FI92882C - Kertakäyttöinen testiliuska ja menetelmä sen valmistamiseksi - Google Patents

Description

92882

Kertakäyttöinen testiliuska ja menetelmä sen valmistamiseksi Testremsa för engängsbruk samt förfarande för dess fram-ställning Tämä keksintö koskee testiliuskaa, jolla immunokemiallinen pikatesti voidaan suorittaa ilman erillisiä reagensseja, laitteita tai välineitä pelkästään kastamalla testiliuskan tietty alue nestemäiseen näytteeseen ja toteamalla lyhyen ajan kuluessa tapahtuva testireaktiosta johtuva, silminnähtävä muutos liuskassa. Keksintö koskee myös testiliuskan edullista teollista valmistusmenetelmää.

Laboratoriotestien käytön lisääntyessä koko ajan ja maailmanlaajuisesti on syntynyt yhä suurempi tarve niin yksinkertaisten testien kehittämiseen, että ne voidaan tehdä lähes missä tahansa muuallakin kuin hyvinvarustetuissa laboratorio-oloissa, jopa ilman esim. sähköä tai puhdasta vettä. Testin tulisi osata tehdä ja tulkita kouluttamatonkin henkilö ja testin suorituksen tulisi olla erittäin nopea, sillä nopeat johtopäätökset ovat useimmiten sekä lääketieteellisesti että taloudellisesti tärkeitä.

Esimerkkinä tämäntyyppisistä testeistä voidaan mainita jo : kauan käytössä olleet virtsan pH-, glukoosi- ja proteiinites- tit, jotka ovat näytteeseen kastettavia liuskoja ja tulkitaan purkissa olevien värimallien mukaan. Värimuutokset perustuvat yleensä pH-indikaattoreihin tai spesifisiin entsymaattisiin reaktioihin. Immunokemiallinen määritystekniikka sen sijaan on niin vaativaa, että siihen perustuvat testit (esim. raskaus -• testi) on vasta muutamana viime vuonna ollut mahdollista kehit- 4 tää suoritettaviksi ilman erillisiä reagensseja ja pipetoin-tej a.

Unilever plc: n patenttijulkaisussa GB 2204398B kuvataan pikatesti, jonka tekemisessä ei tarvita erillisiä reagensseja.

2 92882

Kyseisen patentin mukainen testilaite on ontto muovikotelo, johon on asennettu kalvo. Tämä kalvo on pinnoitettu tietyltä alueeltaan (testiviivan muodostumiskohta) vasta-aineella (1. vasta-aine) ja toisaalle kalvoon on kuivattu vasta-aineella (2. vasta-aine) pinnoitettuja, värillisiä partikkeleja. Testin suorittamiseksi pipetoidaan näytettä tiettyyn kohtaan testi-kotelossa. Nestemäinen näyte imeytyy kalvoa pitkin ja virtaus ottaa mukaansa värilliset partikkelit (latex, metallikolloidi tai orgaaninen väriaine), joissa olevaan 2. vasta-aineeseen näytteessä mahdollisesti oleva, tutkittava antigeeni sitoutuu. Antigeeni sitoutuu toisesta kohdastaan myös testiviivassa olevaan 1. vasta-aineeseen, joten viivan kohtaan muodostuu positiivisessa tapauksessa värillinen viiva. Tällaista kalvolla tapahtuvaan virtaukseen perustuvaa immunokromatografista testitekniikkaa kutsutaan usein lateral flow-tekniikaksi.

Muita yksinkertaisia immunokemiallisia testilaitteita kuvataan mm. seuraavissa patenttijulkaisuissa: PCT/EP86/00055 (jossa sovelletaan entsyymi-immunologista periaatetta ja täten tarvitaan erillisiä reagensseja), GB 1 589 234 A ja EP 0225 054 AI (joissa entsyymi-immunologinen reaktio aloitetaan kastamalla liuskan pää näytteen lisäyksen jälkeen kehitysliuokseen), EP 0186 799 B1 (jossa rakenne muodostuu limittäisistä liuskoista, joista reagenssit liukenevat näytenesteeseen), EP 0 421 294 A2 (jossa kuvataan seleenikolloidin käyttö lateral flow-periaat-teessa sekä plus-kuvion muotoon pinnoitetut testi- ja kontrol-livasta-aineet), EP 0 149 168 B1 (jossa reaktio tapahtuu lasisessa kapillaariputkessa kerrostetussa kromatografisessa kantaja-aineessa).

; Tässä keksinnössä esitetään edellä esitettyjä testejä yksin-kertaisempi testin rakenne, jonka ansiosta testin suorittamiseksi tarvitaan vain testiliuskan kastaminen näytteeseen ja tuloksen toteaminen. Testilaitteen liuskamaisesta muodosta huolimatta tapahtuvat keskeiset reaktiot suojatussa kammiomai-sessa raossa. Testiliuskan laminoitu rakenne mahdollistaa myös entisiä edullisemman teollisen valmistustavan ja pakkaus tavan.

3 92882

Testiliuskan tarkempi kuvaus ilmenee seuraavasta selityksestä ja keksintöä havainnollistavista kuvioista. Keksinnön erityiset piirteet ilmenevät oheisista patenttivaatimuksista.

