KR100796772B1 - 쯔쯔가무시병 진단 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 쯔쯔가무시 혼합 항원을 이용한 쯔쯔가무시병의 진단 키트에 관한 것이다. 구체적으로 상기 진단 키트는 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad), 시료 내의 인간 항체와 결합하는 금 결합 패드(gold conjugation pad), 쯔쯔가무시 혼합 항원을 포함하는 반응선(test line)과 대조군 단백질을 포함하는 대조선(control line)을 포함하는 반응막(test membrane), 및 잔량의 시료를 흡수하는 흡수패드(absorption pad)를 포함하는 테스트 스트립을 포함한다. 본 발명의 진단 키트를 이용하면 쯔쯔가무시 항체를 간단하게 검출할 수 있어 특별한 기계 조작 없이도 쯔쯔가무시 감염 여부를 육안으로 확인할 수 있다.
쯔쯔가무시, 테스트 스트립, 면역크로마토그래피

Description

쯔쯔가무시병 진단 키트{Diagonstic formulation for Tsutsugamushi disease}
도 1은 발현된 재조합 항원 단백질의 정제과정을 확인하기 위한 10% SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 형질 전환된 대장균으로부터 생산, 정제된 단백질(cr56, r21 및 kr56의 혼합액)의 진단용 항원으로 사용가능성을 확인하기 위해 Dot-blot을 통해 환자 혈청과의 반응성을 확인한 것이다.
도 3은 면역크로마토그래피 기술을 도입하여 제작한 본 발명에 따른 진단 키트 내의 테스트 스트립의 구조를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 진단 키트에 있어서 플라스틱으로 캡핑한 최종 진단 샘플의 구조와 해석 방법을 도식한 것이다.
도 5는 본 발명의 진단 키트의 민감도와 특이도 검사로, (A)는 IFA로 진단된 환자(n=30)의 혈청을 래피드형 진단키트로 민감도를 검사한 결과이며, (B)는 건강인 혈청(n=10), 발진열 환자 혈청(n=11), 렙토스피라증 환자 혈청(n=7) 및 신증후출혈열 환자혈청(n=8)으로 특이도를 검사한 결과이다.
본 발명은 쯔쯔가무시 혼합 항원을 이용하여 생물학적 시료 내의 쯔쯔가무시증에 대한 항체를 검출함으로써 쯔쯔가무시병을 진단하는 키트에 관한 것이다.
쯔쯔가무시병은 리케치아 속의 스크럽 티푸스(Scrub typhus)군에 속하는 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)에 의한 것으로, 진드기유충에 의해 전파되는 급성열성질환이다. 진드기유충에 물린 뒤 약 10일(1~3주)이 지나면 오한, 발열, 두통이 나타나며, 발병 1주 전후하여 몸통에서 시작하여 사지로 퍼져나가는 발진이 나타난다. 진드기의 유충에 물린 자리에는 수포가 생기고, 0.5 내지 0.8cm 크기의 궤양을 형성하며, 이것이 검은 딱지로 덮이게 되는데 이를 가피(eschar)라고 한다. 일부 환자에서 호흡기 증상을 호소하며, 흉부 X-선 촬영을 하면 약 반수에서 폐침윤을 볼 수 있다. 심한 경우에는 중추신경계를 침범하여 의식을 잃거나 사망하는 경우도 있다.
쯔쯔가무시병은 전세계적으로 발생하며, 특히 일본, 중국, 말레이시아, 태국, 베트남 등을 포함하는 아시아 지역에서 호발하는 질환으로서(장우현, 한국의 쯔쯔가무시병, 서흥출판사 p21-27, 1994), 10월에 가장 호발하며 대부분 가을철인 9월과 12월 초 사이에 발생한다 (김 등, 감염 20;105-116, 1988). 주로 사람에게는 들판에서 작업이나 캠핑 등의 야외 활동을 하면서 많이 걸린다.
오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 병원성은 혈관 내피 세포의 침입으로 인한 전신 미세혈관염에 기인한다. 혈중으로 들어온 오리엔티아 쯔쯔가무시는 혈관 내피세포에 증식하여 혈관 내피 세포를 파괴하거나, 증식이 촉발되어 미세혈전과 혈관 주위의 염증을 유발한다. 따라서 병리조직학적으로 전신장기의 혈관손상이 특징이며, 이로 인한 피부괴사와 발진, 뇌염과 청력상실, 신근염과 심부전을 일으키기도 한다. 뿐만 아니라 혈관내 응고증에 의한 저 피브린혈증도 보고 되고 있다. 오리엔티아 쯔쯔가무시의 각 군(혈청형)에 따라서 병의 증상이나 역학적인 양상은 경우에 따라 상이한 차이를 보이고 있다. 같은 군 속의 균 상호간에는 혈청학적으로 연관이 있으나, 다른 군의 균과는 혈청학적 교차반응이 약하게 있거나 없다. 오리엔티아 쯔쯔가무시는 한 개의 종으로 분류되고 있으나, 항원구조가 다른 혈청형이 많이 존재하며, 이러한 항원의 차이에 따라 길리암, 카프, 카토(Gilliam, Karp, Kato) 등의 혈청형으로 분류된다. 국내에서는 길리암, 카프 외에 기존에 알려진 원형균주와는 혈청학적 반응 양상이 다른 강원주(Kanwon)과 보령주(Boryong)가 분리된 바 있다.
이와 같은 혈청형의 다양성을 결정짓는 오리엔티아 쯔쯔가무시의 세포막 단백 항원에는 종특이 항원과 혈청형 특이 항원 등이 존재한다. 오리엔티아 쯔쯔가무시를 정제하여 항원을 폴리아크릴아미드 젤 전기영동과 면역블로팅(immunoblotting)으로 분석한 결과 70, 60, 54~56, 46~47kDa의 주요 항원이 존재 하는 것으로 밝혀졌는데(Takahashi K 등, Microbiol. Immunol. 29: 475, 1985), 이중 46~47kDa, 54~56kDa 및 70kDa의 단백질이 항원성을 가지며, 70kDa과 46~47kDa 단백질은 균주 특이 항원이다(Tamura A 등, Microbiol. Immunol. 26: 321, 1982).
일반적으로 쯔쯔가무시병은 임상 증상이 가벼우며 증상에 의한 임상 진단이 용이한 질환으로 인식되고 있지만, 보고에 따르면 비전형적인 임상 증상을 나타내는 예가 많아 전신 임파선 종창이나 가피 형성 등 쯔쯔가무시병의 특징적인 소견이 없는 경우에는 렙토스피라증, 발진열 및 신증후출혈열 등의 급성열성질환과의 감별 진단이 어렵다.
쯔쯔가무시병의 진단법은 병원균을 분리하거나 면역형광항체법으로 항체를 증명하는 방법에 의한 정밀진단이 있다. 그러나, 상기 진단법은 오리엔티아 쯔쯔가무시의 항원을 얻기 위하여 세포 배양을 실시해야 하며 생산된 항원의 장기 보관이 어려울 뿐 아니라 검사에 있어 형광현미경을 필요로 하므로 제한된 일부 검사실에서만 시행할 수가 있다. 따라서 실제로 환자가 많이 발생하는 농촌지역에 위치한 일선 병원에서는 면역형광항체법은 실시하기엔 어려운 점이 있다.
