DE60115016T2

DE60115016T2 - Prüfvorrichtung mit zeiteinstellfunktion

Info

Publication number: DE60115016T2
Application number: DE60115016T
Authority: DE
Inventors: Ib Mendel-Hartvig; Erik Unger
Original assignee: Pharmacia Diagnostics AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 2000-05-05
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2021-04-26
Also published as: CA2406581C; CA2406581A1; JP4737910B2; ATE310245T1; DE60115016D1; SE0001667D0; AU5281201A; WO2001086302A1; ES2252214T3; JP2003533678A; EP1282820A1; EP1282820B1; AU2001252812B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Festphasen-Prüfvorrichtung mit Zeiteinstellfunktion und ein Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung.
Hintergrund der Erfindung
Eine Art von Festphasen-Prüfvorrichtungen weist eine plattenförmige Fließmatrix aus saugfähigem Material auf, üblicherweise einen Membranstreifen, wie z.B. aus Cellulosenitrat oder Glasfaser, worin Flüssigkeit durch die Kapillarkräfte der Membran lateral transportiert werden kann (d.h., in der Ebene des Streifens). Die Membran weist üblicherweise eine Probenauftragszone und stromabwärts von der Probenauftragszone eine Detektionszone auf. In der Detektionszone ist üblicherweise ein Einfangmittel für den Analyten immobilisiert. Um eine Prüfung durchzuführen, wird die Auftragzone mit der auf den Analyten von Interesse zu untersuchenden flüssigen Probe in Kontakt gebracht. Die Vorrichtung wird unter Bedingungen gehalten, die ausreichen, um eine Kapillarwirkung der Flüssigkeit zu ermöglichen, um den Analyten von Interesse, wenn dieser in der Probe vorhanden ist, durch den Membranstreifen zur Detektionszone, wo der Analyt eingefangen wird, zu transportieren. Der Kapillar-Flüssigkeitsfluss wird üblicherweise durch ein Absorptionskissen oder dergleichen am stromabwärtigen Ende des Streifens abgesichert. Ein Detektionsreagens, üblicherweise markiert, wird dann stromaufwärts von der Detektionszone zugegeben und tritt mit dem eingefangenen Analyten in der Detektionszone in Wechselwirkung, und die Menge des eingefangenen Analyten wird gemessen. Das Detektionsmittel ist oft in oder auf dem Membranstreifen bereits abgelagert, z.B. in Form von diffus bewegbaren Teilchen, die fluorphore oder chromogene Gruppen enthalten, und zwar entweder stromaufwärts von der Probenauftragszone oder zwischen der Probenauftragszone und der Detektionszone.
Da es für die Probe und die Prüfflüssigkeiten einige Zeit erfordert, durch die Detektionszone transportier zu werden, damit das Ergebnis der Prüfung abgelesen werden kann, wurde vorgeschlagen, eine Zeitkontrolle bereitzustellen, wie z.B. eine "Zeitmess"-Substanz oder Substanzkombination am Streifen, die den Zustand anzeigt, bei dem der Fluss durch die Fließmatrix aufgetreten ist, oder dass vom Zeitpunkt, bei dem die Fluidprobe auf den Membranstreifen aufgetragen wurde, genügend Zeit für ein Ablesen verstrichen ist, um einen korrekten Wert zu ergeben.
EP-A-915 336 beschreibt eine chromatographische Prüfvorrichtung, worin das Chromatographiemedium einen auflösbaren sichtbaren Farbstoff in einem Bereich zwischen der Detektionszone und dem Ende des Chromatographiemediums aufweist, z.B. im Absorptionskissen. Während der Durchführung der Prüfung wird der Farbstoff im Farbstoffbereich aufgelöst und wandert vom Farbstoffbereich zu einem Farbbetrachtungsbereich, der ein visuelles Anzeichen dafür liefert, dass ein Fluss durch das Chromatographiemedium stattgefunden hat, damit das Prüfergebnis abgelesen und interpretiert werden kann. Der auflös bare Farbstoff kann an ein erstes Teil eines spezifischen Bindungspaars gebunden sein, und ein zweites Teil des spezifischen Bindungspaares kann in der Farbbetrachtungszone immobilisiert sein, um den Farbstoff darin einzufangen. Die Zeitmesskontrolle der EP-A-915 336 zeigt jedoch nur an, dass ein Fluss durch die Fließmatrix stattgefunden hat, sieht aber keine Einrichtung zur Justierung der vom Start der Prüfung bis zu dein Zeitpunkt, bei dem die Farbe in der Betrachtungszone sichtbar ist, verstrichene Zeit vor.
Dieser Nachteil wird in einem gewissen Ausmaß durch den in EP-A-826 777 beschriebenen chemischen Zeitmesser überwunden. Der chemische Zeitmesser, der in einem sichtbaren Teststreifen zur Messung der Konzentration eines Analyten in einem biologischen Fluid, das auf den Streifen aufgetragen wird, verwendet wird, misst ein bestimmtes Intervall chemisch und weist eine Trockenbeschichtung von (i) einer gefärbten Indikatorzusammensetzung, (ii) einem Reagens, das, wenn es hydratisiert ist, dazu fähig ist, mit Glucose zu reagieren, um die Farbe des Indikators zu verändern, (iii) einen Inhibitor, um die Veränderung der Farbe des Indikators zu inhibieren, und (iv) Glucose, worin die Inhibitor- und Glucosekonzentrationen in der Trockenbeschichtung so gewählt sind, dass die Glucose während einer bestimmten Zeit nach Auftragen der biologischen Fluidprobe auf den Streifen, mit dem Reagens reagiert, um die Farbe des Indikators zu verändern. Wenn eine Probe auf den Streifen aufgetragen wird, erlaubt es die Hydratisierung der Zeitmesszusammensetzung, dass die farbbildende Reaktion abläuft. Die Zeit, die der Zeitmesser braucht, um die Farbe zu verändern, wird durch die Temperatur und die Charakteristika des Testreagens, insbesondere die Inhibitorkonzentration, die Menge an Glucose und die Hydratations-Sauerstoff Diffusionsraten bestimmt. Der Zeitmesser weist auch eine Qualitätskontrollfunktion auf, indem er anzeigt, wann ein Teststreifen durch Feuchtigkeitseinwirkung kontaminiert wurde. Eine Wanderung der Indikatoren, die eine solche Tendenz aufweisen, kann verhindert werden, indem man ein Ionen-Paarungsmittel in die Matrix einbaut.
