PL172246B1 - Pasek testowy do testu immunologicznegooraz sposób wytwarzania paska testowego do testu immunologicznego PL - Google Patents

Abstract

1. Pasek testowy do testu immunologicznego zawierajacy swoiste immunochemiczne strefy odczynnikowe oraz posiadajacy podklad i dolaczona do niego wkladke konca wejscio- wego oraz w pewnej odleglosci od niej wkladke konca tylnego, pomiedzy którymi wystepuje blona testowa umozliwiajaca przeplyw cieczy, przy czym wymieniona blona umieszczona jest w ukladzie równoleglym wzgledem tego podkladu w pewnej odleglosci od niego, znamienny tym, ze podklad (1) z wkladka (3) konca wejsciowego oraz wkladka (5) konca wyjsciowego i blona (2) ograniczaj a pomiedzy soba powietrzna szczeline (4), która jest otwarta przy swoich krawedziach. 10. Sposób wytwarzania paska testowego do testu immunologicznego, znamienny tym, ze wzdluznie rozprowadza sie i suszy sie oddzielne, ciagle strefy co najmniej jednego immunochemicznego odczynnika na nieprzerwanym odcinku blony testowej, przylacza sie co najmniej dwie oddzielne ciagle tasmy materialu wkladkowego w pewnej odleglosci od siebie na nieprzerwanym odcinku podkladu, umieszcza sie odcinek tak przygotowanej blony testowej na tasmach materialu wkladkowego tak, aby wymienione odczynnikowe strefy byly ustawione w linii ze szczelina utworzona pomiedzy tymi tasmami materialu wkladkowego, przylacza sie ciagly odcinek przezroczystego materialu przykrywajacego do wymienionych tasm wkladkowych i odcinka blony, a nastepnie tnie sie tak powstaly material wyjsciowy tasmy na paski testowe o zadanym wymiarze. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest pasek testowy do testu immunologicznego oraz sposób wytwarzania paska testowego do testu immunologicznego, który nie wymaga oddzielnych odczynników, aparatury lub urządzeń. Test może być wykonany w sposób prosty przez zanurzenie określonego obszaru paska testowego w płynnej próbce i przez obserwowanie widocznej zmiany w tym pasku występującej w ciągu krótkiego okresu czasu, jako rezultat reakcji immunologicznej i test taki znajduje zwłaszcza zastosowanie w diagnostycznych i środowiskowych badaniach analitycznych.

Testy immunologiczne czyli immunoanalizy opierają się na wykorzystaniu przeciwciał. Przeciwciała zawierają biologiczne odczynniki, które wiążą się z żądanym analitem ze znaczną swoistością. W medycynie klinicznej szeroko rozwinęły się immunoanalizy, gdzie ich czułość i specyficzność jest wysoce cenna. Istniejąjednak wielkie szanse do wykorzystania immunoanaliz także w badaniu środowiska poprzez zaproponowanie niezawodnych testów do wykrywania skażeń w powietrzu, wodzie i glebie oraz w kontroli jakości żywności itp.

Ostatnio wzrosta potrzeba dokonywania analiz różnorodnych substancji zanieczyszczających środowisko. Istnieje potrzeba stwierdzenia ilości tych substancji zanieczyszczających w celu dokonania oceny, czy badane środowisko jest potencjalnie niebezpieczne dla ludzi lub zwierząt.

Istnieje na przykład potrzeba zbadania, czy grunt wokół stacji obsługi zawiera pozostałości paliwa posiadające różnorodne czynniki rakotwórcze, czy występują chorobotwórcze bakterie w wodzie pitnej, czy istnieją rakotwórcze pozostałości pestycydów w warzywach, czy występują pozostałości chemikaliów zapobiegające rozpadowi lub tworzeniu się szlamu w ściekach z przemysłu drzewnego, itd. Gdy stwierdza się, że środowisko zostało zanieczyszczone, istnieje także potrzeba monitorowania procesów oczyszczających na drodze badania. Ponadto, można zapobiec nowym zanieczyszczeniom poprzez badanie dozowania toksycznych chemikaliów przez analizę. W wielu dziedzinach istnieją regulacje prawne określające maksymalne stężenia potencjalnie szkodliwych związków, jak również różnorodne zalecenia, które także wymagają niezawodnych sposobów przeprowadzania badania.

172 246

Z uwagi na fakt, że związki podlegające badaniu w środowisku są tak liczne, istnieje znaczna ilość odmian jeśli chodzi o obecne sposoby prowadzenia badań. Bakterie wykrywane są sposobami hodowli mikrobiologicznej i identyfikacji. Dla innych substancji zanieczyszczających wykorzystywane są tradycyjne sposoby z zakresu chemii analitycznej. Wiele związków rakotwórczych, na przykład pestycydów, jest małymi molekułami zawierającymi aromatyczne pierścienie, a te są odpowiednie dla analizy chromatografii gazowej. Wyniki analizy poprzedzane są często przez procesy ekstrakcji złożonej. W pewnych przypadkach wykorzystuje się badania typu bioanalizy (na przykład toksyny algowe wykrywane są przez badanie skutków na myszach).

Wymienione wyniki badań często wymagają skomplikowanego wyposażenia, a analityczne sposoby są niewłaściwe do wykonywania na dużą skalę. To podnosi koszty badań i stoi na przeszkodzie przeprowadzenia testu tak wielu próbek jak wskazuje na to faktyczna potrzeba. Jedynie niewiele badań natury ogólnej (takich jak badania pH wody lub próbki gleby lub wykrycie określonych metali ciężkich) może być wykonywanych w miejscu pobrania próbki wykorzystując szybkie testy.

Jako przykłady szybkich testów, które przez długi czas były używane w chemii klinicznej mogą być wymienione: testy na określenie pH w moczu, glukozy i białka. Elementy testowe zawierają paski, które są zanurzane w próbce i interpretowane zależnie od kolorowych wzorów w zestawie. Zmiany koloru opierają się zwykle na wskaźnikach pH lub na swoistych reakcjach enzymatycznych.

Metodologia-immunochemiczna była przez długi czas uważana za drogą i skomplikowaną do wykonania. Podczas kilku ostatnich lat jednakże uległy rozwojowi szybkie testy immunochemiczne dla potrzeb chemii klinicznej. Wymienione testy mogą być wykonane przez nieprzeszkoloną osobę w ciągu kilku minut beż żadnego specjalnego wyposażenia, przy czym 'wynik staje się czytelny wizualnie. Ta technika znalazła szczególne zastosowanie w testach ciążowych odpowiednich dla użytku domowego.

Najzwyklejsza techniczna wersja tego rodzaju szybkiego testu ujawnionajest w brytyjskim opisie patentowym nr 2204398, diagnostyczne badanie opiera się o występowanie dwóch przeciwciał. Jedno z nich jest związane z błoną z nitrocelulozy w postaci linii. Drugie przeciwciało związane jest z powierzchnią barwionego lateksu lub cząstkami koloidu zlotowego wysuszonych na tej samej błonie. Test jest przeprowadzany poprzez pochłanianie ciekłej próbki przez wymienioną błonę. Cząstki są uwalniane przez przepływ cieczy, a badany analit wiąże się z przeciwciałami występującymi w wymienionych cząstkach. W drugim miejscu wymieniony analit wiąże się także z drugimi przeciwciałami, które występują na wymienionej linii, a widoczna kolorowa linia utworzona jest po to, aby wykazać obecność wymienionego analitu. Ten rodzaj techniki testu immunochromatograficznego, który opiera się na przepływie po błonie, jest często zwany techniką przepływu poprzecznego.

Powyższa technika może być także wykorzystywana w analizie półilościowej lub ilościowej. Jeśli molekuła analitu jest zbyt mała tak, że jednoczesne związanie dwóch przeciwciał nie jest możliwe, może być stosowana zasada konkurencyjności, gdzie jedynie jedne przeciwciała są wykorzystane i dodatkowo do tego stosuje się analit znakowany. W takim przypadku obecność analitu w próbce jest wykazana, na przykład przez brak występowania linii barwionej.