Näin ollen keksinnön kohteena on testiliuska immunokemiallista pikatestiä varten, jossa testiliuskassa on nestemäisen näytteen kanssa virtausyhteyteen saatettava testikalvo, johon on sovitettu ainakin kaksi testille spesifistä immunokemiallista reagenssivyöhykettä. Liuskalle on tunnusomaista että siinä on ainakin yksi taustalevy, johon on kiinnitetty alkupään tyyny ja välin päähän tästä loppupään tyyny, joiden tyynyjen tausta-levyn suhteen vastakkaisella puolella on tyynyjen välillä ulottuva testikalvo spesifisine vyöhykkeineen siten, että tyynyjen, taustalevyn ja testikalvon väliin jää reunoiltaan avoin, reaktiokammiona toimiva rako.

Testiliuskassa on edullisemmin kaksi taustalevyä, yksi kummallakin puolella ja toinen taustalevy on edullisemmin ainakin osittain läpinäkyvä siten, että testikalvoss a tapahtuva väri-reaktio on nähtävissä.

Taustalevyn ja testikalvon välillä- olevat tyynyt ovat edullisesti imukykyisiä tyynyjä ja erityisesti alkupään imutyyny : ulottuu testikalvoa pitemmälle siten, että näyte voidaan saada virtaamaan imutyynyn kautta testikalvoon. Käyttämällä myös loppupään tyynynä imukykyistä materiaalia varmistetaan nesteen virtauksen jatkuminen testiliuskalla reaktiovyöhykkeiden läpi.

Testikalvossa on edullisesti liikkuvan leiman käsittävä leima-vyöhyke, kiinteän reagenssin käsittävä testivyöhyke ja kontrol-liainetta käsittävä kontrollivyöhyke.

Keksinnön kohteena on myös testiliuskan jatkuvatoiminen teollinen valmistusmenetelmä, jolla testiliuskan valmistus on erityisen edullisesti toteutettavissa. Keksinnön mukaisessa val-*5 mistusmenetelmässä testikalvo-materiaalipituudelle annostel- 4 92882 laan pituussuuntaisesti erilliset, jatkuvat, kapeat reagenssi-vyöhykkeet, jotka sisältävät immunokemialliselle reaktiolle spesifistä leima-ainetta ja testiainetta. Kalvomateriaalille annostellaan edullisesti myös kontrolliainetta sisältävä kapea vyöhyke testiainevyöhykkeen viereen. Annostellut vyöhykkeet kuivataan tämän jälkeen. Erilliselle pitkälle pohjalevy-materiaalille kiinnitetään jatkuvina pituuksina ainakin kaksi toisistaan välimatkan päässä olevaa tyynymateriaalijuovaa. Tyynymateriaalijuovien päälle asetetaan ennalta valmistettu testikalvopituus siten, että reagenssivyöhykkeet kohdistuvat tyynyjen välistä rakoa päin. Testikalvon ja tyynyj uovien päälle kiinnitetään ainakin pohjalevymateriaalin kokoinen läpinäkyvä päällyslevymateriaali ja näin saadaan pitkä testiliuska-aihio, josta voidaan leikata halutun kokoisia kappaleita testiliuskoiksi.

Keksintöä selostetaan seuraavassa yksityiskohtaisemmin viitaten oheisiin piirustuksiin, joissa

Kuvio 1 on perspektiivikuvanto keksinnön mukaisen testiliuskan edullisesta suoritusmuodosta,

Kuvio la esittää kuvion 1 mukaisen suoritusmuodon erilliset osat räjähdyskuviona,

Kuvio 2 esittää keksinnön mukaisessa testiliuskassa käytettävää testikalvoa ja sen erään suoritusmuodon mukaisia vyöhykkeitä,

Kuvio 3 esittää kaavamaista poikkileikkausta keksinnön mukai-; sen testiliuskan toisesta suoritusmuodosta.

Kuvioissa 1 ja la on esitetty keksinnön mukaisen testiliuskan edullinen suoritusmuoto. Yleisesti viitenumerolla 10 merkityn testiliuskan pohjan muodostaa muovinen tai vastaava sopivasti tukeva pohjalevy 1. Tähän pohjalevyyn 1 on kiinnitetty molempiin päihin suhteellisen ohuet tyynyt, jotka edullisesti ovat 92882 5 erittäin imukykyistä ja kemiallisesti inerttiä materiaalia olevat imutyynyt 3 ja 5. Alkupäässä oleva tyyny 3 voi olla käsitelty erilaisilla aineilla imukyvyn lisäämiseksi ja virtauksen nopeuttamiseksi. Tarvittaessa voidaan tähän imutyynyyn 3 imeyttää myös aineita, jotka ovat reaktiossa aktiivisia.

Imutyynyjen 3 ja 5 päälle on asetettu testikalvo 2, jossa varsinainen detektoitava reaktio tapahtuu.

Imutyynyjen 3 ja 5 väliin jää rako 4, joka on riittävän pitkä siten, että sen alueelle mahtuu testikalvossa 2 oleva reaktio-alue eli reagenssivyöhykkeet sisältävä alue. Raon 4 kohdalle jäävät vyöhykkeet 7, 8 ja 9 (kuvio 2), joissa on kuivattu leima, spesifinen vasta-aineviiva ja mahdollinen kontrollivii-va. Testiliuskaa 10 valmistettaessa kalvo 2 asetetaan tyynyjen 3, 5 varaan siten, että kalvon 2 reaktiivinen testipuoli on alaspäin eli rakoa 4 vasten. Tyynyjen 3, 5 ja kalvon 2 välisen kosketuspinnan tulee olla riittävä nestevirtauksen syntymiseksi ja jatkumiseksi.

