CN111132595A - 大型生物反应器 - Google Patents

Abstract

在本发明的一个实施例中，可以提供一种生物反应器，其具有组织支架并且具有从中灌注的培养基。可以有多个独立的培养室和容器或子容器。传感器可以单独控制各个培养室中的条件，并且各个培养室可以不同地运行或持续不同的持续时间。基于流量和压降，可以从支架的流体阻力推断出细胞数量或接近融合的进度。收获可包括以下任何组合或顺序：暴露于收获剂；振动；稳定、脉动或振荡的液体流动；气液界面通过支架。可以施加振动和流动，以相互增强。

Description

大型生物反应器

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2017年9月11日提交的第62/556,646号美国临时专利申请序列和于2018年2月27日提交的第62/636,039号临时美国专利申请序列的权益，这两项申请均通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明的实施例涉及生物反应器。

背景技术

生物反应器用于膨胀细胞群，例如干细胞或其他锚定依赖性细胞。但是，仍然需要改进，例如在易用性、自动化、程序的可再现性以及可生产的细胞数量方面。期望培养细胞以便使用给定的设备从给定的培养过程中产生多达数十亿个细胞或什至超过一百亿个细胞。而且，与这样的过程有关，期望提供一种系统，使得如果污染将在系统中的某处发生，则不一定导致整个批次的损失。

发明内容

在本发明的一个实施例中，可以提供用于培养细胞的生物反应器系统，该生物反应器系统包括细胞可以在其上生长的空间固定支架，该生物反应器系统具有用于通过该支架灌注液体的液体供应系统，其中该生物反应器系统包括多个培养室，每个培养室包含一些支架，该多个培养室具有流动路径使得液体经由其流动，其中该生物反应器系统包括多个容器或多个子容器，其中该生物反应器系统具有控制装置，该控制装置在给定时间向该多个培养室中的各个培养室引导液体流，就液体的流量或液体的流向或液体的流动持续时间而言，该液体流不同于向其他培养室引导的液体流。

本发明的一个实施例包括一种用于从生物反应器系统中回收细胞的方法，该方法包括：提供生物反应器系统，该生物反应器系统包括可供细胞生长的空间固定支架，该生物反应器系统具有用于通过支架灌注液体的液体供应系统，其中该生物反应器系统包括含有一些支架的培养室，该培养室具有流动路径使得所述液体经由其流动；在支架上在生物反应器中培养细胞；以及以任何组合和顺序执行以下任何一项或多项：(a)将所述细胞暴露于收获剂；(b)对所述生物反应器系统施加振动；(c)通过所述支架施加液体的振荡流动；(d)通过所述支架施加脉动的液体流；(e)使液-气界面通过所述支架。

本发明的一个实施例包括一种培养细胞的方法，该方法包括：提供生物反应器系统，该生物反应器系统包括可供细胞生长的空间固定支架，该生物反应器系统具有用于通过该支架灌注液体的液体供应系统，该液体供应系统包括泵，其中，该液体供应系统包括用于测量由泵产生的压力的压力测量装置或用于测量在运行泵时消耗的电力的装置；在支架上培养细胞；可选地收获培养后的细胞；在培养或收获或两者期间，使用液体流量的信息结合压力测量装置测量的压力的信息或所述泵的电力消耗的信息来确定支架的流动阻力。

附图说明

将进一步描述本发明的实施例，但是本发明的实施例决不受以下说明的限制。

图1A是安装在容器上方的培养室的三维立体图。

图1B是图1A的剖视图。

图2A是具有六个子容器的容器组成件的三维立体图，其中培养室安装在每个子容器的上方，所有的容器都被培养箱封闭。

图2B与图2A相似，除了为清楚起见省略了培养室，并且进一步示出了安装在分隔相邻子容器的壁中的侧流过滤器。

图3A是示出三个子容器的侧视图，其中每个子容器中均具有培养室，并且还示出了液体和气体的流动路径。每个子容器都有自己的液体泵。

图3B与图3A相似，但是另外示出了控制系统，该控制系统根据浸入式传感器感测到的参数来控制每个子容器的泵的运行。

图3C与图3B相似，不同之处在于传感器与子容器外部的管道中的流体接触。

图3D与图3C相似，除了传感器是压力传感器之外。

图3E是剖视图，示出了培养箱内部的两个完全独立的容器，其中每个子容器中均具有培养室，并且还示出了液体和气体的流动路径。

图4A是系统的示意性侧视图，示出了三个共享公共液体泵送系统的培养室(可见)。

图4B是类似于图4A的系统的另一侧视图，示意性地示出了生物反应器系统的中央部分上方和下方的液体储存容器。

图4C是具有六个培养室的系统的示意性俯视图，其中三个培养室共享一个公共液体系统，另外三个培养室共享另一个公共液体系统，并且所有培养室共享一个公共容器。

图4D是该系统的俯视图，该系统具有六个培养室，每个培养室位于其自己的子容器中，其中三个培养室共享一个公共液体系统，另外三个培养室共享另一个公共液体系统，并且所有培养室共享一个公共容器。

图4E是具有六个分离的液体泵但共享一个公共容器的系统的三维视图。

图5示出了用于培养和收获细胞的步骤的可能顺序的流程图。

图6示出了在使用流动阻力指示支架中存在的细胞数目时可以遇到的流动阻力的规模。

图7示出了系统的各个组件的可能的物理布置。

图8显示了用于各种可以运行的气-液界面的位置和变化。

具体实施方式

现在参考图1A和1B，可以提供一种生物反应器10，其包含细胞培养室100和支架110的组成件。这种组成件在于2017年8月25日提交的并且公开号为US20180057784的第15/686,211号美国非临时专利申请中进行了描述。在这样的生物反应器中，可以在支架上培养细胞，支架是形成单个多孔筛网的聚合物细丝的交叉矩阵。筛网可以被支撑在保持器120中，该保持器120可以在水平方向上保持多个(例如12至15个)这种筛网，并且筛网竖直地堆叠在另一个之上。保持器120可以容纳在培养室100内。培养室可以与容器190连通。在筛网叠层上方，培养室100可以包括由堰壁140围绕的开放区域，该堰壁140在上方具有一些开放空间。在壁的外部，可存在围绕壁的凹陷区域，该凹陷区域被称为沟槽160。沟槽160可以具有集水槽并且可以具有从集水槽中离开的出口连接170，集水槽的高度比沟槽160本身的垂直高度低。在培养过程中，液体培养基可以通过筛网叠层进行灌注，例如沿垂直向上的方向流动。在培养期间，当液体培养基流动时，通常在堰壁140的顶部与培养室的最上层盖之间可以存在捕获的气袋，并且该气袋也可以在沟槽160内包括一些空间。根据具体尺寸以及其他设计和运行参数，如果筛网包含四层细丝，则此处所述的具有典型实际尺寸的培养室可培养约2.5亿个细胞，并且相应地，用于更大数量的细丝层可培养更多的细胞。

现在参考图2A至8，本发明的实施例包括大规模生物反应器系统，该系统适合于生长比仅使用上述培养室之一可以生长的更多的锚固依赖性细胞。这样的生物反应器系统可以包括多个刚刚描述的培养室100。在本发明的实施例中，如图2A-2B所示，生物反应器系统可以包括具有六个子容器200的容器组成件，每个子容器200具有一个与之流体连通的培养室100。其他数量的子容器200和培养室100也是可能的。子容器200可共同形成容器组成件。这样的子容器200和培养室100可以设置在公共培养箱300内。另外，在这样的系统中，各种培养室100和子容器200可以共享某些公共设施的使用，例如控件和物理结构。

