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Hintergrund
der Erfindung
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Immunochromatografische Streifen-Formate
sind für
qualitative und halb-quantitative Assayverfahren zunehmend populär geworden,
in denen visuelle Nachweisschemata zur Anwendung gelangen. Dieser
Typ von Assay beinhaltet die Aufbringung einer flüssigen Testprobe,
von der angenommen wird, dass sie den Analyt enthält, der
nachgewiesen werden soll, auf eine Aufbringzone eines immunochromatografischen
Teststreifens. Der Streifen ist aus einem Matrixmaterial zusammengesetzt,
durch welches das Testfluid und darin suspendierter oder gelöster Analyt
durch Kapillarwirkung aus der Aufbringzone zu einer Einfangzone
zu fließen vermag,
wo ein nachweisbares Signal oder die Abwesenheit eines solchen die
Anwesenheit und das Vorhandensein des Analyts enthüllen oder
nicht. In typischer Weise schließt der Streifen Mittel zur
immunospezifischen Bindung des nachzuweisenden Analyts mit seinem
spezifischen Bindungspartner ein, der die nachweisbare Markierung
aufweist. Die Markierung kann eine, die für das nackte Auge wie kolloidale
Metallpartikel oder gefärbter
Latex sichtbar ist, ein Enzym, das bei Kontakt mit einem geeigneten
Substrat ein sichtbares Signal bildet, oder eine sein, die nur durch
Anwendung eines Geräts
wie für
eine chemilumineszente oder radioaktive Markierung nachweisbar _
ist. In einem dieser Schemata enthält der Streifen einen mit Enzym
markierten, mobilen Bindungspartner für den Analyt, wobei jener in
einer Probenaufbringzone vorliegt. Ist Analyt in der Testprobe vorhanden,
wird er mit seinem markierten Bindungspartner kombiniert, um einen
Komplex zu bilden, der entlang des Streifens zu einer Nachweiszone
fließt,
die ein Substrat zur Enzym-Markierung enthält, das über die Befähigung verfügt, eine gefärbte Reaktion
in der Gegenwart des Enzyms zu ergeben. Der Streifen kann eine Zone
enthalten, in welcher Analyt immobilisiert ist, so dass markierter
Bindungspartner, der wegen der Abwesenheit von Analyt in der Probe
nicht mit Analyt kombiniert wird, eingefangen und dadurch daran
gehindert wird, die Nachweiszone zu erreichen. Es sind verschiedene
Modifikationen dieser Verfahrenstechnik veröffentlicht worden, von denen
alle ein gewisses konkurrierendes spezifisches Bindungssystem einschließen, mit
welchem die An- oder Abwesenheit von Analyt in der Testprobe durch
den Nachweis oder das Fehlen von markiertem Bindungspartner in der
Einfangzone bestimmt werden.
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Eine Alternative zum oben beschriebenen
immunometrischen Assay, bei dem der freie markierte Antikörper nachgewiesen
wird, stellt das sogenannte Sandwich-Format dar, in welchem die
Einfangzone immobilisierte Antikörper
gegen ein Epitop des Analyt enthält,
zu welchem der markierte Antikörper
spezifisch ist. In diesem Format wird ein Sandwich des Analyt zwischen
den immobilisierten und markierten Antikörpern gebildet, um das nachweisbare
Signal in der Einfangzone zu ergeben.
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Nicht alle der Schemata zur Immunochromatografie
beruhen auf einem mit Enzym markierten Bindungspartner/Enzym-Substrat
zur Bereitstellung des Signals zum Nachweis des Analyts. In
US 4,806,311 ist eine Mehrfachzonen-Testvorrichtung
zur spezifischen Bindungsassay-Bindung eines Analyts und eines immobilisierten
Bindungspartners für
den Analyt zusammen mit einer Einfangzone zur Aufnahme von markiertem Reagens
offenbart, welches durch diese aus der Reagenszone hindurchwandert.
Die Einfangzone enthält
eine immobilisierte Form einer Bindungssubstanz für das markierte
Reagens. Das markierte Reagens weist eine chemische Gruppe mit einer
nachweisbaren physikalischen Eigenschaft auf, die auf der Basis
dieser physikalischen Eigenschaft nachweisbar ist, so dass es keiner
chemischen Reaktion mit einer weiteren Substanz zum entsprechenden
Nachweis bedarf.
