ES2378051T3

ES2378051T3 - Compuestos y métodos para el diagnóstico de la tubercolosis.

Info

Publication number: ES2378051T3
Application number: ES09174756T
Authority: ES
Inventors: Steven Reed; Yasir Skeiky; Davin Dillon; Antonio Campos-Neto; Raymond Houghton; Thomas Vedvick; Daniel Twardzik
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2016-08-30
Also published as: WO1997009429A3; EP2154248A1; PT2154248E; MX9801687A; EP0850305A2; EP0850305B1; DE69636075D1; CA2230927A1; CN1554664A; DK2154248T3; CN1200146A; EP2154248B1; CN1154730C; ATE530671T1; AU7158796A; ATE324445T1; CY2618B2; WO1997009429A2; JPH11514217A

Abstract

Un método para detectar la sensibilización frente a un antígeno micobacteriano en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con un polipéptido que comprende una porción antigénica de SEC ID Nº : 89; y (b) detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unan al polipéptido.

Description

Compuestos y métodos para el diagnóstico de la tuberculosis

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere de forma general a la detección de infección de Mycobacterium tuberculosis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica que generalmente es causada por infección de Mycobacterium tuberculosis. Es una enfermedad importante en los países en desarrollo, así como un problema creciente en áreas del mundo desarrollado, con aproximadamente 8 millones de nuevos casos y 3 millones de muertes cada año. Aunque la infección puede ser asintomática durante un periodo de tiempo considerable, la forma más común en la que se manifiesta la enfermedad es una inflamación aguda de los pulmones, que produce fiebre y tos no productiva. Si no se trata, normalmente da lugar a complicaciones graves y a la muerte.

Aunque la tuberculosis generalmente puede controlarse usando una terapia extendida de antibióticos, dicho tratamiento no es suficiente para prevenir la propagación de la enfermedad. Los individuos infectados pueden ser asintomáticos, pero contagiosos, durante un determinado tiempo. Adicionalmente, aunque el cumplimiento del régimen de tratamiento es crítico, el comportamiento del paciente es difícil de monitorizar. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, lo que puede conducir a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de resistencias a fármaco.

La inhibición de la propagación de la tuberculosis requerirá una vacunación eficaz y un diagnóstico temprano y preciso de la enfermedad. Actualmente, la vacunación con bacterias vivas es el método más eficaz para inducir una inmunidad protectora. El Mycobacterium más habitual para este fin es el Bacillus Calmette-Guerin (BCG), una cepa no virulenta de Mycobacterium bovis. Sin embargo, la seguridad y la eficacia del BCG es una fuente de controversia, y algunos países, tal como los Estados Unidos, no vacunan al público general. El diagnóstico se realiza habitualmente con un ensayo cutáneo, que implica la exposición intradermal a PPD de tuberculina (derivado purificado con proteína). Las respuestas de células T específicas de antígeno dan como resultado una incubación mensurable en la zona de inyección a las 48-72 horas después de inyectar, lo que indica exposición a antígenos de Mycobacterium. Sin embargo, la sensibilidad y la especificidad han sido un problema con este ensayo, y los individuos vacunados con BCG no pueden ser distinguidos de los individuos infectados.

Aunque se ha demostrado que los macrófagos actúan como los principales agentes de la inmunidad de M. tuberculosis, las células T son los inductores predominantes de dicha inmunidad. El papel esencial de las células T en la protección contra la infección de M. tuberculosis se ilustra a través de la frecuente aparición de M. tuberculosis en pacientes de SIDA, debido a un agotamiento de células T CD4 asociado a la infección de virus de inmunodeficiencia humano (VIH). Se ha demostrado que las células T CD4 reactivas frente a Mycobacterium son potentes productores de interferón gamma (IFN-y), el cual se ha demostrado que, a su vez, activa los efectos micobacterianos de macrófagos en ratones. Aunque el papel del IFN-y en humanos está menos claro, hay estudios que han demostrado que la 1,25-dihidroxi-vitamina D3, sola o en combinación con IFN-y o factor alfa de necrosis tumoral, activa macrófagos humanos para inhibir la infección de M. tuberculosis. Además, se sabe que el IFN-y estimula macrófagos humanos para fabricar 1,25-dihidroxi-vitamina D3. De forma similar, se ha demostrado que la IL-12 desempeña un papel en la estimulación de resistencia frente a la infección de M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de la infección de M. tuberculosis véase Chan y Kaufmann, en “Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control”, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC, 1994.

Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de métodos diagnósticos mejorados para detectar la tuberculosis. La presente invención cubre dicha necesidad y además proporciona otras ventajas relacionadas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Brevemente, la presente invención proporciona métodos para diagnosticar tuberculosis. Se describen polipéptidos que comprenden una porción antigénica de un antígeno de M. tuberculosis soluble, o una variante de dicho antígeno que difiere sólo en sustituciones y/o modificaciones conservativas.

El antígeno soluble puede tener una de las siguientes secuencias N-terminales:

(a): Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu (SEC ID Nº: 115);

(b): Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser (SEC ID Nº: 116);

(c): Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg (SED ID Nº: 117);

(d): Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro (SEC ID Nº: 118);

(e): Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val (SEC ID Nº: 119);

(f): Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro (SEC ID Nº: 120);

(g): Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser (SEC ID Nº: 121);

(h): Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly (SEC ID Nº: 122);

(i) Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn5 Val-Ser-Phe-Ala-Asn (SEC ID Nº: 123);

(j): Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser; (SEC ID Nº: 129);

(k): Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp; (SEC ID Nº: 130) ó

(l): Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly; (SEC ID Nº: 131)

en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

10 También se describen polipéptidos que comprenden una porción inmunogénica de un antígeno de M. tuberculosis, o una variante de dicho antígeno que difiere sólo en sustituciones y/o modificaciones conservativas, presentando el antígeno una de las siguientes secuencias N-terminales:

(m) Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val; (SEC ID Nº: 132) ó

(n) Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe; (SEC ID Nº: 15 124)

en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

Los antígenos descritos pueden comprender una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en las secuencias presentadas en los SEC ID Nº: 1, 2, 4-10, 13-25, 52, 94 y 96, los complementos de dichas secuencias y las secuencias de ADN que se hibridan con una secuencia presentada en

20 las SEC ID Nº: 1, 2, 4-10, 13-25, 52, 94 y 96 o un complemento de la misma en condiciones moderadamente severas.