Obwohl die Zeit bis zum Farbwechsel des in EP-A-826 777 beschriebenen chemischen Zeitmessers variiert werden kann, ist dies nicht leicht möglich und erfordert unter anderem eine verschiedene Zusammensetzung des Zeitmessers für jede gewünschte Farbwechselzeit. Da die Zeit, bei der das Prüfungsergebnis zuverlässig abgelesen werden kann, zwischen verschiedenen Prüfformaten variiert, was unter anderem von der Zahl der verwendeten Probenflüssigkeiten abhängt, besteht deshalb ein Bedürfnis für einen Teststreifen, der einen flexibleren Zeitmesser aufweist, der leicht auf eine gewünschte Indikationszeit eingestellt werden kann, um den Erfordernissen einer bestimmten Prüfung zu entsprechen.
Zusammenfassung der Erfindung
Nach der vorliegenden Erfindung wird eine Prüfvorrichtung bereitgestellt, die einen Zeitmesser aufweist, der eine sichtbare Farbveränderung zeigt, wenn eine bestimmte Zeit seit dem Zeitpunkt, bei dem die zu untersuchende Flüssigkeit, z.B. die Probe, auf die Fließmatrix aufgetragen wurde, verstrichen ist, und wobei diese vorbestimmte Zeit durch einfache Maßnahmen so variiert werden kann, dass sie auf ein bestimmtes Prüfformat eingestellt werden kann. Erfindungsgemäß kann dies erreicht werden durch Anbringen eines Zeitindikators an oder in Kontakt mit dem Absorptions- oder Saugelement am Ende des Memb ranstreifens, und in einer Position entlang des Saugelements, die einem bestimmten Wert der vom Start der Prüfung bis zum Farbwechsel des Indikators verstrichenen Zeitperiode entspricht.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung deshalb eine Prüfvorrichtung zur Bestimmung eines Analyten in einer wässerigen Probe bereit, die aufweist:

(i) eine Fließmatrix mit einem stromaufwärtigen Ende und einem stromabwärtigen Ende, die dazwischen einen lateralen Flüssigkeits(Fluid)transport durch Kapillarwirkung ermöglicht, wobei die Matrix eine Auftragzone für Flüssigkeit und stromabwärts davon eine Detektionszone mit einem immobilisierten Einfangmittel, das an den Analyten direkt oder indirekt binden kann,
(ii) ein am stromabwärtigen Ende der Fließmatrix angebrachtes Saugelement mit einem stromaufwärtigen Ende und einem stromabwärtigen Ende, und
(iii) einen stromabwärts von der Detektionszone angebrachten Zeitindikator, um den Zeitpunkt anzuzeigen, bei dem die in der Flüssigkeitsauftragszone aufgebrachte Flüssigkeit den Zeitindikator erreicht hat, wobei der Zeitindikator eine Indikatorsubstanz oder -substanzkombination aufweist, die dazu fähig ist, einen sichtbaren Farbwechsel zu zeigen, wenn sie durch die Flüssigkeit hydratisiert wird. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitindikator in Kontakt mit dem Saugelement an einer veränderbaren Position zwischen dem stromaufwärtigen und stromabwärtigen Ende davon angeordnet ist, wodurch es möglich wird, die vom Auftragen der Flüssigkeit bis zum Zeitpunkt, bei dem die Indikatorsubstanz oder-substanzkombination die Farbe verändert, verstrichene Zeit zu variieren.

In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Durchführung einer Prüfung zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren die Stufen aufweist:

(i) Bereitstellen einer wie vorstehend definierten Prüfvorrichtung, worin der Zeitindikator in einer ausgewählten Position zwischen dem stromaufwärtigen Ende und dem stromabwärtigen Ende des Saugelements angebracht ist, die an die durchzuführende Prüfung angepasst ist,
(ii) Fließen lassen von Probe und Prüfflüssigkeiten) durch die Fließmatrix der Vorrichtung so, dass sie die Detektionszone in einer bestimmten Abfolge erreichen, und
(iii) Ablesen des Ergebnisses der Prüfung in der Detektionszone, wenn der Zeitindikator die Farbe gewechselt hat, was anzeigt, dass eine bestimmte Zeit seit dem Auftragen der Flüssigkeit auf die Flüssigkeitsauftragszone vergangen ist.

Die Fließmatrix ist vorzugsweise im wesentlichen planar, typischerweise rechteckig, wie z.B. ein Membranstreifen, und ermöglicht einen lateralen Flüssigkeitsfluss durch sie. Üblicherweise ist die Fließmatrix ein Chromatographiemedium, das für eine Dünnschicht-Chromatographie geeignet ist. Beispielhafte Materialien sind Nitrocellulose, Nylon, Kunstseide, Cellulose, Papier oder Siliciumdioxid. Ein zur Zeit bevorzugtes Material ist Nitrocellulose. Das Fließmatrix-Material kann, wie erforderlich, vorbehandelt oder modifiziert sein.