이에 본 발명자는 상기와 같은 쯔쯔가무시병 진단에 있어서의 어려움을 극복하고자, 균 배양이 필요 없을 뿐 아니라, 3개의 혈청형의 유전자를 직렬로 연결한 유전자를 사용하여 단일 유전자 재조합 항원을 사용하는 것보다 진단적 민감도를 증가시키고, 또한 별도로 생산된 단일 유전자 재조합 단백을 항원으로 첨가하여 더욱더 민감도를 향상된 쯔쯔가무시병 진단 키트를 개발하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 쯔쯔가무시 혼합 항원을 포함하는 테스트 스트립이 포함된 쯔쯔가무시병 진단키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 하나의 샘플패드(sample pad)에 하나 이상의 테스트 스트립이 결합된 쯔쯔가무시병 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 쯔쯔가무시병 진단을 위한 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 쯔쯔가무시 혼합 항원을 포함하는 테스트 스트립이 포함된 쯔쯔가무시병 진단 키트에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은
(a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad);
(b) 시료 내의 인간의 항체와 결합하는 금 결합 패드(gold conjugation pad);
(c) 쯔쯔가무시 혼합 항원을 포함하는 반응선(test line)과 대조군 단백질을 포함하는 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(test membrane); 및
(d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad)
를 포함하는 테스트 스트립으로 구성되는 생물학적 시료 내의 쯔쯔가무시병의 항체를 검출하는 쯔쯔가무시병 진단 키트에 관한 것이다.
도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 바람직한 쯔쯔가무시병 진단 키트는 샘플패드, 금 결합 패드, 반응막 및 흡수패드를 포함하는 테스트 스트립을 포함하고 있다. 샘플 패드는 금 결합 패드 위에 겹쳐져 있어 제1 중첩 부분을 형성하고, 금 결합 패드는 막 위에 겹쳐져 있어 제2 중첩 부분을 형성한다. 또한 막과 흡수패드는 제3 중첩 부분을 형성한다. 생물학적 시료가 샘플패드 상에 점적되면 모세관 현상에 의하여 생물학적 시료는 금 결합 패드, 예를 들어 골드-라벨된 프로틴 A 등을 포함하고 있는 금 결합 패드를 통과하게 된다. 골드-라벨을 형성하는 금 입자는 바람직하게 20 내지 55nm의 지름 크기, 보다 바람직하게는 20 내지 40nm의 지름 크기를 가지며, 염색 지시자(indicator dye)로서 작용한다. 상기 금 결합 패드를 통과함에 따라, 생물학적 시료 내의 항체는 골드-라벨된 프로틴 A 등과 결합하여 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 막을 따라 이동한다.
본 발명에서 사용된, 용어 생물학적 시료는 쯔쯔가무시병이 의심되는 인간을 포함한 포유동물의 혈청, 혈장 등을 말한다. 생물학적 시료는 본 발명의 진단 키트의 샘플 패드에 점적하기 전에 희석하여 사용하거나 또는 희석하지 않고 사용할 수 있다. 생물학적 시료에 쯔쯔가무시 항체가 있는 경우에는 본 발명의 상기 진단키트 내 쯔쯔가무시 혼합 항원을 포함하는 반응선을 통과함에 따라 상기 항체가 쯔쯔가무시 혼합 항원과 결합하여 육안으로 식별할 수 있도록 막 위의 반응선에서 색 변화가 일어난다. 그러나 생물학적 시료에 쯔쯔가무시 항체가 없는 경우에는 본 발명의 쯔쯔가무시 혼합 항원과 결합하지 않아 막 위의 반응선에서 아무런 변화가 일어나지 않는다.
즉, 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 쯔쯔가무시병 항체는 막 위의 반응선에 고정되어 있는 쯔쯔가무시 혼합 항원에 결합한다. 이 항원-항체 복합체의 형성으로 상기 골드 복합체에 의한 염색 지시자(indicator dye)가 침전하면서 검출할 수 있는 붉은 보라색 밴드를 나타내고, 이에 따라 생물학적 시료 내에 쯔쯔가무시 항체가 존재하는 양성 반응을 나타내게 된다.
본 발명에서 사용된, 쯔쯔가무시 혼합 항원은 쯔쯔가무시병의 원인이 되는 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi) 길리암(Gilliam), 카프(Karp) 및 카토(Kato)로부터 유래한 재조합 항원 단백질, 강원(Kangwon)으로부터 유래한 항원 단백질 및 보령(Boryong)으로부터 유래한 항원 단백질이 혼합되어 있는 것을 말한다. 즉, 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프 및 카토의 항원 결정기를 구성하는 단백질을 코딩하는 유전자를 직렬로 연결한 재조합 유전자로부터 유래한 유전자 재조합 단백질과 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원과 보령주의 항원 활성을 갖는 유전자로부터 유래한 유전자 재조합 단백질이 혼합되어 있는 것을 말한다.
구체적으로, 본 발명에서는 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 56kDa 단백질이 항원성을 가져 진단적 가치가 있다는 대한민국 공개특허 제2002-0020281호 등에 기재된 사실에 근거하여, 표준 혈청형인 길리암(Gilliam), 카프(Karp) 및 카토(kato)주의 56kDa 단백의 일부 절편을 코딩하는 유전자를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)으로 증폭하고, 이들 증폭된 DNA 절편을 직렬 연결한 후 단백질 발현용 벡터에 클로닝하여 대장균 내에서 발현시키고, 이를 분리 정제함으로써 쯔쯔가무시병 진단에 이용할 수 있는 융합 단백질 항원을 단일 공정으로 동시에 생산, 분리 정제할 수 있도록 하였다.
또한, 본 발명에서는 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프 및 카토주 외에 쯔쯔가무시병 진단의 민감도를 향상시키기 위하여 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원주(Orientia tsutsugamushi Kangwon)의 항원 활성을 갖는 56kDa 단백질을 코딩하는 유전자 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령주(Orientia tsutsugamushi Boryung)의 21kDa 단백질을 코딩하는 유전자를 중합효소연쇄반응으로 증폭하고, 이들 증폭된 DNA 절편을 단백 발현용 벡터에 클로닝하여 대장균 내에서 발현시키고 이를 분리 정제하여 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프 및 카토주로부터 유래한 56kDa 단백 유전자 재조합 단백질과 함께 쯔쯔가무시병 진단을 위하여 사용하였다.
바람직한 한 양태에서, 본 발명의 진단 키트는 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프 및 카토주의 재조합 56kDa 단백질, 오리엔티아 쯔즈가무시 강원주의 56kDa 단백질 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령주의 21kDa 단백질을 각각 1mg/ml의 농도로 만들고, 이들을 5 : 2 : 1의 부피비로 섞은 1mg/ml 농도의 쯔쯔가무시 혼합 항원을 반응선(test line)에 점적한다.