W immunochemicznym szybkim teście ujawnionym w amerykańskim opisie patentowym nr 5 141 850 próbka pochłaniana jest przez porowatą błonę testową mającą dwie strefy z ruchomymi przeciwciałami jako odczynnikami. Jeden z tych odczynników jest znakowany sygnalną nalepką. Trzecia nieruchoma strefa zawiera substancje zdolne do wychwycenia przeciwciał nie dających informacji sygnalnej. Jeśli próbka zawiera antygen podlegający testowaniu, to zarówno przeciwciała wiążą się z wymienionym antygenem, jak i kompleks z kolei pozostaje związany z nieruchomą substancją wychwytującą, powodując zabarwienie.

Inne proste rozwiązania testów immunochemicznych opisane są, miedzy innymi, w następujących publikacjach patentowych: zgłoszenie europejskie nr PCT/EP86/00055, gdzie wykorzystuje się enzymatyczną zasadę immunologiczną, w której potrzebne są oddzielne odczynniki; Wielkiej Brytanii nr 1 589 234 oraz europejskie nr 225 054, gdzie enzymatyczna reakcja immunologiczna zaczyna się po włożeniu próbki przez zanurzenie jednym końcem paska do roztworu wywołującego reakcję; zgłoszenie europejskie nr 186 799, gdzie test zawiera

172 246 zakładkowe paski posiadające odczynniki, które rozpuszczają się w płynie próbki; zgłoszenie europejskie nr 421 294, który opisuje zastosowanie koloidu selenowego przy wykorzystaniu zasady przepływu poprzecznego i który posiada test i kontrolne przeciwciała powleczone jako znacznik plus na błonie; zgłoszenie europejskie nr 149 168, gdzie reakcja zachodzi w szklanej rurce kapilarnej w warstwach chromatograficznej substancji będącej nośnikiem.

Wyżej wymienione publikacje ze stanu techniki opisują zastosowanie testów immunochemicznych w diagnostyce.

Zgłoszenie europejskie nr 520 202 opisuje natomiast immunochemiczny test, który przeznaczony jest zwłaszcza do przeprowadzenia badań substancji zanieczyszczających środowisko. Testowany analit przenika do warstwy będącej miejscem reakcji zawierającej kompleks przeciwciał na nalepce, gdzie wymieniony analit jest zdolny przemieścić wymienioną nalepkę i zamiast niej połączyć się z wymienioną warstwą. Odłączona nalepka przenika przez warstwę będącą miejscem reakcji do innej warstwy, która jest przezroczysta i stężenie może być bezpośrednio wykryte w sposób wizualny.

Szybki test diagnostyczny opisany jest w opisie patentowym amerykańskim nr 5 104 811 jako posiadający pochłaniającą wkładkę przyłączoną do podkładu paskowego i co najmniej jedną immunochemiczną warstwę reakcyjną przyłączoną w bliskiej odległości od wymienionej wkładki. Przenikanie cieczy od wkładki do warstwy, realizowane jest albo we włóknistej warstwie przejściowej lub w szczelinie kapilarnej pomiędzy warstwą jako miejscem reakcji i podkładem, przy czym wymieniona szczelina jest zamknięta po stronie swych krawędzi.

Ponieważ wykorzystanie testów wzrasta na całym świecie, zwiększa się też potrzeba dokonania postępu w dziedzinie testów, które są tak proste, że mogą być przeprowadzane nie tylko w dobrze wyposażonych laboratoriach, ale,także prawie wszędzie, na przykład w domu, w fabryce lub w warunkach polowych, nawet bez elektryczności lub czystej wody. Powinno być także możliwe przeprowadzenie testu nawet przez osobę nieprzeszkoloną. Wykonanie testu powinno być szybkie, czułe i niezawodne. Budowa paska powinna być dostatecznie prosta, aby umożliwić jego wytwarzanie bez konieczności stosowania skomplikowanych sposobów. Pasek testowy powinien być jednakże dostatecznie mocny, aby sprostać określonym warunkom środowiska.

Istotą paska testowego do testu immunologicznego zawierającego swoiste immunologiczne strefy odczynnikowe oraz posiadające podkład i dołączoną do niego wkładkę końca wejściowego oraz w pewnej odległości od niej ..wkładkę końca. tylnego, pomiędzy którymi umieszczona jest błona testowa umożliwiająca przepływ cieczy, przy czym wymieniona błona umieszczona jest w układzie równoległym względem tego podkładu w pewnej odległości od niego jest to, że podkład z wkładką końca wejściowego oraz wkładką końca wyjściowego i błona ograniczają pomiędzy sobą szczelinę powietrzną, która jest otwarta przy swoich krawędziach.

Korzystnie wkładka końca wejściowego oraz wkładka końca tylnego są z materiału pochłaniającego.

Korzystnie pasek testowy posiada dwa podłoża tworzące z jednej strony nośny podkład i z drugiej strony co najmniej przezroczysty podkład pokryciowy, przy czym obie wkładki i błona testowa umieszczone są pomiędzy podkładem nośnym i podkładem przykryciowym, a wkładki, błona testowa i jeden z tych podkładów ograniczają pomiędzy sobą otwartą przy krawędziach powietrzną szczelinę stanowiącą osłoniętą komorę reakcji.

Korzystnie błona testowa wykonana jest z materiału porowatego takiego jak azotan celulozy, nylon lub z materiału podobnego, przy czym błona testowa jest co najmniej w części przywarta do jednego z tych podkładów.

Wkładka końca wejściowego i błona testowa posiadają co najmniej jedną znakowaną strefę zawierającą ruchome barwione cząstki powleczone odczynnikiem immunochemicznym takim jak-przeciwciała w stosunku do badanego analitu, a błona w obszarze odpowiadającym szczelinie powietrznej zawiera co najmniej jedną testową strefę posiadającą odczynniki immunochemiczne takie jak przeciwciała lub koniugat tego badanego analitu, jak również jedną kontrolną strefę wskazującą właściwy przepływ.

172 246

Znakowane strefy korzystnie posiadają swoiste odczynniki immunochemiczne dla więcej niż jednego badanego analitu i/lub odmienne stężenia jednego lub więcej swoistych odczynników immunochemicznych.

Korzystnie znakowana strefa posiada barwione cząsteczki powleczone przeciwciałami takimi jak przeciwciała monoklonalne HCG, przeciwciała monoklonalne IGFBP-1, zarówno przeciwciała przeciw homoglobinie jak i przeciw albuminie, monoklonalne ciała mogące reagować z toluenem lub przeciwciała monoklonalne przeciw Salmonelli, natomiast testowa strefa zawiera odpowiednio inne przeciwciała monoklonalne HCG, inne przeciwciała monoklonalne IGFBP-1, inne przeciwciała przeciw hemoglobinie i inne przeciwciała przeciw albuminie, koniugat toluenu lub przeciwciała monoklonalne przeciw Salmonelli.

Korzystnie podobny do taśmy podkład posiada przyłączoną do siebie wkładkę końca wejściowego pochłaniającą ciekłą próbkę oraz w pewnej odległości od tej wkładki końca wejściowego wkładkę końca tylnego, przy czym pomiędzy wkładkami umieszczona jest umożliwiająca przepływ cieczy błona testowa, która położona jest w układzie równoległym w stosunku do podkładu w pewnej odległości od niego tak, że ogranicza szczelinę powietrzną pomiędzy tym podkładem, wkładkami i błoną i która to szczelina powietrzna pozostaje otwarta przy swoich krawędziach stanowiąc osłoniętą komorę reakcji oraz co najmniej jeden analit środowiskowy i swoisty odczynnik - immunochemiczny zawarty jest odpowiednio w znakowanych i testowych strefach paska testowego.

