CN106566803A - 一种培养液及其应用和培养脐带间充质干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种培养液及其应用和培养脐带间充质干细胞的方法。本发明提供的培养液包括无血清培养液、白蛋白、干细胞因子和表皮细胞生长因子。以本发明提供的培养液培养脐带间充质干细胞，能够提高脐带间充质干细胞的数量和细胞活率，且细胞干性维持良好。实验表明，以本发明提供的培养基培养脐带间充质干细胞，所得细胞密度可达1.2×107cell/mL；细胞活率达95％以上，流式细胞检测表面标志物，完全符合脐带间充质干细胞特性。

Description

一种培养液及其应用和培养脐带间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种培养液及其应用和培养脐带间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我复制、自我更新、多方向分化潜能、造血支持以及免疫调控等特性。目前，主要从脂肪、骨髓、脐带、胎盘组织中提取间充质干细胞。间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，为临床治疗各种疾病，如神经系统疾病、肾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗提供了新的途径。此外，间充质干细胞能在培养过程中可分泌多种干细胞因子，包括血管内皮生长因子(vEGF)、胎盘生长因子(PGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)等在内的各种生长因子，这些生长因子可参与多种细胞反应，促进细胞生长，维持细胞干性，收集条件培养基是获得这些活性成分的有效方法。
来源于人脐带的间充质干细胞，取材方便，来源丰富，易于采集和运输，生物学特性稳定，免疫原性低，无异体排斥反应，成本低，对捐献者无损害及不涉及伦理问题等优势，使其成为未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想选择。
目前培养脐带间充质干细胞所使用的培养基配方多为DMEM-F12+血清，或在此基础上添加一些其他的细胞生长所需的营养物质，可适用于脐带间充质干细胞的大规模培养和动物实验。但是，血清中未知成分较多，甚至有可能包括一些未知的过敏原和病原体，一方面会干扰实验结果，另一方面是无法保证其所培养的细胞的安全性，无法应用于临床研究。而目前培养的无血清培养基用于脐带间充质干细胞的培养的效果不佳，细胞生长缓慢且活力低。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养液及其应用和培养脐带间充质干细胞的方法。本发明提供的培养液能够促进脐带间充质干细胞的生长，且所得细胞活力较高。
本发明提供的细胞培养液，包括无血清培养液、白蛋白、干细胞因子和表皮细胞生长因子；其中，
白蛋白的体积分数为10％～20％；
干细胞生长因子的浓度为1mg/mL～2mg/mL；
表皮细胞生长因子的浓度为5ng/mL～15ng/mL。
白蛋白(又称清蛋白，albumin,Alb)是由肝实质细胞合成，在血浆中的半衰期约为15天～19天，是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40％～60％。本发明中，所述白蛋白为人血清白蛋白。
干细胞因子(stem cell factors,SCF)：是一种重要的多功能细胞因子，在干细胞培养过程中，细胞会分泌活性物质到培养液中，它能刺激早期干细胞的增殖及定居，并维持干细胞的干性。
本发明中，干细胞因子可为自制也可为市场购得，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的干细胞因子的制备方法为：用DMEM-F12+10％FBS培养P1～P5代的脐带间充质干细胞，接种密度为1-10×105cell/ml，3天一换液；当细胞生长融合度达80％以上时，以PBS清洗细胞两遍，用1640选择培养基培养细胞，2d后收集培养上清液，经浓缩、干燥制得干细胞因子。其中浓缩采用Slice200切向流过滤，过滤时间为3h，期间经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，滤液再经0.22μm滤膜过滤除去3kDa以下小颗粒物质。浓缩后液体蛋白质浓度约为1000mg/L干燥采用冷冻干燥。
表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)：其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。
无血清培养基(serum free medium,SFM)：是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。简单地认为是体外细胞培养过程中的细胞培养基中不含有动物或人的血清，称为无血清细胞培养基。本发明采用的无血清培养液为DMEM-F12。
