CN103849597A - 脂肪干细胞的规模化生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种脂肪干细胞的规模化生产工艺，包括以下步骤：（1）脂肪干细胞的分离提取；（2）脂肪干细胞的培养扩增；（3）脂肪干细胞的检测；（4）脂肪干细胞的大规模培养；（5）脂肪干细胞的冷冻保存；（6）脂肪干细胞的长期冷冻保存。本发明提供了一种脂肪干细胞的体外规模化培养扩增方法，建立了高质量高活性脂肪干细胞的长期、标准化、系统化冻存体系，以便为临床及科研提供足够高质量的脂肪干细胞资源，成本低廉，应用前景广阔。

Description

脂肪干细胞的规模化生产工艺

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及干细胞的培养扩增及冷冻保存方法，更具体涉及脂肪干细胞的规模化生产工艺。

背景技术

1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞是在生物个体的生长和发育中起“主干”作用的原始细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是"非定位性"的。而成体干细胞不存在着伦理、法律、免疫排斥反应等问题，同时具有取材方便、来源广等优点，使得成体干细胞在组织工程、基因治疗及个体化治疗的研究中具有较好的临床应用前景。

脂肪组织是人类身体内用脂肪形式作储存能源的松散结缔组织,主要由脂肪细胞所组成。脂肪细胞的脂肪质含有脂肪滴,可以被分类为单胞性脂肪细胞及多胞性脂肪细胞两种。自从2001年Zuk等从脂肪中提取出了具有多向分化潜能的干细胞后，脂肪干细胞以其来源广泛，取材方便，扩增迅速等优点迅速成为了组织工程的研究热点。多项研究证实，ADSCs在体外可以向多种细胞系分化，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、神经及内皮。其生物学特性与骨髓基质干细胞非常相似，在组织工程领域颇具应用前景。与其他成体干细胞相比较而言,脂肪干细胞具有以下优点:1.取材方便,对供区影响小,并发症少;2.分离简单,容易获得,增值能力强;3.来源相对充足;4.在诱导因子作用下具有定向分化能力;5.组织相容性好,能适应体内环境,保持良好的生物学特性且不引起免疫排斥反应等。脂肪组织是人体内含量十分丰富的组织。随着肥胖症患者的增多,人类脂肪开始“富余”,并渐成为累赘,利用脂肪抽提术提取脂肪分离干细胞,作为组织工程的种子细胞来源,进行临床治疗和美容健身,具有重大的价值,因此脂肪干细胞正在成为干细胞新的研究热点。

但是，目前突出的关键问题是在脂肪干细胞临床应用过程中，一次成功的治疗需要一定数量的细胞，这意味着如何在短时间内获得大量有效高活性的细胞以提供给病人使用是一个很关键的问题。所以，关于如何在体外大量扩增干细胞的研究也越来越受到研究人员和医院临床医生的重视。目前已经出现了一些扩增干细胞的方法和装置，但是传统的二维平面扩增干细胞方法，较难在短时间内得到足够的细胞量，而且多次传代会造成干细胞质量下降，因此远远不能满足强大的临床需求。

传统的贴壁依赖性细胞的培养是通过静止或者转瓶等培养方法获得，操作复杂，耗费空间及人力。1967年，Van Wezel首次提出了“微载体系统”的概念，为贴壁依赖性细胞的高密度培养提供了思路，并创建了生物反应器微载体培养细胞工艺，使动物细胞培养进入高密度培养阶段。微载体是指由交联葡聚糖或者其他聚合物组成微珠，直径一般在60-200μm之间，适用于贴壁依赖性细胞的生长。使用此类小球为细胞提供贴附面积，通过轻轻搅拌使载体悬浮于培养液中，细胞也成为了悬浮状态，这种培养方式被称为微载体培养技术。目前使用的微载体包括商业化的Cytodex 1/3、Cultispher G/S、Biosilon、Hillex和HyQSp here，以及人工自制的纤维素、陶瓷、壳聚糖、胶原、明胶、PCL、PLA、PLGA等，都可以应用于脂肪干细胞的培养扩增。

