CN107427315A - 体外胚胎的生殖和选择 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于体外受精的卵子和/或精子的改善的监测、测试和/或培养的方法。还描述了在体外植入前选择过程中胚胎的改善的监测、测试和/或培养的方法。卵子、精子或胚胎可以来自野生动物或动物园动物。卵子、精子或胚胎可以是哺乳动物(诸如人类、牛科、猪科、绵羊科、山羊科、马科、犬科、猫科、鼠科等)的卵子、精子或胚胎。

Description

体外胚胎的生殖和选择

背景技术

对于很多人来说，不孕是一个严重的问题。在无法可存活受孕以及以高风险产生无法接受的高比率多胞胎方面，体外受精往往不能成功。能够获得高概率的成功单体植入的植入前选择胚胎的方法将是非常有利的。

发明内容

本发明的一些实施例涉及在离体植入前选择期间胚胎的改善的监测、测试和/或培养。在这种实施例中，可以监测来自单个胚胎或一组胚胎的形态、内部标记、表面标记和/或分泌物。胚胎可以是动物胚胎，诸如家畜胚胎或来自野生动物或动物园中动物的胚胎。胚胎可以是哺乳动物胚胎，例如人类、牛科、猪科、绵羊科、山羊科、马科、犬科、猫科、鼠科的胚胎等。

本发明的一些实施例涉及用于体外受精的卵子和/或精子的改善的监测、测试和/或培养。在一些实施例中，可以监测来自单个卵子或一组卵子的形态、内部标记、表面标记和/或分泌物。在一些实施例中，可以监测来自单个精子或一组精子的形态、内部标记、表面标记、分泌物和/或运动性。可以从一种或多种动物(例如家畜、野生动物和/或动物园中的动物)获得卵子和精子。可以从哺乳动物(诸如人、牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、鼠等)获得卵子和精子。

本发明的一些实施例涉及允许从一组胚胎中选择能够产生可存活受孕的胚胎的装置。一些相关实施例涉及促进卵子的受精和/或从一组卵子中选择能够产生可存活胚胎的卵子的装置。其它相关实施例涉及促进卵子的受精和/或从一组精子中选择能够产生可行胚胎的精子的装置。

在一个方面，提供一种用于在微流体装置中产生胚胎的过程，所述过程包括：将卵子引入到所述微流体装置的隔离围栏中；将至少一个精子引入到所述微流体装置中；允许所述至少一个精子在有利于所述卵子受精的条件下接触所述卵子；以及将所接触的卵子和所述至少一个精子在所述微流体装置中培育一段时间，该段时间至少足够长以使所述卵子和所述至少一个精子形成胚胎。

在各种实施例中，将所述卵子引入到所述隔离围栏中可以包括使用介电泳DEP力。所述DEP力可以由光电镊子(OET)配置产生。在各种实施例中，将所述至少一个精子引入到所述隔离围栏包括使用介电泳DEP力。所述DEP力可以由光电镊子(OET)配置产生。

在各种实施例中，将所述卵子引入到所述隔离围栏中可以包括使用电润湿力。可以由OEW配置产生所述电润湿力。在各种实施例中，将所述至少一个精子引入到所述隔离围栏中包括使用电润湿力。可以由OEW配置产生所述电润湿力。

在各种实施例中，将所述卵子引入到所述隔离围栏中可以包括使用流体流动和/或重力来输送所述卵子。在一些实施例中，将所述至少一个精子引入到所述微流体装置中可以包括使用流体流动和/或重力来输送所述至少一个精子。

在各种实施例中，所述过程还可以包括确定所述卵子的状态。在一些实施例中，所述过程还可以包括确定所述卵子的状态，其中可以在将所述至少一个精子引入到所述微流体装置之前执行所述确定的步骤。在一些实施例中，所述过程还可以包括确定所述卵子的状态，其中可以在将所述卵子引入到所述隔离围栏之前执行所述确定的步骤。

在所述过程的各种实施例中，可以在将所述至少一个精子引入到所述微流体装置之前，对所述卵子执行至少一种调理处理。所述至少一种调理处理可以是电处理或化学处理。所述至少一种调理处理可以是暴露于体细胞。所述体细胞可以是卵丘细胞。在一些实施例中，所述卵子可以被暴露于所述隔离围栏中的所述体细胞。

在所述过程的各种实施例中，有利于所述卵子受精的所述条件可以包括所述卵子周围的介质的组分。在各种实施例中，所述过程还可以包括在将所述至少一个精子引入到所述微流体装置之前，改变所述卵子周围的所述介质的组分。

在所述过程的其它实施例中，可以在将所述至少一个精子引入到所述微流体装置之后，对所述卵子进行至少一种调理处理。所述至少一种调理处理可以是电处理或化学处理。

在各种实施例中，所述过程还可以包括确定所接触的卵子和所述至少一个精子已经形成所述胚胎的步骤。在一些实施例中，确定所述胚胎已经形成的步骤可以包括视觉检查。在一些实施例中，确定所述胚胎已经形成的步骤可以包括成像。在其它实施例中，确定所述胚胎已经形成的步骤可以包括检测在其中引入了所述卵子的所述隔离围栏内的分泌物或监测来自其中引入了所述卵子的所述隔离围栏的分泌物。在一些实施例中，分泌物的所述检测包括检测蛋白质或核酸。

在各种实施例中，所述过程还可以包括对所述胚胎进行至少一种调理处理的步骤。对所述胚胎进行的所述至少一种调理处理可以是暴露于体细胞。在一些实施例中，所述胚胎被暴露的所述体细胞可以是卵丘细胞、子宫内膜细胞、非纤毛分泌细胞、PEG细胞或其任何组合。在其它实施例中，所述胚胎被暴露的所述体细胞可以是卵丘细胞和选自子宫内膜细胞、非纤毛分泌细胞和PEG细胞的组中的至少一个细胞。

在所述过程的各种实施例中，其中所述卵子和所述至少一个精子中的每个都可以从哺乳动物获得。

在所述过程的各种实施例中，所述隔离围栏可以包含单个卵子。所述微流体装置可以包含多个隔离围栏。在一些实施例中，至少一个卵子可以被引入到所述多个隔离围栏中的两个或更多个隔离围栏的每一个中。在其它实施例中，可以将单个卵子引入到所述多个隔离围栏中的两个或更多个隔离围栏的每一个中。在各种实施例中，所述微流体装置还可以包括被配置为包含流体介质的通道；以及所述隔离围栏可以包括隔离区域和连接区域，其中所述连接区域的近端开口将所述隔离区域流体连接到所述通道。所述隔离区域可以仅通过扩散将所述隔离区域内的流体介质的组分与所述通道中所述流体介质的组分交换。

在所述过程的各种实施例中，所述过程还可以包括：确定所接触的卵子和所述至少一个精子已经形成所述胚胎的步骤；以及改变所述隔离围栏中所述胚胎周围的介质的组分。在一些实施例中，随着所述胚胎从单细胞胚胎发育成桑椹胚或囊胚，所述介质的组分可以改变不止一次。在一些实施例中，改变所述介质的组分可以包括改变所述介质的pH。

在所述过程的各种实施例中，所述过程还可以包括将所述胚胎从所述隔离围栏中导出的步骤。在所述过程的各种实施例中，所述过程还可以包括将所述胚胎从所述微流体装置导出的步骤。

在另一方面，提供一种用于监测微流体装置中至少一个生物微物体的状态的过程，其中所述生物微物体选自胚胎、精子或卵子，所述过程包括以下步骤：将所述生物微物体引入到所述微流体装置的隔离围栏中；向所述生物微物体提供介质；分析由生物微物质产生的分泌物；以及确定所述生物微物体的所述状态。在一些实施例中，向所述生物微物体提供介质的步骤还可以包括向所述生物微物体提供被配置为提供生存所必需的营养物的介质。

在所述过程的各种实施例中，所提供的介质可以包括激活所述生物微物体以进行后续生物转化所必需的组分。在一些实施例中，所述后续生物转化可以是受精或进入胚胎发育的后续阶段。

在所述过程的各种实施例中，分析所述分泌物的步骤可以包括用捕获珠粒来捕获分泌物。在一些实施例中，可以在所述隔离围栏内或紧邻所述隔离围栏进行分析所述分泌物的步骤。在其它实施例中，可以在所述微流体装置的外部进行分析所述分泌物的步骤。在各种实施例中，分析所述分泌物的步骤可以包括检测蛋白质、核酸、任何前述物质的片段或其任何组合。在一些实施例中，分析所述分泌物可以被执行两次或更多次。在一些实施例中，可以周期性地分析所述分泌物。

在所述过程的各种实施例中，所述过程还包括对所述生物微物体进行成像的步骤，其中所述生物微物体的至少一个图像可以与用于确定所述生物微物体的所述状态的所述分泌物的至少一个分析结合使用。

在所述过程的各种实施例中，所述过程还包括将所述生物微物体从所述隔离围栏导出的步骤。

在所述过程的各种实施例中，所述生物微物体是胚胎，并且其中可以在确定所述胚胎可存活之后，导出所述胚胎。在各种实施例中，所述生物微物体是胚胎，并且其中可以在确定所述胚胎是可存活囊胚之后，导出所述胚胎。

在另一方面，提供一种用于监测微流体装置中至少一个生物微物体的状态的过程，其中所述生物微物体选自胚胎、精子或卵子，所述过程包括以下步骤：将所述生物微物体引入到所述微流体装置的隔离围栏中；为所述生物微物体提供介质；对所述生物微物体进行成像；以及确定所述生物微物体的所述状态。在一些实施例中，为所述生物微物体提供介质的步骤包括提供被配置为提供生存所必需的营养物的介质。

在所述过程的各种实施例中，对所述生物微物体进行成像的步骤可以被执行多于一次。在一些实施例中，可以周期性地执行成像的步骤。在其它实施例中，可以连续地执行成像的步骤。

在所述过程的各种实施例中，确定所述状态的步骤包括确定卵子的大小、形状或大小和形状两者。

在所述过程的各种实施例中，所述过程还包括基于所确定的卵子的大小和/或所确定的卵子的形状来确定是否对所述卵子进行调理处理的步骤。

在所述过程的各种实施例中，所述过程还包括基于所确定的卵子的大小和/或所确定的卵子的形状来确定所述卵子是否准备好受精的步骤。

在所述过程的各种实施例中，确定所述状态的步骤可以包括确定精子的大小、形状、运动性和趋化性反应中的至少一个。在所述过程的各种实施例中，所述过程还可以包括基于所确定的精子的大小、和/或所确定的精子的形状、和/或所确定的精子的运动性、和/或所确定的精子的趋化性反应，来确定是否对所述精子进行调理处理的步骤。在一些实施例中，确定是否对所述精子执行调理处理的步骤可以基于确定精子的大小、形状、运动性和趋化性反应的至少一个的状态。

在所述过程的各种实施例中，确定所述状态的步骤可以包括确定是否已经形成胚胎。在所述过程的各种实施例中，确定所述状态的步骤可以包括确定胚胎的细胞分裂的大小、形状和时间中的至少一个。在所述过程的各种实施例中，细胞分裂的时间可以是胚胎生存能力的指标。

在另一方面，提供一种在微流体装置中产生孤雌胚胎的方法，包括以下步骤：将卵母细胞引入到所述微流体装置的隔离围栏中；以及应用刺激试剂，从而将所述卵母细胞转化为所述孤雌生殖胚胎。

在所述方法的各种实施例中，所述卵母细胞可以是哺乳动物的卵母细胞。在各种实施例中，所述卵母细胞是人类卵母细胞。在所述方法的各种实施例中，所述孤雌生殖胚胎可以是杂合的。在其它实施例中，所述孤雌生殖胚胎可以是纯合的。

在所述方法的各种实施例中，所述刺激试剂可以是电刺激、化学刺激或两者的组合。在一些实施例中，所述刺激试剂可以是电刺激。

在所述方法的各种实施例中，所述方法还可以包括将所述孤雌生殖胚胎从所述隔离围栏导出的步骤。在所述方法的各种实施例中，所述方法还可以包括将所述孤雌生殖胚胎从所述微流体装置导出的步骤。

在所述方法的各种实施例中，所述方法还可以包括将所述孤雌生殖胚胎转化为一种或多种胚胎干细胞ESC的步骤。在所述方法的各种实施例中，将所述孤雌生殖胚胎转化为一个或多个胚胎干细胞的步骤还可以包括从孵化的囊胚中分离内细胞团ICM。在所述方法的各种实施例中，将所述孤雌生殖胚胎转化为一个或多个胚胎干细胞的步骤还可以包括在所述微流体装置的隔离围栏内培养所述ICM。在隔离围栏内培养ICM的步骤还可以包括与饲养细胞共培养所述ICM。在一些实施例中，与所述饲养细胞共培养所述ICM的步骤可以包括将所述饲养细胞放置在与其中布置有所述ICM的所述隔离围栏邻近的隔离围栏中。

在所述方法的各种实施例中，将所述孤雌生殖胚胎转化为一个或多个胚胎干细胞的步骤还可以包括将所述ICM转化为一个或多个胚胎干细胞ESC。在一些实施例中，所述一个或多个ESC可以是大致纯合的。在一些实施例中，所述大致纯合的ESC可以是二倍体，并且可以对于突变等位基因是纯合的。在其它实施例中，所述一个或多个ESC可以是大致杂合的。在一些实施例中，所述一个或多个ESC可以是与所述卵母细胞的供体匹配的人类白细胞抗原HLA。

附图说明

图1示出根据本发明一些实施例的用于微流体装置和相关联的控制设备的系统的示例。

图2A和图2B示出根据本发明一些实施例的微流体装置。

图2C和图2D示出根据本发明一些实施例的隔离围栏。

图2E示出根据本发明一些实施例的详细的隔离围栏。

图2F示出根据本发明实施例的微流体装置。

图3A示出根据本发明一些实施例的用于微流体装置和相关联的控制设备的系统的具体示例。

图3B示出根据本发明一些实施例的成像装置。

图4是具有流动路径和胚胎所在的隔离围栏的微流体装置的视图。

图5A-图5C是具有位于流动路径中的珠粒的图4的微流体装置的视图。隔离围栏中的胚胎是分泌的分析物，其可以扩散到流动路径中的珠粒并且被流动路径中的珠粒捕获。可以分析珠粒在胚胎发育期间的一个或多个时间点处的分析物的量和类型，其中胚胎发育包括单细胞阶段(图5A)、双细胞阶段(图5B)、四细胞阶段(图5C)或任何其它感兴趣的阶段。

具体实施方式

本说明书描述了本发明的示例性实施例和应用。然而，本发明不限于这些示例性实施例和应用，也不限于在本文中描述的方式或者示例性实施例和应用运行的方式。而且，附图可示出简化或局部视图，并且附图中的元件尺寸可以被夸大或者可以不按比例。此外，当在本文中使用术语“在…上”、“附接到”、“连接到”或“耦接到”或类似词语时，一个元件(例如，材料、层、基底等)可以“在另一个元件上”、“附接到另一个元件”、“连接到另一个元件”、或“耦接到另一个元件”，而不管该一个元件直接在另一个元件上、附接、连接或耦接到该另一个元件，还是有一个或更多个介入元件在该一个元件和该另一个元件之间。另外，除非上下文另有规定，否则在提供方向的情况下，方向(例如，上、下、顶、底、侧、向上、向下、下方、之上、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”等等)是相对的且仅通过示例的方式提供并且为了便于说明和讨论而不是限制。此外，在对一系列元件(例如元件a、b、c)进行描述的情况下，这些描述旨在包括所列出的元件自身的任何一个、少于全部所列出的元件的任何组合和/或全部所列出的元件的组合。