US 4,703,017 beschreibt
die Anwendung sichtbarer teilchenförmiger Markierungen für den Rezeptor.
Verschiedene teilchenförmige
Markierungen wie Gold-Sol-Partikel und sichtbarer Farbstoff, der
Liposome enthält,
sind genannt.
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EP
0 291 194 offenbart einen immunochromatografischen Streifen
eines Typs, der vorliegend in Betracht gezogen wird. Zur Beschreibung
des Aufnahmeelements wird in diesem Patent festgestellt, dass jenes aus
einem saugfähigen,
porösen
oder faserartigen Material, einschließlich poröser Kunststoffe wie aus Polypropylen,
Polyethylen, Polyvinylidenfluorid, Ethylenvinylacetat, Acrylnitril
oder aus Polytetrafluorethylen, hergestellt sein kann. Indem die
Patentinhaber erkennen, dass einige dieser Materialien hydrophob
sind, schlagen sie vor, das Material mit einem oberflächenaktiven
Mittel vorzubehandeln, um die inhärente Hydrophobizität herabzusetzen.
In den Streifen des Standes der Technik wird in typischer Weise
ein poröses
Aufnahmeelement angewandt, um das Testfluid rasch zu absorbieren,
so dass der Streifen schnell vollständig benetzt wird, wenn er
in ein Testfluid wie Urin getaucht wird. Allerdings kann diese Benetzbarkeit
des Teststreifens problematisch werden, wenn das Probenvolumen kritisch
ist, wie in dem Fall, wenn die fluide Testprobe Gesamt- bzw. Vollblut ist,
das aus einer Punktur des Fingers erhalten wird. Im Fall von Teststreifen
mit einem hydrophilen Probenaufnahmeelement liegt im allgemeinen
eine Notwendigkeit für
höhere
Probenvolumina vor, da das hydrophile Element etwas Flüssigkeit
selbst aufnimmt, abhängig
von seiner Porosität,
bevor die Probe den nächsten
Abschnitt auf dem Streifen erreichen kann. Ein Weg zur Minimierung
des Probenvolumens beruht darauf, dass man die Abmessungen des Teststreifens
verringert oder ihn miniaturisiert. Dieser Lösungsansatz kann wegen bestimmter
einschränkender Bedingungen
bei den Abmessungen einer Gehäusekassette
für den
Streifen oder bei einem Gerät
wie einem Reflexionsspektrometer nicht immer der geeignete sein,
welches zur Ablesung des Streifens eingesetzt wird, was in einigen
Fällen
nicht empfindlich genug sein kann.
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Es wäre wünschenswert und ist eine Aufgabe
der vorliegenden Erfindung, einen Immunochromatografiestreifen des
oben beschriebenen Typs anzugeben und bereitzustellen, worin die
fluide Testprobe aus dem Streifen-Aufnahmeelement zu seinem Reagens-Teilstück mit verringertem
Probenvolumen gezogen wird.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
einen Assay zur Bestimmung des Vorliegens oder der Konzentration eines
Analyt in einer fluiden Testprobe durch Aufbringung des Fluids auf
das Aufnahmeelement eines Immunochromatografie-Teststreifens. Das
Streifen-Aufnahmeelement steht in fluider Verbindung mit dem Reagens-Teilstück des Streifens,
das mindestens ein absorbierendes Material einschließt, durch
welches das Testfluid fließen
kann, und welches einen mobilen, markierten spezifischen Bindungsparter
für den
Analyt enthält, worin
die Konzentration des Analyts in der fluiden Testprobe durch Messung
der Menge an markiertem spezifischen Bindungspartner bestimmt wird,
welcher durch einen Einfangmechanismus im Reagens-Teilstück des Streifens
eingefangen wird. Die hier offenbarte Erfindung stellt eine Verbesserung
dieses Assaytyps dar, welcher die Anwendung eines Teststreifens
beinhaltet, worin das Aufnahmeelement aus einem nicht-porösen, hydrophoben
Material hergestellt ist.
