CN105255821B

CN105255821B - 一种牙周膜干细胞的培养方法

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Publication number: CN105255821B
Application number: CN201510732868.5A
Authority: CN
Inventors: 葛啸虎; 陈海佳; 王飞; 王一飞; 冯德龙; 张维敏
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: CN105255821A

Abstract

本发明公开了一种牙周膜干细胞的培养方法。所述培养方法将牙周膜干细胞接种到水凝胶上，用含BMP‑2的无血清培养基进行三维培养。三维培养接种用的牙周膜干细胞在二维培养时，使用含bFGF的无血清培养基进行培养。与现有技术相比，本发明中的细胞与水凝胶培养体系能够更好保持牙周膜干细胞的增殖及细胞活力；所使用的三维培养体系简单易行，同时保持了良好的干细胞特征。

Description

一种牙周膜干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种牙周膜干细胞的培养方法。

背景技术

牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是存在于牙齿牙周组织中的一类可自我更新、增殖能力强及具有多向分化能力的成纤维细胞样干细胞。牙周膜干细胞具有多向分化的潜能，体外可分化为成脂细胞、成骨细胞样细胞、成牙骨质样细胞和神经前体细胞等，体内可分化为成牙骨质样和牙周膜样组织。因此，牙周膜干细胞是牙周组织再生的种子细胞，将体外培养的牙周膜干细胞回输人体以治疗牙周病等疾病。现有牙周膜干细胞的培养多采用单层细胞培养，获得的细胞数量低，生物性状与体内存在差异。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种牙周膜干细胞的培养方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牙周膜干细胞的培养方法，将牙周膜干细胞接种到水凝胶上，用含BMP-2的无血清培养基进行三维培养。

优选地，所述BMP-2的浓度为5-15ng/mL。

优选地，三维培养接种用的牙周膜干细胞在二维培养时，使用含bFGF的无血清培养基进行培养。

优选地，所述bFGF的浓度为5-15ng/mL。

优选地，所述水凝胶为I型胶原水凝胶。

更优选地，所述I型胶原水凝胶通过以下方法制备：Ⅰ型胶原水凝胶溶液瞬时离心脱泡，接种到预先冷却的培养板内，-80℃静置2-4h后冻干12-20h。

更优选地，所述I型胶原水凝胶通过以下方法制备：将Ⅰ型胶原酸性溶液调节pH值至7.2左右，得到终浓度为5-15mg/mL的胶原水凝胶溶液；瞬时离心脱泡后接种到预先冷却的48孔板或96孔板内，-80℃静置3h后冻干16h。

优选地，三维培养接种用的牙周膜干细胞是传代培养第2代至第5代细胞。

优选地，所述牙周膜干细胞的培养方法包括以下步骤：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

用I型胶原酶溶液消化牙周膜组织，获得牙周膜干细胞；用含bFGF的无血清培养基培养牙周膜干细胞，至汇合度80％-90％，用胰蛋白酶溶液消化进行传代培养；

第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，待克隆长至汇合度30％-60％时，用胰蛋白酶溶液消化细胞，进行扩大培养；

S2、三维培养

用胰蛋白酶溶液消化第3代细胞，接种至水凝胶上，用含有BMP-2的无血清培养基进行三维培养。

优选地，无血清培养基包含基础培养基、非必需氨基酸、谷氨酰胺和血清替代物，基础培养基为UltraCULTURE Serum-free Medium。

更优选地，非必需氨基酸的浓度为1倍，谷胺酰胺的浓度为2mmol/L，血清替代物的体积百分数为5％。

优选地，在上述无血清培养基中添加bFGF即为含bFGF的无血清培养基。因含bFGF的无血清培养基是用于牙周膜干细胞的二维培养，下文中将其称为二维培养用无血清培养基。为了防止污染，二维培养用无血清培养基中还可以添加抗生素。本发明中优选二维培养用无血清培养基含有5-15ng/mLbFGF、1倍浓度的双抗(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，即二维培养用无血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物、5-15ng/mLbFGF、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为UltraCULTURESerum-free Medium。