由于微载体本身所占体积和质量不大，但有很大的有效面积可供细胞附着，大大提高了生产效率。比如5mg Cytodex 1表面积能达到30cm²/mL，而传统的单层培养难以达到如此高的表面积/容积比。另外这种培养方式对劳动力的需求下降了许多，1L微载体培养生产的细胞相当于50个转瓶所生产的细胞，而且省却了玻璃容器等的清洗和准备工作，细胞与培养液的分离简单，一旦搅拌停止，3min后细胞即能依靠其重力而沉降，无需进行立离心操作，减少了复杂的操作步骤，细胞生理活性培养参数等容易控制，降低了污染效率。

动物细胞体外大规模培养主要包括分批培养、灌注培养和补料分批培养模式。分批培养模式，其特征在于将脂肪干细胞和培养液一次性装入生物反应器内进行培养，细胞不断生长，得到大量扩增，经过一段时间之后，将这个反应系统取出，消化得到高质量的脂肪干细胞。

机械搅拌式生物反应器主要是通过搅拌器转动来搅动培养液以增加传质能力,确保细胞培养的氧浓度和营养物质的均一性,达到大规模培养细胞的目的,同时使培养液对细胞施加一定的剪应力。目前在医学组织工程研究中最常用的是搅拌瓶反应器。其主要特点是采用磁力转子搅动培养液,把干细胞接种在磁力搅拌的培养液中,细胞在持续搅动的培养液中生长。搅拌式生物反应器的最大优点是,能培养各种类型的动物细胞,培养工艺容易放大,产品质量稳定,非常适合于工厂化生产。

连续灌注式生物反应器在细胞培养生物反应器系统中安装细胞微载体截留装置，是将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养。一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。连续灌注式生物反应器可以对细胞的微环境进行更为精确的监测和控制,既省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，培养细胞的密度及质量可以得到很大提高。

发明概述

针对现有作为种子细胞的脂肪干细胞的快速获取、扩增与长期保存难等问题，本发明的目的是提供一种脂肪干细胞的规模化生产工艺。

本发明提供的脂肪干细胞的规模化生产工艺包括如下步骤：

（1）脂肪干细胞的分离提取：将脂肪组织用胶原酶消化后，于1200-1500rpm/min离心去除上层脂肪，底层细胞用PBS重悬后经100-200目筛网过滤，滤液以900-1200rpm/min离心去除上清，用脂肪干细胞培养液重悬底层细胞，转移至培养皿中，于37℃、5%CO₂条件下培养，获得原代细胞；

（2）脂肪干细胞的培养扩增：将步骤（1）获得的原代细胞以0.1×10⁵-1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种于二维培养器皿中，加入新鲜细胞培养液，于37℃、5%CO₂条件下培养，3天换液；

（3）脂肪干细胞的检测：进行细胞复苏检测、细胞活性检测、无菌性检测和流式细胞仪检测；

（4）脂肪干细胞的大规模培养：采用转瓶培养或生物反应器培养，将步骤（1）获得的脂肪干细胞接种在转瓶或生物反应器中后，调整溶解氧浓度、pH值、搅拌转速和通气量，根据取样分析细胞计数、存活率、营养成分和代谢物的结果更换培养基，从而达到细胞的高密度大规模培养；

（5）脂肪干细胞的冷冻保存:将检测合格的细胞冻存于管内，细胞的详细信息扫描入数据管理系统，自动化系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中;

（6）根据需要，进行脂肪干细胞的长期冷冻保存，保存期间定期从冻存环境中取出细胞进行复苏检测。

步骤（1）中，脂肪组织剪碎后用0.15-0.3%胶原酶磷酸缓冲液消化，于37℃震荡消化40-60min，用等体积的含10-20%FBS的DMEM或α-MEM培养液终止消化。

步骤（1）中，所述脂肪干细胞培养液含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM以及自制的含10-20%的血清或无血清培养基。

步骤（2）中，将步骤（1）培养的原代细胞（在长满培养器皿底部80%-90%时）用胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱离原代培养器皿后接种于二维培养器皿。所述二维培养器皿可选自细胞培养孔板、培养皿和组织培养方瓶。

步骤（4）中，调节溶解氧浓度为40%-60%、pH值为6.8-7.2、搅拌转速为80-120rpm。

步骤（4）中所述的转瓶培养按以下过程进行：将微载体经预处理、转瓶硅化、121℃高温灭菌后，接种细胞，微载体加入量为2-10g/L，大小范围为60~300μm，接种密度为3×10⁴-3×10⁵个细胞/ml，转瓶的大小范围为25ml-500ml，转速范围50-75rpm/min。