在培养箱300内具有一个以上的子容器200使得对于整个系统的某些部分(例如物理结构以及控制各种动作的控制设备和计算机)而言，仅需要在系统中提供一个这样的组成件，这在经济性和简单性方面都有好处。同时，这样的布置使得在这样的系统内可以存在至少在某种程度上彼此隔离的多个液体环境。通过这种布置，如果在容器或子容器之一及其与该容器流体连通的相关组件中意外地发生污染，则其他容器或子容器以及与那些容器流体连通的相关组件仍然可以保持不受污染。因此，单次污染事件不会导致整个系统的全部内容无法使用。

继续参考图1A-2B，示出了容器组成件，该容器组成件是六个子容器200的阵列，每个子容器在其中具有培养室100。使用六个子容器200来简化图示，当然，其他数量的子容器200也是可能的。子容器200可以彼此物理连接并且可以共享分隔相邻子容器200的公共壁。子容器的组成件可以由盖360覆盖。盖360可以包含穿过其中的开口，从而培养室100可以被放置在适当的位置，其中培养室100的下端向下延伸到相应的子容器200中。

子容器200可以彼此相关联，使得在较低的高度处，每个子容器200可以与所有其他子容器200物理地和流体地机械隔离，但是在较高的高度处，各个子容器200可以与一些其他子容器200流体连通。在本发明的实施例中，可以描述在使用期间，当子容器200中存在一定水平的液体时，液体区域彼此隔离，但子容器200内处于液体区域上方的气体区域或顶部空间可以与某些其他子容器200的顶部空间流体连通。

子容器200的组成件可以包含在培养箱300内。培养箱300可以适合于在其中保持受控的温度，也可以保持其中所含气体的所需成分。类似于图2A，图2B示出了在培养箱300内部的子容器200的阵列。在图2B中，为了图示清楚，省略了培养室。另外在图2B中示出了可以安装在将相邻的子容器200分开的壁384中的侧流过滤器380。将相邻的子容器200与其他子容器200分开的壁384可以在其中具有侧流过滤器380，侧流过滤器380允许气体从一个子容器顶部空间流向相邻的子容器顶部空间。侧流过滤器380可具有足够小的孔径，例如0.2微米，从而其可防止微生物通过。

可以在一些壁384中而不是在每个壁中都设置有侧流过滤器380。例如，如图所示，在一个方向(在一行中有三个子容器的方向)上彼此成一直线而在另一不同的方向(在一行中有两个子容器的方向)上不成一直线的子容器200之间的壁384中设置有侧流过滤器380。

现在参考图3A-3E，至少一些子容器200可以具有进气过滤器390。如图所示，所有容器都具有进气过滤器390。来自培养箱300的内部空间的气体可以通过进气过滤器390进入子容器200的顶部空间。进气过滤器390可以具有足够小的孔径，例如0.2微米，从而可以防止微生物通过。例如，通过进气过滤器390的气体可以代替子容器200的顶部空间内的气体，该气体可以由于液体穿过喷头410并向下滴回到子容器200的液体区域而溶解在液体中。

图3A-3E更详细地示出了在培养箱300内涉及三个子容器的液体和气体的可能流动路径。在图3A-3D中，为了便于说明，子容器200的数量简单地被图示为三个子容器200，并且可以理解，可以类似地使用其他数量的子容器200。所有子容器200都由盖360覆盖，盖360在所示的取向上可以是大体上平坦和水平的。培养室100通过盖360进入每个子容器200，使得培养室100的下端向下延伸至子容器200的内部底部附近。培养室100的边缘可以搁在盖360上并可相对于盖360形成密封。培养室100的上端在盖360上方延伸。在运行期间，培养室100的下端可浸入子容器200中包含的液体中。尽管未示出，但是可以向子容器200提供阀或填充/排出系统，该阀或填充/排出系统适合于将子容器200排出或填充适当的液体至子容器200内的期望水平并如果需要的话允许这种液体被不同的液体代替。

关于在运行期间液体的流动模式，如已经说明的，在培养室100中的细胞培养期间，液体培养基可以向上流动通过支架区域并使堰壁140溢流到沟槽160中。沟槽160可具有集水槽，来自沟槽160的液体可进一步流入该集水槽，并且从每个培养室100的集水槽中可存在通向液体泵450的管道和流体流动路径。液体泵450可为蠕动泵或其他合适的泵。液体泵450的流出物可以返回到与同一培养室100流体连通的容器或子容器200。来自液体泵450的返回流动可以通过盖360中的喷头410重新进入容器或子容器200。

示出了从子容器200之一出来的气体，该气体前进到气泵480。气泵480可以是蠕动泵。蠕动泵非常适合泵送液体或气体。由于侧流过滤器380的存在，可以仅从子容器顶部空间之一去除气体，或者从少于全部子容器顶部空间去除气体，已知气体可以通过侧流过滤器380在子容器顶部空间之间流动。

在各个培养室和子容器中，各个子容器中的液位可以独立选择并且可以不同。诸如液体培养基之类的液体既可以手动填充，也可以通过可以由自动化系统控制的填充/排出泵填充。如果需要，液体或其组成可以在各个子容器200之间变化。诸如填充和排出之类的运行时间可以从一个子容器200或培养室100到另一子容器200或培养室100有所不同。

现在参考图4A-4E，在本发明的一个实施例中，培养室100可以与公共液体容器流体连通或与子容器200流体连通。系统可以包括任何所需数量的液体循环泵450。可以存在专门为每个培养室专用的液体循环泵450，使得液体泵450的数量等于培养室100的数量，或者系统可以包括专门用于该多个培养室的子集的液体泵450。液体泵450可以双向运行并且可以由自动控制系统控制。如果有一个以上的培养室100与特定的容器或子容器200相关联以将液体返回到该容器或子容器200，则可以有公共喷头410，所有培养室或该多个培养室的子集的流动路径都通过该喷头410汇聚在一起并通过以小滴的形式散布在容器的液体区域上方而重新进入容器。当这些液滴从喷头410落到容器的液体区域时，它们可以与容器区域的上部空间(顶部空间)中的气体交换氧气和/或二氧化碳。可替代地，可以提供单独的流动路径和喷头410。

图4A示出了系统，该系统示出了共享公共液体泵送系统的三个培养室(可见)。气体泵送系统显示为由与液体泵送系统相同的电机轴驱动。图4B是示意性地类似于图4A的系统的另一侧视图，并且另外示出了在生物反应器系统的中央部分上方和下方用于新鲜液体和用过的液体的液体储存容器。图4C示意性地示出了具有六个培养室的系统的俯视图，其中三个培养室共享一个公共液体泵送系统，另外三个培养室共享另一个公共液体泵送系统，并且所有培养室都共享一个公共容器。示出了两个液体泵送系统和气体泵送系统全部由单个电机轴驱动，尽管当然也可以设置单个电机。图4D示意性地是系统的俯视图，该系统具有六个培养室，每个培养室位于其自己的子容器中，其中三个培养室共享一个公共液体系统，另外三个培养室共享另一个公共液体系统，所有它们共享一个公共容器。图4E是具有六个分开的液体泵但共享一个公共容器的系统的三维视图。就容器、子容器、液体泵送回路和液体泵的数量而言，进一步的变化和组合是可能的。

在系统的某一部分中，培养箱300可以提供具有受控温度并且还具有相对于诸如湿度和CO2浓度的某些组成变量而言受控的气氛的区域。培养箱300的内部可以是干净的或无菌的。在培养箱300内可以是一个或多个容纳液体的容器或者一个或多个子容器200的组成件。此外，可以存在一个或多个与特定容器或子容器流体连通的培养室。每个容器或子容器可根据需要与一个培养室或一个以上培养室流体连通。培养箱300内部的气氛可以与容器或子容器内部的气氛流体连通，如本文其他地方所讨论的。可以设置进气过滤器390，从而使培养箱内的气体可以通过进气过滤器390进入液体容器190或子容器200的顶部空间。