优选地，在上述无血清培养基中添加BMP-2即为含BMP-2的无血清培养基。因含BMP-2的无血清培养基是用于牙周膜干细胞的三维培养，下文中将其称为三维培养用无血清培养基。本发明中优选三维培养用无血清培养基含有5-15ng/mL BMP-2，即三维培养用无血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物和5-15ng/mL BMP-2，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。

优选地，所述的非必需氨基酸包含甘氨酸(Glycine)、L-丙氨酸(L-Alanine)、L-天冬酰胺(L-Asparagine)、L-天冬氨酸(L-Aspartic acid)、L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)、L-脯氨酸(L-Proline)和L-丝氨酸(Serine)各1mM。

优选地，所述牙周膜干细胞的培养方法，包括以下步骤：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

刮取根中1/3牙周膜组织，剪碎后用10倍体积的1g/L-5g/L I型胶原酶溶液在37℃、200rpm条件下消化30-60min，加入等体积的完全培养基终止消化，1000-2000rpm离心5-10min，丢弃上清，用20-40mL PBS反复吹打离散细胞团块，70μm的细胞筛网过滤，滤液1000-2000rpm离心5-10min，用二维培养用无血清培养基重悬沉淀；

按照(0.1-1)×10⁴/well将细胞悬液接种至培养板中，每孔加入2mL二维培养用无血清培养基，混匀后于37℃、湿度95％的条件下培养，每3d换液1次，当汇合度达80％-90％时，用0.125％-0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养；

第1代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，调整原代细胞密度为10-100个细胞/mL，接种于培养板，用二维培养用无血清培养基于37℃、5％CO₂条件下培养，2d-5d换液1次，待克隆长至汇合度30％-60％时，用0.125％-0.25％胰蛋白酶溶液消化细胞，进行扩大培养；

S2、三维培养

将培养至第3代的牙周膜干细胞用0.1％-0.25％胰蛋白酶溶液消化，吸弃胰蛋白酶溶液，用三维培养用无血清培养基重悬，70μm细胞筛过滤细胞，1000-2000rpm离心5-10min，收集细胞沉淀，并用三维培养用无血清培养基重悬细胞，以(0.1-1)×10⁸个细胞/mL的密度接种于5-15mg/mL的水凝胶材料上，加入三维培养用无血清培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养6-8天，每2-3天换半液。

骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)是1963年由美国的MarshallR.Urist教授发现的。骨形态发生蛋白能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。它是与胚胎骨骼形成有关的蛋白质，在骨形成的数个阶段均起作用，由形态发生的早期阶段开始，并延续至出生后。在中枢神经的发生中也起着关键作用。近年来基因重组的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的安全性和有效性得到了充分的证实，美国FDA也于2002年7月批准重组骨形态发生蛋白-2用于脊柱融合。基于骨形态发生蛋白的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实，在一些国家骨形态发生蛋白已进入大规模的临床实验阶段。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种能够促进成纤维细胞生长的物质，因对酸和热敏感，等电点呈碱性(9.6)，称为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。bFGF是重要的促有丝分裂因子，也是形态发生和分化的诱导因子，其生物学效应分体内和体外两大部分。体外作用十分强烈，对成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增殖活性。体外细胞培养中能在低浓度(1mg/mL)发挥其作用。

三维细胞培养技术(three-dimensionalcell culture，TDCC)是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养技术除可以获得大量细胞外，还解决了单层细胞培养与动物实验之间因体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难以研究单一过程、中间过程的问题。普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行，但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明将牙周膜干细胞与水凝胶培养体系进行三维培养，同时添加BMP-2能够更好保持牙周膜干细胞的增殖及细胞活力；所使用的三维培养体系简单易行，同时保持了良好的干细胞特征。

(2)本发明在牙周膜干细胞培养的不同阶段添加不同的细胞因子，在二维培养时添加bFGF，在三维培养时添加BMP-2；且将BMP-2直接添加在培养基中，可以与水凝胶上的牙周膜干细胞更好的接触，促进细胞的生长增殖。

