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Die
Erfindung bezieht sich auf einen Immunoassay, umfassend einen porösen Träger, welcher zur
Durchführung
eines Nachweises eines zu detektierenden Analyten in einer Testflüssigkeit
in einer Applikationszone mit der Testflüssigkeit befeuchtbar ist, wobei
auf dem porösen
Träger
- – in
einer Startzone ein mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markierter
Sondenantikörper, der
an den Analyten binden kann, derart aufgebracht ist, dass er in
einem trockenen Zustand des porösen
Trägers
in der Startzone fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand des
porösen Trägers mit
der Testflüssigkeit
stromabwärts
in dem porösen
Träger
bewegen kann,
- – in
einer stromabwärts
von der Startzone gelegenen Detektionszone ein Detektionsantikörper, der ebenfalls
an den Analyten binden kann, dauerhaft immobilisiert ist,
- – in
einer von der Startzone und der Detektionszone beabstandeten Kontrollzone
eine Kontroll-Detektionssubstanz dauerhaft immobilisiert ist
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Die
Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zum Nachweis eines
zu detektierenden Analyten in einer Testflüssigkeit, wobei ein poröser Träger in einer
Applikationszone mit der Testflüssigkeit befeuchtet
wird, welche ihn stromabwärts
durchläuft und
dabei folgende Zonen auf dem porösen
Träger passiert:
- – eine
Startzone in welcher ein mit einem optisch detektierbaren Farbstoff
markierter und in trockenem Zustand des porösen Trägers fixierter Sondenantikörper vorliegt,
der mit dem Analyten bindet, sofern dieser in der Testflüssigkeit
vorhanden ist, und der sich mit der Testflüssigkeit weiter stromabwärts bewegt,
- – eine
stromabwärts
von der Startzone gelegene Detektionszone, in welcher ein Detektionsantikörper dauerhaft
immobilisiert ist, der mit dem Analyten und dem daran gebundenen
Sondenantikörper
in einer Sandwich-Reaktion
bindet, sofern diese beiden Stoffe nach Passieren der Startzone
in der Testflüssigkeit
vorhanden sind,
- – eine
von der Startzone und der Detektionszone beabstandete Kontrollzone,
in welcher eine Kontroll-Detektionssubstanz
dauerhaft immobilisiert ist
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Derartige
Assays und Verfahren werden in der modernen Diagnostik vielfach
verwendet, um einen Analyten in einer Testflüssigkeit nachzuweisen. Aus
EP 0 291 194 A1 sind
solche Assays und Verfahren bekannt. Dort wird ein streifenförmiger,
poröser Träger beschrieben,
der in einer Applikationszone an einem Ende des Teststreifens mit
einer Testflüssigkeit
befeuchtbar ist, die mutmaßlich
den zu detektierenden Analyten enthält. Aufgrund von Kapillarkräften in
dem porösen
Träger
wird die Testflüssigkeit durch
den Teststreifen in ein an dem gegenüberliegenden Streifenende gelegenes
Flüssigkeitsreservoir
gesaugt. Auf ihrem Weg durch den Teststreifen passiert die Testflüssigkeit
verschiedene unterschiedlich präparierte
Zonen auf dem porösen
Träger.
Die Formulierung „auf
dem Träger" ist hier weit zu
verstehen und umfasst alle Zonenformen, die mit dem Trägermaterial
in Flüssigkeit
leitender Verbindung stehen. Das sind z. B. Präparationen, die den Teststreifen
durchdringen, solche die allein seine Oberfläche betreffen, ebenso wie solche,
bei der ein separates, präpariertes
Element, wie beispielsweise ein Glasfaserkissen mit darin aufgetrockneten
Substanzen, in direktem Kontakt zu dem Teststreifen steht.
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Von
der Applikationszone aus durchläuft
die Testflüssigkeit
stromabwärts
zunächst
einer Startzone, in welcher partikelmarkierte Sondenantikörper vorliegen.