Korzystnie podobny do taśmy podkład posiada przyłączoną do siebie wkładkę końca wejściowego pochłaniającą ciekłą próbkę oraz w pewnej odległości od tej wkładki końca wejściowego wkładkę końca tylnego, przy czym pomiędzy wkładkami umieszczona jest umożliwiająca przepływ cieczy błona testowa, która położona jest w układzie równoległym w stosunku do podkładu w pewnej odległości od niego tak, że ogranicza szczelinę powietrzną pomiędzy tym podkładem, wkładkami i błoną i która to szczelina powietrzna pozostaje otwarta przy swych krawędziach stanowiąc osłoniętą komorę reakcji oraz co najmniej jeden diagnozowany analit i swoisty odczynnik immunochemiczny zawarty jest odpowiednio w znakowanych i testowych strefach paska testowego.

Z kolei istotą sposobu wytwarzania paska testowego do testu immunologicznego jest to, że wzdłużnie rozprowadza się i suszy się oddzielne ciągłe strefy co najmniej jednego immunochemicznego odczynnika na nieprzerwanym odcinku błony testowej, przyłącza się co najmniej dwie oddzielne ciągłe taśmy materiału wkładkowego w pewnej odległości od siebie na nieprzerwanym odcinku podkładu, umieszcza się odcinek tak przygotowanej błony testowej na taśmach materiału wkładkowego tak, aby wymienione odczynnikowe strefy ustawione były w linii ze szczeliną utworzoną pomiędzy tymi taśmami materiału wkładkowego, przyłącza się ciągły odcinek przezroczystego materiału przykrywającego do wymienionych taśm wkładkowych i odcinka błony, a następnie tnie się tak powstały materiał wyjściowy taśmy na paski testowe o żądanym wymiarze.

Korzystnie na odcinku błony lub na jednej z taśm materiału wkładkowego rozprowadza się i suszy co najmniej jedną ciągłą strefę odczynnika znakowanego.

Niniejszy wynalazek zapewnia pasek testowy posiadający budowę, która jest prosta i korzystana ze względu na jego wytwarzanie. Test może być przeprowadzony łatwo poprzez zanurzenie paska testowego do próbki i obserwowanie wyniku. Pomimo paskowego kształtu konstrukcji testu, zasadnicze reakcje mają miejsce w osłoniętej szczelinie, o kształcie zbliżonym do komory. Warstwowa struktura paska testowego umożliwia także korzystny sposób przemysłowego wytwarzania i pakowania.

Przedmiot wynalazku przedstawiony został na rysunku, na którym fig. 1 jest widokiem perspektywicznym korzystnego przykładu wykonania paska testowego według wynalazku, fig. 1A pokazuje widok oddzielnych części, w rozłożeniu, przykładu wykonania z fig. 1, fig. 2 pokazuje błonę testową używaną w pasku testowym według wynalazku oraz strefy zgodnie z jednym z jego przykładów wykonania, a fig. 3 przedstawia schematyczny przekrój poprzeczny drugiego przykładu wykonania paska testowego według wynalazku.

172 246

Figury 1 i IA przedstawiają korzystny przykład wykonania paska testowego według niniejszego wynalazku. Tylna strona paska testowego, ogólnie wskazanego przez oznacznik cyfrowy 10, utworzona jest przez podkład 1 wykonany z tworzywa sztucznego lub z jakiegoś innego odpowiednio sztywnego materiału. Oba końce wymienionego podkładu 1 zaopatrzone są w stosunkowo cienkie wkładki 3,5. Wymienione wkładki korzystnie wykonane są z materiału, który posiada wysoki stopień zdolności absorbcyjnej i jest chemicznie obojętny. Na wejściowym końcu wkładka 3 może być poddana działaniu różnych substancji w celu zwiększenia jej zdolności absorpcyjnej i dla wzrostu przezeń prędkości przepływu cieczy. Występująca we wkładce 3 strefa 7 zawiera wysuszony znakowany odczynnik.

Błona testowa 2, która znajduje się tam, gdzie faktyczna reakcja podlegająca wykryciu będzie mieć miejsce, usytuowana jest na i pomiędzy pochłaniającymi wkładami 3 i 5.

Pochłaniające wkładki 3 i 5 rozdzielone są szczeliną 4, która jest dostatecznie długa, aby rozciągnąć się ponad obszarem reakcji w błonie testowej 2, tj. obszarem zawierającym strefę lub strefy reakcji. Strefy leżące przy szczelinie 4 zawierają co najmniej jedną swoistą linię przeciwciał 8 i kontrolną linię 9. W czasie wytwarzania paska testowego 10, błona testowa 2 umieszczona jest na górze wkładek 3 i 5 w taki sposób, aby odkryta odczynowa strona testowa błony 2 była zwrócona w stronę szczeliny 4. Obszar styku pomiędzy błoną 2 oraz odpowiednio wkładkami 3 i 5 musi być dostatecznie duży dla utworzenia i utrzymania przepływu cieczy.

Powyższy układ tworzy strukturę, w której powierzchnia reakcji w błonie testowej 2 nie pozostaje w styku z jakimkolwiek materiałem. Natomiast pomiędzy błoną testową 2 i podkładem 1 znajduje się szczelina 4, która to szczelina może być opisywana jako mała komora, otwarta z obu stron, gdzie przepływ cieczy na błonie testowej 2 pozostaje niezakłócony. Pochłaniające wkładki 3 i 5 korzystnie posiadają grubość około 0,5-3 mm tak, aby szczelina 4 była wąska. Ponieważ szczelina 4 jest wąska, atmosfera w komorze reakcji ustala jej wilgotność i wszelkie suszenie powodowane przez ciąg powietrza nie zakłóci przepływu cieczy.

W innym przykładzie wykonania przykryciowy podkład 6 korzystnie dołączony jest na górze błony 2 i wkładek 3 i 5. Wymieniony przykryciowy podkład 6 może być przezroczystym arkuszem, korzystnie o tym samym wymiarze jak pasek testowy 10 i wykonany, na przykład, z przezroczystego tworzywa sztucznego, takiego jak PCV, PE lub PC.

Wymieniony przykryciowy podkład chroni błonę 2 oraz wkładki 3 i 5, powstrzymuje ciecze przed wyparowaniem, a także wzmacnia konstrukcję. Z uwagi na fakt, że podkład 6 jest przezroczysty wynik testu będzie wobec tego widoczny. Przykryciowy podkład może być pomalowany w odpowiedni sposób lub też może być zaopatrzony w taśmę lub taśmy (nie pokazane), które ułatwiają interpretację testu przez pokrycie innych części wymienionego paska z wyjątkiem obszaru, gdzie utworzone są linie testowe.

Podkład 6 może być także wykonany z materiału nieprzezroczystego, mającego nacięty w nim otwór lub otwory, dla umożliwienia odczytania wyniku testu. Alternatywnie, podkład 1 może być przezroczysty, a reakcja może być obserwowana przez szczelinę 4.

Figura 2 przedstawia inny przykład wykonania stref odczynnikowych, w którym wszystkie strefy zostały rozmieszczone na błonie testowej 2. Oznacznik cyfrowy 7 wskazuje strefę, w której cząstki użyte jako nalepka zostały osuszone na warstwie osuszonego roztworu cukru, strefy 8’ i 8” zawierają przeciwciała swoiste dla dwóch odmiennych analitów, a strefa 9 posiada kontrolne przeciwciała z nią związane.

Test oparty jest na zasadzie przepływu poprzecznego. Tak więc reakcja zachodzi na błonie testowej 2, chemiczne właściwości której są tak dobrane, aby możliwe było umieszczenie na nięj przeciwciał i innych substancji potrzebnych przy reakcji. Wymieniona błona powinna być porowata w sposób odpowiedni dla utworzenia przezeń przepływu cieczy i dla umożliwienia substancjom potrzebnym do wykrycia (jak na przykład lateks, koloidy metalu lub innych cząsteczek jak również rozpuszczalnych molekuł), aby były przeniesione przez ten przepływ.

Odpowiednim materiałem dla błony testowej 2 jest azotan celulozy.Wymieniona błona może być alternatywnie wykonana z nylonu lub z określonego innego odpowiedniego materiału.

