CN102112593A - 生物反应器平台的腔室 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中等尺寸的生物反应器平台，包括用于生物细胞的向上开口的腔室，所述腔室通过第一端口与传导进入所述腔室的液体的流入流的第一通道连通，并通过第二端口与传导从所述腔室流出的液体的流出流的第二通道连通，所述腔室具有包含水不混溶性液体的封闭物，其中所述第一通道与液体储存器流体连通，所述第二通道与废物容器流体连通。另外，本发明还公开了改变腔室内容物与环境相互作用的方法和培养生物细胞的方法。

Description

生物反应器平台的腔室

技术领域

本发明涉及一种中等尺寸的生物反应器，包括用于生物细胞的腔室、流入流的通道和流出流的通道、以及水不混溶性流体层作为所述腔室上的封闭物，其中所述通道分别与液体储存器和废物容器相流体连通。本发明还涉及改变所述腔室中内容物与周围环境的相互作用的方法，和培养生物细胞的方法。所述中等尺寸生物反应器适用于培养生物细胞；尤其适用于培养哺乳动物细胞，例如胚胎或干细胞。该中等尺寸生物反应器更特别适用于体外受精操作。

背景技术

目前在用于胚胎培养的体外受精(IVF)中所用的方法依赖静态条件下胚胎在培养皿中的培养。这样的方法是劳动密集的，因为更换生长培养基需要大量的人工操作。人工操作总会有引入污染的风险，而且静态条件与体内条件的相似性不高，其难以满足胚胎不断改变的需求。与当前体外静止条件相比，体内胚胎处于不断改变的环境，而且一个发育阶段中胚胎的需求可能与另一个发育阶段中胚胎的需求有很大不同。一个发育阶段的体内条件甚至可能对后面发育阶段的胚胎有害。

基于培养皿的系统的静态条件可以使用开放的生长腔室，其可以用移液管等直接进入。对于IVF过程，开放的系统是方便的，因为这样的系统既可以替换缓冲液，而且重要的是，容易在培养之后移出胚胎。为了最小化污染的风险和防止从生长腔室的挥发，一般腔室中的水性培养基上有水不混溶液体的顶层，例如石蜡油，作为“盖子”或“封闭物”。

基于静止的培养皿培养系统的一些缺点可以通过下述而避免：在能够向胚胎灌注适合其发育阶段的生长培养基的培养系统中培养胚胎。这种系统应该有与胚胎尺寸相匹配的适当尺寸并且更近似于体内条件。此外，以小规模进行运作是重要的，以最小化此类哺乳动物细胞通常所需的昂贵的生长培养基的消耗。

现在许多所谓的微流体装置已经被描述用于进行各种类型的分析或用于培养细胞。这些装置常常用各种原理制造，这些原理通常受到二十世纪七十年代基于硅的微电子学技术的发展的启发。微流体应用的实例为DNA分析，涉及的原理如用于例如检测单核苷酸多态性的聚合酶链反应或使用例如毛细管电泳法的蛋白质分析。

然而，‘真正的’微流体装置(例如具有约100μm或更小级别直径的流体通道)确实具有许多缺点，其中一些缺点对于为灌注型操作设计的细胞培养装置特别明显。正如从Hagen-Poiseuille(哈根-泊肃叶)方程(见下文)可见，在有液流的例如100μm通道中压力降变得很大，对于意在此规模运行的泵提出了高要求，因为这样的泵必须能对抗相当大的反压精确地泵出很小的体积。由于这个原因，在此规模经常使用所谓的电渗流产生液流，其在盐水溶液中通过暴露于巨大的电位下生成液流。但是这样的电渗流不适于涉及活(哺乳动物)细胞的系统。

微流体中遇到的另一个问题是关于“与外界的联接”的问题。生物学实验室中所用的大部分设备，如泵和分析设备，比微流体设备大得多以至于两个级别的集成变得问题重重。如250μm直径(容易得到的)这样小的管与芯片的联接点对于实验室工作人员而言难以操作，而且可能迅速引入几倍于微流体系统体积大小的死体积。这个问题对于灌注型细胞培养装置尤其重要，其中操作复杂性和流体在联接至微流体系统的管中的长滞留时间增加了逆流污染的风险。在培养哺乳动物胚胎的情况下，培养时间可能达五天或更长。

对于以小规模工作的生物反应器系统，当然能够根据预设的事件序列在不同的生长培养基和条件之间切换。但是，为了更充分地优化生物反应器中细胞的生长条件，生物反应器可装备适当的可与电脑通信或类似的能够发送命令到生物反应器的执行元件的传感器。这样可生成反馈系统以对环境的变化做出反应，例如用于维持恒定的环境条件。

在文献中已经记载了许多生化或生物微流体设备。总的来说，这样的设备目的是利用小规模存在的快速扩散速率从样品得到数据，以便从即使是非常小的样本体积来快速得到数据。诸如DNA或RNA等核酸的分析是特别有利的，因为核酸的稳定性质使含有核苷酸的液体可以用电渗流操作。但是，也已经记载了微量发酵罐，当暴露于多种实验条件时，其中可生长并观察或者分析到微生物细胞，例如细菌。参见例如WO2005/123258或WO2007/044699。这样的系统所提供的一个典型优点是仅仅需要非常小体积的样品液体，可能是包含昂贵的测试化合物的样品液体，来诱导和研究对细胞的影响。

但是迄今为止记载的大部分微流体设备是分析设备，其目的在于提供关于设备中样品液体的细胞或生物学化合物的抽象数据。相反地，体外受精操作的目标是培养过程中得到的胚胎。因此，为灌注细胞如未受精或受精的卵母细胞设计的设备，应该使得易于进入培养腔室以能够在该腔室中放置细胞，而且尤其在培养期后也能轻柔地移动细胞。这种特征在仅设计用于数据采集的流体设备中是非必需的，其中适当的传感器可以集成至设备中，使数据从系统中导出而无需物理移动细胞。

如下面所讨论，为解决上述问题已采取了一些手段。

WO07/047826描述了微流体细胞培养设备，其使用油覆盖层以阻止液体从微流体室中蒸发并使得可以进入该设备中的生长室。WO07/047826的设备可以含有光学传感器、电传感器或机电传感器以测定微流体设备元件的状态或液流特性。所述设备包含漏斗形的生长腔室和经第一微通道联接的储存器，第一微通道在包含该腔室的PDMS基底的底部中。该储存器和生长腔室进一步通过位于第一微通道之上的微通道连接。在由弹性材料制成的膜和所谓的销式(pin)传动设备的帮助下，在腔室间产生液体的蠕动是可能的。因此，当液体从储存器通过底部通道蠕动到生长腔室时，生长腔室中水性液体上的油层会通过上层通道推动到储存器中，从而保持两个腔室间的质量平衡。该蠕动可用于产生“往复型流体供应，其中孔中的流体水平周期性地增加和减少”。但是，也可用外部液体供应向WO2007/047826的设备的生长室供应液体。考虑该双通道设计的“质量平衡缓冲”效果，不清楚如何修改该设计以使用这样的外部液体供应，而且该设备似乎不适于传导长期灌注型生长实验，因为需要利用外部流体供应。因此，这样的系统主要用在仅仅两个腔室包括在流体系统中时。特别地，在所有的腔室不连续连接的设计中，当两个或更多个储存器腔室供应同样的培养腔室时，该设计很少适用。

WO2006/089354记载了用于培养细胞的设备，特别是用于IVF的设备。该设备包括至少一个向上开口的培养腔室和流体储存器，其中该培养腔室与该流体储存器流体连通。细胞培养腔室的培养基可以用细胞培养油覆盖，例如石蜡类油，以使蒸发最小化。该细胞培养腔室进一步具有锥形的侧壁。该流体储存器通过该培养腔室的缝隙与该培养腔室连接。该缝隙小于要培养的细胞直径，由此该细胞保持在细胞培养腔室中。

细胞培养介质被注入到该流体储存器中。细胞培养介质从流体储存器优选通过毛细管流或通过流体通路施加压力差流向细胞培养腔室的该缝隙，随后填满该细胞培养腔室。细胞培养腔室的流体水平通常直接取决于注入的流体体积。流体水平可以通过例如重力平衡。所以，例如当一定体积的液体注入到该储存器中时，该液体流入培养腔室中，直至两个腔室的液体水平相同。

WO2006/089354的流体储存器可用于培养腔室的流体流入和流出。在操作中，培养介质可直接加入到WO2006/089354的培养腔室中，多余的液体可通过从储存器中吸出液体从培养腔室去除。因此，看来WO2006/089354中记载的系统不适于灌注操作，特别是长期的灌注操作。WO2006/089354的培养腔室缺乏专用的流体入口和专用的流体出口。这种专用功能的缺失使其难以预测和控制培养腔室当前的条件，而且培养腔室流出的流体的分析也有问题，因为WO2006/089354的设备的流出液将不可避免地与新鲜的培养基混合。当流体流可以通过WO2006/089354的腔室传导时，培养腔室不会同时具有入口和出口通道。所以，该系统看来不适用于灌注该培养腔室，特别是不能达到腔室中液体水平的稳定状态。

不管以上讨论的成果怎样，仍需要解决设计简单的流体设备问题的系统，所述流体设备用于在适合哺乳动物细胞，例如胚胎的规模和时间上进行灌注型操作，在操作中可容易地进入该生长腔室。本发明的目的是提供向上开口的腔室，其在操作中可物理地达到，而且保持该腔室中的液体与周围环境的分离；这种分离用于防止该腔室中溶剂的挥发，并同时防止腔室中的液体被颗粒污染，特别是微生物病菌或病原体。向上开口的腔室可进一步允许气体，例如O₂或CO₂扩散到腔室中的液体中，提供附加的装置来控制腔室中的条件，例如pH。将在胚胎发育期间对生长条件的不同需求以及这样的培养所需的时间考虑在内，并进一步考虑到应可以在腔室的灌注期间进入腔室来放置细胞或从腔室移出细胞，这样的腔室适用于培养哺乳动物卵母细胞和胚胎。

