CN107746829A - 一种分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法，包括：1)犬胎盘保存液的配制；2)新生犬脐带的采集；3)从产后废弃组织中分离出胎盘组织；4)清洗和剪碎组织块；5)胰蛋白酶消化；6)分离除去红细胞；7)扩增培养。本培养方法操作简单、重复性好，从中可获得较少的杂细胞和无污染的纯净间充质干细胞。培养方法中使用的胎盘保存液能避免胎盘运输过程中细菌的大量增长，为后期成功分离胎盘间充质干细胞提供基础，胰蛋白酶消化方法快速便捷，单细胞产量高且能较好保持细胞活性，最后用Ficoll分离法除去红细胞，能获得较纯的具有较强增殖能力的间充质干细胞，可用于后续该细胞的建系、干细胞特性与治疗疾病等。

Description

一种分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesnchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有多向分化能力的成体干细胞，在特定条件下可定向分化为肌肉、软骨、血管、内皮和神经等多种细胞，是目前最具有临床应用前景的一类成体干细胞，已有多项研究证明其在心血管疾病、血液疾病、关节损伤等疾病的治疗中具有显著作用。而胎盘来源的间充质干细胞具有材料易得、免疫原性低的优点，并且在疾病治疗中避免了伦理和道德上的争议，具有广阔的市场前景。犬作为日渐受人们欢迎的宠物，其疾病的治疗技术发展迅速，然而对于如关节炎、神经损伤和肾脏损伤等疾病目前仍无有效治疗药物，间充质干细胞的治疗为此提供了一个新的思路。

目前，对人类间充质干细胞的研究较为深入，但对犬胎盘间充质干细胞的研究却鲜有报道。为深入研究犬脐带间充质干细胞在重大疾病治疗上的应用，高效的分离和培养方法显得尤为重要。

发明内容

为了克服分离间充质干细胞过程中的缺点和不足，本发明提供一种分离和培养犬胎盘间充质干细胞的方法，为其体外培养、建系和应用奠定基础。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

1)犬胎盘保存液的配制：

将180ml生理盐水倒入无菌密封袋中，加入20ml双抗溶液，配制成含浓度10％双抗的胎盘保存液，置于4℃冰箱中保存待用；

2)新生犬产后废弃组织的采集：

在幼犬刚从母体生出时用无菌器械剥离胎衣，将整个产后废弃组织立即放入保存液中，此时若需远距离运输，则将整袋样品置于冰盒中进行运输，保证在48h内分离间充质干细胞；

3)从产后废弃组织中分离出胎盘组织：

小心剪去产后废弃组织中游离的脐带和膜结构，剩下环状胎盘组织，将一整个组织置于75％酒精中浸泡5s迅速取出，置于含5％双抗溶液的PBS中，小心剥离胎盘组织表面的绒毛膜以及附着在上面的肉眼可见白色血管组织；

4)清洗和剪碎组织块：

4-1)将步骤3)中剩下的富含毛细血管的胎盘组织置于含5％双抗的PBS缓冲溶液中浸泡5分钟，用镊子取出；

4-2)将步骤4-1)中的胎盘组织转移到无菌100mL小烧杯中，用组织剪剪至2mm³大小；

5)胰蛋白酶消化：

加入约2倍体积的0.25％胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化30min，消化过程中时不时晃动小烧杯，消化完全后取出，用胰蛋白酶2倍体积的含10％胎牛血清的DMEM终止消化；

6)分离除去红细胞：

将终止后的细胞和组织混悬液用200目筛网过滤，收集滤液1200rpm离心5分钟，弃上清，用5ml DMEM培养液重悬沉淀，然后将悬液沿管壁缓慢加入含有3ml 1.077g/mlFicoll溶液的离心管中，2500rpm/min离心20min，小心吸取中间有核细胞形成的白色云雾层于新的离心管中，加DMEM混匀后1200rpm/min离心5min；