说明书中的段落划分仅用于便利查看，并且不限制所讨论的元件的任何组合。

如本文所使用的，“基本上”是指足以达到预期目的。术语“基本上”因此允许根据绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等进行诸如本领域普通技术人员可以预期，但对总体性能没有显着影响的小的、不重要的变型。当针对数值或者可以被表示为数值的参数或特征使用时，“基本上”是指在百分之十内。

术语“多个”是指多于一个。如本文所用，术语“很多”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多。

如本文所使用的，术语“布置”涵盖其含义“位于”。

如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是包括被配置为保持流体的一个或多个独立微流体回路的装置，每个微流体回路包括流体上互连的回路元件，包括但不限于，区域、流动路径、通道、腔室和/或围栏以及被配置为允许流体(以及可选地，悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置的至少两个端口。通常，微流体装置的微流体回路将包括至少一个微流体通道和至少一个腔室，并且将保持小于约1mL体积的流体，例如，小于约750、500、250、200、150，100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL。在一些实施例中，微流体回路保持大约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL的流体。

如本文所用，“纳流体装置”或“纳流体设备”是具有包含至少一个回路元件的微流体回路的一种微流体装置，其中该回路元件被配置为保持小于约1μL体积的流体，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。通常，纳流体装置将包括多个回路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多个)。在一些实施例中，至少一个回路元件中的一个或多个(例如全部)被配置为保持以下体积的流体：大约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL。在其它实施例中，至少一个回路元件中的一个或多个(例如全部)被配置为保持以下体积的流体：大约100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL或250至750nL。

如本文所使用的“微流体通道”或“流动通道”指具有明显长于水平和垂直尺寸的长度的微流体装置的流动区域。例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1000倍、长度的至少5000倍或更长。在一些实施例中，流动通道的长度在约50,000微米至约500,000微米的范围内，包括其间的任何范围。在一些实施例中，水平尺寸在约100微米至约1000微米的范围内，例如，从约150到约500微米，垂直尺寸在约25微米至约200微米的范围内，例如，从约40至约150微米。应指出的是，流动通道可以在微流体装置中具有各种不同的空间构造，因此不限于理想的线性元件。例如，流动通道可以包括具有以下任一配置的一个或多个部分：弯曲、弯折、螺旋、倾斜、下降、分叉(例如，多个不同的流动路径)及其任何组合。此外，流动通道可以具有沿其路径的不同的横截面面积(扩大和收缩)，以在其中提供期望的流体流动。

如本文所使用的，术语“阻塞”通常指足够大的凸块或类似类型的结构，以便部分地(但不完全)阻止目标微物体在微流体装置的两个不同区域或回路元件之间移动。两个不同的区域/回路元件可以是例如微流体隔离围栏和微流体通道、或微流体隔离围栏的连接区域和分离区域。

如本文所使用的，术语“收缩”通常指微流体装置中回路元件(或两个回路元件之间的界面)的宽度变窄。例如，收缩可以位于微流体隔离围栏与微流体通道之间的界面处、或者位于微流体隔离围栏的分离区域与连接区域之间的界面处。

如本文所使用的，术语“透明”指允许可见光通过但是在光通过时基本不改变光的材料。

如本文所用，术语“微物体”通常指可以根据本发明分离和收集的任何微观物体。微物体的非限制性示例包括：无生命的微物体，诸如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、Luminex^TM珠等)；磁珠；微米棒；微丝；量子点等；生物微物体，诸如细胞(例如，胚胎、卵母细胞、卵子、精细胞、从组织分离的细胞、真核细胞、原生细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、免疫细胞、杂交瘤、培养细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、感染细胞、转染和/或转化细胞、报道细胞、原核细胞等)；生物细胞器；囊泡或复合物；合成泡囊；脂质体(例如，合成的或由膜制剂衍生的)；脂质纳米筏(如Ritchie et al.(2009)Reconstitution of MembraneProteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,Mehotd Enzymol.,464:211-231(里奇等人(2009年)，磷脂双分子层奈米圆盘中的膜蛋白的重组，方法酶学，464:211-231)中描述的)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附着于细胞的微珠、脂质体包覆微珠、脂质体包覆磁珠等)。这些珠粒还可以具有共价或非共价连接的其它部分/分子，诸如能够在测定中使用的荧光标记、蛋白质，小分子信号传导部分、抗原或化学/生物物种。

如本文所使用的，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包括流体和气体成分的环境，以及可选地提供保持细胞存活和/或扩大所必须的条件的表面。

流体介质的“组分”是呈现在介质中的任何化学或生物化学分子，所述介质包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖类、碳水化合物、脂类、脂肪酸、胆固醇、代谢产物等。

如本文关于流体介质所使用的，“使…扩散”和“扩散”是指流体介质的组分朝浓度梯度低的方向的热力学移动。

短语“介质的流动”是指流体介质的除扩散之外的由任何机构导致的整体移动。例如，介质的流动可以包括由于点之间的压力差从一个点到另一个点的流体介质的移动。这样的流动可以包括液体的连续的、脉冲的、周期的、随机的、间歇的或往复的流动，或者其任何组合。当一个流体介质流入到另一个流体介质中时，可导致介质的湍流和混合。

短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速在时间上的平均值小于将材料(例如，感兴趣的分析物)的组分扩散到流体介质中或者在流体介质内扩散的速率。这种材料的组分的扩散速率可取决于例如温度、组分的大小以及组分与流体介质之间的相互作用的强度。

如本文关于微流体装置内的不同区域所使用的，短语“流体连接”是指当不同区域基本上填充有液体(诸如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成流体的单个本体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上一定是相同的。相反，在微流体装置的不同的流体连接区域中的流体可具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，如蛋白质、碳水化合物、离子、或其它分子)，其由于溶质向其各自的浓度梯度低的取向移动和/或由于流体通过该装置流动而不断变化。

微流体(或纳流体)装置可以包括“波及”区域和“未波及”区域。如本文所使用的，“波及”区域包括微流体回路的一个或多个流体上互连的回路元件，当流体流过微流体回路时，其每个均经历介质流动。波及区域的回路元件可以包括例如区域、通道以及腔室的全部或部分。如本文所使用的，“未波及”区域包括当流体流过微流体回路时，其每个基本上都不经历流体流动的微流体回路的一个或多个流体上互连的回路元件。未波及区域可以流体连接到波及区域，假设该流体连接被配置为使得在波及区域与未波及区域之间能够扩散，但在波及区域与未波及区域之间基本上没有介质的流动。微流体装置可因此被配置为基本上使未波及区域与波及区域中的介质的流分离，同时使得在波及区域与未波及区域之间仅能够进行扩散流体连通。例如，微流体装置的流动通道是波及区域的示例，而微流体装置的分离区域(下文将进一步详细描述)是未波及区域的示例。

如本文所使用的，“流动路径”指限定并经受介质流动轨迹的一个或多个流体连接的回路元件(例如，通道、区域、腔室等)。因此，流动路径是微流体装置的波及区域的示例。其它回路元件(例如，未波及区域)可以与包括流动路径的回路元件流体连接，而不经受流动路径中介质的流动。

如本文所用：μm表示微米，μm³表示立方微米，pL表示皮升，nL表示纳升，μL(或uL)表示微升。

如本文所用，“胚胎”指在植入之前的在发育的任何阶段中受精卵的产物。因此，术语胚胎包括受精卵、桑椹胚、囊胚等。

本发明的实施例允许监测当生物微物体位于微流体(或纳流体)装置中时，生物微物体(诸如胚胎、精子或卵子)的状态。监测可以涉及光学、化学和/或电分析。监测还可以包括生物微物体的调理处理，其可以在生物微物体的光学、化学和/或电分析之前和/或之后进行。可以相对于其它对应的生物微物体来确定生物微物体的状态。可替代地，可以相对于预定特征来确定生物微物体的状态。这种预定特征可以与健康和生存能力(viability)相关联。

在一些实施例中，在监测其状态之前，将生物微物体加载到微流体装置或其中的特定区域(诸如隔离围栏)内。微流体装置可以具有包含至少一个微流体通道和一个或多个(例如，多个)隔离围栏的第一区域，其中围栏通向通道。每个围栏可以被配置为具有隔离区域和连接区域，其中隔离区域仅通过扩散来交换隔离区域内流体介质的组分和通道中流体介质的组分。微流体装置的第一区域可以提供可单独地维持生物微物体(诸如卵母细胞、卵子或胚胎)的位置，在每个隔离围栏中维持一个生物微物体。在一些实施例中，精子也可以存储在隔离围栏中，但是可以作为一组维持在隔离围栏中，或者可以单独地维持在隔离围栏中。

在一些实施例中，微流体装置还可以包括第二区域。第二区域可以是选择区域，并且可以位于第一区域的上游。选择区域可以包含可与第一区域(如果存在的话)的通道连接的至少一个通道。可选地，选择区域可以不包括隔离围栏(例如，选择区域可以由通道组成或基本上由通道组成)。选择区域中通道的长度可以与第一区域中通道的长度相同，或者选择区域中通道的长度可以是第一区域中通道的长度的1、2、3、5、7、9或25倍。选择区域可以布置在入口端口与隔离区域之间。

选择区域可以用于选择导入的生物微物体以放置在隔离区域的选定隔离围栏内或以在选择区域自身内进行测试。选择区域中的延伸通道可以用于为被引入到微流体装置中的精子提供游动区域。游动区域(延长通道)可以选择在受精过程中最活跃(适合)的精子。在较慢的、较不适合的精子可以到达卵子之前，最快的精子将到达具有卵子的隔离围栏。(参见Garcia等人，美国专利第9,079,189号，其通过引用整体并入本文)。

生物微物体或诸如但不限于珠粒的微物体的加载可以涉及使用流体流动、重力、介电泳(DEP)力、电润湿、磁力或其任何组合。可以诸如通过光电镊子(OET)配置来光学地产生DEP力，和/或诸如通过激活时间/空间图案中的电极/电极区域而电力产生DEP力。类似地，可以诸如通过光电润湿(OEW)配置来光学地产生电润湿力，和/或诸如通过激活时间/空间图案中的电极/电极区域而电力产生电润湿力。

在一些实施例中，在监测生物微物体的状态之前，在微流体装置内形成生物微物体(例如，通过微流体装置内卵子的受精而形成胚胎)。在这种实施例中，可以在受精之前监测卵子和/或精子，并且可以在形成胚胎之后监测所得到的胚胎。

监测。在一些实施例中，监测生物微物体的状态包括当生物微物体在微流体装置中时，检测生物微物体的形态和/或运动。这种检测可以包含通过显微镜进行观察，或者一次或多次(例如，周期性地)或连续地对生物微物体进行成像(例如，产生视频记录)。对于胚胎，这种观察或成像可以用于确定细胞分裂的大小、形状和时间。细胞分裂的时间可以用作胚胎生存能力的指标。对于卵子，这种观察或成像可以用于评估大小和形状。对于精子，这种观察或成像可用于评估大小、形状、运动性和/或趋化反应。对于卵子和精子两者，通过监测隔离围栏或其上游选择区域中通道内的形态和/或移动能够进行评估(例如，确定卵子或精子的状态)，这种评估可以使得确定提供调理处理(其可以包括刺激或其它加强处理)，以增强卵子或精子的生存能力和/或活性。监测和/或评估可以发生在受精过程中的1、2、3、4个或更多个时间点处，并且可以在受精后继续在1、2、3、4个或更多个时间点处进行监测和/或评估。在将卵子布置在隔离围栏的隔离区域内(例如，在微流体通道内)之前，可以确定卵子的状态，或者当卵子已经布置在隔离围栏的隔离区域内时，可以确定卵子的状态。

形态。本文描述的微流体装置和隔离围栏内的易于可视化提高了对卵子、精子和/或胚胎进行形态评估和排序的机会。视觉检查可以包括使用显微镜的视觉检查、通过包含微流体装置的仪器的光学系统进行成像、或获得可以投影远程或访问的视频图像。在一个非限制性示例中，使用科学工作组建立的共识评估来评估卵母细胞、卵子或胚胎的质量并对其进行排序。可以在“伊斯坦布尔关于胚胎评估的共识研讨会：专家会议的会议记录”，人类繁殖，第6期，第26卷，第1270-1283页”中找到一些排序标准，其整体通过引用并入本文。可以对细胞质特征、原核特征、极体行为(例如第二极体的位置)和胚胎分裂进行标准化比较。此外，形态动力学变量可以用于确定可存活胚胎。一些有用的比较可以是分裂成5个细胞的时间(约48至约57小时)；从3个细胞分裂成4个细胞的时间(小于约0.76小时)；以及细胞分裂的第二个周期的持续时间(从分裂成2个细胞到分裂成3个细胞的时间，小于约12小时)(Milachich,BioMed Res.Intl.2014,Article ID 306505)。在一些实施例中，分裂的程度可以与胚胎发育的质量成反比，并且密切研究这种分裂的能力是本文所述的微流体装置中胚胎培养的优势。

非侵入性分析。在一些实施例中，监测生物微物体的状态包括分析来自生物微物体的一种或多种分泌物。分泌物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物、代谢物、任何前述的片段、或其任何组合。例如，分析可以包括这种分泌物的蛋白质组评估和/或基因组评估。在一些实施例中，可以在分泌物位于微流体装置内时，分析这些分泌物中的部分或全部。在其它实施例中，可以在分泌物从微流体装置中导出之后，分析这些分泌物中的部分或全部。例如，可以取隔离围栏内流体的等分试样，用于分析其中存在的任何分泌物。等分试样可以与在微流体装置内或在从微流体装置导出之后的合适试剂(例如，与等分试样中的分泌物反应以产生可检测信号的试剂)结合。可替代地或额外地，可以在一个或多个捕获珠粒上捕获来自隔离围栏中生物微物体的分泌物，并且可以在微流体装置内或被从中导出之后对捕获珠粒分析与其结合的分泌物。在一些实施例中，随时间重复进行分泌物的分析，并且可以为隔离围栏中的生物微物体产生时间解析的分泌物曲线。

在一些实施例中，可以利用分泌物分析(例如，单个时间点或时间解析的分泌物曲线)和/或其它信息(例如，形态和/或运动性数据，单个时间点或时间解析的分泌物曲线)来选择生物微物体，进行进一步处理。例如，可以使用分泌物分析和/或其它信息来选择用于受精的卵子和/或精子，或者选择用于植入的胚胎。US 2015/0151298(2014年10月22日提交的第14/520,568号申请)和US 2015/0165436(2014年10月22日提交的第14/521,447号申请)，描述了分析在微流体装置，特别是任一微流体装置100、200、240、290中培养的细胞的分泌物的示例性方法，这些申请整体通过引用并入本文。

