CN103649752A

CN103649752A - 使用交叉反应性内分泌糖蛋白激素类似物的清除剂的tsh免疫测定

Info

Publication number: CN103649752A
Application number: CN201180072170.5A
Authority: CN
Inventors: G·B·科里尔; J·E·欧马科尔
Original assignee: Abbott Point of Care Inc
Current assignee: Abbott Point of Care Inc
Priority date: 2011-05-27
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2031-11-29
Also published as: US8617826B2; EP2715356B1; US20120301906A1; US9068994B2; WO2012166200A1; US20140072989A1; CN103649752B; EP2715356A1

Abstract

本发明涉及使用ELISA夹心测定进行的促甲状腺激素(TSH)免疫测定，所述夹心测定使用清除或消耗性珠粒来减小由交叉反应性内分泌糖蛋白激素类似物例如滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)引起的干扰。

Description

使用交叉反应性内分泌糖蛋白激素类似物的清除剂的TSH免疫测定

相关申请的交叉参考

本发明要求2011年5月27日提交的美国临时申请号61/491,077(将其完整内容和公开内容通过引用并入本文)的优先权。

发明领域

本发明总地来说涉及在具有交叉反应性内分泌糖蛋白激素类似物的系统中进行免疫测定，特别是促甲状腺激素(TSH)免疫测定的方法。该测定受益于包含减小干扰性物质例如内分泌糖蛋白激素类似物的作用的清除剂(scavenging reagents)。

发明背景

最早于1959年开发的免疫测定已成为用于人和兽医学健康以及环境测试的有用的灵敏诊断工具(Wu,2006,Clinica Chimica Acta,369:119)。其应用已是广泛的并且在本领域是熟知的。

存在几个进行免疫测定的方法，本发明聚焦在非竞争性或夹心免疫测定上。免疫测定还可被分类为非均相的或均相的。均相测定具有更简单的测定特征，但已被限定于高浓度药物(Engel&Khanna,1992,Journal of Immunological Methods,150:99)。非均相测定需要将结合的材料与未结合的材料分离并且是本发明的焦点。

夹心免疫测定通常作为两步测定来进行，所述测定包括首先将含抗原样品引入共价连接至固体支持物的捕获抗体。然后洗掉非特异性样品组分，留下结合至固体支持抗体的目标抗原。在第二步骤中，将检测或信号抗体引入测定，随后进行另一个洗涤步骤。最后，将检测底物添加至测定中来定量抗原浓度。具有相关洗涤步骤的两步骤免疫测定通常是优选的，因为它们减弱本底信号，从而允许高灵敏性检测。

“一步”夹心免疫测定可通过将检测抗体和含抗原样品一起引入共价连接至固体支持物的捕获抗体来进行。洗涤所得的测定以除去未结合的试剂。最后，将检测底物添加至测定以定量抗原浓度。

存在对具有有限洗涤液体积的一步测定的需要，因为它们更简单并且需要更少的步骤和更少的相关硬件复杂性来进行操作(特别是在护理现场应用中)。对于护理现场设备，减少或消除对洗涤步骤的需要减少了装置成本和测定时间、硬件成本和复杂度以及一次性装置的尺寸，这继而有益于减少环境中的废弃物以及其成本。

迄今为止，具有有限洗涤步骤或无洗涤步骤的一步免疫测定未曾用于抗原，其中内源相关抗原的存在产生混淆检测结果的高本底。当内源抗原以超过目标抗原的高摩尔浓度被发现(这对于一些疾病状况是常见的)时，这尤其如此。

有问题的抗原的实例是促甲状腺激素(TSH)，也称为促甲状腺素，其通常与相关的内分泌糖蛋白激素绒毛膜促性腺激素(CG)、促黄体激素(LH)和滤泡刺激激素(FSH)组合地存在。这4种相关激素具有相同的α亚基和高度相似的β亚基(Vassart,2004,Trends in BiochemicalSciences,29(3):119)。因此，抗α亚基的抗体不区分这4种激素(Wada,1982,Clinical Chemistry,28(9):1862)。也难以鉴定可区分所述4种相关激素的β-特异性抗体(特别是在极高浓度的污染性激素存在的情况下)，因为这些激素具有极相似的初级序列(Cornell,1973,The Journalof Biological Chemistry,248(12):4327)。此外，还难以鉴定TSH上的独特(抗原性)表位以及难以获得识别这些独特表位的抗体。对于夹心测定，还很重要的是：使用不重叠的捕获和信号抗体，所述抗体具有适当的特异性特征，这进一步限制了抗体的选择。

夹心免疫测定中的洗涤步骤帮助减少反应中的污染性激素的浓度，这减少了与污染性物质相关的信号。因此，不具有洗涤步骤或具有有限洗涤能力的一步夹心免疫测定一直以来在相关污染性激素分子存在的情况下，尤其当污染物以极高浓度存在时，不能特异性检测TSH。参见，例如，US20080311676,其描述了在免疫测定中使用洗涤步骤来减少交叉反应性物质的浓度的重要性。解决这些问题的努力可见于Hashida等人1986,Analytical Letters,19,1121-36;Soos等人,1984,Journal of Immunological Methods,73,237;和Lode等人,2003Clinical Biochemistry,36,121中。

EP173973描述了用于TSH的测定的方法，其中使用具有特定缔合常数值的抗-β-亚基TSH单克隆抗体。相关EP212522描述了特征在于TSH-β亚基特异性单克隆抗体识别不同表位的测定。该方法寻求减小因其它糖蛋白激素例如LH、CG和FSH存在而导致的抑制。

存在对具有减少的或消除的洗涤能力的一步骤夹心免疫测定(特别是用于护理现场测定的那些免疫测定)，以及特别地用于检测TSH的一步夹心免疫测定的需要。此外，存在对鉴定能够进行这样的免疫测定的抗体试剂的需要。

发明概述

本发明涉及用于检测液体样品中的促甲状腺激素(TSH)，同时使由高度相关的内源内分泌糖蛋白激素滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)引起的干扰降至最低的装置、免疫测定和方法。

在一个实施方案中，本发明是TSH夹心免疫测定，包括至少两种表位相容性抗体，包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体，其中两种抗体对于TSH的解离常数(Kd)小于1nM或为约1nM，例如不超过0.5nM或不超过0.15nM，并且其中测定还包括利用针对滤泡刺激激素FSH、LH和CG的珠粒抗体涂覆的清除珠粒(scavenger bead)，其中每一种珠粒抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别小于约1nM，并且每一种所述FSH、LH和CG抗体对于TSH的Kd大于250nM。

在另一个实施方案中，本发明是用于进行TSH免疫测定的方法，该方法包括步骤：(a)将液体样品插入于导管中包含免疫传感器的装置，所述免疫传感器具有针对TSH的捕获抗体；(b)将信号抗体溶解入所述液体样品中；(c)利用针对FSH、LH和CG中的一个或多个的清除珠粒修正所述液体样品；(d)在所述免疫传感器上形成夹心复合物，所述复合物包含所述捕获抗体、TSH和所述信号抗体；(e)利用洗涤液从传感器洗掉未复合的信号抗体；和(f)检测，例如光学地或电化学地检测，与所述复合的信号抗体相关的信号。

在优选实施方案中，捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.15nM的对于TSH的解离常数(Kd)。捕获抗体对于FSH的Kd值大于1000nM，大于2500nM或大于3000nM，并且信号抗体对于FSH的Kd值大于250nM或大于1000nM。优选地，捕获抗体对于LH的Kd大于500nM，大于1000nM或大于3000nM，并且捕获抗体对于CG的Kd大于200nM，大于500nM或大于2500nM。信号抗体对于LH的Kd优选大于35nM，大于200nM或大于250nM，并且信号抗体对于CG的Kd优选大于35nM或大于250nM。

清除珠粒可任选地是磁性或非磁性的。当清除珠粒是磁性的时候，方法优选还包括在施加磁场后将所述清除珠粒保留在保留区域中的步骤。保留区域优选是免疫传感器的上游。

在一个方面，清除珠粒包含具有小于约0.15nM的对于FSH、LH和CG的每一个的Kd和大于约250nM的Kd(TSH)的珠粒抗体。在另一个方面，清除珠粒包括用于清除FSH的第一清除珠粒、用于清除LH的第二清除珠粒以及用于清除CG的第三清除珠粒。

在一个方面，捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.15nM的对于TSH的解离常数(Kd)。捕获抗体对FSH的Kd值大于1000nM、大于2500nM或大于3000nM，并且信号抗体对于FSH的Kd值大于250nM或大于1000nM。优选地，捕获抗体对于LH的Kd大于500nM、大于1000nM或大于3000nM，并且捕获抗体对于CG的Kd大于200nM、大于500nM或大于2500nM。信号抗体对LH的Kd优选大于35nM、大于200nM或大于250nM，并且信号抗体对于CG的Kd优选大于35nM或大于250nM。在优选实施方案中，捕获抗体具有大于2500的第一Kd比率Kd(FSH):Kd(TSH)，并且信号抗体具有大于1500的第二Kd比率Kd(FSH):Kd(TSH)。更优选地，捕获抗体具有大于6000的第一Kd比率Kd(FSH):Kd(TSH)。