发明内容

本发明涉及一种中等尺寸的生物反应器平台，包括用于生物细胞的向上开口的腔室，所述腔室通过第一端口与传导进入所述腔室的液体的流入流的第一通道连通，并通过第二端口与传导从所述腔室流出的液体的流出流的第二通道连通，所述腔室具有包含水不混溶性液体的封闭物，其中所述第一通道与液体储存器流体连通，所述第二通道与废物容器流体连通。因此，本发明描述了具有用于生物细胞的腔室的生物反应器平台。通常生物反应器平台应包括多个腔室用作培养生物细胞的腔室，或者进行生物学或生化反应的腔室，例如培养细胞、杂交核酸或进行酶反应；参与这样的反应的生物学或生化实体可固定到该腔室的表面上，或可游离悬浮在该腔室中的液体中。生物反应器平台中的腔室还可作为液体储存器，例如缓冲液或培养基容器，生物反应器平台通常可包括在所述腔室之间传导液体的通道。类似的生物反应器平台通常包括废物容器。根据本发明，任何这些腔室，即用于生物细胞的腔室、液体储存器和废物容器，可以是向上开口的，而且它们可具有包含水不混溶性液体的封闭物。

当其目的是能够以便利的方式物理达到所述腔室时，包含在本发明的中等尺寸生物反应器平台中的腔室特别适用。向上开口的腔室在该腔室中的水性液体顶上具有水不混溶性液体层的封闭物。水不混溶性液体将形成大体均质的相，与限定所述腔室开口表面的周边的腔室侧壁接触，从而基本上防止了液体从腔室的挥发，并预防了该水性液体被来自所述生物反应器平台的外部环境的颗粒的污染，例如微生物病菌或病原体。该封闭物也可控制溶剂和其他挥发性化合物例如CO₂和O₂的挥发。这将有效阻碍所述水性液体或培养基中的一些成分逸出所述腔室，例如水蒸气，而其他成分则可通过该封闭物交换，例如CO₂和O₂。通过控制CO₂跨过水不混溶性液体封闭物的传输，pH可保持在相关水平。因此，可以说该水不混溶性液体为所述腔室提供了半透性的封闭物。

适宜的水不混溶性液体通常对于可见光是透明的，这进一步使所述腔室中的细胞可以可视观察，例如通过显微镜。作为流体，该水不混溶性相易于用例如移液器等穿过，从而允许达到所述腔室及其内容物，因此例如受精的卵母细胞可放置到所述腔室中用来培养和在培养之后轻柔地移出。

本发明的中等尺寸生物反应器平台中包含的腔室与通道通过端口连通。通过向水不混溶性相上表面施加正向相对压力，可将腔室中的液体从该腔室推出，从而形成流出的流。相似地，通过对所述通道施加负向相对压力创建流，使得腔室中的液体被吸出该腔室。因此，可以说该水不混溶性相构成了腔室的可变形的盖子。本发明的中等尺寸生物反应器平台包括腔室，所述腔室具有第一端口和第二端口，第一端口与用于进入所述腔室的液体的流入流的第一通道连通，第二端口与用于从所述腔室流出的液体的流出流的第二通道连通。第一和第二通道使得液体可施加到腔室中和从腔室除去液体，从而可保持相对于例如腔室底部的液体水平的稳定状态。第一通道与另一个腔室或包含液体的储存器流体连通，这种液体可从该储存器吸出或驱散到该腔室中。可使用这种操作填满该腔室或保持稳定状态。当该腔室还与用于流出流的第二通道和用于流入流的第一通道适配时，它可用于灌注操作，例如IVF过程。该腔室可在底表面包括用来保持生物细胞的凹陷，例如用于IVF和其他过程，例如培养其他生物细胞。在一些实施方式中，单个腔室包括多个这样的凹陷。当在单个的腔室中存在多个凹陷时，这些凹陷可以串联连接、并联连接或以串联和并联的组合连接，在这些凹陷之间存在一个或多个用来传导液体的通道。

本发明的中等尺寸生物反应器平台中包含的腔室通常形成在基底中，该基底可以用任何适宜的材料制备，例如聚合物、玻璃、金属、陶瓷材料或这些材料的组合。这种基底可限定腔室的底表面和侧壁；当从上方看时侧壁可形成腔室的周边，该周边为圆形、方形、多角形或矩形等；优选该周边为圆形。该基底可具有上表面，围绕腔室周边的上表面可以是疏油的或超疏油的，以防止水不混溶性液体铺展到基底的上表面上。疏油或超疏油表面将为水不混溶性液体和基底表面上的周围空气之间的界面提供大接触角，例如大于90°。大接触角表示其对于该水不混溶性液体在基底表面上的铺展在能量方面是不利的，而且该水不混溶性液体反而会在腔室中水性液体之上形成凸出的弯月面。

通常在水性环境中发生生物或生化反应，所以，在一个实施方式中，用于生物细胞的该腔室包括在该腔室中形成下层相的水性液体，从而该水不混溶性液体形成上层相。水不混溶性相充当腔室的封闭物，以防止上述水性液体的挥发和污染。为了分别供应给所述腔室水性液体和从该腔室去除水性液体，优选下层水性相覆盖腔室的第一端口和第二端口。端口和水性液体的相对定位将保证该水不混溶性相能够作为封闭物保持在水性液体上。

优选该生物反应器平台是中等尺寸的，这意味着生物反应器平台的腔室和通道的大小设定成适于中等数量的生物细胞，例如用于体外受精(IVF)过程，本发明的生物反应器平台特别适用于体外受精过程。本发明的生物反应器平台可包括两个或更多个用于生物细胞的腔室，例如，第一腔室与第二腔室通过通道流体连通，该通道用于传导从第一腔室流出的液体的流出流。形成用于例如培养基、缓冲液等液体的储存器的腔室可包括水不混溶性液体的封闭物和指向也提供有这样的封闭物的培养腔室的通道。这些腔室中的一个或多个，优选培养腔室，可以与该生物反应器平台中还包括的废物容器流体连通。虽然在某些实施方式中，废物容器不包括水不混溶性液体层，但是优选该废物容器还包括水不混溶性液体层。

在一个实施方式中，生物反应器平台还包括一种提供液体驱动力的装置，以通过第一通道将液体移动入用于生物细胞的腔室中和/或通过第二通道将液体从用于生物细胞的腔室中移出，例如，通过一个或多个通道从储存器到用于生物细胞的腔室和到废物容器。所以，可以将液体从作为储存器的腔室驱动到作为培养腔室的腔室。因为生物反应器平台还包括废物容器，液体还可以从培养腔室进一步被驱动到废物容器。液体驱动力可以通过向储存器施加正向相对压力来提供，以将液体驱散到培养腔室中，和可选地进一步到废物容器中。或者，对用于从培养腔室流出的流出流的通道施加负向的相对压力，也可以产生相同的效果：从储存器移动液体到培养腔室中。负向相对压力也可施加到废物容器中。提供液体驱动力的装置也可集成到生物反应器平台中，例如以蠕动功能的形式作用于通道。一般来讲，提供液体驱动力的所述装置选自：用集成的或外部的泵将液体扩散至腔室中或从腔室吸出；对腔室中的液体的上表面施加正向相对压力；对腔室中的液体的上表面施加负向相对压力；相对于水平面，调节第一腔室中的液体的上表面的水平至比第二腔室中液体的上表面水平更高的水平；或这些的组合。

当生物反应器平台的腔室是向上开口时，液体驱动力也可由腔室的液体表面之间互相的水平位置差来提供。在一个其中腔室包括水性液体的实施方式中，第一腔室如储存器中水性液体的上表面相对于水平面的水平要高于第二腔室如用于生物细胞的腔室中水性溶液的上表面相对于水平面的水平。这提供了形成虹吸作用的可能性，以通过用于第一腔室的流出流的通道从第一腔室将液体移动入第二腔室。从一个腔室到下一个的流速由液体上表面的高度差所支配，还由由于通道的尺寸和材料造成的任何阻力来支配。也可以组合提供液体驱动力的不同原理。所以，虹吸作用可以与集成的泵组合，或者可以如上所述使用正向或负向相对压力，来增加或降低虹吸作用。当生物反应器平台包括至少三个腔室时，虹吸作用特别适用，例如，一个或两个本发明的腔室分别作为液体储存器和培养腔室，和可以提供也可以不提供上层水不混溶性相的废物容器。在该实施方式中，储存器的液体上表面高于培养腔室的液体上表面，培养腔室的液体上表面又高于废物容器的液体上表面。这可以保证在生物反应器平台操作过程中保持培养腔室中水性液体水平的稳定状态。腔室的底部也可遵循相同的模式，即，储存器的底部在培养腔室的底部上方，培养腔室的底部又在废物容器的底部上方。可影响操作的腔室中液体水平之外的其他参数有：通道的流动阻力，其由通道的尺寸限定；以及表面积的大小。

生物反应器平台还可包括多个具有储存器功能的腔室和/或用于培养生物细胞的多个腔室。当存在多个这样的培养腔室时，这些培养腔室可以以一个或多个组排列。一个组中的腔室可以通过用于液流的通道串联连接，各个组可以通过用于液流的通道并联连接。当生物反应器平台设计为利用如上所述的虹吸作用时，生物反应器平台也可以包括多个培养腔室。

