CN102296029A - 灌注式生物反应器系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灌注式生物反应器系统，包括：循环灌注系统、恒温系统、气体交换系统和在线监控系统；循环灌注系统包括通过管道依次连接培养舱、储液瓶、蠕动泵，形成一个灌注培养回路；恒温系统包括：内部具有绕行的循环管道的恒温水浴装置，适用于电加热和制冷的控制部分；气体交换系统由气体过滤器、气体流量表、高压气瓶、减压阀以及连接管道组成；在线监控系统由监控探头、监控终端、监控软件、数据转换芯片和传质调节器组成。本发明所述的灌注式生物反应器系统在组织或器官体外构建过程中能尽量模拟体内微环境，保证生物材料内部种子细胞充分的物质交换以及正常的生理功能，提高种子细胞/生物支架材料的收获效率，降低培养周期与培养成本。

Description

灌注式生物反应器系统

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，涉及用组织工程方法构建人工器官的生物反应器，尤其是涉及应用于种子细胞与生物材料的接种与共培养的灌注式生物反应器系统。

背景技术

当前组织工程研究主要包括了四个方面：种子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法和技术以及组织工程的临床应用。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，这与传统的二维结构(细胞培养)有着本质的区别。随着三维细胞培养技术的兴起，越来越多的研究着眼于种子细胞与生物材料的接种与共培养，并取得了一系列的突破，生物反应器的概念与重要性越来越深入人心。

目前市面上常见的生物反应器种类有搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、膜式生物反应器、灌注式生物反应器以及旋转壁式生物反应器。

搅拌式生物反应器的主要原理是通过叶轮或搅拌器转动培养液，提高培养液内细胞的传质效率。它的优点在于确保了细胞培养的氧浓度和培养液养分的均衡。其缺点是：由于搅拌器转动产生的剪切应力很大，易产生大量气泡，因此不适用于组织工程中细胞和组织的培养。该反应器广泛应用于发酵工业和酶工业。

气升式生物反应器的主要原理是在反应器底部设置一个气体喷嘴，从外部通入的空气或者氧气以气泡的形式从下部上升，在上升的过程中达到气体交换的目的。它的优点是：有较好的传质效率，培养液的浓度也比较均匀，工作状况柔和，操作简单。其缺点是：操作弹性小，在低流速，特别是反应器高、直径大、高密度微载体培养时，混合性能不佳。它的剪切应力虽然较机械搅拌小，但是气泡离开液面破裂瞬间所产生的剪应力仍然对细胞有着巨大的杀伤作用。该反应器广泛适用于动植物细胞的培养研究和生产。

膜式生物反应器的主要原理是通过一个起传质作用的透析性膜进行气体交换。它的优点是：气液交换分开，避免了反应器内气泡和流体剪切应力的产生，是一种温和的培养方式，适合于容易受到剪应力破坏的细胞培养。它的缺点在于膜的通透性。由于动物细胞对氧浓度的要求不高，在反应器中大部分采用膜两端自由扩散的传质方式，但在高浓度培养时，膜供氧的方式就不适应大量细胞培养的需求，并且由于膜式生物反应器结构的设计，并不适合种子细胞与大段生物材料的培养与接种。

灌注式生物反应器的原理是通过蠕动泵的作用，不断泵入新鲜培养基，泵出代谢废产物，经由灌流速率的调节可使营养物质和代谢废产物与细胞之间的物质传递、种子细胞/生物材料结构体内ECM的截留及流体产生的剪切力之间达到平衡，组织培养性强。但是，如何最大限度减少非灌流路径、提高灌注效率一直是亟待突破的问题，虽然可以通过对生物材料的预处理进行干预，但是这提高了成本，且在一定程度上影响了材料本身的力学特性，不具备普适性。