Jeśli błona testowa 2 jest bardzo cienka, korzystne jest przyłączenie jej do własnego podparcia (nie pokazanego na fig.). To ułatwia jej obróbkę podczas procesów powlekania, które

172 246 poprzedzają złożenie testu. Jeśli odkrycie odczynu ma być widoczne po stronie mającej wymienione podparcie błony, to podparcie to powinno być przezroczyste.

Ilość i położenie stref na błonie testowej 2 może ulegać zmianie w zależności od testowanego analitu. Ta sama błona może zawierać szereg odczynników do wykrywania różnych analitów w tej samej próbce lub odpowiednio, do wykrywania różnych stężeń tego samego analitu. Pasek może także zawierać kilka błon testowych. W takim przypadku musi zachodzić nieprzerwany przepływ pomiędzy nimi, co może być osiągnięte, na przykład, poprzez umieszczenie wymienionych błon co najmniej częściowo na górnej powierzchni względem siebie nawzajem lub poprzez umieszczenie porowatej i wzajemnie łączącej błony pomiędzy nimi.

Używając paska testowego według niniejszego wynalazku możliwe jest wykonanie testu, na przykład testu ciążowego, testu żywności w kierunku pałeczek listeriozy lub testu na obecność atrazyny w wodzie przez zanurzenie wejściowego końca paska 10 do określonego poziomu w próbce lub wyciągu początkowej próbki. Ciecz pochłaniana będzie do środka wkładki 3 po stronie wejściowego końca, stąd przenikać będzie dalej do błony testowej 2. Kontrolna linia 9 stanie się widoczna jak tylko przepływ cieczy dojdzie do tej linii. Gdy test opiera się na zasadzie immunometrycznej, jest on dodatni jeśli inna swoista linia testowa została także zabarwiona.

Figura 3 przedstawia alternatywny przykład wykonania paska testowego według niniejszego wynalazku, w którym nośny podkład 1 podtrzymuje na sobie porowatą błonę testową 2. W pewnej odległości od wejściowego końca wymienionej błony znajduje się chemicznie obojętna podpierająca wkładka 3. Inna podpierająca wkładka 5 dołączona jest do przeciwnego końca połączenia błona-podkład tak, że pomiędzy wkładkami 3 i 5 pozostaje pusta przestrzeń. Na górze wkładek 3 i 5 dołączony jest przykryciowy podkład 6 dla zakrycia wymienionych wkładek w sposób, który powoduje utworzenie szczeliny 4, która jest otwarta po stronie swych krawędzi. Podkład 1 lub podkład 6 albo też podkład i pokrycie wykonane są z materiału przezroczystego.

W tym przykładzie wykonania błona testowa 2 działa jednocześnie jako wkładka absorbcyjna, a ciecz pochłaniana jest bezpośrednio do środka wymienionej błony. Korzyścią takiego rozwiązania jest prostota konstrukcji oraz fakt, że przepływ cieczy nie jest zależy od połączenia przepływu pomiędzy wkładką pochłaniającą a błoną testową. Podkład 6 i/lub wkładka 3 może posiadać także wydłużenie równe podkładowi 1, w którym to przypadku ciecz jest pochłaniana do środka błony testowej 2 poprzez jej odkryte krawędzie.

W trakcie używania ważne jest unikanie zanurzenia stref błony testowej w płynie próbki. Reakcje mogą wystąpić jedynie w czasie, gdy początek objętości cieczy postępuje wzdłuż błony. Zatem, głębokość zanurzenia powinna być wskazana użytkownikowi, a najkorzystniej jest, gdy poziom zanurzenia zaznaczony jest na samym pasku.

Jednym ze sposobów przeprowadzenia testu jest zanurzenie wejściowego końca paska testowego 10 do środka próbki do wysokości zaznaczonej linii do chwili, gdy pochłaniająca wkładka 3 na wymienionym wejściowym końcu pochłonie dostateczną ilość cieczy; po czym natychmiast pasek testowy może zostać usunięty z próbki i pozostawiony z boku dopóki nie pojawią się linie.

W celu zapewnienia niezakłóconego przeniknięcia początkowej objętości cieczy do błony testowej, korzystne jest użycie błony, która poddana została działaniu odpowiednich substancji, które ułatwiaj ą pobranie cieczy (na przykład detergentu takiego jak Tween 20, wytwarzany przez BioRad Laboratories, w Stanach Zjednoczonych) i które powodują odpowiedni ładunek elektryczny w stosunku do przenikających cząstek (na przykładjony buforowe). Niepoddana procesom chemicznym błona może także być poddana działaniu substancji przed rozmieszczeniem na niej swoistych stref testowych poprzez zanurzenie tej błony w odpowiednich roztworach i przez jej suszenie w następnej operacji.

Odczynniki, takie jak wymienione powyżej, które udoskonalają funkcje testowe, mogą być także dodane przez ich suszenie na pochłaniającej wkładce 3 lub na wejściowym końcu błony testowej 2. Uwolnienie znakowanych cząstek od wymienionej błony przez przepływ cieczy może być ułatwione przez osuszenie odpowiedniej mieszaniny, takiej jak roztwór cukru, poniżej strefy występowania cząstek. Konstrukcja korzystnych rozwiązań pasków testowych według niniejszego wynalazku, w których pochłaniające wkładki i pochłaniająca błona przewi172 246 dziane są pomiędzy przykryciowym podkładem a nośnym podkładem, umożliwia proste przeprowadzenie testu. Próbka nie musi być odmierzana do testu pipetą, ponieważ absorbcja nie jest hamowana w czasie, gdy pasek zanurzony jest w płynie. W przestrzeni, zbliżonej do komory i ukształtowanej przez wąską szczelinę 4 w pasku przepływ osłaniany jest przed zakłóceniami i suszeniem spowodowanym przez ciąg powietrza.

Jest oczywiste, że paski testowe według niniejszego wynalazku mogą być przygotowane pojedynczo wykorzystując wstępnie przecięte części o odpowiednim wymiarze. Jednakże dzięki temu, że pasek testowy według wynalazku posiada strukturę warstwową, która jest otwarta po stronie jego krawędzi, możliwe było opracowanie sposobu jego wytwarzania w skali przemysłowej, który jest szybki, automatyczny i ekonomiczny. Tak więc błona testowa, ze swoimi strefami odczynników może być wstępnie wytwarzana na specjalnej linii produkcyjnej, a następnie pasek testowy może być złożony na innej linii produkcyjnej, poprzez stworzenie struktury warstwowej różnorodnych części składowych paska w formie długiej taśmy paska testowego.

Błona testowa korzystnie wytwarzana jest na linii produkcyjnej, skąd odwijany jest zwój materiału błony testowej, poddawany następnie obróbce chemicznej i ponownemu nawinięciu na zwój. Odczynniki potrzebne dla błony testowej są rozprowadzane i suszone jako linie ciągłe na materiale błony. W ten sposób czuła błona testowa będzie poddawana obróbce chemicznej, w tak niewielkiej ilości etapów mechanicznych, jak to jest tylko możliwe i będzie chroniona przed uszkodzeniem. Przyjęty i zgodny odczynnik, rozmieszczony na błonie, może być obserwowany i sprawdzany w prosty sposób przez monitorowanie szerokości linii odczynnika przechodzącej przed optycznym przyrządem detekcyjnym. Równomierne rozprowadzenie odczynnika ważne jest w aspekcie przeprowadzenia testu w sposób niezawodny. Ponieważ technika wytwarzania jest szybka, błona testowa pozostanie jedynie przez bardzo krótki czas pod wpływem niekontrolowanych czynników zakłócających, takich jakie mogą wystąpić w otaczającym powietrzu.

Wszystkie materiały dla złożenia paska testowego korzystnie dobrane zostają tak, aby dostępne były w postaci zwojów. Linia produkcyjna paska testowego jest tak zaprojektowana, aby móc podawać różnorodne materiały, w tym także błonę testową, ze zwojów we właściwej kolejności jeśli chodzi o warstwowe nakładanie jednej warstwy na górze drugiej warstwy, na przykład przez klejenie.