Los polipéptidos descritos pueden comprender una porción antigénica de un antígeno de M. tuberculosis, o una variante de dicho antígeno que difiera sólo en sustituciones y/o modificaciones conservativas, en donde el antígeno comprende una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo que

25 consiste en las secuencias presentadas en las SEC ID Nº: 26-51, los complementos de dichas secuencias, y secuencias de ADN que se hibridan con una secuencia presentada en las SEC ID Nº: 26-51 o un complemento de la misma en condiciones moderadamente severas.

También se describen las secuencias de ADN que codifican los anteriores polipéptidos, los vectores de expresión recombinantes que comprenden dichas secuencias de ADN y las células hospedantes transformadas o 30 transfectadas con dichos vectores de expresión.

Según la presente invención se proporciona un método para detectar la sensibilización a un antígeno micobacteriano en un sujeto que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con un polipéptido que comprende una porción antigénica de SEC ID Nº: 89; y (b) detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unan al polipéptido.

35 Se proporcionan métodos y kits de diagnóstico para detectar tuberculosis en un paciente. Los métodos comprenden

(a) poner en contacto una muestra biológica con al menos un polipéptido que comprende una porción antigénica de SEC ID Nº: 89 y (b) detectar en la muestra la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido o polipéptidos, detectando con ello la infección de M. tuberculosis en la muestra biológica. Las muestras biológicas adecuadas incluyen sangre entera, esputo, suero, plasma, saliva, fluido cerebroespinal y orina. Los kits de diagnóstico

40 comprenden uno o más de los polipéptidos anteriores en combinación con un reactivo de detección.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Y DE LOS IDENTIFICADORES DE SECUENCIA

Figura 1A y B: ilustran la estimulación de la proliferación y la producción de interferón y en células T derivadas de un primer y un segundo donantes inmunes a M. tuberculosis, respectivamente, por los antígenos 14 Kd, 20 Kd y 26 Kd descritos en el Ejemplo 1.

45 Figura 2: ilustra la reactividad de dos polipéptidos representativos con sueros procedentes de individuos infectados y no infectados con M. tuberculosis, en comparación con la reactividad de lisato bacteriano.

Figura 3: muestra la reactividad de cuatro polipéptidos representativos con sueros de individuos infectados y no infectados con M. tuberculosis, en comparación con la reactividad del antígeno 38 kD.

Figura 4: muestra la reactividad de los antígenos 38 kD y TbRa11 con sueros procedentes de pacientes de M.

tuberculosis, donantes positivos en PPD y donantes normales. Figura 5: muestra la reactividad del antígeno TbRa2A con sueros negativos 38 kD. Figura 6: muestra la reactividad del antígeno de SEC ID Nº: 60 con sueros procedentes de pacientes de M.

tuberculosis y de donantes normales. SEC ID Nº: 1 es la secuencia de ADN de TbRa1. SEC ID Nº: 2 es la secuencia de ADN de TbRa10. SEC ID Nº: 3 es la secuencia de ADN de TbRa11. SEC ID Nº: 4 es la secuencia de ADN de TbRa12. SEC ID Nº: 5 es la secuencia de ADN de TbRa13. SEC ID Nº: 6 es la secuencia de ADN de TbRa16. SEC ID Nº: 7 es la secuencia de ADN de TbRa17. SEC ID Nº: 8 es la secuencia de ADN de TbRa18. SEC ID Nº: 9 es la secuencia de ADN de TbRa19. SEC ID Nº: 10 es la secuencia de ADN de TbRa24. SEC ID Nº: 11 es la secuencia de ADN de TbRa26. SEC ID Nº: 12 es la secuencia de ADN de TbRa28. SEC ID Nº: 13 es la secuencia de ADN de TbRa29. SEC ID Nº: 14 es la secuencia de ADN de TbRa2A. SEC ID Nº: 15 es la secuencia de ADN de TbRa3. SEC ID Nº: 16 es la secuencia de ADN de TbRa32. SEC ID Nº: 17 es la secuencia de ADN de TbRa35. SEC ID Nº: 18 es la secuencia de ADN de TbRa36. SEC ID Nº: 19 es la secuencia de ADN de TbRa4. SEC ID Nº: 20 es la secuencia de ADN de TbRa9. SEC ID Nº: 21 es la secuencia de ADN de TbRaB. SEC ID Nº: 22 es la secuencia de ADN de TbRaC. SEC ID Nº: 23 es la secuencia de ADN de TbRaD. SEC ID Nº: 24 es la secuencia de ADN de YYWCPG. SEC ID Nº: 25 es la secuencia de ADN de AAMK. SEC ID Nº: 26 es la secuencia de ADN de TbL-23. SEC ID Nº: 27 es la secuencia de ADN de TbL-24. SEC ID Nº: 28 es la secuencia de ADN de TbL-25. SEC ID Nº: 29 es la secuencia de ADN de TbL-28. SEC ID Nº: 30 es la secuencia de ADN de TbL-29. SEC ID Nº: 31 es la secuencia de ADN de TbH-5. SEC ID Nº: 32 es la secuencia de ADN de TbH-8. SEC ID Nº: 33 es la secuencia de ADN de TbH-9.