旋转壁式生物反应器的原理是：培养液及培养物共处于2个同轴的内外圆筒之间，在步进电动机带动下一起绕水平轴作旋转运动；内外筒可同时同向或反向旋转，转速既可相同也可不同。反应器在动力系统的带动下，容器内培养液和培养物沿水平旋转，充满液体的圆柱形悬浮培养容器提供模拟微重力环境，具有低剪切力、容积利用率高、高密度培养组织细胞、高效的传质效率等优点。旋转壁式生物反应器的缺点在于难以在工业上放大，并且在实际操作中总有一些因素互相制约，例如其传质效果需要加快转速使气体与液体充分混合，但转速又受到抵抗细胞沉降不与内外壁碰撞以及动物细胞脆弱性的限制；较高的溶氧度需要提高相应的氧分压，过高的氧分压又会导致抑制代谢物的移出和产生气泡，同时也影响细胞的正常生长。同时该反应器无法满足大段生物材料与种子细胞的复合与培养。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于大段生物材料和种子细胞接种与共培养的灌注式生物反应器系统，该反应器系统在组织或器官体外构建过程中能尽量模拟体内微环境，使种子细胞均匀分布在生物支架材料上的同时保证生物材料内部种子细胞充分的物质交换以及保持种子细胞正常的生理功能，提高种子细胞/生物支架材料的收获效率，降低培养周期与培养成本。

本发明所述的一种灌注式生物反应器系统，包括：循环灌注系统、恒温系统、气体交换系统和在线监控系统；所述的循环灌注系统包括：通过管道依次连接培养舱、储液瓶、蠕动泵，形成一个灌注培养回路；接种室通过两端的三通管、连接到所述的灌注培养回路，通过调节这些三通管、和蠕动泵来切换接种模式和灌注培养模式；在接种模式下，接种室的两端分别与培养舱、蠕动泵连通，以致培养液流经培养舱后通过三通管进入接种室，然后通过三通管返回储液瓶；在灌注培养模式下，蠕动泵直接连通培养舱，将来自储液瓶的培养液送入培养舱，从培养舱流出的培养液返回储液瓶；所述的恒温系统包括：内部具有绕行的循环管道的恒温水浴装置，以及适用于电加热和制冷的控制部分，使得培养液流经水浴中的循环管道时被加热或冷却；所述恒温水浴装置设置在培养舱与储液瓶之间的回路上；所述的气体交换系统由气体过滤器、气体流量表、高压气瓶、减压阀以及连接管道组成，以致高压气瓶内的含5％CO₂的压缩空气经减压阀减压后，经气体过滤器过滤后进入储液瓶中与培养液进行气体交换，交换后的气体经由另一气体过滤器过滤后排出；所述在线监控系统由监控探头、监控终端、监控软件、数据转换芯片和传质调节器组成；实时监控培养液的pH值、温度、溶解氧以及流速的监控探头设置在培养舱与恒温水浴装置之间的导管上，通过在线监控系统反应器内；在蠕动泵、恒温水浴装置，以及高压气瓶与储液瓶之间的气管上均设有监控探头；这些监控探头与监控终端通信连接，再通过监控软件、数据转换芯片和传质调节器对数据进行处理。

根据本发明所述的灌注式生物反应器系统的进一步特征，在蠕动泵最大功率支持的前提下，多个培养舱通过并联的方式接入所述的循环灌注系统。

根据本发明所述的灌注式生物反应器系统的进一步特征，所述的培养舱包括：底座，向外装有进液管道接口；顶盖，向外装有出液管道接口；前盖，安置在所述顶盖上；培养舱外壳，设置在底座与前盖之间；支架套管，设置在所述培养舱外壳内，所述支架套管的一端通过底座密封圈连接底座，另一端通过顶盖密封圈连接顶盖；所述支架套管内设置有支架接套和套管密封圈，以致在所述支架套管内限定容纳生物材料的空间；以及固定杆，两端分别连接底座和前盖以致将培养舱外壳固定在底座与前盖之间。

根据本发明所述的灌注式生物反应器系统的进一步特征，在所述的培养舱中，培养舱外壳、支架套管、支架接套、顶盖均为圆柱形，而所述底座密封圈、顶盖密封圈和套管密封圈均为O形密封圈。

根据本发明所述的灌注式生物反应器系统的进一步特征，在所述的培养舱中，所述底座和前盖均带有矩形框架，分别开设有对应的孔，供固定杆插入并紧固，优选地，所述固定杆为四根，分别固定在底座和前盖的矩形框架的四个角上。