另一方面，本发明涉及一种改变腔室中内容物与环境的相互作用的方法，包括步骤：

提供如本发明的中等尺寸生物反应器平台；

对所述中等尺寸生物反应器平台的所述腔室施加水性液体，以使得所述水性液体覆盖所述第一端口和所述第二端口；

施加密度小于所述腔室的水性液体密度的水不混溶性液体，以形成下层的水相和包含所述水不混溶性液体的上层相；

诱导水性液体流通过所述第一通道流入所述腔室中，和诱导水性液体流通过所述第二通道从所述腔室流出。

腔室的内容物(例如细胞、缓冲液或培养基成分、液体等)与周围环境之间的任何相互作用都适用于用本发明的方法改变。一方面，水不混溶性层提供了对不希望的成分(例如病原菌、颗粒污染物等)进入腔室的障碍，所以，通过将腔室的内容物与周围环境的污染物分离开来而改变了上述相互作用。这种相互作用还可以通过改变或调节腔室中存在的其他条件、和利用上述水不混溶性层形成对液体蒸发或热扩散的障碍来改变。所以，当腔室的温度升高或降低时，水不混溶性层会为腔室中的液体提供绝缘层，从而能够控制温度。同样，该水不混溶性层可以防止液体从腔室的蒸发。对于一些生物操作，例如IVF过程，对含细胞的生长或培养腔室必需具有物理进入。在这种情况下，从受精的卵母细胞形成的胚胎是该过程的目的产物。所以，必需有可能从该培养腔室移出胚胎。并且，要培养的受精卵母细胞的确切鉴定是重要的，所以在培养腔室中放置受精的卵母细胞的便利方法同样也是目的所在。对于要在灌注条件(即具有穿过培养腔室的液流)下操作的生物反应器平台，已经建议使用可关闭的部件，例如盖子，来提供对腔室的进入。但是，使用盖子时必需切断液流来进入腔室，并且，当打开盖子时，腔室中的内容物有被潜在的病原实体污染的风险。盖子还增加了设计的复杂性，使得该生物反应器平台更加昂贵。

发明人意外发现了水不混溶性液体层放到生物反应器平台的腔室中水性液体顶上可用来代替盖子提供对腔室的封闭，即使在液流正在通过腔室灌注时也可以使用。所以，本发明进一步涉及一种方法，包括步骤：

提供如本发明的中等尺寸生物反应器平台；

对所述中等尺寸生物反应器平台的所述腔室施加水性液体，以使得所述水性液体覆盖所述第一端口和所述第二端口；

在所述腔室的所述水性液体上施加密度小于水密度的水不混溶性液体，以形成下层的水相和包含所述水不混溶性液体的上层相；

诱导水性液体流通过所述第一通道流入所述腔室中，和诱导水性液体流通过所述第二通道从所述腔室流出，其中腔室中水性液体的水平保持在稳定状态。

在又一个实施方式中，本发明的方法进一步包括相对于来源于所述腔室中所述水性液体的气体压力，控制所述腔室上方的气体压力的步骤，以控制所述气体向所述水性液体的扩散进入或从所述水性液体的向外扩散。该气体优选为CO₂或O₂。

水不混溶性液体也可以在施加水性液体之前，施加到或者包括流出流通道或者既包括流出流通道又包括流入流通道的腔室。这不会损害该与水不混溶液体的封闭物功能，因为水性液体的更高密度会保证这些液体以所需的形式分层。

在另一方面，本发明涉及使用水不混溶性液体作为用于中等尺寸生物反应器平台中腔室的封闭物。此处，在向中等尺寸生物反应器平台的腔室施加水性液体之前，提供包括向上开口的液体腔室和通过第一端口与该腔室连通的第一通道的中等尺寸生物反应器平台，以使得该水性液体覆盖第一端口，在该腔室中的水性液体上施加密度小于水密度的水不混溶性液体，以形成下层水相和包括该水不混溶性液体的上层相，诱导所述水性液体流从腔室进入所述第一通道，形成流出流，相对于源于腔室中所述水性液体的气体的压力，控制腔室上方的气体压力，以控制气体向所述水性液体内的扩散和从所述水性液体向外的扩散。

该水不混溶性液体形成的封闭物允许气体穿过它扩散。但是，该水不混溶性液体不表示对这种扩散和对溶剂穿过该层的蒸发的阻碍。所以，当腔室上方的气体压力相对于源于该水性液体的气体压力存在梯度时，气体会依据该梯度扩散。但是同时该水不混溶性液体层防止了溶剂从腔室的蒸发，从而能够保持其渗透性。

在本发明中，优选控制所述腔室上方的CO₂压力。高CO₂相对压力会把CO₂驱动到该水性液体内，然后会导致该液体中pH的降低。相反，CO₂低压会允许CO₂从液体中扩散出来，从而升高其pH。因此，通过控制腔室上方的CO₂压力，有可能调节腔室中该水性液体的pH。腔室上方气体的浓度优选为预混合了例如2-10％CO₂的空气，优选5％CO₂。还可以是含有2-20％O₂的三种成分的气体(trigas)。腔室上方的总压力可比正常的大气压稍微升高，CO₂的压力可以从其浓度和该总压力计算出。

在又一方面，本发明涉及一种培养生物细胞的方法，包括步骤：提供如本发明所述的中等尺寸生物反应器平台；将所述生物细胞放到用于生物细胞的所述腔室中；和用水性液体灌注所述细胞。该生物细胞可以是哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母菌细胞、真菌细胞、植物细胞或昆虫细胞。当该细胞是哺乳动物细胞时，该细胞可以是例如精子、卵母细胞、胚胎、干细胞、单核细胞、树突细胞或T细胞，不过本方法并不限于这些细胞。在某一个实施方式中，培养该细胞三天或更长时间。

附图说明

下文中，将借助实施方式的实例并参考示意性附图来更加详细地解释本发明，其中

图1是向上开口的腔室的侧视图。

图2a是本发明的中等尺寸生物反应器平台的向上开口的腔室的侧视图，其中所述腔室的侧壁是亲脂的。

图2b是本发明的中等尺寸生物反应器平台的向上开口的腔室的侧视图，其中所述腔室的侧壁是疏脂的。

图3是本发明的中等尺寸生物反应器平台的侧视图。

图4是本发明另一个实施方式的中等尺寸生物反应器平台的侧视图。

图5a是本发明的中等尺寸生物反应器平台的透视图。

图5b是本发明的中等尺寸生物反应器平台的透视线框图。

图6示出了在本发明的中等尺寸生物反应器平台的向上开口的腔室中所述水性液体的pH的曲线。

具体实施方式

本发明涉及中等尺寸生物反应器平台，其包括用于生物细胞的向上开口的腔室，所述平台包括流入液流的通道、流出液流的通道和作为所述腔室的封闭物的水不混溶性流体层，以及液体储存器和废物容器。本发明进一步涉及用水不混溶性流体层作为中等尺寸生物反应器中腔室的封闭物，来改变腔室的内容物与周围环境的相互作用的方法。本发明还包括培养生物细胞的方法。

本发明的术语“生物反应器平台”或“生物反应器”涵盖适于培养生物细胞的系统和设备。公开的腔室和生物反应器尤其适于哺乳动物细胞。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞为与体外受精(IVF)相关的细胞，所述细胞将包括精子、卵母细胞和/或胚胎。但是，对本领域技术人员而言显而易见的是，所述生物反应器平台还可以用于其它哺乳动物细胞类型，如干细胞或免疫系统细胞如单核细胞、树突细胞、T细胞等等。在优选的实施方案中，哺乳动物细胞为人细胞。此外，本发明中公开的向上开口的腔室或中等尺寸生物反应器平台还可用于培养哺乳动物细胞以外的细胞类型。例如，在本文公开的生物反应器平台中还可培养细菌、酵母、真菌、植物或昆虫细胞。

生物反应器可包括多种类型的腔室，例如液体(例如缓冲液或培养基)储存器，培养腔室(即用于生物细胞的腔室)和/或废物容器。在本发明的上下文中，“腔室”一般是向上开口的。这意味着，该腔室由底表面和侧壁限定；所述侧壁可基本垂直，或所述腔室可向下逐渐变细。该腔室还可包括在底部上方垂直放置的“天花板”，虽然这样的天花板不能完全覆盖所述腔室中液体的表面。废物容器是不含用于流出液流的通道的腔室，从而通过生物反应器平台中腔室灌注的液体最终会收集在该废物容器中。因此，废物容器从培养腔室收集了用过的培养基。然而，液体也可以从废物容器移除，例如用来分析该液体，或调节废物容器中的液体体积。

通过向上开口，所述培养腔室提供了向该腔室的方便的物理进入。在该上下文中术语“物理进入”是指可以将工具插入到培养腔室的液体中，以操作培养腔室的内容物。这种操作可以是插入或从培养腔室移出一种或多种细胞，或者还可包括对已经存在于培养腔室中的细胞的操作。这样的操作易于利用工具得到，例如一次性使用的吸管。

在水性溶液中最经常发生生物和生化反应。在本发明的上下文中，“水性液体”是包含溶剂的液体，其可以与水混合。最常用的水性液体仅仅包括水作为溶剂，但是也可存在某些操作溶剂，例如甲醇、乙醇、丙醇、DMSO、甘油等。通常该水性液体还可含有盐和缓冲成分，例如，NaCl、磷酸盐，以及营养物质或其他成分，例如溶解的氧气(O₂)、二氧化碳(CO₂)、葡萄糖、维生素、代谢产物、特殊的蛋白质或酶等。用于IVF过程中的适当介质为本领域所公知，如可从MediCult A/S(于厄灵，丹麦)得到的所示。