SEC ID Nº: 34 es la secuencia de ADN de TbM-1.

SEC ID Nº: 35 es la secuencia de ADN de TbM-3. SEC ID Nº: 36 es la secuencia de ADN de TbM-6. SEC ID Nº: 37 es la secuencia de ADN de TbM-7. SEC ID Nº: 38 es la secuencia de ADN de TbM-9. SEC ID Nº: 39 es la secuencia de ADN de TbM-12. SEC ID Nº: 40 es la secuencia de ADN de TbM-13. SEC ID Nº: 41 es la secuencia de ADN de TbM-14. SEC ID Nº: 42 es la secuencia de ADN de TbM-15. SEC ID Nº: 43 es la secuencia de ADN de TbH-4. SEC ID Nº: 44 es la secuencia de ADN de TbH-4-FWD. SEC ID Nº: 45 es la secuencia de ADN de TbH-12. SEC ID Nº: 46 es la secuencia de ADN de Tb38-1. SEC ID Nº: 47 es la secuencia de ADN de Tb38-4. SEC ID Nº: 48 es la secuencia de ADN de TbL-17. SEC ID Nº: 49 es la secuencia de ADN de TbL-20. SEC ID Nº: 50 es la secuencia de ADN de TbL-21. SEC ID Nº: 51 es la secuencia de ADN de TbH-16. SEC ID Nº: 52 es la secuencia de ADN de DPEP. SEC ID Nº: 53 es la secuencia de aminoácidos deducida de DPEP. SEC ID Nº: 54 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de DPV. SEC ID Nº: 55 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de AVGS. SEC ID Nº: 56 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de AAMK. SEC ID Nº: 57 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de YYWC. SEC ID Nº: 58 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de DIGS. SEC ID Nº: 59 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de AEES. SEC ID Nº: 60 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de DPEP. SEC ID Nº: 61 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de APKT. SEC ID Nº: 62 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de DPAS. SEC ID Nº: 63 es la secuencia de aminoácido deducida de péptido de TbM-1. SEC ID Nº: 64 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa1. SEC ID Nº: 65 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa10. SEC ID Nº: 66 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa11. SEC ID Nº: 67 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa12. SEC ID Nº: 68 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa13. SEC ID Nº: 69 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa16. SEC ID Nº: 64 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa1.

SEC ID Nº: 70 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa17.

SEC ID Nº: 71 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa18. SEC ID Nº: 72 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa19. SEC ID Nº: 73 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa24. SEC ID Nº: 74 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa26. SEC ID Nº: 75 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa28. SEC ID Nº: 76 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa29. SEC ID Nº: 77 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa2A. SEC ID Nº: 78 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa3. SEC ID Nº: 79 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa32. SEC ID Nº: 80 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa35. SEC ID Nº: 81 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa36. SEC ID Nº: 82 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa4. SEC ID Nº: 83 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRa9. SEC ID Nº: 84 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRaB. SEC ID Nº: 85 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRaC. SEC ID Nº: 86 es la secuencia de aminoácido deducida de TbRaD. SEC ID Nº: 87 es la secuencia de aminoácido deducida de YYWCPG. SEC ID Nº: 88 es la secuencia de aminoácido deducida de TbAAMK. SEC ID Nº: 89 es la secuencia de aminoácido deducida de Tb38-1. SEC ID Nº: 90 es la secuencia de aminoácido deducida de TbH-4. SEC ID Nº: 91 es la secuencia de aminoácido deducida de TbH-8. SEC ID Nº: 92 es la secuencia de aminoácido deducida de TbH-9. SEC ID Nº: 93 es la secuencia de aminoácido deducida de TbH-12. SEC ID Nº: 94 es la secuencia de ADN de DPAS. SEC ID Nº: 95 es la secuencia de aminoácido deducida de DPAS. SEC ID Nº: 96 es la secuencia de ADN de DPV. SEC ID Nº: 97 es la secuencia de aminoácido deducida de DPV. SEC ID Nº: 98 es la secuencia de ADN de ESAT-6. SEC ID Nº: 99 es la secuencia de aminoácido deducida de ESAT-6. SEC ID Nº: 100 es la secuencia de ADN de TbH-8-2. SEC ID Nº: 101 es la secuencia de ADN de TbH-9FL. SEC ID Nº: 102 es la secuencia de aminoácido deducida de TbH-9FL. SEC ID Nº: 103 es la secuencia de ADN de TbH-9-1. SEC ID Nº: 104 es la secuencia de aminoácido deducida de TbH-9-1. SEC ID Nº: 105 es la secuencia de ADN de TbH-9-4. SEC ID Nº: 106 es la secuencia de aminoácido deducida de TbH-9-4.

SEC ID Nº: 107 es la secuencia de ADN de Tb38-1F2 IN.