在系统的某一部分中(如图4B所示)，可以提供区域，该区域是温度受控的，但对于任何成分变量，其气氛均不受控制。例如，温度控制区域602、604可用于储存需要特定温度的液体容纳容器或袋子。

传感器、控件和软件

为了监测相关的工艺参数，生物反应器系统可以包括用于相关参数的传感器。这样的参数可以是pH值、溶解氧和培养液的其他参数(可以根据需要)。可以使用的另一种类型的传感器是用于测量液体中的葡萄糖浓度或乳酸浓度的传感器。还可以测量培养箱300中或容器或子容器的顶部空间或培养室的顶部空间中的气体中的二氧化碳浓度。这样的传感器可以在过程中提供实时数据，并且可以用于调整过程变量，例如组成、液体或气体的泵送速度等。液体培养基中溶解氧的浓度可以用作控制系统的输入，以响应于测量，通过改变培养箱300内部的气体浓度，例如通过升高或降低该气体中的氧气或氮气的浓度，来保持控制系统的浓度。类似地，其他测量参数可用于控制过程变量。

另外，为了提供细胞生长的实时可视化，可以在培养室的顶部安装微型照相机/视频设备，以便在适当的时间捕获支架上细胞的快照。也可以使用的另一种类型的传感器是可以测量或估计细胞数量的电容性传感器。可以在从一个培养室到所有培养室的任何数量的培养室中提供任何这样的传感器。任何此类传感器均可用于控制过程步骤的持续时间。

参照图3A，示出了具有若干培养室、子容器和液体泵的基本系统。如图3B所示，传感器700可以直接与子容器中的液体接触。替代地，如图3C所示，传感器700可以连接到子容器外部的流体流动回路中的某处，并且可以在子容器外部的某处执行其感测功能。

传感器700可以测量溶解氧和pH值。这样的传感器可以穿透培养室的顶部进入特定的子容器中。这样的传感器可以包括非无菌多次使用部分和无菌一次性使用部分。无菌一次性使用部分可以基本上覆盖非无菌部分，并且可以防止子容器200中的液体接触非无菌部分。可以使用基于测量子容器中液体的电容的传感器来表征子容器200中的细胞含量，进而可以用来估计培养物的融合程度正在进行中。

本文中其他地方描述了基于支架的流动阻力来估计支架内的细胞数量的另一种技术。

在本发明的一个实施例中，可以将成像系统安装在一个或多个培养室的顶部上，以在膨胀过程中实时观察细胞生长。通常，照相机/视频设备可以帮助确定整个培养室或专门针对一个特定培养室的膨胀过程的持续时间，因为来自不同患者的干细胞群体可以以不同的速率生长，并且不同培养室中的细胞可以以不同的速率生长。可能期望的是在支架中的细胞达到融合状态之前停止膨胀过程。传感器设备可以通过各种通信协议(包括蓝牙)中的任何一种与控制软件进行无线通信。实时图像或视频可以显示在计算机屏幕上。

这些各种传感器可以连接到控制系统，该控制系统又可以连接到计算机中安装的软件并与其通信。来自那些源的信息可用于控制或调整整个培养箱阵列的培养条件。在另一种运行方式中，来自那些源的信息可用于独立于系统中其他培养室的运行来控制或调整单个培养室的培养条件。培养条件的控制或调整可包括以下任一项：调整液体培养基通过支架的流量；调整液体培养基的组成；并选择结束细胞培养并开始收获的时间。取决于液体泵450的数量和管道的配置，可以针对单个培养室或整个培养室组的子集或所有培养室100做出响应于感测到的信息的调整。结果，本发明的实施例可以具有优于目前可用于再生医学中细胞产物膨胀的生物反应器的优点。

关于流体流动布置，如所讨论的，该系统可以包括专门用于每个培养室的液体循环泵450，使得液体泵450的数量等于培养室100的数量，或者该系统可以包括专用于该多个培养室100的子集的液体泵450。另一种可能性是，可以存在诸如蠕动泵之类的液体泵450，其包含单个电机但泵送多于一个流体通道。可替代地，代替具有专用于单个培养室的单个液体泵450，可以调整通过诸如比例阀等阀实现的培养室100之间的流动比例。如果需要的话，这样的阀可以使液体培养基的流动转向或离开特定的培养室。可以响应于由本文描述的任何传感器测量的条件来进行这种调整。可以使用这种装置或技术的任何组合。

为了提供数据跟踪和获取，可以将软件程序用于过程控制和数据获取。所有过程参数都可以定期获取，并储存在数据库中，以备将来参考和分析。另外，该软件还可以控制成像功能和用于收获细胞的自动化步骤。

为了提供警报机制，可以以某种方式对软件进行编程，使得当某个关键参数超出范围时可以适当地发送警报消息。例如，可以将此类警报发送到操作员的蜂窝电话，例如通过使用现场Wi-Fi。这可以使得能够针对异常运行状况及时地采取纠正措施。

为了提供自动的细胞收获，可以提供一种机制，该机制提供用生理盐水例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)轻轻洗涤，然后用收获试剂洗涤并且任选地同时施加摇动。在这种自动机构中，可以通过控制软件由液体泵450控制用于冲洗支架的盐水或收获剂的流动。可以将振动机构(例如电机)安装成与生物反应器系统的某个部分机械接触，以帮助将细胞与支架分离。完整的洗涤、拆卸、振动和收集周期可以由控制软件控制。

通过泵送特征确定细胞占据的程度

液体流动回路的整体流动特性可以用于确定与支架中细胞的存在程度有关的信息。随着细胞生长的进行，支架中或支架上的细胞数量增加，并且细胞外基质(ECM)的数量也会增加，ECM是细胞分泌的物质，存在于细胞之间。细胞和ECM都占用支架内的空间。这减少了可用于流动的空间并增加了支架的流动阻力。流动阻力描述了实现通过支架的给定量的流体流量需要多少压降。因此，流动阻力可以指示培养过程进行的广泛程度以及培养物融合的距离。可以通过对与流动相关的压力或压降的知识以及对流体流量的知识来表征流体阻力。

通常，对于这种表征，如果流动回路包含用于测量流经培养细胞的筛网叠层的液体流动的压降的装置，或者更一般而言，测量流动回路中某处的压力的装置是有帮助的。这样的压力测量装置可以是压力传感器800。图3D示出了压力传感器800，该压力传感器800连接到从培养室通向液体泵450的流体流动路径，在这种情况下，压力传感器800将与被泵送液体连通。这种压力传感器800可以测量其连接到液体流动路径的点处的压力，当与环境压力相比时，可以提供合适的压力测量。也可以(仅在图3D中的一个位置示出)将压力传感器800安装在培养室100顶部的盖520中，在这种情况下，压力传感器800将在堰壁140的顶部边缘上方与顶部空间(气袋)连通。如果压力传感器的第二侧连接到流动路径中的适当位置，则可以使用压差传感器。除压力传感器外，还可以使用压力测量装置(例如压力变送器或其他设备)。

如本文所讨论的，液体灌注穿过支架的流动路径可以由液体泵450驱动，该液体泵可以是蠕动泵。蠕动泵既适合于泵送流体，又可以指示流体的体积流量。蠕动泵实质上是正排量泵，这意味着累计流量直接与泵电机的累计转速有关，而流量直接与泵电机的转速有关。这些流量参数也与蠕动泵的泵管的尺寸有关，该尺寸是恒定的，并且对于任何给定的设备都是已知的。如果驱动这种泵的电机是步进电机，则可以从操作步进电机的控制系统中轻松获得有关电机运动的详细信息。还有另一可能性是，即使不设置压力测量装置，也可以从电机的电力消耗中推断出压力。随着流动回路中压降的增加，可以预期这种泵的电能消耗也会类似地增加。据认为，压力传感器可以提供比泵电机的电能消耗更准确的指示，但是这将取决于具体情况。