附图说明

图1为原代培养至克隆形成时显微观察图。

图2为效果实施例1中细胞增殖检测图。其中1-6分别表示实施例1-4、对比例1-2方法获得的牙周膜干细胞。

图3为效果实施例2的Western blot结果图。其中1-6分别表示实施例1-4、对比例1-2方法获得的牙周膜干细胞。

图4为效果实施例3的流式检测图。

图5为效果实施例4的茜素红染色结果图。

图6为效果实施例5的油红O染色结果图。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

本发明中使用的主要试剂和仪器如表1所示。

表1试剂和仪器清单

试剂及仪器名称	品牌	货号/型号
			双抗	GIBCO	15140-122
NEAA	GIBCO	11140-050
			UltraCULTURESerum-freeMedium	Lonza	12-725F
血清替代物	PALL	15950-017

流式细胞仪

BD

Accuri C6

本发明中无血清培养基包含基础培养基、1倍浓度的非必需氨基酸、2mmol/L谷氨酰胺和体积百分数为5％血清替代物，基础培养基为UltraCULTURE Serum-free Medium。所述的非必需氨基酸包含甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸各1mM。

二维培养用无血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物、5-15ng/ml bFGF、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。

三维培养用无血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物和5-15ng/mL BMP-2，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。

实施例1、牙周膜干细胞的培养方法

一种牙周膜干细胞的培养方法，包括以下步骤：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

收集30岁以下人脱落及拔出的智齿，PBS清洗牙齿表面污垢后，用无菌刀片刮取根中1/3牙周膜组织，剪碎后放置于50mL离心管中，加入10mL的2g/LI型胶原酶溶液，充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃、200rpm消化45min左右，加入等体积的完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，丢弃上清，用40mL PBS反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，滤液1000rpm离心5min，沉淀用二维培养用无血清培养基重悬细胞。并按照1×10⁴/well接种至六孔板中，每孔加入2mL二维培养用无血清培养基，混匀后于37℃、5％CO₂、湿度95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，此时在光学显微镜100倍下观察，如图1所示，细胞群成团生长，单个细胞呈长梭形。当细胞生长至80％-90％汇合，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养。

第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，将消化的牙周膜细胞悬液计数，并调整细胞密度为50个细胞/mL，将细胞悬液吹打均匀，种于6孔板，每孔2mL，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养，2d-5d换液一次，待克隆长至孔底30％-60％左右时，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化细胞，扩大培养。

S2、三维培养

将培养至第3代的牙周膜干细胞，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化，吸弃胰蛋白酶溶液，用三维培养用无血清培养基重悬细胞，用70μm细胞筛过滤细胞，1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用三维培养用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁸个细胞/mL，接种于水凝胶材料上，加入三维培养用无血清培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，2-3d更换一次培养基。

本实施例中二维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物、10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium；三维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物和10ng/mL BMP-2，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。

本实施例中水凝胶为Ⅰ型胶原水凝胶，I型胶原为鼠尾胶原蛋白I型，购自sigma。通过下述方法制备水凝胶：用10mmol/L乙酸溶液配制Ⅰ型胶原酸性溶液，于4℃下用1mol/LNaOH溶液调节pH值至7.2左右，得到终浓度为10mg/mL的胶原水凝胶溶液。瞬时离心脱泡后接种到预先冷却到4℃的96孔板内，-80℃静置3h后冻干16h，得到水凝胶。

实施例2、牙周膜干细胞的培养方法

一种牙周膜干细胞的培养方法，与实施例1基本相同，包括以下步骤：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

将分离得到的牙周膜干细胞按照1×10⁴/well接种至六孔板中，每孔加入2mL二维培养用无血清培养基，混匀后于37℃、5％CO₂、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成。当细胞生长至80％-90％汇合，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养。第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，待克隆长至孔底30-60％左右时，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化细胞，扩大培养。

S2、三维培养

将培养至第3代的牙周膜干细胞，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化，吸弃胰蛋白酶溶液，用三维培养用无血清培养基重悬，70μm细胞筛过滤细胞，以1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用三维培养用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁷个细胞/mL，接种于水凝胶上，加入三维培养用无血清培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，2-3d更换一次培养基。

本实施例中二维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物、10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium；三维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物和15ng/mL BMP-2，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。

实施例3、牙周膜干细胞的培养方法

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

将分离得到的牙周膜干细胞按照1×10⁴/well接种至六孔板中，每孔加入2mL二维培养用无血清培养基，混匀后于37℃、5％CO₂、湿度95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成。当细胞生长至80％-90％汇合，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养。第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，待克隆长至孔底30-60％左右时，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化细胞，扩大培养。