W typowym sposobie produkcji klej, taśma przylepna lub tym podobne materiały są przykładane do taśmy podkładu, która podawana jest ze zwoju materiału zawierającego podkład. Po tej operacji materiały wkładek podawane są ze swoich zwojów na z góry określone powierzchnie taśmy podkładu w pewnej odległości od siebie tak, aby pomiędzy nimi została utworzona szczelina.

Szczególnie materiał wkładki, który jest przewidziany do formowania wkładki po stronie wejściowego końca może być wstępnie poddany działaniu substancji, które polepszają przepływ cieczy. Wymieniony materiał na wkładki może być także dostarczany wraz z odczynnikiem swoistym dla danego testu. Wstępnie poddany obróbce chemicznej materiał błony testowej odwijany jest ze swojego zwoju i umieszczany jest w takim położeniu na górze i pomiędzy taśmami materiału wkładek. Wymieniona błona może posiadać na jednej stronie warstwę ochronną, w którym to przypadku strona zawierająca odsłonięte odczynniki powinna być zwrócona w stronę wymienionej szczeliny. Przezroczysta taśma z tworzywa jest w końcowym etapie podawana ze zwoju materiału przykrywającego i dołączona do połączenia utworzonego przez błonę i wkładki na wymienionym podkładzie. Materiał przykrywający przywiera do taśm materiału wkładek oraz także do materiału błony testowej, co najmniej na swych końcach. Na koniec taki układ warstwowy jest równomiernie ściskany dla zapewnienia przylegania.

Ponieważ linia produkcyjna działa w sposób ciągły, jednorodna jakość każdego pojedynczego paska testowego może być z łatwością monitorowana. I tak, na przykład, możliwe jest sprawdzenie, czy zachowane są tolerancje mechaniczne. Linia produkcyjna może łatwo i szybko być dostosowana do spełnienia wymogów dla różnorodnych testów poprzez zmianę odczynników i/lub szerokości zwojów materiału używanego do laminowania.

172 246

Długi materiał paska testowego wyprodukowany po laminowaniu jest cięty na paski testowe o żądanej szerokości na końcu linii produkcyjnej. Nowe odcinki powstałe z wymienionego cięcia zapewniają, że krawędzie wkładek absorbcyjnych posiadają jednorodną jakość, a zatem i to, że próbka będzie pobierana w sposób powtarzalny i równomierny. To z kolei wpłynie korzystnie na dokładność wyniku testu.

Gotowe paski testowe mogą być pakowane w sposób tradycyjny w pojedyncze paczki (na przykład torebki z tworzywa warstwowego zawierające woreczek wiążący wilgoć). Jednakże, ponieważ konstrukcja pasków testowych według niniejszego wynalazku jest lekka i mała, wymienione paski mogą także być korzystnie pakowane, na przykład, w rurki zbliżone kształtem do cylindra, takie jak rurki aluminiowe, które nie przepuszczają wilgoci, są odporne mechanicznie i łatwe do trzymania.

Pasek testowy według niniejszego wynalazku może być używany na przykład do testów ciążowych. Test ten może być przeznaczony do wykonania bezpośrednio wykorzystując mocz lub surowicę, a analit podlegający określeniu byłby ludzkim komórkowym hormonem gonadotropowym (HcG) wydzielanym przez łożysko. Pasek testowy może jednak być przystosowany także dla wielu innych testów diagnostycznych, gdzie występowanie lub nieobecność pewnego szczególnego związku wykrywana jest w próbce, przy czym związek ten połączony jest z występowaniem choroby lub stanu patofizjologicznego lub jest sztucznie wprowadzony do organizmu. Ten rodzaj dodatniego/ujemnego testu jest zwłaszcza odpowiedni dla diagnozy zakażeń spowodowanych przez drobnoustroje.

Próbka może być płynem takim jak surowica, gdy ma miejsce wykazanie obecności czynników reumatoidalnych w chorobie reumatycznej lub moczem, gdy wykazuje się obecność wycieku albuminy, która jest spowodowana przez uszkodzone nerki, lub płynem rdzeniowym, przy wykazywaniu obecności bakterii powodujących zapalenie opon mózgowych.

Próbka może być także śluzem lub ciałem stałym, w których to przypadkach związek podlegający testowaniu jest najpierw ekstrahowany w odpowiednim płynie. Przykładem takiego przystosowania jest wykrycie antygenów chlamydii w próbce, która została pobrana z błony śluzowej narządów moczowo-płciowych pacjenta. Zatem, próbka może być pobrana z błony śluzowej gardła w celu wykrycia, na przykład, paciorkowca typu A.

Krew utajona w stolcu, co jest związane z rakiem jelit, może być wykryta w próbce kału przy użyciu paska testowego według niniejszego wynalazku dla wykazania w tej próbce ludzkiej hemoglobiny. Obecność pneumokok powodujących zapalenie płuc może zostać wykryta w próbce plwociny. Pęknięcie błon płodowych może być wykryte poprzez wykazanie obecności białka zwanego IGFBP-1 w próbce wydzieliny pochwowej. Jeżeli w tym samym teście wykazywane są dwa odmienne znakowane stężenia przeciwciała monoklonalnego przeciw IGFBP-1 możliwe staje się wykrycie niskiego stężenia związanego ze skłonnością do porodu lub wysokiego stężenia spowodowanego rozerwaniem błon płodowych. Możliwe jest także wykazanie obecności przeciwciał związanych z zakażeniem, takich jak przeciwciała klasy IgG przeciw Helicobacter pylori w surowicy.

Wymienione bakterie zostały uznane za ważny czynnik etiologiczny we wrzodzie żołądka.

Pasek testowy według niniejszego wynalazku może zostać także przystosowany dla wielu testów z zakresu badania środowiska. Niniejszy pasek testowy dostarcza wielu korzyści w porównaniu z tradycyjnymi sposobami. Test jest szybki, niedrogi i łatwy do wykonania.

W stanie techniki nie ma sposobu wykonywania testów o podobnej czułości i specyficzności w ciągu jedynie paru minut. Samo wykonanie testu nie wymaga żadnego specjalistycznego wyposażenia, a personel nie musi przechodzić żadnego specjalistycznego szkolenia. Wstępna obróbka próbki jest znacznie bardziej prosta od tego co jest wymagane w większości tradycyjnych sposobów. Specyficzność sposobu immunochemicznego opiera się na swoistości przeciwciał i dlatego żaden szczególny etap obejmujący oczyszczanie próbki nie jest potrzebny. Wystarczające jest tylko to, aby próbka była przemieniona do postaci płynnej.

Znane są anality, które nie są dobrze przystosowane dla oznaczeń wykorzystujących tradycyjne chromatograficzne i inne odpowiadające sposoby, ale które są dobrze przystosowane do technik immunologicznych (na przykład, wszystkie białka). Dlatego niniejszy wynalazek proponuje możliwość dla całkowicie nowych testów.

172 246

Ponieważ testy są tanie oraz łatwe do wykonania, ich dostateczna ilość może być wykonana, na przykład, w celu dokładnego zbadania skażonego obszaru i monitorowania sytuacji przez dostatecznie długi okres czasu. Dostatecznie duże pobranie próbek może być dokonane z artykułów spożywczych. Właściciel szklarni może obserwować glebę oczyszczoną z pestycydów (obecnie nie ma żadnego innego sposobu niż odczekiwanie przez pewien czas, który wydaje się zbyt długi). Nawet drobni producenci żywności mogą dysponować dobrymi środkami wykorzystującymi dalsze opracowania w zakresie czystości produktów żywnościowych.

Wykorzystując pasek testowy według niniejszego wynalazku mogą być rozwijane różnego rodzaju systemy badań skryningowych. Szybki test może być przeznaczony, na przykład, do wykrycia pewnej grupy substancji (wieloaromatycznych węglowodorów, aflatoksyn itp.) z tym, że próbki są następnie dalej poddawane analizie pod kątem występowania różnorodnych związków przy użyciu bardziej złożonego sposobu laboratoryjnego, jeśli uzyskano wynik dodatni w teście badań skryningowych na miejscu badania. Szybkie badanie skryningowe pojedynczego analitu może być także wykonane przy wykorzystaniu testu jakościowego (przez wykazanie, że stężenie jest wyższe niż poziom dopuszczalny), a dokładniejsze badanie może być wtedy wykonane poprzez wykorzystanie wolniejszego, ale bardziej czułego jakościowego sposobu laboratoryjnego, jeśli uzyskano dodatni wynik badania skryningowego.