Diese sind in der Startzone derart fixiert, dass sie im trockenen
Zustand des porösen
Trägers nicht
beweglich sind, im feuchten Zustand des porösen Trägers jedoch von der Testflüssigkeit
erfasst werden und sich mit dieser stromabwärts bewegen können. Die
Sondenantikörper
sind derart gewählt, dass
sie an den Analyten binden können.
Enthält
die Testflüssigkeit
den Analyten, kommt es daher in der Startzone zu einer ersten Immunreaktion
zwischen dem Analyten und dem Sondenantikörper.
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Weiter
stromabwärts
läuft die
Detektionsflüssigkeit
zusammen mit dem gelösten
Sondenantikörper
in eine Detektionszone, in welcher ein Detektionsantikörper dauerhaft
immobilisiert ist. Das bedeutet, dass der Detektionsantikörper weder
im trockenen noch im feuchten Zustand des porösen Trägers beweglich ist. Der Detektionsantikörper ist
so gewählt,
dass er ebenfalls an den Analyten binden kann. Enthält die Testflüssigkeit
den Analyten, kommt es daher in der Detektionszone zu einer sogenannten Sandwich-Reaktion,
bei welcher der Analyt mit dem an den ihn gebundenen Sondenantikörper an
den Detektionsantikörper
bindet und so in der Detektionszone immobilisiert wird. In der Folge
kommt es zu einer Anfärbung
der Detektionszone, die optisch nachgewiesen werden kann.
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Von
der Startzone und der Detektionszone beabstandet (bei dem bekannten
Verfahren und Assay stromabwärts
gelegen, was für
die vorliegende Erfindung jedoch nicht erforderlich ist) ist eine
Kontrollzone vorgesehen, in welcher eine Kontroll- Detektionssubstanz
dauerhaft immobilisiert ist. Bei dem bekannten Assay und Verfahren
ist die Kontroll-Detektionssubstanz
so gewählt,
dass sie an den Sondenantikörper
binden kann. Dies hat zur Folge, dass der Sondenantikörper unabhängig davon,
ob in der Testflüssigkeit
Analyt vorhanden ist, in der Kontrollzone immobilisiert wird, was
zu einer entsprechenden Anfärbung
der Kontrollzone führt.
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Die
Anfärbung
der Kontrollzone stellt einen Hinweis für den Benutzer dar, dass der
Test vollständig
abgelaufen ist. Zusätzliche
Anfärbung
der Detektionszone stellt einen Hinweis für den Benutzer dar, dass in
der Testflüssigkeit
Analyt enthalten ist.
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Dieses
Verfahren kann beispielsweise für Schwangerschaftstests
eingesetzt werden, die sich auf unkomplizierte Weise von nicht geschulten
Benutzern zuhause durchführen
lassen. In diesen Fällen
kann die Testflüssigkeit
beispielsweise weiblicher Urin und der Analyt hCG sein.
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Der
bekannte Assay und das bekannte Verfahren weisen den Nachteil auf,
dass die Reaktionsintensität
in der Kontrollzone von der Reaktionsintensität in der Detektionszone abhängig ist.
Werden nämlich
in der Detektionszone auf Grund einer hohen Konzentration von Analyt
bereits große
Mengen des Sondenantikörpers
immobilisiert, fällt
die Reaktion und damit die Anfärbung
der Kontrollzone entsprechend schwächer aus, da für diese
Reaktion nur noch wenige markierte Sondenantikörper zur Verfügung stehen.
Ist im Gegensatz dazu die Konzentration an Analyt sehr gering, fällt die
Kontrollreaktion und damit die Anfärbung der Kontrollzone übermäßig stark
aus, was zu einer Unterschätzung
der Detektionszonenfärbung
und somit zu einer Fehlinterpretation des Testergebnisses führen kann.
Insbesondere steht dieser Nachteil einer quantitativen oder semiquantitativen
Auswertung des Tests im Wege. Im Falle eines Schwangerschaftstests
ist lediglich eine Ja/Nein-Aussage
gewünscht.
Bei einer Vielzahl anderer Analyten, beispielsweise bei der PSA-Diagnostik
zur Erkennung von Prostata-Karzinomen dagegen ist eine wenigstens
semiquantitative Auswertung erforderlich.