S2、三维培养

将培养至第三代的牙周膜干细胞，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化，吸弃胰蛋白酶溶液，用三维培养用无血清培养基重悬，70μm细胞筛过滤细胞，以1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用三维培养用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁸个细胞/ml，接种于水凝胶上，加入三维培养用无血清培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，2-3d更换一次培养基。

本实施例中二维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物、15ng/mL bFGF、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium；三维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物和15ng/mL BMP-2，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。

本实施例中水凝胶为Ⅰ型胶原水凝胶，I型胶原为鼠尾胶原蛋白I型，购自sigma。通过下述方法制备水凝胶：用10mmol/L乙酸溶液配制Ⅰ型胶原酸性溶液，于4℃下用1mol/LNaOH溶液调节pH值至7.2左右，得到终浓度为12mg/mL的胶原水凝胶溶液。瞬时离心脱泡后接种到预先冷却到4℃的96孔板内，-80℃静置3h后冻干16h，得到水凝胶。

实施例4、牙周膜干细胞的培养方法

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

S2、三维培养

将培养至第三代的牙周膜干细胞，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化，吸弃胰蛋白酶溶液，用三维培养用无血清培养基重悬细胞，用70μm细胞筛过滤细胞，以1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用三维培养用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁷个细胞/mL，接种于水凝胶上，加入三维培养用无血清培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，2-3d更换一次培养基。

本实施例中二维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物、7.5ng/mL bFGF、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium；三维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物和7.5ng/mL BMP-2，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。

本实施例中水凝胶为Ⅰ型胶原水凝胶，I型胶原为鼠尾胶原蛋白I型，购自sigma。通过下述方法制备水凝胶：用10mmol/L乙酸溶液配制Ⅰ型胶原酸性溶液，于4℃下用1mol/LNaOH溶液调节pH值至7.2左右，得到终浓度为8mg/mL的胶原水凝胶溶液。瞬时离心脱泡后接种到预先冷却到4℃的96孔板内，-80℃静置3h后冻干16h，得到水凝胶。

对比例1、牙周膜干细胞的培养方法

一种牙周膜干细胞的培养方法，二维培养时不使用bFGF，其他培养条件与实施例1相同；具体如下：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

将分离得到的牙周膜干细胞按照1×10⁴/well接种至六孔板中，每孔加入2mL无血清培养基，混匀后于37℃、5％CO₂、湿度95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，此时在光学显微镜100倍下观察，细胞群成团生长，单个细胞成长梭形。当细胞生长至80％-90％汇合，0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养。

第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，将消化的牙周膜细胞悬液计数，并调整细胞密度为50个细胞/mL，将细胞悬液吹打均匀，种于6孔板，每孔2mL，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养，2d-5d换液一次，待克隆长至孔底30-60％左右时，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化细胞，扩大培养。

S2、三维培养

将培养至第3代的牙周膜干细胞，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化，吸弃胰蛋白酶，用无血清培养基重悬，用70μm细胞筛过滤细胞，以1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为以1×10⁸个细胞/mL的密度接种于水凝胶材料上，加入三维培养用无血清培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，2-3d更换一次培养基。

本实施例中三维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物和10ng/mL BMP-2，余量为UltraCULTURE Serum-freeMedium。

对比例2、牙周膜干细胞的培养方法

一种牙周膜干细胞的培养方法，在三维培养时不使用BMP-2，其他培养条件与实施例1相同，具体培养方法如下：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

将分离得到的牙周膜干细胞按照1×10⁴/well接种至六孔板中，每孔加入2mL二维培养用无血清培养基，混匀细胞悬液，放于37℃、5％CO₂、湿度95％的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，此时在光学显微镜100倍下观察，细胞群成团生长，单个细胞成长梭形。当细胞生长至80％-90％汇合，0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养。

第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，将消化的牙周膜细胞悬液计数，并调整细胞密度为50个细胞/mL，将细胞悬液吹打均匀，种于6孔板，每孔2mL，放入37℃、5％CO₂培养箱，2d-5d换液一次，待克隆长至孔底30-60％左右时，胰酶消化，扩大培养。