쯔쯔가무시병에 대한 양성 반응 결과는 대조선 외에 쯔쯔가무시 혼합 항원을 포함하고 있는 반응선이 발색하는 경우이다. 상기 대조선은 진단 키트의 이상 유무를 확인하기 위한 것이다. 쯔쯔가무시병에 대한 음성 반응 결과는 대조선만이 발색하는 경우이다. 상기 대조선은 골드-라벨과 결합하는 대조군 단백질을 포함하고 있는데, 이는 예를 들어 토끼 항-산양 IgG 다클론 항체, 산양 항-인간 IgG 다클론 항체, 토끼 항-산양 IgM 다클론 항체 또는 산양 항-인간 IgM 다클론 항체 등을 포함할 수 있으며, 이들 대조군 단백질을 0.1mg/ml 내지 1mg/ml의 농도로 포함할 수 있다.
하나의 바람직한 양태로서, 본 발명의 진단 키트는 상기 반응막(test membrane)에 쯔쯔가무시 항원 단백질을 발현하지 않는 대장균 추출물을 포함하는 전반응선(pretest line)을 더 포함할 수 있다. 상기 전반응선은 본 발명의 대장균에서 발현된 오리엔티아 쯔쯔가무시의 항원 단백질을 쯔쯔가무시병 진단 목적으로 사용하는데 있어 정제된 항원 단백질에 포함되어 있는 대장균 유래의 단백질과 사람 혈청 중에 포함되어 있는 대장균 유래의 단백질에 대한 항체에 의해 실제로 오리엔티아 쯔쯔가무시 항원 단백질에 대한 항체를 보유하고 있지 않음에도 환자인 것으로 오판될 수 있는 가능성을 배제하기 위함이다. 이 대장균 추출물은 0.5mg/ml 내지 0.6mg/ml의 농도로 전반응선에 포함될 수 있다.
반응막은 규격화된 크기(10 × 500nm)의 니트로셀룰로즈막(MiliporeTM XA3J072100) 등의 적합한 물질을 포함할 수 있다. 반응막은 상기 전반응선, 반응선 및 대조선이 순서대로 배열되는 것이 바람직하며, 이들 전반응선, 반응선 및 대조선은 2.0 내지 4.5mm의 간격, 바람직하게는 2.5 내지 3.0mm로 배열될 수 있다.
금 결합 패드는 적합한 마커, 예를 들어 마커로서 건조된 콜로이드성 골드-라벨된 프로틴 A(portein A), 골드-라벨된 항-인간 IgG 항체 또는 골드-라벨된 항-인간 IgM 항체 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게 샘플패드에 인접하여 위치할 수 있다. 상기 골드 라벨된 마커가 금 결합 패드에 과량으로 포함될 경우에는 분석하고자 하는 쯔쯔가무시 항체가 비교적 낮은 영역에서도 비특정신호로 증가됨으로써 위양성 결과를 초래할 수 있으므로, 본 발명에서는 골드-콜로이드 원액을 희석하여 흡광도(optical density; OD)가 1 내지 6, 바람직하게는 흡광도가 2 내지 4의 농도로 포함할 수 있다. 흡수패드는 막의 반대편 말단에 위치하며 모세관 현상에 의해 막을 따라 이동한 생물학적 시료, 예를 들면 혈청, 혈장 등을 흡수한다.
하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 진단 키트는 하나의 테스트 스트립으로 이루어질 수 있다. 또는, 본 발명의 진단 키트는 도 4에서 보는 바와 같이, 하나의 샘플패드로부터 분지되는 제1 및 제2의 두 개의 테스트 스트립으로 이루어질 수도 있다. 이때, 예컨대, 제1 스트립은 쯔쯔가무시 항원 단백질에 대한 인간 IgG 항체를 검색하기 위해 사용될 수 있고, 제2 스트립은 쯔쯔가무시 항원 단백질에 대한 인간 IgM 항체를 검색하기 위해 사용될 수 있다. 이때, 상기 제 1 스트립은 산양 항-인간 IgG 항체 또는 단백질 A를 포함하는 금 결합 패드와 토끼 항-산양 IgG 다클론 항체를 포함하는 대조선을 포함하며, 상기 제 2 스트립은 산양 항-인간 IgM 항체를 포함하는 금 결합 패드와 산양 항-인간 IgM 다클론 항체를 포함하는 대조선을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 제1 스트립과 제2 스트립은 도 4에 나타낸 바와 같이 병렬로 배열될 수 있으나, 본 발명은 이에 제한되지 않고, 제1 스트립과 제2 스트립이 반대방향으로 서로 직렬 배치되거나 또는 다양한 방향으로 배열될 수 있다.
본 발명의 진단 키트는 개별적으로 안전성을 확보하기 위하여 테스트 스트립을 둘러싸는 케이스로 패키징될 수 있다. 이 진단 키트는 진단 활성의 손실 없이 실온에서 오랜 기간(적어도 12개월 이상) 보관될 수 있다.
하나의 구체적 실시에서, 진단 시간은 약 5 내지 10분으로서, 15분 이내이다. 진단 결과는 환자의 쯔쯔가무시 감염 상태를 진단하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 만일 쯔쯔가무시에 감염된 환자로부터 수집된 생물학적 시료라면, 본 발명의 진단 키트는 쯔쯔가무시 항체에 대해 양성 반응을 나타내어 쯔쯔가무시병을 진단할 수 있으며, 만일 쯔쯔가무시에 감염되지 않은 환자로부터 수집된 생물학적 시료인 경우 본 발명의 진단 키트는 음성 반응을 나타내어 쯔쯔가무시병이 아닌 것으로 진단할 수 있다.
상기한 쯔쯔가무시 혼합 항원의 쯔쯔가무시병에 대한 민감도와 특이도를 간접면역형광항체법, Dot-blot 및 ELISA와 비교하여 조사한 결과, 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프 및 카포주로부터 유래된 재조합 56kDa 융합 단백질과 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령주로부터 유래된 21kDa 단백질이 혼합된 경우에는 전체적으로 95%이상의 민감도와 특이도를 나타냈으나, 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원주로부터 유래된 56kDa 단백질의 첨가 시 양성 시그널이 매우 약한 환자혈청에서 뚜렷하게 되어 민감도의 향상(100%)을 보였다. 이러한 결과로부터, 본 발명에서 사용되는 쯔쯔가무시 혼합 항원은 민감도와 특이도가 우수함을 알 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 쯔쯔가무시 혼합 항원으로서 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프 및 카토의 56kDa 융합 단백질, 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원의 56kDa 단백질 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령의 21kDa 단백질을 포함하는 쯔쯔가무 시병 진단용 조성물을 제공한다.
하나의 바람직한 양태로서, 상기 쯔쯔가무시 혼합 항원에 포함되는 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원의 56kDa 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지며, 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령의 21kDa 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진다.
일반적으로, 쯔쯔가무시병이 의심되는 환자가 오리엔티아 쯔쯔가무시에 감염되었는지를 진단하기 위해서는 인체 내 오리엔티아 쯔쯔가무시의 존재 유무를 확인하여야 하는데, 현재 쯔쯔가무시병 진단방법은 주로 면역형광항체법을 이용하고 있다. 그러나, 이 방법은 감수성과 특이도가 높고, IgG와 IgM을 감별하여 측정할 수 있어 초기감염과 재감염을 어느 정도 구분할 수 있다는 장점이 있으나, 균체 배양을 하여야 하기 때문에 세포배양시설이 필요하고 방법이 복잡하여 전문가에 의해서만 수행될 수 있으며, 시간과 유지비용 등이 많이 소요된다는 문제점이 있다. 이에 반하여, 본 발명의 진단 방법은 항원-항체반응에 의한 면역크로마토그래피 방법을 이용하기 때문에, 10분 내외의 빠른 시간 내에 간편하고 정확하게 쯔쯔가무시병을 진단할 수 있어 종래의 진단 방법에 비하여 우수한 효능을 가지고 있다.