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Durch Bereitstellung einer hydrophoben
Plattform als Proben-Aufnahmeunterlage
wird eine effizientere und einheitlichere Freisetzung des markierten
Konjugats bewerkstelligt. Die Genauigkeit der Reflexionswerte aus
den Nachweis- und Vergleichsbereichen der Vorrichtung sind ebenfalls
verbessert. Die hydrophobe Natur der Unterlage, die eine Absorption
der Probe verhindert, ermöglicht
die Anwendung eines kleineren Volumens der Testprobe gegenüber einem
herkömmlichen
Immuno-Teststreifen, worin eine absorbierende Unterlage mit Dochtwirkung
auf die Testprobe verwendet ist.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1A und 1B stellen die jeweiligen
Front- und Seitenansichten einer Streifenvorrichtung zur Anwendung
in der vorliegenden Erfindung dar.
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Beschreibung
der Erfindung
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Betreffend 1A (Draufsicht) und 1B (Seitenansicht), umfasst die Vorrichtung
der vorliegenden Erfindung ein Stützelement 9, das aus
einem hydrophoben, nicht-porösen
Material wie aus Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen oder aus
einem weiteren nicht-saugfähigen
hydrophoben Material hergestellt ist, auf welchem die absorbierenden
Teilstücke
der Vorrichtung angeordnet werden. Die nicht-poröse Proben-Aufbringzone ist ein festes, undurchdringliches
hydrophobes Material oder eine feste, undurchdringliche Oberfläche, die behandelt
ist, um hydrophobe Eigenschaften zu ergeben. Die Anwendung einer
solchen undurchdringlichen hydrophoben Oberfläche hindert die darauf aufgebrachte
fluide Probe daran, dass sie übermäßig stark
ausgebreitet wird, wodurch die Gesamtprobe maximiert wird, die dann
für das
System verfügbar
ist. Als Ergebnis kann das Probenvolumen in Situationen, wie derjenigen
eines Stichs in den Finger, worauf dann nur ein kleines Probenvolumen
zur Anwendung gelangt, vorzugsweise oder nötigenfalls minimiert werden.
In dieser bevorzugten Ausgestaltungsform wird der Teilbereich 9a des
hydrophoben, nicht-porösen
Materials unbedeckt von absorbierendem Material gelassen, um die
Proben-Aufbringzone zu ergeben. Alternativ dazu, kann ein Stück aus hydrophobem, nicht-porösen Material
auf das Stützelement
aufgebacht werden, um als das hydrophobe, nicht-poröse Material
für die
Proben-Aufbringzone 9a zu dienen, in welchem Fall das Stützelement 9 als
solches aus anderen Materialien als denjenigen hergestellt sein
kann, die hydrophob und nicht-porös sind.
Die hydrophobe, nicht-poröse
Proben-Aufbringzone braucht nicht auf diese oben genannten Materialien
eingeschränkt
zu sein; weitere Materialien wie Polytetrafluorethylen und Materialien,
die auf ihrer Oberfläche
mit hydrophoben Materialien wie mit Polyfluorethylen und Silanierungsmitteln
behandelt worden sind, können
mit gleichwertigen Ergebnissen verwendet werden. Die Begriffe "hydrophob" und "nicht-porös" sollen für die Zwecke
der vorliegenden Beschreibung bedeuten, dass die Materialien wasserabstoßend sind
und nichts von der flüssigen
Testprobe absorbieren. Die hydrophobe Oberfläche absorbiert keine fluide
Testprobe, die wässriger Natur
ist, wodurch sich ein maximales Probenvolumen für den Transport quer durch
den Reagensbereich ergibt. Dies ist besonders erwünscht, wenn
das Probenvolumen eingeschränkt
ist. Stromaufwärts
in Richtung des fluiden Testprobenflusses liegt die Konjugat-Unterlage 1 vor,
die in direkter fluider Verbindung mit der hydrophoben, nicht-porösen Aufbringzone 9a steht.
Die Konjugat-Unterlage ist in typischer Weise aus einem absorbierenden,
porösen
Material, wie aus Glasfaser, Polyester oder weiterem gewebten oder
Vlies-Synthesematerial hergestellt, durch welches die fluide Testprobe
fließen
kann, und sie enthält
mobiles Konjugat eines oder mehrerer markierter spezifischer Bindungspartner.
Der spezifische Bindungspartner, der in typischer Weise ein Antikörper ist,
kann mit einem Enzym, Fluorophor, radioaktivem Isotop oder vorzugsweise
mit einer direkten teilchenförmigen
Markierung wie mit einem Gold-Sol oder mit gefärbten Latexpartikeln markiert
sein. Wird die fluide Testprobe auf die hydrophobe, nicht-poröse Aufbringzone
in direktem physikalischen Kontakt mit der Konjugat-Unterlage aufgebracht,
wird sie in der Konjugat-Unterlage
absorbiert, wo sie in Kontakt mit dem markierten spezifischen Bindungspartner
gelangt und weiter aufwärts
in der Vorrichtung hin zu einer Brücken-Unterlage 3 befördert wird.