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Die
WO 97/09620 A1 nimmt
sich dieser Probleme an und schlägt
für einen
Immunoassay bzw. ein Nachweisverfahren mit abgewandelter Probenapplikation
vor, dass in einer stromaufwärts
der Kontrollzone gelegenen Kontroll-Startzone auf dem porösen Träger eine
mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markierte Kontrollsubstanz,
welche an die Kontroll-Detektionssubstanz
binden kann und die nicht an den Analyten oder den Sondenantikörper binden
kann, derart auf dem porösen
Träger
aufgebracht ist, dass sie in einem trockenen Zustand des porösen Trägers in
der Kontroll-Startzone fixiert ist und sich im befeuchteten Zustand
des porösen
Trägers
mit der Testflüssigkeit
stromabwärts
in dem porösen
Träger
bewegen kann. Entsprechend wird für das Nachweisverfahren vorgeschlagen,
dass die Testflüssigkeit
weiter eine stromaufwärts
der Kontrollzone gelegene Kontroll-Startzone auf dem porösen Träger durchläuft, in
welcher eine mit einem optisch detektierbaren Farbstoff markierte
und in trockenem Zustand des porösen
Trägers
fixierte Kontrollsubstanz vorliegt, welche an die Kontroll-Detektionssubstanz
binden kann und die nicht an den Analyten oder den Sondenantikörper binden
kann und die sich mit der Testflüssigkeit
stromabwärts
bewegt.
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Dies
bedeutet im Ergebnis eine Entkopplung der Nachweisreaktion von der
Kontrollreaktion. Der Sondenantikörper (mit oder ohne gebundenen
Analyten) wird nicht in der Kontrollzone festgehalten, sondern kann
ohne Reaktion durch diese hindurchtreten. Stattdessen wird in der Kontrollzone
die markierte Kontrollsubstanz von der immobilisierten Kontroll-Detektionssubstanz
gebunden. Die Kontrollsubstanz hat zuvor weder eine Reaktion mit
dem Analyten noch mit dem in der Detektionszone immobilisierten
Detektionsantikörper
erfahren.
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Für den Anwender
eines Test mit dem Ja/Nein-Aussage ergibt sich keine Benutzungsänderung
gegenüber
Techniken mit gekoppelten Detektions- und Kontrollreaktionen. In
jedem Fall erfolgt eine Anfärbung
der Kontrollzone und im Fall, dass in der Testflüssigkeit Analyt vorliegt, ergibt
sich zusätzlich eine
Anfärbung
der Detektionszone.
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Im
Hinblick auf eine semi-quantitative Auswertung schlägt die
WO 97/09620 A1 zudem
vor, dass
- – die
Dichte, in welcher die Kontroll-Detektionssubstanz in der Kontrollzone
immobilisiert ist,
- – die
Dichte, in welcher der Detektionsantikörper in der Detektionszone
immobilisiert ist, und
- – die
Menge, in welcher die Kontrollsubstanz im trockenen Zustand des
porösen
Trägers
in der Kontroll-Startzone fixiert ist,
derart aufeinander
abgestimmt sind, dass sich nach Ablauf einer vorgegebenen Zeitspanne
nach bestimmungsgemäßer Befeuchtung
des porösen
Trägers mit
einer den Analyten in einer vorbestimmten Referenzkonzentration
enthaltenden Testflüssigkeit
in der Detektionszone und in der Kontrollzone ein gleiches Ausmaß an Anfärbung einstellt.
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Für das Nachweisverfahren
bedeutet dies, dass sich nach Ablauf einer vorgegebenen Zeitspanne
nach bestimmungsgemäßer Befeuchtung
des porösen
Trägers
mit einer den Analyten in einer vorbestimmten Referenzkonzentration
enthaltenden Testflüssigkeit
in der Detektionszone und in der Kontrollzone ein gleiches Ausmaß an Anfärbung einstellt.