步骤（4）中所述的生物反应器选自细胞培养生物反应器，包括搅拌式生物反应器、固定床生物反应器、WAVE生物反应器等。

本发明的生产工艺中，所使用的搅拌式生物反应器、WAVE生物反应器按以下过程进行细胞培养：将微载体用PBS冲洗2次，第三次加入PBS放入4℃冰箱内平衡水化过夜，高压蒸汽灭菌后，接种脂肪干细胞，微载体的加入量为3-10g/L，接种密度为10⁵-10⁶个细胞/mL，细胞扩增至密度为5×10⁵-2×10⁷个细胞/mL。本发明的生产工艺中，所使用的固定床生物反应器按以下过程进行细胞培养：在生物反应器中加入经表面处理切割好的聚酯切片作为细胞载体，并加入磷酸缓冲液，高温蒸汽灭菌后加入细胞培养液，接种脂肪干细胞，其中聚酯纤维载体的使用量为每升罐体积25-45g，接种密度为10⁵-10⁶个细胞/mL，细胞扩增至密度为5×10⁵-2×10⁷个细胞/mL。上述生物反应器培养条件所述溶解氧浓度为40%-60%、pH值为7.0-7.2、搅拌转速为50-100rpm。

本发明的生产工艺中，步骤（5）中输入的细胞详细信息包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期；所述冷冻保存包括将所获得的脂肪干细胞按1×10⁶~1×10⁷个/ml细胞密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，经过程序降温后，将冻存管转移至-196℃液氮中冷冻保存。所述冻存液包含DMSO、胎牛血清和DMEM培养液1:2:7（体积比）。

根据需要，进行脂肪干细胞的长期冷冻保存，保存期间定期从冻存环境中取出细胞进行复苏检测。

发明详述

本发明针对现有作为种子细胞的脂肪干细胞的快速获取、扩增与长期保存难等问题，寻找一种适用于规模化生产的脂肪干细胞高效培养扩增及长期保存方法。

下面详细描述本发明的脂肪干细胞规模化生产工艺。

一、脂肪干细胞的分离提取：

取出采集的人脂肪，去除脂肪组织中肉眼可见的血管和纤维部分，用PBS或D-Hanks或SPB等平衡盐缓冲溶液反复冲洗，去除残留的血液，用剪刀将脂肪组织剪碎，加入0.15-0.3%胶原酶磷酸缓冲液在37℃条件下均匀震荡消化40-60min，然后加入等体积的含有10-20%FBS的DMEM或者α-MEM培养液终止消化，再转移至离心管中，1200-1500rpm/min离心10min，去除上层的脂肪；将底层的细胞用PBS重悬；重悬后的细胞悬液经100-200目筛网过滤，去除还未消化完的组织，将滤液以900-1200rpm/min离心5min，去除上清，用脂肪干细胞培养液重悬底层细胞，转移至培养皿中，37℃、5%CO₂培养箱中培养，获得原代培养的脂肪干细胞；

二、脂肪干细胞的培养扩增

当原代细胞长满器皿底80~90%，用含0.25%EDTA的胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱离后，采用不同的培养方式重新接种，并加入细胞培养液，在恒温培养箱中培养扩增。

当采用二维培养器皿进行脂肪干细胞培养扩增时，根据培养容器的底部表面积及原代细胞的数量，将原代细胞以0.1×10⁵-1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种于二维培养器皿中，加入细胞培养液（例如含15%胎牛血清的DMEM培养液）于37℃、5%CO2条件下培养，3天换液。

二维培养器皿常见的有各种细胞培养孔板、Petri培养皿、组织培养方瓶、滚瓶等。

三、脂肪干细胞的检测

在脂肪干细胞提取之后，进行细胞活性检测、无菌性检测、流式细胞检测等。

细胞活性检测，包括在显微镜下观察细胞生长情况，将细胞接种于24孔板内，用cck-8法制作细胞生长曲线。

无菌性检测，收集培养过细胞的培养液，在25℃、37℃的生化培养箱内培养后在显微镜下观察进行真菌、细菌检测。

流式细胞检测，检测细胞的特异性，包括间充质干细胞特异性表面标志物Stro-1、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120等，以及其它系细胞表面标志物，如CD14、CD34、CD45等。