Der Fluid-Transfer zwischen der Aufbringzone und Reagenszone (in
diesem Fall der Konjugat-Unterlage) ist gegenüber demjenigen Fall verbessert,
der zu beobachten ist, wenn die Aufbringzone aus einem anderen Material
als einem hydrophoben, nicht-porösen
Material hergestellt ist, weil die Grenzfläche zwischen der Aufbringung-Unterlage
und der Konjugat-Unterlage eliminiert ist. Unregelmäßigkeiten
durch diese Grenzfläche
können
nicht-einheitliche Fließmuster
verursachen, die zu Abweichungen beim Testergebnis führen. Diese
Konfiguration benötigt
auch ein nur kleineres Probenvolumen. Die hydrophoben Eigenschaften
der Proben-Aufbringzone
verhindern, dass sich die Probe weit ausbreitet, so dass sie durch
die Konjugat-Unterlage fließen
kann, was den am wenigsten Widerstand leistenden Weg darstellt.
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Stromaufwärts auf der Vorrichtung, ausgehend
von der Konjugat-Unterlage, befindet sich die Brücken-Unterlage 3,
die dem Zwecke dient, eine Vermisch-Pforte bereitzustellen, um die
einheitliche Vermischung reaktiver Reagenzien zu gewährleisten,
die die Reaktionszonen erreichen. Sie dient auch dazu, überschüssige rote
Blutzellen, die nicht in der vorherigen Zone fixiert worden sein
mögen,
am Eintritt in die Nachweiszonen zu hindern, und sie kann aus einem
Material wie Polyester oder Glasfaser hergestellt sein. Stromabwärts von
der Brücken-Unterlage 3 befindet
sich der Ablesebereich 5, der aus einem Material wie Nitrocellulose,
Cellulose oder Polyethylensulfonat hergestellt sein kann, durch
welchen die fluide Testprobe, die die Reagenzien (den markierten
spezifischen Bindungspartner und Analyt, mit dem der spezifische
Bindungspartner reagiert hat) aufweist, und an welchen die Einfangmittel
anhaften. Somit kann die Nachweiszone 11 daran immobilisiert
entweder Analyt (oder ein Bindungsanalogon davon) im Fall eines
kompetitiven (konkurrierenden) Immunoassay aufweisen, wobei markierter
Bindungspartner, der spezifisch für den Analyt ist, mit Analyt konkurriert,
der mit der Testprobe in der Nachweiszone immobilisiert wird. Alternativ
dazu, kann in der Nachweiszone ein spezifischer Bindungspartner
immobilisiert sein, der spezifisch für ein Epitop des Analyt ist,
das sich von demjenigen Epitop unterscheidet, zu welchem der markierte
spezifische Bindungspartner spezifisch ist, so dass ein markierter
spezifischer Bindungspartner-Analyt/immobilisierter
spezifischer Bindungspartner-Sandwich in der Gegenwart von Analyt
gebildet wird. Die Konkurrenz (Bindungsinhibierung) und Sandwich-Bildung
könnten
in der Konjugat-Unterlage stattfinden, in welchem Fall die Nachweiszone
als eine universelle Einfangzone dienen würde.
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Der Ablesebereich 5 kann
auch eine Vergleichszone 13 enthalten, worin markierter
Antikörper
eingefangen wird, um für
den Anwender anzuzeigen, dass der Assay ordnungsgemäß durchgeführt worden
ist. Im typischen Fall weist die Vergleichszone darauf immobilisiert
Bindungspartner auf, die spezifisch zum markierten Bindungspartner
wie anti-Maus IgG sind, wenn der markierte spezifische Bindungspartner
ein Maus-Antikörper
ist. Der Vergleichs-Bindungspartner kann an einer getrennten Markierung
wie Latex oder an der gleichen Markierung wie an derjenigen angebracht
und befestigt sein, die für
den Nachweis des Analyt verwendet wird. Schließlich gibt es eine absorbierende
Unterlage 7, deren Funktion es ist, als eine Senke zur
Beseitigung überschüssiger unreagierter
Reagenzien zu wirken und als eine Pumpe zum effizienten Kapillarfluss
durch den Teststreifen zu dienen. Die absorbierende Unterlage kann
aus absorbierenden Materialien wie aus Cellulose, mit einem Trocknungsmittel
behandelter Cellulose und aus mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelten porösen Polymeren
abgeleitet sein.