夹心复合物优选通过所述捕获和信号抗体与液体样品的大体上非相继的接触来形成。任选地在不存在一个或多个用于减少与FSH、LH和CG中的一个或多个的交叉反应的间插洗涤步骤的情况下形成夹心复合物。在优选实施方案中，捕获抗体包括小鼠单克隆抗体(Biospacific Cat#5409SPTNE-5)并且信号抗体包括小鼠单克隆抗体(Fitzgerald Cat#10-T25C)。在一个方面，捕获抗体和信号抗体选自下列捕获/信号抗体对[5409/T25C和T25C/5409]或[5409/10-1179-456和10-1179-456/5409]。

在一些示例性方面，将信号抗体缀合至选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和荧光部分的报道分子。任选地，方法包括不超过一个洗涤步骤来从捕获抗体除去样品和未结合的信号抗体，并且洗涤液也包含报道分子的底物。

附图概述:

根据下列非限定性图本发明将获得更好地理解。

图1是免疫传感器筒盖的等长俯视图；

图2是免疫传感器筒盖的等长仰视图；

图3是免疫传感器筒的胶带垫圈的布局的俯视图;

图4是免疫传感器筒底座的等长俯视图；

图5是免疫传感器筒的布局的示意图;

图6是免疫传感器筒内的流体和空气路径、包括利用干试剂修正流体的位置的示意图;

图7显示CG的基于FRET的结合数据和其Kd值的测定;

图8显示FSH和LH的磁性珠粒捕获;

图9是显示使用聚苯乙烯珠粒产生的减少的FSH的交叉反应性的图；

图10是显示使用聚苯乙烯珠粒产生的减少的LH的交叉反应性的图；和

图11是显示使用磁性珠粒产生的减少的FSH的交叉反应性的图。

发明详述

引言

在不同的实施方案中，本发明涉及免疫测定、用于在干扰性物质存在的情况下，进行夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)(优选具有有限的洗涤步骤或不具有洗涤步骤)的装置和方法。本发明有益地允许在这些污染性干扰性物质存在的情况下获得准确的测定结果。在第一实施方案中，本发明涉及用于进行促甲状腺激素(TSH)夹心免疫测定的装置和方法以及选择用于这样的免疫测定的抗体的方法。在第二实施方案中，本发明涉及免疫测定，特别是TSH免疫测定，以及使用单个洗涤步骤或不使用洗涤步骤的相关装置和方法。在第三实施方案中，本发明涉及免疫测定，特别是TSH免疫测定，以及使用以针对内源性污染物的抗体涂覆的清除珠粒的相关装置和方法，所述清除珠粒减小或消除与此类污染物相关的干扰。或者，可将此类抗体共价地结合至筒表面或可在反应介质中包含游离抗体。任选地，可将这些实施方案的一个或多个彼此组合。

TSH免疫测定和选择用于TSH免疫测定的抗体的方法

在第一实施方案中，本发明涉及针对TSH的免疫测定和用于进行这样的测定的相关装置和方法。尽管在高度相关的内源性内分泌糖蛋白激素滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)存在的情况下，本发明的免疫测定仍有益地提供TSH的准确检测。在某些疾病状态下，这些相关激素可以以非常高的浓度存在。在本文中就

免疫测定平台(Abbott Point of Care Inc.,Princeton,NJ,USA)对上述测定进行了示例，所述测定平台是低洗涤容量平台。参见共同拥有的美国专利号7,419,821，将其整体通过引用并入本文。在本说明书中，术语“低洗涤”包括组合的一次性测试装置，其包括具有相对少量(通常大约数十微升至约5毫升)的洗涤液的小袋，或类似的装置(其中从与所述装置衔接的仪器递送相似量的洗涤液)。在一些示例性实施方案中，装置和方法使用5至500μL，例如25至250μL，或50至150μL，优选约100μL的洗涤体积。其还包括这样的测定概念，其中将捕获抗体、分析物和信号抗体混合在一起以形成夹心免疫测定，随后将洗涤液用于从在捕获抗体上形成的夹心除去具有未结合的分析物和未结合的信号抗体的样品，所述捕获抗体优选以一定的方式固定例如固定在可具有磁性的珠粒上或固定在传感器上。通常将这些类型的装置和系统与病患护理现场的测试结合。

在另一个方面，本发明涉及选择用于在具有有限的洗涤容量的系统中进行夹心ELISA测定的抗体的方法。具体地，选择具有减小的交叉反应性的抗体，这继而增加夹心ELISA的分析特异性。这些特征对于低洗涤夹心ELISA测定特别有用。作为具体的实例，本文中显示了在内源性内分泌糖蛋白激素FSH、LH和CG存在的情况下使用

筒的TSH测定的性能。相反地，测定TSH的典型的现有商业系统利用多个洗涤步骤来减少在某些疾病状况下可能以高摩尔浓度存在的内源性内分泌糖蛋白激素的存在。然而，很明显地，这些多洗涤系统也受益于具有本说明书中公开的这些特异性特征的抗体的使用，并且本发明不应当被认为限定于使用有限的洗涤容量的免疫测定系统或装置。

在优选实施方案中，选择两个夹心抗体，其主要针对TSH分子的β-亚基或与该区域的表位重叠，其显示期望的特异性程度。这两个夹心抗体的理想特征是它们识别TSH的β-亚基的表位(优选地不同表位)和不唯独地TSH的α-亚基。预期该识别可包括横跨α和β亚基的表位，显示对TSH的高亲和力和对其它交叉反应性物质的低亲和力。此外，这些抗体优选显示对于TSH分子的低Kd，同时具有对于其它内源性糖蛋白激素FSH、LH和CG的高Kd值。

如本文中所用，术语“解离常数”或“Kd”是指一般反应的平衡常数：

其中A是抗体，B是分析物，即抗原。对于该反应，解离常数或Kd值可表达为：

Kd = \frac{[A] \times [B]}{[AB]} = \frac{k_{- 1}}{k_{1}}

一般而言，解离常数越低，抗体A对于分析物B的结合的亲和力或程度越大。测定这些动力学值的方法在本领域是公知的。参见，例如，Goodrich&Kugel,2007,Binding and Kinetics for MolecularBiologists,Cold Spring Harbour Laboratory Press,Cold SpringHarbour,New York。

在特别优选实施方案中，捕获和信号抗体显示对于TSH的高亲和力(低Kd)。在低浓度产生弱信号的抗体将具有高可变性(噪声)并且将难以与更高的测量的交叉反应性相区分。这类抗体不应当被选择为候选抗体。在特别优选实施方案中，具有不大于1nM例如不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM的对于TSH抗原的Kd的抗体被选择用作用于本发明的免疫测定的捕获和/或信号抗体。

在经选择用于夹心杂交的两种或更多种抗体的另一个优选实施方案中，具有最大的对于FSH、LH和CG的Kd值的抗体可用作捕获抗体。在另一个方面，如果两种抗体被鉴定为捕获和信号抗体的候选者，则具有更大Kd值(例如，大5至1000%，大20至100%或大20至50%)的抗体可以优选为捕获抗体。在任一情况下，除了具有低的对于TSH的Kd值(例如，不超过1nM，不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM)外，期望抗体(捕获和信号抗体)具有相对高的对于干扰性内分泌糖蛋白激素FSH、LH和CG中的每一种的Kd值。

在特别优选实施方案中，捕获抗体具有大于1000nM、大于2500nM、大于3000nM或大于4000nM的Kd(FSH)，大于500nM、大于800nM、大于1000nM、大于2500或大于4000nM的Kd(LH)和大于200nM、大于500nM、大于2500nM或大于4000nM的Kd(CG)。就范围而言，捕获抗体任选地具有范围在1000至5000nM内，1500至4000nM内或2500至3000nM内的Kd(FSH)，范围在500至5000nM内，750至1200nM内，800至1000nM内，1000至5000内或1500至4000nM内的Kd(LH)以及范围在35至5000nM内，200至5000nM内，210至2500nM内或220至500nM内的Kd(CG)。

类似地，信号抗体优选具有大于250nM、大于1000nM或大于4000nM的Kd(FSH)，大于35nM、大于200nM、大于250nM、大于1000nM、大于2500nM或大于4000nM的Kd(LH)以及大于35nM、大于250nM或大于2500nM的Kd(CG)。就范围而言，信号抗体任选地具有范围在250至5000nM内，250至2500nM内或250至500nM内的Kd(FSH)，范围在35至5000内，200至5000nM内，35至2500nM内，200至2500nM内，35至1000nM内或200至1000nM内的Kd(LH)以及范围在35至5000nM内，35至2500nM内或35至1000nM内的Kd(CG)。在本方法的具体实施方案中，TSH结合物质优选选自抗体、抗体的片段(例如，Fab片段)、单链抗体、适体、受体和其它特定结合物质。

本发明的优选实施方案涉及TSH夹心免疫测定，所述测定包含至少两种表位相容性抗体(包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体)，其中两种抗体对于TSH的Kd小于(或不超过)约1nM，例如不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM，并且其中捕获抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于约2500、大于约500和大于约200nM，并且其中信号抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于约250、大于约200和大于约35nM。更优选，捕获抗体对于CG的Kd大于约35nM，并且信号抗体对于LH的Kd大于约35nM。在本说明书中，关于“表位相容性”，其意指抗体可选择性结合目标分析物上的不同表位，如上文中论述的。对于TSH免疫测定，抗体优选可选择性结合至少部分地在TSH的β-亚基上的不同表位。