使用流动阻力来推断融合的程度的技术可用于表征细胞培养期间细胞生长的程度。它也可以在收获细胞的过程中使用，以表征已经收获了多少个细胞以及待收获的支架中还有多少个细胞。图6概念性地示出了在本文所述的过程中可以进行的各种流动阻力测量值之间的关系。

与本文所述的其他反馈技术类似，使用流动阻力作为支架中存在的细胞程度的指标可以用作控制或影响细胞培养或细胞收获过程的参数。在细胞培养期间，流动阻力的测量可用于调整液体培养基的参数，例如其化学性质或培养基的流动持续时间。在细胞收获期间，可以使用流动阻力的测量来影响执行收获过程的时间或强度或步骤的组合。为了使由收获过程的各个可能的步骤或方面引起的对细胞的可能的损害最小化，这可以是有利的。这样的控制可以针对特定的子容器200或培养室100单独进行，而与针对其他子容器200或培养室100所做的无关。这使得过程参数独特地适合于特定的子容器200或培养室100。

生物反应器系统的其他部件和物理布置

辅助管

可以提供辅助管和泵(未示出)以将液体填充到单个子容器200中或从单个子容器200中排出液体。液体可以是液体培养基、分离试剂或冲洗试剂，例如磷酸盐缓冲盐水。可以以这样的方式处理这样的液体：除了可以在废物储存容器中之外，防止来自一个子容器的液体与来自另一个子容器200的液体接触。可以有独立的泵，也可以提供适当的阀门。这样的实践可以减少可能的污染物从一个子容器200扩散到另一子容器200的机会。来自容器190或子容器200的液体的填充、排出和替换可以在控制器的控制下进行。这样的运行的时序可以从一个子容器200到另一子容器200变化，这可以受到如本文其他地方所述的传感器700的影响。

摇动器

如图4A-4B所示，可以提供用于在膨胀后收获细胞的摇动器或振动源。摇动器或振动源900可以与一个或多个容器或子容器200的组成件机械接触，并且可以将振动传递到一个或多个容器或子容器200的组成件。该设备的一部分可以可安装在弹簧或垫子上，以帮助管理振动。振动的方向可以是水平的或垂直的，或其他方向或所需方向的组合。摇动器或振动源的运行可以由控制该系统的其他功能的相同控制器或软件控制。在收获操作的某些步骤期间或之前，会发生摇动或振动。

系统的物理布置

现在参考图7，在本发明的实施例中，可以如图所示组装系统的各个组件。

该系统可以包括已经描述的培养箱300，培养箱300可以控制培养室100和容器或子容器200的组成件的温度，并且还可以控制其中的气氛的组成。围绕培养室100和容器或子容器200的培养箱300可以在其中具有气氛，可以针对以下任意一种或多种对气氛进行控制：氧气的浓度、二氧化碳的浓度和湿度。

该系统还可以包括第一温度控制区域602，以控制等待使用的新鲜液体的温度。该系统还可以包括第二温度控制区域604，以控制可以包含诸如用过的介质、用过的盐溶液等物质的容器的温度以及容纳回收细胞的容器。

如图所示，第一温度控制区域602可以位于培养箱300和培养室100以及容器和子容器的组成件的高度之上的高度，以便重力可以驱动液体从储存容器中流入容器190或子容器200。第二温度控制区域604可以位于低于培养箱300和培养室及容器高度的高度，以便重力可以驱动液体从容器中流出到在第二温度控制区域中容纳用过的液体的容器。替代地，例如，出于整体设备中重量分布和稳定性的原因，也如图所示，可以将所有的储存容器(新鲜的和用过的)都放置在较低的高度。

在所示的设备中，流体可以储存在刚性容器中或袋中。柔性袋的使用可以更有效地利用温度控制区域602、604内的空间，并且柔性袋在医疗应用中被广泛使用并且便宜。

该系统还可以包含计算机或其他控制系统，以及根据需要包含泵。该系统可以组装在一个整体的机柜中，也可以安装在轮子上。蠕动泵的电机(例如液体泵450或气泵480)可以安装在培养箱300的壁厚之内。泵头本身可以在培养箱300的内部延伸。这样的布置可以减少管道的长度或复杂性。

该系统还可包含将培养的细胞与液体分离的分离器设备。这种分离器可以是离心的，或者可以是过滤器，或者可以是其他种类。这种分离器可以与本文所述的其他组成件安装在同一设备内，或者可以是单独的设备。

与细胞分离和收获有关的与流动相关的技术

本发明的实施例包括用于从生物反应器收获细胞的设备和技术。收获可以涉及多种技术中的任何一种，包括：

暴露于分离试剂；

从培养基或分离试剂中冲洗掉；

沿任何所需方向的振动或摇动；

液体以稳定、间歇或脉动或液体流动方向或振荡方向颠倒的方式流过支架；

液-气界面经过或通过支架。

液-气界面通过支架可用于从支架上移出或分离细胞。在本发明的实施例中，培养室包括顶部空间，该顶部空间通常在运行期间是气袋。图8示出了流体运动和气-液界面的位置的各种可能性的细节。

在如图3A-4E所示的用于液体流动的流体流动装置中，液体可以是培养基、或分离试剂、或磷酸盐缓冲盐水、或可以根据需要是任何其他液体。这些流程图表明，利用容器子容器和多个液体泵的各种组合，可以彼此独立地运行多个培养室。在一些图示中，多个培养室(如图所示，其中三个)共享一个公共容器。喷头410可与循环培养基一起使用，目的是使液体培养基暴露于容器或子容器的气体区域(顶部空间)内的富含CO2的气体中，从而使培养基液滴可以从该气体中吸收二氧化碳。如果培养装置位于培养箱300内，则培养箱300的内部也可以具有相同的富含CO2的气氛。

在本发明的实施例中，液体泵450用于出于各种目的将液体泵送通过液体流动路径。用于此目的的液体泵450可以是蠕动泵。对于诸如本申请的应用，蠕动泵是正排量的，能够泵送液体或气体，完全隔离所泵送的流体，并且具有丰富的经验基础。它们还能够根据泵转子的旋转方向沿任一方向移动流体。如果液体泵450在正常方向上运行，则液体从沟槽160中抽出并被输送到喷头410。如果蠕动泵在相反方向上运行，则气体可以通过喷头410被吸入并被泵送。具体地说，气体可以流入沟槽160的集水槽，然后继续进入沟槽160。如果集水槽或沟槽160中存在任何液体，则气体可以通过任何可能的液体向上冒泡。然后，气体可以进入培养室100的上部区域(顶部空间)，该上部区域可以是气袋，并且这可以使培养室100中的液位下降。作为替代，通过在连接到沟槽160的管子的T形管的分支中打开适当的阀(未示出)，并允许随着气体进入管道，培养室100中的液位下降，可以获得相同的效果。可以重复和交替该过程，使得液-气界面以期望的速度重复地上下穿过培养室100和支架110。

可能的是，当培养室100容纳液体并且支架110仍然浸没在液体中时，通过支架和培养室的液体流动方向可以颠倒和交替。这将产生在垂直方向上流过支架110的液体速度，其交替改变其方向。如果期望在所有支架都浸没的同时发生这种逆流，则可以在培养室内提供在垂直方向上位于最上部支架110的最上表面和堰壁140的顶部之间的足够空间。在该空间内，液位可根据需要升高和降低，以实现两个相反的流动方向，以使液体在垂直方向上流动通过支架110。