상기와 같이 구성된 쯔쯔가무시병 진단 키트를 이용하여 쯔쯔가무시병 항체를 검출하는 방법은 하기와 같다. 우선, 검체하고자 하는 생물학적 시료를 상기 진단 키트의 시료가 흡수되는 부위인 샘플패드(sample pad)에 점적하면, 생물학적 시료는 모세관 현상에 의해 금 결합 패드(gold conjugation pad)에 도달하여 시료 내의 항체가 금 결합 패드 내의 마커, 예를 들어 골드-라벨된 프로틴 A(gold-labeled protein A), 골드-라벨된 항 인간 IgG 항체(gold-labeled anti-human IgG antibody) 및 골드-라벨된 항 인간 IgM 항체(gold-labeled anti-human IgM antibody) 등에 결합하여 콜로이드를 형성하게 된다. 이때, 검체하고자 하는 생물학적 시료는 상기 금 결합 패드에 고정화되지 않고 계속 이동하여 쯔쯔가무시 혼합 항원이 고정화되어 있는 반응선(test line)에 도달하게 된다. 쯔쯔가무시병에 감염된 환자의 생물학적 시료인 경우에는 상기 쯔쯔가무시 혼합 항원과 항원-항체 반응을 일으키게 되는데, 즉 환자의 금 결합 패드 내의 특정 마커에 결합된 쯔쯔가무시 항체는 반응선에 고정된 쯔쯔가무시 혼합 항원에 결합하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 육안으로 관찰할 수 있게 된다. 그리고, 생물학적 시료 내 항체와 반응하지 않은 나머지 금 결합 패드 내의 마커는 대조선에 도달하여 대조군 단백질과 반응하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 검사의 적합성을 나타내게 된다. 이와 같이 본 발명의 진단 키트는 항원-항체 반응에 의한 면역크로마토그래피 방법을 이용함으로써 특별한 장비 없이 육안으로 검사결과를 확인할 수 있는 방법이다.
또한, 본 발명에서는 전반응선(pretest line)에 의해 실제로 오리엔티아 쯔쯔가무시 항원 단백질에 대한 항체를 보유하고 있지 않음에도 보유하고 있는 것으로 오판될 수 있는 가능성을 제거함으로써 쯔쯔가무시병 진단의 정확성을 향상시켰다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이는 본 발명의 이해를 돕기 위해 추가된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항원 단백질 발현 및 분리
1-1. 카이메릭 재조합 56 kDa ( cr56 )의 단백질 발현
오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 카토(Orientia tsutsugamushi Gilliam, Karp, Kato)의 주요 항원 부위를 포함하는 카이메릭 재조합 단백질(cr56)은 대한민국 특허공개 제 2002-0020281호의 실시예에 기재된 방법과 동일한 방법으로 발현 및 분리 정제하였다.
즉, 오리엔티아 쯔쯔가무시의 길리엄, 카프, 카토 및 보령주를 마우스 L-929 세포에서 배양하여 수확한 후 정제한다. 정제된 균주를 효소 분해시킨 후 페놀 추출과 에탄올 침전으로 DNA를 정제한다. 또한, 오리엔티아 쯔쯔가무시 56kDa 단백 유전자의 염기서열을 근거로 하여, 보령주 및 길리엄, 카프, 카토 혈청형간 아미노산 서열이 30% 이상 상동성을 보이는 단백 부위를 선택하여, 길리엄, 카프, 카토 주에서 각각 한쌍 씩의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조한다. 이들 각각의 프라이머쌍을 가지고 상기에서 추출한 오리엔티아 쯔쯔가무시 DNA를 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하여 길리엄, 카프 및 카토의 DNA 절편을 증폭시킨다. PCR 산물을 정제하여 pTYB12 벡터의 해당 제한효소 절단 부이에 연결되도록 클로닝한다. 먼저 pTYB12 벡터에 길리엄의 DNA 절편을 도입하여 벡터 pTG3를 제작하고, pTG3에 카프의 DNA 절편을 도입하여 벡터 pTGP1을 제작한 후, pTGP1에 카토의 DNA 절편을 도입하여 pTGPT2를 제작한다. 또한, 벡터 pTGPT2로부터 길리엄, 카프 및 카토의 DNA 절편의 직렬 연결체를 절단하여 pET22b(+) 벡터에 도입하여 벡터 pETb7을 제작한다. 제작한 발현 벡터로 대장균을 형질전환하고, 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질 발현을 유도한다. 전기영동 및 웨스턴 블롯으로 확인한 후 발현된 융합 단백 항원을 분리 정제하였다.
1-2. 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령주( Orientia tsutsugamushi Boryong)의 재조합 21kDa ( r21 ) 단백질 발현
오리엔티아 쯔쯔가무시 보령(Orientia tsutsugamushi Boryong) 중 종특이적 항원 특성을 갖는 유전자를 대장균에서 발현한 재조합 단백질(r21)은 다음과 같은 방법으로 발현 및 분리 정제하였다.
(1) O. tsutsugamushi DNA 정제
O. tsutsugamushi Boryong에 감염된 마우스 L-세포를 원심하여 침사를 수확하고 이를 인산완충액으로 3회 세척한 다음, 전체 DNA를 추출하여 사용하였다. DNA는 침사물 1% SDS와 proteinase K(100ug/ml)가 포함된 Tris-HCl 완충액 (10mM pH 8.0, 10mM EDTA, 150mM NaCl)에 넣은 후, 56℃에서 1시간 반응시켜 용해시키고 동량의 phenol-chloroform-isoamylalchol 혼합액으로 3회 반응시켜 정제하였다.
(2) PCR 증폭
정제하여 보관한 DNA 100ng에 NdeⅠ과 XhoⅠ인식부위를 함유하도록 변형한 프라이머를(표 1), 각 20pmole이 되도록 첨가한 다음, 10X Tag 중합효소 완충액 (100mM Tris-HCl, 15mM MgCl2, 500mM KCl, 1mg/ml gelatin, pH 8.3), dNTPs, Tag 폴리머라제(polymerase)를 넣고 PCR을 실행하였다. DNA의 증폭여부는 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동을 실시하여 확인하였다.
Figure 112006063655858-pat00001
(3) 유전자의 클로닝 및 발현
중합효소 연쇄반응으로 증폭한 DNA를 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동한 다음 QIAGEN gel elution kit (QIAGEN Inc., USA)를 사용하여 회수하였다. UV 투과조명기(transilluminator)상에서 예상크기에 맞게 증폭된 밴드를 잘라내어 마이크로튜브로 옮겼다. 아가로즈 겔 부피의 3배량의 NaI 용액을 첨가한 다음 60℃에서 5분간 방치하여 겔을 완전히 녹였다. 여기에 글라스 밀크(glass milk)를 첨가하여 10초간 교반(vortexing)하였다. 이를 상온에서 17,000 g(Hanil, AI.5S-24, 12,000rpm)로 1분간 원심 분리한 다음 상층액을 제거하였다. 여기에 용출(elution) 용액을 첨가하여 교반한 다음 17,000g(12,000rpm)로 원심 분리하여 상층액을 새로운 마이크로튜브에 옮겼다. 이렇게 정제된 DNA 40ng을 pET22b(+)에 클로닝시켰다.