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Beispielsweise
könnte
sich bei einem PSA-Test die Kontrollzone nach einer vorgegebenen Zeit
stets in dem gleichen Ausmaßanfärben, wie
sich die Detektionszone bei einer PSA-Konzentration in der Testflüssigkeit
von 4 ng/ml, was eine physiologisch relevante Grenzkonzentration
darstellt, anfärben
würde,
so kann der Anwender des Verfahrens durch Vergleich von Detektionszone
und Kontrollzone leicht feststellen, ob die in der Testflüssigkeit
vorliegende Analyt-Konzentration den Grenzwert überschreitet oder nicht.
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Nachteilig
bei dem bekannten Verfahren ist jedoch, dass eine korrekte Auswertung
eines durchgeführten
Tests sehr stark von Störkomponenten
in der Testflüssigkeit
abhängt.
Insbesondere Störantigene,
die in der Lage sind, kompetitiv, d. h. hier in Konkurrenz zum Analyten,
an den Detektionsantikörper
zu binden, können
das Signal in der Detektionszone deutlich reduzieren, ohne jedoch
die entkoppelte Reaktion in der Kontrollzone entsprechend zu beeinflussen.
Hieraus kann sich eine starke Unterschätzung des Messwertes ergeben.
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Aus
der
DE 197 31 465
A1 ist es bekannt, mit einer Mehrzahl von Detektionsfeldern
unterschiedlichen immunologischen Aufbaus zu arbeiten, um so zum
einen feststellen zu können,
ob eine Störung
der Messung aufgrund von Störkomponenten
in der Testflüssigkeit
vorliegt, und um zum anderen ggf. Hinweise für eine geeignete quantitative
Korrektur des Messergebnisses zu erlangen. Der Aufbau eines aussagekräftigen Musters
von Detektionsfeldern ist in Auslegung und Herstellung aufwendig
und somit teuer. Insbesondere bei Assays, die auch von ungeschultem
Personal durchgeführt
werden sollen, ist zudem die komplexe Korrektur des Messergebnisses
aus einer Vielzahl von Einzelinformationen nachteilig.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Immunoassay und
ein Nachweisverfahren für
einen Analyten gemäß der
WO 97/09620 A1 so
weiterzubilden, dass auf einfach handhabbare Weise eine sichere
semi-quantitative Auswertung ermöglicht
wird.
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Diese
Aufgabe wird gelöst
durch die Merkmale der Ansprüche
1 und 12. Dabei ist insbesondere vorgesehen, dass auf dem porösen Träger und dessen
Breite überspannend
stromaufwärts
der Startzone und stromabwärts
der Applikationszone eine Fangzone vorgesehen ist, in welcher Fangantikörper dauerhaft
immobilisiert sind, welche selektiv oder spezifisch sind für mutmaßlich in
der Testflüssigkeit
vorhandene Störantigene,
die mit dem Sondenantikörper
und/oder dem Detektionsantikörper binden
können.
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Im
Hinblick auf das erfindungsgemäße Nachweisverfahren
wird entsprechend vorgeschlagen, dass die Testflüssigkeit eine auf dem porösen Träger stromaufwärts der
Startzone und stromabwärts
der Applikationszone vorgesehene und die Breite des Trägers überspannende
Fangzone durchläuft
und dort in der Testflüssigkeit
enthaltene Störantigene,
die mit dem Sondenantikörper
und/oder dem Detektionsantikörper
binden können,
von in der Fangzone (F) dauerhaft immobilisierten Fangantikörpern selektiv
oder spezifisch gebunden werden.
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Die
Wirkungen dieser Maßnahmen
lassen sich besonders deutlich an einem Beispiel erläutern, wobei
als Beispiel der Einfachheit der Erklärung halber ein Ja/Nein-Test,
insbesondere ein Schwangerschaftstest gewählt wurde. Erst beim Einsatz
der erfindungsgemäßen Maßnahmen
bei einem Test, der vorzugsweise semi-quantitativ auszuwerten ist,
wie z. B. einem PSA-Test, kommen sämtliche Vorteile der Erfindung
zur Entfaltung, wie der Fachmann leicht erkennen wird. Bei einem
Schwangerschaftstest soll üblicherweise
als Analyt hCG detektiert werden, das lediglich in der Schwangerschaft
im weiblichen Urin vorkommt. Dem hCG biochemisch ähnlich sind
verschiedene weitere Hormone, insbesondere LH, FSH und TSH, die
unabhängig
von der Schwangerschaft im weiblichen Urin auftreten. Insbesondere
weisen alle vier Hormone im Wesentlichen identische α-Ketten auf
und sind lediglich an ihren individuell verschiedenen β-Ketten unterscheidbar.