四、脂肪干细胞的大规模扩增

采用转瓶培养或生物反应器进行脂肪干细胞的大规模培养，在培养过程中，应调整溶解氧浓度、pH值、搅拌转速和通气量，根据取样分析细胞计数、存活率、营养成分和代谢物的结果更换培养基，从而达到细胞的高密度大规模培养。

转瓶培养扩增的过程包括：将微载体经预处理、转瓶硅化、121℃高温灭菌后，接种细胞，微载体加入量为2-10g/L，接种密度为3×10⁴-3×10⁵个细胞/ml，转瓶的大小范围为25ml-500ml，微载体的大小范围为60~300μm，转速范围50-75rpm/min，培养方式是分批培养。

反应器培养的一个主要问题就是溶氧限制，培养基中的氧气的溶解度很低（7.6μg/ml），典型密度2×10⁶/ml培养的细胞在不到1h的时间内就会耗尽培养基中的氧气，因此必须在培养周期内不断向培养基中通入氧气。通过控制空气，氮气，二氧化碳，氧气的比例维持培养液中的溶解氧在一个合适的水平供细胞消耗。搅拌一方面可以使细胞悬浮于培养基中，另一方面可以促进液体混合传质，提高供氧能力。细胞代谢的副产物积累会影响培养液的pH值从而影响到细胞生长，所以需要通过分析培养基成分控制添加新鲜培养基的速率，以提供给细胞一个良好的营养环境。

生物反应器培养扩增的过程包括：①微载体的预处理：将微载体用PBS冲洗2次，第三次加入PBS放入4℃冰箱内平衡水化过夜，高压蒸汽灭菌；②将转瓶或大量二维平皿扩增培养的脂肪干细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，接种在微载体上，反应器的体积为3-10L，微载体的加入量为3-10g/L，接种密度为10⁵-10⁶个细胞/mL，细胞培养扩增至密度为5×10⁵-2×10⁷个细胞/mL；③用含EDTA的胰酶收获所扩增的脂肪干细胞，进行后续检测。

生物反应器培养扩增可以是一级生物反应器培养，也可以是多级培养。在一级生物反应器中细胞生长到一定程度时，根据对细胞数量的要求可进行下一级细胞放大培养，即将微载体上的细胞完全消化之后作为种子细胞接种下一级生物反应器或者直接添加新的微载体进行球转球放大培养。

生物反应器可选自搅拌式生物反应器、固定床生物反应器、波浪式（wave）生物反应器等，以及其他各种形式和基于各种原理的细胞体外大规模培养系统或装置。

搅拌式生物反应器主要是通过搅拌器转动来搅动培养液以增加传质能力,确保细胞培养的氧浓度和营养物质的均一性,达到大规模培养细胞的目的,同时使培养液对细胞施加一定的剪应力。目前在医学组织工程研究中最常用的是搅拌瓶反应器。其主要特点是采用磁力转子搅动培养液,把干细胞接种在磁力搅拌的培养液中,细胞在持续搅动的培养液中生长。搅拌式生物反应器的最大优点是,能培养各种类型的动物细胞,培养工艺容易放大,产品质量稳定,非常适合于工厂化生产。

固定床生物反应器内部填充片状载体，使细胞贴服生长，通过连续灌注新鲜培养液使细胞达到较高密度，培养过程中，细胞营养充足，代谢废物能及时去除，为细胞生长提供一个良好的环境。使用的片状载体包括NBS公司的聚酯纤维等一切可以利于细胞贴服生长的材料。

WAVE生物反应器是一次性使用的波浪袋生物反应器，用以替代传统的不锈钢发酵罐。一次性反应器适用于各种类型的细胞培养。温和的波浪式运动可以起到良好的供氧和混合的目的，同时，这种运动方式所产生的剪切力也很小，远远小于传统罐体中用搅拌或者气升式方法所产生的剪切力；能够支持高密度大规模细胞培养，并且不会形成泡沫和剪切力的破坏作用。