根据本发明所述的灌注式生物反应器系统的进一步特征，在所述的培养舱中，固定杆的端部通过焊接固定到前盖和/或底座，或者由锁定螺母锁紧固定到前盖和/或底座。

根据本发明所述的灌注式生物反应器系统的进一步特征，在所述的培养舱中，底座与进液管道接口的固定方式是螺纹固定。

根据本发明所述的灌注式生物反应器系统的进一步特征，在所述的培养舱中，顶盖与出液管道接口的固定方式是螺纹固定。

根据本发明所述的灌注式生物反应器系统的进一步特征，在所述的培养舱中，顶盖与前盖的固定方式是螺纹固定。

根据本发明所述的灌注式生物反应器系统的进一步特征，在所述的培养舱中，顶盖还通过固定螺纹圈紧固所述前盖。

根据本发明所述的灌注式生物培养装置的进一步特征，所述底座与支架套管相连接的截面大于顶盖与支架套管相连接的截面。

本发明所述的灌注式生物反应器系统，具有以下的特点和优点：

(1)能将细胞高效且均一地接种于三维多孔支架中，并在可控的力学和物化环境里进行长期培养，将细胞接种和长期培养功能整合于一个系统中进行，使得三维生物材料能够在本灌注式生物反应器系统中产生有效的、均匀的细胞种植效果。

(2)确保流体垂直流经整个支架内部，使力学刺激分布均一，最大限度减少流体流经支架外周的非灌注流动路径，能够有效促进氧气和营养物质向生物材料内部输送，排除代谢废产物，提高传质效率，保持材料内部细胞的活性和功能的发挥，避免“空巢化”现象。保证流体可重复、可控制且连续地流经整个培养体系。

(3)能够有效促进生物材料中附着的种子细胞的生长与增殖，分泌更多的细胞外基质，促进骨组织再生。

(4)能够有效促进成骨性细胞沿着三维生物材料的孔隙生长，产生具有一定几何形状的骨组织。

(5)培养液流动能够对细胞产生一定的剪切应力刺激，调节成骨性细胞功能的发挥。

(6)各个系统部件可进行模块式组合，操作简便，不仅可以增加工程化组织培养的数量，而且根据实验目的在不同时间点灵活方便地收获种子细胞/生物支架材料结构体。

(7)灌注培养舱的进液和出液口不等大，通过配套的套管支架能满足大段生物材料与种子细胞的接种与共培养，无需对生物材料进行预处理，可最大限度减少非灌注路径，成本低廉，适应于多种种子细胞与生物材料的共培养。

(8)整个系统便于灭菌，并在整个培养过程中保持无菌状态。

附图说明

图1为本发明所述的灌注式生物反应器的系统简图；

图2为本发明所述的灌注式生物反应器的培养舱内生物材料内部有效灌注示意图；

图3为本发明所述的灌注式生物反应器的接种模式操作示意图；

图4为本发明所述的灌注式生物反应器的培养舱的剖面图；

图5为图4所示的培养舱的爆炸图，该培养舱内未装入生物材料；

图6为图4所示的培养舱的主视图；

图7为图4所示的培养舱的俯视图；

图8为第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)倒置相差显微镜图片(倒置相差显微镜100×)；

图9为第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)流式细胞仪鉴定图；

图10为不同组别之间生物支架材料上SD大鼠骨髓间充值干细胞(BMSCs)不同时间点的扫描电镜图；

图11为不同组别之间SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖趋势图。

具体实施方式

实施例一：本发明所述的灌注式生物反应系统的构建

本发明所述的灌注式生物反应器主要包括循环灌注系统、恒温系统、气体交换系统和在线监控系统，适用于不同种类的种子细胞(例如，人、鼠、兔、羊、猴等的各种来源的干细胞)与具备一定生物力学强度的生物支架材料的共培养。

整个反应器系统在医用硅胶管90的连通下形成一个整体，经由一个双向蠕动泵20提供动力，新鲜培养液不断从储液瓶30中泵出，经过恒温水浴装置40，加热至37℃，流经监控探头55，通过在线监控系统50实时监控反应器内培养液的PH值、温度、溶解氧以及流体速率。随后，新鲜培养液进入培养舱60，垂直流经种子细胞与生物材料的复合体，带入营养物质与氧气，带出细胞的代谢废产物后回到储液瓶30。气体交换装置35与储液瓶30相连接，通过在线监控系统50的控制，随时调控储液瓶内的溶解氧与PH值。在不超过双向蠕动泵20的最大功率的前提下，可通过培养舱60左右两侧的医用四通管80、81增加培养舱60的数量，提高种子细胞/生物支架材料复合体的获取数量。(参见图1)