Tällä järjestelyllä aikaansaadaan rakenne, jossa testikalvon 2 reaktiopinta ei ole kosketuksissa minkään materiaalin kanssa, vaan kalvon 2 ja pohjalevyn 1 väliin jää rako 4, jonka voidaan ajatella muodostuvan ikäänkuin pienen, sivuista avoimen kammion, jossa nestevirtaus kalvolla 2 on häiriötön. Imutyynyjen 3 ja 5 paksuus on edullisesti suuruusluokkaa 0,5-3 mm siten, että rako 4 jää kapeaksi. Raon 4 kapeuden takia atmosfääri reaktiokammiossa on kuitenkin kostea eikä ilmavirtauksista johtuva kuivuminen haittaa nesteen virtausta.

: Kalvon 2 ja tyynyjen 3, 5 päälle kiinnitetään edullisesti toiseksi taustalevyksi päällyslevy 6, joka voi olla läpinäkyvä, esimerkiksi kirkasta PVC-, PE- tai PC-muovia oleva, mieluiten koko testiliuskan 10 kokoinen levy. Tämä päällyslevy suojaa kalvoa 2 ja tyynyjä 3, 5, estää nesteiden haihtumista ja tukevoittaa rakennetta. Koska päällyslevy 6 on läpinäkyvä, : voidaan testin tulos nähdä siitä huolimatta.· Päällyslevy voi- 92882 6 daan maalata sopivalla tavalla tai kiinnittää sen päälle teippi tai teippejä (ei näytetty), jotka helpottavat testin tulkitsemista peittämällä muut osat kuin viivojen muodostumisalueen. Päällyslevy 6 voi myös olla läpinäkymätöntä materiaalia, johon on tehty aukko tai aukot siten, että testitulos on nähtävissä. Vaihtoehtoisesti pohjalevy 1 on läpinäkyvä ja reaktio havaitaan raon 4 läpi.

Kuviossa 2 esitetään tyypillisen testikalvon vyöhykkeet, joista 7 on vyöhyke, johon on kuivattu sokeriliuosta ja sen päälle leima-aineena käytettäviä partikkeleita; 8 on vyöhyke, johon on kiinnitetty analyytille spesifistä vasta-ainetta; ja 9 vyöhyke, johon on kiinnitetty kontrollivasta-ainetta.

Testi perustuu lateral flow-periaatteeseen. Reaktio tapahtuu siis kalvolla 2, joka on kemiallisilta ominaisuuksiltaan sellaista, että siihen voidaan kiinnittää vasta-aineita ja muita reaktiossa tarvittavia aineita ja joka on sopivalla tavalla huokoista niin, että nestevirtaus muodostuu ja detektioon tarvittava aine (kuten latex-, metallikolloidi- tai muut partikkelit ja liukoiset molekyylit) voi liikkua virtauksen mukana. Testikalvo 2 voi olla materiaaliltaan nitroselluloo-saa. Se voi olla myös nailonia tai muuta sopivaa materiaalia.

: Mikäli testikalvo 2 on ohut, on sen edullista olla kiinnitetty omaan tukikalvoonsa (ei näytetty kuvioissa), mikä helpottaa sen käsittelyä testin kokoamista edeltävissä pinnoitusvaiheis-sa. Mikäli reaktion detektointi tapahtuu tukikalvon puolelta, on tukikalvon oltava samalla tavoin läpinäkyvä kuin liuskaan 10 päällimmäiseksi kiinnitettävän levynkin.

Testikalvolla 2 olevien vyöhykkeiden määrä ja paikka voi vaihdella testattavasta analyytistä riippuen.

Tällä keksinnön tarkoittamalla testiliuskalla voidaan testi, esimerkiksi raskaustesti, suorittaa siten, että liuskan 10 alkupää asetetaan tiettyä kohtaa myöten näytteeseen, jolloin

II

92882 7 näytettä imeytyy alkupään imutyynyyn 3, josta se siirtyy edelleen testikalvoon 2. Odotetaan kontrolliviivan 9 muodostumista nestevirtauksen edettyä sen kohdalle. Jos myös toinen, spesifinen viiva 8 on muodostunut, on testi positiivinen.

Kuviossa 3 on esitetty keksinnön mukaisen testiliuskan vaihtoehtoinen suoritusmuoto, jossa pohjalevyyn 1 on kiinnitetty huokoinen testikalvo 2 ja tietyn välimatkan päähän kalvon toisesta päästä on kiinnitetty inertti tukityyny 3. Testikalvo-pohjalevy-yhdistelmän vastakkaiseen päähän on kiinnitetty toinen tukityyny 5 siten, että tyynyjen 3 ja 5 väliin jää väli. Tyynyjen 3 ja 5 päälle on kiinnitetty tyynyt peittävä päällyslevy 6 siten, että muodostuu reunoiltaan avoin rako 4. Joko pohjalevy 1 tai päällyslevy 6 on läpinäkyvää ainetta.

Tässä suoritusmuodossa testikalvo 2 toimii samalla imutyynynä ja neste imetään suoraan kalvoon. Ratkaisun etuna on rakenteen yksinkertaisuus ja se, että nesteen virtaus ei ole riippuvainen imutyynyn ja testikalvon välisestä virtausyhteydestä. Päällyslevy 6 ja/tai tyyny 3 voivat ulottua myös yhtä pitkälle kuin pohjalevy 1, jolloin neste imeytyy testikalvoon 2 sen avoimilta reunoilta.