采用以上生物反应器进行细胞培养的模式包括分批培养模式、间歇式培养模式和连续灌注式培养模式。

分批培养模式是将压碎干细胞和培养液一次性装入生物反应器内进行培养，细胞不断生长、大量扩增，经过一段时间之后，将这个反应系统取出，消化得到高质量的脂肪干细胞。

间歇式培养模式采用间歇式生物反应器，在反应器中加入培养液，进行灭菌后，接入细胞株，在维持适合细胞生长和产物生成的条件下进行细胞培养，反应过程中除需要通入一定量的无菌空气、消泡剂和酸碱外，一般不再加入培养基和培养物，也不取出产物，只有等反应进行到一定程度后，才全部将培养液放出，进行后处理。

连续灌注式培养模式，在连续灌注式生物反应器系统中安装细胞微载体截留装置，将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养。一方面新鲜培养液不断加入反应器内；另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。连续灌注式生物反应器可以对细胞的微环境进行更为精确的监测和控制,既省时省力，又减少了细胞发生污染的机会，培养细胞的密度及质量可以得到很大提高。

五、脂肪干细胞的冷冻保存

细胞收获之后，用培养液反复吹打细胞，混匀，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测，支原体检测，病毒检测，免疫表形检测，细胞技术和活力测定，生物学效力检测，细胞分化能力检测以确定其是否到达合格标准。经过检测符合标准的脂肪干细胞按1×10⁷~8×10⁷个细胞/ml的密度在冻存液DMSO、胎牛血清和DMEM培养液1:2:7中重悬，分装入冻存管。

填写细胞的详细信息，包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期等，完整记录每一样本的真实冷冻状况，冻存管上的信息感应部位对准扫描仪器，将信息准确无误地扫描入数据管理系统，完成细胞库信息录入和构建。

各冻存管经过程序降温后，转移至-196℃液氮中冷冻保存。系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中。

冻存空间应符合国家相关文件规定，具有良好的卫生环境，包括洁净区、通风、采光环境。

冻存期间定期从冻存环境中取出细胞进行检测。定期检测的内容包括细胞复苏、细胞活性检测。

本发明提供的脂肪干细胞规模化生产工艺建立了脂肪干细胞大量扩增方法，并建立了脂肪干细胞的标准化、系统化冻存体系，建立了长期高质量储存脂肪干细胞的细胞库，以便为临床及科研提供足够高质量的干细胞资源，成本低廉，应用前景广阔。

本发明的脂肪干细胞规模化生产工艺中尤其使用了生物反应器微载体培养技术大量培养干细胞。与传统的培养方法相比，本发明的方法具有以下优点：

(1)微载体表面积/体积比大，单位体积培养细胞的产率高。较传统的单层细胞培养面积大大增加，可以在短期内大量得到脂肪干细胞；

(2)微载体悬浮于培养基中，脂肪干细胞生长环境均一，简化了培养条件的监测和控制，同时培养基利用率高；

(3)采样重演性好，细胞最终收获过程不复杂，劳动强度小，占用空间小，操作简便，所需人员少，工艺容易放大生产，可以保证细胞质量；

(4)细胞培养系统符合最新的法规标准，安全性更好。

同时，本发明的脂肪干细胞规模化生产工艺中尤其采用了标准化、系统化的脂肪干细胞长期冻存方法。干细胞通过体外大规模扩增后，按照标准化流程冻存，冻存空间具有良好的卫生环境，包括洁净区，通风，采光环境，符合国家相关文件规定。同时，详细记录的细胞信息以备未来科研和临床使用。

本发明的脂肪干细胞规模化生产工艺不仅能大大增加脂肪干细胞作为种子细胞的数量，而且能够长期保持其生长与分化的能力，冷冻复苏后也能够保持其干细胞的基本特性，经过冷冻保存后能够为未来的临床以及科研提供大量的脂肪干细胞资源。

附图说明

图1是本发明的脂肪干细胞规模化生产工艺的流程图。

图2是脂肪干细胞在含微载体的转瓶中培养扩增的生长曲线图。

具体实施方式

以下用实验例对本发明作进一步阐述。本技术领域普通技术人员应当认识到，这些实验例仅仅用于举例说明本发明而不对本发明的范围构成任何限制，对本发明所作的任何改变，只要不违背本发明的精神实质，都将落在权利要求范围内。

实例中的操作均在严格无菌环境下进行，为保证细胞不受污染，在所有使用的磷酸盐缓冲液、细胞培养液中均加有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。