SEC ID Nº: 108 es la secuencia de ADN de Tb38-1F2 RP. SEC ID Nº: 109 es la secuencia de aminoácido deducida de Tb37-FL. SEC ID Nº: 110 es la secuencia de aminoácido deducida de Tb38-IN. SEC ID Nº: 111 es la secuencia de ADN de Tb38-1F3. SEC ID Nº: 112 es la secuencia de aminoácido deducida de Tb38-1F3. SEC ID Nº: 113 es la secuencia de ADN de Tb38-1F5. SEC ID Nº: 114 es la secuencia de ADN de Tb38-1F6. SEC ID Nº: 115 es la secuencia de aminoácido N-terminal deducida de DPV. SEC ID Nº: 116 es la secuencia de aminoácido N-terminal deducida de AVGS. SEC ID Nº: 117 es la secuencia de aminoácido N-terminal deducida de AAMK. SEC ID Nº: 118 es la secuencia de aminoácido N-terminal deducida de YYWC. SEC ID Nº: 119 es la secuencia de aminoácido N-terminal deducida de DIGS. SEC ID Nº: 120 es la secuencia de aminoácido N-terminal deducida de AAES. SEC ID Nº: 121 es la secuencia de aminoácido N-terminal deducida de DPEP. SEC ID Nº: 122 es la secuencia de aminoácido N-terminal deducida de APKT. SEC ID Nº: 123 es la secuencia de aminoácido N-terminal deducida de DPAS. SEC ID Nº: 124 es la secuencia de proteína de antígeno N-terminal de DPPD. SEC ID Nº: 125-128 son las secuencias de proteína de cuatro fragmentos de bromuro de cianógeno de

DPPD. SEC ID Nº: 129 es la secuencia de proteína N-terminal de antígeno de XDS. SEC ID Nº: 130 es la secuencia de proteína N-terminal de antígeno de AGD. SEC ID Nº: 131 es la secuencia de proteína N-terminal de antígeno de APE. SEC ID Nº: 132 es la secuencia de proteína N-terminal de antígeno de XYI.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención está dirigida de forma general a métodos para diagnosticar tuberculosis. Tal como se usa en la presente memoria, el término “polipéptido” abarca cadenas de aminoácido de cualquier

longitud, que incluyen proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), en las que los residuos de aminoácido están unidos mediante enlaces peptídicos covalentes. Por tanto, un polipéptido que comprende una porción antigénica de uno de los anteriores antígenos puede consistir completamente en la porción antigénica, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivar del antígeno nativo de M. tuberculosis

o pueden ser heterólogas, y dichas secuencias pueden ser antigénicas (aunque no necesariamente).

Una “porción antigénica” de un antígeno (que puede ser o no soluble) es una porción que es capaz de reaccionar con sueros obtenidos de un individuo infectado con M. tuberculosis (es decir, genera una lectura de absorbancia con sueros procedentes de individuos infectados que está al menos tres desviaciones estándar por encima de la absorbancia obtenida con sueros de individuos no infectados, en un ensayo ELISA representativo descrito en la presente memoria). Un “individuo infectado con M. tuberculosis” es un humano que ha sido infectado con M. tuberculosis (por ejemplo, que tiene una respuesta de ensayo cutáneo intradermal frente a PPD que tiene al menos

40 0,5 cm de diámetro). Los individuos infectados pueden presentar síntomas de tuberculosis o pueden estar libres de síntomas de enfermedad. Los polipéptidos que comprenden al menos una porción antigénica de uno o más antígenos de M. tuberculosis, tal como se describe en la presente memoria, pueden usarse de forma general, solos

o en combinación, para detectar tuberculosis en un paciente. Una “variante”, tal como se usa en la presente memoria, es un polipéptido que difiere del antígeno nativo sólo en

sustituciones y/o modificaciones conservativas, de tal modo que se retienen las propiedades antigénicas del polipéptido. Dichas variantes pueden identificarse de forma general modificando una de las anteriores secuencias de polipéptido, y evaluando las propiedades antigénicas del polipéptido modificado usando, por ejemplo, los procedimientos representativos descritos en la presente memoria.

Una “sustitución conservativa” es aquella en la que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de tal modo que el especialista en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente inmutables. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservativos: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Las variantes pueden también (o alternativamente) estar modificadas, por ejemplo, mediante la eliminación o adición de aminoácidos que tengan una influencia mínima sobre las propiedades antigénicas, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido puede estar conjugado a una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige co-traducción o post-traducción la transferencia de la proteína. El polipéptido también puede estar conjugado a un ligando u otra secuencia para facilitar la síntesis, la purificación o la identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse a una región Fc de inmunoglobulina.

Se describen polipéptidos de combinación. Un “polipéptido de combinación” es un polipéptido que comprende al menos una de las anteriores porciones antigénicas y una o más secuencias antigénicas adicionales de M. tuberculosis, que están unidas mediante un enlace peptídico en una única cadena de aminoácido. Las secuencias pueden estar unidas directamente (es decir, sin aminoácidos intervinientes) o pueden estar unidas mediante una secuencia ligando (por ejemplo, Gly-Cys-Gly) que no disminuye significativamente las propiedades antigénicas de los polipéptidos componentes.

En general, los antígenos de M. tuberculosis, y las secuencias de ADN que codifican dichos antígenos, pueden prepararse usando cualquiera de una variedad de procedimientos. Por ejemplo, se pueden aislar antígenos solubles a partir de filtrado de cultivo de M. tuberculosis mediante procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica, que incluyen la cromatografía de intercambio aniónico y de fase inversa. A continuación los antígenos purificados pueden evaluarse para determinar una propiedad deseada, tal como la capacidad de reaccionar con sueros obtenidos de un individuo infectado con M. tuberculosis. Dichos escrutinios pueden llevarse a cabo usando los métodos representativos descritos en la presente memoria. A continuación los antígenos pueden ser secuenciados parcialmente usando, por ejemplo, química de Edman tradicional. Véase Edman y Berg, Eur. J. Biochem. 80: 116-132, 1967.