On olennaista, ettei testikalvon vyöhykkeitä kasteta näyte-nesteeseen, vaan reaktiot on saatava tapahtumaan vasta neste-rintaman edetessä kalvoll'a. Tästä johtuen testiliuskan käyttäjälle tulisi kuvata upotussyvyys ja kaikkein edullisinta on merkitä kastamisraja itse testiliuskaan. Testi voidaan kehittää myös suoritettavaksi siten, että testiliuskan 10 alk :pää kastetaan merkittyä kohtaa myöten näytteeseen, jolloin a-ku-: pään imutyyny 3 imee itseensä riittävän määrän näytettä; heti senjälkeen testiliuska voidaan ottaa pois näytteestä ja asettaa muualle viivojen kehittymisajan ajaksi.

Nesterintaman häiriöttömäksi liikkumiseksi on edullista valita testikalvo, joka valmistusvaiheessa on käsitelty sopivalla • aineella, joka tekee nesteen tunkeutumisen helpommaksi (esimer- 8 92882 kiksi detergentti kuten Tween 20 (valmistaja BioRad Laboratories, USA) ja sen varauksen sopivaksi valittuihin partikkeleihin nähden (esimerkiksi puskuroivia ioneja). Käsittelemätön kalvo voidaan myös käsitellä ennen testille spesifisten vyöhykkeiden lisäämistä kastamalla kalvo sopiviin liuoksiin ja kuivattamalla. Edellä kuvattuja testin toimintaa edistäviä reagensseja voidaan myös lisätä kuivaamalla ne imutyynyyn 3 tai testikalvon 2 alkupäähän. Leimapartikkelien irtoamista kalvolta nestevirtauksen mukaan voidaan helpottaa kuivaamalla partikkelivyöhykkeen alle sopiva seos, esimerkiksi sokeri-liuos.

Keksinnön mukaisen testiliuskan rakenne, jossa päällys- ja pohjalevyjen välissä on imutyynyt tai imukalvo siten, että reunat ovat avoimet, mahdollistaa testin yksinkertaisen suorituksen, koska näytettä ei tarvitse erillisesti pipetoida testiin, vaan imu kastettaessa on esteetöntä. Liuskassa olevan kapean raon muodostamassa kammiomaisessa tilassa on virtauksen kulku suojattu häiriöiltä ja ilmavirran aiheuttamalta kuivumiselta.

Vaikka on selvää, että keksinnön mukaiset testiliuskat voidaan valmistaa yksitellen oikean kokoisista osista, niin keksinnön mukaisen testiliuskan laminoidun ja reunoilta avoimen raken-teen ansiosta sen teollinen valmistus on mahdollista kehittää nopeaksi, automaattiseksi ja kustannuksiltaan edulliseksi. Tällöin testikalvo reagenssivyöhykkeineen valmistetaan ennalta erillisellä tuotantolinjalla, minkä jälkeen testiliuska kootaan toisella tuotantolinjalla laminoimalla liuskan eri komponentit toisiina pitkäksi testiliuskamatoksi.

Siten testikalvo valmistetaan edullisesti tuotantolinjalla, jossa se puretaan kaivomateriaalirullata, käsitellään ja rullataan uudelleen testikalvorullaksi, ja jossa testikalvolla tarvittavat reagenssit annostellaan ja kuivataan yhtenäisinä viivoina. Näin toimien helposti vaurioituva testikalvo altistetaan mahdollisimman harvoille mekaanisille toimenpiteille.

9 92882

Lisäksi reagenssien annostelun onnistuminen ja tasaisuus, mikä on tärkeää testin luotettavan toiminnan kannalta, pystytään havainnoimaan ja varmistamaan yksikertaisesti esim. seuraamalla optisen mittalaitteen alla kulkevan reagenssiviivan leveyttä. Nopeasta valmistustekniikasta johtuen testikalvo joutuu mahdollisimman lyhyen aikaa tekemisiin esim. huoneilmassa mahdollisesti esiintyvien kontrolloimattomien häiriötekijöiden kanssa.

Itse testiliuskan kokoamista varten kaikki materiaalit valitaan edullisesti niin, että ne saadaan rullalle käärityssä muodossa. Testiliuskan valmistuslinja on suunniteltu sellaiseksi, että se syöttää eri materiaalit testikalvo mukaanlukien rullilta oikeassa järjestyksessä päällekkäin laminoitavaksi, esimerkiksi liimaamalla.

Siten tyypillisessä valmistusmenetelmässä taustamateriaali-rullalta purettavalle pohjalevymateriaalirainalle levitetään liimaa, sen päälle saatetaan rullilta purkautumaan tyyny-materiaalipituudet pohjaievyrainan ennalta määrätyille alueille siten, että niiden väliin jää rako. Ennalta valmistettu testikalvomateriaali puretaan rullaltaan ja saatetaan asettumaan tyynymateriaalijuovien päälle, niiden väliin siten, että reagensseilla päällystetty puoli on rakoa päin. Näin saadun yhdistelmän päälle liimataan vielä päällysmateriaalirullalta purettava läpinäkyvä muoviraina siten, että se liimautuu tyyny-materiaali j uoviin ja myös osittain testikalvomateriaaliin tämän reuna-alueilla. Lopuksi yhdistelmää puristetaan tasaisesti liimautumisen varmistamiseksi.