循环灌注系统包括：培养舱60、蠕动泵20、接种室65、储液瓶30以及一系列医用硅胶管90和医用三通管70、四通管80组成。本发明在整个培养过程中，可将细胞与生物材料接种以及细胞与生物材料的共培养整合起来，提高了效率的同时可以降低操作所引起的细胞污染。通过开关接种室65上端71和下端70的医用三通管，可以随时切换接种回路与培养回路。

在接种回路模式下，培养液流经培养舱60后通过医用三通管71进入接种室65，然后通过医用三通管70，培养液返回储液瓶30，形成一个完整的回路。

在培养回路模式下，关闭接种室65上下两端的医用三通管71、70，将接种室65切出整个回路。培养液流出培养舱60后，通过与接种室65并联的医用硅胶管90返回储液瓶30，形成一个完整的回路。

培养舱60主要由进液管道接口1、底座2、底座O型圈3、培养舱外壳4、支架套管5、套管O型圈6、支架接套7、前盖8、顶盖9、顶盖密封圈10、固定螺纹圈11、出液管道接口12、四个固定杆13、四个锁定螺母14组成。O型圈3、6和密封圈10采用氯丁二烯橡胶，培养舱外壳4、支架套管5采用硅酸盐玻璃，其余部件均采用医用级别的不锈钢。整个培养舱采用高温高压消毒。

四个固定杆13的一侧可与前盖8通过焊接固定在一起，另一侧穿过底座2上的四个孔，通过锁定螺母14固定。四个固定杆包绕着培养舱外壳4，培养舱外壳4内部为培养腔，放置着支架套管5。生物材料15置于支架套管5内部，支架接套7在其上方，防止灌注过程中生物材料15的移动。顶盖9采用螺纹设计，通过前盖8的螺纹孔，可旋入培养腔内，顶住支架套管5，前盖8上方的固定螺纹圈11在培养舱外部锁住顶盖9。进液管道接口1与底座2相连，出液管道接口12与顶盖9相连。两个管道接口的底部均采用螺纹设计，可随时从培养舱上进行拆卸，方便针对不同管径的医用硅胶管90进行更换。

在系统运作时，整个培养舱以底座2在下，顶盖9在上的方式呈立位放置。培养液从进液管道接口1流入，从下往上垂直流经支架套管5内部的生物材料15从顶盖9的出液管道接口12流出。

支架套管5内部的生物材料15两侧进出液口不等大(例如，进液口直径7mm，出液口直径5mm)，与配备不同的支架套管5和支架接套7是本发明的两个特色所在。培养液在进出液口不等大的生物材料两侧产生一定的压强，可确保培养液均一地流经具有三维立体结构的多孔生物材料内部，形成有效灌注。如图2所示，支架接套可防止支架套管内部生物材料在灌注过程中由于流体的运动才产生移动，可最大限度地减少非灌注路径，提高灌注的效率。

恒温系统包括：可调节式恒温水浴以及在其中绕行的循环管道组成。恒温水浴适用电加热和制冷系统，水浴中水温的波动范围在37±0.1℃。培养液流经水浴中的循环管道时被加热或冷却，从而达到恒温的目的。

气体交换系统包括：气体过滤器、气体流量表、高压气瓶、减压阀以及连接管道组成。含5％CO₂的的压缩空气经减压阀减压、气体过滤器过滤后进入储液瓶中与培养液进行气体交换，交换后的气体经由另一气体过滤器过滤后排出。

在线监控系统包括：监控探头、监控终端、监控软件、数据转换芯片和传质调节器。通过监控探头可以实时监测系统内部的温度、培养液流动速率、液体压力、PH值以及溶解氧浓度。例如，利用LABVIEW平台可编写相应的监控与数据记录程序，经数据转换芯片处理针对相应情况，监控终端采取相应措施通过传质调节器控制蠕动泵、气体交换系统与恒温系统，确保整个反应器系统内环境的稳定。

细胞与生物材料接种培养的操作步骤为：

1、在超净工作台内连接好系统的各个部件，储液瓶30内注入培养液，启动蠕动泵20，抽取培养液充满整个反应器以排空管道内的气体，监测密闭性。

2、排空管道内的培养液，在培养舱60内放入所需的生物材料15，启动蠕动泵20，预湿材料30分钟后排空系统内培养液，关闭蠕动泵20。打开接种室65两端的三通管70、71，开放接种回路，使得接种室65与培养舱60形成串联结构。