还可根据Kd比率即Kd(内分泌糖蛋白激素类似物例如FSH、LH、CG或其平均值):Kd(TSH)的比率来表征捕获抗体和信号抗体对于TSH相对于对于FSH、LH和CG的相对选择性。在该方面，Kd比率值越大，则抗体相对于所指的内分泌糖蛋白激素类似物选择性结合TSH的能力越大。在一个方面，例如，固定的抗体具有大于2500，例如大于3000或大于5000的第一Kd比率Kd_FSH:Kd_TSH。此外或备选地，信号抗体可具有大于1500，例如大于1800或大于2000的第二解离常数比率Kd_FSH:Kd_TSH。就范围而言，固定抗体优选具有1500至50000，例如1800至30000或2000至28000的第一Kd比率Kd_FSH:Kd_TSH，并且信号抗体可具有1500至50000，例如1800至30000或1900至20000的第二Kd比率Kd_FSH:Kd_TSH。

如上所述，免疫测定优选使用一对在两个非重叠表位上结合TSH的不同抗体。在特别优选实施方案中，捕获抗体包括TSH捕获小鼠单克隆抗体(例如，Biospacific Cat#5409SPTNE-5)并且信号抗体包括信号小鼠单克隆抗体(例如，Fitzgerald Cat#10-T25C)。在该方面，捕获抗体优选共价结合至珠粒，例如胶乳和/或聚苯乙烯珠粒，信号抗体缀合至选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和荧光或光学吸收部分的报道分子。检测步骤优选是电化学的，例如安培计检测步骤，但也可以是光学的例如荧光和吸光度。

本发明还可表征为配体结合测定。例如，在一个实施方案中，本发明是包括至少一种捕获配体和至少一种信号配体的TSH夹心测定，其中两种配体对于TSH的解离常数小于(或不超过)约1nM，例如不超过0.5nM，不超过0.15nM或不超过0.1nM，并且其中捕获配体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于约2500，大于约500和大于约200nM，并且其中信号配体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于约250、大于约200和大于约35nM。更优选，捕获配体对于LH的Kd大于约1000nM并且对于CG的Kd大于约500nM，信号配体对于LH的Kd大于约35nM。此处，配体可选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体的片段、适体和单链抗体。

本发明还涉及用于利用免疫测定检测分析物例如TSH的方法，所述免疫测定对于TSH具有高度选择性并且对于竞争性内分泌糖蛋白激素类似物例如FSH、LH和CG是非选择性的。例如，在一个实施方案中，本发明是使用至少两种表位相容性抗体(包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体)进行全血TSH夹心测定的方法。两种抗体对于TSH的Kd小于1nM或为约1nM，例如，不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM。捕获抗体对于FSH、LH和CG的Kd值分别大于约2500、大于约500和大于约200nM，并且信号抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于约250、大于约200和大于约35nM。更优选，捕获抗体对于FSH、LH和CG的Kd值分别大于约1000、大于约1000和大于约1000nM，并且信号抗体对于LH的Kd值大于约35nM。该方法包括如下步骤：(a)将全血样品与TSH信号抗体和固定在电化学传感器上的TSH捕获抗体接触，以形成夹心复合物，和(b)检测与所述复合的信号抗体相关的信号。

除了TSH的检测以外，本发明还具有其它功用。例如，在一个方面，本发明是在包含至少两种抗体或其它配体(包括至少一种捕获抗体或配体和至少一种信号抗体或配体)的全血样品中进行的分析物夹心免疫测定，其中所述至少两种抗体或配体对于分析物的Kd至少为预选水平，所述预选水平低于对于至少两种选择的已知交叉反应物(在蛋白质序列上密切相关的污染性抗原)的Kd，例如为其1/500，1/1000或1/10,000。在该方面，夹心优选通过大体上非相继的抗体或配体至样品的添加来形成。可在检测前利用单洗涤步骤进行测定。此处，例如，靶分析物可以是TSH、FSH、LH和CG之一，并且交叉反应物可选自TSH、FSH、LH和CG，但不是靶分析物。因此，在本发明的其它实施方案中，靶分析物可选自FSH、LH和CG之一而非TSH。

低洗涤夹心免疫测定

上述针对TSH的抗体或配体优于竞争性内分泌糖蛋白激素类似物例如FSH、LH和CG的选择性质使得本发明的免疫测定、装置和方法特别适合于使用有限洗涤步骤的免疫测定。因此，本发明特别适合于在可使用分析测试筒或装置的护理现场测试装置例如

免疫测定平台（其不具有充足空间容纳大量洗涤液）中实施。

对于常规TSH测定，使用多个和重复的洗涤步骤以减少牵涉FSH、LH和CG的一个或多个的交叉反应性对于准确的结果是至关重要的。根据本发明的一些实施方案，测定这样操作：通过至样品的非相继抗体添加(即，捕获和信号抗体大致同时接触样品)并且在无间插洗涤步骤的情况下形成夹心。测定任选地在检测之前包括单个洗涤步骤，例如从捕获抗体除去血液和未结合的信号抗体的单个有限洗涤步骤。因此，在第二实施方案中，本发明涉及具有减少的洗涤步骤的免疫测定。在本实施方案的一个方面，单个洗涤步骤用于从夹心测定除去未结合的分析物和信号抗体。

在本实施方案的一个方面，本发明是TSH夹心免疫测定，包括至少两种表位相容性抗体(包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体)，其中两种抗体对于TSH的Kd小于1nM或为约1nM，例如不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM，并且其中捕获抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于约2500nM、大于约500nM和大于约200nM，并且其中免疫测定使用单个洗涤步骤。更优选，捕获抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于约1000nM、大于约1000nM和大于约1000nM。在本说明书中，“单个洗涤步骤”是指这样的洗涤步骤：其中将洗涤液(其优选大体上不含分析物和信号抗体)用于免疫传感器以从免疫传感器的区域除去未结合的分析物和未结合的信号抗体。单个洗涤步骤中使用的洗涤液的量可广泛变化，但优选少于1000μL，少于750μL，少于500μL或少于250μL。本发明中使用的免疫传感器的种类可广泛变化，并且可选自例如电化学传感器、表面声波传感器、表面等离子体共振传感器、热传感器、场效应晶体管传感器、光学传感器、倏逝波传感器、波导传感器等。

本发明还涉及利用免疫测定检测分析物例如TSH的方法，所述免疫测定使用不超过一个洗涤步骤。例如，在一个实施方案中，本发明是使用至少两种表位相容性抗体(包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体)进行全血TSH夹心测定的方法。两种抗体对于TSH的Kd小于1nM或为约1nM，例如，不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM。捕获抗体对于FSH、LH和CG的Kd值分别大于约2500nM、大于约500nM和大于约200nM，并且信号抗体对于FSH、LH和CG的Kd值分别大于约250nM、大于约200nM和大于约35nM。更优选，捕获抗体对于FSH、LH和CG的Kd值分别大于约1000nM、大于约1000nM和大于约1000nM，并且信号抗体对于LH的Kd值大于约35nM。方法包括步骤：(a)将全血样品与TSH信号抗体和固定在电化学传感器上的TSH捕获抗体接触以形成夹心复合物，(b)将样品和未复合的信号抗体从传感器洗掉，和(c)检测与所述复合的信号抗体相关的信号。

在该实施方案中，洗涤液优选包含含有水和一种或多种添加剂的液体，并且应当能够将传感器洗涤至期望的程度。在一个方面，洗涤液包含酶促底物ANPP(氨基硝基苯基磷酸)。洗涤液pH优选维持在对于报道酶是最佳的pH，这对于碱性磷酸酶而言是约9至10的最佳碱性pH。洗涤液优选还包含在电化学测定中影响电导率的盐，其由氯化钠和镁提供。镁还是碱性磷酸酶的辅因子，并且可以以低浓度存在来增强酶活性。用于基于其它酶的测定的洗涤液还可包含适当的酶促底物、盐和酶稳定性所需的缓冲剂以及，如果用于电化学，为了溶液的电导率，还包含任何适当的酶辅因子。

包括已知的干扰性物质的清除珠粒

在第三实施方案中，本发明涉及使用一种或多种清除珠粒的TSH夹心免疫测定和用于进行这样的免疫测定的相关装置和方法。为了帮助增强测定对于分析物例如TSH的选择性，设计了这样的实施方式：其中将包含例如利用针对交叉反应物例如FSH、LH、CG的抗体标记的胶乳或聚苯乙烯珠粒的清除珠粒添加至溶解入样品的混合物。因此，在TSH捕获抗体上为交叉反应物提供了相当不利的结合位点并且在溶解于样品中的珠粒上为交叉反应物提供了相当有利的结合位点。

在该实施方案的一个方面，例如，本发明是包括两种表位相容性抗体(包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体)的免疫测定。测定还包括利用针对FSH、LH和CG的抗体(珠粒抗体)涂覆的清除珠粒，其中所述抗体的每一种对于FSH、LH和CG的每一种的Kd小于1nM或为约1nM，例如，不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM，并且所述珠粒抗体的每一种对于TSH的Kd大于约250nM。免疫测定中使用的捕获和信号抗体对于TSH的Kd优选小于(或不超过)约1nM，例如，不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM，如上文中所论述的。