Odpowiednie środowiskowe adaptacje paska testowego według niniejszego wynalazku, które są warte wymienienia, to na przykład badanie obszarów ze skażoną glebą i wodą w celu odkrycia ich stężeń PCP lub PCB lub dla wykrycia aromatycznych lub chlorowanych węglowodorów alifatycznych. Na obszarach przemysłowych monitorowaniu może być poddana ewentualna emisja chemikalii takich jak, na przykład, związki olejowe, rozpuszczalniki i pestycydy. Występowanie różnorodnych toksyn, antybiotyków, histaminy, mikroorganizmów lub pestycydów może być przedmiotem badania w produktach spożywczych. Związki rakotwórcze takie jak benzopiren mogą być określane na podstawie uchodzącego gazu. W skażonej glebie mogą być wykryte toluen i odnośne związki zawierające aromatyczne struktury pierścieniowe, które są używane jako znaczniki dla paliwa z ropy naftowej.

Ponieważ przykłady ilustrują niniejszy wynalazek, jednakże bez ograniczania go w żaden sposób.

Przykład I. Test ciążowy.

Przygotowanie nalepki. W celu przygotowania paska testowego według wynalazku cząstki niebieskiego lateksu zostały powleczone przeciwciałem monoklonalnym przeciw HCG. Wymiar cząsteczek wynosił 200 nm. Nalepka wykrywająca wykonana w ten sposób była przechowywana jako zawiesiny w mieszaninie buforowej.

Przygotowanie błony testowej (wariant 1). Materiałem użytym do przygotowania błony testowej był azotan celulozy, który został przyłączony do cienkiego przezroczystego podkładu z tworzywa sztucznego. Błona miała długość 30 mm. Roztwór cukru został wysuszony w 9 mm strefie od jednego końca błony, a następnie nalepka opisana powyżej została umieszczona na strefie suchego cukru. Druga wąska strefa została położona 18 mm od wymienionego końca tej błony, przy czym wymieniona druga strefa zawiera roztwór innego przeciwciała monoklonalnego w stosunku do HCG w mieszaninie buforowej. Trzecia wąska strefa została umieszczona 2 mm od strefy drugiej, przy czym ta trzecia strefa posiada przeciwciała w stosunku do immunoglobuliny myszy.

Przygotowanie błony testowej (wariant 2). Wykorzystano ten sam materiał jak w wariancie 1, ale jedynie druga i trzecia strefa zostały rozmieszczone na nim. Natomiast nalepka z lateksu wymienionej pierwszej strefy była osuszona w absorpcyjnej wkładce użytej po stronie wejściowej końca paska testowego.

Złożenie paska testowego. Biały arkusz poliestrowy został pocięty na kawałki o wymiarze 6 mm x 120 mm ctell^im przygotowania podkładki dla paska tt^.sl^cowtego. Materiał zastosowany do przygotowania pochłaniających wkładek na obu końcach paska testowego był włóknem sztucznego jedwabiu o grubości warstw około 1 mm pomiędzy dwiema bibułkami z polietylenu. 30 mm kawałek materiału wkładki został przyłączony do wejściowego końca podkładu, a odpowiednio 70 mm kawałek został przyłączony do przeciwległego końca. W wariancie 2, wkładka leżąca po stronie wejściowego końca została zaopatrzona w odczynnik nalepkowy.

172 246

Sucha błona testowa, przygotowanajak opisano powyżej, została umieszczona na górze wkładek tak, że zachodziła na obie wkładki na około 5 mm przy każdym końcu. Powleczona strona na podłożu z azotanu celulozy została zwrócona do dołu w kierunku pustej szczeliny, w wyglądzie zbliżonym do komory, utworzonej pomiędzy wkładkami, podkładem i błoną. Przykrywający arkusz podpierający z przezroczystego poliestru pocięty został na kawałki o wymiarach odpowiadających wymiarom podkładu. Przykrycie zostało przyłączone do wkładek i częściowo także do błony na odcinku kilku milimetrów. Do obu końców przykrycia przyłączona została nieprzezroczysta taśma tak, aby jedynie 10 mm szerokości przestrzeń pozostała niezakryta w miejscu, gdzie utworzona została linia swoista i linia kontrolna.

Złożeniu uległo kilka pasków testowych tak, że błona testowa została dołączona do podparcia podkładu w taki sposób, aby reaktywna strona z azotanu celulozy skierowana była w kierunku do góry. Wkładki zostały usytuowane przy zachowaniu styczności z każdym końcem błony testowej w sposób odpowiadający temu opisanemu powyżej.

I dalej, przezroczyste przykrycie przyłączone zostało do części górnej, a powierzchnia zawierająca azotan celulozy nie została pokryta żadnym klejem. Różnica wyniku porównana ze złożeniem testu opisanym powyżej polega na tym, że szczelina o wyglądzie zbliżonym do komory została utworzona powyżej błony, a nie pod nią.

Wykonanie testu ciążowego.

1. Wejściowy koniec paska testowego zanurzony został w próbce na głębokość 20 mm.

2. Pasek został usunięty z próbki.

3. Po 5 minutach, ilość niebieskich linii pojawiających się na pasku testowym została opisana, a wynik został zinterpretowany.

Interpretacja wyniku.

W swoistej linii zastosowano taką ilość przeciwciał, aby stężenie HCG wynoszące około 50IU/1 było najniższe, co mogło sprawić, że dostateczna część nalepki uległa związaniu tak, aby pojawiła się widoczna linia, a test został zinterpretowany jako dodatni. Przeciwciała przeciw immunoglobulinie myszy, które zostały zastosowane w linii kontrolnej związały się nieswoiście z nalepką przeniesione przez przepływ płynu, ponieważ nalepka została pokryta przeciwciałami myszy należącymi do klasy IgG. Roztwory zostały dodane w takich stosunkach, że nawet przy wysokim stężeniu HCG, występowała dostateczna ilość nalepki, która nie wiązała się ze swoistą linią tak, by mogła utworzyć się kontrolna linia wskazująca, że przepływ płynu nastąpił we właściwy.sposób i że test zadziałał. Pojawienie się niebieskiej linii kontrolnej wykazało, że test zadziałał -w sposób niezawodny.

Wyniki serii testu przedstawiono w tabeli 1 poniżej. Do próbki dodano znane ilości HCG, a próbka, co było wiadome, była ujemna.

Tabela 1

Stężenie HCG w próbce (IU/1)	Linia swoista	Linia kontrolna	Interpretacja
0	-	+	ujemny
25	-	+	ujemny
100	+	+	dodatni
1.000	+	+	dodatni
10.000	+	+	dodatni
100.000	+	+	dodatni
200.000	+	+	dodatni

Paski testowe, w których błona została dołączona do podkładu dały identyczny wynik.

Przykład II. Test na wykrycie przerwania błon płodowych.

Test na wykrycie przerwania błon płodowych opiera się na wskazaniu obecności IGFBP-1 (insulino-podobny czynnik wzrostowy wiążący proteinę-1), w próbce wydzieliny pochwowej. Nalepka, błona testowa i złożenie paska testowego nastąpiło w ten sposób jak w przykładzie I, z wyjątkiem tego, że ponieważ proteiną podlegającą określeniu była IGFBP-1, przeciwciała

172 246 zastosowane w nalepce i w linii swoistej były przeciwciałami monoklonalnymi w stosunku do IGFBP-1.

Próbka. Próbka wydzieliny pochwowej została pobrana przy pomocy sterylnego gazika z dakronu. Próbka, która została pochłonięta do środka gazika została ekstrahowana w rozcieńczeniu buforowym w z góry określonym stosunku.

Wykonanie testu.