Das Saugelement oder Absorptionsmittel kann aus einem saugfähigen Material hergestellt sein, das eine Flüssigkeit ausreichend hält, damit die Flüssigkeit durch die Fließmatrix hindurchgezogen werden kann und sich im Saugelement anreichert. Die Größe und Form des Saugelements kann entsprechend dem in der Prüfung verwendeten Flüssigkeitsvolumen gewählt werden. Üblicherweise ist das Saugelement ein parallelflächiges Kissen oder dergleichen. Typische Materialien für das Saugelement umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Cellulose und Filterpapier.
Der Zeitindikator kann irgendeine Substanz oder Kombination von Substanzen umfassen, die, wenn sie hydratisiert werden, d.h., wenn sie mit einer wässerigen Flüssigkeit in Kontakt kommen, einen Farbwechsel ergeben. Der Ausdruck "Farbwechsel" umfasst eine Änderung zwischen zwei bestimmten Farben, sowie zwei verschiedenen Nuancen einer gleichen Farbe. Im vorliegenden Zusammenhang sind auch farblos oder Weiß als eine Farbe darstellend zu verstehen. Der Farbwechsel kann durch die chemische Reaktion zwischen zwei oder mehreren chemischen Verbindungen (die von Wasser verschieden sind) oder durch eine pH-Änderung verursacht werden. Vorzugsweise ist die Indikatorsubstanz jedoch eine einzige chemische Verbindung, die ihre Farbe verändert, wenn sie hydratisiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein solcher chemischer Indikator eine Substanz, die ihre Farbe abhängig von der Menge des darin enthaltenen Kristallwassers ändert. Die Substanz kann deshalb, wenn sie trocken ist, eine erste Farbe aufweisen, und eine zweite Farbe, wenn sie Kristallwasser aufgenommen hat. Beispielhaft für eine solche Indikatorsubstanz ist Kobaltdichlorid-hexahydrat, das, wenn es dehydratisiert ist, hellblau ist, und wenn es hydratisiert ist, blassrosa ist.
Die Indikatorsubstanz sollte dazu fähig sein, wenn sie hydratisiert ist, an ihrer Stelle zu bleiben, zumindest für eine bestimmte Zeit. Wenn eine Indikatorsubstanz per se die Tendenz zum Wandern zeigt, kann es notwendig werden, sie zu immobilisieren oder die Beweglichkeit der Indikatorsubstanz auf andere Weise einzuschränken. Dies kann durch verschiedene Maßnahmen, die auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, erzielt werden, z.B. durch eine chemische Immobilisierung, eine Immobilisierung auf Bioaffinitätsbasis usw. Der Indikatorsubstanz kann es auch erlaubt werden, in einem kleinen Abstand zu diffundieren, bevor sie zurückgehalten wird, z.B. immobilisiert oder eingefangen wird. Ein Beispiel für eine solche Indikatorsubstanz ist mit einer Füllsubstanz, wie z.B. Sephadex^®, gemischtes Patent-Blau(E131)-Pulver. In trockenem Zustand ist die Mischung im wesentlichen weiß, während die Mischung nach blau umschlägt, wenn der Patent-Blau-Farbstoff gelöst wird und in das Sephadex^®-Gel wandert, das dort ausgebildet ist, wo die Wanderung verzögert wird. Die trockene Pulvermischung kann auf der Oberfläche des Saugelements mit einem transparenten Band fixiert sein. Alternativ kann das Patent-Blau-Pulver in einem nicht-transparenten aber porösen Band eingeschlossen sein, z.B. einem Cellulose-Vlies oder einem Nitrocellulose-Filter, wobei in diesem Fall das durch das transportierte Fluid gelöste Patent-Blau das Band blau färben wird.
Indikatorsubstanzen, die hydratisiert werden können, wie z.B .das vorstehend erwähnte Kobaltdichloridhexahydrat, können, wenn erforderlich zusammen mit einer hygroskopischen Substanz, auch als Test dazu dienen, dass die Prüfvorrichtung betriebsbereit ist, da im Falle eines Eindringens von Feuchtigkeit in die Vorrichtung, die die Lebensdauer der Vorrichtung verringert, die Indikatorsubstanz die Farbe wechseln wird. Ein anderes Beispiel für einen Zeitindikator, der auch das Eindringen von Feuchtigkeit in die Vorrichtung oder ein ausgesetzt sein gegenüber der Außenumgebung anzeigt, ist eine trockene Pulvermischung, die besteht aus (i) einer leicht löslichen gefärbten Substanz, wie z.B. dem vorstehend erwähnten Patent-Blau, (ii) einer weißen Füllersubstanz in einem Anteil, der dem Pulver ein weißes Aussehen verleiht, und (iii) einem hygroskopischen Salz, wie z.B. Calciumchloriddihydrat (CaCl₂-2H₂O).
Das weiße Pulver kann an die Oberfläche des Saugelements durch ein transparentes und permeables Band befestigt sein. Wenn das Band aus einem weißen nicht-transparenten Material besteht, das gegenüber Wasserdampf porös und permeabel ist, kann die Füllstoffsubstanz weggelassen werden. Eine Einstellung der Mischung auf verschiedene Weise ermöglicht es, dass der Indikator eine Feuchtigkeitseinwirkung mit verschiedener Stärke zeigt. Ein Indikator dieses Typs ist nicht reversibel und wird deshalb die gesamte Einwirkung von Feuchtigkeit im Gegensatz zum vorstehend erwähnten Kobaltdichloridhexahydrat-Indikator, der reversibel ist, zeigen.