实施例1、脂肪干细胞分离提取

取出采集的人脂肪，去除脂肪组织中肉眼可见的血管和纤维部分，用PBS或D-Hanks或SPB等平衡盐缓冲溶液反复冲洗，去除残留的血液，用剪刀将脂肪组织剪碎，加入0.15-0.3%胶原酶磷酸缓冲液在37℃条件下均匀震荡消化40-60min，然后加入等体积的含有10-20%FBS的DMEM培养液终止消化，再转移至离心管中，1200-1500rpm/min离心10min，去除上层的脂肪；将底层的细胞用PBS重悬；重悬后的细胞悬液经100-200目筛网过滤，去除还未消化完的组织，将滤液以900-1200rpm/min离心5min，去除上清，用脂肪干细胞培养液重悬底层细胞，转移至培养皿中，37℃、5%CO₂培养箱中培养，获得脂肪干细胞。

脂肪干细胞流式检测：将获得的第三代脂肪干细胞进行干细胞表面抗原的鉴定，即分别对细胞表面标志物进行流式检测。（检测的指标有检测标志物CD105、CD14、CD44、CD45、CD29、CD90）

结果显示，其中CD105、CD44、CD29、CD90为间充质干细胞表面抗原，此检测中呈阳性；

CD14、CD45为造血系细胞的表面抗原，此检测中呈阴性。

实施例2、脂肪干细胞的平皿培养扩增

当细胞长满平皿的80%时，弃去原培养液，用PBS洗涤2遍，加入覆盖皿底量的0.25％含有EDTA的胰蛋白酶，消化3-4min，期间不间断用倒置显微镜观察，见胞质回缩，细胞间隙增大，细胞变圆，立即加入与胰酶等体积的细胞培养基终止消化，用吸管反复吹打贴壁细胞，将细胞吹打下来，1000r/min离心5min，再用细胞培养液重悬细胞，按照密度为1.0×10⁶个细胞/cm²，接种到新的平皿中，加入新鲜细胞培养液于37℃、5%CO₂条件下培养，3天换液。即可得到数量扩增的细胞。

实施例3、脂肪干细胞在含微载体的转瓶中培养扩增

在本实施例中使用的是含有微载体的转瓶培养扩增细胞，转瓶工作体积为125ml，微载体为Cytodex-3。

①转瓶预处理：125ml转瓶清洗干净，烘干至完全干燥，20ml加入硅化液(Sigmacote,Sigma)于转瓶中，缓慢旋转转瓶使硅化液浸润瓶壁，吸去硅化液后，将转瓶置于通风处风干12h，蒸馏水冲洗备用。

②微载体预处理：本实施例中微载体密度定为2g/L，由于培养体积为50ml，因此称取0.1gCytodex-3转瓶中，加入20ml PBS浸泡3h，吸去后加入20ml新的PBS，121℃高压蒸汽灭菌20min，吸去PBS并加入20ml含15%胎牛血清的DMEM培养液，37℃浸泡过夜。

③脂肪干细胞的接种：取4平皿生长至80%融合的脂肪干细胞，0.25%胰酶-EDTA消化后，以15%胎牛血清的培养液终止消化，1000rpm离心5min，新鲜培养液重悬，以4×10⁴个细胞/ml的密度接种在三维微载体上。将含有8×10⁶个细胞的悬液加入含有Cytodex-3的转瓶中，再分别补足培养液至25ml，置于Wheaton磁力搅拌器上间歇搅拌，间歇搅拌条件为45rpm搅拌2min，停止13min，如此循环3h，37℃，5%CO₂。接种结束后，分别补入25ml培养液至50ml最终工作体积，转速调整为55rpm，每2天更换2/3培养液直至培养结束。

④脂肪干细胞的获取：停止转瓶内的搅拌，弃去上清液，0.25%胰酶-EDTA消化后，以15%胎牛血清的培养液终止消化，1000rpm离心5min，新鲜培养液重悬，可得到6.1×10⁵个细胞/ml密度的细胞，即最终脂肪干细胞扩增了约15倍。实验结果见图2。

实施例4、搅拌式生物反应器培养扩增脂肪干细胞

用平皿或转瓶小规模培养扩增脂肪干细胞，达到足够的细胞数量。

连接反应器气路管，进液管，出液管等管路，121℃高压湿热灭菌40min，打入新鲜的细胞培养液，搅拌2天进行培养液检菌。

微载体的水化过程：称取15g微载体置一干净容器，使用无Ca²⁺，Mg²⁺的PBS在室温下水化过夜并不时温和搅拌。弃去上清，加入新鲜的无Ca²⁺，Mg²⁺的PBS，温和搅拌后洗涤2次，弃去洗涤的PBS，加入PBS，121℃高压湿热灭菌20min。