1. Wejściowy koniec paska testowego został zanurzony na głębokość 20 mm do ekstraktu próbki.

2. Pasek został usunięty z próbki.

3. Po 5 minutach, odnotowano ilość niebieskich linii pojawiających się na pasku testowym, a wynik został zinterpretowany.

Wyniki serii testu przedstawione są w tabeli 2 poniżej. W roztworze solnym rozcieńczono płyn owodniowy (stężenie IGFBP-1 w próbce płynu owodniowego było znane).

Tabela 2

IGFBP-1	Linia swoista	Linia kontrolna	Interpretacja
(kg/l)
0	-	+	ujemny
20	-	+	ujemny
200	+	+	dodatni
500	+	+	dodatni
1.000	+	+	dodatni
50.000	+	+	dodatni

Przy użytym rozcieńczeniu w teście, stężenie IGFBP- 1 o wartości 200 mg/l może być uważane za zbyt wysokie, aby w próbce wydzieliny pochwowej mogło ono być jedynie spowodowane przez obecność płynu owodniowego i aby mogło być zinterpretowane jako wskazanie, że błony płodowe uległy pęknięciu.

Przykład III. Test na wykrycie krwi utajonej w stolcu (dwa anality).

Test ten jest przeznaczony do wykrywania krwi utajonej w stolcu, która występuje po krwawieniu w jelitach osób chorych na raka. Test jest sporządzony z zamysłem, aby oprzeć się na wykazaniu obecności zarówno hemoglobiny ludzkiej jak i ludzkiej albuminy. Hemoglobina jest bardziej swoistym znacznikiem krwi ponieważ albumina może przedostać się do stolca jako rezultat wyciekania białka, które nie ma związku z występowaniem raka Albumina, z kolei jest bardziej trwała w stolcu niż hemoglobina.

Nalepka, błona testowa i złożenie paska testowego zostały wykonane w ten sposób jak w przykładzie I, z wyjątkiem tego, że ponieważ mają zostać wykryte dwa anality przygotowana została mieszana nalepka, która zawierała cząstki powleczone przeciwciałami hemoglobiny jak również cząsteczki pokryte przeciwciałami albuminy. Zgodnie z tym, na błonie zastosowano dwie odmienne linie swoiste. Przy ich zastosowaniu wzięto pod uwagę fakt, iż test musi być tak czuły jak tylko jest to możliwe.

Próbka. Mała próbka stolca została zawieszona w roztworze buforowym. Zawiesina, która powinna okazać się na tyle jednorodna na ile jest to możliwe, została przefiltrowana, a filtr został przekazany do rurki testowej.

Wykonanie testu.

1. Wejściowy koniec paska testowego zanurzony został w filtrze na głębokość 20 mm.

2. Pasek został usunięty z próbki.

3. Po 5 minutach, ilość niebieskich linii pojawiających się na pasku testowym została odnotowana, a wynik został zinterpretowany.

Pojawienie się jednej linii oznaczało, że test był ujemny, a trzy linie, że test był dodatni. Jeśli pojawiły się jedynie dwie linie, zaleca się aby pobrana została nowa próbka.

172 246

Przykład IV. Test na wykrycie toluenu w glebie.

Przygotowanie przeciwciał. Stosowanie mysich przeciwciał monoklonalnych, skierowanych przeciw toluenowi ulega rozwojowi z wykorzystaniem sposobów znanych specjalistom z tej dziedziny (patrz na przykład publikacja: J. Immunol. Methods 1981; 46:337-345 autorstwa Stenman U.-H. i inni). Istotą rzeczy antygenu będącego antygenem resztkowym jest to, że myszy są immunizowane związkiem pochodnym antygenu o większej względnej masie cząsteczkowej. Dlatego kwas tolylo-octowy jest kowalentnie związany z surowiczą albuminą bydlęcą (BSA) dla immunizacji (co do wiązania i stosowania wielkości łączonych w immunizacji - patrz publikacja Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Tom 19, autorstwa Muller S. oraz Burdon R. H. i van Knippenberg P. H., Elsevier, Amsterdam 1988 rok, strony 95-130 lub Hudson L. i Hay F. C., Practical Immunology, Blackwell Oxford 1983 r., strony 1-23). Przy badaniu skryningowym przeciwciał wykorzystywany jest test radioimmunologiczny.

Radioaktywna nalepka potrzebna w tym sposobie przygotowana jest jak następuje: kwas tolylo-octowy jest związany z nośnikiem peptydowym zawierającym co najmniej jedną pozostałość tyrozyny (co się tyczy wiązania - patrz wyżej), a koniugatem jest wielkość związana z radioaktywnym jodem wykorzystująca standardowy sposób z preparatem chloraminy T. Uzyskane monoklonalne ciała mogące reagować z toluenem testowym są w reakcjach krzyżowych z odnośnymi związkami znalezionych w paliwach. W takim przypadku reakcje krzyżowe nie są szkodliwe, ale pożądane, ponieważ przeciwciała mają być wykorzystane w teście, gdzie każdy znacznik zanieczyszczenia paliwem może powodować wynik dodatni.

Przygotowanie paska. Nalepka, błona testowa i złożenie paska testowego są wykonanetak, jak to opisano w przykładzie I, z wyjątkiem tego, że swoista linia w błonie przygotowana jest poprzez powleczenie antygenem (koniugatem kwasu tolylo-octowego i nośnika peptydowego) zamiast drugiego przeciwciała. Przeciwciała związane z cząsteczkami nalepki są skierowane przeciw toluenowi.

Przygotowanie próbki. Materiał próbki o standardowej masie, ekstrahowany jest za pomocą metanoli o znanej objętości. Wyciąg jest rozcieńczony roztworem buforowym w z góry określonym stosunku objętości (co najmniej 1:5) i użyty jako próbka w teście.

Wykonanie testu.

1. Wejściowy koniec paska testowego zanurzony jest w płynie próbki na głębokość 20 mm.

2. Pasek jest usuwany z płynu.

3. Po 5 minutach, odnotowywana jest ilość niebieskich linii pojawiająca się na pasku testowym, a wynik jest zinterpretowany.

Interpretacja. Test opiera się o zasadę konkurencyjności. Antygen z próbki konkurować będzie o miejsca, w których na nalepkach są wiążące go przeciwciała z antygenem na swoistej linii testowej. Ilość przeciwciał na nalepce jest tak przystosowana, że nawet bardzo mała ilość (odpowiadająca około 5 części na milion lub więcej w próbce pierwotnej) toluenu lub związku pokrewnego z toluenem odkryta w paliwie naftowym zablokuje miejsca reaktywne i na pasku nie będzie mogła być utworzona żadna swoista linia.

Dlatego, jeśli pojawiły się dwie linie niebieskie, test może być zinterpretowany jako ujemny. Jeśli pojawiła się jedna niebieska linia (linia kontrolna) to test jest dodatni, a próbka gleby jest zanieczyszczona.

Przykład V. Test na wykrycie Salmonelli swoistej w żywności.

Przygotowanie przeciwciał. Stosowanie monoklonalnych przeciwciał mysich przeciw antygenowi Salmonelli ulega rozwojowi z wykorzystaniem sposobów znanych dla specjalistów z tej dziedziny (patrz na przykład publikacje Stenman U.-H. i inni, J. Immunol. Methods 1981 rok; 46: 337-345). Wyciąg ścian komórkowych Salmonelli sp. używany jest jako antygen do immunizacji. Przy skryningowym badaniu przeciwciał, tam gdzie płytki mikrościanki powleczone są tym samym wyciągiem ze ścian komórki stosowany jest sposób wg ELISA (enzymatyczny test immunosorpcyjny). Przeciwciała związane z powierzchnią pokrytą antygenem wykrywane są przy użyciu enzymu (HRP - peroksydaza chrzanu) znakowanego króliczą przeciw mysią immunoglobuliną.

Klony, które są odkryte jako dodatnie są następnie testowane sposobami wg testu ELISA z wykorzystaniem wyciągów ściany komórki innego większego patogenetycznego gatunku

172 246

Salmonelli. Pożądana jest swoistość dla szerokiej grupy. Wybrane przeciwciała monoklonalne testowane są w reakcjach krzyżowych dla wykluczenia reakcji szkodliwych z innymi bakteriami znanymi jako występujące powszechnie w żywności.