本发明的一些实施例的优势包括能够将生物微物体(诸如胚胎、精子、卵子或卵母细胞)放置于受限空间中同时保持其生存能力，允许检测和/或跟踪其形态和运动性，并且产生足以进行准确测定的高分泌物浓度。卵子、胚胎或精子在微流体装置的隔离围栏内占据的受限空间的大小可以在人的卵子或胚胎大小(例如，约2nL至约10nL、约2nL至约20nL、约5nL至约15nL、约5nL至约20nL、约5至约25nL、约10nL至约20nL、约10nL至约30nL、约10至约40nL或约10nL至约50nL)的大约5至约50倍的范围内。其它优势包括使用珠粒或取介质的小等分试样来测量分泌物的时间响应；移动介质的等分试样和/或珠粒，而不干扰生物微物体的局部环境；以及分析所分泌的或所释放的物质(例如，蛋白质、核酸、碳水化合物、代谢物和/或其片段)，以收集关于生物微物体的状态和质量的信息，从而能够选择优选的(例如，健康的、可生存的等)生物微物体。使用本文所述的微流体装置，能够选择多个生物微物体中的仅仅一个，这有利地允许在微流体装置内的指定位置内的高选择性布置以及微物体的状态与其位置之间的相关性。此外，生物微物体的导入和导出同样可以是高选择性和特异性的，这是本文所述方法的另一有利方面。监测和成像的便利性提供了方法的其它有利方面。此外，导入具有特异性和选择性捕获材料的测定珠粒的便利性允许非侵入性地测定生物微物体的很大灵活性。能够使用彼此良好分离的非常小培养体积，还允许以惊人的特异性和选择性来监测并且可选地将特定生物微体的状态提高到更大的生殖适合度。可替代地，本文描述的方法的相同属性可以允许更早且更精确地识别应当在辅助生殖过程中从进程中取消选择的生物微物体。所有这些能力解决了在辅助生殖领域(例如，用于人类辅助生殖)并且更广泛地在生殖技术领域内的紧迫的和未满足的需求。

捕获珠粒。用于本文所述分析的珠粒可以由任何合适的材料制成，包括玻璃、聚合材料和磁性材料。珠粒还可以在基部材料上具有涂层或壳体，其提供用于附着捕获材料(诸如，被设计为结合从卵子、精子或胚胎分泌或释放的寡核苷酸、蛋白质、抗体、抗原、多糖或设计用于结合生物分子的合成分子)的基底。捕获材料可以结合可溶性或其它细胞外胚胎材料，诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、代谢物和/或其片段。检测可以包括检测整个可溶性或细胞外胚胎分泌物或其片段。

分析。可以对诸如卵母细胞、卵子、精子或胚胎的生物微物体进行各种非侵入性分析。有利地，可以在植入之前在微流体装置内执行体外进行的分析(这消除了DNA污染(例如来自母体)的混杂影响)；并且可以在围绕或邻近感兴趣的单个胚胎的介质的体积(其比典型的IVF条件的体积小得多)内进行上述分析。因此，无胚胎DNA或其它分泌物质的浓度可能会显著增加，从而增大了从感兴趣的细胞周围的介质中捕获有效测试材料的可能性。如本文所述的分析包括在微流体装置内收集分析物。处理分析物以产生生物微物体的状态或评估状态可以发生在微流体装置内。可替代地，可以在微流体装置外处理(例如，捕获到的核酸的扩增和扩增产物的随后检测)捕获到的分析物。

无细胞DNA。可以通过将无细胞DNA捕获到具有针对感兴趣缺陷的捕获寡核苷酸的捕获珠粒上，从而使得能够检测卵母细胞、卵子、精子或卵子中的单基因缺陷。可以从单个卵子或胚胎中释放足够的DNA，以允许在含有卵子或胚胎的隔离围栏中或在邻近隔离围栏的近端开口的微流体通道中将其捕获到捕获珠粒上。捕获珠粒可以具有与珠粒结合或相关联的捕获材料，其中捕获材料被配置为捕获所有核酸或者可以被配置为捕获核酸(例如，gDNA、mDNA、mRNA、rRNA、miRNA等)的一个或多个特定子集。捕获材料可以基于相互作用，例如但不限于电荷亲和力或序列互补性。已经表明微升体积的耗尽细胞培养介质含有足够的待捕获并待分析的无细胞DNA，以便通过荧光间隔聚合酶链反应(PCR)分析来检测引起α地中海贫血的α球蛋白基因缺失(Wu等人，Medicine 2015；94；e669)。可以通过设计对靶基因的一个或多个区域具有特异性的捕获寡核苷酸来检测其它单基因缺陷(例如，Tay Sachs，BRCA或囊胞性纤维症)。承载这些结合寡核苷酸的捕获珠粒可以通过大规模并行测序(下一代测序(NGS))、定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)、使用双分子信标报告基因探针的实时PCR、或微阵列检测)来捕获足够的DNA进行检测。可以使用巢式PCR来充分扩增捕获到的DNA，同时减少由于高循环数导致的错误。使用在PCR反应中不同标记的控制样本，比较基因组杂交可以降低偏移的PCR的影响。

除了单基因缺陷之外，SNP阵列可以用于卵母细胞、卵子或胚胎(包括具有已被有效放大的低输入样本)的非整倍体分析。dPCR也可以用于非整倍体分析，其中针对感兴趣的染色体中的多态性等位基因的引物可以为非整倍体提供与整倍体卵母细胞、卵子或胚胎相比不同的信号平衡。可以使用短串联重复(STR)微卫星片段分析来使用多重定量荧光PCR(QF-PCR)来检测非整倍体。已经证明了针对X和Y染色体的非整倍体的10重QF-PCR样品板(panel)。该样品板包括两个常染色体STR(Xie,PLOS one 2014:9:e106307)。最近开发的另一个样品板针对使用同源基因定量PCR(HGQ-PCR)的染色体13、18、21、X和Y的非整倍体，以获得与更耗时的核型分析测定相同的拷贝数信息(Long,Mol.Med.Reports:2013:8:1601-1605)。当检查同胞的组织相容性时，可以使用STR分析来确定人体白细胞抗原匹配。当PCR扩增误差有限时，全基因组分析(WGA)可以提供最大量的信息。当集中于与植入前或受精决定相关的遗传信息的样品板在与以微流体尺度获得的胚胎的耗尽介质或分泌物的样本一起使用时，可以提供关键信息。

可以通过捕获所有DNA，随后检测mtDNA/gDNA比例来进行胚胎适应度的一般测量。mtDNA的增强存在可以与早期胚胎中的分裂率高度相关。高分裂率可以表明成功发育和成功植入的减小的可能性。

蛋白质。可以通过捕获到珠粒上的抗体来监测自分泌或旁分泌的分泌物。脂质运载蛋白-1的增大的水平已经与胚胎的非整倍体相关联，并且包含针对该蛋白质的抗体的珠粒可以捕获足够的蛋白质(例如，当其在保持卵子的隔离围栏内扩散或从该隔离围栏扩散时)，用于芯片外分析。如果以这种方式检测到多重蛋白质产物，则可以增强定量。还可以对其它蛋白质分析与非整倍体(来自胚胎分泌物)的相关性，包括可溶性肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-10(IL-10)、巨噬细胞刺激蛋白质-α(MSP-α)；干细胞因子(SCF)、趋化因子(CXC-motif)配体13(CXCL 13)、TNF相关细胞凋亡诱导配体受体3(TRAILR 3)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)和GM-CSF。

作为分层方法的电场下的物理行为的非侵入分析。在一些实施例中，微流体装置中的介电泳场可以用于区分更好质量的卵母细胞、卵子或胚胎。由于这些细胞是可极化的，所以介导电泳场可以用于对特定细胞在低电导介质(例如，0.3M山梨糖醇)中、在场的影响下移动的速率进行分类。在一些实施例中，发育更完全的微物体(诸如卵母细胞、卵子或胚胎)可以比相对较欠发育的微物体移动得相对更快。这可能是由于导致不同转录水平的基因表达的差异。在本文描述的微流体装置中，可以根据需要快速完成培养介质的改变。可以在围栏或通道内快速测试微物体，并返回到已知位置，并且该位置可以与测试结果相关联(Garcia等人，第9,079,189号美国专利)。

在饲养细胞附近培养。本发明的实施例还允许在饲养细胞附近培养生物微物体(例如胚胎、卵子、卵母细胞)，上述饲养细胞能够促进适当的生长和发育，增加可存活受孕的可能性，和/或帮助提供不会导致可存活受孕的胚胎的负选择压力。饲养细胞可以以允许生物微物体对饲养细胞的分泌物进行采样的方式，位于微流体装置的外部或内部。例如，当位于微流体装置外部时，饲养细胞可以位于在进入微流体装置之前介质流过的腔室中。当位于微流体装置内部时，饲养细胞可以位于公共流动路径中生物微物体的上游区域(例如，腔室)中，使得生物微物体对饲养细胞的分泌物进行采样。可替代地，饲养细胞可以位于与生物微物体相同的隔离围栏中。例如，饲养细胞可以是子宫细胞、子宫内膜细胞、非纤毛分泌细胞或源自子宫管(例如输卵管或皮奥氏管)的PEG细胞、卵巢(卵丘细胞)或其组合的群体。作为饲养细胞的卵丘细胞可以提供必需的丙酮酸和半胱氨酸浓度，在该浓度下，卵母细胞、卵子或胚胎不能分别从含有葡萄糖和半胱氨酸的标准培养介质代谢。与卵丘细胞可选地相结合的子宫细胞(或子宫内膜细胞、非纤毛分泌细胞和/或PEG细胞)可以提供支持正常胚胎发育的营养物和/或信号。可以例如从未来的母体(例如，生物母体或替代母体)中提取饲养细胞。可替代地，饲养细胞可以是成纤维细胞或常规地用于支持在试管内或体外细胞生长的其它类型的细胞。

培养介质。本发明的实施例还可以允许在胚胎的早期发育(例如，植入前培养阶段)期间优化介质。如果胚胎在微流体装置中的围栏中生长，则它们通过扩散对灌注的介质进行采样。因此，可以响应于胚胎的监测和/或对来自上述胚胎的分泌物的采样来改变介质组分。在胚胎生长期间，可以改变介质组分2、3、4或更多次。可以根据受精期间所使用的介质组分(其本身可以被改变2、3或更多次)来改变在胚胎生长期间所使用的介质组分。随着胚胎从单细胞胚胎发育成桑椹胚或囊胚，介质的组分可以被改变一次或多次。例如，在胚胎发育期间的不同时间具有不同的pH已经显示是优选的。因此，介质之间的切换可以允许响应于观察到的胚胎性质来优化pH。

可以在从受精前评估到胚胎的围植入的整个工作流程中使用单个培养介质，并且可选地还可以在卵母细胞激活过程中使用单个培养介质。“通用”培养介质的非限制示例包括G-TL^TM(Vitrolife)和Continuous Single Complete(CSC-C，IrvineScientific)。在其它实施例中，介质可以被设计为本质上是顺序的，并且在卵母细胞/卵子/胚胎发育的特定时间段期间使用。顺序介质系统的一个示例是G-GAMETE^TM、G-1^TM(原核至d2-3)、来自Vitrolife的G-2^TM(d3至囊胚)系列。在一些实施例中，可以将介质设计为提供在具有OET或OEW配置的微流体装置内使用的优化的电导。适当的介质可以含有以下中的一种或多种：葡萄糖、果糖、丙酮酸、葡聚糖、牛磺酸、缓冲液(包括但不限于碳酸氢盐、柠檬酸盐、磷酸盐、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)或吗啉代丙烷-1-磺酸(MOPS))、视黄酸、玻尿酸和/或透明质酸/酸性盐、氨基酸(所有氨基酸，但在一些特定用途中，半胱氨酸和诸如天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸等的非必需氨基酸)、抗氧化剂(包括但不限于半胱胺、维生素(包括但不限于与维生素B相关的烟酰胺、硫胺素、吡哆醇和/或核黄素、与维生素E相关的生育酚和生育三烯酚)、细胞因子(包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、抗菌剂(例如庆大霉素、四环素)和/或螯合剂(一个非限制示例是乙二胺四乙酸(EDTA))以及其它可能的组分。

在一些实施例中，培养介质可以包括半胱氨酸，其中半胱氨酸以以下浓度范围存在：约1微摩尔至约500微摩尔、约10微摩尔至约250微摩尔、约50微摩尔至约150微摩尔、或任何这些范围内的任何值。在各种实施例中，培养介质可以包括半胱胺，其中半胱胺以以下浓度范围存在：约5微摩尔至约1000微摩尔、约50微摩尔至约500微摩尔、约100微摩尔至约300微摩尔、或任何这些范围内的任何值。

在一些实施例中，介质可以含有与卵母细胞/卵子/胚胎/精子相同物种的血清。在一些实施例中，介质可以含有与卵母细胞/卵子/胚胎/精子不同物种的血清。不同的物种可以是不同的哺乳动物物种。在其它实施例中，介质可以是无血清的。

在培养介质中可以存在阳离子盐(包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸镁、磷酸钾或乳酸钠)，并且可以在培养期间将其电导率控制在不同水平。当不使用介电泳力或光电润湿时，特别地在培养期间可以增加电导率。可以减少盐含量，以在使用介电泳或电润湿的操作期间提供低电导介质。在不同类型的介质中容易流动的能力允许导电系数便于变化，从而限制生物微物体短时间地暴露于低电导介质。

许多不同的培养介质是可商购的并可以适用于微流体装置内。商购介质包括但不限于：G-IVF^TM和G-IVF^TM PLUS(Vitrolife)、G-TL^TM(Vitrolife)、G-MOPS^TM(Vitrolife)、G-GAMETE^TM(Vitrolife)、人输卵管液(Human Tubal Fluid，HTF)、修改的HTF、和具有(血清替代物补充剂，Serum Substitute Supplement)SSS^TM的完整HTF(Irvine Scentific)、修改的Ham’s F10或F15基础培养介质(Irvine Scientific)、Continuous SingleComplete(Irvine Scientific)、Multipurpose HandlingComplete(IrvineScientific)、Complete介质(Irvine Scientific)、介质(Irvine Scientific)、具有SSS^TM的Complete Early介质(IrvineScientific)、具有(Dextran Serum Supplement)DSS的Complete Early介质(Irvine Scientific)、(介质)、介质(Group)、G-1^TM and G-2^TM系列(Vitrolife)、Sequential Fert^TM Sequential Fert^TM/Cleav^TM Sequential Cleav^TM/Blast^TM Sequential Blast^TM Universal IVFBlastGen^TM ISM1^TM BlastAssist^TM EllioStep 2(Ellios BioMedia)、BMI(Ellios BioMedia)、SMART2(Ellios BioMedia)、GM501(Gynemed)、HTF(InVitroCare,Inc.)、IVC-ONE^TM(InVitroCare,Inc.)、IVC-TWO^TM(InVitroCare,Inc.)、IVC-THREE^TM(InVitroCare,Inc.)、和Sydney IVF切割/囊胚培养介质(Cook)。

