CN104164403B - 一种提取及培养脂肪干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，是一种提取及培养脂肪干细胞的方法，步骤为：(1)取人脂肪组织，用pH值为7.2‑7.4的D‑Hank’s平衡盐液反复离心冲洗；(2)将脂肪组织绞碎为1‑2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的消化液进行消化，(3)静置分层：将底层细胞用pH值为7.2‑7.4的D‑Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，获得干细胞；(4)将获得的干细胞按照2‑3×104/cm2的密度接种于培养瓶，加入培养液，置于培养箱中进行培养。该方法具有消化速度快，不溶性组织块大幅减少，而且不影响干细胞活性等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是一种提取及培养脂肪干细胞的方法。
背景技术
脂肪干细胞(Adipose-derived Stem Cells，ADSCs)，是目前广泛应用于组织工程及再生医学研究领域的一种成体干细胞(Cowan CM,.Nat Biotechnol，2004.22:560-567)。脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能，在特定条件下可以向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、成内皮细胞和成神经细胞等多个方向分化。除此之外，脂肪干细胞还具有许多其他类型成体干细胞所不具备的优势，如脂肪组织来源充足、取材方便、获取过程损伤轻微、无伦理学争议，平均每100mL的脂肪组织中可获得约1×106个干细胞，脂肪组织来源的细胞约有2％具有干细胞特征，远高于骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)(约0.02％的细胞具有干细胞特征)。并且脂肪干细胞具有稳定的群体倍增率、自我更新潜能及良好的免疫相容性(Strem BM，Trends Biotechnol，2005.24:1246-1253)，其基因转染效率高、能稳定表达外源基因，已广泛应用于再生医学的研究(Gimble JM,.Circ Res,2007:1249-1260)。而且ADSCs分化为脂肪细胞的效率比BMSCs更高。因此，脂肪干细胞是组织工程研究理想的种子细胞之一，最有希望成为脂肪组织工程的种子细胞。
目前常用的脂肪干细胞分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经机械或酶处理方法分离除去红细胞等成熟细胞后，采用含10％胎牛血清的培养基进行继代培养。含10％胎牛血清的培养基虽可促进脂肪干细胞的增殖，但难以维持其未分化状态，随着传代次数增加，细胞增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力。另外，动物血清可能存在动物携带的潜在病毒或支原体污染，对以后可能的临床应用构成威胁。尽管研究人员尝试了很多的无血清培养基方案，但间充质干细胞在无血清培养基中普遍存在生长缓慢，多向分化能力逐渐消失的问题。
现有常规的机械或酶处理方法仅能除去红细胞等成熟细胞，除红后的这部分细胞中仍含有大量成熟细胞，因而，现有获得的脂肪干细胞纯度不高，由于细胞的生长和细胞之间的信号交通有关，纯度不高的干细胞更易老化，往往在体外经5-6次传代培养脂肪干细胞后，脂肪干细胞就出现老化。干细胞老化(或称衰老)，是指干细胞增殖能力下降，多向分化潜能(或称干性)降低或消失。老化意味着干细胞数量的减少和功能的减退，也可以说是无法再生。脂肪干细胞的老化限制了其在脂肪组织工程及其他组织工程中应用的深入研究。
发明内容
为克服现有常规的机械或酶处理脂肪干细胞分离培养方法存在的缺陷，本发明提供一种脂肪干细胞的提取及培养方法，该方法具有消化速度快，不溶性组织块大幅减少，而且不影响干细胞活性等优点，该方法的步骤是：
(1)取人脂肪组织，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；
(2)将脂肪组织绞碎为1-2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的消化液进行消化，放入摇床中，温度为37℃，190rpm，消化时间为30min；加入等体积的含有15％FBS的BME培养基终止消化；
(3)静置分层，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，获得干细胞；
(4)将获得的干细胞按照2-3×104/cm2的密度接种于培养瓶，加入培养液，置于37℃、CO2浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养，1-2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞。
本发明所述的消化液为胰酶-EDTA和I型胶原酶的D-Hank’s平衡盐溶液；其中胰酶-EDTA的浓度为0.05-0.5％(g/100ml，下同)，I型胶原酶的浓度为0.05-0.5％；进一步地，在所述消化液中，还可添加IV型胶原酶，其浓度为0.1-0.5％，在最优选的实施方案中，所述消化液是浓度分别为0.1％的胰酶-EDTA、0.1％的I型胶原酶和0.2％的IV型胶原酶的D-Hank’s平衡盐溶液。
在本发明的实施方案中，在上述步骤(3)中，在过滤后，将脂肪干细胞悬浮液和红细胞裂解液以1：1混合孵育2分钟，4℃、离心力450g条件下离心5min，利用脂肪干细胞培养基重悬脂肪干细胞。
所述培养液由L-谷氨酰胺1-5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)5-30ng/ml，表皮生长因子(EGF)1-20ng/ml，白血病抑制因子(LIF)1-20ng/ml，谷胱甘肽5-20μg/ml，BME补足至100％组成。进一步地，所述培养液优选由L-谷氨酰胺1mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml，表皮生长因子(EGF)5ng/ml，白血病抑制因子(LIF)5ng/ml，谷胱甘肽10μg/ml，BME补足至100％组成。