Der Zeitindikator kann die Indikatorsubstanz oder-substanzmischung per se sein oder kann in einer Trägersubstanz eingebaut oder auf eine Trägersubstanz oder an einen anderen Träger, wie z.B. ein Gel, Filterpapier, Streifen usw., appliziert sein. Das Anbringen des Zeitindikators an der Prüfvorrichtung kann durch verschiedene Maßnahmen erreicht werden.
In einer Ausführungsform wird die Indikatorsubstanz oder -substanzkombination direkt auf dem Saugelement aufgebracht, wie z.B. durch eine darauf vorhandene Ablagerung oder Beschichtung, oder z.B. durch Fixierung mittels eines wie vorstehend erwähnten Bandes. In einer anderen Ausführungsform wird die Indikatorsubstanz auf einen Träger, wie z.B. einen dünnen Filterpapierstreifen, imprägniert oder aufgeschichtet, der dann selbst auf dem Saugelement angebracht wird. Wenn die Prüfvorrichtung ein Gehäuse oder einen Deckel aufweist, kann der Träger auf dem Innenteil des Gehäuses, der auf das Saugelement gerichtet ist, so angebracht sein, dass der Träger das Saugelement an einer gewünschten Position an deren Oberfläche kontaktiert. Der Zeitindikator sollte natürlich im Vergleich zu den Ausmaßen des Saugelements ausreichend klein sein, um es zu ermöglichen, dass der Zeitindikator an einer Anzahl verschiedener Positionen in Fließrichtung des Saugelements platziert werden kann.
Die Zeit, die für eine wässerige Probe erforderlich ist, um von der Flüssigkeitsauftragszone oder dem Auftragsbereich der Fließmatrix zum Zeitindikator in einer bestimmten Prüfvorrichtung so transportiert zu werden, dass der Indikator seine Farbe wechselt, wird einerseits durch die Flüssigkeitswanderungsrate in der Fließmatrix und dem Flüssigkeitsvolumen, das durch die Fließmatrix hindurch laufen muss, und andererseits durch die Position des Indikators auf dem Saugelement bestimmt. Durch Variieren der Position des Indikators auf dem Saugelement in Fließrichtung der Prüfvorrichtung kann die Zeit, die vom Flüssigkeitsauftrag bis zur Indikatorveränderung verstreicht, wie gewünscht so verkürzt oder verlängert werden, dass der Farbwechsel der Indikatorsubstanz nur stattfindet, wenn eine ausreichende Zeit zur Analytmessung oder -bestimmung in der Detektionszone verstrichen ist, um zuverlässig zu sein. Eine übliche Prüfvorrichtungsstruktur kann deshalb zur Verwendung in verschiedenen Prüfungen bereitgestellt werden, indem man den Indikatorstreifen oder das Ablesefenster an einer ausgewählten Position am Saugelement der besonderen durchzuführenden Prüfung platziert.
Die Zeit, die bis zum Farbwechsel verstreicht, wird auch durch Variation der Dicke, d.h., der Höhe des Saugelements beeinflusst, und diese kann, wenn gewünscht, angewendet werden, um die Zeit, die bis zum Farbwechsel verstreicht, weiter zu verändern, z.B. durch Zufügen einer zusätzlichen Saugmaterial-Schicht auf der Oberseite des ursprünglichen Saugelements.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine perspektivische Darstellung einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
2 ist eine Querschnittsseitenansicht der Vorrichtung der 1.
3 ist eine in Einzelteile aufgelöste Ansicht entsprechend der Seitenansicht der 2.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäße Prüfvorrichtung ist mit einem Zeitindikator versehen, der einen Farbwechsel zeigt, wenn die aufgetragene Probe oder eine andere Prüfflüssigkeit eine bestimmte Position auf einem Saugelement am Ende der Fließmatrix erreicht. Nachfolgend wird die Erfindung auf eine Prüfvorrichtung, wie sie in der schwebenden schwedischen Patentanmeldung Nr. 9904175-8 der gleichen Anmelderin beschrieben wird, veranschaulicht.
Wie dies am besten in 1 gezeigt wird, weist die in den 1 bis 3 dargestellte Vorrichtung ein oberes Gehäuseteil 1 und ein unteres Gehäuseteil 2 aus einem Material auf, das gegenüber der Probe und Reagentien, die in den mit der Vorrichtung durchgeführten Prüfungen verwendet werden, inert ist, z.B. Polystyrol oder Polypropylen. Das obere Gehäuseteil 1 weist eine Probenmuldenöffnung 3 (hier konisch) und ein Detektionsfenster 4 auf. In 1 ist ebenfalls ein nachstehend beschriebenes Trennelement 5 dargestellt.