* Koska valmistuslinja on jatkuvatoiminen, on yksittäisten testien tasalaatuisuus esim. asetettujen mekaanisten toleranssien pysyvyyden suhteen yksinkertaisesti varmistettavissa ja todennettavissa. Muuttamalla laminoinnissa käytettävien materiaali-rullien leveyttä on tuotantolinja helposti ja nopeasti asennettavissa erilaisille testeille soveltuviin vaatimuksiin.

92882 10

Testiliuskan tuotantolinjan loppupäässä valmiiksi laminoitu pitkä nauha-aihio leikataan halutun levyisiksi testiliuskoiksi. Leikkausvaiheen aikaansaama tuore leikkauspinta varmistaa imutyynyn reunojen tasalaatuisuuden ja siten näytteen toistettavan tasaisen imeytymisen, joka puolestaan vaikuttaa suotuisasti testituloksen toistettavuuteen.

Valmiit testiliuskat voidaan pakata ennestään totutulla tavalla yksittäispakkauksiin (esimerkiksi muovilaminaattipussei-hin), joissa on kosteutta sitova kuivausainepussi. Mutta koska keksinnön mukaisten testiliuskojen rakenne on kevyt ja pieni, voidaan niitä pakata myös edullisesti esimerkiksi lieriömäisiin purkkeihin, jotka ovat kosteutta läpäisemättömiä, esimerkiksi alumiinipurkkeihin.

Raskaustesti on eräs keksinnön mukaisen testiliuskan hyvä sovellutuskohde. Testi voidaan suunnitella tehtäväksi suoraan virtsasta tai seerumista ja määritettävä analyytti on tällöin istukan erittämä koriongonadotropiini (human chorionic gonadotropin, hCG).

Testiliuskaa voidaan soveltaa myös moniin testeihin, joissa osoitetaan jonkin tietyn, tautiin tai fysiologiseen tilaan liittyvän tai keinotekoisesti elimistöön ' tuodun yhdisteen .· olemassaolo tai puuttuminen näytteessä. Erityisen hyvin tällainen ±-testi soveltuu mikrobien aiheuttamien infektioiden diagnosointiin. Näyte voi olla nestemäinen (esim. seerumi kuten osoitettaessa reumaan liittyvän reumafaktorin läsnäoloa, tai virtsa kuten osoitettaessa albumiinivuotoa, joka johtuu munuaisten vaurioitumisesta, tai selkäydinneste kuten osoitet-taessa meningiitin aiheuttavan bakteerin läsnäoloa). Näyte voi olla myös limainen tai kiinteä, jolloin tutkittava yhdiste uutetaan ennen testiä sopivaan liuokseen. Esimerkki tällaisesta sovellutuksesta on klamydia-antigeenin osoittaminen näytteestä, joka on otettu potilaan urogenitaalialueen limakalvoilta. Vastaavasti voidaan näyte ottaa nielun limakalvoil-ta esim. Streptokokki A: n toteamiseksi. Ulostenäytteestä voi- n 92882 11 daan todeta suolistoalueen syövän yhteydessä esiintyvä ulosteen piilevä veri osoittamalla testiliuskalla ihmishemoglo-biinin läsnäolo. Yskösnäytteestä voidaan osoittaa esimerkiksi keuhkokuumetta aiheuttavan Pneumokokin läsnäolo. Sikiökalvojen puhkeaminen voidaan todeta osoittamalla vaginaeritenäytteestä IGFBP-1-nimisen proteiinin läsnäolo. Eri näytteistä voidaan myös osoittaa infektioihin liittyvien vasta-aineiden olemassaolo, esimerkiksi IgG-luokan vasta-aineet Helicobacter pylori:ta vastaan. Ko. bakteerin on todettu olevan yksi tärkeä syy mahahaavan syntymiselle.

Seuraavat esimerkit havainnolistavat keksintöä sitä millään tavalla rajoittamatta.

Esimerkki 1 Raskaustesti

Leiman valmistaminen. Keksinnön mukaisen raskaustestiliuskan valmistamiseksi pinnoitettiin sinisiä latex-partikkeleita monoklonaalisella hCG-vasta-aineella. Partikkelien koko oli noin 200 nm. Näin saatua detektioleimaa säilytettiin 1% suspensiona puskurissa.

Testikalvon valmistaminen. Testikalvon materiaalina käytettiin *. nitroselluloosaa, joka oli kiinnitetty ohueen läpinäkyvään muoviin. 30 mm pitkän kalvon alkupäähän kuivattiin sokeriliuosta ( 9 mm päähän alusta) ja kuivan sokerivyöhykkeen päälle annosteltiin edellä kuvattua latexleimaa. 18 mm päähän alusta annosteltiin kapea vyöhyke liuosta, joka sisälsi toista mono-klonaalista hCG-vasta-ainetta puskurissa. Siitä 2 mm:n päähän ·: annosteltiin kapea vyöhyke liuosta, joka sisälsi vasta-ainetta hiiren immunoglobuliinille.