用于激活过程的培养介质。用于激活的培养介质可以使用上述培养介质之一。在一些实施例中，培养介质可以是Modified Ham’s、G-GAMETE^TM、Multipurpose HandlingComplete等。在一些实施例中，介质还可以含有血清。可替代地，介质可以是无血清的。在一些实施例中，培养介质不含蛋白质、不含次黄嘌呤并且不含抗生素。

动态培养条件。在一些实施例中，可以在部分或整个培养期间采用动态条件，以提供可以增强胚胎发育的温和的生理条件。动态条件可以包括倾斜、灌注、旋转或振动中的一个或多个。

微流体装置内的隔离围栏布置。本发明的实施例还可以包括将围栏对准或放置在例如子宫或子宫内膜细胞附近，可选地允许细胞粘附并将胚胎放置在围栏中。然后，可以监测胚胎的分泌物和形态，以识别最高生存能力的胚胎。基于评估，可以从隔离围栏导出胚胎(例如，囊胚)，并从微流体装置输出，以便植入未来的母体。通过这种方式，可以在进行监测时实现优选的胚胎健康和健全性。

本发明的实施例还可以包括在围栏中隔绝单个或一组精子和/或卵子(或卵母细胞)，测量它们的分泌物和形态，并且将基于它们各自的分泌物和/或形态所选择的精子和卵子结合以形成受精卵。然后，如上所述，可以通过分泌物和/或形态监测发育中的胚胎是否适合。这可以代表一个完整的工作流程，其利用已知的方法选择精子、受精卵和/或胚胎来改善受孕结果。

本发明的实施例还可以提供用于模拟输卵管和/或子宫环境随着时间的微环境。例如，这可以通过下述来实现：通过利用引入子宫细胞、子宫内膜细胞或源自输卵管或皮奥氏管的细胞、来自这些细胞类型的分泌物来控制环境；调节介质的pH值；调整介质的生长因素；和/或本领域已知的其它条件。

另外，隔离围栏的大小可以被调整，以促进从生物微物体产生足够浓度的分泌物，以便能够准确分析分泌物。因此，例如，隔离围栏可以包括至少2×10⁶μm³、3×10⁶μm³、4×10⁶μm³、5×10⁶μm³、6×10⁶μm³、7×10⁶μm³、8×10⁶μm³、9×10⁶μm³、1×10⁷μm³或更大的体积。隔离围栏可以具有立方体的形状或其它形状，x、y和z中的每个的大小至少与设计隔离围栏来保持的微型物体的直径大约一样大。例如，人类卵子具有约120微米的直径，因此设计用于保持人体卵子的隔离围栏的x、y、z大小中的每一个可以是至少100、110、120、130、140、150或更多微米。

在一些实施例中，可以调节微流体装置的内表面(例如，隔离围栏的内表面)，以便促进生物微物体(诸如胚胎、精子、卵母细胞或卵子)的健康和生存能力。例如，内表面可以涂覆聚合物，诸如天然聚合物(例如层粘连蛋白、纤连蛋白、人工基底膜或透明质酸)、合成聚合物(例如PEG、或用天然聚合物链段修改的PEG)、蛋白质、多糖、上述任何一种的衍生物、或其组合。可替代地或额外地，可以用支持细胞(例如上皮细胞或成纤维细胞)的分泌物来调节内表面。这种细胞的示例可以包括卵丘细胞、子宫内膜细胞、非纤毛分泌细胞和源自输卵管的PEG细胞。

生物微物体的调理处理。在一些实施例中，进行调理处理，以在将卵子与一个或多个精子接触时增强受精成功机率。

电处理。在一些实施例中，一个、一些或所有隔离围栏可以额外被配置为向位于其中的微物体提供电刺激。可以通过在局部位置调制DEP(OET)或电润湿基底来提供电刺激。可替代地，围栏可以具有可通过光刻来制造的2D平面电极或3D电极，或者可以具有线型电极(铂、银/氯化银等)。在一些实施例中，当微流体装置具有带有DEP(OET)或电润湿(OEW)配置的基部基底，并且典型的ITO上电极时，向下基底施加电压。一旦用光照亮，基底就切换到低电阻状态。隔离围栏中的介质可以被配置为具有大约0.01S/M的导电系数，其高于被照亮的基底的导电系数，并且所施加的场的大部分落在填充围栏的介质之间。当隔离围栏内腔室的高度为约30至约150微米时，微操作(microporate)卵子所需的电场为约0.1至约5.0kV/cm、约0.1、0.3.-0.5、0.7、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.4、2.6、2.8、3.0、3.3、3.5、3.7、4.0、4.3、4.5、4.7或约5.0kV/cm或范围内的任何值。在一些实施例中，电场可以是约1.4kV/cm。在两个电极两端需要施加的电势将随腔室的高度而变化。在电激活期间使用的培养介质可以不同于用于培养卵母细胞、卵子或胚胎的培养介质。

可以在各种实施例中提供电刺激。在一个实施例中，可以在将卵子暴露于精子之后提供电刺激。例如，卵子可能不会被精子的侵入所激活，因此可能无法进行胚胎发育。精子可能无法诱导促进胚胎发育所需的细胞内钙浓度增加。电脉冲的应用可能引起启动受精卵发育所必需的细胞内钙离子浓度升高。在一些实施例中，离子载体也可以存在于电刺激期间或电刺激之后。由电脉冲引起的微操作可以使离子载体和/或钙离子的通路代替/诱导由正常功能的精子受精所诱导的钙(Ca⁺²)瞬变。

在其它实施例中，可以在不存在精子的情况下提供电刺激，以引发卵母细胞的孤雌生殖发育。这些人为触发的细胞在不经历细胞分裂的情况下恢复减数分裂。这可以在存在离子载体(诸如离子霉素和/或钙2⁺离子)的情况下进行，或者可以仅用电刺激来刺激。这可以在专为电融合设计的介质中进行。例如，当在微流体装置的基底内存在DEP(例如，OET)或电润湿(例如，OEW)配置时，电穿孔介质的电导率可以为约0.01S/M或者可以在约0.001～1S/M的范围内。当人体卵母细胞被诱导成孤雌生殖时，发育不会进行到全期。然而，孤雌生殖人类胚胎可能发育晚于桑椹胚阶段并达到囊胚状态(32-64细胞，d4-5)。孤雌生殖囊胚可以用于建立人类胚胎干细胞系。囊胚可以被孵出，并且内细胞团(ICM)可以是隔离的或与合适的饲养细胞(例如，可以依次进行的脾细胞、成纤维细胞)共培养。共培养之后，可以建立原代胚胎干细胞集落。可以分离和培养hESC细胞。

可以在微流体装置内进行从孤雌生殖囊胚转化为胚胎干细胞的步骤。在其它实施例中，孤雌生殖囊胚可以从微流体装置导出，其余步骤在其它仪器中执行。在其它实施例中，在将ICM从孵出的囊胚在芯片外(off-chip)隔离之后，可以在进行刺激的相同或相似的微流体芯片上执行ICM与饲养细胞的共培养。ICM可以布置在隔离围栏的隔离区域内，并且可以在相同的隔离围栏或相邻隔离围栏中共培养饲养细胞。

在转化到胚胎干细胞集落之后，hESC可以从微流体装置导出，以进一步扩增、保存或使用。

相同的步骤用于来自非人类卵母细胞的孤雌胚胎，以便在其它物种(包括但不限于其它哺乳动物(例如小鼠))中建立胚胎细胞系。

取决于相对于卵母细胞发育阶段受刺激的时间，孤雌生殖hESC可以是基本上纯合的或基本上杂合的，并且通常可以是二倍体。在中期I阶段阻止减数分裂的同时刺激卵母细胞，这可以提供基本上杂合的hESC。在第二极体排出之后阻止减数分裂的同时进行刺激可以提供基本上纯合的hESC。在中期1与排出第二极体之前的卵母细胞发育阶段进行刺激可以提供杂合和纯合hESC的混合物。

在一些实施例中，未受精的人类卵母细胞的孤雌生殖可以用于产生多能干细胞。在一些实施例中，hESC可以是卵母细胞供体的HLA匹配(人类白细胞抗原)。可替代地，电刺激的孤雌生殖衍生的hESC可以建立患病的hESC细胞系，而无基因操作，这产生承载二倍体纯合突变的hESC。

化学处理。在一些实施例中，可以用化学试剂处理卵子或卵母细胞，以提升受精步骤期间成功的可能性。化学试剂可以是小分子试剂，或者可以是生物分子试剂。在一些实施例中，可以在将化学试剂(例如但不限于离子霉素、卡西霉素，氯化锶和/或氯化钙)暴露于精子之前，将其加入到卵子或卵母细胞的培养介质中。

在一些实施例中，通过将精子暴露于磷脂酶Cζ以恢复精子诱导启动正常胚胎发育所需的Ca⁺²瞬态的能力，能够使无生育能力的精子恢复正常功能。可以如此处理隔离围栏中的精子，以与其它隔离围栏中存在的卵子相隔离，或者可以在芯片外处理精子。可以通过用己酮可可碱(一种磷酸二酯酶抑制剂)进行处理来增大精子的运动性，其抑制已知精子运动性中所涉及的环磷酸腺苷的分解。在一些实施例中，当精子没有足够的运动性或穿透性时，由OET产生的DEP力可以用于使精子进入卵子。

暴露于体细胞。在一些实施例中，调理处理可以包括暴露于体细胞，其可以包括但不限于子宫细胞、子宫内膜细胞、卵丘颗粒细胞、间生PEG细胞和输卵管的非睫状分泌细胞，其中任何一个可以在生理相关和发育相关浓度下产生增大浓度的钾、碳酸氢盐、精氨酸、丙氨酸和谷氨酸和/或前列腺素。卵子或卵母细胞在引入精子之前可能暴露于卵丘颗粒细胞。在由卵子和精子形成胚胎之后，调理处理可以包括暴露于卵丘颗粒细胞、子宫细胞、子宫内膜细胞、间生PEG细胞、非睫状非分泌细胞或其任何组合。在一些实施例中，可以对胚胎进行调理处理，其可以包括暴露于卵丘颗粒细胞、以及由子宫内膜细胞、间生PEG细胞和非睫状非分泌细胞组成的组中的一个。暴露于体细胞可以是直接的(例如，在相同的隔离围栏内)或间接的(例如，在相邻或附近的隔离围栏中)，其中来自体细胞的分泌物可以通过扩散进入包含卵子、卵母细胞或胚胎的隔离围栏中。

拯救激活。在一些实施例中，可以在卵子上进行受精的初始尝试，并且通过成像和/或测试的监测可能显示胚胎发育没有进展。在这种情况下，可以采用上述调理处理的部分或全部来拯救激活，以开始第二次减数分裂，形成原核并进入胚胎的正常发育。

体外激活和体外成熟。在一些实施例中，进行调理处理，以激活卵母细胞/卵子或精子，用于随后的生物转化。例如，可以如本文所述监测和测试引入到微流体装置中的卵母细胞或卵子，并且可能发现其未充分发育以足以具有合理受精的机会。

如上所述，可以用诸如但不限于磷脂酶Cζ或己酮可可碱的试剂来处理精子，以激活用于受精的精子。

可以进行调理处理，以将卵母细胞或卵子推进到更成熟的状态，具有增强的胚胎发育潜力来更容易接受受精。将卵母细胞或卵子推进到更成熟状态(中期I、中期II)的调理处理的一些非限制性示例包括人体绒毛膜促性腺激素(hCG)、促卵泡激素(FSH)、类维生素A(包括视黄酸)、表皮生长因子(EGF)、雌二醇17β(E2)、滤泡减数分裂激活固醇(4,4-二甲基-5α-胆固醇-8,14,24-三烯-3β-醇)、脑源性神经营养因子、类胰岛素生长因子-1、褪黑激素、磷脂酶Cζ和/或溶血磷脂酸(LPA)。在一些实施例中，可以在存在卵丘颗粒细胞的情形下执行将卵母细胞或卵子暴露于调理化学试剂。

共培养。在一些实施例中，可以通过与子宫细胞、子宫内膜细胞、卵丘颗粒细胞、间生PEG细胞、输卵管的非睫状分泌细胞或其组合的共培养来执行卵母细胞的体外成熟。

用于操作和观察这种装置的微流体装置和系统。图1示出可以用于在体外生成胚胎的微流体装置100和系统150的示例，包括选择和评估卵子和/或卵母细胞和/或精子。示出了微流体装置100的透视图，其盖110被部分切除以提供微流体装置100的局部视图。微流体装置100通常包括具有流动路径106的微流体回路120，流体介质180可以流动到该流动路径106中和/或流动通过微流体回路120，可选地携带一个或多个微物体(未示出)。虽然在图1中示出单个微流体回路120，但是合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3)这种微流体回路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳流体装置。在图1所示的实施例中，微流体回路120包括多个微流量隔离围栏124、126、128和130，其每个具有与流动路径106流体连通的一个或多个开口。如下文进一步讨论的，微流体隔离围栏包括已被优化用于即使当介质180流过流动路径106时，仍然保留微流体装置(例如微流体装置100)中的微物体的各种特性和结构。然而，在描述上述之前，简要说明微流体装置100和系统150。

如图1中大体所示，微流体回路120由围界102限定。尽管围界102可以物理地构造成不同的配置，但是在图1所示的示例中，围界102被描述为包括支撑结构104(例如，基部)、微流体回路结构108和盖110。支撑结构104、微流体回路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体回路结构108可以布置在支撑结构104的内表面109上，盖110可以布置在微流体回路结构108上方。微流体回路结构108与支撑结构104和盖110一起，可以限定微流体回路120的元件。

如图1所示，支撑结构104可以位于微流体回路120的底部，盖110可以位于微流体回路120的顶部。可替代地，支撑结构104和盖110可以以其它取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体回路120的顶部，盖110可以位于微流体回路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，其每个包括进入或流出围界102的通路。例如，通路包括阀、门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体回路结构108中的间隙形成的通孔。然而，端口107可以位于围界102的其它组件(诸如盖110)中。图1中仅示出一个端口107，但是微流体回路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在用作流体进入微流体回路120的入口的第一端口107，并且可以存在用作流体离开微流体回路120的出口的第二端口107。端口107用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。

支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和一个基底或多个互连的基底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104还可以包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。

微流体回路结构108可以限定微流体回路120的回路元件。这种回路元件可以包括当微流体回路120充满流体时，可以流体上互连的空间或区域，诸如流动通道、腔室、围栏、捕集器等。在图1所示的微流体回路120中，微流体回路结构108包括框架114和微流体回路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体回路材料116。例如，框架114可以是基本上围绕微流体回路材料116的相对刚性结构。例如，框架114可以包括金属材料。

可以用空腔等来图案化微流体回路材料116，以限定微流体回路120的回路元件和互连。微流体回路材料116可以包括柔性材料，诸如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气的。可构成微流体回路材料116的材料的其它示例包括模制玻璃；可蚀刻材料，诸如硅树脂(例如光图案化硅或“PPS”)；光致抗蚀剂(例如SU8)等。在一些实施例中，这种材料(并且因此微流体回路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体回路材料116可以布置在支撑结构104上和框架114内部。