Nach den 2 und 3 weist das untere Gehäuseteil 2 einen darin angebrachten Membranstreifen 6 aus saugfähigem Material (d.h. einem porösen Material, das aufgrund der Kapillarwirkung ein wässeriges Medium in Längsrichtung transportieren kann), z.B. Nitrocellulose auf einer Polyesterunterlage, auf. In der Nähe des stromaufwärtigen Endes des Streifens 6 (links in den 2 und 3) wird ein Filterstück 7, das ein diffus bewegliches Detektionsreagens enthält, auf dem Streifen angebracht. Ein solches Detektionsreagens kann z.B. ein Konjugat zwischen einem Markerteilchen und einem Reaktanten sein, der an den Analyten binden kann. Weiter stromabwärts und unterhalb und innerhalb des Detektionsfensters 4 angebracht befindet sich eine Reaktionszone 8 auf dem Streifen, die einen immobilisierten Reaktanten enthält, der dazu fähig ist, einen zu testenden Analyten zu binden. Im dargestellten Fall ist auch eine Kalibratorzone 9 vorhanden, die eine vorbestimmte Menge einer immobilisierten Kalibratorsubstanz, z.B. Analyt, enthält. Auf dem Membranstreifen 6 ist auch eine Fließbarriere 10 dargestellt, hier spezifisch ein Stück eines Filmelements, das das Filterstück 7 bedeckt und gegen die Öffnung 3 im Gehäuseteil 1 verläuft. Die Funktion des Fließbarrierenfilms 10 wird weiter unten beschrieben.
Das obere Gehäuseteil 1 enthält am stromaufwärtigen Ende des Membranstreifens 6 ein Kissen 11 aus einem Flüssigkeits-absorbierenden Material und soll als Behälter für Fließflüssigkeit oder Puffer dienen. Eine Öffnung 3 im Gehäuseteil 1 (siehe 1) dient der Einführung einer Probe zur Membran 6. Im dargestellten Fall ist unterhalb der Öffnung 3 ein Filterelement 12 (das gegebenenfalls aus zwei oder mehr getrennten Filtern bestehen kann) für Prüfungen vorgesehen, bei denen die Probenflüssigkeit filtriert werden muss, z.B., wenn die Probe Vollblut ist und Blutzellen abzutrennen sind. Das Pufferkissen 11 formt somit einen Flüssigkeitspufferbehälter, nachstehend als Pufferkissen bezeichnet, und der durch die Probenöffnung 3 und das Filterelement 12 definierte Raum bildet eine Probenmulde oder einen Probenbehälter aus.
Am stromabwärtigen Ende des Membranstreifens 6 ist ein Saugelement 13 angebracht, hier in Form eines Kissens aus Absorptionsmaterial, wie z.B. Cellulose, dessen Zweck es ist, die Aufrechterhaltung des Kapillarflusses der Prüfflüssigkeiten durch den Membranstreifen 6 zu unterstützen. Ein dünner Streifen 14 aus absorbierendem Material, z.B. Filterpapier, ist in Kontakt mit der Oberseite des Kissens 13 angebracht, z.B. wie in 3 dargestellt, an das Kissen 13 oder die gegenüberliegende Innenfläche des Gehäuseteils 1 angebracht. Der Streifen 14 enthält eine Substanz, die, wenn sie hydratisiert wird, die Farbe ändert, z.B. dehydratisiertes Kobaltdichlorid-hexahydrat. Diese Substanz kann durch Tränken des Streifens in einer Lösung der Substanz und nachfolgendes Trocken des Streifens auf dem Streifen appliziert werden. Wie dies nachstehend beschrieben wird, dient der Streifen 14 als chemischer Zeitindikator oder chemischer Zeitmesser. Mindestens ein Teil des Gehäuseteils 1, der das Kissen 13 bedeckt, ist transparent oder transluszent oder weist eine Öffnung auf, damit der Farbwechsel des Streifens 14 durch die Abdeckung visuell beobachtet werden kann.
Das vorstehend erwähnte Trennelement 5, hier ein flüssigkeitsdichter herausziehbarer Film, ist am stromaufwärtigen Teil des Membranstreifens 6 angebracht, um einen Kontakt zwischen dem Membranstreifen 6 und den unteren Teilen des Pufferkissens 11 bzw. des Probenfilters 12 zu verhindern. Der Film 5 ist so angeordnet, dass er manuell durch Wegziehen von der Vorrichtung entfernt werden kann, um die Oberseite des Membranstreifens 6 dem Pufferkissen 11 (mit der Ausnahme des Teils des Membranstreifens, der mit dem Fließbarrierenfilm 10 bedeckt ist) bzw. dem Probenfilter 12 so auszusetzen, dass der Membranstreifen 6 in gleichzeitigen oder nahezu gleichzeitigen flüssigkeitsempfangenden Kontakt mit dem Pufferkissen 11 und dem Filter 12 in der Probenmulde 3 gebracht wird. Der obere Gehäuseteil 1 weist eine Aussparung 15 für das Pufferkissen 11 auf, die so ausgestaltet ist, um das Kissen gegen den auszuziehenden Film 5 zu drücken, und damit gegen den Membranstreifen 6 und den Fließbarrierenfilm 10, wenn der herauszuziehende Film 5 entfernt wird. Um eine flüssigkeitsdichte Umhüllung des Kissens 11 in der Aussparung 15 sicherzustellen, wird der herauszuziehende Film gegen die Kanten der Aussparung abgedichtet, z.B. durch Verschweißen. Obwohl in dem oben dargestellten Fall der herausziehbare Film 5 vollständig aus der Vorrichtung herausgezogen werden soll, ist es natürlich ausreichend, wenn der Film 5 vom Membranstreifen 6 in einem solchen Ausmaß abgezogen wird, dass die in Frage kommenden Teile der Membranstreifenoberfläche der Probe bzw. den Pufferflüssigkeiten ausgesetzt sind.
Eine Prüfung auf einen Analyten in einer Probe kann mit der vorstehend beschriebenen Vorrichtung wie folgt durchgeführt werden.