一些具体实施例中，细胞培养液中包括：无血清培养液、体积分数为20％的白蛋白、浓度为1.5mg/mL的干细胞生长因子和浓度为10ng/mL的表皮细胞生长因子。
一些具体实施例中，细胞培养液中包括：无血清培养液、体积分数为15％的白蛋白、浓度为1mg/mL的干细胞生长因子和浓度为15ng/mL的表皮细胞生长因子。
一些具体实施例中，细胞培养液中包括：无血清培养液、体积分数为10％的白蛋白、浓度为2mg/mL的干细胞生长因子和浓度为5ng/mL的表皮细胞生长因子。
本发明在无血清培养基中添加白蛋白、干细胞因子、表皮细胞生长因子；该无血清培养基配方采用的蛋白全为人源性蛋白及人工合成的化合物，因此成分确定，避免血清的抑制因子TGF-b浓度不同和未知成分的干扰，减少过敏原。实验表明，本发明提供的培养液有利于脐带干细胞的培养扩增及干性维持。以此培养液培养脐带间充质干细胞，所得细胞的活率可达95％以上，与数量可达1×107cell/mL以上。且流式细胞检测结果表明，所得细胞干性保持良好，未出现分化现象。
本发明所述无血清培养基的制备方法为将白蛋白，加入DMEM-F12培养基，再添加EGF和干细胞因子，配制好后置于4℃保存。
本发明提供的细胞培养液在培养脐带间充质干细胞中的应用。
本发明还提供了一种培养脐带间充质干细胞的方法，将脐带间充质干细胞接种于本发明提供的细胞培养液，培养。
一些实施例中，脐带间充质干细胞的接种密度为5×104cell/mL。
一些实施例中，培养的条件为37℃，CO2体积分数5％，培养时间为24h～48h。
在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞为2～5代的骨骼肌干细胞。
一些实施例中，脐带间充质干细胞为第3代的骨骼肌干细胞。
所述接种的方法为：取汇合度80％的P3代的脐带间充质干细胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.015mL/cm2的消化液，消化2min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，200g离心5min，去上清。所述消化液中包括质量分数为0.25％的胰酶和质量分数为0.04％的EDTA。
所述接种前包括复苏的步骤，所述复苏采用的培养基为本发明提供的培养液。
在本发明的实施例中，脐带间充质干细胞的原代分离方法为组织块培养法；具体的，脐带间充质干细胞的原代分离方法包括以下步骤：
步骤1：将脐带用含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS缓冲液漂洗2次，以体积分数为75％的乙醇水溶液浸泡1min～2min后，去除脐带外膜和血管；
步骤2：以LONZA人干细胞无血清培养液(Lonza UltraCULTURETM)培养液培养，培养条件为5％CO2、37℃、湿度95％；第5～7天半量换培养基，继续培养12～14天后全量换液去掉组织块，收集细胞传代培养。
本发明提供的培养液包括无血清培养液、白蛋白、干细胞因子和表皮细胞生长因子。以本发明提供的培养液培养脐带间充质干细胞，能够提高脐带间充质干细胞的数量和细胞活率，且细胞干性维持良好。实验表明，以本发明提供的培养基培养脐带间充质干细胞，所得细胞密度可达1.2×107cell/mL；细胞活率达95％以上，流式细胞检测表面标志物，完全符合脐带间充质干细胞特性。
具体实施方式
本发明提供了一种培养液及其应用和培养脐带间充质干细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1脐带间充质干细胞的分离
将脐带(乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性)置于含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS中漂洗2次，加入预冷的75％酒精，浸泡1-2min，期间不停翻动脐带；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用组织剪将脐带剪成2mm左右的小段，每段用眼科剪纵向开，用血管钳去除脐带内三根血管(两条动脉，一条静脉)，同时去除脐带外膜；将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm3大小的组织块，取适量放入直径为10cm的无菌培养皿中，覆盖70％培养皿的底面积。加入LONZA人干细胞无血清培养液(Lonza UltraCULTURETM)，5％CO2、37℃、湿度为95％的CO2培养箱中培养。第5天～7天半量换培养基，继续培养12天～14天左右全量换液去掉组织块同时收集细胞传代培养。
经传递3代的hUC-MSCs细胞生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大。