与水性液体相反，“水不混溶性液体”包含不能与水混合或溶于水的成分。这些成分可以是生物来源的油或脂肪，例如植物油等，或矿物油或合成的油，例如石蜡油。水不混溶性液体优选包括石蜡油。水不混溶性液体通常具有比水低的密度，从而当该液体放到水性液体之上时，会形成两相的系统，其中该水不混溶性液体层在水性液体的顶上。水不混溶性液体的用量应足以完全覆盖所述水性液体与周围环境空气交界的表面。当完全覆盖水性液体的表面时，水不混溶性液体与生物反应器平台的基底限定的腔室的外周接触。在此情况下，可以说该水不混溶性液体为所述腔室提供了封闭物。水不混溶性液体层的适宜厚度介于0.5至3mm之间，例如1mm和2mm之间，例如约1mm或约2mm。

“封闭物”是指水不混溶性液体将防止水性液体或其中其他成分从所述腔室的挥发，例如CO₂，并进一步防止颗粒进入该水性液体，例如微生物病菌或病原体。在腔室中的水性液体上形成的水不混溶性液体形成的封闭物的一个重要特征是气体可通过该水不混溶性液体扩散。因此，例如，气体(例如CO₂)的扩散方向将取决于腔室之上的空气中所述气体的压力和所述水性液体中该气体的浓度。所以，水性液体的pH可通过调节该腔室之上CO₂的压力来控制。例如，通过提高CO₂压力，CO₂将被压入水性液体中并降低pH；同样，CO₂低压力将导致CO₂的蒸发，从而升高pH。另外，该封闭物可作为热绝缘层，其可促进该腔室中水性液体的恒定温度的保持，例如37℃。但是，水不混溶性液体提供的封闭物不会阻碍操作员对所述腔室内容物的物理进入。所以，操作员可用如移液器穿透水不混溶性液体并达到对该腔室的进入。在去除移液器之后，该水不混溶性液体将再次形成封闭物。

在本发明的上下文中，术语“中等尺寸”意在涵盖一定范围的大小，其中最小的通道尺寸在约100μm至约3mm范围内，虽然这些通道也可包含颈缩。相似地，所述培养腔室可以具有约500μm至约5mm或更大的深度，最大的水平尺寸可以为从约1mm至约50mm。在一个实施方式中，与水平面相对的腔室中水性液体的上表面在不同水平处。这会反映到相对于包含这些腔室的基底的上表面的这些腔室的深度上。储存器的大小必须足以在整个培养过程中给培养在灌注条件下的细胞供应适当的培养基。当目的是能够在培养腔室中物理操作细胞时，以及目的是能够基于细胞的来源快速地定位包含细胞如胚胎的单个位置时，中等尺寸范围的生物反应器系统使用起来特别方便。此外，一般可以说，中等尺寸流体系统中的流体会在层式条件下流动，只要系统中包含的流体在层式条件下流动，不同于上述的具有通道或腔室的流体系统也可被称为“中等尺寸”。

在中等尺寸和更小尺寸，由于流体穿过通道移动产生的压差可变得非常显著，对于牛顿流体，这种压差可以从Hagen-Poiseuille(哈根-泊肃叶)方程式来估算：

$\mathrm{\ΔP}=\frac{\mathrm{\Δx}8\mathrm{\μQ}}{\mathrm{\π}{r}^4}$

此处ΔP是沿半径为r的通道长度Δx的压差，通道中的流体的动力学粘度为μ，该流体以体积流速Q流动。所以，从该方程式，对于给定的通道，可定义一个流速抵抗参数Δx/r⁴。

在某个实施方式中，培养腔室的最大水平尺寸在约2至约6mm范围内。在另一个实施方式中，培养腔室的最大水平尺寸在约20至约30mm范围内。在本发明的中等尺寸生物反应器中通常使用的流速范围内，液体基本以层式流的方式移动。

本发明的生物反应器平台适于在灌注条件下运行，而且可在本发明的方法中使用下面所列出的条件。上下文中术语“灌注”是指一般的连续流被应用于设备的培养腔室。该连续流不局限于某一流速，而在使用本发明的生物反应器平台的实验过程期间可使用几种不同的流速。虽然也可使用更低的流速，但适合的流速为约1μL/h至约200ìL/min或更多。流可以以脉冲产生；以少量脉冲，以每次脉冲小体积，如0.5μL、1μL等的如1、2、3或至多10次脉冲，每次时间间隔为如每分钟或每小时，如每小时1μL的1次1μL的脉冲，在实践中，该流以连续流进行。应该强调的是，如有必要所述的流也可被停止，例如用于进行涉及培养腔室内容物的各种操作。此外，还要考虑使生物细胞静置的中间操作。

比起常规的具有向上封闭腔室、可选地连接到外部液体储存器的流体系统，用于为灌注操作设计的生物反应器平台中的向上开口的腔室或者涉及从该腔室的流出或向该腔室的流入的腔室提出了一种挑战。在封闭的腔室中液体的行为容易预测，因为液体只能通过与该腔室连通的任何通道或导管离开腔室。相反，与通道连通的向上开口的腔室允许腔室中的液体通过该通道或容纳该腔室的基底所限定的腔室上表面离开腔室。开放的性质使其必需更加仔细地考虑流体连通中腔室之间的压力差，以保证对腔室之间流体流的控制。

现在发明人发现，水不混溶性液体层能够用于在生物反应器平台的向上开口的腔室上形成封闭物，以将腔室的内容物与周围环境的污染物分离开，以防止腔室中水性液体的蒸发和污染。本发明一个实施方式的中等尺寸生物反应器平台的腔室示于图2中。因此，本发明包括具有用于生物细胞的向上开口腔室1的中等尺寸生物反应器平台，该腔室通过第一端口22与第一通道32连通，第一通道32用于将液体的流入流导入腔室1中，其中腔室1提供有包括水不混溶性液体4的封闭物。腔室1还包括第二端口21，第二端口21与第二通道31连通，第二通道31用于从腔室1流出的液体的流出流。腔室1可在基底5中形成，基底5限定腔室1的底表面51和侧壁52，该基底具有上表面53。腔室1可进一步包括形成下层相的水性液体6，其中水不混溶性液体4形成上层相，其中下层水相覆盖第一端口22和第二端口21。腔室的底部还可以包括凹陷54，以在培养过程中保持生物细胞61。

另一方面，本发明涉及改变腔室内容物与环境相互作用的方法，例如将中等尺寸生物反应器平台中腔室的内容物与周围环境的污染物分离。当腔室仅仅具有单独一个出口时，例如对于如图1所述的液体储存器，水性液体6被施加到容纳腔室1的中等尺寸生物反应器平台的向上开口的腔室1上，从而使得水性液体6覆盖端口21；然后将密度小于水的水不混溶性液体4施加到腔室1中的水性液体6上，以形成下层水相和包含水不混溶性液体4的上层相；然后诱导水性液体6的流从腔室1进入通道31，以形成流出流。在如图2所示的本发明一个实施方式中，描述了使用水不混溶性液体作为腔室1的封闭物的方法，腔室1包括第一通道32和第二通道31，第一通道32与腔室1通过第一端口22连接，第二通道31与该腔室通过第二端口21连接。此处，在施加水不混溶性液体4到腔室1中的水性液体6上之前，施加水性液体6，使其覆盖第一端口22和第二端口21，以形成下层水相和上层水不混溶性相。然后诱导水性液体6流通过所述第一通道32流入所述腔室1中，和诱导水性液体6流通过所述第二通道31从所述腔室1流出。

优选控制在具有水不混溶性液体4的向上开口的腔室1上方的气体如CO₂的部分分压。也可控制O₂的分压。相对于源自腔室中水性液体的气体的压力，控制水不混溶性液体4上方的气体的压力，以控制气体扩散入该水性液体中，或从该水性液体扩散出来。所以，当腔室上方的气体压力高于来自腔室中液体的气体压力时，该压力梯度会驱动该气体扩散到该液体中。通过控制CO₂的压力，从而可能控制腔室中水性液体的pH，因为CO₂浓度的升高会导致pH的下降。上方开口的腔室1上方的气体可以是空气，或者也可以是预混了例如2-10％CO₂，优选5％CO₂的空气，和/或可以是含有2-20％O₂的三种成分的气体(trigas)。

水不混溶性液体4也可在施加水性液体6之前施加到腔室。水性液体6的较高密度会保证形成两相系统，水不混溶性液体4在水性液体6顶上形成覆盖层，而且适当地水性液体6会覆盖端口21和22。现在水不混溶性液体4会形成腔室1上所需的封闭物。

在其最简单的形式中，仅仅具有单个通道31，通道31用于流出流或流入流，通过对水不混溶性液体4表面上施加正向的相对压力(如图1中的三角所示)，水性液体的流可从腔室1诱导进入通道31，从而经由通道31将该水性液体推出腔室1。同样，负向相对压力可形成经由通道31的流入流。施加到水不混溶性液体4的压力应该相对通道31的压降来考虑，该压降从例如上述哈根-泊肃叶方程式估算。也可通过对通道31施加负向相对压力诱导流。这样的负向相对压力可借助泵(未显示)来提供，泵可以与包括腔室1和通道31的生物反应器平台集成，或者泵可位于外部。

与这种简单形式相反，具有开放的腔室1和用于进入腔室1的液体流入流的通道32和从腔室1流出的流出流的通道31的流体系统，例如本发明的中等尺寸生物反应器平台，有三种不同的途径供液体流经：通道31和32和穿过限定腔室1的开放部分的表面。这意味着，在腔室1中要保持基本恒定的液体水平的稳定状态可能是一种挑战，即，保证经由通道31离开该腔室的液体量等于经由通道32进入腔室1的液体量。在该实施方式中，可以通过对通道32施加正向的相对压力和对通道31施加负向的相对压力诱导流，而且一直要考虑到施加到腔室1中水不混溶性液体4表面上的外部压力。例如，可以通过在通道31、32具有液体置换功能(例如泵)以使得液流可以控制来提供稳定状态。