将预先水化、灭菌的微载体接种到3L培养液中。

挑选形态健康，生长良好的平皿生产细胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，按照6×10⁵个/mL制成细胞悬液，半量接种至反应器中，调节反应器的温度，培养液pH，溶氧等参数，是细胞生长于最适宜环境进行细胞培养。80rpm转3min,静置12min，如此重复12个循环，结束后接种剩余细胞，以100rpm的转速连续培养。

采用灌注模式进行培养，溶氧是细胞代谢中的重要参数，它可以影响细胞的产率，所以需要时事观测调节溶氧量维持在50%，此过程可通过计算机有序定量地控制加入动物细胞培养罐内的空气，氧气，氮气和二氧化碳四种气体的流量使其保持最佳的比例来实现。

计算机实时自动将反应器温度控制在37±0.2℃，pH：7.0-7.2。

细胞接种第2天，根据细胞的生长汇合情况判断是否进行灌注培养及灌注体积，一般灌注体积为反应器1个工作体积，之后可控制在1-2vvD；

每天取样观察拍照，计算细胞数目。当细胞长满微载体表面，数目达到约4.5×10⁶个/mL时，停止培养。

通过反应器的微载体/细胞截留装置将高压液体排出，加入500mLPBS冲洗2-3次，100mL胰酶/EDTA加入罐子，消化20min，加入等体积培养液终止消化。收获脂肪干细胞，最终细胞扩增了近7.5倍。

实施例5、固定床式生物反应器培养扩增脂肪干细胞

①采用美国BBA Fiberweb的Reemay公司（Old Hickory，TN，USA）生产的无纺布聚酯类纤维（Non Woven Polyester Fabric），No.2214型，经表面处理并切割成直径为6mm的圆形小片体。

②细胞生物反应器选择的是购买自美国NBS公司的5L生物反应器Celligen Plus，工作体积3.5L，采用固定床篮式搅拌系统。在生物反应器中加入上述处理切割好的直径为6mm的圆形聚酯切片作为细胞载体，并加入磷酸缓冲液，121℃灭菌30min。灭菌后，排空磷酸缓冲液，加入含15%胎牛血清的DMEM培养液，并开始控制细胞生物反应器条件。（下一段有介绍到）

③挑选形态健康，生长良好的脂肪干细胞用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，作为细胞生物反应器的种子细胞，以3.0×10⁵个细胞/mL的密度接种到生物反应器中的无纺布/聚酯纤维圆形小片载体上，用细胞培养液进行扩增培养。其中聚酯纤维圆形小片载体的使用量为每升罐体积35g，所使用的细胞培养液为DMEM培养基加15%胎牛血清。细胞生物反应器培养条件为酸碱度（pH）值7.2，温度37℃，溶氧浓度（DO）为空气饱和的50%，搅拌速度120rpm。

④每天通过生化分析仪检测葡萄糖和乳酸含量等参数，接种后培养约8天，排空培养液，加入500mLPBS冲洗2-3次后，加入100mL胰酶/EDTA，消化20min，加入等体积培养液终止消化，收获细胞。最终获得的脂肪干细胞密度为4.2×10⁶个细胞/mL，即利用固定床式生物反应器培养脂肪干细胞扩增了近14倍。

实施例6、脂肪干细胞的冷冻保存

将平皿中长满至80-90%的脂肪干细胞，去除旧的培养液，用PBS清洗2遍，接着加入0.25%含有EDTA的胰酶37℃消化3min，待细胞全部脱落后，加入等体积的脂肪干细胞培养液终止消化，1000rpm/min离心5min，去除上清，再用干细胞冻存液（含有DMSO、胎牛血清和DMEM培养液，1:2:7）将细胞重悬，获得的脂肪干细胞悬液加入到细胞冻存管中，置于程序式降温盒（含异丙醇的程序降温盒）中-80℃过夜，第二天转移到-196℃的液氮中长期保存。

Claims (10)