(4) 적격 세포( competent cell ) 제작 및 형질전환
LB 배지에서 18시간 배양한 대장균 BL21을, LB 배지에 100배 희석하여 600nm에서 흡광도가 0.3이 될 때까지 재배양하였다. 얼음속에서 30분간 방치한 후 배지 상층액을 버리고, 0.1M CaCl2를 배지의 1/2 부피가 되도록 첨가하여 대장균을 부유시켰다. 얼음 속에서 1시간 동안 방치하고 10분 동안 2,000g(4,100rpm)에서 원심분리 한 후, 배양한 배지의 1/10부피의 0.1M CaCl2로 부유하여 이를 형질전환에 사용하였다.
위에서 제작한 리게이션 산물과 적격세포를 혼합하여 얼음 속에서 방치한 후 42℃에서 열충격을 주었다. LB 배지를 첨가한 후 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 배양액을 LB 한천 평판배지에 접종한 후 37℃에서 배양하였다.
(5) 단백질의 발현 및 분리
형질전환된 대장균 BL21을 37℃에서 18시간 배양한 후 100배 희석하여 OD600=0.5가 되게 배양하였다. IPTG 농도가 0.3mM이 되게 첨가하여 2시간 배양하고, 5,800 g (7,000rpm)에서 원심분리하였다. E. coli 배양액을 23,000 g(14,000rpm)로 원심 분리하여 침사를 모으고 1 X binding buffer( 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl pH 7.9, 0.5M NaCl)로 부유한 후 초음파분쇄기로 18Hz에서 15초간 6회 교반하였다. 원심 분리하여 상층액을 용해분획(soluble fraction)으로, 침사를 비용해분획(insoluble fraction)으로 하였다. 이렇게 준비된 각 분획을 SDS-PAGE를 시행하여 어느 분획에 재조합 단백이 존재하는지를 확인하였다.
(6) 단백질 정제
Hisbind 레진 (Novagen)을 컬럼에 2ml이 되도록 채운 후, 증류수와 1 X charge buffer, 1 X binding buffer를 사용해 컬럼을 준비하였다. 항원단백을 컬럼에 통과시킨 후, 1 X washing buffer로 세척하였다. Elution buffer (100mM ~ 300mM imidazole, 0.5M NaCl, 20mM Tris-Cl pH 7.9)를 통과시켜 단백질을 1 ml씩 회수하였다. 각각 분획내의 단백질 농도는 롤리법을 이용하여 정량하였으며, SDS-PAGE와 웨스턴 블롯(Western blot)을 하여 단백질(서열번호 3)을 확인하였다(도 1).
1-3. 재조합 Kangwon 56 kDa 단백( kr56 )의 발현
계통발생 분석(Phylogenic analysis) 결과(FEMA Microbiology Letters, 1999, 180:163-169)를 참고하면 전세계적 주혈청형(prototype)인 카프(Karp), 길리엄(Gilliam), 카토(Kato)와 국내유행 혈청형인 보령(Boryong)과 연천(Yonchon) (Kangwon과 가장 유사)으로 크게 분류될 수 있음을 고려할 때 이들 5가지 균주를 항원으로 이용하는 것이 매우 적절할 것으로 여겨졌다. 카프(Karp), 길리엄(Gilliam) 및 카토(Kato)는 cr56으로 제시되고, 보령(Boryong)은 r21로 제시된다. 또한 연천(Yonchon)은 유사한 강원(Kangwon)의 kr56으로 제시된다. 이에 본 발명자들은 강원 56kDa 재조합단백질(kr56)을 r21과 함께 카이메릭 재조합 단백(cr56)의 보조항원으로 사용하기로 하였다.
(1) Kangwon 56 kDa protein ( kr56 ) 발현의 개요
강원(Kangwon) 87-61의 주 항원 도메인(major antigenic domain)으로 알려진 부분 아미노산 84(250bp)부터 445(1,335bp)까지 NcoⅠ과 SalⅠ인식부위를 함유하도록 변형하여 프라이머 한 쌍을 제작하였으며(표 2), PCR 반응을 수행하였다. PCR 산물과 발현벡터 pET30a를 NcoⅠ과 SalⅠ 제한효소를 처리하여 절단한 다음, 이들을 서로 라이게이션 시켰다. 이 플라스미드를 대장균주 BL21에 형질전환 시킨 후 단백을 추출하였다.
Figure 112006063655858-pat00002
(2) 유전자의 클로닝 및 발현
중합효소 연쇄반응으로 증폭한 DNA (amino acid 84(250bp)부터 445 (1,335bp)까지 362 a.a. (total 1,086bp))를 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동한 다음 QIAGEN gel elution kit (QIAGEN Inc., USA)를 사용하여 회수하였다. UV 투과조명기(transilluminator)상에서 예상크기에 맞게 증폭된 밴드를 잘라내어 마이크로튜브로 옮겼다. 아가로즈 겔 부피의 3배량의 NaI 용액을 첨가한 다음 60℃에서 5분간 방치하여 겔을 완전히 녹였다. 여기에 글라스 밀크(glass milk)를 첨가하여 10초간 교반하였다. 이를 상온에서 17,000 g(Hanil, AI.5S-24, 12,000rpm)로 1분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다. 마이크로튜브를 상온에서 5분간 방치하여 건조시킨 다음 elution buffer를 첨가하여 교반한 후, 17,000 x g(12,000rpm)로 원심분리하여 상층액을 새로운 마이크로튜브로 옮겼다. 이렇게 정제된 PCR 산물과 pET30a 백터를 제한효소 NcoⅠ과 SalⅠ으로 완전절단한 후, Geneclean kit Ⅱ를 이용하여 동일한 방법으로 회수하였다. 절단된 백터 100ng과 절단된 PCR 산물 100ng을 혼합하고, 여기에 10배 농도의 리가제 완충액 (250mM Tris-HCl pH 7.8, 100mM MgCl2, 20mM DTT, 4mM ATP)과 리가제를 혼합하여 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다.
(3) 적격세포( competent cell ) 제작 및 형질전환
LB 배지에서 18시간 배양한 대장균 BL21을, LB 배지에 100배 희석하여 600nm에서 흡광도가 0.3이 될 때까지 재배양하였다. 얼음 속에서 30분간 방치한 후 배지 상층액을 버리고, 0.1M CaCl2를 배지의 1/2 부피가 되도록 첨가하여 대장균을 부유시켰다. 얼음 속에서 1시간 동안 방치하고, 10분 동안 2,000 g(4,100rpm)에서 원심분리 한 후, 배양한 배지의 1/10부피의 0.1M CaCl2로 부유하여 이를 형질전환에 사용하였다.
(4) 형질전환
상기 (3)에서 제작한 리게이션 산물과 적격세포(competent cell)를 혼합하여 얼음 속에서 방치한 후 42℃에서 1분 30초간 열충격을 주었다. LB 배지를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양액을 LB 한천 평판배지에 접종한 후 37℃에서 배양하였다.