Die Vorrichtung wird üblicherweise gebrauchsfertig bereitgestellt, wobei das Pufferkissen 11 mit Pufferlösung (Fließflüssigkeit) getränkt ist, das Detektionsreagens im Filter 7 abgelagert ist, und die entsprechenden geeigneten Einfangreagentien in der Reaktions(oder Detektions-)zone 8 bzw. der Kalibrationszone 9 immobilisiert sind. Wenn der zu testende Analyt z.B. ein Antigen ist, kann das Detektionsreagens im Filter 7 z.B. ein an ein Fluorogen-markiertes Teilchen gekuppelter Antikörper für das Antigen sein, der immobilisierte Reaktant in der Reaktionszone 8 kann ein Antikörper für das Antigen sein und der Kalibrator in der Kalibrationszone 9 kann der Analyt oder ein Analyt-Analogon sein.
Eine bestimmte Menge der Probe wird durch die Öffnung 3 im Gehäuseteil 1 zugegeben. Alle notwendigen Prüfflüssigkeiten, d.h. in diesem Fall die Probenflüssigkeit und die Pufferflüssigkeit, sind dann in der Vorrichtung vorhanden, der herausziehbare Film 5 verhindert jedoch wirksam einen Kontakt zwischen den entsprechenden Flüssigkeiten und dem Membranstreifen 6. Die Prüfung wird dann durch den Anwender begonnen, indem er den herausziehbaren Film 5 entfernt, wodurch der Membranstreifen 6 in gleichzeitigem flüssigkeitsempfangenden Kontakt mit dem Pufferkissen 11 und der Probenflüssigkeit in der Probenmulde 3 gebracht wird.
Pufferflüssigkeit aus dem Kissen 11 dringt nun in den Membranstreifen 6 über den gänzlich stromaufwärts liegenden Endteil davon, der in direktem Kontakt mit dem Kissen 11 ist (siehe 3), ein und wird durch Kapillarkraft am Membranstreifen 6 stromabwärts transportiert. Gleichzeitig dringt Probenflüssigkeit in den Membranstreifen 6 ein und wird in stromabwärtiger Richtung des Streifens transportiert. Es wird deshalb ein Fließen der Probenflüssigkeit stattfinden, das direkt gefolgt wird von einem (ersten) Fließimpuls der Pufferflüssigkeit. Das Detektionsreagensfilter 7 und ein Großteil des Pufferkissens 11 sind jedoch vom Membranstreifen durch den Fließbarrierenfilm 10 getrennt. Pufferflüssigkeit, die in den Membranstreifen 6 transportiert wurde, wird in den Filter 7 eindringen und durch den Filter 7 transportiert und bringt das darin abgelagerte Detektionsreagens mit, wodurch ein Detektionsreagens-Fließimpuls ausgebildet wird. Dieser Detektionsreagens-Fließimpuls folgt auf den ProbenFließ- und den Puffer-Fließimpuls. Der Puffer, der im Membranstreifen 6 nach Entfernung des Detektionsreagens vom Filter 7 transportiert wird, bildet einen zweiten Puffer-Fließimpuls aus, der nach dem Detektionsreagens-Fließimpuls folgt.
Die vorstehend erwähnten verschiedenen Flüssigkeitsströme werden entlang des Membranstreifens 6 in der angegebenen Reihenfolge transportiert, d.h. Probenfluss, erster Pufferfluss, Detektionsreagensfluss und zweiter Pufferfluss, und werden gegebenenfalls die Kalibratorzone 9 und die Reaktionszone 8 erreichen. In der Reaktionszone 8 wird in der Probe vorhandener Analyt durch das in der Membran immobilisierte Reagens eingefangen. Der gebildete Analyt/Einfangreagens-Komplex wird durch den nachfolgenden ersten Pufferfluss (Pufferfließstrom) gewaschen, und der Analyt/Reagens-Komplex wird dann mit dem im Detektionsreagensfluss enthaltenen Detektionsreagens reagieren unter Bildung eines bestimmbaren Detektionsreagens/Einfangsreagens-Komplexes. Letzterer wird schließlich durch den zweiten Pufferfluss gewaschen. In der Kalibrationszone 9 wird die darin enthaltene bestimmte Menge des Analyten mit dem Detektionsreagens im Detektionsreagensfluss unter Bildung eines bestimmbaren Detektionsreagens/Analyt-Komplexes reagieren. Die Fließflüssigkeit vom Pufferkissen 11 wird somit in Reihenfolge sein: Waschen, Lösen und Transportieren des Detektionsreagens, und Waschen.
Wenn die wässerige Probe den Indikatorstreifen 14, der das Saugkissen 13 kontaktiert, erreicht hat, wird die darin abgelagerte Indikatorsubstanz ihre Farbe ändern, was durch die transparente oder transluszente Abdeckung oder die darin befindliche Öffnung gesehen werden kann. Die Position des Streifens 14 wurde so gewählt, um sicherzustellen, dass die gesamten Prüfflüssigkeiten die Reaktionszone 8 passiert haben, wenn die Flüssigkeitsfront den Streifen 14 erreicht und ein Farbwechsel stattfindet. Der Farbwechsel des Zeitindikators signalisiert, dass das Prüfergebnis abgelesen werden kann. Durch Messen über das durch die Öffnung 4 im Gehäuseteil 1 ausgebildete Detektionsfenster erfolgendes Messen der Signalin tensität vom in der Reaktionszone 8 eingefangenen Detektionsreagens und in Beziehung bringen mit dem in der Kalibrationszone 9 erhaltenen Signal kann die Menge des Analyten in der Probe bestimmt werden. Aus den vorstehenden Ausführungen ist es ersichtlich, dass eine Prüfung mit der beschriebenen Vorrichtung leicht und bequem durchgeführt werden kann, und eine gleichzeitige Initiierung der verschiedenen Prüfflüssigkeitsströme ermöglicht. Sobald die Probe der Probenmulde zugegeben wurde, kann der herausziehbare Film entfernt werden. Die Flüssigkeit im Pufferkissen und die Probe werden dadurch in Kontakt mit dem Membranstreifen gebracht und der gewünschte aufeinander folgende Transport der verschiedenen Flüssigkeitsströme beginnt. Der chemische Zeitmesser zeigt dann den Zeitpunkt an, bei dem die Prüfung beendet ist und das Ergebnis der Prüfung verlässlich abgelesen werden kann.