还可以通过对流入流的通道32施加正向相对压力或对流出流的通道31施加负向相对压力来诱导水性液体流动。当仅仅使用单独的液体置换功能时，水不混溶性液体4、基底5和周围的空气之间的界面相互作用是要考虑的参数。具体而言，水不混溶性液体4和基底5的侧壁52之间的相互作用是重要的。一般来讲，可以说侧壁52的表面特征会决定水不混溶性液体4的弯月面形状。当腔室1的侧壁52是亲油的(或疏水的)时，弯月面是凹的，如图2a所示；相反，疏油的(或亲水的)侧壁52会导致凸弯月面的形成，如图2b所示。在操作的相关尺寸(即，腔室直径在1mm和50mm之间，例如约2.5mm、约8mm、约12mm、约14mm、约25mm等)，发明人发现水不混溶性液体4和基底5的侧壁52之间的粘附与水不混溶性液体4与周围空气的表面张力的组合力可为经由向上开口的腔室1开放表面的流出流提供足够的阻力。所以，当从通道32用正向相对压力将水性液体6扩散到腔室1中来形成水性液体6的液流时，水不混溶性液体4提供的封闭物被水不混溶性液体4和侧壁52的粘性与水不混溶性液体4和周围空气的表面张力保持在原位，从而该液体基本上仅仅经由通道31扩散出腔室1。当侧壁52是亲油的时，这种效应特别显著。

在一个实施方式中，水不混溶性液体层4的厚度(用从水性液体上表面到凹弯月面表面底部或凸弯月面表面顶部的距离表示)在0.5至3mm之间，例如约1mm或约2mm。该层的厚度一般不依赖于包括该水不混溶性液体4的腔室直径。

在本发明的腔室1的另一个实施方式中，围绕腔室1周边的基底5的上表面53是疏油的或超疏油的。这会通过防止水不混溶性液体4在基底上表面53上的铺展而增加水不混溶性液体4提供的封闭物的有效性。所以，疏油或超疏油周边会使其能量上有利于水不混溶性液体4不铺展，而是保持凸起的形状，从而最大化水不混溶性液体4的封闭能力。不同实施方式的特征可以自由结合，因此疏油或超疏油周边可以与液体置换功能一起用于通道31和32。

在本发明的另一个实施方式中，中等尺寸生物反应器平台8包括两个或更多个如上所述的腔室。在这个实施方式中，第一腔室或储存器11与第二腔室或培养腔室12经由通道31流体连通，通道31用来将液体的流出流从第一个腔室导出。该生物反应器平台进一步包括废物容器7，其中至少一个通道，例如腔室12的通道31’与废物容器7流体连通。在一个实施方式中，中等尺寸生物反应器平台8进一步包括提供液体驱动力的装置(未显示)，来经由通道31、31’中的一个或多个从腔室中的一个将液体移动至腔室中的另一个和/或废物容器7。提供液体驱动力的装置可集成到生物反应器平台8中，或在生物反应器平台8外部。

生物反应器平台的基底5能与控制单元(未显示)形成基本不透气的连接，所以可以控制水不混溶性液体4表面上方的气压。此外，控制单元也可构建为形成与基底5的不透气连接，从而可以独立控制分开的腔室11、12，可选的腔室7的水不混溶性液体4上方的气压。在一个实施方式中，作为培养基或缓冲液储存器的腔室上方的气压可各个储存器腔室独立控制。在另一个实施方式中，废物容器7上方的压力也可独立控制。腔室上方的气压可以借助泵来控制，或者控制单元可包括具有活塞的圆柱形腔室，提供注射器的功能，以控制压力。

腔室压力也可通过分别加入或移出水不混溶性液体从而改变水不混溶性液体4的质量来升高或降低。

提供液体驱动力的适宜外部泵可以是蠕动泵、活塞泵、注射泵、膜式泵、隔膜泵、齿轮泵、微环齿轮泵(microannular gear pump)或任何其他适宜类型的泵。集成的泵可以是蠕动泵、活塞泵、电解产生的气体驱动的泵或其他类型的泵。中等尺寸生物反应器平台也可包括阀，例如单向阀，以协助指引流经过该中等尺寸生物反应器。

也可用重力驱动流提供液体驱动力。在该实施方式中，如图3所示，腔室11、12和废物容器7包括水性液体6，其中第一腔室11中水性液体6上表面相对于水平面A的水平h₁高于第二腔室12中水性液体6上表面相对于水平面A的水平h₂。腔室11、12中水不混溶性液体层4的上表面水平应跟随同样的模式。当也存在废物容器7时，其水性液体6的表面应在更低的水平h₃。水性液体6的密度以及水不混溶性液体4的质量/密度与液体上表面的不同高度和重力的驱动力组合，形成了经由通道31移动腔室11中水性液体4至腔室12、和可选地经由通道31’从这些腔室再移动至废物容器7的驱动力。只要腔室11、12和可选的废物容器7之间的压力差高于由于液流在通道31、31’中的阻力引起的压降，水性液体6就能从腔室11流到12和可选的废物容器7。可以进一步通过从废物容器7吸走液体来控制这种重力驱动流。

可进一步通过对腔室11和/或废物容器7施加外部的、正向或负向的相对压力来控制水性液体6的流动。例如，腔室11位置处的生物反应器平台的基底可允许围绕腔室11周边与控制单元基本不透气的连接，从而可以控制腔室11中水不混溶性液体上方的压力，例如提高该压力来将水性液体6扩散到通道31和腔室12中。如上所述，腔室12中水不混溶性液体4的保持能力始终用来防止水性液体6经由向上开放的表面的向外流。中等尺寸生物反应器平台的这个实施方式也可包括集成的或外部的泵，而且通道可以提供有阀。例如，通道31中的单向阀会防止水性液体6从腔室12回流至腔室11。

在优选的实施方式中，中等尺寸生物反应器平台包括两个储存器腔室、一个或多个培养腔室和废物容器。将泵(例如活塞泵)与废物容器中的液体流体连通，从而可通过用泵从废物容器中吸走液体来在中等尺寸生物反应器平台中产生液流。通过在储存器腔室上形成不透气的连接，即阻断气体或空气流入储存器腔室中，控制从储存器腔室进入培养腔室中的流动。所以，可以通过阻断空气流入一个储存器腔室，来控制液流从另一个储存器流入培养腔室。中等尺寸生物反应器平台也可包括多于两个储存器腔室，可以单独而且独立地阻断空气流进入这些储存器腔室。

生物反应器平台也可包括多个腔室；例如生物反应器平台可以包括一定数量，例如2、3或更多个用于不同培养基的储存器腔室，这多个腔室可与单个培养腔室流体连通，从而可以从单个储存器腔室或从来自多于一个储存器腔室的组合培养基成分将不同的培养基成分供应给该培养腔室中的生物细胞。

本发明的中等尺寸生物反应器平台不限于培养细胞的单个腔室。实际上，在一些实施方式中，生物反应器平台包括几个这样的培养腔室，例如10-20个培养腔室。这些培养腔室可以以一组或多组串联的培养腔室排列。每个组可以与作为储存器的腔室并联连接。所以，该平台可包含单个培养腔室、单独串联连接的多个培养腔室、并联连接的多个培养腔室或多组串联连接的培养腔室，其中各个组并联连接。

没有中等尺寸生物反应器平台实施方式会包括腔室11、12中每一个中水不混溶性液体4之间的任何直接接触。对于每个腔室11或12，水不混溶性液体4会与另一个腔室上的水不混溶性液体4分离，所以，可以说水不混溶性液体4能够独立作为各个腔室上的封闭物。但是，当中等尺寸生物反应器平台使用多个培养腔室时，该生物反应器平台可以设计为使得这些培养腔室共用单个水不混溶性液体形成的封闭物。在图4中所示的实施方式中，在五个培养腔室12a-e上形成水不混溶性液体层4。水不混溶性液体4由侧壁52a限定，从而很好地限定了水不混溶性液体4的横切面面积和高度。如上所述，当生物反应器平台8使用虹吸作用作为液体驱动力时，这会特别有利，虽然也可用其他原理提供这种液体驱动力。同样，生物反应器平台8不限于图4中腔室12a-e所示的串联连接的培养腔室；这些培养腔室也可并联连接，或生物反应器平台可包括成组的串联连接的腔室，这些组之间并联连接。当几个培养腔室共用水不混溶性液体4形成的单个封闭物时，重要的是封闭这些培养腔室的水不混溶性液体4不与封闭储存器腔室11的水不混溶性液体4接触，但是腔室11和12之间的液体转移分别经由通道通过水性液体6传输。

本发明的中等尺寸生物反应器平台特别适用于IVF过程。同样，使用水不混溶性液体作为中等尺寸生物反应器平台中腔室的封闭物来分离中等尺寸生物反应器中腔室内容物的方法适用于IVF过程。所以，一方面，本发明涉及培养生物细胞的方法，该生物细胞优选是与IVF过程相关的生物细胞，例如精子、卵母细胞、胚胎等。这些细胞优选是人来源的细胞，虽然来自其他哺乳动物的这些类型的细胞也落入本发明的范围内。