1.一种脂肪干细胞的规模化生产工艺，包括如下步骤：

（1）脂肪干细胞的分离提取：将脂肪组织用胶原酶消化后，于1200-1500rpm/min离心去除上层脂肪，底层细胞用PBS重悬后经100-200目筛网过滤，滤液以900-1200rpm/min离心去除上清，用脂肪干细胞培养液重悬底层细胞，转移至培养皿中，于37℃、5%CO₂条件下培养，获得原代细胞；

（2）脂肪干细胞的培养扩增：将步骤（1）获得的原代细胞以0.1×10⁵-1.0×10⁵个细胞/cm²的密度接种于二维培养器皿中，加入新鲜细胞培养液，于37℃、5%CO₂条件下培养，3天换液；

（3）脂肪干细胞的检测：进行细胞复苏检测、细胞活性检测、无菌性检测和流式细胞仪检测；

（4）脂肪干细胞的大规模培养：采用转瓶培养或生物反应器培养，将步骤（1）获得的脂肪干细胞接种在转瓶或生物反应器中后，调整溶解氧浓度、pH值、搅拌转速和通气量，根据取样分析细胞计数、存活率、营养成分和代谢物的结果更换培养基，从而达到细胞的高密度大规模培养；

（5）脂肪干细胞的冷冻保存:将检测合格的细胞冻存于管内，细胞的详细信息扫描入数据管理系统，自动化系统根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中;

（6）根据需要，进行脂肪干细胞的长期冷冻保存，保存期间定期从冻存环境中取出细胞进行复苏检测。

2.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤（1）中，所述胶原酶消化是将脂肪组织剪碎后用0.15-0.3%胶原酶磷酸缓冲液于37℃震荡消化40-60min。

3.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤（1）中，所述脂肪干细胞培养液含有支持干细胞生长的糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，包括商品化的DMEM、α-MEM以及自制的含10-20%的血清或无血清培养基。

4.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤（2）中，将步骤（1）培养的原代细胞在长满培养器皿底部80%-90%时用胰酶溶液消化并吹打细胞，使细胞完全脱离原代培养器皿后接种于二维培养器皿，所述二维培养器皿可选自细胞培养孔板、培养皿和组织培养方瓶。

5.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤（4）中，所述溶解氧浓度为40%-60%、pH值为7.0-7.2、搅拌转速为50-100rpm。

6.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤（4）中的所述转瓶培养按以下过程进行：将微载体经预处理、转瓶硅化、121℃高温灭菌后，接种细胞，微载体加入量为2-10g/L，大小范围为60~300μm，接种密度为3×10⁴-3×10⁵个细胞/ml，转瓶的大小范围为25ml-500ml，转速范围50-75rpm。

7.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤（4）中的所述生物反应器选自细胞培养生物反应器，包括搅拌式生物反应器、固定床生物反应器和WAVE生物反应器。

8.如权利要求7所述的生产工艺，其中所述搅拌式生物反应器、WAVE生物反应器按以下过程进行细胞培养：将微载体用PBS冲洗2次，第三次加入PBS放入4℃冰箱内平衡水化过夜，高压蒸汽灭菌后，接种脂肪干细胞，微载体的加入量为3-10g/L，接种密度为10⁵-10⁶个细胞/mL，细胞扩增至密度为5×10⁵-2×10⁷个细胞/mL；其中所述固定床生物反应器按以下过程进行细胞培养：在生物反应器中加入经表面处理切割好的聚酯切片作为细胞载体，并加入磷酸缓冲液，高温蒸汽灭菌后加入细胞培养液，接种脂肪干细胞，其中聚酯纤维片状载体的使用量为每升罐体积25-45g，接种密度为10⁵-10⁶个细胞/mL，细胞扩增至密度为5×10⁵-2×10⁷个细胞/mL。上述生物反应器培养条件所述溶解氧浓度为40%-60%、pH值为7.0-7.2、搅拌转速为50-100rpm。

9.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述步骤（5）中，所述细胞的详细信息包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期；所述冷冻保存包括将所获得的脂肪干细胞按1×10⁶~1×10⁷个/ml细胞密度在冻存液中重悬，分装入冻存管，经过程序降温后，将冻存管转移至-196℃液氮中冷冻保存。

10.如权利要求1所述的生产工艺，其中所述脂肪干细胞的冷冻保存使用的冻存液包含体积比为1:2:7的DMSO、胎牛血清和DMEM培养液。

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