Los antígenos también pueden producirse recombinantemente usando una secuencia de ADN que codifica el antígeno, que ha sido insertado en un vector de expresión y expresado en un hospedante apropiado. Las moléculas de ADN que codifican antígenos solubles pueden aislarse mediante escrutinio de una biblioteca de expresión de M. tuberculosis apropiada con anti-sueros (por ejemplo, de conejo) cultivados específicamente contra antígenos de M. tuberculosis solubles. Las secuencias de ADN que codifican antígenos que pueden o no ser solubles pueden identificarse mediante escrutinio de una biblioteca de expresión apropiada genómica de M. tuberculosis de ADNc con sueros obtenidos de pacientes infectados con M. tuberculosis. Dichos escrutinios pueden llevarse a cabo de forma general usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como las descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Las secuencias de ADN que codifican antígenos solubles también pueden obtenerse mediante escrutinio de una biblioteca de ADNc o ADN genómico de M. tuberculosis apropiada, para secuencias de ADN que se hibridan para degenerar oligonucleótidos derivados de secuencias parciales de aminoácidos de antígenos solubles aislados. Las secuencias de oligonucleótidos degeneradas para el uso en dicho escrutinio pueden diseñarse y sintetizarse, y el escrutinio puede llevarse a cabo tal como se describe (por ejemplo) en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (y las referencias citadas en la misma). También se puede emplear reacción en cadena de polimerasa (PCR), usando los anteriores oligonucleótidos en métodos bien conocidos en la técnica, para aislar una sonda de ácido nucleico procedente de una biblioteca de ADNc o genómica. El escrutinio de biblioteca puede llevarse a cabo entonces usando la sonda aislada.

Independientemente del método de preparación, los antígenos descritos en la presente memoria son “antigénicos”. Más específicamente, los antígenos tienen la capacidad de reaccionar con sueros obtenidos a partir de un individuo infectado con M. tuberculosis. La reactividad puede ser evaluada usando, por ejemplo, los ensayos ELISA representativos descritos en la presente memoria, en donde se considera positiva una lectura de absorbancia con sueros a partir de individuos infectados que éste al menos tres desviaciones estándar por encima de la absorbancia obtenida con sueros procedentes de individuos no infectados.

Las porciones antigénicas de antígenos de M. tuberculosis pueden prepararse e identificarse usando técnicas bien conocidas, tales como las enumeradas en Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., Raven Press, 1993, pág. 243247 y las referencias citadas en la misma. Dichas técnicas incluyen el escrutinio de porciones de polipéptido del antígeno nativo para determinar propiedades antigénicas. Los ELISAs representativos descritos en la presente memoria pueden emplearse de forma general en dichos escrutinios. Una porción antigénica de un polipéptido es una porción que, dentro de dichos ensayos representativos, genera una señal en tales ensayos que es sustancialmente similar a la generada por el antígeno de longitud completa. En otras palabras, una porción antigénica de un antígeno de M. tuberculosis genera al menos aproximadamente un 20%, y preferiblemente aproximadamente un 100%, de la señal inducida por el antígeno de longitud completa en un ELISA modelo tal como se describe en la presente memoria.

Se pueden generar porciones y otras variantes de antígenos de M. tuberculosis usando medios sintéticos o recombinantes. Se pueden generar polipéptidos sintéticos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden sintetizarse usando cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles comercialmente, tales como el método de síntesis de fase sólida de Merrifield, en donde se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos creciente. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. El equipamiento para la síntesis automatizada de polipéptidos se encuentra disponible comercialmente a través de suministradores tales como Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA, y puede operarse según las instrucciones del fabricante. Las variantes de un antígeno nativo se pueden preparar de forma general usando técnicas de mutagénesis estándares, tales como la mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótido. También se pueden eliminar secciones de la secuencia de ADN usando técnicas estándares para permitir la preparación de polipéptidos truncados.

Se pueden preparar fácilmente polipéptidos recombinantes que contengan porciones y/o variantes de un antígeno nativo a partir de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido usando una variedad de técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, los sobrenadantes procedentes de sistemas hospedante/vector adecuados que secretan proteína recombinante al medio de cultivo pueden concentrarse primeramente usando un filtro disponible comercialmente. Después de la concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, se puede emplear una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente una proteína recombinante.

Se puede emplear cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los especialistas en la técnica para expresar polipéptidos recombinantes como los descritos en la presente memoria. La expresión se puede lograr en cualquier célula hospedante apropiada que haya sido transformada o transfectada con un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que codifica un polipéptido recombinante. Las células hospedantes adecuadas incluyen procariontes, levadura y células eucarióticas superiores. Preferiblemente, las células hospedantes empleadas son E. coli, levadura o un línea celular de mamífero, tal como COS o CHO. Las secuencias de ADN expresadas de esta manera pueden codificar antígenos naturales, porciones de antígenos naturales y otras variantes de los mismos.

En general, independientemente del método de preparación, los polipéptidos descritos en la presente memoria se preparan en forma sustancialmente pura. Preferiblemente, los polipéptidos son al menos aproximadamente 80% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% puros y lo más preferible al menos aproximadamente 99% puros. Sin embargo, para su uso en los métodos descritos en la presente memoria dichos polipéptidos sustancialmente puros pueden combinarse.