盖110可以是框架114和/或微流体回路材料116的集成部件。可替代地，盖110可以是结构上独立的元件，如图1所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体回路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体回路材料116分开的结构，如图所示，或者支撑结构104可以是框架114或微流体回路材料116的集成部件。类似地，框架114和微流体回路材料116可以是如图1所示的分离结构或相同结构的集成部件。

在一些实施例中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似特性的材料。在一些实施例中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，诸如PDMS。在一些实施例中，盖110可以既包括刚性材料也包括可变形材料。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于隔离围栏124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料相交界的可变形材料。在一些实施例中，盖110还可以包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，诸如氧化铟锡(ITO)，其可以涂覆在玻璃或类似绝缘材料上。可替代地，该一个或多个电极可以是嵌入在可变形材料(诸如聚合物(例如PDMS))中的柔性电极，诸如单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如US2012/0325665(Chiou等人)中描述了可以用于微流体装置的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施例中，可以修改盖110(例如，通过调节向内朝向微流体回路120的表面的全部或部分)来支持细胞粘附、生存能力和/或生长。这种修改可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施例中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可以包括至少一种透气的材料(例如，PDMS或PPS)。

图1还示出用于操作和控制微流体装置(诸如微流体装置100)的系统150。如图所示，系统150包括电源192、成像装置194和倾斜装置190。

电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。例如，电源192可以包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压或电流源。成像装置194可以包括用于捕获微流体回路120内的图像的装置(诸如数字照相机)。在一些情形下，成像装置194还包括具有快速帧速率和/或高灵敏度的检测器(例如用于低光应用)。成像装置194还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体回路120中并收集从微流体回路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射光束可以包括源自LED或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的发射的反射。如关于图3所讨论的，成像装置194还可以包括显微镜(或光学系统)，其可以包括或可以不包括目镜。

系统150还包括倾斜装置190，其被配置为围绕一个或多个旋转轴旋转微流体装置100。在一些实施例中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体回路120的围界102，使得微流体装置100(以及因此微流体回路120)可以保持在水平取向(即相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体回路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流体回路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以将微流体装置100(和微流体回路120)相对于x轴和/或y轴倾斜大于90°的角度，或者使微流体装置100(和微流体回路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以便完全反转微流体装置100(和微流体回路120)。类似地，在一些实施例中，倾斜装置190围绕由流动路径106或微流体回路120的某些其它部分限定的旋转轴来倾斜微流体装置100(和微流体回路120)。

在一些情形下，微流体装置100倾斜成垂直取向，使得流动路径106位于一个或多个隔离围栏的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示在由重力限定的垂直轴上，流动路径106被定位为高于一个或多个隔离围栏(即，在流动路径106上方的隔离围栏中的物体将具有比流动路径中的物体高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示在由重力限定的垂直轴上，流动路径106被定位为低于一个或多个隔离围栏(即，在流动路径106下方的隔离围栏中的物体将具有比流动路径中的物体低的重力势能)。

在一些情形下，倾斜装置190围绕平行于流动路径106的轴来倾斜微流体装置100。此外，微流体装置100可以倾斜成小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或多个隔离围栏的上方或下方，而不是位于隔离围栏的正上方或正下方。在其它情况下，倾斜装置190围绕垂直于流动路径106的轴来倾斜微流体装置100。在另外其它情况下，倾斜装置190围绕既不平行也不垂直于流动路径的轴来倾斜微流体装置100。

系统150还可以包括介质源178。介质源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，其每个用于保持不同的流体介质180。因此，如图1所示，介质源178可以是位于微流体装置100外部并与微流体装置100分离的装置。可替代地，介质源178可以全部或部分位于微流体装置100的围界102内。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。

图1还示出构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的示例的简化框图。如图所示，这种控制和监测设备152的示例包括主控制器154(包括用于控制介质源178的介质模块160)；运动模块162，用于控制微流体回路120中微物体(未示出)和/或介质(例如，介质的液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制用来捕获图像(例如，数字图像)的成像装置194(例如相机、显微镜、光源或其任何组合)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其它模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其它功能。如图所示，设备152还可以包括显示装置170和输入/输出装置172。

主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、微码等)操作。可替代地地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其它模块168。因此，可以由如上配置的主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其它模块168中的一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其它微流体装置所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其它模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中所使用的数据。

介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178将选择的流体介质180输入到围界102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制从围界102移除介质(例如，通过出口端口(未示出))。因此，可以将一个或多个介质选择性地输入到微流体回路120中以及从微流体回路120移除。介质模块160还可以控制微流体回路120内部流动路径106中流体介质180的流动。例如，在一些实施例中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，介质模块160阻止介质180在流动路径106中和通过围界102的流动。

运动模块162可以被配置为控制微流体回路120中微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文关于图2A和2B所讨论的，围界102可以包括介电泳(DEP)、光电镊子(OET)和/或光电润湿(OEW)配置(图1中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或隔离围栏124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。

成像模块164可以控制成像装置194。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置194的图像数据。来自成像装置194的图像数据可以包括由成像装置194捕获的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、介质液滴、标记(诸如荧光标记等)的积聚)。使用由成像装置194捕获的信息，成像模块164还可以计算微流体装置100内物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。

倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。可替代地或另外地，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时间，以优化微物体经由重力到一个或多个隔离围栏的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体回路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体回路120的倾斜，以便调节微物体和/或介质液滴在微流体回路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微物体和/或介质液滴在微流体回路120中的位置。

在图1所示的示例中，微流体回路120被示为包括微流体通道122和隔离围栏124、126、128、130。每个围栏包括通向通道122的开口，但是其它部分被包围，使得围栏可以将围栏中的微物体与通道122的流动路径106或其它围栏中的流体介质180和/或微物体基本上分离。在一些情形下，围栏124、126、128、130被配置为物理地圈住微流体回路120内的一个或多个微物体。根据本发明的隔离围栏可以包括各种形状、表面和特性，其利用DEP、OET、OEW、流体流动和/或重力优化以被使用，下文将详细讨论和示出。

微流体回路120可以包括任何数量的微流体隔离围栏。尽管示出了五个隔离围栏，但是微流体回路120可以具有更少或更多的隔离围栏。如图所示，微流体回路120的微流体隔离围栏124、126、128和130各自包含不同的特性和形状，其可以提供有益于生成胚胎的一个或多个益处(诸如，将一个卵子与相邻卵子隔离)。测试、刺激和受精都可以在单独的基础上进行，并且在一些实施例中可以在单个时间尺度上进行。在一些实施例中，微流体回路120包括多个相同的微流体隔离围栏。在一些实施例中，微流体回路120包括多个微流体隔离围栏，其中两个或更多个隔离围栏包括不同的结构和/或特性，其提供生成胚胎的不同益处。一个非限制示例可以包括将卵子维持在一种类型的围栏中，同时将精子保持在不同类型的围栏中。在另一个实施例中，隔离围栏中的至少一个被配置为具有适于为卵子提供电激活的电触点。在另一实施例中，来自子宫管(例如，输卵管或皮奥氏管)、卵丘细胞或其组合的不同类型的细胞(诸如子宫细胞、子宫内膜细胞、PEG(间生)细胞)可以布置在与包含卵子的隔离围栏相邻的隔离围栏中，使得来自周围隔离围栏的分泌物可以从每个相应的围栏扩散到含有卵子的围栏中，这在大规模的体外培养和受精中是不可能的。可用于生成胚胎的微流体装置可以包括隔离围栏124、126、128和130中或其变型的任何一个，或者可以包括如图4和图5A-图5C所配置的围栏430或其变型的围栏。

在图1所示的实施例中，示出了单通道122和流动路径106。然而，其它实施例可以包含多个通道122，每个通道被配置为包括流动路径106。微流体回路120还包括与流动路径106和流体介质180流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情形下，流动路径106包括单个路径。在一些情形下，单个路径被布置为Z字形图案，使得流动路径106在交替的方向上穿过微流体装置100两次或更多次。

在一些情形下，微流体回路120包括多个平行通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同的方向流动。在一些情形下，每个流动路径106内的流体介质沿正向或反向中的至少一个流动。在一些情形下，多个隔离围栏被配置为(例如，相对于通道122)使得隔离围栏可以并行加载有目标微物体。

在一些实施例中，微流体回路120还包括一个或多个微物体捕集器132。捕集器132通常形成在构成通道122的边界的壁中，并且可以与一个或多个微流体隔离围栏124、126、128、130的开口相对。在一些实施例中，捕集器132被配置为从流动路径106接收或捕获单个微物体。在一些实施例中，捕集器132被配置为从流动路径106接收或捕获多个微物体。在一些情形下，捕集器132包括基本上等于单个目标微物体的体积的体积。

捕集器132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入捕集器132。在一些情形下，捕集器132包括开口，开口的高度和宽度基本上等于单个目标微物体的尺寸，从而防止较大的微物体进入微物体捕集器。捕集器132还可以包括被配置为有助于保留捕集器132内的目标微物体的其它特性。在一些情形下，捕集器132相对于微流体隔离围栏的开口对准并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入隔离围栏的开口中的轨迹离开捕集器132。在一些情形下，捕集器132包括小于目标微物体的侧通路134，以便有助于穿过捕集器132的流，从而增大在捕集器132中捕获微物体的可能性。

在一些实施例中，通过一个或多个电极(未示出)将介电泳(DEP)力施加在流体介质180(例如，在流动路径中和/或在隔离围栏中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施例中，将DEP力施加到微流体回路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔离围栏。在一些实施例中，使用DEP力来防止隔离围栏(例如，隔离围栏124、126、128或130)内的微物体从隔离围栏移位。此外，在一些实施例中，使用DEP力，来从根据本发明的教导先前收集的隔离围栏中选择性地移除微物体。在一些实施例中，DEP力包括光电镊子(OET)力。

在其它实施例中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(OEW)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定流动路径和/或隔离围栏的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体回路120中的液滴。例如，在一些实施例中，将OEW力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体隔离围栏中。在一些实施例中，使用OEW力来防止隔离围栏(例如，隔离围栏124、126、128或130)内的液滴从隔离围栏移位。另外，在一些实施例中，使用OEW力来从根据本发明的教导先前收集的隔离围栏中选择性地移除液滴。

在一些实施例中，将DEP和/或OEW力与其它力(诸如流动和/或重力)结合，以便操纵、运输、分离和分类微流体回路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将围界102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体隔离围栏之上，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到围栏。在一些实施例中，可以在施加其它力之前施加DEP和/或OEW力。在其它实施例中，可以在施加其它力之后施加DEP和/或OEW力。在其它情况下，可以在施加其它力的同时施加DEP和/或OEW力，或者可以交替地施加DEP和/或OEW力和其它力。

图2A-2F示出可用于本发明实践中的微流体装置的各种实施例。图2A描述了微流体装置200被配置为光学致动的动电装置的实施例。本领域中已知各种光学致动的动电装置，包括具有光电镊子(OET)配置的装置和具有光电润湿(OEW)配置的装置。在以下美国专利文献中示出合适的OET配置的示例，其均通过引用整体并入本文：美国专利第RE 44,711号(Wu等人)(最初以美国专利号7,612,355发布)；和美国专利第7,956,339号(Ohta等人)。美国专利第6,958,132号(Chiou等人)和美国专利申请公布第2012/0024708号(Chiou等人)中示出了OEW配置的示例，上述两者都通过引用整体并入本文。光学致动的动电装置的另一个示例包括组合的OET/OEW配置，在美国专利公布20150306598号(Khandros等人)和20150306599(Khandros等人)以及其对应的PCT公布WO2015/164846和WO2015/164847中示出其示例，其通过引用整体并入本文。

例如在美国2014/0116881(申请号14/060,117，提交于2013年10月22日)、美国2015/0151298(申请号14/520,568，提交于2014年10月22日)和美国2015/0165436(申请号14/521,447，提交于2014年10月22日)中描述了具有其中可以放置、培养和/或监测卵母细胞、卵子或胚胎的围栏的微流体装置的示例，上述每一个通过引用整体并入本文。美国申请号14/520,568和14/521,447还描述了分析在微流体装置中培养的细胞分泌物的示例性方法。前述申请中的每一个还描述被配置为产生介电泳(DEP)力(诸如光电镊子(OET))或被配置为提供光电润湿(OEW)的微流体装置。例如，US2014/0116881的图2中所示的光电镊子装置是可用于本发明实施例中的装置的示例，用于选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体。

微流体装置运动配置。如上所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体回路中诸如微物体或液滴的物体。微流体装置可以具有各种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其它考量。例如，可以利用介电泳(DEP)配置来选择和移动微流体回路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括DEP配置，用于选择性地在微流体回路120中的流体介质180中的微物体上诱导DEP力，从而选择、捕获和/或移动单个微物体或微物体组。可替代地，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(EW)配置，用于在微流体回路120中的流体介质180中的液滴上选择性地诱导EW力，从而选择、捕获和/或移动单个液滴或液滴组。

在图2A和图2B中示出包括DEP配置的微流体装置200的一个示例。虽然为了简单起见，图2A和图2B分别示出具有开放区域/腔室202的微流体装置200的围界102的一部分的侧截面图和顶截面图，应当理解，区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体回路元件的一部分，诸如生长腔室、隔离围栏、流动区域或流动通道。此外，微流体装置200可以包括其它流体回路元件。例如，微流体装置200可以包括多个生长腔室或隔离围栏和/或一个或多个流动区域或流动通道，诸如本文关于微流体装置100所述的那些。DEP配置可以被并入微流体装置200的任何这种流体回路元件，或选择其一部分。还应当理解的是，上述或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任何一个可以被并入微流体装置200中和/或与微流体装置200结合使用。例如，包括上述控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，该系统150包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其它模块168中的一个或多个。

如图2A所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化基底206的支撑结构104、以及具有顶部电极210的盖110，顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化基底206限定区域/腔室202的相对表面。因此，包含在区域/腔室202中的介质180在顶部电极210与电极活化基底206之间提供电阻连接。还示出了电源212，其被配置为被连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室202中产生DEP力所需要的。例如，电源212可以是交流(AC)电源。

在一些实施例中，图2A和图2B所示的微流体装置200可以具有光学致动的DEP配置。因此，可由运动模块162控制的来自光源220的光222的变化图案可以选择性地激活和去激活电极活化基底206的内表面208的区域214处的DEP电极的变化图案。(下文中，具有DEP配置的微流体装置的区域214被称为“DEP电极区域”。)如图2B所示，指向电极活化基底206的内表面208的光图案222可以照亮以诸如正方形的图案选择的DEP电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未照射的DEP电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极活化基底206的相对电阻抗(即，从底部电极204直到与流动区域106中介质180相交界的电极活化基底206的内表面208)大于通过每个暗DEP电极区域214处的区域/腔室202中的介质180的相对电阻抗(即，从电极活化基底206的内表面208到盖110的顶部电极210)。然而，照亮的DEP电极区域214a表现出通过电极活化基底206的减小的相对阻抗，其小于通过每个照亮的DEP电极区域214a处的区域/腔室202中介质180的相对阻抗。