3、启动蠕动泵20，以逆时针方向抽取少量培养液，注意观察培养液浸润了培养舱60，部分进入接种室65，暂停蠕动泵提起储液瓶内泵液的硅胶管，将种子细胞混悬液用注射器注入接种室。医用硅胶管90，接种室65内部淡色区域为培养液。(如图3A所示)

4、调节蠕动泵20，以顺时针方向运作，注意避免系统内的培养液流回储液瓶30。培养液流经培养舱60后，再次反转蠕动泵20运作方向。如此反复进行抽吸，保证每次培养液都经过培养舱60与接种室65，对培养舱内的生物材料15进行反复灌注15分钟。医用硅胶管90内深色区域为种子细胞的混悬液。(如图3B所示)

5、将管道内的种子细胞混悬液抽吸至培养舱60内，暂停蠕动泵20运作3-4小时，等待种子细胞贴壁。

6、调节接种室两端的三通管70和71，将接种室65切出反应器的灌注回路，注意管道进出液口与储液瓶内培养液液面的关系，以逆时针方向启动蠕动泵，调节灌流速率，开启监控系统50，进行灌注培养。

收获种子细胞/生物材料复合体的操作步骤为：

1、将反应器系统部件移入超净工作台。

2、关闭监控系统50。

3、排空反应器系统内的培养液，关闭蠕动泵20。

4、断开培养舱60与其他部件的连接。

5、打开培养舱顶盖9，取出装有生物材料15的支架套管5，将生物材料与支架套管进行分离，将生物材料移入无菌器皿内。

6、在超净工作台内拆卸系统各部件，进行清洗消毒，以备再次使用。

实施例二：培养舱的设计与装配

培养舱是本发明所述的灌注式生物反应器的关键装置，详述如下：

如图4所示，所述培养装置包括：底座2，向外装有进液管道接口1；顶盖9，向外装有出液管道接口12；前盖8，安置在所述顶盖9上；培养舱外壳4，设置在底座2与前盖8之间；支架套管5，设置在所述培养舱外壳4内，所述支架套管5的一端通过底座密封圈3连接底座2，另一端通过顶盖密封圈10连接顶盖9；所述支架套管5内设置有支架接套7和套管密封圈6，以致在所述支架套管5内限定容纳生物材料的空间15；以及固定杆13，两端分别连接底座2和前盖8以致将培养舱外壳4固定在底座2与前盖8之间。

作为一个特例，如图2所示，培养舱外壳4、支架套管5、支架接套7、顶盖9可以为圆柱形，底座密封圈3、顶盖密封圈10和套管密封圈6因而采用O形密封圈，即截面为圆形的橡胶密封圈。O形圈断面结构极其简单，且有自密封作用，密封性能可靠，安装、更换都非常容易，对于底座、顶盖和套管等部件起到良好的密封、减震作用。

如图5所示，底座2和前盖8均带有矩形框架，分别开设对应的孔，供固定杆13插入并紧固。

可选地，固定杆13的端部可以通过焊接固定到前盖8和/或底座2，也可以由锁定螺母14锁紧固定到前盖8和/或底座2。如图1所示的一个实施例中，固定杆13的一端通过焊接固定到前盖8，另一端由锁定螺母14锁紧固定到底座2。

如图5所示的一个实施例中，所述固定杆13为四根，分别固定在底座2和前盖8的矩形框架的四个角上。

如图4至图7所示，底座2与进液管道接口1的固定方式可以是螺纹固定；顶盖9与出液管道接口12的固定方式可以是螺纹固定；顶盖9与前盖8的固定方式也可以是螺纹固定。

如图4至图7所示，所述顶盖9还通过固定螺纹圈11紧固所述前盖8。

所述的密封圈可采用氯丁二烯橡胶等合适的材料制备，培养舱外壳4、支架套管5可采用硅酸盐玻璃等合适的材料制备，其余部件均采用医用级别的不锈钢等合适的材料制备。所有部件都可经受高温高压消毒。

根据图5至图7的教导，可以方便地将各部分组装成为完整的灌注式生物培养装置。

当把该生物培养装置放入灌注式生物反应器系统中运作时，整个培养装置以底座2在下，顶盖9在上的方式呈立位放置。培养液从进液管道接口1流入，受泵压作用从下往上垂直流经支架套管5内部的生物材料空间15，然后从顶盖9的出液管道接口12流出。