Zur Vermeidung einer sterischen Inhibition der Immunreaktion in der
Detektionszone ist es wünschenswert,
die dort stattfindende Sandwich-Reaktion so zu gestalten, dass ein
Antikörper,
vorzugsweise der Sondenantikörper,
für die β-Kette von hCG spezifisch
ist, während
der immobilisierte Detektionsantikörper an die α-Kette von
hCG bindet. Da, wie bereits erwähnt,
im weiblichen Urin LH, FSH und TSH vorhanden sein, die identischen α-Ketten aufweisen,
könnten
diese ebenfalls an den Detektionsantikörper binden, damit Bindungsstellen
in der Detektionszone kompetitiv besetzen und die sichtbare Sandwich-Reaktion
abschwächen.
Um dies zu verhindern, kann vorteilhafter Weise vorgesehen sein,
in der Fangzone Antikörper
zu immobilisieren, die für
die β-Ketten
von LH, FSH bzw. TSH spezifisch sind. Die Störantigene LH, FSH und TSH werden
somit in der Fangzone aus der Testflüssigkeit herausgefangen und
können
in der Detektionszone keine Bindungsplätze besetzen, so dass die gewünschte Sandwich-Reaktion
(Detektionsantikörper-hCG-Sondenantikörper) optimal
ablaufen kann. Bei anderen Analyten und/oder Störantigenen sind die Fangantikörper hinsichtlich
ihrer Selektivität
bzw. Spezifität
vom Fachmann angemessen auszuwählen.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Assays
und des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Kontroll-Startzone
der Startzone benachbart angeordnet oder überlappt diese ganz oder teilweise.
Der Vorteil dieser Maßnahme liegt
darin, dass beide markierte Substanzen, nämlich der Sondenantikörper und
die Kontrollsubstanz gemeinsam in einer Zone, beispielsweise einem
vorzugsweise stromabwärts
der Applikationszone und zu dieser benachbart aufgebrachten Glasfaserkissen,
aufgebracht, z. B. aufgetrocknet, werden können. Da die Kontrollreaktion
und die Detektionsreaktion erfindungsgemäß entkoppelt sind, kann die
Kontroll-Startzone jedoch auch an jedem beliebigen anderen Ort des
porösen
Trägers
stromaufwärts
der Kontrollzone vorgesehen sein.
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Bei
einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Assays
und des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist die Kontrollsubstanz ein Kontrollantikörper und die Kontroll-Detektionssubstanz
ist ein Kontroll-Detektionsantigen, welches mit dem Kontrollantikörper, nicht
aber mit dem Sondenantikörper
binden kann.
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Bei
einer alternativen, in der Regel zu bevorzugenden Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Assays
und des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist vorgesehen, dass die Kontroll-Detektionssubstanz ein Kontroll-Detektionsantikörper ist,
welcher eine ausreichende Selektivität aufweist, um mit der Kontrollsubstanz,
nicht aber mit dem Analyten oder dem Sondenantikörper zu binden. Unter „Selektivität" bzw. „selektiv" wird im Rahmen der
vorliegenden Beschreibung die Eigenschaft eines Antikörpers verstanden,
mit einer mehr oder weniger großen
Gruppe von Antigenen eine bindende Immunreaktion einzugehen, welche
er mit nicht dieser Gruppe zugehörigen
Antigenen nicht zeigt. Im Gegensatz dazu versteht der Fachmann unter
dem weiter unten verwendeten der „Spezifität" bzw. „spezifisch" die Eigenschaft
eines Antikörpers
mit genau einem wohldefinierten Antigen eine bindende Immunreaktion
einzugehen und mit anderen Antigenen keine nennenswerte Kreuzreaktion
zu zeigen.