Testiliuskan kokoaminen. Testin pohjalevyksi leikattiin valkoista polyesteriä 6 mm x 120 mm kokoinen kappale. Loppu- ja alkupään imutyynyjen materiaalina käytettiin raionkuitua, joka •j oli ohuiden polyetyleenikankaiden välissä noin 1 mm paksuisena 92882 12 kerroksena. Pohjalevyn alkupäähän liimattiin 30 mm: n pituinen kappale imutyynyä ja loppupäähän 70 mm: n pituinen kappale. Näiden päälle asetettiin edellä valmistettu kuiva testikalvo siten, että se oli tyynyjen päällä 5 mm: n matkalta kummassakin päässä. Päällystetty reaktiopuoli oli alaspäin. Tyynyihin ja muutaman mm:n matkalta myös kalvoon liimattiin päällyslevy, joka oli leikattu läpinäkyvästä polyesteristä pohjalevyn kokoiseksi. Päällyslevyn alku- ja loppupäähän kiinnitettiin läpinäkymätöntä teippiä siten, että vain spesifisen testiviivan ja kontrolliviivan muodostumiskohtaan jäi 10 mm pitkä paljas kohta.

Osa liuskoja koottiin siten, että testikalvo kiinnitettiin heti pohjalevyyn reaktiopuoli ylöspäin. Tyynyt asetettiin ylläkuvattua tapaa vastaavalla tavalla kosketuksiin testikalvon kanssa. Päällimmäiseksi kiinnitettiin jälleen päällyslevy. Nit-roselluloosapintaan ei tehty liimauksia. Erona edelliseen oli siis se, että kammiomainen rako muodostui kalvon ylä- eikä alapuolelle.

Raskaustestin suoritus: 1. Kastettiin testiliuskan alkupää 20 mm: n syvyydeltä virtsanäytteeseen.

2. Poistettiin liuska näytteestä ja odotettiin 5 minuuttia.

3. Tarkasteltiin liuskaan muodostuneiden sinisten viivojen määrää ja tulkittiin tulos.

Tulkinta: spesifiseen viivaan oli annosteltu vasta-ainetta sellainen määrä, että hCG-pitoisuus noin 50 IU/1 on alin, joka aiheuttaa näkyvän leimamäärän sitoutumisen havaittavaksi viivaksi eli testin tulkitsemisen positiiviseksi. Kontrollivii-vaan annosteltu hiiren immunoglobuliinin vasta-aine sitoo virtauksen mukana tulevan leiman epäspesifisesti, koska se on pinnoitettu IgG-luokkaan kuuluvalla hiiren vasta-aineella. Annostelut tehtiin sellaisissa suhteissa, että korkeankin hCG-pitoisuuden läsnäollessa jää niin paljon leimaa sitoutumat- 92882 13 ta spesifiseen viivaan, että muodostuu näkyvä kontrolliviiva, joka osoittaa, että nestevirtaus on edennyt toivotulla tavalla ja testi on toimintakelpoinen. Sinisen kontrolliviivan ilmestyminen osoittaa, että testi on toiminut luotettavasti.

Tulokset testisarjasta, jossa tunnetusti negatiiviseen näytteeseen oli lisätty tunnettuja määriä hCG: tä: hCG-pitoisuus Spesifinen viiva Kontrolliviiva Tulkinta näytteessä (10/1) 0 - + negatiivinen 25 - + negatiivinen 100 + + positiivinen 1000 + + positiivinen 10000 + + positiivinen 100000 + + positiivinen 200000 + + positiivinen

Testiliuskat, joissa kalvo oli kiinnitetty pohjalevyyn, antoivat samanlaisen tuloksen.

Esimerkki 2

Testi lapsiveden menon osoittamiseen • Lapsiveden menon osoittamiseen tarkoitettu testi perustui siihen, että vaginaeritteestä osoitetaan IGFBP-1: n (Insulin-like growth factor binding protein-1) läsnäolo.

Leima, testikalvo ja kokoaminen tehtiin samalla tavalla kuin esimerkissä 1, lukuunottamatta sitä, että koska tutkittava 0 proteiini on IGFBP-1, käytettiin leima- ja spesifisen viivan muodostavana vasta-aineina monoklonaalisia IGFBP-l-vasta-ainei-ta.

92882 14 Näyte

Otettiin steriilillä dacrontikulla näyte vaginaeritteestä. Tikkuun imeytynyt näyte uutettiin laimennuspuskuriin tarkoin tunnetussa suhteessa.

Testin suoritus: 1. Kastettiin testiliuskan alkupää 20 mm syvyydeltä puskuriin, johon näyte oli uutettu.

2. Poistettiin liuska nesteestä ja odotettiin 5 minuuttia.

3. Tarkasteltiin liuskaan muodostuneiden sinisten viivojen määrää ja tulkittiin tulos.

Tulokset testisarjasta, jossa lapsivettä oli laimennettu suolaliuokseen (lapsivesinäytteen IGFBP-1-pitoisuus oli tunnettu): IGFBP-1 Spesifinen viiva Kontrolliviiva Tulkinta (ug/i) 0 - + negatiivinen 20 - + negatiivinen 100 + + positiivinen 500 + + positiivinen 1000 + + positiivinen « 50000 + + positiivinen IGFBP-1-pitoi s uutta 100 μg/1 tässä testilaimennoksessa voidaan pitää niin korkeana, että se vaginaeritenäytteessä voi aiheutua vain lapsiveden läsnäolosta ja sikiökalvojen voidaan tuiki -·. ta puhjenneen.

Esimerkki 3

Testi ulosteessa olevan veren osoittamiseksi (kaksi analyyt-tiä)

Ulosteessa oleva, siihen suolistosta syövän takia vuotaneen 92882 15 veren osoittamiseen tarkoitettu testi suunniteltiin perustumaan sekä ihmisen hemoglobiinin että albumiinin läsnäolon osoittamiseen. Hemoglobiini on spesifisempi veren merkkiaine, sillä albumiinia voi olla ulosteessa sellaisen proteiinivuodon tuloksena, joka ei liity syöpään. Albumiini on puolestaan hemoglobiinia säilyvämpi ulosteessa.