7)扩增培养：

取上一步离心后的细胞液弃上清，加入含10％血清、1％L-谷氨酰胺的DMEM混匀制成细胞悬液接种至细胞培养皿中，以5％CO₂浓度、37℃环境于培养箱中培养。

进一步，还包括步骤：

8)培养24h后进行胎盘间充质干细胞培养液换液，以后每3天换一次液，并根据间充质干细胞生长状况进行传代。

本发明的有益效果是：

(1)本发明中间充质干细胞来源于新生犬胎盘，来源广泛，材料易得，使后期该细胞的大量生产和临床应用成为可能；

(2)本发明使用的胰蛋白酶消化方法方便快捷，能获得大量的具有较强增殖能力的间充质干细胞，可用于后续该细胞的建系、干细胞特性与治疗疾病等。

(3)本发明操作简单、重复性好。胎盘中含有大量血细胞，使用Ficoll分离法除去其中的红细胞，从中可获得较少的杂细胞和无污染的纯净间充质干细胞。

附图说明

图1是实施例2所得的生长曲线图；

图2是实施例3所得的鉴定结果图；

图3是实施例4所得的分化结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞。

1)犬胎盘保存液的配制：

将180ml生理盐水倒入无菌密封袋中，加入20ml双抗溶液，配制成含浓度10％双抗的胎盘保存液，置于4℃冰箱中保存待用；

2)新生犬产后废弃组织的采集：

在幼犬刚从母体生出时用无菌器械剥离胎衣，将整个产后废弃组织立即放入保存液中，此时若需远距离运输，则将整袋样品置于冰盒中进行运输，保证在48h内分离间充质干细胞；

3)从产后废弃组织中分离出胎盘组织：

小心剪去产后废弃组织中游离的脐带和膜结构，剩下环状胎盘组织，将一整个组织置于75％酒精中浸泡5s迅速取出，置于含5％双抗溶液的PBS中，小心剥离胎盘组织表面的绒毛膜以及附着在上面的肉眼可见白色血管组织；

4)清洗和剪碎组织块：

4-1)将步骤3)中剩下的富含毛细血管的胎盘组织置于含5％双抗的PBS缓冲溶液中浸泡5分钟，用镊子取出；

4-2)将步骤4-1)中的胎盘组织转移到无菌100mL小烧杯中，用组织剪剪至2mm³大小；

5)胰蛋白酶消化：

加入约2倍体积的0.25％胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化30min，消化过程中时不时晃动小烧杯，消化完全后取出，用胰蛋白酶2倍体积的含10％胎牛血清的DMEM终止消化；

6)分离除去红细胞：

将终止后的细胞和组织混悬液用200目筛网过滤，收集滤液1200rpm离心5分钟，弃上清，用5ml DMEM培养液重悬沉淀，然后将悬液沿管壁缓慢加入含有3ml 1.077g/mlFicoll溶液的离心管中，2500rpm/min离心20min，小心吸取中间有核细胞形成的白色云雾层于新的离心管中，加DMEM混匀后1200rpm/min离心5min；

7)扩增培养：

取上一步离心后的细胞液弃上清，加入含10％血清、1％L-谷氨酰胺的DMEM混匀制成细胞悬液接种至细胞培养皿中，以5％CO₂浓度、37℃环境于培养箱中培养；

8)传代培养：

培养24h后进行胎盘间充质干细胞培养液换液，以后每3天换一次液，并根据间充质干细胞生长状况进行传代。

本实施例中所使用的试剂包括：

PBS缓冲溶液的配制配方为：

胎盘间充质干细胞培养基购于Cyagen公司(货号：T160104G001)，根据使用说明将其配成完全培养液，配方为：

所述双抗溶液、胎牛血清、胰蛋白酶购于Hyclone公司。

实施例2：绘制细胞生长曲线

(1)从实施例1中取生长良好的第三代犬胎盘间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；

(2)将细胞稀释至3×10⁴/mL接种至24孔板中，每孔0.5mL，置于含5％CO₂，37℃培养箱中培养；

(3)每天同一时间随机抽取3孔细胞，用胰蛋白酶消化制成悬液后计数，每孔计三次取平均值；

(4)连续计数八天，根据计数结果，以细胞密度为纵坐标(个/mL)，时间为横坐标，绘制得到如图1所示的生长曲线图。

实施例3：免疫荧光鉴定

(1)从实施例1中选取生长良好的第三代间充质干细胞，接种在明胶包被过的培养板上，使细胞贴壁12h，弃去培养基，用含5％FBS的PBS洗涤2次；

(2)加入4％多聚甲醛室温固定30分钟，去掉固定液，用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(3)加入透化剂(0.2％Triton×100)，冰上孵育20分钟，弃去后用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(4)加入封闭液(含10％FBS的PBS)，37℃封闭1h，去掉封闭液，用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(5)分别加入CD44、CD34、CD90三种表面标记蛋白的一抗，4℃避光孵育过夜，弃去液体后用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(6)分别加入FITC标记的相对应的二抗，4℃避光孵育30分钟，弃去液体，用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(7)加入1μg/mL DAPI避光复染5分钟，弃去液体，用含5％FBS的PBS洗涤3次，每次5分钟；