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Vorzugsweise
ist bei dem erfindungsgemäßen Immunoassay
ist eine stromabwärts
der Start-, Kontroll-Start-, Detektions- und Kontrollzonen eine Flüssigkeitsaufnahmezone
vorgesehen, in welcher Testflüssigkeit,
welche die Start-, Kontroll-Start-,
Detektions- und Kontrollzonen durchlaufen hat, speicherbar ist.
In einer solchen Flüssigkeitsaufnahmezone
wird bei einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens
Testflüssigkeit gespeichert,
welche die Start-, Kontroll-Start-, Detektions- und Kontrollzonen
durchlaufen hat. Hierdurch wird sichergestellt, dass nicht gebundene
markierte Substanz den Test nicht verfälscht. Auch ein großes Flüssigkeitsreservoir,
das beispielsweise durch ein Kissen aus porösen Stoff realisiert sein kann,
günstig,
um auch bei vollständiger
Durchfeuchtung des Teststreifens den kapillarkraftgetriebenen Strom
von Testflüssigkeit
durch die einzelnen Zonen am Laufen zu halten.
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Bei
unterschiedlichen Ausführungsformen des
erfindungsgemäßen Assays
und des erfindungsgemäßen Verfahrens
können
die Spezifitäten
und Selektivitäten
der verschiedenen Antikörper
unterschiedlich verteilt sein. So kann beispielsweise bei einer
Ausführungsform
vorgesehen sein, dass der Sondenantikörper und der Detektionsantikörper für den Analyten
spezifisch sind. Bei einer anderen Ausführungsform kann vorgesehnen
sein, dass der Sondenantikörper
für den
Analyten spezifisch ist und der Detektionsantikörper lediglich eine Selektivität für den Analyten
aufweist, d. h. auch an andere, verwandte Antigene binden kann,
wie etwa in dem oben genannten Beispiel hCG, FSH, LH, TSH. Auch
der umgekehrte Aufbau ist möglich,
wobei der Sondenantikörper
eine Selektivität
für den
Analyten aufweist und der Detektionsantikörper für den Analyten spezifisch ist.
Die Fangantikörper
sind, wie bei dem genannten Beispiel, vorzugsweise für die Störantigene
spezifisch.
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Als
optisch detektierbarer Farbstoff ist insbesondere die Wahl eines
partikelförmigen
Direktfarbstoffs günstig,
der vorzugsweise Gold- und/oder Latexpartikel enthält. Derartige
Markierung von Antikörpern
ist im Stand der Technik bekannt, und einfach sowie preiswert durchzuführen.
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Weitere
Vorteile der Erfindung ergeben aus der nachfolgenden speziellen
Beschreibung und den Zeichnungen, in denen
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1 schematisch
die Reaktionen darstellt, die in zwei Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen Assays
im Vergleich mit einem Assay nach dem Stand der Technik auftreten
und
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2 schematisch
eine Weiterbildung des erfindungsgemäßen Assays und die auftretenden Reaktionen
zeigt.
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1 zeigt
schematisch einen Assay 10, der als Teststreifen aus porösen Material,
vorzugsweise Papier, Pappe, Nitrozellulose etc., mit unterschiedlich präparierten
Zonen aufgebaut ist. In der Zeichnung rechts neben dem Teststreifen 10 sind
drei Spalten I, II, II' angeordnet,
in denen schematisch die in den jeweiligen Zonen ablaufenden Reaktionen
bei einem Tests, die aus dem Stand der Technik bekannt (I) oder
extrapolierbar (II, II')
sind.
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In
der Zeichnung unten am Teststreifen 10 ist eine Applikationszone
A vorgesehen, auf welche Testflüssigkeit,
beispielsweise Urin aufgebracht oder welche in die Testflüssigkeit
eingetaucht wird. Bei der Applikationszone kann es sich z. B. um
einen aufgerauhten Bereich des porösen Trägers oder ein in Flüssigkeit
leitender Verbindung mit dem porösen Träger stehendes
Aufnahmeschwämmchen
handeln. In der Testflüssigkeit
sei Analyt 11, z. B. hCG vorhanden.