典型的IVF过程涉及本发明的生物反应器平台的使用。在这种情况下，该生物反应器平台可包含多个作为储存器的腔室，用于不同的培养基。储存器通常是具有流出物通道但是不包含流入物流通道的腔室，直接连接到培养腔室，或者储存器腔室可以通过岐管连接到培养腔室，来自几个储存器腔室的流出物通道连接到该岐管上。用于IVF过程的本发明的生物反应器平台通常具有两个或更多个储存器腔室。每个储存器腔室在其水性培养基上用覆盖层匹配，该覆盖层是作为储存器腔室封闭物的水不混溶性液体。但是生物反应器平台也可仅仅包括一个储存器腔室。

相反，通常培养腔室会既具有流入通道又具有流出通道，所以可以从储存器提供新鲜的培养基至该培养腔室，而且用过的培养基可以从该培养腔室通过流出通道去除，流出通道接下来会与废物容器流体连通。对于储存器，培养腔室会含有在该腔室中的水性液体上形成保护性封闭物的水不混溶性液体。

通常废物容器会与生物反应器平台集成，而且像储存器腔室和培养腔室一样，通常包括水不混溶性液体，虽然在一些实施方式中，废物容器不包括水不混溶性液体。废物容器也可位于生物反应器平台的外部，流出流经由生物反应器平台上的通道，也可能是外部的管道，从培养腔室被导向该废物容器。

对于IVF过程，可以在填满储存器和培养腔室之后施加该水不混溶性液体。但是，还可以在对储存器和培养腔室施加水不混溶性液体之后，对该平台施加水性培养基。例如，最初储存器可包含水不混溶性液体，然后可用例如安装有皮下注射针头的注射器将适当的培养基注入储存器中水不混溶性液体之下，以使得储存器腔室的端口用水性培养基覆盖。然后可以通过向储存器腔室中的水不混溶性液体上表面施加压力，提供进入培养腔室的培养基流。这会促使该水性培养基经由流出通道进入培养腔室，在那里该水性培养基将取代水不混溶性液体(如果存在的话)，并覆盖培养腔室的流出通道的端口。如果存在水不混溶性液体，则会形成想要的两相系统。否则，水不混溶性液体可以后续施加，例如用移液器覆盖。

一旦培养腔室被培养基充满，并布置有形成封闭物的水不混溶性液体，就可以把适宜的细胞放到该培养腔室中。例如，借助工具将受精的卵母细胞放到腔室中，例如移液器或皮下注射器针头。中等尺寸生物反应器平台也可用于使未受精的卵母细胞受精。为此目的，储存器可包括纯化或未纯化的精子，或用于从卵母细胞除去卵丘的透明质酸酶。培养腔室可在腔室的底部表面装配一种或多个凹陷，其中每个凹陷用于保持单个受精的卵母细胞，从而可以在该腔室中同时培养多个胚胎。这允许相同来源的多个细胞在同一个培养腔室中分开培养。例如，每个凹陷可包括来自同一个患者的一个胚胎。培养腔室的底部也可是圆锥形的，从而生物细胞或胚胎会定位到该锥体的最下面部分。一旦受精的卵母细胞在培养腔室中的适当位置，然后就会用来自一个或多个储存器的适宜的生长培养基灌注。对于受精的卵母细胞，培养阶段会持续几天，例如三天或更长时间，虽然也可适宜更长的培养接段，但是通常最多5天。储存器应该足够大，以在整个培养阶段，用适宜的培养基以相对流速供应培养腔室。

培养腔室中包含的细胞通常存在于具有水性液体的下层。除了防止水相中从生长培养基的蒸发和最小化水性液体的生物污染之外，水不混溶性液体覆盖层也可用来最小化培养腔室中水性液体的灌注体积。特别是对于IVF过程，水不混溶性液体层的施加会通过防止CO₂的蒸发协助保持pH。

本发明的中等尺寸生物反应器平台的腔室不限于特定形状。然而，在优选的实施方式中，通常可将腔室的形状描述为具有基本圆形周长的圆柱形。此周长的直径可大于或小于圆柱体的高度。圆柱体的高度将通常跟随垂直轴。在一个实施方式中，圆柱形培养腔室的直径可为约2至约6mm，如约2.5mm或4mm，且在另一个实施方式中，其可为约20至约30mm，如约25mm。这些圆柱形培养室的深度可为约0.5至约2mm，如约1.5mm。储存器腔室和废物容器将通常具有比培养室更深的深度，通常约6mm。

在其它实施方案中，培养腔室可通常为盒形。此盒形可通常采用具有矩形边的平坦盒的形式，或此盒形状可接近立方体。在一个实施方式中，培养腔室可具有约5至约10mm的宽度，且长度至多为约50mm。此盒形培养室的深度可为约0.5至约2mm。

在一个实施方式中，本发明的中等尺寸生物反应器平台包含至多约2.5mm直径、约1.5mm深的12个圆柱形培养腔室，每个腔室具有可选的单个凹陷在其底部表面中，各个培养腔室的体积为约10μL或更小。在该实施方式中，培养腔室与储存器串联连接。

中等尺寸生物反应器平台的优选实施方式示于图5中。这个实施方式包括两个深6mm的储存器腔室11a和11b，其直径分别为14mm和12mm。两个流出通道31从各个储存器腔室11a和11b分别指向两个分离的岐管31a。从各个歧管，一个通道指向一系列的六个培养腔室12中的第一个，使得这两个各有六个的培养腔室12的组与储存器腔室11a、b并联连接。每个培养腔室12都具有2.5mm直径和1.5mm的深度。从这两个系列中每个最后一个培养腔室12，通道32指向废物容器7(直径7.9mm，深6mm)。培养腔室12以3×4的图案排列，该图案限定在25mm直径的圆中。对应于该25mm的圆，基底5用内壁52a限定4.5mm高的壁。内表面52a进一步限定了水不混溶性液体的壁，使得培养腔室12可分享由水不混溶性液体形成的单个封闭物。

在使用中，这两个储存器腔室11a和11b可用适宜的用于受精的卵母细胞的生长培养基充满，培养腔室12用来自适当的储存器11a或11b中的第一个的生长培养基充满。然后将一层水不混溶性液体，例如石蜡油提供到各个储存器腔室11a、11b和内表面52a限定的培养腔室，以及可选的废物容器7。石蜡油层的厚度通常为约1mm至约2mm。在通过用来自储存器腔室11a、11b的生长培养基灌注培养腔室12来开始培养之前，受精的卵母细胞可放置到各培养腔室12的各个可选的凹陷中。灌注来自一个储存器腔室，或者来自两个储存器腔室11a、11b的培养基可以适当比例组合。在整个培养过程中，储存器11a、11b中的液体水平可高于培养腔室12中的水不混溶性液体的上表面，培养腔室12中的水不混溶性液体的上表面又高于废物容器7的液体水平。但是，在培养阶段的后期，当大部分或所有的培养基都已经用过时，废物容器7中的液体水平可达到甚至超过储存器腔室11a、11b的液体水平；在这种情况下，液体可以利用外部放置的泵的抽吸从废物容器移除。还可以提高储存器腔室11a、11b上方的压力，来防止液流方向逆转。

在另一个实施方式中，本发明的中等尺寸生物反应器平台包含一个约20-40mm直径的圆柱形培养腔室。在该实施方式中，培养腔室具有8-20个凹陷。

培养腔室的内表面可以是平滑的或粗糙的，虽然对于某些应用，培养腔室可以适用于支架支撑的细胞生长。这样的支架可以是构成培养腔室的部分材料，或者以可插入的印痕(imprint)形式提供。可对该支架塑形，以模拟生物发生界面，而且可涉及物理刻印的图案，或具有亲水和疏水位置的改变的图案的图案，或这两种的组合。在又一个实施方式中，该支架可以是用适于细胞结合的物质化学功能化的，例如蛋白质、带电荷的基团、细胞、细胞碎片等。

当在培养腔室中存在凹陷时，这些凹陷通常为圆柱形，其水平尺寸和垂直尺寸相似。这些尺寸通常为约500μm。凹陷适于保持一个或多个哺乳动物细胞。其特别适于保持受精的卵母细胞。所以，在培养胚胎之前，可用例如移液器或皮下注射针头放置受精或未受精的卵母细胞于培养腔室中的凹陷中。只要存在一个凹陷，通常它就会位于培养腔室底表面的中间位置。如果存在多于一个的凹陷，这些凹陷可沿着底表面中的一条线排列，或者以一种合适的图案布置，例如由矩形、三角形或六角形单元的筛中的交叉点决定，或类似于蜘蛛网的筛中的交叉点，或沿着同心圆的周长布置。

中等尺寸生物反应器平台的这些流体结构，即通道和可选的岐管，也可进一步包括混合部分，其通常位于储存器腔室和培养腔室之间。所以，来自两个或多个储存器腔室的流体流可在该流体达到培养腔室之前混合。这样的混合部分可包括通道部分内表面上的内部结构，例如鲱骨式构造或混杂混合器，或者其可包括长度部分元件(length contributing element)，例如弯曲通道或涡形通道，使液体通过扩散混合。该平台还可包括岐管或类似结构，将来自储存器腔室的液流分至多个通道中。也可选择生物反应器平台中通道的长度以控制通道的流动阻力，如上所述。

作为本发明的中等尺寸生物反应器平台的储存器的腔室通常具有大于培养腔室的体积。在优选的实施方式中，储存器腔室的体积为培养腔室体积的至少10倍。在另一个优选的实施方式中，储存器腔室的体积为培养腔室体积的至少20倍。

中等尺寸生物反应器平台的储存器腔室可以是圆柱形的形式，在一个实施方式中，为与培养腔室相比足够高的腔室，例如6mm，从而水性培养基液体的上表面可以在比培养腔室中水性液体上表面更高的水平上。圆柱体的底部可具有平坦表面，或者该表面可以是圆锥形或漏斗形状，其可以是水坑(sloped)或组合了上述特征的更复杂的形状。