在电源212被激活的情况下，前述DEP配置在照射的DEP电极区域214a与相邻的暗DEP电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体介质180中附近微物体(未示出)的局部DEP力。因此，可以通过改变从光源220投射到微流体装置200的光图案222，在区域/腔室202的内表面处的许多不同的这种DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体介质180中微物体的DEP电极。DEP力吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电特性的这种参数。

图2B所示的照亮的DEP电极区域214a的正方形图案224仅仅是示例。通过投射到装置200的光图案222可以照射(从而被激活)DEP电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案222来反复改变照亮的/激活的DEP电极区域214的图案。

在一些实施例中，电极活化基底206可以包括光电导材料或由光电导材料组成。在这样的实施例中，电极活化基底206的内表面208可以是无特性的。例如，电极活化基底206可以包括氢化非晶硅(a-Si：H)层或由其构成。a-Si：H可以包括例如约8％至40％的氢(以100*氢原子数/氢和硅原子的总数计算)。a-Si：H层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。在这样的实施例中，可以根据光图案222，在电极活化基底206的内表面208上的任何地方以任何图案来形成DEP电极区域214。因此，无需固定DEP电极区域214的数量和图案，而是可以将其对应于光图案222。已经在例如美国专利第RE44,711号(Wu等人)(最初发布为美国专利第7,612,355号)中描述了具有包括上述光电导层的DEP配置的微流体装置的示例，其全部内容通过引用并入本文。

在其它实施例中，电极活化基底206可以包括具有多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和诸如在半导体领域中已知的形成半导体集成电路的导电层的基底。例如，电极活化基底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管对应于DEP电极区域214。可替代地，电极活化基底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如导电金属电极)，每个这种电极对应于DEP电极区域214。电极活化基底206可以包括这种光电晶体管或光电晶体管控制电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上正方形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列，如图2B所示。可替代地，图案可以是形成六方点格的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制电极的阵列。不管何种图案，电路元件可以在电极活化基底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案222选择性地激活和去激活那些电连接(即光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接可以具有高阻抗，使得通过电极活化基底206的相对阻抗(即，从底部电极204到与区域/腔室202中介质180相交界的电极活化基底206的内表面208)大于在相应DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗(即，从电极活化基底206的内表面208到盖110的顶部电极210)。然而，当由光图案222中的光激活时，通过电极活化基底206的相对阻抗小于在每个照亮的DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗，从而在相应DEP电极区域214处激活DEP电极，如上所述。因此，可以按照光图案222确定的方式，在区域/腔室202中电极活化基底206的内表面208处的许多不同DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引和排斥介质180中的微物体(未示出)的DEP电极。

在例如美国专利第7,956,339号(Ohta等人)中已经描述了具有包括光电晶体管的电极活化基底的微流体装置的示例(参见例如图21和图22所示的装置300以及其说明书)，其全部内容通过引用并入本文。在例如美国专利公布第214/0124370号(Short等)中已经描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化基底的微流体装置的示例(参见例如各个附图所示的装置200、400、500、600和900以及其说明书)，其全部内容通过引用并入本文。

在DEP配置的微流体装置的一些实施例中，顶部电极210是围界102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化基底206和底部电极204是围界102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室202可以在第一壁与第二壁之间。在其它实施例中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化基底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源220可以替代地用于从下方照亮围界102。

利用具有DEP配置的图2A-图2B的微流体装置200，通过将光图案222投射到装置200，以便以围绕并捕获微物体的图案(例如，正方形图案224)来激活电极活化基底206的内表面208的DEP电极区域214a处的第一组一个或多个DEP电极，运动模块162可以在区域/腔室202中选择介质180中的微物体(未示出)。然后运动模块162可以通过相对于装置200移动光图案222以激活在DEP电极区域214处的第二组一个或多个DEP电极，来移动捕获到的微物体。可替代地，可以相对于光图案222来移动装置200。

在其它实施例中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化基底206的内表面208处的DEP电极的光激活的DEP配置。例如，电极活化基底206可以包括与包含至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的选择性可寻址和可激励电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)，以激活或去激活DEP电极区域214处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室202中的微物体(未示出)上形成净DEP力。取决于诸如电源212的频率和区域/腔室202中介质(未示出)和/或微物体的介电特性的特征，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组DEP电极(例如，在形成正方形图案224的一组DEP电极区域214处)，可以在区域/腔室202内捕集和移动区域/腔室202中的一个或多个微物体。图1中的运动模块162可以控制这种开关，从而激活和去激活各个DEP电极，以选择、捕集和移动区域/腔室202周围的特殊微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址和可激励电极的DEP配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经在例如美国专利第6,294,063号(Becker等人)和第6,942,776号(Medoro))中描述，其全部内容通过引用并入本文。

作为又一示例，微流体装置200可以具有电润湿(EW)配置，其可以代替DEP配置，或者可以位于微流体装置200中与具有DEP配置的部分分离的一部分中。EW配置可以是光电润湿配置或介质上电润湿(EWOD)配置，这两者都是本领域已知的。在一些EW配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)与底部电极204之间的电极活化基底206。介电层可以包括疏水材料和/或可以涂覆有疏水材料。对于具有EW配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。

介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如约125nm至约175nm)的厚度。在一些实施例中，介电层可以包括氧化物(诸如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪))的层。在一些实施例中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，诸如硅的氧化物或氮化物。无论确切的组分和厚度如何，介电层可以具有约10kΩ至约50kΩ的阻抗。

在一些实施例中，介电层的向内朝向区域/腔室202的内表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的示例包括全氟聚合物，诸如聚四氟乙烯(例如，)或聚(2,3-二氟甲基-全氟四氢呋喃)(例如CYTOP^TM)。构成疏水材料的分子可以共价接合到介电层的表面。例如，可以通过连接基团(诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团)将疏水材料的分子共价结合到介电层的表面。因此，在一些实施例中，疏水材料可以包括烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳的链，或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。可替代地，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可以包含氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施例中，疏水涂层具有约10nm至约50nm的厚度。在其它实施例中，疏水涂层具有小于10nm(例如，小于5nm、或约1.5至3.0nm)的厚度。

在一些实施例中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是与用于涂覆支撑结构104的介电层相同的疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层与顶部电极210之间的电极活化基底206。电极活化基底206和盖110的介电层可以具有与电极活化基底206和支撑结构104的介电层相同的组分和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。

在一些实施例中，如上所述，电极活化基底206可以包括光电导材料。因此，在一些实施例中，电极活化基底206可以包括氢化非晶硅层(a-Si：H)或由其构成。a-Si：H可以包括例如约8％至40％的氢(以100*氢原子数/氢和硅原子的总数计算)。a-Si：H层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。可替代地，如上所述，电极活化基底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置是本领域已知的和/或可以用本领域已知的电极活化基底来构建。例如，美国专利第6,958,132号(Chiou等人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-Si：H的光电导材料的光电润湿配置，而上述参引的美国专利公布第2204/0124370号(Short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化基底。

因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案222可以用于激活电极活化基底206中的光电导EW区域或光响应EW电极。电极活化基底206的这种激活的EW区域或EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射到电极活化基底206上的光图案222(或相对于光源220移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，含有水介质、溶液或溶剂)穿过存在于区域/腔室202中的不混溶流体(例如，油介质)。

在其它实施例中，微流体装置200可以具有EWOD配置，并且电极活化基底206可以包括不依赖于光进行激活的选择性可寻址和可激励的电极。因此，电极活化基底206可以包括这种电润湿(EW)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形EW电极的阵列，如图2B所示。可替代地，图案可以是形成六边点格的基本上六边形EW电极的阵列。不管何种图案，可以通过电开关(例如半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)EW电极。通过选择性地激活和去激活电极活化基底206中的EW电极，可以在区域/腔室202内移动与覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208相接触的液滴(未示出)。图1中的运动模块162可以控制这样的开关，从而激活和去激活各个EW电极，以选择并移动区域/腔室202周围的特殊液滴。具有包括选择性寻址和可激励电极的EWOD配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经在例如美国专利第8,685,344号(Sundarsan等人)中进行了描述，其全部内容通过引用并入本文。

不管微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源212可以与图1参引的电源192相同或是图1参引的电源192的组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。对于AC电压，如上所述，电源212可以提供足以产生足够强大以捕集和移动区域/腔室202中各个微物体(未示出)的净DEP力(或电润湿力)的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围，和/或还如上所述，电源212可以提供足以改变区域/腔室202中支撑结构104的内表面208(即介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿特性的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围。这种频率范围和平均或峰值功率范围是本领域已知的。例如，参见美国专利第6,958,132号(Chiou等人)、美国专利第RE44,711号(Wu等人)(最初发布为美国专利第7,612,355号)和美国专利申请公布第US2014/0124370号(Short等人)、US2015/0306598(Khandros等人)和US2015/0306599(Khandros等人)。

隔离围栏。在图2C和图2D所示的微流体装置240内示出一般隔离围栏244、246和248的非限制性示例。每个隔离围栏244、246和248可以包括分离结构250，其限定分离区域258和将分离区域258流体连接到通道122的连接区域254。连接区域254可以包括到通道122的近端开口252以及到分离区域258的远端开口256。连接区域254可以被配置为使得从通道122流入隔离围栏244、246、248的流体介质(未示出)流动的最大穿透深度不延伸到分离区域258。因此，由于连接区域254，因此，布置在隔离围栏244、246、248的分离区域258中的微物体(未示出)或其它材料(未示出)可以与通道122中的介质180的流动分离并且基本上不受其影响。

因此，通道122可以是波及区域的示例，并且隔离围栏244、246、248的分离区域258可以是未波及区域的示例。如所示的，通道122和隔离围栏244、246、248可以被配置为包含一个或多个流体介质180。在图2C-图2D所示的示例中，端口242被连接到通道122并且允许将流体介质180引入微流体装置240或从微流体装置240移除流体介质180。在引入流体介质180之前，可以用诸如二氧化碳气体的气体来装填微流体装置。一旦微流体装置240包含流体介质180，则可以选择性地产生和停止通道122中的流体介质180的流260。例如，如图所示，端口242可以布置在通道122的不同位置(例如，相对端)处，并且可以从用作入口的一个端口242到用作出口的另一端口242形成介质的流260。

图2E示出根据本发明的隔离围栏244的示例的详细视图。还示出微物体270的示例。

众所周知，微流体通道122中流体介质180的流260经过隔离围栏244的近端开口252可以使得介质180的二次流262进入和/或离开隔离围栏244。为了将隔离围栏244的分离区域258中的微物体270与二次流262分离，隔离围栏244的连接区域254的长度L_con(即，从近端开口252到远端开口256)应该大于二次流262进入到连接区域254的穿透深度D_p。二次流262的穿透深度D_p取决于在通道122中流动的流体介质180的速度、以及与通道122的配置相关的各种参数、以及到通道122的连接区域254的近端开口252。对于给定的微流体装置，通道122和开口252的配置将是固定的，而通道122中流体介质180的流260速率将是可变的。因此，对于每个隔离围栏244，可以识别通道122中流体介质180流260的最大速度V_max，确保二次流262的穿透深度D_p不超过连接区域254的长度L_con。只要通道122中流体介质180的流260速率不超过最大速度V_max，则所得到的二次流262可以被限制到通道122和连接区域254并保持在分离区域258之外。因此，通道122中的介质180的流260将不会把微物体270拖拽出分离区域258。相反，位于分离区域258中的微物体270将停留在分离区域258中，而不管通道122中流体介质180的流260。

此外，只要通道122中介质180的流260速率不超过V_max，通道122中流体介质180的流260将不会把混杂颗粒(例如微粒和/或纳米颗粒)从通道122移至隔离围栏244的分离区域258。使得连接区域254的长度L_con大于二次流262的最大穿透深度D_p，可以因此防止一个隔离围栏244被来自通道122或另一个隔离围栏(例如，图2D中的隔离围栏246、248)的混杂颗粒污染。

由于通道122和隔离围栏244、246、248的连接区域254可能受通道122中介质180的流260的影响，所以通道122和连接区域254可以被认为是波及(或流动)区域。另一方面，隔离围栏244、246、248的分离区域258可以被认为是未波及(或非流动)区域。例如，通道122中第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分扩散(从通道122经过连接区域254并进入到分离区域258中的第二流体介质280)与分离区域258中的第二流体介质280混合。类似地，分离区域258中第二介质280的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质280的组分扩散(从分离区域258经过连接区域254并进入到通道122中的第一介质180)与通道122中的第一介质180混合。第一介质180可以是与第二介质280相同或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质280可以在开始时是相同的，然后变得不同(例如，通过由分离区域258中的一个或多个细胞来调节第二介质280，或者通过改变流过通道122的介质180)。

由通道122中流体介质180的流260引起的二次流262的最大穿透深度D_p可以取决于如上所述的多个参数。这类参数的示例包括：通道122的形状(例如，通道可以将介质引导到连接区域254中，将介质从连接区域254转移，或者沿着基本上垂直于连接区域254的近端开口252的方向将介质引导到通道122中)；通道122在近端开口252处的宽度W_ch(或横截面积)；和连接区域254在近端开口252处的宽度W_con(或横截面积)；通道122中流体介质180的流260的速度V；第一介质180和/或第二介质280的粘度等。

在一些实施例中，通道122和隔离围栏244、246、248的尺寸可以相对于通道122中的流体介质180的流260的向量被定向如下：通道宽度W_ch(或通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流260；连接区域254在开口252处的宽度W_con(或横截面积)可以基本上平行于通道122中介质180的流260；和/或连接区域的长度L_con可以基本上垂直于通道122中介质180的流260。前述仅仅是示例，并且通道122和隔离围栏244、246、248的相对位置可以是相对于彼此的其它取向。

如图2E所示，连接区域254的宽度W_con可以从近端开口252到远端开口256是均匀的。因此，连接区域254在远端开口256处的宽度W_con可以是本文为连接区域254在近端开口252处的宽度W_con所标识的范围。可替代地，连接区域254在远端开口256处的宽度W_con可以大于连接区域254在近端开口252处的宽度W_con。

如图2E所示，分离区域258在远端开口256处的宽度可以与连接区域254在近端开口252处的宽度W_con基本相同。因此，分离区域258在远端开口256处的宽度可以是本文为连接区域254在近端开口252处的宽度W_con所标识的任何范围。可替代地，分离区域258在远端开口256处的宽度可以大于或小于连接区域254在近端开口252处的宽度W_con。此外，远端开口256可以小于近端开口252，并且连接区域254的宽度W_con可以在近端开口252与远端开口256之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域254可以在近端开口与远端开口之间变窄。此外，连接区域254的任何部分或子部分(例如，连接区域与近端开口252相邻的一部分)可以变窄。

在隔离围栏(例如124、126、128、130、244、246或248)的各种实施例中，分离区域(例如258)被配置为包含多个微物体。在其它实施例中，分离区域可以被配置为仅仅包含一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数量的微物体。因此，例如，分离区域的体积可以是至少4×10⁵、8×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶、6×10⁶立方微米或更大。