优选地，所述底座2与支架套管5相连接的截面大于顶盖9与支架套管5相连接的截面，使得在内部的生物材料的两侧产生一个压强差，提高灌注的效率。

实施例三：种子细胞(SD大鼠骨髓间充质干细胞)的分离、培养及鉴定。

断颈处死2周龄的SD大鼠，置75％酒精浸泡15min，在超净工作台中无菌取出大鼠股骨与胫骨，去除骨骼附着的软组织，采用无菌生理盐水冲洗髓腔1-2次，直接收集于离心管中。以1000r/min离心10min，弃上清，采用SD大鼠BMSCs标准培养液(赛业公司，美国)重悬计数，种植于25cm²培养瓶中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养。24小时后换液，以后每2-3天换液1次。达到80％-90％融合时(原代培养3-5天)，采用0.25％胰酶消化传代，分组培养。选取生长良好的第3代细胞采用流式细胞仪及倒置相差显微镜进行形态学观察进行鉴定。

如图8所示：在倒置相差显微镜下观察可见第3代SD大鼠BMSCs呈长梭形，轮廓清晰。

取1×10⁶/ml浓度第3代SD大鼠BMSCs1ml进行流式细胞仪细胞表面鉴定，结果如图9所示：CD34、CD45反应阴性，CD29、CD44反应阳性。可证实此细胞为SD大鼠BMSCs。

实施例四：种子细胞的接种与共培养。

取生长良好的第3-5代大鼠BMSCs细胞，将种子细胞用0.25％胰蛋白酶消化后计数，制成2×10⁷/ml的单细胞悬液约50ml。

采用的生物材料为直径10mm高10mm大小的胶原-生物活性玻璃复合体。

按细胞接种的方法不同，培养的方法不同分为2组。

(1)反应器培养组(n＝6)：采用灌注式生物反应器进行接种，接种完毕后，启动蠕动泵，3ml/min流量，培养16小时、3天、7天、14天。

(2)传统方法培养组(n＝6)：将生物支架材料浸入含单细胞悬液的注射器内，抽真空后维持1min，使细胞进入载体内部。将生物支架材料放入T25培养瓶，浸没于100ml含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、α-MEM培养液，置于培养箱内培养16小时、3天、7天、14天。

培养期间，观察培养基颜色变化，当颜色变橘黄色时完全更换培养液。

实施例五：生物支架材料的扫描电镜(SEM)观察。

在各时间点培养终止后，收集生物支架材料，用PBS冲洗3遍，放入2.5％戊二醛溶液固定2小时。待自然干燥后，喷金，采用SEM观察。

如图10所示，采用灌注式生物反应器进行细胞接种的培养组与传统方法培养组，接种细胞16小时后，在材料上均有细胞贴附。但是相较于传统方法培养组，反应器组中在支架材料内部可贴附更多的种子细胞，且分布更为均匀。而传统方法培养组，种子细胞大多聚集在材料的表面和浅层，而在材料内部，仅有少量的种子细胞。培养3天后，两组支架材料中的种子细胞均进行了大量增殖，但反应器组的细胞分布、密度优于传统方法培养组。7天与14天后，反应器组支架材料的内部贴附细胞密度较3天时增大，而传统方法培养组的材料内部细胞增殖不明显。

实施例六：阿尔玛蓝细胞增殖实验(AlamarBlue KIT)

细胞经生物反应器复合于支架材料，取材料正中2mm厚的薄片，转移至48孔板中，以300μl培养液置于培养箱中培养，达各时间点后加入30μlAlamarBlue母液，继续置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中3小时，吸取上清液100μl于96孔板中，作为实验组(生物反应器复合法)4例，对照组(常规复合方法)4例，同时设立空白对照(无细胞复合的材料)4例和调零组样本(无细胞无支架材料)4例，共同于530nm-600nm下测荧光值。除第一次外，每次吸取上清液后均以PBS漂洗材料，再加入新鲜培养液培养。

如图11所示，各时间点反应器培养组细胞的数量均高于传统培养组，两组在10天后，细胞数量进入了平台期，但反应器培养组的水平远高于传统培养组。

Claims (10)