如果存在多个培养室100，则可以在任何时间段内同时有适当的液体(培养基、收获试剂、冲洗液)垂直向上流经所有培养室。这将涉及液体占据每个培养室100中的堰壁140(溢流壁)顶部的高度。在这种情况下，所需的液体量将至少足以填充每个培养室的内部，从其底部边缘到堰的顶部，再加上一定的体积以保持容器的高度至少达到每个培养室100的底部边缘。

在本发明的实施例中，可以根据需要在特定的培养室100中具有各种不同的液位中的任何一种。此外，可以在包含多个培养室100的本发明实施例的系统中，在任何给定时间，在本文描述的选项中，不同的培养室100可以以不同的方式运行。可以在不同的培养室100中的不同时间执行任何这样的运行。在任何一个培养室100中都可能期望这样做，液位可以随时间变化。图8中显示了各种选项。在图8中，波浪线表示液体和气体之间的界面。在其中两个这样的界面之间带有双头箭头的选项中，图示说明了液-气界面可以在界面的两个所示位置之间来回移动。显示了若干这样的选项。在培养室100的外部，示出了用于公共容器的通用液位，但是可以理解的是，培养室可以与各个容器或子容器相关联。

现在参考图8选项A，对于特定的培养室来说，所有的支架110都浸没在液体中，液体可以到达堰壁140的顶部，并可以保持这样持续延长的时间。可以有向上的连续液体流动，使得所有支架110都被淹没，并且在堰壁140上有连续的液体溢流。液体也可以是静止的，其中气-液界面位于堰壁140的顶部。当液体是培养基时，这可以在细胞培养期间发生。它也可以发生在细胞收获和回收的某些阶段，例如该过程的后期。在这种情况下，液体可以是各种液体中的任何一种。

现在参考图8选项B，可以在所有支架110都被浸没的情况下，培养室100可以使用经过或通过支架的液体的振荡或变速流动。为了通过流动的液体的剪切应力帮助从支架上分离细胞，可以这样做。在这样的过程中，培养室中的液位可以位于堰壁140的顶部和最上面的支架的上表面之间的某处。该液位可以随时间变化。如果特定培养室100中的液位以振荡的方式变化，则这将与通过支架的液体的交替流动方向相关联，并且因此与细胞所经历的剪切应力的交替方向相关联。也可以提供流动的脉冲波形。这种情况对于分离细胞也可以有用。

现在参考图8选项C，另一种可能性是，特定培养室内的所有支架都浸没在液体中，在该培养室内，液位可以保持在最上面支架的水平之上，并可以保持在静止状态。

现在参考图8选项D，液-气界面可以位于支架区域内的某个位置，或者可以以时间相关的方式穿过支架区域。对于其中使用液-气界面运动帮助从支架上分离细胞的培养室，在某些时候，液位会低于最低支架的底部，并且在其他时间，会高于最上面的支架的顶部，或者可以在支架区域内的某个位置。该液位可以随时间变化。液-气界面的时变位置可以有助于从支架上分离细胞。

现在进一步参考图8选项E，可以存在一个培养室，其中所有支架都可以在限定的时间内暴露于气体，即液位可以低于最低支架的底部，可以保持一段时间静止。可以使用这种情况来减少所需的液体总量，特别是在液体昂贵的情况下。

这些选项中的任何一个都可以在培养室内用任何感兴趣的液体(例如培养基、冲洗试剂或收获试剂)来执行。可以通过单个液体泵450的运行来控制根据选项A-E的系统的运行，包括它们的泵送速度和流动方向。蠕动泵是一种可能的泵。如图3A所示，每个培养室100可与专用液体泵450相关联，以在该特定培养室的液体路径中泵送液体。其他布置(相对于培养室的数量涉及不同数量的液体泵450)也是可能的。

在收获过程期间，可以将由摇动器或振动源900施加的振动的使用与液体或液-气界面的运动的特定特征协调。例如，如果振动是沿垂直方向的，并且如果当培养室浸没在液体中时液体具有垂直速度，则由于振动，液体在垂直方向上的运动会叠加在垂直运动上，从而增加使细胞分离的力量。另外，如果振动是在垂直方向上，并且如果存在液-气界面向上或向下移动经过筛网，则由于振动，液-气界面在垂直方向上的运动会叠加在垂直运动上，从而增加使细胞移动或分离的力。振动也可以在水平方向或其他方向上发生。

如果以振荡方式进行液体流动，则存在流动振动的频率，并且如果施加振动，则存在振动频率。这两个频率可以彼此不同，例如所施加的振动频率快于液体振荡频率，而频率之间不一定有任何特定的关系。可以选择频率，使得一个频率是另一个频率的整数倍(谐波)。频率可以选择为彼此相等。在那种情况下或在谐波情况下，流体振荡和机械振动之间可以存在所需的相对相位关系。例如，流体流动振荡和所施加的机械振动可以被定相，使得由流体流动振荡引起的对细胞的最大力和由所施加的机械振动引起的对细胞的最大力可以在时间上和在相同方向上同时，以产生组合的峰值力来移动细胞。如果振动方向与流体运动方向垂直，则情况尤其如此。即使流体振荡是连续的，振动也可以是间歇性的，反之亦然。

培养和收获方法

本发明的实施例可包括培养和收获细胞的方法。这种方法可以包括提供如本文所述的生物反应器系统，其具有多个培养室和多个子容器以及多个循环液体泵450，并且独立地或彼此不同地运行各种培养室。在图5的流程图中说明了这种方法。

在该方法中，可以使用诸如美国临时专利申请之一中描述的装置之类的装置将细胞接种到支架上，该专利通过引用结合在此。或者，可以使用移液管或类似设备手动接种细胞。可以将细胞以支架或筛网内均匀的空间分布接种在单个支架或筛网上。可选地，如果需要，它们可以以在支架或筛网内不均匀的空间分布接种。如果细胞是由自动化系统接种的，则可以通过将特定数量的细胞沉积与分配器的特定位置相关联来对任何分布进行编程。各种支架或筛网(如所述在培养室中的其中的12至15个)可以彼此相同地接种。可替代地，一些支架或筛网可以以与其他支架或筛网的图案不同的图案接种。然后可以将包含接种细胞的支架和支架保持器装载到培养室中，然后将其与容器或子容器组装在一起。

在培养过程的开始，新鲜的流体可以被加载到第一温度控制区域中并且可以被带到期望的温度。然后，期望量的液体培养基可以被允许流动或可以被泵送到容器或子容器中。当存在液体培养基和接种的支架时，可启动各个培养室中的流动以灌注通过支架，从而在培养期间提供营养。该灌注可以持续期望的时间，该时间可以是大约一周或更长时间。如本文所述，生物反应器系统可以包括至少一个传感器700，并且甚至可以包括用于各个培养室的传感器700，并且可以能够感测与细胞培养过程有关的若干参数中的任何一个。传感器700可以与控制系统相互作用以调整或控制系统或单个容器或子容器或液体流动回路或气体成分的运行参数。例如，无论存在什么液体泵450，其可以与存在培养室100一样多的液体泵450，都可以彼此独立地运行，例如通过响应于特定的传感器。

如果特定的液体泵450正向运行，它可以使液体培养基循环通过其流动路径，向上流过支架，如本文其他地方所述或在通过引用并入的文件中所述。只要发生培养需要，培养基就可以通过特定的培养室向前流动。该持续时间可以响应于由传感器或照相机中的任何一个测量的条件。而且，流速可以响应于由传感器或照相机中的任何一个测量的条件。而且，如本文所述，对支架的流动阻力的测量可以提供附着于支架的细胞数量的指示，并且这可以用于确定运行参数或培养的持续时间。这些运行参数在各个培养室之间可以有所不同。