Leima, testikalvo ja testiliuskan kokoaminen tehdään samalla tavalla kuin esimerkissä 1, lukuunottamatta sitä, että kahden analyytin osoittamisen takia tehdään seosleima, joka sisältää sekä hemoglobiinivasta-aineella että albumiinivasta-aineella pinnoitettuja partikkeleita. Myös spesifisiä testiviivoja annostellaan vastaavasti kaksi erilaista. Annosteluissa otetaan huomioon, että testille halutaan mahdollisimman suuri herkkyys.

Näyte

Pieni ulostenäyte suspendoidaan puskuriliuokseen. Mahdollisimman homogeeninen suspensio suodatetaan ja suodos pannaan koeputkeen.

Testin suoritus: 1. Kastetaan testiliuskan alkupää 20 mm syvyydeltä suodokseen.

2. Poistetaan liuska nesteestä ja odotetaan 5 minuuttia.

3. Tarkastellaan liuskaan muodostuneiden sinisten viivojen määrää ja tulkitaan tulos. Yksi viiva osoittaa testin olevan negatiivinen, kolme viivaa positiivinen. Mikäli muodostuu vain kaksi viivaa, suositellaan uuden näytteen ottamista.

Edellä keksintöä on selitetty tiettyjen suoritusmuotojen avulla. Alan ammattimiehelle on kuitenkin ilmeistä, että keksinnön puitteissa voidaan aikaansaada useita muunnoksia ja vaihtoehtoja keksinnön periaatteista poikkeamatta.

Claims (11)

92882

1. Testremsa för ett immunokemiskt snabbtest innefattande för testet specifika immunokemiska reagenszoner (7,8,9), vilken testremsa (10) har en pä dess fondplatta (1) fäst främre dyna (3) och pä avständ fran den främre dynan (3) en bakre dyna :, (5)/ varvid mellan dynorna (3,5) finns en pä avständ frän fondplattan (1) och därmed parallell testfilm (2), som kan bringas i vätskeströmningskontakt med ett prov, kanne-tecknad av att fondplattan (1) och testfilmen (2) begränsar mellan sig en vid kanterna öppen luftspalt (4) som fungerar som reaktionskammare.

1. Immunokemiallista pikatestiä varten tarkoitettu testi-liuska, jossa on testille spesifiset immunokemialliset rea-genssivyöhykkeet (7, 8,9,), jonka testiliuskan (10) tausta-levyyn (1) on kiinnitetty alkupään tyyny (3) ja välin päähän alkupään tyynystä (3) loppupään tyyny (5), jolloin tyynyjen (3.5) välillä on näytteen kanssa nestevirtausyhteyteen saatettava, taustalevyn (1) suuntainen ja välin päässä taustalevystä (1) sijaitseva testikalvo (2), tunnettu siitä, että taustalevy (1) ja testikalvo (2) rajoittavat väliinsä reaktio-kammiona toimivan, reunoiltaan avoimen ilmaraon (4).

2. Testremsa enligt patentkravet 1, kännetecknad av att den främre dynan (3) och fördelaktigt ocksä den bakre dynan (5) är av absorberande material. 92882

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testiliuska, tunnet-t u siitä, että alkupään tyyny (3) ja edullisesti myös loppupään tyyny (5) on imukykyistä materiaalia.

3. Testremsa enligt patentkravet 1 eller 2, kanne-tecknadav att den har tvä fondplattor, vilka bildas av en bottenplatta (1) och en fördelaktigt genomskinlig täck-platta (6) sä, att dynorna (3,5) och testfilmen (2) ligger mellan bottenplattan (1) och täckplattan (6), varvid dynorna (3,5), testfilmen (2) och den ena fondplattan (1,6) begränsar mellan sig en vid kanterna öppen luftspalt (4).

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että siinä on kaksi taustalevyä, jotka muodostuvat pohjalevystä (1) ja edullisesti läpinäkyvästä päällys-levystä (6) siten, että tyynyt (3,5) ja testikalvo (2) jäävät pohjalevyn (1) ja päällyslevyn (6) väliin, jolloin tyynyt (3.5) , testikalvo (2) ja toinen taustalevy (1,6) rajoittavat väliinsä reunoiltaan avoimen ilmaraon (4).

4. Testremsa enligt nägot av patentkraven 1-3, k ä n n e - tecknadav att fondplattorna (1, 6) sträcker sig utmed dynornas (3,5) hela utsträckning eller att den ena fondplattan eller bäda täcker endast en del av dynorna (3, 5).

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1-3 mukainen testi-liuska, tunnettu siitä, että taustalevyt (1,6) ulottuvat tyynyjen (3,5) koko ulottuvuudelle tai että toinen tai molemmat taustalevyt peittävät vain osan tyynyistä (3,5).

5. Testremsa enligt nägot av patentkraven 1-4, k ä n n e - tecknadav att testfilmen (2) är av poröst material säsom nitrocellulosa, nylon eller motsvarande, varvid testfilmen (2) fördelaktigt är ätminstone delvis limmad vid den ena fondplattan (1,6).