(8)加入抗荧光淬灭剂，在倒置荧光显微镜下观察染色结果并拍照得到如图2所示的鉴定结果图。

实施例4：选取生长状态良好的细胞进行成脂和成骨诱导分化

本实施例所需的试剂包括：

犬间充质干细胞成骨诱导分化培养基配方：

犬间充质干细胞成脂诱导分化培养基配方：

(一)诱导成脂分化步骤

1.犬P-MSC培养至80％融合时，用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；

2.将细胞密度调整至2×10⁴/cm²，加到六孔板中，每孔加2ml细胞悬液；

3.置于37℃、5％CO₂条件下培养细胞，每3天换一次液；

4.细胞达到100％汇合时，弃去孔内的培养基，用PBS冲洗2次，每孔加入2ml A液；

5.培养三天后，弃去原培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入2mlB液

6.培养24小时后，弃去原培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入2ml A液

7.重复步骤5和6，3-5次，最后将细胞养在B液中7天，每3天换一次液；

8.油红O染色分析：弃去孔中培养液，用PBS清洗2次，加入2ml 4％甲醛溶液固定细胞30分钟；然后弃去液体，PBS清洗2次，用1ml油红O工作液染色30分钟后用PBS清洗2次，显微镜下观察并拍照。

(二)诱导成骨分化步骤

1.犬P-MSC培养至80％融合时，用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；

2.将细胞密度调整至3×10⁴/cm²，加到六孔板中，每孔加2ml细胞悬液；

3.置于37℃、5％CO₂条件下培养24h后弃去原培养液，用PBS清洗2次后加入2ml成骨分化培养液；

4.以后每3天换一次液，直至2-3周后进行茜素红染色分析；

5.茜素红染色分析：弃去原有培养液，用PBS清洗2次后每孔加入2ml 4％甲醛溶液固定30分钟；然后弃去液体用PBS洗2次，加入1ml茜素红工作液反应五分钟后用PBS清洗2次，在光学显微镜下观察并拍照，得到如图3所示的分化结果图。

Claims (5)

1.一种分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)犬胎盘保存液的配制：

以生理盐水和双抗溶液配制成含浓度10％双抗的胎盘保存液，4℃冷藏保存；

2)新生犬产后废弃组织的采集：

在幼犬刚从母体生出时用无菌器械剥离胎衣，将整个产后废弃组织立即放入保存液中，在48h内进行间充质干细胞的分离；

3)从产后废弃组织中分离出胎盘组织：

剪去产后废弃组织中游离的脐带和膜结构，消毒后置于含5％双抗溶液的PBS中，剥离胎盘组织表面的绒毛膜以及附着在上面的肉眼可见白色血管组织，得到胎盘组织；

4)清洗和剪碎组织块：

将胎盘组织剪碎成2mm³的组织块；

5)胰蛋白酶消化：

向组织块加入2倍体积的0.25％胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化30min，消化完全后取出，用胰蛋白酶2倍体积的含10％胎牛血清的DMEM终止消化，得到细胞和组织混悬液；

6)分离除去红细胞：

将细胞和组织混悬液用200目筛网过滤，收集滤液1200rpm离心5分钟，弃上清，用5mlDMEM培养液重悬沉淀，然后将悬液沿管壁缓慢加入含有3ml 1.077g/ml Ficoll溶液的离心管中，2500rpm/min离心20min，吸取中间有核细胞形成的白色云雾层于新的离心管中，加DMEM混匀后1200rpm/min离心5min；

7)扩增培养：

取离心后的细胞液弃上清，加入含10％血清、1％L-谷氨酰胺的DMEM混匀制成细胞悬液接种至细胞培养皿中，以5％CO₂浓度、37℃环境于培养箱中培养，即可获得间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤3)所述的消毒是将剪去游离脐带和膜结构后的产后废弃组织置于75％酒精中浸泡5s。

3.根据权利要求1所述的分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤4)所述清洗和剪碎组织块具体包括步骤：

4-1)将胎盘组织置于含5％双抗的PBS缓冲溶液中浸泡5分钟，用镊子取出；

4-2)将清洗后的胎盘组织转移到无菌容器中，用组织剪剪至2mm³大小。

4.根据权利要求1所述的分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法，其特征在于，步骤5)胰蛋白酶消化的消化过程中定时震荡消化液。

5.根据权利要求1所述的分离与原代培养犬胎盘来源的间充质干细胞的方法，其特征在于，还包括步骤8)：培养24h后进行胎盘间充质干细胞培养液换液，其后的换液周期为3天/次，所述培养液为10％血清、1％L-谷氨酰胺的DMEM。