因此，在一个实施方案中，本发明是利用至少两种表位相容性抗体(包括至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体)的TSH夹心免疫测定，其中一种或多种清除珠粒用于减小由竞争性内分泌糖蛋白激素类似物FSH、LH和CG引起的干扰。此处，捕获和信号抗体对于TSH的Kd优选小于或为约1nM，例如，不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM。利用针对FSH、LH和CG的珠粒抗体涂覆的添加的清除珠粒，其中这些抗体的每一种对FSH、LH和CG的每一种的Kd优选分别小于1nM或为约1nM，例如，不超过0.5nM，不超过0.15nM，或不超过0.1nM。

在一个方面，利用对于竞争性内分泌糖蛋白激素类似物的每一种具有选择的单一类型的抗体涂覆珠粒。在另一个方面，利用多个类型的抗体涂覆珠粒，其中第一珠粒抗体对于FSH具有选择性，第二珠粒抗体对于LH具有选择性，第三珠粒抗体对于CG具有选择性。珠粒抗体的其它组合可以是可能的，例如，其中第一珠粒抗体对于FSH和LH具有选择性并且第二珠粒抗体对于CG具有选择性。

在另一个方面，可使用多种不同的珠粒。例如，可将三个不同类型的珠粒(每一种具有不同的抗体)用于选择性结合竞争性内分泌糖蛋白激素类似物。例如，免疫测定、装置和方法可使用第一珠粒、第二珠粒和第三珠粒来分别选择性结合FSH、LH和CG。更具体地，第一珠粒可包含对于FSH具有选择性的第一珠粒抗体，第二珠粒可包含对于LH具有选择性的第二珠粒抗体，并且第三珠粒可包含对于CG具有选择性的第三珠粒抗体。

为了避免TSH优先结合这些珠粒，期望珠粒抗体(无论对于一种类型的珠粒还是多种类型的珠粒)的每一种对于TSH的Kd大于约250nM。在抗体标记方面清除珠粒的制备遵照本文中针对TSH的捕获抗体所描述的方法。关于上述实施方案，优选地TSH捕获抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于约2500nM、大于约500nM和大于约200nM。同样地，期望TSH信号抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于约250nM、大于约200nM和大于约35nM。

要指出的是，清除珠粒可以是非磁性的，并且保持悬浮于样品中，从而在洗涤和检测步骤之前可随样品被移至废液室。或者，清除珠粒可以是磁性的并且通过施加磁场被吸引至远离TSH捕获位置区域例如TSH免疫传感器的装置的区域。或者，清除珠粒可以是磁性的，但在施加或不施加磁场的情况下被移至废液室。用于通过磁力将磁性珠粒保留在免疫传感器中的各种方法描述于属于Miller的美国专利申请号61/371,066，将其整体通过引用并入本文。

磁性清除珠粒用于减少交叉污染物干扰的用途示例于图8中。如所显示的，将具有对LH具有选择性的的清除抗体的磁性珠粒添加至样品，其选择性结合包含在样品中的LH。将例如来自永久磁铁或来自电磁铁的磁场应用于装置(筒)中或装置读数器中以将磁性珠粒定位于远离传感器并且优选在其上游的区域。这有利地导致减小的来自交叉反应性或竞争性分析物(此处LH)的干扰。

在优选实施方案中，将消耗性珠粒掺入干试剂涂层，所述涂层在一些实施方案中可以是相同的包含信号抗体的干试剂涂层。因此，在一个实施方案中，分析装置包括干试剂涂层，所述涂层包含如下物质的任一种或两种：(a)适合用于减小FSH、LH或CG的一种或多种的作用的消耗性珠粒，和/或(b)信号产生性试剂例如信号抗体或标记的分析物。干试剂涂层可从试剂混合物形成，所述混合物还优选包含如下物质的任一种或两种：(a)适合用于减小FSH、LH或CG的一种或多种的作用的消耗性珠粒，和/或(b)信号产生性试剂例如信号抗体或标记的分析物。在一个方面，试剂涂层和/或混合物还包含用于减小由嗜异性抗体引起的干扰的IgM或其片段，如共同未决的美国申请12/411,325(将其通过引用整体并入本文)中公开的。优选地首先对在其上沉积试剂混合物的表面进行第一Corona处理以提供带电荷的表面基团，所述基团将促进打印的混合物的扩散。

一般而言，用于形成干试剂涂层的试剂混合物还可包含水溶性蛋白质、氨基酸、聚醚、含羟基聚合物、糖或碳水化合物、盐和任选地染料分子。可使用一种或多种每一组分。在一个实施方案中，混合物包含牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、盐、甲氧基聚乙二醇、蔗糖和任选地溴酚蓝以提供帮助显现打印过程的颜色。在一个实施方案中，将1至20μL的混合物打印在例如分析装置的保持室或其它导管内的期望的表面上，使其风干(加热或不加热)，随后用其罩子装配。在优选方面，试剂混合物和从其形成的干试剂涂层包含拉克替醇、DEAE-葡聚糖、盐例如氯化镁和氯化钠、IgG/IgM、肝素、表面活性剂和罗丹明的一种或多种。

优选将试剂混合物配制为包含消耗性珠粒和任选地其它减小干扰的试剂的可打印的水溶液。在引入生物样品例如血液后，优选在测定的第一步骤中将样品与试剂混合。试剂还可包括无机盐和表面活性剂以在化学和流体性属性方面最优化测定性能。其它可选的添加剂可包括肝素(以确保足够的抗凝作用)和染料(以在打印后显现试剂的定位)。还任选地存在稳定剂例如叠氮化钠(以抑制微生物生长)和拉克替醇与二乙基氨基乙基葡聚糖(Applied Enzyme Technologies Ltd.,Monmouth House,Mamhilad Park,Pontypool,NP40HZ UK)的混合物(以稳定蛋白质)。一旦沉积在装置中，可以例如在暖气流中干燥沉积的试剂30至60分钟。在一个实施方案中，使用自动打印设备在装置的样品入口中打印试剂，并干燥以形成包含消耗性珠粒的试剂涂层。

在另一个实施方案中，测试筒可包含多个干试剂涂层(在该情况下，涂层可各自称为第一试剂涂层、第二试剂涂层等，以区分它们)。例如，可将消耗性珠粒包含在第一试剂涂层中，该涂层，例如可与包含信号抗体的第二试剂涂层相邻。在该方面，第二试剂涂层可位于第一试剂涂层的上游或下游，虽然对于包含信号抗体的试剂涂层，优选位于包含消耗性珠粒的试剂涂层的下游。在优选实施方案中，用包含消耗性珠粒和任选地其它减小各种形式的干扰的试剂的第一试剂涂覆保持室。在该方面，包含信号抗体的第二试剂涂层优选位于保持室的下游，例如在免疫传感器紧邻上游。

在其它实施方案中，消耗性珠粒可以不是分析装置例如筒的一部分。例如，可将消耗性珠粒整合进样口收集装置例如毛细管、Vacutainer^TM或注射器。例如，可在收集装置的内壁上形成消耗性珠粒涂层。因此，在一个实施方案中，本发明是用于进行免疫测定的试剂盒，其包括首先用于在第一容器或位置中修正血液样品的消耗性珠粒，随后使样品通过具有捕获和信号抗体的第二容器或位置。

除了本文中论述的珠粒外或作为其的另一选择，可用共同拥有的属于Campbell等人的美国申请号12/620,179(将其整体通过引用并入本文)中描述的类型的消耗性珠粒(任选地针对白细胞进行了调理的)修正样品。

免疫传感器的制造

如上所述，本发明通过参考使用电化学免疫传感器的

系统来进行最佳示例。免疫传感器的优选实施方案的晶片级微制造如下。基极由在15μm中央上的7μm金盘的正方形阵列组成。阵列覆盖直径约600μm的圆形区域，通过在由一系列包含Si/SiO₂/TiW/Au的层制造的基底上对一薄层0.35μm厚的聚酰亚胺进行光刻图案化来实现。7μm微电极的阵列提供了电活性的物质的高收集效率，具有减少的来自与暴露的金属的电容相关的任何电化学本底电流的贡献。在金属上包含PVA层例如光可成型聚乙烯醇显著增强了本底电流的减小。

优选通过在晶片上的微电极上旋转涂覆PVA+有机吡啶盐光敏交联剂的含水混合物来制备多孔PVA层。旋转涂覆混合物任选地包含牛血清白蛋白(BSA)。随后可对PVA层进行光刻图案化以仅覆盖阵列上方和周围的区域，并且所述PVA层优选具有约0.2至1.0μm，例如0.4至0.8μm或约0.6μm的厚度。不同TSH抗体的免疫传感器可通过将抗体涂覆至珠粒上，随后将珠粒施用于它们附着至其上的传感器表面来制造。

通过使用下述珠粒制备法，可将约30至60nL，例如35至50nL或约40nL的小滴(包含约0.6至2.0wt%，例如约0.8至1.6wt%或约1wt%的去离子水中的固体)微分散(使用，例如，美国专利号5,554,339(通过引用并入本文)的方法和装置)至覆盖传感器的光刻图形化的多孔聚乙烯醇选择性渗透层，并且让其干燥。干燥的颗粒应当附着至多孔层，从而基本上阻止其溶解于血液样品或洗涤液中。