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Durch
Kapillarkräften
in dem porösen
Träger strömt die Testflüssigkeit
mit dem Analyten 11 durch die Startzone S, die bei den
dargestellten Ausführungsformen
der Erfindung (II, II')
mit der Kontroll-Startzone CS übereinstimmt.
Hier kommt es zu einer Bindung des Analyten 11 mit dem
markierten Sondenantikörper 1.
Die Markierung ist in 1 schematisch als Markierung
mit einem Goldpartikel dargestellt. Während dies bei dem Test I die
einzige Reaktion in der Startzone S ist, werden bei den Tests II
und II' im trockenen
Zustand in der Kontroll-Startzone CS fixierte Kontrollantikörper 4,
welche ebenfalls mit einem Goldpartikel markiert sind, gelöst und bewegen
sich zusammen mit dem Antigen 11 und dem Sondenantikörper 1 mit
der Testflüssigkeit
stromabwärts.
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Als
nächstes
durchströmt
die Testflüssigkeit die
Detektionszone D. Hier kommt sowohl bei Test I als auch bei den
den Tests II und II' zu
einer Sandwich-Reaktion, bei welcher der Analyt 11 mit
dem an ihn gebundenen Sondenantikörper 1 an einen in
der Detektionszone immobilisierten Detektionsantikörper 2 bindet.
Der Kontrollantikörper 4 nimmt
an dieser Reaktion nicht teil.
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In
der Folge durchströmt
die Testflüssigkeit die
Kontrollzone C. Hier ist bei Test I ein Kontroll-Detektionsantikörper 3 dauerhaft
immobilisiert. Dieser bindet an den Sondenantikörper 1 der dadurch
in der Kontrollzone C festgehalten wird und diese anfärbt. Dass
diese Reaktion unabhängig
davon stattfindet, ob Analyt 11 an den Sondenantikörper 1 gebunden ist,
wird durch die gestrichelte Darstellung des Analyten 11 angedeutet.
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Bei
Test II ist in der Kontrollzone C ein Kontroll-Detektionsantikörper 3' dauerhaft immobilisiert, der mit
dem Sondenantikörper 1 nicht
binden kann. Stattdessen erfolgt hier eine Bindung mit dem markierten
Kontrollantikörper 4.
Der Sondenantikörper 1 durchströmt die Kontrollzone
C ohne Reaktion und wird in dem Flüssigkeitsreservoir R aufgefangen. Auch
der Analyt 11 selbst kann mit dem Kontroll-Detektionsantikörper 3' nicht reagieren.
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Bei
Test II' ist in
der Kontrollzone C ein Antigen 12 immobilisiert, an welches
der Kontrollantikörper 4 bindet.
Ebenso wie bei der Variante II findet keine Reaktion zwischen Kontroll-Detektionssubstanz 12 und
Sondenantikörper 1 oder
Analyt 11 statt.
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2 zeigt
einen erfindungsgemäßen Immunoassay 10 sowie
in der Spalte III die in den jeweiligen Zonen stattfindenden Reaktionen. 2 soll zur
Vermeidung von Wiederholungen nur insoweit beschrieben werden, als
sie sich von 1 unterscheidet.
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Stromabwärts der
Applikationszone A und stromaufwärts
der Startzone S bzw. der Kontroll-Startzone CS ist eine Fangzone
F angeordnet. In dieser Fangzone F sind Antikörper 5, 6 dauerhaft
immobilisiert, welche Störantigene 13 bzw. 14 binden, nicht
jedoch den Analyten 11, der gemeinsam mit den Störantigenen 13, 14 in
der Testflüssigkeit
vorhanden ist. Auf Grund ihrer Selektivität, vorzugsweise Spezifität binden
die Fangantikörper 5, 6 die
Störantigene 13, 14 in
der Fangzone F. Der Analyt 11 hingegen passiert die Fangzone
F unbeeinträchtigt.