In der vorstehend beschriebenen Reaktions(oder Detektions-)zone ist ein Reaktant, der den Analyten spezifisch binden kann, immobilisiert (durch kovalente Bindung, über physikalische Absorption oder biospezifische Affinität, über immobilisierte Teilchen, an die der Reaktant kovalent gebunden ist, usw.). Es kann jedoch stattdessen ein Reagens, das mit dem Reaktanten reagieren kann, in der Membran immobilisiert sein, und der Reaktant kann dann zusammen mit der Probe zugegeben werden, oder in der Membran in einem Bereich oder einer Zone stromaufwärts von der Reaktionszone vorher abgelagert werden. Ein solches immobilisiertes Reagens kann ein Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp) sein, und der Reaktant wird dann an das andere Element des spb gekuppelt oder konjugiert. Beispielhafte spezifische Bindungspaare umfassen immunologische Bindungspaare, wie z.B. Antigen-Antikörper und Hapten-Antikörper, Biotin-Avidin oder-Streptavidin, Lectin-Zucker, Hormon-Hormonrezeptor, Nucleinsäure-Duplex. Die Reaktionszone kann z.B. ein darin immobilisiertes Streptavidin aufweisen, und der Einfangreaktant für den Analyten kann biotinyliert sein.
Auf ähnliche Weise kann die Kalibrationszone einen Binder für die Kalibratorsubstanz und nicht die Kalibratorsubstanz per se enthalten. Der Binder ist üblicherweise ein Element eines spezifischen Bindungspaares, wie z.B. eines der vorstehend erwähnten, während das andere Element des spezifischen Bindungspaares an die Kalibratorsubstanz gekuppelt oder konjugiert ist, die dann wieder mit der Probe zugegeben oder stromaufwärts von der Kalibratorzone vorab abgelagert werden kann. Streptavidin kann z.B. in der Kalibratorzone immobilisiert sein, während die Kalibratorsubstanz biotinyliert ist.
Für weitere Einzelheiten von Prüfvorrichtungen des hier beschriebenen Typs und insbesondere im Hinblick auf Fließmatrices, sequentielle Prüfungen, Kalibratorsysteme und Detektionsreagentien kann auf die publizierten PCT-Anmeldungen WO 99/36776, WO 99/36777 und WO 99/36780 der gleichen Anmelderin verwiesen werden.
Unter Verwendung der vorliegenden Vorrichtung zu bestimmende Analyten sind für einen Fachmann leicht erkennbar. Üblicherweise ist jedoch der Analyt ein biospezifischer Affinitätsreaktant, z.B. ein Antikörper oder anderes Protein, Hapten, Nucleinsäure oder Polynucleotid, wie z.B. eine DNA-Sequenz. Im letzteren Fall kann die Reaktionszone Streptavidin enthalten, und die DNA-Sequenz, mit der die Analyt-Sequenz hybridisiert werden soll, kann biotinyliert sein.
Die vorliegende Vorrichtung ermöglicht eine bequeme Vorbehandlung der Probe vor Beginn der Prüfung.
Die vorliegende Vorrichtung kann auch so ausgestaltet sein, um Prüfungen der in der publizierten PCT-Anmeldung WO 99/60402 der gleichen Anmelderin beschriebenen Art durchzuführen, worin die Fließmatrix eine chromatographische Trennzone stromaufwärts von der Reaktions(Detektions-)zone enthält, um Probenkomponenten, die sonst die Bestimmung des Analyten stören oder beeinflussen könnten, abzutrennen.
Nachstehend wird ein Experiment beschrieben, das mit einer vorstehend beschriebenen Prüfvorrichtung zeigt, wie die vom Beginn der Prüfung bis zum Farbwechsel verstreichende Zeit abhängig von der Position des chemischen Zeitmesserstreifens 14 entlang des Saugkissens 13 in Fließrichtung des Membranstreifens 6 variiert.
(EXPERIMENT
Zeit des Farbwechsels vs Position des Zeitindikators auf dem Saugkissen Es wurde eine in den 1 bis 3 dargestellte Vorrichtung verwendet. Der Membranstreifen 6 war eine 5 x 45 mm-Nitrocellulosemembran (Whatman, Porosität 8 μm) auf einer Polyesterunterlage, das Probenfilter war eine Primecare-Blutzellen/Plasma-Trennmembran, und das Pufferkissen 11 bestand aus PVA, enthaltend 150 μl Puffer (0,1 M Na-Phosphat, pH 7,5, 3% BSA, 10% Sucrose, 0,15 M NaCl, 0,05% Rindergammaglobulin, 0,05% NaN₃). Das Saugkissen 13 war ein doppeltes Whatman WF1,5-Filter.