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Die einzigen 2 Elemente, die bezüglich der
Durchführbarkeit
der vorliegenden Erfindung kritisch sind, sind die feste Trägerunterlage
und das feste Teilstück
des Streifens in fluider Verbindung mit der festen Trägerunterlage.
Wird die feste Trägerunterlage
nicht durch das Reagens-Teilstück
abgedeckt, dient sie als das Aufnahmeelement der Streifenvorrichtung.
Somit dient in dieser Ausgestaltungsform, der feste Träger 9 auch
als das Aufnahmeelement 9a, wenn es aus einem nicht-porösen, hydrophoben
Material konstruiert ist. Alternativ dazu, kann ein getrenntes Aufnahmeelement
auf die feste Trägerunterlage
aufgebracht und eng dem Reagens-Teilstück des Streifens zugewandt
sein, so dass es in fluider Verbindung mit dem Reagens-Teilstück steht.
Während
das Reagens-Teilstück
des Streifens so dargestellt ist, als ob es aus getrennten Stücken in
den Zeichnungen zusammengesetzt wäre, ist es klar und verständlich,
dass dies die bevorzugte Ausgestaltungsform der Erfindung darstellt
und ein Einzelstreifen auch verwendet werden könnte, unter der Voraussetzung, dass
er mit einem Material konstruiert ist, durch welches die fluide
Testprobe zu fließen
vermag, und welches die Befähigung
aufweist, die entsprechenden Reagenzien (den mobilen markierten
Bindungspartner, der für Analyt
in der Testprobe spezifisch ist, und einen immobilisierten Einfangmechanismus
für den
Analyt oder den markierten Bindungspartner) aufzunehmen und zu halten.
Dies könnte
durch Befestigung einer Einzelunterlage aus absorbierendem Material
wie aus Nitrocellulose am Stützelement 9 bewerkstelligt
werden, welches das mobile Konjugat enthalten und die Nachweisstelle 11 und
Vergleichsstelle 13 aufweisen würde. Im Allgemeinen ist die
Reagenszone der Vorrichtung aus einem absorbierenden Material wie
Papier oder einer weiteren Membran hergestellt, welche mit einem
entsprechenden Reagens behandelt worden sind, das mit einem besonderen
Assay, der durchgeführt
werden soll, zusammenhängt.
Die Immunoassay-Komponenten können
auf eine Platte des absorbierenden Materials aufgebracht werden,
die dann in Streifen entsprechender Größe geschnitten und auf das
Stützmaterial
in solch einer Weise geklebt werden, dass sich ein direkter physikalischer Kontakt
zwischen der hydrophoben, nicht-porösen Aufbringzone der Vorrichtung
und ihrer Reagenszone ergibt.
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Obwohl sich die Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung zur Durchführung
von Immunoassayverfahren mit verschiedenen Körperflüssigkeiten wie Urin, Speichel,
Schweiß und
Schleim eignet, ist sie besonders geeignet für Assayverfahren, in denen
Blut das Testfluid ist. Dies deshalb, weil es einen Bedarf für einen
Test gibt, der eines nur kleinen Probenvolumens bedarf, und zwar
für den
Fall, dass das Blut durch eine Maßnahme wie einen Stich in den
Finger gewonnen wird.
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Die Vorrichtung kann so, wie sie
ist, eingesetzt und angewandt werden, oder sie kann in ein Gehäuse wie
das in der vorher genannten
EP
0 291 194 beschriebene eingeschlossen werden. In jeder
Ausgestaltungsform wird die Vorrichtung angewandt, wobei eine Probe
der fluiden Testprobe auf die Aufbringzone entweder direkt oder
durch eine Aufbringpforte im Gehäuse
aufgebracht wird. Durch Aufbringung der fluiden Probe auf die hydrophobe
nicht-poröse
Aufbringzone in teilweisem Kontakt mit dem absorbierenden Reagens-Teilstück der Vorrichtung
wird die Probe in und durch die Reagenszone effizienter sorbiert,
als wenn sie direkt auf das absorbierende Reagensmaterial aufgebracht
würde.