Im Anschluss an die Fangzone F verläuft der Test wie zuvor unter
Bezugnahme auf 1, Spalte II erläutert. Selbstverständlich ist
auch eine Ausführungsform analog
zu 1, Spalte II' möglich.
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Abschließend sollen
konkrete Ausführungsbeispiele
eines Schwangerschaftstests gemäß der vorliegenden
Erfindung aufgeführt
werden. Der Analyt 11 ist dabei in allen Fällen hCG;
Störantigene
sind LH, FSH und TSH, die schwangerschaftsunabhängig im weiblichen Urin auftreten.
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Beispiel 1
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In
der Fangzone F sind für β-Ketten von
LH, FSH bzw. TSH spezifische Antikörper als Fangantikörper dauerhaft
immobilisiert, z. B. Maus-Anti-βLH-Antikörper, und
Maus-Anti-βFSH-Antikörper und
Maus-Anti-βTSH-Antikörper. In
der Startzone S ist ein monoklonaler Maus-Anti-βhCG-Antikörper, der spezifisch für die β-Kette von
hCG ist und der mit einem Goldpartikel markiert ist, als Sondenantikörper aufgetrocknet.
Derselbe räumliche
Bereich des porösen
Trägers
dient auch als Kontroll-Startzone CS. Dort ist als Kontrollantikörper zusätzlich ein
polyklonaler Kaninchen-Antikörper aufgetrocknet,
der im Wesentlichen unspezifisch ist, nicht jedoch mit hCG oder
dem nachfolgend beschriebenen Detektionsantikörper bindet. In der Detektionszone
D ist ein monoklonaler Maus-Anti-αhCG-Antikörper als
Detektionsantikörper
dauerhaft immobilisiert, der an die α-Kette von hCG bindet und daher auch
an die α-Ketten
von LH, FSH und TSH binden würde,
wenn diese nicht bereits in der Fangzone F aus der Testflüssigkeit
herausgefangen worden wären.
In der Kontrollzone C ist ein polyklonaler Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper als
Kontroll-Detektionssubstanz dauerhaft immobilisiert, der den Kontrollantikörper 4 bindet,
jedoch keine Reaktion mit hCG oder den Sondenantikörper 1 zeigt.
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Beispiel 2
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In
der Startzone ist ein Maus-Anti-αhCG-Antikörper als
Sondenantikörper
aufgetrocknet, der mit einem Goldpartikel markiert ist. An diesen
Antikörper binden
sowohl der Analyt hCG als auch die Störantigene LH, FSH und TSH.
In der Detektionszone D ist ein monoklonaler Maus-Anti-βhCG-Antikörper als Detektionsantikörper dauerhaft
immobilisiert, der mit dem Analyten hCG und dem daran gebundenen
Sondenantikörper
eine Sandwich-Reaktion eingeht. Diejenigen Sondenantikörper, an
welche LH, FSH oder TSH gebunden hat, werden in der Detektionszone
D nicht festgehalten, sondern durchlaufen diese sowie die Kontrollzone
C ohne Reaktion. Im Übrigen
können
die Antikörper
wie in Beispiel 1 gewählt
werden.
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Selbstverständlich ist
es in Verallgemeinerung des Erfindungsgedankens auch möglich, mehrere
zusätzliche
Kontrollantikörper 4 zu
verwenden und/oder mehrere Kontrollzonen C vorzusehen. Diese Kontrollzonen
C können
mit unterschiedlichen, jeweils wohldefinierten Dichten von immobilisierten Kontroll-Detektionssubstanzen
belegt sein, um eine Abstufung unterschiedlicher Referenzfärbungen
zu erhalten, mit welcher die Färbung
der Detektionszone D verglichen werden kann, um eine quantitative Interpretation
des Testergebnisses zu ermöglichen.
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Natürlich stellen
die gezeigten Ausführungsbeispiele
lediglich besonders vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung
dar, die jedoch keinesfalls als auf die illustrierten Beispiele
beschränkt
angesehen werden soll.