En la presente memoria se describen polipéptidos que comprenden al menos una porción antigénica de un antígeno de M. tuberculosis soluble (o de una variante de dicho antígeno), en donde el antígeno tiene una de las siguientes secuencias N-terminales:

(f): Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro (SEC ID Nº: 120);

(i): Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Gln-Thr-Ser-Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn (SEC ID Nº: 123);

en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente un residuo de cisteína. En la SEC ID Nº: 52 se proporciona una secuencia de ADN que codifica el antígeno identificado arriba como (g), cuya secuencia de aminoácidos deducida se proporciona en la SEC ID Nº: 53. En la SEC ID Nº: 96 se proporciona una secuencia de ADN que codifica el antígeno identificado arriba como (a), su secuencia de aminoácidos deducida se proporciona en la SEC ID Nº: 97. En la SEC ID Nº: 24 se proporciona una secuencia de ADN correspondiente al antígeno (d) anterior, en la SEC ID Nº: 25 se proporciona una secuencia de ADN correspondiente al antígeno (c) y en la SEC ID Nº: 94 se proporciona una secuencia de ADN correspondiente al antígeno (i) y su secuencia de aminoácidos deducida se proporciona en la SEC ID Nº: 95.

En la presente memoria también se describen polipéptidos que comprenden al menos una porción inmunogénica de un antígeno de M. tuberculosis que tiene una de las siguientes secuencias N-terminales, o una variante del mismo que difiere sólo en sustituciones y/o modificaciones conservativas:

(m): Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val; (SEC ID Nº: 132) ó

(n): Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe; (SEC ID Nº: 124)

en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente un residuo de cisteína.

En la presente memoria también se describen polipéptidos que comprenden al menos una porción antigénica de un antígeno de M. tuberculosis soluble (o una variante de dicho antígeno) que comprende una o más secuencias de aminoácido codificadas por (a) las secuencias de ADN de las SEC ID Nº: 1, 2, 4-10, 13-25, 52, 94 y 96, (b) los complementos de dichas secuencias de ADN o (c) las secuencias de ADN sustancialmente homólogas a una secuencia de (a) o (b).

En la presente memoria también se describen polipéptidos que comprenden al menos una porción antigénica de un antígeno de M. tuberculosis (o una variante de dicho antígeno), que puede ser soluble o no, que comprende una o más secuencias de aminoácido codificadas por (a) las secuencias de ADN de las SEC ID Nº: 26-51, (b) los complementos de dichas secuencias de ADN o (c) secuencias de ADN sustancialmente homólogas a una secuencia de (a) o (b).

Los antígenos de M. tuberculosis incluyen variantes que son secuencias de ADN codificadas que son sustancialmente homólogas a una o más de las secuencias de ADN mencionadas específicamente en la presente memoria. “Homología sustancial”, tal como se usa aquí, se refiere a secuencias de ADN que son capaces de hibridarse en condiciones moderadamente severas. Las condiciones moderadamente severas adecuadas incluyen un prelavado en una disolución de 5X SSC, 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridarse a 50ºC-65ºC, 5X SSC, durante una noche o, en caso de homología de especies cruzadas, a 45ºC con 0,5X SSC; seguida de un doble lavado a 65ºC durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0,5X y 0,2X SSC que contienen un 0,1% de SDS).

En la presente memoria también se describen proteínas de fusión que comprenden un primer y un segundo polipéptidos como los descritos aquí, o alternativamente un polipéptido como los descritos aquí y un antígeno de M. tuberculosis conocido, tal como el antígeno de 38 kD descrito anteriormente o ESAT-6 (SEC ID Nº: 98 y 99), junto con las variantes de dichas proteínas de fusión. Las proteínas de fusión también pueden incluir un péptido ligando entre el primer y el segundo polipéptidos.

Se construye una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión usando técnicas de ADN recombinante para construir secuencias de ADN que codifican el primer y el segundo polipéptidos en un vector de expresión apropiado. Se liga el extremo 3’ de una secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido, con o sin un ligando peptídico, al extremo 5’ de una secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido de tal modo que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase para permitir la traducción de ARNm de las dos secuencias de ADN en una única proteína de fusión que retenga la actividad biológica del primer y el segundo polipéptidos.

Se puede emplear una secuencia de ligando peptídico para separar el primer y el segundo polipéptidos por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Dicha secuencia de ligando peptídico se incorpora a la proteína de fusión usando técnicas estándares bien conocidas en la técnica. Las secuencias de ligando peptídico adecuadas pueden seleccionarse en base a los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interaccionar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos; y (3) la carencia de residuos hidrofóbicos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias de ligando peptídico preferidas contienen residuos Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos neutros, tales como Thr y Ala también pueden usarse en la secuencia de ligando. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse de manera útil como ligandos incluyen aquellas descritas en Maratea y col., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8562, 1986; la Patente de EE.UU. nº 4.935.233 y la Patente de EE.UU. Nº 4.751.180. La secuencia de ligando puede tener una longitud de entre 1 y aproximadamente 50 aminoácidos. Las secuencias de ligando peptídico no son requeridas cuando el primer y segundo polipéptidos no tienen regiones N-terminales no esenciales que puedan usarse para separar los dominios funcionales y prevenir impedimentos estéricos.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para detectar la infección de M. tuberculosis en una muestra biológica. En realizaciones en las que se emplean polipéptidos múltiples, se pueden incluir polipéptidos que no sean los descritos específicamente en la presente memoria, tal como el antígeno de 38 kD descrito en Andersen y Hansen, Infect. Immun. 57: 2481-2488, 1989. Tal como se usa en la presente memoria, una “muestra biológica” es cualquier muestra que contenga anticuerpos obtenida de un paciente. Preferiblemente, la muestra es sangre entera, esputo, suero, plasma, saliva, fluido cerebroespinal u orina. Más preferiblemente, la muestra es una muestra de sangre, suero o plasma obtenida de un paciente o de un banco de sangre. El(los) polipéptido(s) se usa(n) en un ensayo, tal como se describe más adelante, para determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos de el(los) polipéptido(s) de la muestra, respecto a un valor de corte predeterminado. La presencia de dichos anticuerpos indica una sensibilización previa a antígenos micobacterianos que puede ser indicativa de tuberculosis.