捕获珠粒的制造

本发明中使用的捕获珠粒，无论用于固定的捕获抗体还是任选的清除珠粒抗体，可通过多种技术来形成。在优选实施方案中，通过相同方法制备利用抗-TSH和抗-HSA涂覆的羧化物修饰的胶乳微粒(可从Bangs Laboratories Inc.和Seradyn Microparticles Inc.商购获得)。优选通过离心更换颗粒的第一缓冲液，随后添加抗体，所述抗体被允许被动地吸附至颗粒上。随后优选例如利用MES缓冲液(pH6.2)中的EDAC活化颗粒上的羧基，以与抗体形成酰胺键。任何珠粒聚集体可通过离心除去，可将完成的珠粒例如在约-80℃冷冻贮存。

筒设计

参照附图，用于本发明的任选筒设计包括罩子，图1,2；底座，图4；以及置于底座与罩子之间的薄膜粘合垫圈，图3。现参照图1,罩子1由能够在柔性铰链区5、9、10反复变形而不破裂的坚硬材料，优选塑料制成。罩子包含通过柔性铰链9连接至罩子主体的盖子2。在操作中，在将样品引入样品保持室34后，盖子可在样品入口端4的入口上方盖牢，防止样品渗漏，并且通过钩子3将盖子保持在原位。罩子还包含两个桨6,7，其相对于罩体是可移动的，并且通过柔性铰链区5,10与其连接。在操作中，当通过泵装置操作时，桨6对由腔43组成的气囊施加力，所述腔覆盖有薄膜垫圈21，以置换筒的管道内的液体。当通过第二泵装置操作时，桨7对垫圈21施加力，所述垫圈由于在其中切割产生的裂缝22和23而变形。筒被改造来适合插入读数装置，从而为此目的具有多个机械和电联接。还应当很明显的是筒的手工操作是可能的。因此，在将筒插入读数装置后，垫圈将压力传递至位于腔42中的充满约130μL的分析/洗涤溶液("液体")的包含液体的箔片包，在尖钉38上刺破所述包，将液体排入管道39，所述管道通过底座中的短的横切管道连接至传感器管道。分析液充满分析管道的前部，首先将液体推压至胶带垫圈中的用作毛细管终点的小开口上。用于筒的分析仪装置的其它运动可用于将一个或多个空气段在分析管道内受控的位置上注射进入分析液。这些区段用于帮助以最少的液体洗涤传感器表面和周围管道。

罩子还包含被柔软薄膜8覆盖的洞。在操作中，施加在膜上的压力将一个或多个空气段通过垫圈中的小洞28排入管道20。

参考图2，底座的下表面还包含第二管道11和第一管道15。第二管道11包括缢缩12，其通过提供对液体流动的阻力来控制液体流动。任选的涂层13、14提供疏水表面，其与垫圈洞31、32一起控制管道11、15之间的液体流动。基底中的凹陷17为管道34中的空气提供了路径以通过垫圈中的洞27传至管道34。

参考图3，薄膜垫圈21包含多个洞和裂缝以帮助液体在基座与罩子内的管道之间的转移，并允许垫圈在必要时在压力下变形。因此，洞24允许液体从管道11流入废液室44；洞25在管道34与11之间包含毛细管终点；洞26允许空气在凹陷18与管道40之间流动；洞27提供了凹陷17与管道34之间的空气流动；洞28允许液体经任选的可关闭阀41从管道19流至废液室44。洞30和33允许分别安置在切除物35和37内的免疫传感器芯片(上文中描述的)接触管道15内的液体。在具体实施方案中，切除物37安装了接地电极和/或反-参比电极，切除物35安装至少一个分析物传感器和任选地电导率测定传感器。洞29允许下面的滤器接触外部空气供应，从而允许产生流入洗涤液流的气泡。气泡的边缘在洗涤液中产生不同的变化，从而实现传感器上的部分洗涤。典型的ELISA测定利用允许有效地洗涤捕获传感器的不同缓冲液变化(而非部分洗涤)。

参考图3和4，管道34是在装配的筒中经垫圈21中的开口122将样品入口端4连接至第一管道11的样品保持室。切除物35安装有分析物传感器或分析物反应性表面以及任选的电导率测定传感器。切除物37安装有接地电极(必要时)作为电化学传感器的反流路径，并且还安装有任选的电导率测定传感器。切除物36在垫圈洞31与32之间提供了流体路径，以便液体可在第一与第二管道之间通过。凹陷42在装配的筒中安装有包含液体的包例如可破裂的小袋，所述小袋由于在插入读数装置后对桨7施加的压力而被尖钉38刺穿。来自刺破的包的液体流入39上的第二管道。气囊由在其上表面上被垫圈21密封的凹陷43组成。气囊是泵装置的一个实施方案，其被施加于桨6的压力驱动，将管道40中的空气置换，从而将样品从样品室34移至第一管道15。

空气从气囊进入样品室的位置(垫圈洞27)和毛细管终点25一起确定了样品室的预定体积。在一些优选实施方案中，样品被计量为1至500μL例如5至200μL或10至50μL，优选约20μL的样品体积。当桨6被压下时一定量的对应于该体积的样品被转移进第一管道。该排列从而是用于将计量量的未计量的样品递送进入筒的管道的计量工具的一个可能的实施方案。

在这种筒中，在基座塑料部分提供了用于计量样品段的工具。区段尺寸受基座中的区室的尺寸以及毛细管终点和带垫圈中的通气管洞的位置控制。该体积可容易地从1变化至500μL，例如从1变化至200μL。样品尺寸的该范围的扩大也可能在本发明的背景中。

液体被推动通过分析前管道11，该管道可用于在其出现在传感器管道19之前将试剂(例如，与清除珠粒、信号抗体或可溶性分子的一种或多种一起)修正进入样品。或者，修正试剂的一种或多种可位于一个或多个管道中。例如，一种或多种试剂可位于管道34和/或管道15中，超出位置16。推动样品通过分析前管道还用于将张力引入隔膜泵桨7，这改善其对于液体移位的驱动的反应性。

在一些测定中，如果需要分析物的定量，则计量是有利的。为从管道排出的样品和/或流体提供了废液室44，以防止筒外表面的污染。还提供了将废液室连接至外部大气的排气口45。筒的特性在于一旦样品被装载，分析就可完成并且可抛弃筒而无需操作者或其它人接触样品。

现参考图5，提供了筒和组件的特征的示意图，其中51-57是管道和样品室的部分，其可任选地用干试剂涂覆来修正样品或液体。样品或液体在干试剂上方通过至少一次以溶解其。用于修正筒内的样品或液体的试剂可包括抗体-酶缀合物、信号抗体、阻止测定化合物间的特异性或非特异性结合反应的阻断剂，或消耗性珠粒(上述的)。还可提供不溶解的但帮助阻止测定组分至筒内表面的非特异性吸附的表面涂层。

在一段样品或液体内，可优选地将修正物质在区段的预定区域内溶解和浓缩。这通过控制区段的位置和移动来实现。因此，例如，如果仅将一部分区段例如前缘在修饰物质上方来回往复运动，则可在靠近前缘的地方获得高局部浓度的物质。或者，如果期望物质的均匀分布，例如，如果需要已知浓度的修正物质来进行定量分析，则样品或液体的进一步往复运行将导致混合和均匀分布。

在具体实施方案中，在第一管道与废液室之间提供可关闭的阀门58。在一个实施方案中，阀门58由涂覆有不可渗透的物质的干海绵材料组成。在操作中，将海绵材料与样品或液体接触导致海绵膨胀以充满腔41，从而基本上阻断液体进一步流入废液室44。此外，浸湿的阀门还阻断第一管道与废液室之间的空气流动，这允许连接至样品室的第一泵装置移动第二管道内的液体，以下列方式将液体从第二管道移入第一管道。在样品暴露于传感器进行控制的时间后，将样品移入分析后管道19，在所述管道中，其可用另一种试剂进行修正。随后可将其移回传感器并且开始第二反应期。或者，分析后管道可简单地用于将样品区段与传感器分离。

图6显示包括3个泵装置61-63的免疫传感器筒的示意性布局。虽然这些泵已根据特定的实施方案进行了描述，但很容易理解，能够进行泵装置61-63的各自功能的任何泵装置可用于本发明中。因此，泵装置1、61必须能够将样品从样品保持室移至第二管道；泵装置2,62必须能够移动第二管道内的液体；泵装置3,63必须能够将至少一个区段插入第二管道。

操作

在优选实施方案中，在第一步骤中，用户从患者抽取血液样品(或如在下列情况下，使用具有已知TSH浓度的对照液体)并且将数滴样品插入筒。一旦筒被插入仪器，仪器就控制剩余的测试循环。优选将信号抗体涂覆在筒中的管道(例如，保持室)的壁上，信号抗体溶解进入样品，一部分样品被泵转移至免疫传感器的位置。或者，可将信号抗体沉积在免疫传感器区域的管道或装置的其它地方的涂层中，但理想地在免疫传感器上游的位置中。泵还振动样品以帮助促进在传感器上形成夹心。这可花费约1至20分钟，优选2至14分钟，4至12分钟或理想地约8分钟。随后泵迫使样品进入废液室。对于包括分开的洗涤步骤的实施方案，可通过泵将来自内部液体袋的洗涤液递送至免疫传感器上方以洗掉任何残留样品和未结合的信号抗体。一部分液体（还可包含酶底物）保留在传感器的区域。随后进行免疫传感器上的电流测量。仪器中的软件记录值例如电流或其它数据，如实施例部分的表中显示的，或计算和显示实际分析物浓度。