如果特定的液体泵450在刚刚描述的状态下停止，则支架周围可以存在液体(例如培养基)的静止条件。这种静止条件可以是在培养室中充满液体直至堰壁140的顶部。

如果这种液体泵450以相反的方向运行，则短时间内会导致液体培养基以相反的方向流动，这对应于液体培养基通过支架的向下流动。液体泵450也可以在液位在最上方支架上方或液位在支架所在区域内或下方的情况下停止。

有一定量的管道从沟槽160穿过液体泵450(可以是蠕动泵)延伸到喷头410。还存在一定量的沟槽160，如从沟槽160的底表面到限定沟槽160的溢流堰壁140的顶部的空间所限定。如果液体泵450已经在向前方向上运行了一段时间，则可以预期管道中充满液体。同样典型的是，沟槽160中的液位相当低，即接近沟槽160的底部。可能期望的是，当管道中的流动方向反向时，液体泵450可以运行成使气体从喷头410进入管道。这种气体可以通过沟槽160或连接到沟槽160的集水槽中的液体向上冒泡。目的可以是该气体最终到达培养室100的顶部空间。在气体进入喷头410附近的管道的同时，液体从沟槽160附近的管道移回沟槽160。可能期望的是，当液体流回沟槽160时，沟槽160应不会使液体溢出到支架上。如果喷头410和沟槽160之间的管道的内部容积小于沟槽160的容积，则可以实现此目的。如果进行了足够的反向泵吸量，则可以预期来自管道的液体将返回到沟槽160，并且在进一步泵送时，气体将从喷头410移至培养室100的上部空间，这将使气体通过沟槽160和连接到沟槽160的集水槽中的液体向上冒泡，并且泵送的气体将使培养室内的液体移位，使培养室内的液位下降。

接下来，如果针对特定培养室或所有培养室100的细胞培养期结束，则可以从一个或多个容器中排出液体培养基。根据需要，对于所有培养室，可以运行一个或多个填充泵(未示出)以将培养基从各个管道中排出。对于下一次运行，然后可以向容器或子容器中填充生理盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)，或填充分离试剂，或在一个时间填充其中一种并在另一时间填充另一种。如果液体培养基含有血清，则可能期望的是在引入分离试剂之前用冲洗液例如盐水冲洗培养区域。如果不存在血清，则可能无需执行冲洗步骤。然后，可以运行一个或多个填充泵，以根据需要用该液体填充培养室。所有的培养室都可以同时填充液体，并且液体可以同时流过所有的培养室。预期收获仅需要将支架暴露于分离试剂中持续较短时间，例如15分钟。在此期间，如本文中其他地方所讨论的，分离试剂或其他液体的流动可以是稳定的、间歇的、振荡的或脉动的，或者可以具有相反的流动方向。

在支架暴露于分离试剂所需的持续时间之后，可以从单个培养室中排出或泵出分离试剂。在所有培养室都暴露于分离试剂后，可以将分离试剂从容器中排出。如果需要，可以再次用诸如磷酸盐缓冲盐水之类的试剂填充容器。

在收获期间，液体泵450可以以稳定流动模式运行，类似于在培养期间所做的。然而，在这种情况下，可以选择通过支架的流量和液体速度以适合收获，这可以不同于(大于)培养期间所使用的。

液体泵450还可以以脉动或随时间变化的模式运行，使得即使液体的流动在单个方向上持续较长的时间，流量或速度也可以变化。脉动流动可以理解为在特定方向上具有短暂的速度或流动突发，并且在相同方向上具有较短的流动周期，但是总体波形不同于典型的正弦波形。即使在较弱的条件下，短暂的大于液体平均速度的突发也可以使细胞脱落或分离，而较低速或较弱的条件可以将分离的细胞转运出培养液室。

液体流也可以以振荡方式运行。在n振荡流动模式下，液体的流动方向会反复变化，并且在任一振荡过程中排出的液体量会相对较小，给定液体段在振荡过程中通过支架移动的距离也会相对较小。如果蠕动泵的转子交替旋转其旋转方向来回旋转，则使用蠕动泵会产生这种情况。这样的振荡可以是正弦的，但不是必须的。

可以以与在另一培养室100或子容器200中执行的方式或顺序不同的方式或顺序在一个培养室100和子容器200中执行流动方式。

当支架区域仍完全浸没在液体中时，液体泵450还可以在交替的方向上进行少量的容积位移。这会导致液体上下交替流过支架，这可以适用于从支架中移出细胞。也可以以某种顺序将刚刚描述的交替流动与刚刚描述的脉动流动组合。例如，液体的某种反向流动之后可以是具有相对强的速度或流量的液体的正向流动，其之后可以是一段更缓和的液体流动。根据需要，这可以与外部施加的振动同时进行。流动的振荡频率可以不同于振动频率，甚至可以显著不同；或者，如果需要的话，流动的振荡频率可以与振动频率相同或几乎相同。在后一种情况下，可以将振动和流动振荡调整为彼此同相，使得细胞由于振动而经历的加速度可以增强细胞由于液体运动而经历的力。但是，这不是必需的。

在这种情况下，液体泵450还可以被运行以使得液-气界面重复地穿过支架区域。液体泵450可以首先在一个方向上然后在相反的方向上运行，从而将适于将培养室中的液位从一个位置改变到另一位置的一定量的气体移位，以交替地使支架暴露并浸没在液体中。

更进一步地，对于给定的培养室100以及支架和子容器，可以基于收获过程期间任何给定时间的支架的流动阻力来确定收获的进度。例如，当支架浸入液体中时，可以这样做。可以通过观察支架在收获过程中随时间变化的流动阻力(或流动阻力的变化)来估算收获过程的进度。支架的流动阻力可以通过使用与泵送相关的信息，以与在估计培养过程中细胞生长的程度(接近融合)时所描述的大致相同的方式表征。

例如，作为参考，如图6所示，可以在若干种相关情况下表征支架的流动阻力。一种相关情况将是空的支架，上面没有细胞。另一种相关情况将是在细胞培养的开始时的支架，即在将细胞接种到支架上之后但尚未发生细胞生长之前。另一种相关情况可以是在决定终止细胞培养并开始收获时的支架。还存在可以表征的中间情况。当部分培养支架时，其流动阻力介于培养开始时的值和培养结束时的值之间。当部分收获支架时，其流动阻力介于收获开始时的值和支架完全空时的值之间。

例如，如果支架在收获开始时接近融合处，则支架将具有相对较大的流动阻力，这将反映在压降中。可以通过使用液体流量和压降的计算来确定流动阻力。在收获的后期，当一些细胞可能已经被去除时，支架的流动阻力会更小。该信息可用于确定收获过程应持续多长时间。收获过程会损坏细胞，因此有利的是，收获过程不会持续超过所需的时间。同样，此信息可用于调整收获过程中给定时间使用的技术。在收获过程的某个阶段，诸如稳定流动之类的一种技术会更有用，而在收获的另一阶段，诸如交替流动或脉动流动或气液界面通过等另一种技术可以更为有用，支架的流动阻力的这种测量可以指示什么是收获阶段，因此是什么时候最适合使用的技术。可以针对每个培养室100或由专用液体泵450泵送的每个培养室100唯一地完成该收获指示，该专用液体泵450在流动路径或培养室100中的某处具有压力测量仪器。