(5) 형질전환된 대장균의 plasmid DNA 분리
형질전환된 대장균 단일집락을 카나마이신(Kanamycin)이 함유된 LB배지에 접종하여 37℃에서 진탕배양하였다. 플라스미드 DNA 추출은 AccuPrep Plasmid Extraction kit를 이용하였다. 배양액을 상온에서 750g (2,500rpm)로 10분간 원심분리한 다음 세포침전물만 회수하였다. 여기에 resuspenstion buffer를 첨가한 다음 교반하여 lysis buffer를 첨가하고 상온에서 5분간 방치하였다. Neutralization buffer를 첨가하여 상온에서 방치한 후 17,000xg (12,000rpm)로 원심분리하여 상층액을 바인딩 컬럼튜브(binding column tube)로 옮겼다. 이를 상온에서 17,000xg (12,000rpm)로 원심분리한 다음 추출액을 제거하였다. 여기에 80% 에탄올을 분주하여 원심분리한 다음 바인딩 컬럼만을 새로운 튜브로 옮겼다. 여기에 Elution buffer를 분주하여 상온에서 방치한 후 원심분리하여 상층액을 새로운 마이크로튜브로 옮겼다.
(6) 단백질의 발현 및 분리
형질전환된 대장균 BL21을 37℃에서 18시간 배양한 후 100배 희석하여 OD600=0.5가 되게 배양하였다. IPTG 농도가 0.3mM이 되게 첨가하여 2시간 배양하고, 5,800g (7,000rpm)에서 원심분리하였다. E. coli의 배양액을 23,000g (14,000rpm)로 원심분리하여 침사를 모으고 1 X binding buffer ( 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl pH 7.9, 0.5M NaCl)로 부유한 후 초음파분쇄기로 18Hz에서 15초간 6회 교반하였다. 원심분리하여 상층액을 용해분획(soluble fraction)으로, 침사를 비용해분획(insoluble fraction)으로 하였다. 이렇게 준비된 각 분획을 SDS-PAGE를 시행하여 어느 분획에 재조합 단백지 존재하는지를 확인하였다.
(7) 단백질 정제
Hisbind 레진 (Novagen)을 컬럼에 2ml이 되도록 채운 후, 증류수와 1 X charge buffer, 1 X binding buffer를 사용해 컬럼을 준비하였다. 항원단백을 컬럼에 통과시킨 후, 1 X washing buffer로 세척하였다. Elution buffer (300mM imidazole, 0.5M NaCl, 20mM Tris-Cl pH 7.9)을 통과시켜 단백질을 1 ml씩 회수하였다. 각각 분획내의 단백질 농도는 롤리법을 이용하여 정량하였으며, SDS-PAGE와 웨스턴 블롯(Western blot)을 하여 단백질(서열번호 6)을 확인하였다(도 1).
실시예 2. 정제된 항원 단백질의 ELISA 을 이용한 진단 연구
대장균에서 오리엔티아 쯔쯔가무시의 3개 혈청형을 융합하여 발현한 cr56 단백질과 2개의 혈청형을 각각 발현한 kr56과 r21 단백질을 이용하여 쯔쯔가무시병 환자 혈청중의 이들 단백질에 대한 항체와의 항원-항체 반응에 의한 쯔쯔가무시병 환자의 진단에 이용할 수 있는지 가능성을 조사하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 이상의 3종류의 단백질을 혼합하여 사용한 이유는 cr56 단독으로 사용할 시 효소면역측정법에서 민감도와 특이도가 93.2%와 94.2%로 충분하지 못할 뿐만 아니라 측정치가 진단기준 흡광도(OD) 부근에 빈번히 나타나서 판정에 어려움이 있었으므로, r21과 kr56을 추가하여 이러한 문제점을 해결하였다.
정제된 단백 항원을 1㎍/㎕이 되도록 0.05M 탄산염완충용액(pH9.6)에 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 코팅한 후, 18시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween 20이 포함된 인산완충용액(PBST)으로 2회 세척한 후 3% 우혈청알부민을 100㎕를 웰에 넣어 37℃에서 2시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체는 환자 혈청을 2배수로 단계희석하여 100㎕를 사용하였으며, 2차 항체는 퍼옥시다제가 부착된 염소의 항 인간 항체G(peroxidase conjugate of goat anti-human IgG)를 1:6,000으로 희석하여 100㎕를 넣었다. 3회 세척 후 1mg/ml OPD (o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드) 및 0.03% 과산화수소가 함유된 0.1M 시트레이트-포스페이트 버퍼(pH4.9)를 100㎕ 넣어 차광하여 실온에서 30분 후 1M 황산을 50㎕을 넣어 반응을 정지시키고 마이크로엘라이자 리더를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과를 표 3에 나타내었다. cr56과 r21의 혼합항원의 결과에서 전체적으로 95%이상의 민감도와 특이도를 나타냈으나, kr56의 첨가 시 양성 signal이 매우 약한 환자혈청에서 뚜렷하게 되어 민감도의 향상(100%)을 보이고 있다. 이는 kr56 단백항원 첨가가 진단의 전체적인 민감도 향상에 효과가 있는 것으로 판단된다.
정제된 항원 단백질에 대해 ELISA을 이용한 항원성 검증
Patient No . IFA ( titer ) ELISA ( OD at 490 nm )
Gilliam Karp Kangwon ① cr56 / r21 (1:1) ② cr56 / r21 / kr56 ③ cr56 / r21 (5:1) ④ kr56
IgG IgM IgG IgM IgG IgM
99-241 160 - 640 - 320 - 1.366 1.023 0.838 0.457
99-251 640 640 - - 640 640 0.463 0.431 0.303 0.180
99-355 160 40 10 40 160 40 0.279 0.270 0.152 0.076
99-383 640 160 640 40 10 40 0.218 0.218 0.224 0.072
99-398 640 640 10 - 160 10 0.376 0.372 0.317 0.120
99-433 40 10 10 - - - 0.269 0.260 0.217 0.094
2000-374 - - - - 640 640 0.212 0.246 0.224 0.148
2000-381 - - - - 320 - 0.229 0.488 0.742 0.604
2000-394 - - - - 320 10 1.197 0.989 0.802 0.758
2000-395 - - - - 320 - 0.416 0.447 0.703 0.563
2000-397 640 80 - - 320 40 1.014 0.897 0.452 0.126
2000-409 640 160 - - 160 80 0.489 0.371 0.385 0.108
2000-375 - - - - 160 - 0.195 0.291 0.254 0.337
① 각 항원 단백질(cr56 및 r21)을 1.25ug/ml되게 하여 동량으로 섞어 well당 100ul씩 사용. 정상인은 OD=0.085 ± 0.042
② cr56 1.25ug/ml, r21 0.25ug/ml 및 kr56 0.5ug/ml으로 되게 하여 동량으로 섞어 well당 100ul 사용. 정상인은 OD=0.078 ± 0.038
③ cr56 1.25ug/ml, r21 0.25ug/ml 사용. 정상인은 OD= 0.081 ± 0.044
④ kr56 만 0.6ug/ml 사용. 정상인은 OD= 0.075 ± 0.035
실시예 3. 정제된 항원 단백질의 Dot - blot 을 이용한 진단 연구
대장균에서 오리엔티아 쯔쯔가무시의 3개 혈청형을 융합하여 발현한 cr56 단백질과 2개의 혈청형을 각각 발현한 kr56과 r21 단백질을 이용하여 쯔쯔가무시병 환자 혈청 중에 이들 단백질에 대한 항체와의 항원-항체 반응에 의한 쯔쯔가무시병 환자의 진단에 이용할 수 있는지 가능성을 조사하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 정제된 단백 항원을 1㎍(1㎍/㎕)을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 점적한 후, 37℃에서 1시간 동안 건조시켰다. 건조된 멤브레인을 5% 스킴밀크가 포함된 TBST용액(Tris-buffered saline+0.5% Tween 20)으로 1시간 동안 블로킹하였으며, 1차 항체인 환자 혈청은 1:3,000으로 희석해 1시간 동안 반응시켰다. 2차 항체는 퍼옥시다제가 부착된 염소의 항 인간 항체 IgG(peroxidase conjugate of goat anti-human IgG)를 사용하였다. 결과는 도 2와 표 4에 나타내었다. 그 결과 cr56, r21 및 kr56의 혼합단백질을 사용한 항원에서 가장 높은 민감도와 특이도를 보였다.