在隔离围栏的各种实施例中，通道122在近端开口(例如252)处的宽度W_ch可以在以下范围内：50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米和100-120微米。上述仅仅是示例，并且通道122的宽度W_ch可以在其它范围内(例如，由上面列出的任何端点限定的范围)。此外，通道122的W_ch可以被选择为通道在除了隔离围栏的近端开口之外的区域中的任何一个范围。

在一些实施例中，隔离围栏的横截面的高度为约30至约200微米、或约50至约150微米。在一些实施例中，隔离围栏的横截面积为约100,000至约2,500,000平方微米、或约200,000至约2,000,000平方微米。在一些实施例中，连接区域具有与对应的隔离围栏的横截面高度相匹配的横截面高度。在一些实施例中，连接区域具有约50至约500微米、或约100至约300微米的横截面宽度。

在隔离围栏的各种实施例中，通道122在近端开口252处的高度H_ch可以在以下任何范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。上述仅仅是示例，并且通道122的高度H_ch可以在其它范围内(例如，由上述任何端点限定的范围)。通道122的高度H_ch可以被选择为通道在除了隔离围栏的近端开口之外的区域中的任何一个范围。

在隔离围栏的各种实施例中，通道122在近端开口252处的横截面面积可以在以下任何范围内：500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米、或3,000至6,000平方微米。上述仅仅是示例，并且通道122在近端开口252处的横截面积可以在其它范围内(例如，由上述任何端点限定的范围)。

在隔离围栏的各种实施例中，连接区域254的长度L_con可以在以下任何范围内：1-200微米、5-150微米、10-100微米、15-80微米、20-60微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米和100-150微米。上述仅仅是示例，并且连接区域254的长度L_con可以在与上述示例不同的范围内(例如，由上述任何端点限定的范围)。

在隔离围栏的各种实施例中，连接区域254在近端开口252处的宽度W_con可以在以下任何范围内：20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米和80-100微米。上述仅仅是示例，并且连接区域254在近端开口252处的宽度W_con可以不同于前述示例(例如，由上面列出的任何端点限定的范围)。

在隔离围栏的各种实施例中，连接区域254在近端开口252处的宽度W_con可以至少与隔离围栏专供微物体(例如，卵母细胞、卵子、胚胎、精子)使用的最大尺寸一样大。例如，将放置卵母细胞、卵子或胚胎的隔离围栏的连接区域254在近端开口252处的宽度W_con可以在以下任何范围内：大约100微米、大约110微米、大约120微米、大约130微米、大约140微米、大约150微米、大约160微米、大约170微米、大约180微米、大约190微米、大约200微米、或大约100-200微米、大约120-200微米或大约140-200微米。上述仅仅是示例，并且连接区域254在近端开口252处的宽度W_con可以不同于前述示例(例如，由上面列出的任何端点限定的范围)。

在隔离围栏的各种实施例中，连接区域254的长度L_con与连接区域254在近端开口252处的宽度W_con之比可以大于或等于以下任一比例：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。上述仅仅是示例，并且连接区域254的长度L_con与连接区域254在近端开口252处的宽度W_con之比可以与上述示例不同。

在微流体装置100、200、240、290的各种实施例中，V_max可以被设置为约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、or 1.5μL/sec。

在具有隔离围栏的微流体装置的各种实施例中，隔离围栏的分离区域258的体积可以是例如至少5×10⁵、8×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶、6×10⁶、8×10⁶、1×10⁷立方微米或或更大。在具有隔离围栏的微流体装置的各种实施例中，隔离围栏的体积可以是约5×10⁵、6×10⁵、8×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、4×10⁶、8×10⁶、1×10⁷、3×10⁷、5×10⁷或约8×10⁷立方微米或更大。

在各种实施例中，微流体装置具有如本文所述的任何实施例中所配置的隔离围栏，其中微流体装置具有约5至约10个隔离围栏、约10至约50个隔离围栏、约100至约500个隔离围栏、约200至约1000个隔离围栏或约500至约1500个隔离围栏。这些隔离围栏无需全部具有相同的尺寸。

图2F示出根据一个实施例的微流体装置290。图2F中示出的微流体装置290是微流体装置100的程式化图。实际上，微流体装置290及其组成回路元件(例如，通道122和隔离围栏128)将具有本文所讨论的尺寸。图2F中示出的微流体回路120具有两个端口107、四个不同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置290还包括通到每个通道122的多个隔离围栏。在图2F所示的微流体装置中，隔离围栏具有类似于图2E所示围栏的几何形状，因此具有连接区域和分离区域。因此，微流体回路120既包括波及区域(例如，通道122和在二次流262的最大穿透深度D_p内的连接区域254的部分)也包括非波及区域(例如，分离区域258和不在二次流262的最大穿透深度D_p内的连接区域254的部分)。

图3A至图3B示出可用于操作和观察根据本发明的微流体装置(例如，100、200、440、290)的系统150的各种实施例。如图3A所示，系统150可以包括被配置为保持微流体装置100(未示出)或本文所述的任何其它微流体装置的结构(“巢(nest)”)300。巢300可以包括能够与微流体装置360(例如，光学致动的动电装置100)交界并且提供从电源192到微流体装置360的电连接的插座302。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。集成的电信号生成子系统304可以被配置为向插座302提供偏置电压，使得当插座302保持微插流器装置360时，在微插流器装置360中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。将偏置电压施加到微流体装置360的能力并不意味着当插座302保持微流体装置360时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏置电压，例如，仅在需要在微流体装置360中便于生成动电力(例如介电泳或电润湿)时，才施加偏置电压。

如图3A所示，巢300可以包括印刷电路板组件(PCBA)320。电信号生成子系统304可以安装在PCBA 320上并被电集成到PCBA 320中。示例性支撑件也包括安装在PCBA 320上的插座302。

通常，电信号生成子系统304将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量由插座302保持的提供给微流体装置360的波形。在一些实施例中，示波器测量在接近微流体装置360(和远离波形发生器)位置处的波形，从而确保更准确地测量实际施加到装置的波形。例如，从示波器测量值获得的数据可以被提供为对波形发生器的反馈，并且波形发生器可以被配置为基于这种反馈来调节其输出。Red Pitaya^TM是一个合适的组合式波形发生器和示波器的示例。

在一些实施例中，巢300还包括控制器308，诸如用于感测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的示例包括Arduino^TM微处理器，诸如ArduinoNano^TM。控制器308可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1所示)进行通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施例中，控制器308通过接口310(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。

在一些实施例中，巢300可以包括电信号生成子系统304，其包括Red Pitaya^TM波形发生器/示波器单元(“Red Pitaya^TM单元”)和波形放大电路，其中波形放大电路将RedPitaya^TM单元产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置100。在一些实施例中，Red Pitaya^TM单元被配置为测量微流体装置360处的放大电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得在微流体装置360处测量到的电压是期望值。在一些实施例中，波形放大电路可以具有由安装在PCBA 320上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V的电源，从而在微流体装置100处产生高达13Vpp的信号。

如图3A所示，支撑结构300还可以包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调整由支撑结构300保持的微流体装置360的温度。例如，热控制子系统306可以包括Peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。Peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置360的至少一个表面相交界的第一表面。例如，冷却单元可以是冷却块(未示出)，诸如液体冷却铝块。Peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径330，流体路径330被配置为通过冷却块循环冷却的流体。在图3A所示的实施例中，支撑结构300包括入口332和出口334，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入流体路径330并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施例中，Peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径330可以安装在支撑结构300的壳体340上。在一些实施例中，热控制子系统306被配置为调整Peltier热电装置的温度，以便实现微流体装置360的目标温度。例如，可以通过诸如Pololu^TM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.(PololuRobotic和Electronics公司))的热电电源来实现Peltier热电装置的温度调整。热控制子系统306可以包括反馈电路，诸如由模拟电路提供的温度值。可替代地，可以由数字电路提供反馈电路。

在一些实施例中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，其中反馈电路是包括电阻器(例如，电阻为1kΩ+/-0.1％，温度系数+/-0.02ppm/C0)和NTC热敏电阻(例如，标称电阻为1kΩ+/-0.01％)的模拟分压器电路(未示出)。在一些示例中，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载PID控制环路算法的输入。例如，来自PID控制环路算法的输出可以驱动Pololu^TM马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制Peltier热电装置。

巢300可以包括串行端口350，其允许控制器308的微处理器经由接口310与外部主控制器154进行通信。另外，控制器308的微处理器可以与电信号生成子系统304和热控制子系统306进行通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器308、接口310和串行端口350的组合，电信号生成子系统308和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其它方面之外，主控制器154可以通过执行用于输出电压调节的缩放计算，以辅助电信号生成子系统308。通过耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统308获得的温度和波形数据。可替代地或另外地，GUI可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。

如上所述，系统150可以包括成像装置194。在一些实施例中，成像装置194包括光调制子系统404。光调制子系统404可以包括数字反射镜装置(DMD)或微快门阵列系统(MSA)，其中任一个可以被配置为接收来自光源402光并将接收到的光的一部分发送到显微镜400的光具组中。可替代地，光调制子系统404可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源402)，诸如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)器件、铁电硅基液晶(FLCOS)或透射液晶显示器(LCD)。例如，光调制子系统404可以是投影仪。因此，光调制子系统404能够发射结构化的光和非结构化的光。合适的光调制子系统404的一个示例是来自AndorTechnologies^TM的Mosaic^TM系统。在一些实施例中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统404。

在一些实施例中，成像装置194还包括显微镜400。在这种实施例中，巢300和光调制子系统404可以被单独地配置为安装在显微镜400上。例如，显微镜400可以是标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置为安装在显微镜400的载物台410上和/或光调制子系统404可以被配置成安装在显微镜400的端口上。在其它实施例中，巢300和光调制子系统404可以是显微镜400的集成组件。

在一些实施例中，显微镜400还可以包括一个或多个检测器422。在一些实施例中，由成像模块164控制检测器422。检测器422可以包括目镜、电荷耦合器件(CCD)、相机(例如，数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器422，则一个检测器可以是例如快速帧率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜400可以包括一种光具组，其被配置为接收从微流体装置360反射和/或发射的光并且将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦在一个或多个检测器422上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同管透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以不同。

在一些实施例中，成像装置194被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源402来产生结构化的光(例如，经由光调制子系统404)，并且可以使用第二光源432来提供非结构化的光。第一光源402可以产生用于光学致动的电运动和/或荧光激发的结构化光，并且第二光源432可以用于提供亮视场照明。在这些实施例中，运动模块164可以用于控制第一光源404，并且成像模块164可以用于控制第二光源432。显微镜400的光具组可以被配置为(1)从光调制子系统404接收结构化的光，并且当该装置被支撑结构200保持时，将结构化的光聚焦在微流体装置(诸如光学致动的动电装置)中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器422上。光具组还可以被配置为从第二光源接收非结构化的光，并且当该装置被支撑结构300保持时，将非结构化的光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在一些实施例中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠区域。例如，第一区域可以是第二区域的一部分。

在图3B中，第一光源402被示为将光提供给光调制子系统404，其将结构化的光提供给显微镜400的光具组。第二光源432被示为经由分束器436将非结构化的光向提供给光具组。来自光调制子系统404的结构化光和来自第二光源432的非结构化光通过光具组一起从分束器436行进到达第二分束器436(或二向色滤光器406，取决于光调制子系统404提供的光)，其中光通过物镜408向下反射到样本平面412。然后来自样本平面412的被反射和/或发射的光通过物镜408、通过分束器和/或二向色滤光器406返回至二向色滤光器424。到达二向色滤光器424的仅仅一部分光穿过并到达检测器422。

在一些实施例中，第二光源432发射蓝光。利用适当的二向色滤光器424，从样本平面412反射的蓝光能够穿过二向色滤光器424并到达检测器422。相反地，来自光调制子系统404的结构化的光从样本平面412反射，但不穿过二向色滤光器424。在该示例中，二向色滤光器424滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，对来自光调制子系统404的光的这种滤除才算完成(如图所示)。在实践中，如果来自光调制子系统404的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光将穿过滤波器424以到达检测器422。在这种实施例中，滤波器424作用为改变从第一光源402和第二光源432到达检测器422的光量之间的平衡。如果第一光源402明显强于第二光源402，则这是有益的。在其它实施例中，第二光源432可以发射红光，并且二向色滤光器424可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。

示例

示例1。监测高生存能力的胚胎。如图4所示，胚胎可以被放置在微流体装置的隔离围栏430的隔离区域458中，其中上述微流体装置可以被配置为如微流体装置100、200、240或290中的任何一个。微流体装置可以具有流动路径，在该示例中是通道122，其流动260的方向被示为从左到右。隔离围栏被流体连接到流动路径，隔离围栏的近端开口452通向通道，使得通道在隔离围栏(和胚胎)周围提供新鲜的介质，新鲜介质不会流入隔离围栏并带走胚胎。通道壁414提供流动路径的边界，并且微流体装置的内表面208可以是可以被配置为DEP配置(包括光电镊子(OET)配置)或电润湿配置(包括光电(OEW)配置))的基底的顶表面或覆盖基底。可以通过流体流动、重力、DEP或电润湿力或其组合来将胚胎放置在隔离围栏中。隔离区域可以被配置为具有足够大的尺寸，以支持胚胎的培养，例如，足够大以防止废物积聚而对胚胎有毒并且足够小以防止细胞分泌的生存能力信号因子被过度稀释。培养介质的流动260可以是间断的或是以下常数：该常数为通过经由隔离围栏43的连接区域454从隔离区域458扩散而有效地提供必需的营养物并去除废物的速率。培养介质可以是可在整个实验中使用的Continuous SingleComplete(Irvine Scientific)。

在图5A中，捕获珠粒574可以通过任何适当的方式导入到邻近围栏430的近端开口452的通道122中，上述方式包括但不限于流体流动260、重力、DEP或电润湿。胚胎分泌物510通过扩散离开围栏430。通常地，停止流动260，以防止珠粒574和分泌物510沿着通道122移动并远离围栏430。可以由捕获珠粒574来捕获胚胎分泌物510，其中胚胎分泌物510邻近隔离围栏430移动或者被加载到隔离围栏430本身(未示出)中。可以在适当位置(例如，在流动路径中)或在从离开微流体装置之后测定第一组捕获珠粒574。可替代地或额外地，可以获得胚胎272的形态的一个或多个图像。可以在时间1处收集这种成像和/或分泌数据。时间1可以在单细胞受精卵阶段，如图5A所示。图5A-图5C的通道壁414、通道122、围栏430、隔离区域458、连接区域454、近端开口452和内表面208中的每一个分别如图4所示。

随后，可以由第二组捕获珠粒576来捕获胚胎分泌物512，其中胚胎分泌物512位于隔离围栏430附近或被加载到隔离围栏本身(未示出)中。另外，可以在适当位置(例如，在流动路径中)或在从微流体装置导出之后测定第二组捕获珠粒576。可替代地或额外地，可以获得胚胎274的形态的一个或多个额外图像。可以在时间2处收集这种成像和/或分泌数据。时间2可以在双细胞阶段，如图5B所示。由第二组捕获珠粒576执行的分泌测定可以与由第一组捕获珠粒574执行的测定相同或不同。