这样的压力传感器800可以位于液体泵450和培养室100之间。如图所示，测得的压力可以是低于大气压的，但是可以被压力传感器和相关软件考虑在内。

关于这种情况，可能期望的是，在各个管道进入喷头410的地方，它们在喷头410的上游不彼此接合，从而避免了其中一个管道吸入液体的可能性。如果用于该特定管道的液体泵450是反向运行的，而其他液体泵450是以正向模式运行的，则来自其他管道的压力从其它管道中移除。同样，可以为每个子容器200提供独立的喷头410。

鉴于存在用于单独的流动回路的单独的液体泵450，或者具有不同地运行单独的流动回路的能力，可以在不同的培养室中进行非同时的收获操作。例如，如果一个培养室准备好比另一个培养室更早地收获，则可以在适当的时间对其进行收获操作，而与另一个培养室中发生的情况无关。这可以取决于特定培养室中的细胞接近融合的距离的函数。

当收获细胞时，可能期望的是使某些流动垂直向下穿过支架，随后有机会使细胞从液体中沉降进入相应的容器或子容器200的底部或朝向其底部。预期收获的细胞密度大于可能导致的流经设备的各种液体的密度，因此细胞将倾向于从液体中沉降到容器或子容器200的底部。在收获过程中，可以提供适当的停顿和静止条件的持续时间以使这种情况发生。认为与使收获的细胞流过蠕动泵450和喷头410相比，这是优选的。

在收获之后，可以对包含在容器或子容器200中的液体进行使所收获的细胞与液体分离的程序。这可以通过离心、过滤或其他合适的过程来完成。为了去除可能残留在细胞上的分离试剂，还可以用诸如盐水(磷酸盐缓冲盐水)冲洗收获的细胞。还可以进行测试以确定冲洗和从细胞中去除分离试剂的有效性。

在某些情况下，可能期望的是通过冷冻来保存回收的细胞。在这种情况下，可以将回收的细胞重新悬浮在适于冷冻的溶液中，然后使其置于适当的低温下以冷冻细胞。细胞可以储存在例如液氮中。

在其他应用中，从细胞培养过程中有价值的可能是细胞在培养过程中分泌的蛋白质。在这样的过程中，培养的细胞本身可能没有价值。在这种情况下，将不需要施加分离试剂或执行与收获相关的任何其他步骤。

收获期间以不同方式运行不同的培养箱

可以监测生物反应器中与它们的运行有关的各种工艺参数中的任何一种，包括但不限于：培养基的pH；温度；培养基中葡萄糖的浓度；培养基中乳酸的浓度；培养基中溶解氧的浓度；液体上方大气中二氧化碳的浓度；在底物上生长的细胞数量或融合度。这些中的任何一个也可以用作控制反馈回路的参数，该反馈回路将调整过程参数以获得期望的结果。

如本文所述，可以提供多个子容器，每个子容器具有与其相关联的培养室。对于每个培养室，可以有一个专用的流体流动回路，该回路在培养过程中将液体培养基移动经过支架。这样的回路可以具有对流体流量的单独控制，例如通过单独控制的液体泵450。响应于传感器指示的条件，可以在细胞培养或细胞收获期间调整以下的任何一项或多项：液体的体积流量；液体流动的持续时间；液体流动方向。

特别地，对于所描述的在支架区域上方包括堰并且在运行过程中包含气袋的培养室，可以使气-液界面根据需要以所需的速度和所需的重复次数沿向上或向下方向移动经过支架区域。

对于不同的培养室，这些收获操作中的任何一个都可以不同地完成，并且可以响应于所描述的任何参数的感测值来完成。例如，不必对所有培养室同时进行收获操作；相反，当确定该特定的培养室已经达到融合的适当水平时，可以执行收获操作。而且，对于所有培养室100，收获操作的持续时间不必相同。

通过适当的流体连接，可以去除液体培养基并用收获液体代替。

分离试剂可包含诸如酶之类的试剂，其使细胞与相邻细胞或与底物的附着松动。这种收获酶的例子是胰蛋白酶。另一个是胶原酶。进一步地，与这些酶中的任何一种结合使用，或者单独使用，在细胞分离或收获过程中流动的液体可以包含添加剂，例如表面活性剂，或三嵌段共聚物，有助于减少收获酶或类似物质对细胞的损害。这种三嵌段共聚物的一个例子是三嵌段共聚物聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯，可以从BASF Corporation商购获得。更具体地说，该家族的合适成员是Pluronic F-68。Pluronic F-68的平均分子量约为8400Da，其中环氧乙烷约占80％。Pluronic通过减少施加到细胞上的剪切应力的作用来保护细胞免受外部施加的剪切应力。也可以单独或与本文提及的其他物质组合包含表面活性剂。细胞分离或收获期间流动的液体可以是表面张力小于50达因/厘米，或小于40达因/厘米，或小于30达因/厘米的水性液体。

传感器700可以是接触子容器中液体的探针，如图3B所示，也可以是流体流动回路中其他位置的探针，例如来回移动到液体泵450的管道中的探针，如图3C所示。

替代地，与一组子容器相关联的培养室(虽然仍不是全部培养室)可以一起被控制。

为了实现细胞的分离，仅需要将支架暴露于分离试剂一段相对短的时间，例如大约15分钟。这不是很长(与典型的大约一周的培养时间相比)。如本文其他地方所述，暴露于分离试剂是否与支架的摇摆或振动或某些流动方式同时发生是优选的。可以在一个培养室中填充分离试剂，可能包括使其振动适当的时间，而其他培养室中则不包含分离试剂。

还可以存在子容器200或容器，该容器被细分为分别竖立和控制的子区域。在这种情况下，可以在一个培养室暴露于分离试剂的情况下，其他培养室仍然可以像在培养过程中一样容纳培养基。这可以通过为各个培养室100测量的工艺参数来确定。如本文其他地方所述，在不同培养室100中不同条件的许多组合是可能的。

还可以提供如所描述和图示的多个子容器，并且在子容器内，可以提供两个或更多个共享同一子容器的培养室，而不仅仅是每个子容器一个培养室，如图所示。

附加评论

如本文所述，在培养室100内可以存在溢流堰壁140，溢流堰壁140限定出沟槽160，该溢流堰壁的出口的高度低于溢流堰壁140的顶部，从而在运行时，在培养室100内的液体上方捕获了一定体积的气体。但是，所捕获的气体的存在不是必需的，并且作为替代，还可以在培养室100的内部完全充满液体的模式下运行培养室100。

如果培养基包含血清，则可能期望的是在使用收获试剂之前用冲洗液如磷酸盐缓冲的盐水冲洗支架。如果使用无血清培养基，则可能无需冲洗支架，

所描述的通过表征支架的流动阻力来监测细胞生长程度以及细胞收获程度的方法对于监测那些参数可以是有利的，特别是因为该方法是非侵入性的。它不需要拆卸系统的任何部分即可获得测量结果，并且可以连续执行，并且如果将传感器或监视器连接到管道，甚至不需要传感器或监视器即可穿透培养室本身的边界。对于特定的培养室，这也可以唯一完成。

在此类支架上，3D打印表面为生长提供了三维表面积，从而与类似的平板培养板相比，提供了更多的可用于细胞膨胀的区域。对于给定的体积，与类似的平板相比，在这种支架上包装的细胞可以多出5-7倍。通过调整纤维的间隔密度，可以根据细胞类型根据需要增加该数量。富集的ECM(细胞外基质)可以在支架纤维之间的孔或空间中形成，这一事实可以为细胞生长提供额外的区域。

细胞可以在其上膨胀和生长的支架的3D打印性质可以被数字地定义。通过增加或减小孔径，可以控制间距、图案和纤维直径以更改各种膨胀参数，例如可用于细胞附着/生长的表面积，使培养基更容易流过支架或支架中的间距。