S2、三维培养

将培养至第三代的牙周膜干细胞，用0.25m/v％胰蛋白酶溶液消化，吸弃胰蛋白酶溶液，用无血清培养基重悬，用70μm细胞筛过滤细胞，以1000rpm离心5min，收集细胞沉淀，并用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为以1×10⁸个细胞/mL的密度接种于水凝胶材料上，加入无血清培养基在37℃、5％CO₂培养箱中培养，2-3d更换一次培养基。

本实施例中二维培养用无血清培养基的组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物、10ng/mL bFGF、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。

为了便于更直观的了解各实施例、对比例的区别，现将各实施例、对比例中的bFGF浓度、三维培养的接种密度、水凝胶浓度和BMP-2浓度列于表1。

表1各实施例、对比例的区别

编号	bFGF浓度	接种密度	水凝胶浓度	BMP-2浓度
					实施例1	10ng/mL	1×10<sup>8</sup>/mL	10mg/mL	10ng/mL
实施例2	10ng/mL	1×10<sup>7</sup>/mL	10mg/mL	15ng/mL
					实施例3	15ng/mL	1×10<sup>8</sup>/mL	12mg/mL	15ng/mL
实施例4	7.5ng/mL	1×10<sup>7</sup>/mL	8mg/mL	7.5ng/mL
					对比例1	0	1×10<sup>8</sup>/mL	10mg/mL	10ng/mL
对比例2	10ng/mL	1×10<sup>8</sup>/mL	10mg/mL	0

效果实施例1、CCK8检测细胞增殖检测

采用CCK-8法检测各实施例、对比例中三维培养6天后牙周膜干细胞的增殖活力。CCK-8法检测时每孔加10μL CCK-8(终质量浓度约为0.5g/L)于5％CO₂，37℃培养2h，用酶标仪测定450nm，参考波长为630nm的吸光度值(A)。具体操作方法按照酶标仪说明书进行。结果如图2所示。在荧光显微镜下观察胶原凝胶内牙周膜干细胞的生长活力。与对比例1和对比例2相比，用实施例1-4中的培养方法培养牙周膜干细胞时，在培养6天左右时间，能够保持更好的细胞活力。

效果实施例2、Western blot检测Stro-1表达的情况

提取各实施例、对比例培养6天的牙周膜干细胞的细胞总蛋白，12％SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V转膜1h至PVDF膜。用5％BSA室温封闭1h，加入抗Stro-1一抗(1:200)或β-tubulin抗体(1:200)，4℃过夜；洗膜，加入HRP标记的二抗(1:2000)，室温孵育60min；ECL发光，用凝胶图片系统进行对胶片进行拍照。

结果如图3所示，与对比例1和对比例2相比，实施例1-4方法所得的蛋白条带的间充质干细胞特有蛋白Stro-1，明显强于对比例1-2。说明本发明牙周膜干细胞的培养方法能够更好的让牙周膜干细胞在胶原凝胶内仍然保持着干细胞的基本特性。

效果实施例3、流式细胞仪检测牙周膜干细胞表面标志

收集实施例1培养6天的细胞并计数，每管加入2×10⁵个细胞，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD73、CD90、CD45、及HLA-DRA抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原，结果见图4。

由图4可知，间充质干细胞阴性表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)、CD34为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD73、CD90、CD105均呈现阳性。因此，使用本发明牙周膜干细胞的培养方法可以使牙周膜干细胞依然保持间充质干细胞的良好生物学特征。

效果实施例4、成骨分化鉴定

收集实施例1培养6天的细胞，按照1×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液。所述成骨诱导培养基的组成为10mmol/Lβ甘油磷酸钠、0.05mmol/L维生素C、100mmol/L地塞米松、体积分数10％FBS，余量为DMEM培养液。21天后进行茜素红染色以未诱导的牙周膜干细胞作为对照。结果见图5。

由图5可知，牙周膜干细胞，经过成骨诱导3周后，由茜素红染色可见钙化结节。因此，本发明牙周膜干细胞的培养方法可以使牙周膜干细胞仍然保持向成骨分化的潜能。

效果实施例5、成脂分化鉴定

收集实施例1培养6天的细胞，并按照1×10³细胞/cm²接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养，每3d换液。成脂诱导培养基包括体积分数10％胎牛血清、0.5mM IBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/mL胰岛素、2mm/L谷氨酰胺，余量为DMEM培养液。4周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果见图6。