在作为安培计电化学系统的优选实施方案的操作中，由分析仪记录因ALP的活性产生的与免疫传感器上的对氨基苯酚的氧化相关的电流。各种磷酸化物质的ALP去磷酸化的生物化学是公知的。针对银-氯化银参比电极使免疫传感器上的电位保持平衡。

许多免疫测定装置和方法描述于下列共同拥有的专利和申请中。用于成功地测量血液样品中的分析物的一次性感应装置由Lauks在美国专利号5,096,669中公开。其使用读出装置和为了测量血液样品中的分析物浓度适配该读出装置的筒。属于Miller等人的美国专利7,723,099描述了利用免疫参比电极的免疫测定装置；属于Miller等人的美国专利号7,682,833描述了利用改进的样品封闭的免疫测定装置；属于Campbell等人的美国专利申请公布2004/0018577描述了多个杂交免疫测定；属于Davis等人的美国专利7,419,821描述了用于分析物测量和免疫测定的装置和方法；以及属于Collier等人的美国专利申请公布号2010/0167301描述了使用核苷酸缀合物的免疫测定组合物和方法。将这些专利和申请的每一个专利和申请通过引用整体并入本文。

在本领域内众所周知的是免疫测定易受不同形式的干扰。共同拥有未决的美国申请号12/411,325(“‘325申请”)例如阐明了通过将IgM包含在IgG试剂混合物中来减小来自嗜异性抗体的干扰。将‘325申请通过引用整体并入本文。

用于低洗涤TSH测定的抗体选择的经验与理论方法

对于TSH测定，在许多临床状况中相较于TSH可潜在地以高摩尔浓度发现相关激素。因此，通常将FSH、LH和CG分别以500、500和200,000mIU/mL的水平添加至TSH测定，以在高浓度的交叉反应性物质存在的情况下模拟真实样品(Architect Product DataInsert,Abbott,Chicago,IL)。TSH、FSH、LH和CG的这些浓度分别为约0.96、3000、760和436,000pM。

理论交叉反应性

一旦平衡解离常数已被测量，就可进行理论计算以基于获得的解离常数比较预期的交叉反应性。这些计算不能准确地预测实际测定的结果，但可用作指导，以确保抗体的亲和力将满足进行测定以及当在低洗涤筒实验中测试时选择的抗体表现显著更好。这些计算还可通过在开发的原型期中鉴定未预料到的测定结果来帮助测定的开发。见下文表1。

通过假定两步测定和在洗涤步骤之前进行计算，两步测定包括：(1)捕获步骤和(2)检测步骤。在捕获步骤中，假定所有4种激素都结合捕获抗体并且达到平衡。在该步骤后每一种结合至捕获抗体的激素的浓度被认为是捕获的激素的浓度。在检测步骤中，捕获的激素假定在与检测抗体的结合中达到平衡。在该第二步骤后结合至检测抗体的每一种激素的浓度是检测的浓度。随后通过将干扰性激素的检测浓度除以TSH的检测浓度，然后乘以100%来计算交叉反应性。表8中给出的抗体的测量的解离常数用于计算。TSH、FSH、LH和CG的浓度分别约为1,3000,760和436,000pM。这些值与通常添加至TSH测定(以对测定进行测试)的值是相当的。该计算用于确认选择的抗体相对于对照抗体的改善。计算假定100pM捕获抗体和100pM检测抗体。

由于模型不能准确地预测实际测定的结果，因为其它其它因素例如确定相容性抗体对或对捕获抗体的大规模运输的影响，所以数据仅用作指导来确认抗体具有价值，和估计靶解离常数。因此，为了比较抗体，以下列方式比较从交叉反应性计算而确定的值。通过使用抗体TSH Ab544和414B进行上述计算来确定对照交叉反应性值。对于这些对照抗体获得的交叉反应性的最佳值被采用为必须对其进行改善的交叉反应性。对于下表1中的每一种激素，该值利用星号来标示。任何候选抗体对应当具有比两种构型中的这些值更低的交叉反应性。根据表中的数据，我们看到414B和5409的组合具有其中针对FSH和CG的交叉反应性高于对照值的条件。该结果表明该组合对于TSH测定可能不是最佳的对。对于所有激素，该表还表明5409、ME130和T25C的组合产生低于任一组合的对照值的交叉反应性的值。这表明这些抗体可以是用于测定的良好候选者并且进一步进行了研究。

*表示差的夹心抗体对。

本发明将根据下列非限定性实例获得更好的理解。

实施例1:初始抗体筛选

获得67个抗体制剂(表2)，利用硝酸纤维素斑点印迹测定进行测试。此外，将TSH抗体544和Seradyn抗-α-LH单克隆抗体(Seradyn,Cat#MIT0414B)在这些研究中用作抗体的基准交叉反应性对。为了提供测定标准物，将抗原TSH(Cat#T9265,Sigma,St.Louis,MO)、FSH(Cat#F4021,Sigma,St.Louis,MO)、LH(Cat#L5259,Sigma,St.Louis,MO)和CG(Cat#C0434,Sigma,St.Louis,MO)重悬浮于1/5PBS缓冲液中至对于TSH、FSH、LH和CG分别为约35,000uIU/mL、700,000mIU/mL、250,000mIU/mL和2x10⁷mIU/mL的浓度。将1μL的每一种抗原点在一小条硝酸纤维素上并且进行干燥。首先用1%的PBS中的奶粉封闭硝酸纤维素条，随后用不同抗体制剂的每一种温育各个条。随后用PBS,0.05%Tween-20洗涤条，然后添加山羊抗-小鼠IgGH+L ALP第二缀合物(Cat#4751-1806,Kirkegaard&Perry,Gaithersburg,MD,USA)，其中将适当的抗-兔、绵羊和山羊IgG H+LALP缀合物用于某些多克隆，随后添加BCIP/NBT碱性磷酸酶底物(1-组分)(Cat#50-81-07,Kirkegaard&Perry,Gaithersburg,MD,USA)。通过在去离子水中漂洗来终止反应。

被选择用于进一步评估的抗体通过鉴定那些对于TSH抗原显示良好信号并且对FSH、LH和CG显示较弱的信号的条来确定。这导致产生用于进一步评估的25种候选抗体(表3)，包括TSH Ab544和Seradyn MIT0414B作为对照。

随后将25个候选抗体用于产生捕获珠粒和ALP缀合物，如下面实施例10和11中描述的。将这些试剂构建成筒，随后使用本文中描述的测试循环筛选交叉反应性。对于TSH(ThermoFisher,Cat#ABT0315)、FSH、LH和CG，抗原(对照测试液体)的浓度分别为约0.4mIU/L、500mIU/L、500mIU/L和200,000mIU/L。FSH、LH和CG试剂来自与上文所述的来源相同的来源。利用单独的TSH以及与CG、FSH和LH中的每一种单个地组合的TSH进行测定。百分比交叉反应性通过将从TSH与交叉反应性抗原之一产生的电化学信号减去由其本身产生的TSH信号的差除以由单独的TSH产生的信号来计算。

该筛选产生了用于另外评价的4种候选抗体(表4)。TSH Ab544和MIT0414B抗体用于比较研究，作为高交叉反应性对照。来自具有最低相对交叉反应性的抗体的商业提供的数据列于表4中。应当指出，这些具有最低水平的与使用的抗原样品的交叉反应性。随后通过使用Abbott Architect i2000SR仪(Chicago,IL,USA)测试这些干扰性抗原来鉴定和确认它们，这些抗原包含痕量的TSH抗原，从而导致在随后实验中当使用更高纯度的抗原(购自Fitzgerald,North Acton,MA)时未看到的观察到的更高水平的交叉反应性。由于交叉反应性水平相对于其它测试的抗体较低，因此预期这些抗体具有最佳交叉反应性能并且通过下文中描述的其它技术进一步进行了分析。

实施例2:FRET表位作图

抗体对相容性通过基于荧光共振能量转移(FRET)的竞争测定来测定。用

488羧酸琥珀酰亚胺酯(Cat#A20100,Invitrogen,Carlsbad,CA)标记约500至1000μg的每一种内分泌性糖蛋白激素(TSH(Cat#T9265,Sigma,St.Louis,MO)、FSH(Cat#30R-AF020,Fitzgerald,North Acton,MA)、LH(Cat#30-AL15,Fitzgerald,NorthActon,MA)和CG(Cat#30R-AC048,Fitzgerald,North Acton,MA)。用BHQ-10羧酸琥珀酰亚胺酯(Cat#BHQ-10S,Biosearch Technologies,Inc.,Novato,CA)作为荧光淬灭部分标记抗体。按照Ruan等人(2009,Analytical Biochemistry,第393卷:196)标记蛋白质。

基于它们在未标记抗体存在的情况下的淬灭能力选择抗体对。首先用荧光标记的抗原温育过量的6种抗体，随后将每一样品分入6个试管。在6个试管中，添加6种BHQ标记的抗体之一。因此，如表5中所示产生6x6个反应矩阵。在添加BHQ标记的抗体之前和之后测量来自每一个试管的荧光强度。荧光强度的显著变化显示正性夹心配对。荧光强度的无变化或几乎无变化表明未标记的抗体的存在阻断BHQ标记的抗体与相同分析物的结合。对于相同的对，针对1.0的值标准化荧光。表5提供了相对荧光值。