Auf die Innenfläche des oberen Gehäuseteils 1 gegenüber dem Saugkissen 13 und durch das transparente Gehäuse sichtbar wurden mittels eines zweiseitigen Klebebands vier Filterpapierstreifen 14, von denen jeder 1 mm lang und 8 mm breit war, angebracht, mit einem Zwischenraum von 1 mm bei 0, 2, 4 bzw. 6 mm, von der benachbarten Kante des Detektionsfensters 4. Die vier Filterstreifen 14 kontaktierten das darunter liegende Saugkissen 13 0 mm an der stromaufwärtigen Kante des Saugkissens 13. Das Filterpapier wurde vorher mit einer gesättigten Lösung von Kobaltdichlorid-hexahydrat [CoCl₂(H₂O)₆] getränkt, und ca. 15 Minuten lang bei 120°C getrocknet. 80 μl Vollblut wurden der Vorrichtung zugegeben, nach 20 Sekunden wurde der herausziehbare Film 5 abgezogen, um das Probenfilter 12 und das Pufferkissen 11 in Kontakt mit dem Nitrocellulose-Streifen 6 zu bringen. Die Zeit wurde von der Entfernung des herausziehbaren Films gemessen, bis (i) der Farbwechsel begann, und (ii) die Hälfte des Indikatorstreifens eine veränderte Farbe aufwies. Die Veränderung des Indikators war von Hellblau bis Blassrosa, und nach einer längeren Zeit wurde die Farbe weggewaschen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 als Mittelwert von vier Tests für jeden Streifen angegeben. Tabelle I
Aus der Tabelle ist es ersichtlich, dass die Zeit des Farbwechsels des Indikatorstreifens proportional zur Distanz des Indikatorstreifens von der stromaufwärtigen Kante des Saugkissens war, und, abhängig von der Position des Indikatorstreifens, von ca. 12 Minuten bis 25 Minuten variierte. Dies zeigt, dass eine gewünschte Zeit des Farbwechsels festgesetzt werden kann, indem man den Indikatorstreifen an einer geeigneten Position am oberen Gehäuse der Vorrichtung oder am Saugkissen anbringt.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf operative Ausführungsformen davon beschrieben und herausgestellt wurde, ist es für den Fachmann auf diesem Gebiet verständlich, dass verschiedene Änderungen, Modifikationen, Substitutionen und Weglassungen durchgeführt werden können. Die Erfindung soll deshalb solche Äquivalente innerhalb des Rahmens der nachfolgenden Ansprüche mitumfassen.

Claims

Prüfvorrichtung für die Bestimmung eines Analyten in einer wässrigen Probe, umfassend: (i) eine längliche Fließmatrix (6), die einen lateralen Flüssigkeitstransport durch Kapillarwirkung ermöglicht, wobei die Matrix eine Auftragezone (3) für eine Flüssigkeit sowie flussabwärts davon eine Detektionszone (8) mit einem immobilisierten Fänger umfasst, der den Analyten direkt oder indirekt binden kann, (ii) ein Saugelement (13) am Ende der Fließmatrix, mit einem, in Fließmatrix betrachtet, vorderen und hinteren Ende und (iii) einen Zeitindikator (14) flussabwärts der Detektionszone (8) zum Anzeigen, wann die Flüssigkeit, die auf die Auftragezone aufgebracht wurde, den Zeitindikator erreicht hat, wobei der Zeitindikator eine Indikatorsubstanz oder eine Substanzkombination umfasst, die einen sichtbaren Farbwechsel aufweisen kann, wenn sie durch die wässrige Probe hydratisiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitindikator (14) in Kontakt mit dem Saugelement (13) an veränderbarer Position zwischen dessen vorderem und hinterem Ende angeordnet ist und es dadurch ermöglicht, die Zeitspanne zwischen dem Auftragen der Flüssigkeit und dem Farbwechsel der Indikatorsubstanz oder der Substanzkombination zu variieren.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitindikatorsubstanz eine einzelne chemische Substanz enthält, die durch Aufnahme von Wasser ihre Farbe wechseln kann.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitindikator (14) an dem Saugelement (13) angebracht ist.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Prüfungsvorrichtung ein Gehäuse (1, 2) umfasst, welches die Fließmatrix (6) und das Saugelement (13) umgibt, und dass der Zeitindikator (14) an der Innenseite des Gehäuses an einer durchsichtigen oder lichtdurchlässigen Stelle angebracht ist.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitindikator eine hygroskopische Substanz enthält.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitindikator einen Füllstoff enthält.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitindikator ein Stoffgemisch umfasst, das an dem Saugelement oder an der Innenseite des Gehäuses mit Klebeband angebracht ist.
Die Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitindikator eine Indikatorsubstanz oder Substanzkombination umfasst, die an einem Träger (14) angebracht ist, der wiederum an dem Saugelement oder an der Innenseite des Gehäuses angebracht ist.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger (14) einen Streifen festen Materials, z.B. einen Streifen Filtermaterial umfasst.
Verfahren zur Durchführung einer Prüfung für die Bestimmung eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst: (i) Bereitstellen einer Prüfvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Zeitindikator je nach auszuführender Prüfung an einer ausgewählten Position zwischen dem vorderen und dem hinteren Ende des Saugelements plaziert wird, (ii) Fließenlassen von Proben- und Prüfflüssigkeiten) durch die Fließmatrix der Vorrichtung, so dass sie die Detektionszone in einer vorbestimmten Abfolge erreichen, und (iii) Ablesen des Prüfungsergebnisses in der Detektionszone, wenn der Zeitindikator die Farbe gewechselt hat, was anzeigt, dass eine vorbestimmte Zeitspanne seit dem Aufbringen der Flüssigkeit auf die Auftragezone vergangen ist.