由图6可知，牙周膜干细胞经过成脂诱导4周后，由油红O染色可见红色油滴。因此，本发明牙周膜干细胞的培养方法可以使牙周膜干细胞仍然保持向成脂分化的潜能。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，将牙周膜干细胞接种到水凝胶上，用含BMP-2的无血清培养基进行三维培养；

所述BMP-2的浓度为5-15ng/mL；

所述三维培养接种用的牙周膜干细胞在二维培养时，使用含bFGF的无血清培养基进行培养；

所述bFGF的浓度为5-15ng/mL；

包括以下步骤：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

用I型胶原酶溶液消化牙周膜组织，获得牙周膜干细胞；用二维培养用无血清培养基培养牙周膜干细胞，至汇合度80％-90％，用胰蛋白酶溶液消化进行传代培养；

第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，待克隆长至汇合度30-60％时，用胰蛋白酶溶液消化细胞，进行扩大培养；

S2、三维培养

用胰蛋白酶溶液消化第3代细胞，接种至水凝胶上，用三维培养用无血清培养基进行三维培养；

所述二维培养用无血清培养基含有bFGF，所述三维培养用无血清培养基含有BMP-2。

2.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，所述牙周膜干细胞的培养方法包括以下步骤：

S1、牙周膜干细胞的分离及纯化

刮取根中1/3牙周膜组织，剪碎后用10倍体积的1g/L-5g/L I型胶原酶溶液在37℃、200rpm条件下消化30-60min，加入等体积的完全培养基终止消化，1000-2000rpm离心5-10min，丢弃上清，用20-40mL PBS反复吹打离散细胞团块，用70μm的细胞筛网过滤，滤液1000-2000rpm离心5-10min，用二维培养用无血清培养基重悬沉淀；

按照(0.1～1)×10⁴/well将细胞悬液接种至培养板中，每孔加入2mL二维培养用无血清培养基，混匀后于37℃、5％CO₂、湿度95％的条件下培养，每3d换液1次，当汇合度80％-90％时，0.25％-0.125％胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养；

第一代细胞按照有限稀释法克隆化培养人牙周膜干细胞，调整原代细胞密度为10-100个细胞/mL，接种于培养板，用二维培养用无血清培养基于37℃、5％CO₂条件下培养，2d-5d换液1次，待克隆长至汇合度30-60％时，用0.125％-0.25％胰蛋白酶消化细胞，进行扩大培养；

S2、三维培养

将培养至第三代的牙周膜干细胞用0.1％-0.25％胰蛋白酶溶液消化，吸弃胰蛋白酶，用三维培养用无血清培养基重悬，用70μm细胞筛过滤细胞，以1000-2000rpm离心5-10min，收集细胞沉淀，并用三维培养用无血清培养基重悬细胞，以(0.1-1)×10⁸个细胞/mL的密度接种于5-15mg/mL的水凝胶材料上，加入三维培养用无血清培养，在37℃、5％CO₂中培养6-8天，每2-3天换半液。

3.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，所述水凝胶为I型胶原水凝胶。

4.根据权利要求3所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，所述I型胶原水凝胶通过以下方法制备：Ⅰ型胶原水凝胶溶液瞬时离心脱泡，接种到预先冷却的培养板内，-80℃静置2-4h后冻干12-20h。

5.根据权利要求4所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，所述I型胶原水凝胶通过以下方法制备：将Ⅰ型胶原酸性溶液调节pH值至7.2左右，得到终浓度为5-15mg/mL的胶原水凝胶溶液；瞬时离心脱泡后接种到预先冷却的48孔板或96孔板内，-80℃静置3h后冻干16h。

6.根据权利要求1或2所述的牙周膜干细胞的培养方法，其特征在于，二维培养用无血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物、5-15ng/mLbFGF、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，余量为UltraCULTURE Serum-freeMedium；三维培养用无血清培养基组成为：2mmol/L谷胺酰胺、1倍的非必需氨基酸、体积百分数5％血清替代物和5-15ng/mL BMP-2，余量为UltraCULTURE Serum-free Medium。