*表示差的夹心抗体对。

实施例3:利用

筒进行的表位作图

产生了6种抗体(实施例2中描述的)的每一种的聚苯乙烯珠粒和ALP缀合物。利用0.4mIU/L TSH(重组TSH,ThermoFisher,Cat#ABT0315,Fremont,CA,USA)测试筒，产生电化电流(nA)。表6列出了许多显示相容性抗体对的抗体对。未测试相同抗体对组合。例如，414B识别可预期因结合的生物学而具有高交叉反应性的α亚基，在筒中未进行测试。应当理解，利用荧光标签或荧光淬灭部分标记抗体可能会封闭表位，这可解释两种FRET与夹心ELISA法之间的差异，特别是对于T25C与BHQ标记的5409和M4。使用浓度为30mIU/L的TSH抗原在i-STAT筒的电化学免疫测定系统中测试抗体对。表6中的值是以nA表示的测量的电流。

*表示差的抗体对

NT=未测试的

用于交叉反应性评价的抗体对列于表7(基于FRET竞争测定和

筒数据)中。

实施例4:Kd计算

用

488羧酸琥珀酰亚胺酯(Cat#A20100,Invitrogen,Carlsbad,CA)标记约500至1000μg的每一种内分泌性糖蛋白激素(TSH(Cat#T9265,Sigma,St.Louis,MO)、FSH(Cat#30R-AF020,Fitzgerald,North Acton,MA)、LH(Cat#30-AL15,Fitzgerald,NorthActon,MA)和CG(Cat#30R-AC048,Fitzgerald,North Acton,MA))。抗原也利用BHQ-10羧酸琥珀酰亚胺酯(Cat#BHQ-10S,BiosearchTechnologies,Inc.,Novato,CA)作为荧光淬灭部分来标记。按照Ruan等人(2009,Analytical Biochemistry,第393卷:196)标记蛋白质。

按照Ruan等人,(2009,Analytical Biochemistry,第393卷:196)，使用SLM-Aminco Model SLM8100荧光分光光度计进行约100至250nM的浓度的BHQ缀合的抗体和100pmol(对于TSH)至约1000pmol(对于LH、CG和FSH的每一种)

488标记抗原的添加。利用IDL软件(ITT,Boulder,CO)分析数据以产生Kd值(nM)。数据的实例见于图7中。Kd数据的总结见于表8中。ME130、M4和414B不具有表9和11的抗体特征，从而不显示低水平的交叉反应性。表8提供了使用4种不同抗原的6种抗体的Kd结合数据；所有值以nM表示。

重要地，抗体产生充足的信号，因为交叉反应性水平对于低信号来说是更高的。因此，表9中不具有充分低的Kd值的抗体(较高的对于TSH的亲和力)不被考虑用于交叉反应性。这产生了用于交叉反应性测试的可能的抗体对的新列表(表10)。

那些具有表11中见到的抗体Kd特征的抗体预期具有低交叉反应性。

实施例5:

交叉反应性数据

将缀合的抗体珠粒制剂和碱性磷酸酶(ALP)缀合物组合构建入

免疫测定筒。

如实施例1中所述，基于相容性抗体对(表7)、对于TSH的适当Kd值(表9)和对于FSH、LH和CG的高Kd值(表11)，测试表10的组合的交叉反应性，并且总结于表12中。对于干扰抗原的任意一种显示大于5%的交叉反应性的抗体对用星号(*)标示。仅5409(捕获抗体)和T25C(信号抗体)显示小于5%的交叉反应性，因为它们是具有表9和11中描述的特征的唯一抗体。

用作捕获抗体的5409和用作检测抗体的T25C的抗体组合是唯一的能够赋予低交叉反应性(归因于它们的抗原结合特征以及它们识别相容性表位的能力)的一对。ME130具有更好的对于TSH的结合亲和力，这通过更高的安培计电流产生来显示。显示更高的安培计信号的抗体相较于那些产生更低的安培计信号的抗体对(所述抗体对对于区分系统中的噪音更成问题)产生更低的交叉反应性。表12显示使用0.4mIU/L TSH和添加所有抗原浓度的筒形式的抗原交叉反应性。仅选择先前测定的相容性抗体对。从选择中除去M4，因为其具有弱的对于TSH的亲和力，并且在筒测定中相较于其它抗体组合产生低信号(表6和表8)。

*表示具有不太期望的高于5%的交叉反应性的对

实施例6:抗-FSH95784珠粒制剂

如下制备抗-FSH95784珠粒：将15mg的1.01μm羧化聚苯乙烯微粒(10%重量/体积)(part#PCO4N,Bangs Laboratories Inc.,USA)与25mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES缓冲液,pH6.2)中的1.2mg的抗-FSH95784反应15分钟，随后离心以除去上清液。在将沉淀于25mMMES缓冲液中重悬浮后，将10mM碳二亚胺(EDAC)添加至样品，在4℃反应2小时。在此之后，离心样品，用1/5生理磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次。将于包含0.05%Tween20的磷酸盐缓冲液中配制的具有10%的固体的样品贮存以待将来使用。

将这些珠粒用于FSH检测筒的装配，其中将TSH捕获抗体用FSH缀合的珠粒替代。将珠粒配制成于1/5生理盐酸缓冲液(包含25%蛋白质稳定溶液(Cat#Q2030529P1,Gwent Group,Pontypool,UnitedKingdom))中的3.2%的固体。将0.8%的固体、0.08%Tween-20中的0.8%的蛋白质稳定溶液的制剂打印在芯片上并且构建入FSH筒。

将约5至10mg/mL(或0.5至1%的固体)的FSH珠粒掺入包含约500mIU/mL FSH的测试样品，利用移液器垂直地混合，随后立即注射进入FSH检测筒的进样口。还可将珠粒打印至筒的进样口上，随后当样品被引入筒时溶解于样品中。

实施例7:LH珠粒制备

除将Biospacific LH5304抗体用于取代抗-FSH95784外，与上文实施例6类似地制备LH聚苯乙烯珠粒。如上文实施例6中一样，将这些珠粒用于制造LH检测筒。

实施例8:FSH磁珠制备

如下制备FSH磁珠：将15mg的0.70μm超顺磁性微球体(10%重量/体积)(Catalog#MC04,Bangs Laboratories Inc,USA)与30mM碳二亚胺(EDAC)在离心管中于50mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES缓冲液,pH6.2)中反应15分钟。将管置于磁铁上以将磁珠吸引至磁铁一侧，同时抽吸出上清液。在用50mM MES两次洗涤后，将1.2mg抗-FSH95784(Abbott Diagnostics Division)与珠粒在4℃反应90分钟。通过将磁铁置于离心管的侧面将珠粒与上清液分离，随后除去上清液。随后，用1/5生理磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次。将于包含0.05%Tween20的磷酸缓冲液中配制的具有5%固体的样品贮存以待将来使用。

将约5至10mg/mL(或0.5至1%的固体)的FSH珠粒掺入包含约500mIU/mL FSH的测试样品，利用移液器垂直地混合，随后立即注射进入筒的进样口。还可将珠粒打印至筒的进样口上，随后当样品被引入筒时溶解于样品中。

实施例9:LH磁珠制备

除用Biospacific LH5304单克隆抗体替代抗-FSH95784外，与上述实施例8类似地制备LH磁珠。

实施例10:TSH珠粒制备

如下制备TSH5409ANA磁珠：将15mg的0.2μm羧化微球体(10%重量/体积)(part#13000550100390,Seradyn,Indianapolis,IN,USA)与25mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES缓冲液,pH6.2)中的1.2mgTSH5409mAb反应15分钟，随后离心以除去上清液。在将沉淀于25mM MES缓冲液中重悬浮后，将10mM碳二亚胺(EDAC)添加至样品，在4℃反应2小时。在此之后，离心样品，用1/5生理磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次。将于包含蛋白质稳定溶液(Cat#Q2030529P1,Gwent Group,Pontypool,United Kingdom)的1/5生理磷酸盐缓冲液中配制的具有3.2%的固体的样品贮存以待将来使用。将这些珠粒打印在用于构建TSH筒的芯片上。

如下制备TSH参照珠粒：除在反应中使用抗-HSA抗体(HyTestLtd,Cat4T24Mab1C8,Joukahaisenkatu,Turku,Finland)而非5409mAb外，制备过程与5409ANA珠粒制备过程相同。参照珠粒在免疫传感器制造和操作中的使用描述于美国专利号7,732,099(将其整体通过引用并入本文)中。此处，将免疫-参照传感器用于扣除从信号抗体与免疫传感器的非特异性结合产生的信号。

实施例11A:TSH信号抗体缀合物合成

信号抗体缀合物合成的优选实施方案如下：TSH T25C缀合物制剂使用胃蛋白酶消化的T25C完整抗体以在37℃于0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH3.5)中制备T25C F(ab)2’。通过使用S-300大小排阻柱(GEHealthcare,SE-75184Uppsala,Sweden)进行T25C F(ab)2’级分的纯化。将单乙醇胺盐酸盐(MEA)用于将T25C F(ab)2’还原成Fab-SH，随后将其与LC-SMCC(琥伯酰亚胺-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸酯])和活化的单分子ALP(碱性磷酸酶)在4℃反应过夜。随后使用大小排阻柱纯化缀合物级分，将其配制成1/5生理磷酸盐缓冲蛋白质稳定液。随后将其于-80℃冷冻贮藏以待将来使用。