在一个实施方式中，中等尺寸生物反应器平台进一步安装有射频识别(RFID)-标签。RFID标签使其可以快速方便地识别生物反应器平台。当RFID标签中包含的信息与提供要在给定的生物反应器平台中培养的细胞的人的身份关联时，生物反应器平台的识别是有利的。

本发明的腔室优选在基底中形成，接下来又构成生物反应器平台。优选基底是一种或多种热塑性聚合物，例如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、环烯烃共聚物或聚苯乙烯(PS)，虽然也可以使用其他材料，例如玻璃、硅、金属、弹性聚合物或这些材料的组合。这些材料可以是透明的或半透明的。优选地，至少构成培养腔室底部的材料是透明的。进一步优选，基底材料具有通常亲水的表面，可以改性天然疏水材料的表面使其亲水。这样的改性可包括用氧等离子体处理该表面，用带电荷的或亲水的部分、携带例如正电荷或负电荷或亲水基团的适当硅烷分子的共价连接物对表面进行衍生化。这些方法也可组合使用，以保护形式提供相关部分也是必须的，以使其可以在连接之后通过去除保护基团得到所需的功能团。基底表面的化学修饰可用湿化学法进行，或用气相沉积法进行；这两种原理对本领域技术人员都是公知的。

在一个实施方式中，围绕本发明腔室周边的基底的上表面是疏油的或超疏油的。基底的疏油性可以用油滴和表面之间的接触角来表征。接触角被几何学限定为液体在液体、气体和固体交界的三相边界形成的内角。接触角值小于90°表明该液体在该固体表面上铺展开来，在这种情况下，该液体称为润湿该固体(这可定义为“亲油的”)。如果接触角大于90°，液体在固体表面倾向于形成液滴，称为呈现非润湿(或疏油的)行为。当接触角超过145°时，在本发明的上下文中，该特征被称为超疏油的。接触角超过120°通常需要该表面在用具有所需的物理化学功能团的适当部分包覆之前提供微尺寸的结构。微结构表面可包括随机或周期性的结构图案，不超过100μm大小，如上所述；这样的图案可用例如激光烧蚀、热模压、化学蚀刻或其他方法提供。取决于该微结构表面的物理-化学性质，化学衍生化该表面也是必须的。用全氟代部分对表面的功能化提供了超疏油的性质。例如，这样的基团可以以全氟代硅烷的形式提供，如本领域所公知，可用气相沉积过程涂覆到表面上。

本发明中等尺寸生物反应器平台的通道和腔室可通过将第一基底层与第二基底层连接来形成，所述第一基底层包括与通道和腔室对应的结构。因此，通过连接层中的基底在两个基底之间形成通道，且腔室可对应于层的厚度。中等尺寸生物反应器平台不限于两个基底层。在特定实施方式中，可使用多个基底，其中每个基底可包括与通道和腔室相适应的结构。可随后将层中的这些多个基底连接，以组装为中等尺寸生物反应器平台。

可使用任何适合的方法构建与基底中通道和腔室对应的结构。在优选的实施方式中，基底材料为热塑性聚合物，且适合的方法包括研磨、微研磨、钻孔、切割、激光烧蚀、热模压、注塑和微注塑。注塑和微注塑为优选的技术。这些和其它技术是本领域公知的。这些通道也使用适合的方法，如浇铸、模制、软平版印刷等在其它基底材料中构建。

基底材料可使用任何适合的方法连接。在优选的实施方式中，基底材料为热塑性聚合物，且适合的连接方法包括涂胶、溶剂粘合、夹紧、超声焊接和激光焊接。

示例

示例1，中等尺寸生物反应器平台的构建

由四层基底材料组成的原型中等尺寸生物反应器平台采用2D绘图软件Auto-CAD LT(Autodesk，圣拉斐尔，加利福尼亚州，美国)进行设计。该生物反应器平台设计含有两个直径16mm和深5mm(体积1mL)的圆柱形储存器，其通过两个通道与接合点联接。每个储存器具有使储存器与周围环境联接的通道。从接合点出来的通道使三个直径4mm和深1.5mm(体积约20μL)的培养腔室串联联接。每个培养腔室在底面中有直径约500μm和深约200μm的凹陷。从第三个培养腔室出来的排废通道通向周围环境。

生物反应器平台设计的底层为具有500μm直径的通孔和三个培养腔室凹陷的矩形板(尺寸5cmx8cm)。此板被设计与第二基底板(尺寸4.5cmx7.5cm)接合，第二基底板含有与培养腔室(直径4mm)相应的三个通孔和与上层中储存器位置相匹配的位置处的两个另外的通孔(直径500μm)。这两个直径500μm的孔分别与在接合点会合的通道(宽500μm)联接，形成从接合点至相应于培养腔室的第一个孔的通道(宽500μm)；此外通道与其它培养腔室孔联接，并且最终的通道被设计与底层中的通孔匹配(从而形成排废通道)。所有的通道被设计在第二层的底面中产生。第三层(尺寸4.5cmx2.5cm)仅含有两个与储存器相应的直径16mm的通孔。第四层(尺寸4.5cmx2.5cm)包含从与两个储存器中心相应位置至板的一个边的通道(宽500μm)。第四层的通道被设计在此板的底面中产生。

AutoCAD LT设计被用于使用Synrad Fenix(西澳菲尼克斯)标记CO2激光(Synrad有限公司，马基奥，华盛顿州，美国)将结构烧蚀到聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)基底中。透明的PMMA基底由

两合有限公司(Plexiglas XT20070，两合有限公司，达姆施塔特，德国)提供；含有储存器的层厚5mm，其它层厚1.5mm。烧蚀前将AutoCAD LT设计转换为封装的后脚本(post-script)文件并导入控制Synrad Fenix标记CO2激光的WinMark Pro软件中。用本领域技术人员公知的激光设置进行烧蚀。在80℃经适当的退火处理以用于防止PMMA基底应力开裂后，将三种最上面基底的底面用IR-吸收剂染料(Clear-Weld(清除-焊接)LD130，Gentex公司，卡尔代本，宾西法尼亚州，美国)染色。使用能产生高强的～800nm激光的FisbaFLS铁激光扫描器(Fisba Optik(眼光)AG，圣加仑，瑞士)将不同层焊接在一起。首先将第二基底层焊接至底部基底层，随后将第三和第四层焊接至增加的叠层。焊接期间，采用由对激光透明的玻璃制成的虎钳对基底适当加压。有效焊接的最佳激光设置为本领域技术人员所公知的。

这种原型中等尺寸生物反应器平台的三个培养腔室是开放的和可进入的，使得水不混溶性液体层可施加到这些腔室的水性介质组合物中。

示例2，中等尺寸生物反应器平台的构建

除了用直径20mm的单一培养腔室(体积0.5mL)代替三个串联连接的培养腔室(在第二基底层中)外，按示例1中所述设计和构建中等尺寸生物反应器平台。此单一培养腔室的底部含有六个凹陷(直径大约500μm且深大约200μm)，它们被置于位于腔室中心的直径10mm的圆的周边上。

示例3，控制单元的构建

选择适当的聚合材料盒来构建用于容纳中等尺寸生物反应器平台的原型控制单元。盒子尺寸为约16×24×12cm³。盒子装配有由用于容纳铝块体(约10×7×2cm³)(其作为热调节元件起作用)的更小的盒子组成的隔室，以及示例1或示例2中所述的任一中等尺寸生物反应器平台。铝块体被加工成刚好容纳生物反应器平台，并在它的与中等尺寸生物反应器平台出口相应的位置上钻孔(直径1mm)。扩大孔的开口以容纳橡胶O-环(内径(ID)1mm)，并且出口孔装有一根内径0.5mm的聚四氟乙烯管，其与微尺寸pH-电极联接，微尺寸pH-电极进一步与2mL注射泵联接。在一个可替换的设计中，出口孔连接到360μm直径的玻璃毛细管。pH-电极与传感器板联接，传感器板进一步与运行LabView(版本8，美国国家仪器，奥斯汀，德克萨斯州)的电脑联接。

将铝块体进一步加工以容纳珀耳帖元件，其与直流电供应相联接。将电子温度传感器集成入铝块体中。用于加热元件的电子控制和温度传感器都与传感器板联接。使用定制的LabView应用软件执行基于温度传感器中的输入来控制温度的模型预测控制(MPC)算法。

含有铝块体的隔室由具有可闭合盖子的透明塑料盒组成。此盒的底侧有直径约1cm的圆孔，其与能向隔室供应围绕铝块体的空气层流的空气供应系统联接。

原型控制单元盒进一步装备有两个注射泵，每个注射泵装有一根管(内径0.5mm的特氟龙管或360μm直径的玻璃毛细管)，其使得能够与生物反应器平台进气口联接，从而能够提供液体驱动力至液体储存器，以从所述储存器腔室分散水性液体至培养腔室中。

由LabView应用软件经传感器板对所有泵进行控制。

示例4，IVF-生物反应器平台的构建

设计并构建了包含两个储存器腔室11a、11b和12个培养腔室12的用于IVF过程的生物反应器平台8。该生物反应器平台的透视图示于图5a和5b，其中示出了各个储存器腔室11a、11b(直径分别为12mm和14mm，高6mm)如何具有指向两个分开的歧管31a的两个流出通道31。从各个歧管，通道指向一系列的六个培养腔室12中的第一个(每个均为直径2.5mm，深1.5mm)，所以，这两个各有六个的培养腔室12的组与储存器腔室11a、11b并联。从这两个系列中每个最后一个培养腔室，通道32指向废物容器7(直径7.9mm，深6mm)。生物反应器平台8的基底5限定了具有内表面52a的壁，用来限制在培养腔室12上的水不混溶性液体层(未示出)，使得这些培养腔室共享了由水不混溶性液体层提供的单个封闭物。52a限定的封闭腔(confinement)具有25mm直径和4.5mm深度。