En las realizaciones en las que se emplea más de un polipéptido, los polipéptidos usados preferiblemente son complementarios (es decir, un polipéptido componente tenderá a detectar la infección en muestras en las que la infección no sería detectada por otro polipéptido componente). Los polipéptidos complementarios generalmente se pueden identificar usando cada polipéptido individualmente para evaluar muestras de suero obtenidas de una serie de pacientes que se sabe han sido infectados con M. tuberculosis. Tras determinar qué muestras son positivas en el ensayo (como se describe más adelante) para cada polipéptido, se pueden formular combinaciones de dos o más polipéptidos que sean capaces de detectar la infección en la mayoría, o en todas, las muestras evaluadas. Dichos polipéptidos son complementarios. Por ejemplo, aproximadamente el 25-30% de los sueros procedentes de individuos infectados con tuberculosis son negativos para anticuerpos de cualquier proteína sencilla, tales como el antígeno de 38 kD mencionado anteriormente. Por tanto, los polipéptidos pueden usarse en combinación con el antígeno de 38 kD para mejorar la sensibilidad de un ensayo diagnóstico.

Existe una variedad de formatos de ensayo conocidos por los especialistas en la técnica para usar uno o más polipéptidos para detectar anticuerpos en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En una realización preferida, el ensayo implica el uso de un polipéptido inmovilizado sobre un soporte sólido para unirse al anticuerpo y eliminarlo de la muestra. El anticuerpo ligado puede ser detectado a continuación usando un reactivo de detección que contenga un grupo indicador. Los reactivos de detección adecuados incluyen anticuerpos que se unen al complejo anticuerpo/polipéptido y polipéptido libre marcado con un grupo indicador (por ejemplo, en un ensayo semi-competitivo). Alternativamente, se puede utilizar un ensayo competitivo en el que se marca un anticuerpo que se une al polipéptido con un grupo indicador y se permite que se una al antígeno inmovilizado tras incubación del antígeno con la muestra. La extensión en la que los componentes de la muestra inhiben la unión del anticuerpo marcado con el polipéptido es indicativa de la reactividad de la muestra con el polipéptido inmovilizado.

El soporte sólido puede ser cualquier material sólido conocido por los especialistas en la técnica al que se pueda unir el antígeno. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo en una placa de microtitulación o en una membrana de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Alternativamente, el soporte puede ser una esfera o disco, tal como de vidrio, de fibra de vidrio, de látex o de material plástico tal como poliestireno o policloruro de vinilo. El soporte también puede ser una partícula magnética o un sensor de fibra óptica, tal como los descritos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 5.359.681.

Los polipéptidos se pueden ligar al soporte sólido usando una variedad de técnicas conocidas por los especialistas en la técnica, que se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes. En el contexto de la presente invención, el término “ligado” se refiere tanto a una asociación no covalente, tal como una adsorción, como a una unión covalente (que puede ser un enlace directo entre el antígeno y grupos funcionales del soporte, o puede ser un enlace a través de un agente reticulante). Se prefiere la unión mediante adsorción a un pocillo en una placa de microtitulación o a una membrana. En tales casos, la adsorción puede lograrse poniendo en contacto el polipéptido, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante un periodo de tiempo adecuado. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero habitualmente se encuentra aproximadamente entre 1 hora y 1 día. En general, poner en contacto un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o policloruro de vinilo) con una cantidad de polipéptido que oscila entre aproximadamente 10 ng y aproximadamente 1 µg, y preferiblemente aproximadamente 100 ng, es suficiente para fijar una cantidad adecuada de antígeno.

La unión covalente de polipéptido a un soporte sólido generalmente puede llevarse a cabo haciendo reaccionar primero el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o un grupo amino, del polipéptido. Por ejemplo, el polipéptido puede fijarse a soportes que tengan un recubrimiento polimérico apropiado usando benzoquinona o mediante condensación de un grupo aldehído del soporte con una amina y un hidrógeno activo del polipéptido (véase, por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, en A12-A13).

En determinadas realizaciones, el ensayo es un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA). Este ensayo puede llevarse a cabo poniendo en contacto primero un antígeno polipéptido que haya sido inmovilizado sobre un soporte sólido, normalmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra, de tal modo que se permite que los anticuerpos del polipéptido que hay en la muestra se unan al polipéptido inmovilizado. La muestra no ligada es eliminada a continuación del polipéptido inmovilizado y se añade un reactivo de detección capaz de unirse al complejo de polipéptido-anticuerpo inmovilizado. La cantidad de reactivo de detección que permanece ligado al soporte sólido se determina entonces usando un método apropiado para el reactivo de detección específico.

Más específicamente, una vez que el polipéptido se ha inmovilizado sobre el soporte como se ha descrito anteriormente, los centros de unión de proteína que quedan en el soporte normalmente son bloqueados. Se puede emplear cualquier agente de bloqueo adecuado conocido por los especialistas en la técnica, tal como albúmina de suero bovino o Tween 20TM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Entonces el polipéptido inmovilizado es incubado con la muestra, y se deja que el anticuerpo se una al antígeno. La muestra puede diluirse con un diluyente adecuado, tal como disolución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la incubación. En general, un periodo de contacto apropiado (es decir, un tiempo de incubación) es aquel periodo de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de anticuerpo en una muestra infectada con M. tuberculosis. Preferiblemente, el tiempo de contacto es suficiente para alcanzar un nivel de unión que sea al menos el 95% del alcanzado en el equilibrio entre anticuerpo libre y ligado. Los especialistas en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio puede determinarse fácilmente evaluando el nivel de unión que se produce durante un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, generalmente es suficiente un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos.