另外，在本发明的所述培养液中，还可包含50μg/ml虫草提取物，所述虫草提取物可以为现有技术常规方法获得，例如，将冬虫夏草粉碎，加8-10倍量的水煎煮，过滤，浓缩干燥，即得。使用时，将虫草提取物用BME培养基溶解，过22μm滤膜，加入到已配制好的培养液中。
本发明的有益效果是：通过对消化液进行改良，采用胰酶-EDTA与胶原酶混合液进行消化，不仅消化速度快，不溶性组织块大幅减少，而且不影响干细胞活性。另外，本发明对培养基进行了改良，由于其中不含动物血清，避免了潜在的病毒或支原体污染，无血清培养基中添加剂较少，配制简单，并且结合中医药的传统理论，摸索出合适的中药提取物用于脂肪干细胞增殖，具有大幅提高干细胞增值速度、活性好等优点，使脂肪干细胞具有至少130代分裂增殖的自我更新能力，细胞多向分化能力强。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
术语解释
脂肪干细胞
如本文所用，术语“脂肪干细胞”、“本发明脂肪干细胞”、或“本发明的干细胞”可以互换使用，都指分离自脂肪组织的干细胞。
在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。
脂肪干细胞(ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，它取材容易、体内储备量大、适宜大规模培养、对机体损伤小、来源广泛、适宜自体移植。
干细胞抗原检测
用本发明方法制备的脂肪干细胞具有很高的纯度，其基本上不含有其他类型的细胞或干细胞。这可通过细胞表面抗原的检测加以验证。
脂肪干细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有CD3、CD13、CD29、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC等。
CD34抗原是一种高度糖基化I型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞(HSC)，祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面，带有CD34的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≤1％。CD31是一种内皮细胞表面抗原，带有CD31的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≤1％。CD45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞。带有CD45的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≤1％。
CD29、CD73、CD90、CD105和CD49d等主要存在于脂肪间充质干细胞表面。带有CD29、CD73、CD90、CD105和CD49d的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≥95％。
本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪干细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。
成脂诱导及检测
由于脂肪干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下对脂肪干细胞进行分化诱导，能够得到特定功能的已分化的细胞。
本领域内技术人员可以使用通用的方法对脂肪干细胞进行成脂诱导。一种通用的诱导方法是向培养液中加入地塞米松。诱导成脂的条件主要有3种，包括地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)，地塞米松加胰岛素，或地塞米松加茚甲新(indomethacin，消炎痛)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤及胰岛素。其中最重要的就是地塞米松，低浓度的地塞米松是无血清或低血清培养间充质干细胞的必需成分之一，能够促进间充质干细胞的体外快速增殖；较高浓度的地塞米松则可以诱导间充质干细胞向脂肪细胞分化。
本领域内技术人员可以使用通用的方法和染料(如Oil Red、苏丹红5B和溶剂红27等)对脂肪干细胞诱导成脂进行检测。最常用的染料是Oil Red(O)，即油红O。油红O的结构为1-[2，5-二甲基-4-(2，5-二甲基苯偶氮)苯偶氮]-2萘酚，是一种红色粉末，油溶性偶氮染料，易溶于苯、乙醇和丙酮。成脂肪诱导的过程中，细胞在胞浆中不断有油滴的累积，并不断的增加变大，最后整个细胞的胞浆中都是油滴。油红O作为生物染色剂，易与油脂结合，但与细胞本身的结构着色力差。在显微镜下可以清楚地进行成脂染色观察。
成骨诱导及检测
由于脂肪干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下对脂肪干细胞进行成骨分化诱导，能够得到成骨细胞。
本领域内技术人员可以使用通用的方法对脂肪干细胞进行成骨诱导。经典的化学成骨诱导液配方为：DMEM培养液，甘油磷酸钠，维生素C和地塞米松。成骨诱导的过程是使钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来，即“钙结节”。
鉴定钙结节的染料常用“茜素红”。茜素红溶液包括：茜素磺酸钠，茜素S，茜素红S，茜素胭脂红，1，2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠，1，2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠盐。茜素红为橙黄色或黄棕色粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿能与许多金属离子生成带色化合物，能与锆、钍、铝、钛及铍和钙的显色反应。茜素红染色的原理就是茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色。
实施例1
(1)取人脂肪组织50ml，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；