Dies deshalb, weil durch Aufbringung der Probe auf die hydrophobe
Proben-Aufbringzone, in Kontakt mit dem absorbierenden Teilstück der Vorrichtung,
die Flüssigkeit
stromaufwärts
hin zur Nachweiszone bewegt wird, was zu einer einheitlicheren Freisetzung
der Reagenzien führt.
Wird dagegen die Probe direkt auf die Reagenszone aufgebracht, erreicht
sie die Nachweisfläche. Dadurch
entsteht eine Tendenz, dass sich die Freisetzung der Reagenzien
verlangsamt. Dies führt
zu längeren Testzeiten
und beachtlichem nicht freigesetzten Reagens, das im absorbierene
Reagens enthaltenden Material zurückbleibt, was wiederum zu einer
geringeren Reaktion auf den in der Testprobe enthaltenen Analyt
führt.
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Viele klinisch signifikante Ziel-Analyte
sind in Körperflüssigkeiten
vorhanden und können
mit der Vorrichtung und dem Verfahren der vorliegenden Erfindung
analysiert werden. So können
in Urin Analyte wie Deoxypyridinolin, Humanserumalbumin, Missbrauchsdrogen,
Protein-Marker wie Prostata-spezifisches Antigen, Nierenkrankheitsproteine
wie Lactat-Dehydrogenat, N-Acetyl-β-D-glucosamin, mit Schwangerschaft
oder Fruchtbarkeit zusammenhängende
Hormone wie menschliches chorinisches Gonadotropin und Marker einer Harntraktinfektion
analysiert werden. Die Bestimmung von Blut-gestützten Analyten wie von therapeutischen Arzneimitteln,
Hormonen, Krebsmarkern wie Prostata-spezifischem Antigen, Herzmarkern (Troponin
I, Troponin T, CKMB) und von α-Fötoprotein
lässt sich
in besonders geeigneter Weise mit der vorliegenden Erfindung durchführen.
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Während
die Mittel zum Nachweis des oder der Signale aus der Reagenszone
der vorliegenden Erfindung vom Typ der nachweisbaren Markierung
abhängen,
die am markierten Bindungspartner angebracht ist, wird ein Reflexionsspektrometer
in typischer Weise angewandt, wenn die nachweisbare physikalische
Eigenschaft der Markierung die Reflexion von Licht bei einer vorbestimmten
Wellenlänge
ist. In einer bevorzugten Ausgestaltungsform zur Anwendung der Vorrichtung
wird ein Reflexionsmessgerät
mit Mitteln zum Bewegen des Teststreifens oder zum Bewegen des Detektorelements
des Messgeräts
relativ zueinander wie durch die Anwendung eines Spezimen-Tisches
für den
Streifen bereitgestellt, der seitlich unter dem Lesekopf des Detektors
bewegt werden kann. Die Reflexion aus der Nachweiszone des Ablesebereichs
kann abgelesen werden, um die Konzentration des Analyt in der fluiden
Probe zu erhalten, worauf die Vorrichtung auf dem Spezimen-Tisch
zur Ablesung der Reflexion der Vergleichszone verschoben werden
kann. Das Verfahren zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung wird durch das folgende Beispiel noch
besser erläutert:
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Beispiel I
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Teststreifen wurden gemäß dem Design
der 1A und 1B in einem Muschel-Schale-Laminator
hergestellt. Auf einem Polystyrol-Stützteil (5,6 × 0,765
cm) wurde ein Nitrocellulose-Streifen (2,5 cm lang) angebracht,
und stromaufwärts
von diesem Streifen wurden eine 0,7 cm lange Brücken-Unterlage aus vorlaminierter
Glasfaser (Whatman F075-075)
und eine 0,9 cm lange Konjugat-Unterlage aus lose konsolidierter
amorpher Glasfaser aufgebracht, die anti-PSA-Monoclonal-Antikörper enthielt, der mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
markiert war. Diese Abschnitte wurden so angeordnet, dass 0,4 cm
des Polystyrol-Stützteils
freigelegt zurückblieben,
um als hydrophobe Plattform zur Aufbringung der flüssigen Testprobe
zu dienen. Stromabwärts vom
Nitrocellulose-Streifen wurde ein 1,0 cm langes Stück aus mit
Trocknungsmittel imprägniertem
absorbierenden Cellulosepapier als absorbierende Unterlage aufgebracht.