1.一种灌注式生物反应器系统，其特征在于，包括：循环灌注系统、恒温系统、气体交换系统和在线监控系统；

所述的循环灌注系统包括：通过管道依次连接培养舱(60)、储液瓶(30)、蠕动泵(20)，形成一个灌注培养回路；接种室(65)通过两端的三通管(70、71)连接到所述的灌注培养回路，通过调节这些三通管(70、71)和蠕动泵(20)来切换接种模式和灌注培养模式；在接种模式下，接种室(65)的两端分别与培养舱(60)、蠕动泵(20)连通，以致培养液流经培养舱(60)后通过三通管(71)进入接种室(65)，然后通过三通管(70)返回储液瓶(30)；在灌注培养模式下，蠕动泵(20)直接连通培养舱(60)，将来自储液瓶(30)的培养液送入培养舱(60)，从培养舱(60)流出的培养液返回储液瓶(30)；

所述的恒温系统包括：内部具有绕行的循环管道的恒温水浴装置(40)，以及适用于电加热和制冷的控制部分，使得培养液流经水浴中的循环管道时被加热或冷却；所述恒温水浴装置(40)设置在培养舱(60)与储液瓶(30)之间的回路上；

所述的气体交换系统由气体过滤器、气体流量表、高压气瓶(35)、减压阀以及连接管道组成，以致高压气瓶内的含5％CO₂的压缩空气经减压阀减压后，经气体过滤器过滤后进入储液瓶(30)中与培养液进行气体交换，交换后的气体经由另一气体过滤器过滤后排出；

所述在线监控系统由监控探头、监控终端、监控软件、数据转换芯片和传质调节器组成；实时监控培养液的pH值、温度、溶解氧以及流速的监控探头(55)设置在培养舱(60)与恒温水浴装置(40)之间的导管上，通过在线监控系统(50)反应器内；在蠕动泵(20)、恒温水浴装置(40)，以及高压气瓶(35)与储液瓶(30)之间的气管上均设有监控探头；这些监控探头与监控终端通信连接，再通过监控软件、数据转换芯片和传质调节器对数据进行处理。

2.根据权利要求1所述的灌注式生物反应器系统，其特征在于：在蠕动泵最大功率支持的前提下，多个培养舱(60)通过并联的方式接入所述的循环灌注系统。

3.根据权利要求1所述的灌注式生物反应器系统，其特征在于：所述的培养舱(60)包括：

底座(2)，向外装有进液管道接口(1)；

顶盖(9)，向外装有出液管道接口(12)；

前盖(8)，安置在所述顶盖(9)上；

培养舱外壳(4)，设置在底座(2)与前盖(8)之间；

支架套管(5)，设置在所述培养舱外壳(4)内，所述支架套管(5)的一端通过底座密封圈(3)连接底座(2)，另一端通过顶盖密封圈(10)连接顶盖(9)；所述支架套管(5)内设置有支架接套(7)和套管密封圈(6)，以致在所述支架套管(5)内限定容纳生物材料的空间(15)；以及

固定杆(13)，两端分别连接底座(2)和前盖(8)以致将培养舱外壳(4)固定在底座(2)与前盖(8)之间。

4.根据权利要求3所述的灌注式生物反应器系统，其特征在于：所述培养舱外壳(4)、支架套管(5)、支架接套(7)、顶盖(9)均为圆柱形，而所述底座密封圈(3)、顶盖密封圈(10)和套管密封圈(6)均为O形密封圈。

5.根据权利要求3所述的灌注式生物反应器系统，其特征在于：所述底座(2)和前盖(8)均带有矩形框架，分别开设有对应的孔，供固定杆(13)插入并紧固，优选地，所述固定杆(13)为四根，分别固定在底座(2)和前盖(8)的矩形框架的四个角上。

6.根据权利要求5所述的灌注式生物反应器系统，其特征在于：所述固定杆(13)的端部通过焊接固定到前盖(8)和/或底座(2)，或者由锁定螺母(14)锁紧固定到前盖(8)和/或底座(2)。

7.根据权利要求3所述的灌注式生物反应器系统，其特征在于：所述底座(2)与进液管道接口(1)的固定方式是螺纹固定。

8.根据权利要求3所述的灌注式生物反应器系统，其特征在于：所述顶盖(9)与出液管道接口(12)的固定方式是螺纹固定。

9.根据权利要求3所述的灌注式生物反应器系统，其特征在于：所述顶盖(9)与前盖(8)的固定方式是螺纹固定；优选地，所述顶盖(9)还通过固定螺纹圈(11)紧固所述前盖(8)。

10.根据权利要求3所述的灌注式生物反应器系统，其特征在于：所述底座(2)与支架套管(5)相连接的截面大于顶盖(9)与支架套管(5)相连接的截面。

Images