由两个PMMA的“片”5a、5b构建生物反应器平台8，它们在激光焊接过程中被连接到一起。上基底5a由黑色PMMA注塑模制，并含有限定腔室11a、11b、7、12和通道的结构。通道在黑色PMMA基底的下表面中限定，腔室11a、11b、7、12基本限定为在上表面有“壁”的在基底中透过的“孔”。下层基底片5b为具有和上层基底片5a相同大小的透明的PMMA片。在对应于每个培养腔室12的位置，用激光消融在下层基底片5b中用CO₂激光形成凹陷。然后用激光扫描器将两个基底片5a、5b激光焊接到一起，从而在两个基底片之间形成通道，而且下层基底片5b为每个腔室11a、11b、7、12提供了透明的底部。

示例5，通过控制CO₂压力控制pH

设定实验来通过控制具有与水不混溶性层的培养腔室上方CO₂压力来检测对pH的控制。简言之，如上述示例中所解释的那样设计和构建系统。该系统包括单个的储存器腔室、培养腔室和废物容器；单个的通道将该储存器连接到上述培养腔室，和另一个的通道将培养腔室与废物容器连接。从培养腔室导向废物容器的通道包括一个加宽的部分，为pH电极提供空间。最初，储存器和培养腔室充满X-Vivo培养基(BioWhittaker，沃克斯维尔，马里兰州，美国)，然后将水不混溶性层(购自Sigma-Aldrich(西格玛-奥德里奇)有限公司的石蜡油)施加到每个腔室上。pH电极放置到样品端口中，进行一个为期15天的实验。在该阶段中，施加从储存器腔室经培养腔室到废物容器的1μ/h的流。

实验结果作为pH对时间的曲线示于图6中。在标记“a”的点，在生物反应器上向该系统施加空气中5％CO₂的供应，在标记“b”的点，气体供应变回到没有额外CO₂的空气。在标记“c”的时间点，pH探针回到校正的缓冲液中。覆盖曲线的盒指出了正常生理pH范围7.36-7.48。

从该实验可知，有可能通过在腔室上方提供包含在空气中的5％CO₂来降低具有石蜡油覆盖层的水性液体的pH。在使用不含CO₂的空气时，pH快速升高，因此包含石蜡油层的封闭物和控制CO₂压力的组合应用使得该方法可以将pH保持在生理范围内。

在该实验中进一步观察到，腔室中水性液体的水平仅仅由于腔室之间经由通道的液体转移而改变。换句话说，任何腔室中都基本没有溶剂的挥发。

示例6，系统中的细胞培养

加工两块铝块以在适宜尺寸的外壳中在这两个块体之间容纳示例4的中等尺寸生物反应器或平台。

加工上层铝块体以容纳生物反应器平台，在上层块体中对应于该生物反应器平台的废物容器位置的位置中钻一孔(直径1mm)。扩展孔的开口，以容纳橡胶O-环(1mm内径)，该出口孔与一根360μm直径的玻璃毛细管相匹配，该玻璃毛细管连接到上层铝块体下表面中隔室里的pH电极上，以限定样品端口。样品端口进一步连接到2ml的注射器泵上。pH电极连接到传感器板上，传感器板进一步连接到运行LabView(版本8，美国国家仪器，奥斯汀，德克萨斯州)的电脑上。

加工下层铝块体以容纳加热线圈，其与直流电供应相联接。将电子温度传感器集成到这个铝块体中。用于加热元件的电子控制和温度传感器都与传感器板联接。用MPC控制块体的温度。下层铝块体进一步包括层式气流供应。这由具有水平缝隙(高1mm，宽30mm)的管组成，该缝隙位于对应于具有培养腔室的生物反应器平台末端，以在培养腔室上方引入宽度与腔室宽度相似的水平层式气流。该管具有入口点(位于上层铝块体的外表面)，该入口点用来连接到空气供应，例如含5％CO₂的空气。在可替换的设计中，该系统使用了集成的气体混合器。

这两个铝块体通过铰合机构互相连附到一起，从而该中等尺寸生物反应器平台能够放到下层块体的温度调节元件上。通过封闭该铰合机构，上层铝块体中的该特氟龙管可插入到中等尺寸生物反应器平台上的连接腔室中，从而形成将来自培养腔室的液体引导到样品端口的连接。

由LabView应用软件经传感器板对所有泵进行控制。

使用中，生物反应器平台的培养基储存器填充有胚泡培养用的生长培养基(分别为培养基“A”和“B”)，并用培养基A预处理细胞培养腔室。然后将石蜡油层施加到各个向上开口的腔室上，并将平台放到铝容器中。系统温度设定为37℃，含5％CO₂的空气流以大约1L/h的速度施加到空气供应系统，以平衡生物反应器平台中的生长培养基，并提供在腔室的开放表面上方的层式空气流。

在接下来的一天，将一个受精后的卵母细胞放到各个培养腔室中，关闭细胞培养系统。7.5μL/h的流提供到培养腔室中，以供应新鲜培养基，并去除代谢废物。每1.5小时将15μL的废物流引至样品端口，并测量pH。用LabView应用软件表示的数据加工单元监测培养过程的进展并记录pH和温度。MPC算法用来将温度控制在37℃，通过经由空气供应调节含CO₂空气流来以相似的算法保证pH保持在7.25至7.45。

该细胞培养过程持续3天，根据预定的程序控制培养基的成分，即A和B培养基的比例。还用该系统进行了持续5天的细胞培养过程。

Claims (21)

1.一种中等尺寸的生物反应器平台，包括用于生物细胞的向上开口的腔室，所述腔室通过第一端口与传导进入所述腔室的液体的流入流的第一通道连通，并通过第二端口与传导从所述腔室流出的液体的流出流的第二通道连通，所述腔室具有包含水不混溶性液体的封闭物，并且其中所述第一通道与液体储存器流体连通，所述第二通道与废物容器流体连通。

2.根据权利要求1所述的中等尺寸生物反应器平台，其中用于生物细胞的所述腔室进一步包括形成下层相的水性液体，其中所述水不混溶性液体形成上层相，并且其中下层的水相覆盖所述第一端口和所述第二端口。

3.根据权利要求2所述的中等尺寸生物反应器平台，其中用于生物细胞的所述腔室用所述水性液体灌注。

4.根据权利要求3所述的中等尺寸生物反应器平台，其中用于生物细胞的所述腔室中的所述水性液体的水平处于稳定状态。

5.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述腔室在基底中形成，所述基底限定所述腔室的底表面和侧壁，所述基底具有上表面，其中围绕所述腔室的周边的所述上表面是疏油的或超疏油的，以防止所述水不混溶性液体铺展到所述基底的所述上表面上。

6.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述液体储存器和/或所述废物容器是向上开口的腔室。

7.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸的生物反应器平台，其中用于生物细胞的所述腔室在所述底表面包括凹陷以保持所述生物细胞。

8.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸的生物反应器平台，包括两个或更多个用于生物细胞的腔室。

9.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸的生物反应器平台，包括两个或更多个储存器，其中每个储存器通过通道与用于生物细胞的所述腔室流体连通。

10.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸的生物反应器平台，进一步包括提供液体驱动力的装置，以将液体通过所述第一通道移动入用于生物细胞的所述腔室中，和/或通过所述第二通道将液体从用于生物细胞的所述腔室移出。

11.根据权利要求10所述的中等尺寸的生物反应器平台，其中提供液体驱动力的所述装置选自：用集成的或外部的泵将液体扩散至腔室中或从腔室吸出；对腔室中的液体的上表面施加正向相对压力；对腔室中的液体的上表面施加负向相对压力；相对于水平面，调节第一腔室中的液体的上表面的水平至比第二腔室中液体的上表面水平更高的水平；或这些的组合。

12.根据权利要求10或11所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述腔室包含水性液体，并且其中第一腔室中所述水性液体的上表面相对于水平面的水平高于第二腔室中所述水性液体的上表面相对于水平面的水平。

13.根据前述任一项权利要求所述的中等尺寸生物反应器平台，其中所述储存器的体积是用于生物细胞的所述腔室体积的至少10倍大。

14.一种改变腔室中内容物与环境的相互作用的方法，包括步骤：

提供根据权利要求1-13中任一项所述的中等尺寸生物反应器平台；

对所述中等尺寸生物反应器平台的所述腔室施加水性液体，以使得所述水性液体覆盖所述第一端口和所述第二端口；

在所述腔室的所述水性液体上施加密度小于水密度的水不混溶性液体，以形成下层的水相和包含所述水不混溶性液体的上层相；

诱导水性液体流通过所述第一通道流入所述腔室中，和诱导水性液体流通过所述第二通道从所述腔室流出。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述腔室中的所述水性液体的水平保持在稳定状态。

16.根据权利要求14或15所述的方法，进一步包括步骤：

相对于所述腔室中源于所述水性液体的气体的压力，控制所述腔室上的气体压力，以控制所述气体向所述水性液体的扩散进入或从所述水性液体的向外扩散。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述气体为CO₂或O₂。

18.一种培养生物细胞的方法，包括步骤：

提供根据权利要求1-13中任一项所述的中等尺寸生物反应器平台；

将所述生物细胞放置在用于生物细胞的所述腔室中；以及

用水性液体灌注所述细胞。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述生物细胞为哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞或昆虫细胞。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为精子、卵母细胞、胚胎、干细胞、单核细胞、树突细胞或T细胞。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中培养所述细胞三天或更长时间。

Images