Przygotowanie paska testowego. Nalepka, błona testowa i złożenie paska testowego wykonane są tak, jak to opisano w przykładzie I. Przeciwciała monoklonalne Salmonelli powleczone są na cząstkach nalepki i na linii swoistej na błonie testowej.

Przygotowanie próbki. Wzbogacająca hodowla prowadzona jest na próbce żywności, a pożywka hodowli rozcieńczona roztworem próby korzystnym przy wystawieniu na działanie antygenu używana jest w teście jako próbka. Gdy spodziewane jest duże skażenie Salmonellą test noże być wykonany bez wzbogacania poprzez rozcieńczanie próbki pierwotnej, jeśli jest to płyn lub może być zawieszony w postaci płynu.

Wykonanie testu.

1. Wejściowy koniec paska testowego zanurzony jest w płynie próbki na głębokość 20 mm.

2. Pasek jest usuwany z próbki.

3. Po 5 minutach, odnotowywana jest ilość niebieskich linii pojawiająca się na pasku testowym, a wynik jest zinterpretowany.

Interpretacja. Jeśli pojawia się jedna niebieska linia na pasku, wynik jest ujemny. Jeśli pojawiły się dwie linie niebieskie próbka jest dodatnia dla Salmonelli sp. Test może wykryć od 0,1-1 miliona bakterii/ml lub więcej.

Powyżej, wynalazek został objaśniony w odniesieniu do pewnych określonych sposobów wykonania jeśli chodzi o testowanie diagnostyczne i środowiskowe.

172 246

Fig 1a

Fig 3

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Pasek testowy do testu immunologicznego zawierający swoiste immunochemiczne strefy odczynnikowe oraz posiadający podkład i dołączoną do niego wkładkę końca wejściowego oraz w pewnej odległości od niej wkładkę końca tylnego, pomiędzy którymi występuje błona testowa umożliwiająca przepływ cieczy, przy czym wymieniona błona umieszczona jest w układzie równoległym względem tego podkładu w pewnej odległości od niego, znamienny tym, że podkład (1) z wkładką (3) końca wejściowego oraz wkładką (5) końca wyjściowego i błona (2) ograniczają pomiędzy sobą powietrzną szczelinę (4), którajest otwarta przy swoich krawędziach.
2. 2. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że wkładka (3) końca wejściowego oraz wkładka (5) końca tylnego są z materiału pochłaniającego.
3. 3. Pasek według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że posiada dwa podłoża tworzące z jednej strony nośny podkład (1) i z drugiej strony co najmniej częściowo przezroczysty przykryciowy podkład (6), przy czym obie wkładki (3, 5) i błona testowa (2) umieszczone są pomiędzy nośnym podkładem (1) i przykryciowym podkładem (6), a wkład (3,5), błona testowa (2) i jeden z podkładów (1, 6) ograniczają między sobą otwartą przy krawędziach powietrzną szczelinę (4) stanowiącą osłoniętą komorę reakcji.
4. 4. Pasek według zastrz. 3, znamienny tym, że błona testowa (2) wykonana jest z porowatego materiału takiego jak azotan celulozy, nylon lub z materiału podobnego, przy czym błona testowa (2) jest co najmniej w części przywarta do jednego z podkładów (1, 6).
5. 5. Pasek według zastrz. 3, znamienny tym, że wkładka (3) końca wejściowego i błona (2) posiadają co najmniej jedną znakowaną strefę (7) zawierającą ruchome barwione cząstki powleczone odczynnikiem immunochemicznym takim jak przeciwciała w stosunku do badanego analitu i że błona (2) w obszarze odpowiadającym powietrznej szczelinie (4) zawiera co najmniej jedną testową strefę (8, 8', 8”) posiadającą odczynniki immunochemiczne, takie jak inne przeciwciała lub koniugat tego badanego analitu, jak również jedną kontrolną strefę (9) wskazującą właściwy przepływ.
6. 6. Pasek według zastrz. 5, znamienny tym, że znakowane strefy (7) posiadają odmienne swoiste odczynniki immunochemiczne dla więcej niż jednego badanego analitu i/lub odmienne stężenia jednego lub więcej swoistych odczynników immunochemicznych.
7. 7. Pasek według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że znakowana strefa (7) posiada barwione cząsteczki powleczone przeciwciałami takimi jak przeciwciała monoklonalne HCG, przeciwciała monoklonalne IGFBP-1, zarówno przeciwciała przeciw hemoglobinie jak i przeciw albuminie, monoklonalne ciała mogące reagować z toluenem lub przeciwciała monoklonalne przeciw Salmonelli i że testowa strefa (8, 8', 8”) zawiera odpowiednio inne przeciwciała monoklonalne HCG, inne przeciwciała monoklonalne IGFBP-1, inne przeciwciała przeciw hemoglobinie i inne przeciwciała przeciw albuminie, koniugat toluenu lub przeciwciała monoklonalne przeciw Salmonelli.
8. 8. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że podobny do taśmy podkład (1) posiada przyłączoną do siebie wkładkę (3) końca wejściowego pochłaniającą ciekłą próbkę oraz w pewnej odległości od tej wkładki (3) końca wejściowego wkładkę (5) końca tylnego, przy czym pomiędzy tymi wkładkami (3, 5) umieszczona jest umożliwiająca przepływ cieczy błona testowa (2), która położonajest w układzie równoległym w stosunku do podkładu (1) w pewnej odległości od niego tak, że ogranicza powietrzną szczelinę (4) pomiędzy podkładem (1), wkładkami (3, 5) i błoną (2) i która to powietrzna szczelina (4) pozostaje otwarta przy swych krawędziach stanowiąc osłoniętą komorę reakcji oraz, że co najmniej jeden analit środowiskowy i swoisty odczynnik immunochemiczny zawarty jest w strefach (7, 8, 9) paska testowego (10).

   172 246
9. 9. Pasek według zastrz. 1, znamienny tym, że podobny do taśmy podkład (1) posiada przyłączoną do siebie wkładkę (3) końca wejściowego pochłaniającą ciekłą próbkę oraz w pewnej odległości od tej wkładki (3) końca wejściowego wkładkę (5) końca tylnego, przy czym pomiędzy tymi wkładkami (3,5) umieszczona jest umożliwiająca przepływ cieczy błona testowa (2), która położona jest w układzie równoległym względem podkładu (1) w pewnej odległości od niego tak, że ogranicza powietrzną szczelinę (4) pomiędzy podkładem (1), wkładkami (3, 5) i błoną (2) i która to powietrzna szczelina (4) pozostaje otwarta przy swych krawędziach stanowiąc osłoniętą komorę reakcji oraz, że co najmniej jeden diagnozowany analit i swoisty immunochemiczny odczynnik zawarty jest w strefach (7, 8, 9) paska testowego (10).
10. 10. Sposób wytwarzania paska testowego do testu immunologicznego, znamienny tym, że wzdłużnie rozprowadza się i suszy się oddzielne, ciągle strefy co najmniej jednego immunochemicznego odczynnika na nieprzerwanym odcinku błony testowej, przyłącza się co najmniej dwie oddzielne ciągłe taśmy materiału wkładkowego w pewnej odległości od siebie na nieprzerwanym odcinku podkładu, umieszcza się odcinek tak przygotowanej błony testowej na taśmach materiału wkładkowego tak, aby wymienione odczynnikowe strefy były ustawione w linii ze szczeliną utworzoną pomiędzy tymi taśmami materiału wkładkowego, przyłącza się ciągły odcinek przezroczystego materiału przykrywającego do wymienionych taśm wkładkowych i odcinka błony, a następnie tnie się tak powstały materiał wyjściowy taśmy na paski testowe o żądanym wymiarze.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że na odcinku błony lub na jednej z taśm materiału wkładkowego rozprowadza się i suszy co najmniej jedną ciągłą strefę znakowanego odczynnika.