实施例11B:LH和FSH信号抗体缀合物合成

对于FSH和LH实验，用上述实施例11A中描述的T25C替代识别α-亚基的414B抗体。该抗体用于清除珠粒实验，用作检测抗体。

实施例12:清除剂或消耗性珠粒

清除珠粒法的使用示于图9-11中。如图9中所示，聚苯乙烯珠粒的使用使FSH干扰从超过100%的交叉反应性显著地减小至低于15%。图9是其中将FSH珠粒(实施例6)构建成FSH检测筒的实验。样品包含极高浓度(500mIU/mL)的FSH。未添加FSH清除珠粒的信号被赋予100%的值。在添加FSH清除珠粒后，信号减小至15%。

图10聚焦在来自实施例7的LH清除珠粒的作用。对于实施例7和11B中描述的抗体组合LH捕获抗体和414B，LH的交叉反应性在清除珠粒不存在时为100%，然而将清除珠粒添加至测定循环使干扰减少至4%。

在上述实施例中，LH抗体是单克隆抗体小鼠β-LH,Catalog#5304SP-5。使用约0.5mg/mL的珠粒。FSH mAb是抗-FSH95784SP-5。下面的表13提供了关于可用作按照本发明的实施方案的清除珠粒的各种商购可得的材料的额外信息。

图11显示通过使用磁性珠粒FSH交叉反应性从约100%减小至低于10%的显著减小。在本实验中，构建了包含FSH聚苯乙烯捕获珠粒(实施例6)的FSH检测筒，将涂覆有镍(Nd₂Fe₄B)的永久磁铁构建成图8中显示的筒。同样地，将超顺磁FSH清除珠粒(实施例8)打印在样品入口端(图5进样口)。通过这些组分修饰，筒被构建得与标准方法相似。通过添加约20μL的掺入500mIU/mL的FSH的AbbottArchitect0TSH样准器(Chicago,IL)样品进行实验。

分析仪利用筒进行测定的步骤，对于无清除珠粒筒测试，测定中产生的所得电流被转化至100%，基于无清除珠粒的结果计算筒中打印的具有清除珠粒的样品，显示了信号的显著减小，从而确认清除珠粒减小测定中的本底的能力。

实施例13:筛选替代性单克隆抗体

作为可选择的实施方案，在Abbott Diagnostic Division(ADD)从TSH抗体细胞系的原液获得了11个抗体制剂作为T25C和/或5409抗体的潜在替代物。用于替代T25C和/或5409抗体的潜在替代性单克隆抗体的筛选方法基于下列假说：如果在未表征的抗体中发现相同表位，则它们应当潜在地具有与T25C和/或5409抗体相似的性质。

将约0.1ug ADD TSH完整mAb抗体掺入39mIU/L TSH样品，充分混合，在

免疫测定筒上，利用5409作为捕获抗体、利用T25C作为标记抗体进行测试。两个抗体克隆10-518-308和10-1179-45(表14)显示检测信号的显著减小，这表明它们与5409或T25C抗体竞争。

当抗体克隆10-518-308和10-1179-45被鉴定为5409和/或T25C的潜在替代物后，下一测试步骤将从单克隆抗体制备珠粒和缀合物以及确定它们是否形成有可用的夹心(与抗体表位对相容)和确定它们是否与TSH显示良好的信号以及抗FSH、LH和CG的良好选择性。

将ADD TSH抗体10-518-308制备成ANA珠粒，打印在传感器上，构建成无缀合物筒。将ADD TSH10-1179-45消化成F(ab)2’，还原成Fab片段，进一步与ALP缀合以形成用于筒测试的缀合物。5409ANA和T25C缀合物用作对照以进行比较。对于评价中的下列步骤存在4个筒组合。

就敏感性和线性评价，在0.1、0.4、0.6、1、8、45、88mIU/L水平，针对一系列TSH内部对照(包括去除TSH的血浆)测试这4亚批筒(表15)。还可就交叉反应性评价，针对0.4mIU/L TSH样品中的掺入的500mIU/ml的LH、FSH和200000mIU/ml的CG测试它们。

基于上述测试，TSH抗体克隆10-1179-456被确认为替代Fitzgerald T25C抗体以与抗体Biospacific5409配对的潜在候选物，因为该组合具有相似的对TSH的信号应答和相较于T25C/5409组合小于10%的与LH、FSH和CG交叉反应物的交叉反应性。

虽然已根据各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员将认识到，可进行各种变动、置换、省略和变化而不背离本发明的精神。因此，本发明的范围仅受下列权利要求的范围限定。

Claims

1.一种促甲状腺激素(TSH)夹心免疫测定，其包括至少两种表位相容性抗体，包含至少一种捕获抗体和至少一种信号抗体，其中两种抗体对于TSH的解离常数(Kd)均小于1nM或为约1nM，并且其中该测定还包括以针对滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)的珠粒抗体涂覆的清除珠粒，其中每一种珠粒抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别小于约1nM，并且每一种所述FSH、LH和CG抗体对于TSH的Kd大于250nM。

2.权利要求1的免疫测定，其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.5nM的对于TSH的Kd。

3.权利要求1的免疫测定，其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.15nM的对于TSH的Kd。

4.权利要求1的免疫测定，其中捕获抗体对于TSH的Kd小于0.15nM并且捕获抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于1000nM，大于1000nM和大于500nM。

5.权利要求1的免疫测定，其中信号抗体对于TSH的Kd小于0.15nM并且信号抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于300nM，大于35nM和大于35nM。

6.权利要求1的免疫测定，其中所述免疫测定使用单个洗涤步骤。

7.权利要求1的免疫测定，其中所述清除珠粒是非磁性的。

8.权利要求1的免疫测定，其中所述清除珠粒是磁性的。

9.一种用于进行TSH免疫测定的方法，所述方法包括步骤：

(a)将液体样品插入于导管中包含免疫传感器的装置，所述免疫传感器具有针对TSH的捕获抗体;

(b)将信号抗体溶解进入所述液体样品;

(c)利用针对滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)中的一种或多种的清除珠粒修正所述液体样品;

(d)在所述免疫传感器上形成夹心复合物，所述复合物包含所述捕获抗体、TSH和所述信号抗体;

(e)利用洗涤液从传感器洗掉未复合的信号抗体；和

(f)检测与所述复合信号抗体相关的信号。

10.权利要求9的方法，其中所述清除珠粒是磁性的，所述方法还包括在施加磁场后将所述清除珠粒保留在保留区域的步骤。

11.权利要求9的方法，其中所述清除珠粒包含具有对于FSH、LH和CG的每一种小于约0.15nM的Kd和大于约250nM的Kd(TSH)的珠粒抗体。

12.权利要求9的方法，其中所述清除珠粒包含用于清除FSH的第一清除珠粒、用于清除LH的第二清除珠粒以及用于清除CG的第三清除珠粒。

13.权利要求9的方法，其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.15nM的对于TSH的解离常数(Kd)。

14.权利要求9的方法，其中捕获抗体和信号抗体各自具有不超过0.15nM的对于TSH的解离常数(Kd)，其中捕获抗体对于滤泡刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)的Kd分别大于1000、大于1000和大于500nM，并且其中信号抗体对于FSH、LH和CG的Kd分别大于250，大于35和大于35nM。

15.权利要求9的方法，其中捕获抗体具有大于6000的第一Kd比率Kd(FSH):Kd(TSH)，并且信号抗体具有大于1500的第二Kd比率Kd(FSH):Kd(TSH)。

16.权利要求9的方法，其中夹心复合物通过所述捕获抗体和信号抗体与液体样品的大体上非相继的接触形成。

17.权利要求9的方法，其中在无一个或多个用于减小与FSH、LH和CG中的一个或多个的交叉反应的间插洗涤步骤的情况下，形成夹心复合物。

18.权利要求9的方法，其中所述液体样品是稀释的血液样品、未稀释的血液样品、稀释的血浆样品或非稀释的血浆样品。

19.权利要求9的方法，其中捕获抗体包括小鼠单克隆抗体(Biospacific Cat#5409SPTNE-5)，并且信号抗体包括小鼠单克隆抗体(Fitzgerald Cat#10-T25C)。

20.权利要求9的方法，其中捕获抗体共价地结合至珠粒。

21.权利要求9的方法，其中将信号抗体缀合至选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和荧光部分的报道分子。

22.权利要求9的方法，其中所述检测步骤是电化学检测。

23.权利要求9的方法，其中所述检测步骤是光学检测。

24.权利要求9的方法,包括不超过一个洗涤步骤来从捕获抗体除去样品和未结合的信号抗体，并且其中洗涤液还包含报告分子的底物。

25.权利要求9的方法,还包括在计量室中计量液体样品以形成具有1至500μL的体积的计量的样品。

26.权利要求9的方法，还包括爆裂洗涤液小袋以释放5至500μL的洗涤液进入所述导管，所述洗涤液小袋与免疫传感器是液体连通的。

27.权利要求9的方法,还包括在所述洗涤液中形成多个空气段。

28.权利要求9的方法，其中捕获抗体和信号抗体各自能够结合TSH的TSH-β亚基上的至少两个不同的表位。

29.权利要求9的方法，其中捕获抗体和信号抗体是表位相容的抗体。

30.权利要求9的方法，其中捕获抗体和信号抗体选自下列捕获/信号抗体对：5409/T25C和T25C/5409。

31.权利要求9的方法，其中捕获抗体和信号抗体选自下列捕获/信号抗体对：5409/10-1179-456和10-1179-456/5409。