(2)将脂肪组织绞碎为1-2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的消化液进行消化，放入摇床中37℃，190rpm消化30min；加入100ml的含有15％FBS的BME培养基终止消化；消化液为0.1％的胰酶-EDTA、0.1％的I型胶原酶和0.2％的IV型胶原酶的D-Hank’s平衡盐溶液。
(3)静置分层，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将脂肪干细胞悬浮液和红细胞裂解液以1：1混合孵育2分钟，4℃、离心力450g条件下离心5min，利用培养液重悬脂肪干细胞；
(4)将获得的干细胞按照2×104/cm2的密度接种于培养瓶，加入培养液，置于37℃、CO2浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养，1天后将原培养液吸弃，更换新鲜的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞。培养液由L-谷氨酰胺1mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/ml，表皮生长因子(EGF)5ng/ml，白血病抑制因子(LIF)5ng/ml，谷胱甘肽10μg/ml，虫草提取物50μg/ml，BME补足至100％组成。
实施例2-5消化液配方对脂肪干细胞的影响
根据实施例1的提取及培养方法，对消化液进行调整，观察最后获得的脂肪干细胞的情况。
| 分组 | 胰酶-EDTA(％) | I型胶原酶(％) | IV型胶原酶(％) |
| 实施例2 | 0.15 | 0.15 | 0.3 |
| 实施例3 | - | 0.7 | 0.3 |
| 实施例4 | 2.5 | 0.75 | - |
| 实施例5 | 0.05 | 0.05 | 0.5 |
在细胞传至P2代时，收集培养细胞，通过流式细胞仪测定CD31、CD34、CD45、CD29、CD73、CD90、CD105和CD49d，脂肪干细胞中CD31、CD34和CD45呈阴性，小于1％，并且CD29、CD73、CD90、CD105和CD49d呈阳性，大于95％，视为合格细胞，传代过程中通过显微镜观察，杂细胞情况，并且通过细胞计数计算提取的原代脂肪干细胞提取总量具体结果如下：
实施例6-10培养液配方对脂肪干细胞的影响
根据实施例1的提取及培养方法，对培养液组成进行调整，观察最后获得的脂肪干细胞的情况。
| 实施例6 | 实施例7 | 实施例8 | 实施例9 | 实施例10 | |
| L-谷氨酰胺(mmol/L) | 2 | 3 | 5 | 6 | 0.5 |
| bFGF(ng/ml) | 20 | 30 | 35 | 10 | 5 |
| EGF(ng/ml) | 10 | - | 20 | 25 | 15 |
| LIF(ng/ml) | 10 | 25 | - | 15 | 1 |
| 谷胱甘肽(μg/ml) | 10 | 3 | 5 | 20 | 35 |
| 虫草提取物(μg/ml) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
当原代培养细胞覆盖率达到80％-90％时，同时对各培养瓶中细胞，采用Invitrogen公司的全自动细胞计数仪Countess进行细胞计数。具体结果如下：
| 细胞密度(1×106) | |
| 对照培养基 | 2.2 |
| 实施例1 | 23.8 |
| 实施例6 | 22.9 |
| 实施例7 | 5.6 |
| 实施例8 | 8.4 |
| 实施例9 | 15.2 |
| 实施例10 | 14.3 |
经流式细胞检测，实施例6-10培养的干细胞符合实施例2-5中所述的合格细胞标准，对照培养基为15％FBS的BME培养基。
实施例11-14虫草提取物含量对脂肪干细胞的影响
根据实施例1的提取及培养方法，对培养液组成中虫草提取物含量进行调整，观察最后获得的脂肪干细胞的情况。采用实施例6-10所述的方法对细胞进行考察及计数。
| 虫草提取物含量(μg/ml) | 细胞密度(1×106) | |
| 实施例11 | - | 10.9 |
| 实施例12 | 25 | 15.7 |
| 实施例13 | 75 | 14.3 |
成脂或成骨诱导及检测
将实施例6-14培养的脂肪干细胞相同条件下传代培养至P50，然后按照上述方法进行成脂或成骨诱导检测，结果发现实施例1和6培养的脂肪干细胞在P50时，仍具备较好成脂或成骨诱导分化能力，成脂诱导后的细胞产生了脂滴并且经油红-O染色后脂滴为红色，而成骨诱导后的细胞产生了大量钙盐并且可用茜素红-S染为红色，而其他实施例制备的脂肪干细胞则能力明显减弱。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。
Claims (1)
1.一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)取人脂肪组织，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；
(2)将脂肪组织绞碎为1-2mm3小块，加入与所取脂肪组织等体积的消化液进行消化，放入摇床中37℃，190rpm消化30min；加入等体积的含有15％FBS的BME培养基终止消化；所述的消化液是浓度分别为0.1％的胰酶-EDTA、0.1％的I型胶原酶和0.2％的IV型胶原酶的D-Hank’s平衡盐溶液；
(3)静置分层，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，将脂肪干细胞悬浮液和红细胞裂解液以1：1混合孵育2分钟，4℃、离心力450g条件下离心5min，利用脂肪干细胞培养基重悬脂肪干细胞；
(4)将获得的干细胞按照2-3×104/cm2的密度接种于培养瓶，加入培养液，置于37℃、CO2浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养，1-2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；
所述培养液由L-谷氨酰胺1mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子20ng/ml，表皮生长因子5ng/ml，白血病抑制因子5ng/ml，谷胱甘肽10μg/ml，50μg/ml虫草提取物，BME补足至100％组成。
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