정제된 항원 단백질에 대해 dot-blot을 이용한 항원성 검증
Patient No . IFA ( titer ) Dot - blotting
Gilliam Karp Kangwon ① cr56 / r21 (1:1) ② cr56 / r21 (5:1) ③ kr56 ④ cr56 / r21 / kr56
IgG IgM IgG IgM IgG IgM
99-241 160 - 640 - 320 - +++ ++ +(weak) ++++
99-251 640 640 - - 640 640 +(weak) + + +
99-355 160 40 10 40 160 40 +(weak) +(weak) +(weak) ++
99-383 640 160 640 40 10 40 + - +(weak) +
99-398 640 640 10 - 160 10 +(weak) +(weak) - +(weak)
99-433 40 10 10 - - - +(weak) + - ++
2000-374 - - - - 640 640 +(weak) +(weak) +(weak) ++
2000-381 - - - - 320 - +(weak) - - +
2000-394 - - - - 320 10 +++ +++ ++ +++
2000-395 - - - - 320 - + +(weak) - ++
2000-397 640 80 - - 320 40 +++ +++ + +++
2000-409 640 160 - - 160 80 + + ++ ++
2001-22 - - - - 80 - + - - +
2001-8 - - - - 320 - +(weak) + - +
① 각 항원 단백질 cr56 : r21 = 1 : 1로 섞어 1ug/1ul/dot 사용
② cr56 : r21 = 5 : 1로 섞어 1ug/1ul/dot 사용
③ Kangwon 0.6ug 사용
④ cr56 : r21 : kr56 = 5 : 1 : 2으로 섞어 1ug/1ul/dot 사용
실시예 4. 정제된 항원 중에 포함된 대장균유래 단백질과 사람 혈청 중의 항체와의 반응 제거 연구
His-bind 친화 크로마토그래피를 이용하여 항원을 정제하였으나 대장균유래 단백질을 완전히는 제거할 수 없었다. 따라서 정제로는 이러한 대장균유래 단백질을 완전히 제거하는 것이 힘들다고 판단하여 쯔쯔가무시 항원 단백질을 발현하지 않는 대장균 숙주세포만을 배양하여 추출액을 만든 후 테스트라인 앞 부분에 전반응선(pretest line)으로 점적함으로써 사람 혈청중에 포함되어 대장균유래의 단백질과 항원-항체 반응을 일으키는 항체를 제거하였다.
실시예 5. 스틱 형태의 진단제 샘플의 제조
대장균에서 발현된 쯔쯔가무시 항원 (cr56, kr56, r21) 단백질에 대한 쯔쯔가무시병 진단제로서의 효능을 확인하고 나노 엔지리어링 (NANO ENG)사의 디스펜서(dispenser)라는 기기를 이용하여 진단용 테스트 스트립 샘플을 제작하였다. 테스트 스트립의 구조는 제3에서 보는 바와 같이 니트로셀룰로즈 막, 샘플패드, 흡수패드, 금결합패드(유리섬유)로 구성되어 있다. 니트로셀룰로즈 막은 밀리포아사에서 제작한 것을 사용하였는데 막이 쉽게 손상되는 것을 방지하기 위해 한쪽에 투명한 플라스틱을 부착하였다. 니트로셀룰로즈 막에는 3종의 단백질을 스프레이하였다. 1종은 환자의 혈청중에 존재하는 쯔쯔가무시에 대한 항체를 검출하기 위해 대장균에서 발현된 cr56, kr56, r21 단백항원을 적당한 양으로 혼합한 단백질로서 반응선(test line)이며, 다른 1종은 발색시스템의 정상적인 반응 여부를 판단하기 위한 대조선(control line)이다. 또 다른 1종은 사람 혈청중에 포함되어 대장균유래의 단백질과 항원-항체 반응을 일으키는 항체를 제거하기 위해 쯔쯔가무시 항원 단백질을 발현하지 않은 대장균 배양 추출액으로서 전반응선(pretest line)이다. 디스펜서를 사용하여 적정량의 단백질을 전반응선, 반응선, 대조선에 스프레이한 후 37℃에서 2시간 동안 건조시켰다. 유리섬유에 5% 트레할로이즈에 적당량 콜로이달 골드 콘주게이트를 흡수시킨 후 진공 오븐에서 2시간 동안 건조시켰다. 샘플패드와 흡수패드는 각각 원하는 크기로 절단한 후 샘플패드에는 다시 혈청이나 혈장을 잘 흡수할 수 있도록 250mM 트리스 용액에 트윈 20을 1%가 되게 만든 용액에 담가 흡수시킨 후 37℃에서 4시간 동안 완전 건조시켰다. 다음에는 니트로셀룰로즈 막 아래쪽에 콜로이달 골드 콘주게이트가 스프레이된 금결합패드(유리섬유)를 접착하고, 그 아래에 다시 샘플패드를 부착하였다. 니트로셀룰로즈 막 위쪽에는 흡수패드를 부착하였다. 최종 진단제 스틱의 크기는 너비 4mm 높이 60mm되게 절단하였다. 진단제 샘플은 그 용도에 따라 2종류를 제작하였다. 여기에 사용된 단백질의 종류를 표 5에 나타내었다. 샘플 1 및 2는 사람 혈청 중의 쯔쯔가무시 항원 단백질에 대한 항체 면역글로불린 G만을 검색할 수 있으며, 샘플 3 및 4는 면역글로불린 M만을 검색할 수 있다. 용도로 보면 샘플 1 및 2는 중기 이후의 환자를 검출할 수 있으며, 샘플 3 및 4는 초기 환자 검색에 유효한 진단제가 될 수 있다. 본 발명에서는 두 개의 스트립을 한 플라스틱에 넣어 동시에 진단할 수 있도록 제작하였다. 이에 따라 제작된 진단제 샘플에 대해 환자 혈청과 정상인 혈청을 사용하여 효능 시험을 수행해 본 결과, 신속, 정확, 간편한 쯔쯔가무시병 진단제로서의 효능이 입증되었다. 또한 다른 급성열성질환(신증후출혈열, 발진열, 렙토스피라증) 환자 혈청으로 교차실험한 결과 반응이 일어나지 않은 것으로 확인되므로 기존의 키트에 비해 민감도가 더욱 향상된 진단제임을 확인하였다.