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1-4 mukainen testi-liuska, tunnettu siitä, että testikalvo (2) on huokoista materiaalia kuten nitroselluloosaa, nailonia tai vastaavaa, jolloin testikalvo (2) on edullisesti ainakin osittain liimattu toiseen taustalevyyn (1,6). Il 92882

6. Testremsa enligt nägot av patentkraven 1-5, kanne-tecknad av att testfilmen (2) omfattar en signalzon (7) med en rörlig signal, en testzon (8) med en fast reagens och en kontrollzon (9) med ett kontrollämne, varvid zonernas specifika reagenser fördelaktigt är överdragna pä den mot : spalten (4) vända sidan av testfilmen (2).

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1-5 mukainen testiliuska, tunnettu siitä, että testikalvossa (2) on liikkuvan leiman käsittävä leimavyöhyke (7), kiinteän reagenssin käsittävä testivyöhvke (8) ja kontrolliainetta käsittävä kontrollivyöhyke (9), joiden vyöhykkeiden käsittämät spesifiset reagenssit on edullisesti päällystetty testikalvon (2) rakoa (4) vastaan olevalle puolelle.

7. Testremsa enligt patentkravet 6, kännetecknad av att den ena fondplattan (1,6) ätminstone vid omrädet för testzonen (8) och kontrollzonen (9) är genomskinlig, öppen eller pä annat sätt möjliggör observation av reaktionen. 1 Testremsa enligt patentkravet 6 eller 7, kännetecknad av att ett för testet specifikt signalämne doserats pä signalzonen (7) och en för testet specifik anti-kropp doserats pä testzonen (8). y 2 8 8 2

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testiliuska, tunnet- t u siitä, että toinen taustalevy (1,6) on ainakin testi-vyöhykkeen (8) ja kontrollivyöhykkeen (9) kohdalta läpinäkyvä, avoin tai muulla tavalla mahdollistaa reaktion havaitsemisen.

8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen testiliuska, tun nettu siitä, että leimavyöhykkeeseen (7) on annosteltu testille spesifistä leima-ainetta ja testivyöhykkeeseen (8) on annosteltu testille spesifistä vasta-ainetta.

9. Testremsa enligt patentkravet 8, kännetecknad av att signalzonen (7) omfattar som signalämne latex-, metall-kolloid- eller andra partiklar, som överdragits med a) hCG-antikroppar b) IGFBP-1-antikroppar, eller c) säväl hemoglobinantikroppar som albuminantikroppar och att testzonen (8) pä motsvarande vis omfattar a) andra hCG-antikroppar b) andra IGFBP-1-antikroppar, eller c) säväl andra hemoglobinantikroppar som andra albuminantikroppar.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen testiliuska, tunnet- t u siitä, että leimavyöhykkeessä (7) leima-aineena on a) hCG-vasta-aineella, b) IGFBP-l-vasta-aineella, tai c) sekä hemoglobiini vasta-aineella että albumiinivasta-aineel-la : pinnoitettuja värillisiä latex-, metallikolloidi- tai muita partikkeleita, ja vastaavasti testi vyöhykkeessä (8) on a) toista hCG-vasta-ainetta, b) toista IGFBP-l-vasta-ainetta tai c) toista hemoglobiinivasta-ainetta ja toista aiburniinivasta-. ainetta. ‘ · a

10. Testremsa enligt nägot av patentkraven 1-8, kanne-tecknadav att den ena av fondplattorna (1,6) eller bäda har en doppgräns som markerar det dj up till vilket testet skall sänkas.

10. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen 1-8 mukainen testi-liuska, tunnettu siitä, että toiseen . tai molempiin taustalevyihin (1,6) on merkitty testin upotussyvyyttä osoittava kas tamisraj a. 92882

11. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen testiliuskan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa (a) testikalvomateriaalipituudelle annostellaan ja kuivataan pituussuuntaisesti erilliset, jatkuvat, immunokemiallisia rea-gensseja sisältävät vyöhykkeet, (b) pitkälle pohjalevymateriaalille kiinnitetään jatkuvina pituuksina ainakin kaksi toisistaan välimatkan päässä olevaa tyynymateriaalij uovaa, (c) tyynymateriaalijuovien päälle asetetaan vaiheessa (a) saatu testikalvopituus siten, että reagenssivyöhykkeet kohdistuvat tyynymateriaalijuovien välisen raon kohdalle, (d) testikalvopituuden ja tyynymateriaalijuovien päälle kiinnitetään pohjalevymateriaaliin nähden vastakkaiselle puolelle läpinäkyvää päällyslevymateriaalia, ja (f) näin muodostunut pitkä liuska-aihio leikataan halutun kokoisiksi testiliuskoiksi.

11. Förfarande för framställning av en testremsa enligt patentkravet 1, kännetecknat av att det omfattar stegen, väri (a) zoner med separata, kontinuerliga, immunokemiska reagenser doseras och torkas longitudinellt pä en längd av testfilm-material, (b) ätminstone tvä pä avständ frän varandra befintliga 'j strängar av dynmaterial fästs som kontinuerliga längder pä ett längt bottenplattematerial, (c) den i steg (a) erhällna testfilmlängden placeras pä strängarna av dynmaterial sä, att reagenszonerna passar mot springan mellan strängarna av dynmaterial, (d) pä motsatta sidan av längden av testfilm och strängarna av dynmaterial jämfört med bottenplattematerialet fästs ett genom-skinligt täckplattematerial, och (e) det sä framställda länga ämnet för remsa skärs i test-remsor av önskad storlek.