实施例2脐带间充质干细胞的培养
各受试组培养液的配方如表1：
表1各组分化诱导液配方
组别 基础培养基 人血清白蛋白 EGF(ng/ml) SCF(mg/ml)
实验组1 DMEM/F12 20％ 10 1.5
实验组2 DMEM/F12 15％ 15 1
实验组3 DMEM/F12 10％ 5 2
对照组1 DMEM/F12 -- -- --
对照组2 DMEM/F12 10％ 10
对照组3 DMEM/F12 10％ -- 1.5
取汇合度80％的P3代的脐带间充质干细胞，用PBS洗2遍后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的完全培养基终止酶解，取样计数，平均分成三管，200g离心5min,去上清。离心结束后，弃去上清，根据计数结果，每个对应分别加入A、B、C三组培养基，并调整细胞密度为5×104cell/mL，轻轻吹打均匀后分别取20ml接种于15cm的培养皿中，转入37℃，5％CO2的培养箱中培养。
培养48h后，计算细胞数量，细胞活率，以及做流式检测。
①细胞数量和细胞活率，用PBS洗2遍培养皿后，往细胞中加入0.015ml/cm2的0.25％的胰酶+0.04％EDTA消化2min，用10倍于消化液的DMEM-F12终止酶解，取样，用0.4％台盼蓝1：1染色后，置于显微镜下，计算活细胞数及死细胞数，细胞活率＝活细胞数/总细胞数×100％。结果如表2：
表2细胞密度、细胞活率
组别 细胞密度(个/mL) 细胞活率(％)
实验组1 1.2×107 95.26％
实验组2 1.1×107 95.15％
实验组3 0.78×107 93.13％
对照组1 1.6×106个 73.44％
对照组2 0.71×107 92.31％
对照组3 0.85×107 92.89％
结果表明，各实验组培养基的培养效果显著优于各对照组p<0.05。
②流式检测，通过流式检测仪，检测细胞表面标记物CD90、CD73、CD105、CD11-b、HLA及CD34、CD45等表面标记物。结果如表3：
表3流式细胞检测结果
组别 CD73 CD90 CD105 CD34 CD45
实验组1 100.0％ 99.9％ 98.9％ 0.1％ 0.3％
实验组2 94.96％ 95.9％ 90.6％ 0.2％ 0.1％
实验组3 93.26％ 91.5％ 89.2％ 0.2％ 0.3％
对照组1 62.12％ 63.50％ 68.89％ 11.70％ 8.2％
对照组2 85.68％ 88.98％ 90.12％ 1.2％ 0.52％
对照组3 89.98％ 91.25％ 90.23％ 0.63％ 0.55％
从细胞的流式结果来看，三组没有实验组1～3没有显著性差异，但都显著优于对照组，p<0.05。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细胞培养液，其特征在于，包括无血清培养液、白蛋白、干细胞因子和表皮细胞生长因子；其中，
所述白蛋白的体积分数为10％～20％；
所述干细胞生长因子的浓度为1mg/mL～2mg/mL；
所述表皮细胞生长因子的浓度为5ng/mL～15ng/mL。
2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述白蛋白为人血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述无血清培养液为DMEM-F12。
4.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液中包括：无血清培养液、体积分数为20％的白蛋白、浓度为1.5mg/mL的干细胞生长因子和浓度为10ng/mL的表皮细胞生长因子。
5.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液中包括：无血清培养液、体积分数为15％的白蛋白、浓度为1mg/mL的干细胞生长因子和浓度为15ng/mL的表皮细胞生长因子。
6.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液中包括：无血清培养液、体积分数为10％的白蛋白、浓度为2mg/mL的干细胞生长因子和浓度为5ng/mL的表皮细胞生长因子。
7.权利要求1～6任一项所述细胞培养液在培养脐带间充质干细胞中的应用。
8.一种培养脐带间充质干细胞的方法，其特征在于，将脐带间充质干细胞接种于权利要求1～6任一项所述的细胞培养液，培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的接种密度为5×104cell/mL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为37℃，CO2体积分数5％，培养时间为24h～48h。
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