因为表面是网格状的3D打印表面，所以与在使用中空纤维生物反应器或使用微粒或微载体作为培养表面的生物反应器等细胞培养技术的情况下相比，在膨胀过程结束时去除细胞的过程要容易得多。因为所描述的支架的孔被很好地限定，所以可以选择本发明的实施例的系统的流动参数以允许容易地回收细胞。这与使用微粒的细胞培养不同，后者需要大量使用酶和时间来提取细胞，尤其是间充质干细胞。

因为在本发明的实施例中3D打印的支架是固定的，所以细胞或支架在细胞培养期间经受的唯一剪切应力是由于培养基流过支架表面所致。因此，更容易控制和调整细胞所经受的剪切应力。相反，在使用微粒作为支架的生物反应器中，细胞所经历的剪切应力不容易调整，因为微球在其周围反弹时会在容器内旋转，这使得几乎无法建模和控制剪切应力水平。在本发明的实施例中，生物反应器中的细胞所经受的剪切应力在可用于细胞生长的所有表面积上是一致的。

聚苯乙烯用作3D打印支架的材料利用了现有经验，因为聚苯乙烯是组织培养板中常用于锚定依赖性细胞的材料。

由于本文所述支架或通过引用并入的文献中的支架中的空的空间相互连接，因此期望在膨胀后可以分离并收获超过90％的细胞。

与其他当前可用的细胞培养技术相比，本发明的实施例是封闭的系统，与当前可用的系统相比，该系统更封闭，操作更容易且成本更低，需要的维护更少且自动化程度更高。

对于某些应用，期望收获并利用培养的细胞本身。但是，并非总是必须从生物反应器中收获细胞。在某些其他应用中，感兴趣的是细胞的分泌物，而不是细胞本身。

在本文中称为盐溶液的可以是磷酸盐缓冲盐水。

泵(液体泵或气体泵或填充/排出泵)可以是蠕动泵或根据需要可以是其他泵。术语液体泵是指通常可以泵送液体的泵，但是在某些时候，例如当这种泵以其反向运行时，这种泵也可以泵送气体。

术语压力测量装置旨在包括压力传感器、压力变送器和用于测量压力的任何其他合适的装置。

通常，对于收获细胞，可以使用振动或流动模式或暴露于分离试剂的任何组合或顺序。分离试剂可包括酶，例如胰蛋白酶或胶原酶或其他。

通常，本文描述的公开特征、组件和方法的任何组合都是可能的。可以以物理上可能的任何顺序执行方法的步骤。

所有引用的参考文献通过引用并入本文。

尽管已经公开了实施例，但是不希望由此受到限制。而是，范围应仅由所附权利要求书确定。

Claims (20)

1.一种用于培养细胞的生物反应器系统，

所述生物反应器系统包括空间固定支架，所述细胞可在所述空间固定支架上生长，

所述生物反应器系统具有液体供应系统，所述液体供应系统用于通过所述支架灌注液体，

其中，所述生物反应器系统包括多个培养室，每个培养室包含一些所述支架，所述培养室具有流动路径使得所述液体经由其流动，

其中，所述生物反应器系统包括多个容器或多个子容器，

其中，所述生物反应器系统具有控制装置，所述控制装置用于在给定时间向所述多个培养室中的各个培养室引导液体流，就液体的流量或液体的流向或液体的流动持续时间而言，所述液体流不同于向其他培养室引导的液体流。

2.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，所述控制装置包括至少一个传感装置，所述传感装置选自pH传感器、溶解氧传感器、葡萄糖传感器、乳酸传感器、照相机和指示一个所述支架的流动阻力的装置，其中，所述控制装置响应于所述至少一个传感装置。

3.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，所述多个所述培养室中的超过一个与所述液体的公共容器相关联。

4.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，每个所述培养室与相应的子容器相关联，其中，每个子容器将包含于其中的液体与任何其他子容器中的液体隔离。

5.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，至少一些所述培养室分别与不同的子容器相关联，其中，每个子容器将包含于其中的液体与任何其他子容器中的液体隔离，其中，一些所述培养室通过侧流过滤器的流路与其他培养室流体连通，所述侧流过滤器位于所述子容器中液位上方的高度处。

6.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，所述控制装置包括多个泵，并且其中，每个所述泵被连接以便仅通过一个所述培养室或所述多个所述培养室的子设备来泵送所述液体。

7.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，所述控制装置包括能够调节所述液体在所述多个所述培养室之间的流量分布的阀。

8.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，所述液体是培养基、收获试剂和盐溶液中的一种。

9.根据权利要求1的生物反应器系统，其中，在一个培养室中开始收获细胞的时间与在另一个培养室中开始收获细胞的时间不同。

10.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，在特定培养室中开始收获细胞的时间响应于特定培养室中的培养基测量的参数，所述参数选自：所述培养基的pH；所述培养基中的溶解氧浓度；所述培养基中的葡萄糖浓度；所述培养基中的乳酸浓度；所述培养基的电容特性；一个所述支架的光学图像；以及一个所述支架的流动阻力。

11.根据权利要求1所述的生物反应器系统，其中，所述生物反应器系统具有控制装置，所述控制装置用于在给定时间向所述多个培养室中的各个培养室引导液体流，以在所述培养室中的一个培养室中产生液-气界面，所述液-气界面具有的液-气界面高度与所述培养室中的另一个培养室的液-气界面的液-气界面高度不同。

12.一种用于从生物反应器系统中回收细胞的方法，所述方法包括：

提供生物反应器系统，所述生物反应器系统包括空间固定支架，所述细胞可在所述空间固定支架上生长；所述生物反应器系统液体供应系统，所述液体供应系统用于通过所述支架灌注液体；其中，所述生物反应器系统包括含有一些所述支架的培养室，所述培养室具有流动路径使得所述液体经由其流动；

培养在所述支架上的所述生物反应器中的细胞；以及

以任何组合和任何顺序执行以下任何一项或多项：

将所述细胞暴露于收获剂；

对所述生物反应器系统施加振动；

通过所述支架施加振荡的液体流；

通过所述支架施加脉动的液体流；或者

使液-气界面通过所述支架。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述振荡流或所述气-液界面的所述通过具有流动频率，并且所述振动具有振动频率，并且所述频率之一等于或者是所述频率的另一个的整数倍。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述振动和所述界面的所述流动或所述通过以相位关系施加，以便彼此增强。

15.根据权利要求12所述的方法，其中，在至少一个所述培养室中，所述控制装置使所述液-气界面从所述支架的最低处到达所述支架的最高处。

16.根据权利要求12所述的方法，其中，在至少一个所述培养室中，所述控制装置使所述液体的流动方向改变方向。

17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述收获液包括三嵌段共聚物或表面活性剂。

18.一种培养细胞的方法，所述方法包括：

提供生物反应器系统，所述生物反应器系统包括可供所述细胞生长的空间固定支架，所述生物反应器系统具有用于通过所述支架灌注液体的液体供应系统，所述液体供应系统包括泵，其中，所述液体供应系统包括用于测量由所述泵产生的压力的压力测量装置或用于测量在运行所述泵时消耗的电力的装置；

在所述支架上培养细胞；

任选地收获培养后的所述细胞；以及

在所述培养或所述收获或两者期间，使用所述液体的流量的信息结合由所述压力测量装置测量的所述压力的信息或所述泵的电力消耗的信息来确定所述支架的流动阻力。

19.根据权利要求18所述的方法，进一步包括使用所述流动阻力来调节所述细胞的所述培养的过程参数或持续时间。

20.根据权利要求18所述的方法，进一步包括使用所述流动阻力来调节所述细胞的所述收获的过程参数或持续时间。

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