진단제 샘플 제작을 위해 사용된 단백질
단백질 샘플 1 샘플 2 샘플 3 샘플 4
콘드롤 라인 토끼 항-산양 IgG 다클론 항체 산양 항-인간 IgG 다클론 항체 토끼 항-산양 IgG 다클론 항체 산양 항-인간 IgM 다클론 항체
테스트 라인 cr56, kr56, r21 혼합 단백질 cr56, kr56, r21 혼합 단백질 cr56, kr56, r21 혼합 단백질 cr56, kr56, r21 혼합 단백질
골드콘주게이트 산양 항-인간 IgG 항체 Protein A 산양 항-인간 IgM 항체 산양 항-인간 IgM 항체
여기서 제작한 테스트 스트립을 한 플라스틱에 넣어 제 4도와 같이 최종진단제를 제작하였다. 사용방법은 아래쪽의 작은 웰에 환자 혈장이나 혈청을 적당한 희석액으로 희석하여 400㎕을 떨어뜨린 후 10분을 기다린 후 반응선(T로 표기된 위치), 대조선(C로 표기된 위치)에 붉은 보라색의 발색을 관찰한다. 두 선 모두가 발색되면 양성이며, 대조선만 발색되면 음성이고, 아무런 발색도 나타나지 않으면 발색시스템에 이상이 있으므로 새로운 진단제로 재시험을 하도록 고안하였다. 진단제 샘플에 사용되는 제반 단백질에 대한 최적 농도와 용량에 대한 시험을 수행한 결과 표 6와 같은 진단제 샘플 제작을 위한 최적 용량을 결정하였다.
진단제 샘플 제작(4mm 너비 스틱)을 위한 최적 단백질 조성
프리테스트라인 테스트라인 콘드롤라인 골드콘주게이트
0.2㎍ 0.1㎍~0.4㎍ 0.04㎍~0.4㎍ 흡광도=10 20㎕
실시예 6. 진단제 스트립 샘플의 효능 시험
제작한 진단제 스트립 샘플에 대한 효능을 알아보기 위해 환자, 정상인, 다른 급성열성질환 환자를 포함한 50종의 사람 혈청에 대해 시험을 수행하였다. 사용 방법은 아래쪽 작은 웰에 환자나 정상인의 환자 혈장을 적당한 희석액으로 희석하여 400㎕을 떨어뜨린 후 10분을 기다린 후 반응선(T로 표기된 위치), 대조선(C로 표기된 위치)에 붉은 보라색의 발색을 관찰한다. 두 선 모두가 발색되면 양성이며, 대조선만 발색되면 음성으로 판정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
IFA로 진단된 쯔쯔가무시증 환자 30례는 모두 양성을 나타내었으며, 이에 따른 IgG 진단 민감도는 100%를 나타내었다. 또한 IgM에 대해서는 30명 환자 중 11명의 환자에서(37%)에서 강한 양성이 나타났고, 4명(13%)에서 약한 양성이 나타났다. 이에 초기 감염 환자 또한 검출 하는데 상당한 효과가 있는 것으로 판단되었다.
건강인 혈청(n=10), 발진열 환자 혈청(n=11), 렙토스피라증 환자 혈청(n=7) 그리고 신증후출혈열 환자혈청(n=8)으로 특이도를 시험하였다. 분석 결과 렙토스피라증 환자 혈청 1검체에서 IgG에 반응을 나타내었으며, 나머지 혈청에서는 반응을 하지 않았다. 특이도 검사에 대한 검체수가 적어 완벽하지는 않으나, 특이도는 97.2%를 나타내었다. 또한 IgM(μ-speicific)으로 교차반응을 시험한 결과, 특이도는 100%를 나타내었다.
본 발명의 쯔쯔가무시병 진단 키트는 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 카토, 강원 및 보령주의 항원 활성을 갖는 단백질을 이용하여 면역크로마토그래피 방법에 의해 쯔쯔가무시병을 진단함으로써 종래의 면역형광항체법 등에 비하여 간단하면서도 정확하고, 빠르게 육안으로 검사 결과를 확인할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad);
    (b) 시료 내의 인간의 항체와 결합하는 금 결합 패드(gold conjugation pad);
    (c) 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 카토의 56kDa의 융합 단백질, 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원의 56kDa 단백질 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령의 21kDa 단백질이 혼합된 쯔쯔가무시 혼합 항원을 포함하는 반응선(test line)과 대조군 단백질을 포함하는 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(test membrane); 및
    (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad)
    를 포함하는 테스트 스트립으로 이루어지는 생물학적 시료 내의 쯔쯔가무시 항체를 검출하는 쯔쯔가무시병 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서, 반응막 상의 반응선 전에 쯔쯔가무시 항원 단백질을 발현하지 않는 대장균 추출물을 포함하는 전반응선(pretest line)을 더 포함하는 진단 키트.
  3. 제2항에 있어서, 전반응선, 반응선 및 대조선의 순서로 위치하는 진단 키트.
  4. 제2항에 있어서, 전반응선에 대장균 추출물이 0.5mg/ml 내지 0.6mg/ml 흡착되어 있는 진단 키트.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 쯔쯔가무시 혼합 항원이 1mg/ml, 대조군 단백질이 0.1mg/ml 내지 1mg/ml의 농도로 혼합되어 있는 진단 키트.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 카토의 56kDa의 융합 단백질, 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원의 56kDa 단백질 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령의 21kDa 단백질을 각각 1mg/ml의 농도로 만들고, 이들을 5 : 2 : 1의 부피비로 섞은 쯔쯔가무시 혼합 항원 1mg/ml의 농도로 만든 진단 키트.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제1항의 테스트 스트립 2개가 하나의 샘플패드로부터 분지되어 포함된 진단 키트로서,
    이중 하나의 스트립은 쯔쯔가무시 항원 단백질에 대한 인간 IgG 항체를 검색하기 위한 제1 스트립을 구성하고, 나머지 하나의 스트립은 쯔쯔가무시 항원 단백 질에 대한 인간 IgM 항체를 검색하기 위한 제2 스트립을 구성하며, 상기 제 1 스트립은 산양 항-인간 IgG 항체 또는 단백질 A를 포함하는 금 결합 패드와 토끼 항-산양 IgG 다클론 항체를 포함하는 대조선에 특징이 있으며, 상기 제 2 스트립은 산양 항-인간 IgM 항체를 포함하는 금 결합 패드와 산양 항-인간 IgM 다클론 항체를 포함하는 대조선에 특징이 있는, 쯔쯔가무시병 진단 키트.
  13. 제12항에 있어서, 제 1 스트립 및 제 2 스트립이 직렬 또는 병렬로 배열된 진단 키트.
  14. 쯔쯔가무시 혼합 항원으로서 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암, 카프, 카토의 56kDa의 융합 단백질, 오리엔티아 쯔쯔가무시 강원의 56kDa 단백질 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령의 21kDa 단백질을 포함하는 쯔쯔가무시병 진단용 조성물.
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