9±7.18 mV（* p<0.05），提示此神经元样细胞除了在形态上有神经元的特点，可能也有电生理的类似功能。ATRA预诱导在MSCs分化为神经细胞过程中可促进其成熟和功能完善，经ATRA预诱导再MNM诱导后所得神经元样细胞又较单独经MNM诱导的神经元样细胞有更大负值膜电位-43.92±5.71（# p<0.05）（见图8）。

钙影像测定：细胞内钙离子参与了神经元突触间信号的促发，通过钙影像检测胞内钙离子浓度的高低可以反映神经元样细胞的功能情况。将MSCs种在置于六孔板中的涂有L型多聚赖氨酸的盖玻片上，诱导处理同上。加入Fura-2（缓冲盐水/3μM Fura-2-acetoxymethylester/1.6μM pluronic F127）后37 oC培养45分钟。用50 mM KCl刺激细胞，用带有CCD摄像机的倒置Olympus IX70显微镜记录荧光获取Fura-2在340nm和380nm激发的图像信号，这两个信号的比值与钙离子的浓度成正比，用Metaflour 软件(UniversalImaging Corp.)进行分析。结果显示：50mM KCL 刺激状态下，未诱导的MSCs 340nm/380nm 荧光比值为0.087±0.043，MNM单独诱导分化的神经元样细胞340nm/380nm 荧光比值为0.272±0.062，而经ATRA预诱导再MNM诱导的神经元样细胞340nm/380nm 荧光比值为0.426±0.124, 提示其胞内钙离子浓度较单独MNM诱导的神经样细胞更高，（* p<0.05）。（见图9）。8分钟动态跟踪340nm/380nm 荧光强度比在各不同处理组别中亦可见相同趋势。（见图10）

结果证实ATRA预诱导联合MNM诱导MSCs所得神经元样细胞在功能上具有更大优势。

<110> 重庆医科大学附属儿童医院

<120>一种诱导干细胞神经分化的方法

<160> 10

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>用于检测Nestin基因PCR反应的上游引物

<400> 1

1 GGGCAAGTGGAACGTAGA 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>用于检测Nestin基因PCR反应的下游引物

<400> 2

1 TCCCACCGCTGTTGATTT 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>用于检测NSE基因PCR反应的上游引物

<400> 3

1 CTGTTTGCTGCTCAAGGTC 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>用于检测NSE基因PCR反应的下游引物

<400> 4

1 TCCCACTACGAGGTCTGC 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>用于检测MAP-2基因PCR反应的上游引物

<400> 5

1 GTATCAGGAGACAGGGAGGAG 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测MAP-2基因PCR反应的下游引物

<400> 6

1 GGGGTAGTAGGTGTTGAGGTG 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>用于检测GFAP基因PCR反应的上游引物

<400> 7

1 GAGTGGTATCGGTCCAAGTT 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测GFAP基因PCR反应的下游引物

<400> 8

1 CTCAAGGTCGCAGGTCAA 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测CD68基因PCR反应的上游引物

<400> 9

1 GGGCTCTTGGAAACTACAC 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测CD68基因PCR反应的下游引物

<400> 10

1 TTTGTTCGGGTTCAATACAG 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测β-actin基因PCR反应的上游引物

<400> 11

1 GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> 用于检测β-actin基因PCR反应的下游引物

<400> 12

1 GAGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGA 23

Claims

1.一种诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于使用全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）作为诱导剂，改良的神经诱导培养基（modified neuronal induction medium，MNM）作为培养基处理干细胞；所述ATRA的浓度为1μM；所述ATRA诱导时间为24小时；所述MNM的配方为2%DMSO，200μM BHA，25mM KCL，2mM丙戊酸，8μM forsklin，lμM氢化可的松和5μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养液；所述干细胞为骨髓间充质干细胞；所述骨髓间充质干细胞来源于大鼠。

2.根据权利要求1所述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于由以下步骤组成：

(1)分离培养及鉴定原代大鼠MSCs；

(2)诱导原代大鼠MSCs分化：加入ATRA进行预诱导24小时，再加入改良的神经诱导培养基MNM诱导24小时。

3.根据权利要求2所述诱导干细胞神经分化的方法，其特征在于由以下步骤组成：

（1）分离培养及鉴定原代大鼠MSCs：取SPF级4～8周龄SD大鼠，取股骨，5ml空针吸取DMEM/F12反复冲洗骨髓腔及干垢端，离心去上清，加DMEM/F12/10%FBS/1%青链霉素完全培养基吹打，按3×10⁶个／瓶的浓度接种在25cm² 的塑料培养瓶中，置于37℃，5%CO₂湿化孵箱中培养，24小时后倾去上清液及未贴壁细胞，加入新鲜培养液；随后每3天换液；细胞融合度达80%后胰蛋白酶消化离心，按1：2或1：3的浓度传代，3-5代细胞用于实验；流式细胞技术检测CD106、CD90、CD45、CD34干细胞标志；

（2）MSCs神经诱导方案的优化：MSCs以3×10⁵/ml浓度接种于培养瓶，培养皿或细胞孔板中，6-8小时细胞贴壁后加入终浓度为0-100μM的ATRA进行预诱导，24小时后全量换液去除预诱导液，D-hank’s 洗细胞2-3次，尽量去除残留血清，加入改良的神经诱导培养基MNM诱导24小时；光镜下观察细胞存活情况及神经样细胞的形态，计算神经分化效率；Real-time PCR 检测神经细胞相关标志的表达水平，胎盘蓝染色实验检测分化后神经样细胞的存活率，确定最佳诱导方案；

（3）诱导后神经样细胞的鉴定：免疫荧光检测神经元标志NESTIN、NES、MAP-2、NF，以及神经表面标志GFAP、CD68、BNDF；全细胞膜片钳检测细胞静息电位，钙影像测定KCl刺激后细胞的胞内钙离子浓度变化。