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Der Nitrocellulose-Streifen war mit
Test- und Vergleich-Linien
versehen, welche durch Aufbringen von 3,0 mg/mL monoclonalem Maus-anti-FITC
als Test-Linie und von 3,75 mg/mL Glucose-Oxidase (GO) als Vergleich-Linie
(als Test- und Vergleich-Linie-Proteine) auf den Streifen mit einem
IVEK-Streifer hergestellt
wurden. Die Konjugat-Unterlage wurde mit einer Mischung aus 125 μg/mL anti-GO-Latex,
350 mg/mL anti-PSA-Latex,
5 μg/mL
FITC-anti-PSA, 3,16 mg/mL Chremophor, 0,23% Kasein, 20,9 mg/mL HEPES,
23,3 mg/mL Maltose, 9,32 mg/mL BSA, 1,45 mg/mL Ziege-IgG und aus
1,1 mg/mL Kartoffellectin imprägniert
und mit einem Auflage-Trockner bei Zonen von 70, 60 und 50°C mit einer
Geschwindigkeit von 120 cm/min getrocknet.
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Die Vorrichtung wurde durch Aufbringung
von 75 μL
Vollblut, gespickt mit Komplex-PSA-Kalibrator, auf den Teststreifen
durch Pipettieren auf die hydrophobe Plattform aus Polystyrol, auf
die Konjugat-Unterlage oder auf eine poröse Puffer-Unterlage getestet,
die in Front der Konjugat-Unterlage
angeordnet war. Die Blutprobe wurde in die Konjugat-Unterlage und
durch die Reaktionszonen des Teststreifens sorbiert, die dazu dienten,
rote Zellen aus dem Vollblut abzutrennen, als das Blut durch die
verschiedenen Zonen des Streifens wanderte. Die Brücken-Unterlage
dient zur Gewährleistung
einer effizienten Vermischung des Konjugats und der Blutprobe und
trägt dazu
bei, rote Blutzellen am Eintritt in die Nitrocellulose-Fläche zu hindern,
wo sie das Signal aus den Test- und Vergleichszonen verdunkeln könnten. Die
entwickelten Streifen wurden durch Bestimmung der Reflexion aus
der Testzone bei 625 nm mit einem CLINITEK®-Reflexionsmessgerät 10 min
nach Aufbringung der Blutprobe abgelesen.
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3 Formate wurden bezüglich der
Fluid-Durchlaufcharakteristika und der Gesamt-Testleistung verglichen.
In Format "A" wurde die Probe
auf die Mitte der Polystyrol-Plattform bei 1 bis 2 mm von der Konjugat-Unterlage
aufgebracht, so dass das Testfluid die Unterlage berührte. In
Format "B" wurde die Blutprobe
auf die Mitte der porösen
Konjugat-Unterlage aufgebracht. In Format "C" wurde
die Probe auf eine poröse
Puffer-Unterlage aus Glasfaser aufgebracht, die in Front der Konjugat-Unterlage
angeordnet war. Dies stellt das üblichste
Format dar, das in Immunochromatografie-Streifen angewandt wird.
In Tabelle 1 sind die Vergleichs- und Testlinienintensität und der
mit jedem der drei Formate zusammenhängende Fehler dargestellt.
Die Test- und Vergleichsbandenreflexionswerte (% R) wurden in Triplikaten
in einem CLINITEC
®-Reflexionsmessgerät gemessen.
Die Signal-STDs und -CVs wurden durch Einsetzen der um den Hintergrund
verringerten Peak-Reflexionswerte (n = 3) berechnet, um den Fehler
in jedem Fall zu bestimmen:
Tabelle
1
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Aus Tabelle 1 ist ermittelbar, dass
das Format A, worin gemäß der vorliegenden
Erfindung die nicht-poröse
hydrophobe Plattform angewandt wird, eine signifikante Überlegenheit
bezüglich
verbesserter Genauigkeit (niedrigerer CV) und der reproduzierbaren
Bildung der Vergleich-Linie zeigt und ergibt. Format B bildet keine
Vergleich-Linie, und Format C ergibt einen hohen Grad an Ungenauigkeit
(hoher CV) für
die Vergleich-Linie.