随后，可以由第三组捕获珠粒578来捕获胚胎分泌物514，其中胚胎分泌物514邻近隔离围栏或在隔离围栏本身(未示出)中移动。可以在适当位置(例如，在流动路径中)或在从微流体装置导出之后测定第三组捕获珠粒578。可替代地或额外地，可以获得胚胎276的形态的一个或多个额外图像。可以在时间3处收集这种成像和/或分泌数据。时间3可以在四细胞阶段，如图5C所示。由第三组捕获珠粒578执行的分泌测定可以与由第一组捕获珠粒(574)或第二组捕获珠粒(576)执行的测定相同，或与由第一组捕获珠粒(574)或第二组捕获珠粒(576)中一个或两个所执行的测定不同。例如，珠粒574可以被配置为从导致TaySachs疾病的单个基因中捕获核酸。芯片外分析可以识别胚胎272是否具有靶向突变。珠粒576可以包括具有针对样品板蛋白质(包括TNF、IL-10、MSP-α、SCF、CXCL 13、TRAILR 3、MIP-1β、GM-CSF和一种或两种持家蛋白质)的抗体的多个珠粒。还可以在芯片外处理珠粒，或者可替代地，可以通过使用芯片上多重荧光标记的二次抗体来识别珠粒。如果发现与持家蛋白质相比较，样品板蛋白质具有较大比例的荧光信号，则还可以研究胚胎274的非整倍体。通常，一组珠粒574、574和578可以被配置为捕获所有DNA。在一个非限制性示例中，这组珠粒可以是珠粒578，并且可以用于确定mtDNA与gDNA的比例。该比例将在4细胞发育时间点处产生胚胎适合度的测量，并且可以确定植入的适合度。

可选地，可以周期性地监测胚胎分泌物和形态，直到胚胎处于适合植入的发育阶段(例如，3天、4天或5天囊胚)。基于收集到的分泌物和/或形态数据，可以确定在胚胎植入后是否可能存活。只要胚胎可能存活(或预计在一组胚胎中具有最高生存能力，未示出)，胚胎276(或含有更大数量细胞的该胚胎的后续阶段)可以被植入未来的母体中。

示例2。在受精之前监测、测试和调理卵子。类似于示例1，可以将卵子672放置在隔离围栏430的隔离区域458中。可以如示例1所述配置微流体装置。将培养介质(G-GAMETE^TM(VitroLife))流入。培养介质的流动260可以是间断的或是以下常数：该常数为通过经由隔离围栏43的连接区域454扩散至隔离区域458(或从隔离区域458扩散)而有效地提供必需的营养物(并去除废物)的速率。可以通过流体流动、重力，DEP(包括OET)、电润湿力(包括OEW)或其组合来将卵子672放置到隔离围栏430中。

可以获得卵子672(未示出)的图像，并对其形态进行分析。额外地或可替代地，可以类似地分析受精中所使用的精子，以确定精子是否是可用的和运动的。基于分析结果(例如，卵子或精子之一具有缺陷的生理机能或功能)，在体外受精期间进行激活调节。精子可以流入通道122，并允许其进入隔离围栏。激活介质(BTXpress^TM Cytoporation^TM Media T(Fisher Scientific，Thermo Fisher Scientific的一部分))可以流入并替代初始介质。激活介质还可以含有浓度为约0.05mM的氯化钙。激活离子载体(诸如离子霉素或卡西霉素)在引入精子的约30分钟内以有效的浓度(在约1微摩尔至约15微摩尔的范围内)流入微流体通道122中。在暴露于离子载体试剂一段时间(其可以为大约30分钟)之后，流动260引入第二介质(例如，G-FERT^TM(VitroLife))来代替激活介质。此时卵子是可视化的，以确定是否发生受精。然后可以如上述示例1所述来监测和测试成功受精的卵子。

尽管在本说明书中已经描述了本发明的具体实施例和应用，但是这些实施例和应用仅仅是示例性的，并且许多变型是可能的。

Claims (83)

1.一种用于在微流体装置中产生胚胎的过程，所述过程包括：

将卵子引入到所述微流体装置的隔离围栏中；

将至少一个精子引入到所述微流体装置中；

允许所述至少一个精子在有利于所述卵子受精的条件下接触所述卵子；以及

将所接触的卵子和所述至少一个精子在所述微流体装置中培育一段时间，该段时间至少足够长以使所述卵子和所述至少一个精子形成胚胎。

2.根据权利要求1的过程，其中将所述卵子引入到所述隔离围栏中包括使用介电泳DEP力。

3.根据权利要求2所述的过程，其中所述DEP力由光电镊子(OET)配置产生。

4.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中将所述至少一个精子引入到所述隔离围栏包括使用介电泳DEP力。

5.根据权利要求1所述的过程，其中将所述卵子引入到所述隔离围栏中包括使用电润湿力。

6.根据权利要求5所述的过程，其中由OEW配置产生所述电润湿力。

7.根据权利要求1-3或5-6所述的过程，其中将所述至少一个精子引入到所述隔离围栏中包括使用电润湿力。

8.根据权利要求1所述的过程，其中将所述卵子引入到所述隔离围栏中包括使用流体流动和/或重力来输送所述卵子。

9.根据权利要求1或8所述的过程，其中将所述至少一个精子引入到所述微流体装置中包括使用流体流动和/或重力来运输所述至少一个精子。

10.根据前述权利要求中任一项所述的过程，还包括：

确定所述卵子的状态，

其中在将所述至少一个精子引入到所述微流体装置之前执行所述确定。

11.根据前述权利要求中任一项所述的过程，还包括：

确定所述卵子的状态，

其中在将所述卵子引入到所述隔离围栏之前执行所述确定。

12.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中在将所述至少一个精子引入到所述微流体装置之前，对所述卵子执行至少一种调理处理。

13.根据权利要求12所述的过程，其中所述至少一种调理处理是电处理或化学处理。

14.根据权利要求13所述的过程，其中所述至少一种调理处理是暴露于体细胞。

15.根据权利要求14所述的过程，其中所述体细胞是卵丘细胞。

16.根据权利要求14或15所述的过程，其中所述卵子被暴露于所述隔离围栏中的所述体细胞。

17.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中有利于所述卵子受精的条件包括所述卵子周围的介质的组分。

18.根据权利要求17所述的过程，还包括在将所述至少一个精子引入到所述微流体装置之前，改变所述卵子周围的所述介质的组分。

19.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中在将所述至少一个精子引入到所述微流体装置之后，对所述卵子进行至少一种调理处理。

20.根据权利要求19所述的过程，其中所述至少一种调理处理是电处理或化学处理。

21.根据前述权利要求中任一项所述的过程，还包括：

确定所接触的卵子和所述至少一个精子已经形成胚胎。

22.根据权利要求21所述的过程，其中确定已经形成胚胎包括视觉检查。

23.根据前述权利要求中任一项所述的过程，还包括对所述胚胎进行至少一种调理处理。

24.根据权利要求23所述的过程，其中对所述胚胎进行的所述至少一种调理处理是暴露于体细胞。

25.根据权利要求24所述的过程，其中所述胚胎被暴露的所述体细胞是卵丘细胞、子宫内膜细胞、非纤毛分泌细胞、PEG细胞或其任何组合。

26.根据权利要求21-25中任一项的过程，其中确定胚胎已经形成包括检测所述卵子被引入的隔离围栏内的分泌物或来自该隔离围栏的分泌物。

27.根据权利要求26所述的过程，其中分泌物的所述检测包括检测蛋白质或核酸。

28.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中所述卵子和所述至少一个精子中的每个都从哺乳动物获得。

29.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中所述隔离围栏包含单个卵子。

30.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中所述微流体装置包含多个隔离围栏。

31.根据权利要求30所述的过程，其中至少一个卵子被引入到所述多个隔离围栏中的两个或更多个隔离围栏的每一个中。

32.根据权利要求30所述的过程，其中将单个卵子引入到所述多个隔离围栏中的两个或更多个隔离围栏的每一个中。

33.根据前述权利要求中任一项所述的过程，还包括：

确定所接触的卵子和所述至少一个精子已经形成胚胎；以及

改变隔离围栏中胚胎周围的介质的组分。

34.根据权利要求33所述的过程，其中随着所述胚胎从单细胞胚胎发育成桑椹胚或囊胚，所述介质的组分改变不止一次。

35.根据权利要求33或34所述的过程，其中改变所述介质的组分包括改变所述介质的pH。

36.根据前述权利要求中任一项所述的过程，还包括：

将所述胚胎从所述隔离围栏中导出。

37.根据权利要求36所述的过程，还包括：

将所述胚胎从所述微流体装置导出。

38.根据前述权利要求中任一项所述的过程，其中：

所述微流体装置还包括被配置为包含流体介质的通道；以及

所述隔离围栏包括隔离区域和连接区域，其中所述连接区域的近端开口将所述隔离区域流体连接到所述通道。

39.根据权利要求38所述的过程，其中所述隔离区域仅通过扩散将所述隔离区域内的流体介质的组分与所述通道中所述流体介质的组分进行交换。

40.一种用于监测微流体装置中至少一个生物微物体的状态的过程，其中所述生物微物体选自胚胎、精子或卵子，所述过程包括：

将所述生物微物体引入到所述微流体装置的隔离围栏中；

向所述生物微物体提供被配置为提供生存所必需的营养物的介质；

分析由所述生物微物体产生的分泌物；以及

确定所述生物微物体的状态。

41.根据权利要求40所述的过程，其中所提供的介质包括激活所述生物微物体以进行后续生物转化所必需的组分。

42.根据权利要求40或41所述的过程，其中所述后续生物转化是受精或进入胚胎发育的后续阶段。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的过程，其中分析所述分泌物的步骤包括用捕获珠粒来捕获分泌物。

44.根据权利要求40至43中任一项所述的过程，其中在所述隔离围栏内或紧邻所述隔离围栏进行分析所述分泌物的步骤。

45.根据权利要求40至43中任一项所述的过程，其中在所述微流体装置的外部进行分析所述分泌物的步骤。

46.根据权利要求40至45中任一项所述的过程，其中分析所述分泌物包括检测蛋白质、核酸、任何前述物质的片段或其任何组合。

47.根据权利要求40至46中任一项所述的过程，其中分析所述分泌物被执行两次或更多次。

48.根据权利要求47所述的过程，其中周期性地分析所述分泌物。

49.根据权利要求40至48中任一项所述的过程，还包括：

对所述生物微物体进行成像，

其中所述生物微物体的至少一个图像与用于确定所述生物微物体的状态的所述分泌物的至少一个分析结合使用。

50.根据权利要求40至49中任一项所述的过程，还包括：

将所述生物微物体从所述隔离围栏导出。

51.根据权利要求50所述的过程，其中所述生物微物体是胚胎，并且其中在确定所述胚胎是可存活的之后，导出所述胚胎。

52.根据权利要求50所述的过程，其中所述生物微物体是胚胎，并且其中在确定所述胚胎是可存活囊胚之后，导出所述胚胎。

53.一种用于监测微流体装置中至少一个生物微物体的状态的过程，其中所述生物微物体选自胚胎、精子或卵子，所述过程包括：

将所述生物微物体引入到所述微流体装置的隔离围栏中；

为所述生物微物体提供被配置为提供生存所必需的营养物的介质；

对所述生物微物体进行成像；以及

确定所述生物微物体的状态。

54.根据权利要求53所述的过程，其中对所述生物微物体进行成像的步骤被执行多于一次。

55.根据权利要求53或54所述的过程，其中周期性地执行成像的步骤。

56.根据权利要求53或54所述的过程，其中连续地执行成像的步骤。

57.根据权利要求53-56中任一项所述的过程，其中确定状态的步骤包括确定卵子的大小、形状或大小和形状两者。

58.根据权利要求57所述的过程，还包括基于所确定的卵子的大小和/或所确定的卵子的形状来确定是否对所述卵子进行调理处理。

59.根据权利要求57所述的过程，还包括基于所确定的卵子的大小和/或所确定的卵子的形状来确定所述卵子是否准备好受精。

60.根据权利要求53-59中任一项所述的过程，其中确定状态的步骤包括确定精子的大小、形状、运动性和趋化性反应中的至少一个。

61.根据权利要求60所述的过程，其中还包括基于所确定的精子的大小、和/或所确定的精子的形状、和/或所确定的精子的运动性、和/或所确定的精子的趋化性反应，来确定是否对所述精子进行调理处理。

62.根据权利要求53至56中任一项所述的过程，其中确定状态的步骤包括确定是否已经形成胚胎。

63.根据权利要求53至56中任一项所述的过程，其中确定状态的步骤包括确定胚胎的细胞分裂的大小、形状和时间中的至少一个。

64.根据权利要求63所述的过程，其中细胞分裂的时间是胚胎生存能力的指标。

65.一种在微流体装置中产生孤雌胚胎的方法，包括：

将卵母细胞引入到所述微流体装置的隔离围栏中；以及

应用刺激试剂，从而将所述卵母细胞转化为孤雌生殖胚胎。

66.权利要求65所述的方法，其中所述卵母细胞是哺乳动物的卵母细胞。

67.根据权利要求65或66所述的方法，其中所述卵母细胞是人类卵母细胞。

68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂是电刺激、化学刺激或两者的组合。

69.根据权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂是电刺激。

70.根据权利要求65至69中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖胚胎是杂合的。

71.根据权利要求65至69中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖胚胎是纯合的。

72.根据权利要求65至71中任一项所述的方法，还包括将所述孤雌生殖胚胎从所述隔离围栏导出的步骤。

73.根据权利要求65至72中任一项所述的方法，还包括将所述孤雌生殖胚胎从所述微流体装置导出的步骤。

74.根据权利要求65至73中任一项所述的方法，还包括将所述孤雌生殖胚胎转化为一种或多种胚胎干细胞ESC的步骤。

75.根据权利要求74所述的方法，其中将所述孤雌生殖胚胎转化为一个或多个胚胎干细胞的步骤还包括从孵化的囊胚中分离内细胞团ICM。

76.根据权利要求75所述的方法，其中将所述孤雌生殖胚胎转化为一个或多个胚胎干细胞的步骤还包括在所述微流体装置的隔离围栏内培养所述ICM。

77.根据权利要求76所述的方法，其中在隔离围栏内培养ICM的步骤还包括与饲养细胞共培养所述ICM。

78.根据权利要求77所述的方法，其中与所述饲养细胞共培养所述ICM的步骤包括将所述饲养细胞放置在与布置有所述ICM的隔离围栏邻近的隔离围栏中。

79.根据权利要求76至78中任一项所述的方法，其中将所述孤雌生殖胚胎转化为一个或多个胚胎干细胞的步骤还包括将所述ICM转化为一个或多个胚胎干细胞ESC。

80.根据权利要求74至79中任一项所述的方法，其中所述一个或多个ESC基本上是纯合的。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述基本上纯合的ESC是二倍体，并且对于突变等位基因是纯合的。

82.根据权利要求74至79中任一项所述的方法，其中所述一个或多个ESC基本上是杂合的。

83.权利要求82的方法，其中所述一个或多个ESC是与所述卵母细胞的供体匹配的人类白细胞抗原HLA。