A continuación, la muestra no ligada se elimina mediante lavado del soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que contiene un 0,1% de Tween 20TM. Entonces se puede añadir el reactivo de detección al soporte sólido. Un reactivo de detección apropiado es cualquier compuesto que se una al complejo polipéptido-anticuerpo inmovilizado y que pueda ser detectado por cualquiera de una serie de medios conocidos por los especialistas en la técnica. Preferiblemente, el reactivo de detección contiene un reactivo de unión (tal como, por ejemplo, Proteína A, Proteína G, inmunoglobulina, lectina o antígeno libre) conjugado con un grupo indicador. Los grupos indicadores preferidos incluyen enzimas (tales como peroxidasa de rábano), sustratos, cofactores, inhibidores, colorantes, radionucleidos, grupos luminiscentes, grupos fluorescentes y biotina. La conjugación de agente de unión con grupo indicador puede lograrse usando métodos estándares conocidos por los especialistas en la técnica. Los agentes de unión comunes también pueden adquirirse conjugados a una serie de grupos indicadores procedentes de múltiples fuentes comerciales (por ejemplo, Zymed Laboratories, San Francisco, CA, y Pierce, Rockford, IL).

A continuación se incuba el reactivo de detección con el complejo polipéptido-anticuerpo inmovilizado durante un periodo de tiempo suficiente para detectar el anticuerpo ligado. El periodo de tiempo apropiado se puede determinar de forma general a partir de las instrucciones del fabricante, o evaluando el nivel de unión que se produce a lo largo de un periodo de tiempo. El reactivo de detección no ligado se elimina a continuación y el reactivo de detección ligado se detecta usando el grupo indicador. El método empleado para detectar el grupo indicador depende de la naturaleza del grupo indicador. Para grupos radioactivos, generalmente son apropiados métodos de conteo de centelleo o métodos autorradiográficos. Se pueden usar métodos espectroscópicos para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. La biotina se puede detectar usando avidina, acoplada a un grupo indicador diferente (comúnmente un grupo radioactivo o fluorescente o una enzima). Los grupos indicadores enzimáticos generalmente se pueden detectar mediante la adición de sustrato (generalmente durante un periodo de tiempo específico), seguido de análisis espectroscópico o de otro tipo de los productos de reacción.

Para determinar la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-M. tuberculosis en la muestra, generalmente se compara la señal detectada del grupo indicador que queda ligado al soporte sólido con una señal que corresponde a un valor de corte predeterminado. En una realización preferida, el valor de corte es la señal promedio obtenida cuando el antígeno inmovilizado se incuba con muestras procedentes de un paciente no infectado. En general, una muestra que genera una señal que está tres desviaciones estándar por encima del valor de corte predeterminado se considera positiva para tuberculosis. En una realización preferida alternativa, el valor de corte se determina usando una Curva de Operador Receptor, según el método de Sackett y col., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, pág. 106-107. En resumen, en esta realización, el valor de corte puede determinarse a partir de una representación de pares de tasas de positivos verdaderos (es decir, sensibilidad) y tasas de positivos falsos (100% de especificidad) que corresponden a cada posible valor de corte para el resultado del ensayo diagnóstico. El valor de corte en el gráfico que está más cerca de la esquina superior izquierda (es decir, el valor que abarca el mayor área) es el valor de corte más preciso, y una muestra que genera una señal que superior al valor de corte determinado mediante este método puede considerarse positiva. Alternativamente, el valor de corte puede desplazarse a la izquierda del gráfico, para minimizar la tasa de positivos falsos, o a la derecha, para minimizar la tasa de negativos falsos. En general, una muestra que genera una señal que es superior al valor de corte determinado mediante este método se considera positiva para tuberculosis.

En una realización relacionada, el ensayo se lleva a cabo en un formato de ensayo de flujo rápido o de tira, en donde el antígeno es inmovilizado sobre una membrana, tal como nitrocelulosa. En el ensayo de flujo los anticuerpos de la muestra se unen al péptido inmovilizado según la muestra va pasando a través de la membrana. A continuación se liga un reactivo de detección (por ejemplo, proteína A-oro coloidal) al complejo anticuerpopolipéptido según la disolución que contiene el reactivo de detección se hace pasar a través de la membrana. La detección de reactivo de detección ligado puede llevarse a cabo entonces como se ha descrito antes. En el formato de ensayo de tira, un extremo de la membrana a la que está ligado el polipéptido se sumerge en una disolución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene reactivo de detección y hasta el área de polipéptido inmovilizado. La concentración de reactivo de detección en el polipéptido indica la presencia de anticuerpos anti-M. tuberculosis en la muestra. Normalmente, la concentración de reactivo de detección en dicha posición genera una estructura, tal como una línea, que puede leerse visualmente. La ausencia de dicha estructura indica un resultado negativo. En general, se selecciona la cantidad de polipéptido inmovilizado sobre la membrana para generar una estructura que sea discernible visualmente cuando la muestra biológica contienen un nivel de anticuerpos que sería suficiente para generar una señal positiva en un ELISA, tal como se ha discutido antes. Preferiblemente, la cantidad de polipéptido inmovilizado sobre la membrana oscila entre aproximadamente 25 ng y aproximadamente 1 µg, y más preferiblemente entre aproximadamente 50 ng y aproximadamente 500 ng. Dichos ensayos pueden llevarse a cabo típicamente con una cantidad muy pequeña (por ejemplo, una gota) de suero o sangre del paciente.

Por supuesto, existen otros muchos protocolos de ensayo que son adecuados para su uso con los polipéptidos de la presente invención. Las descripciones anteriores solamente pretenden proporcionar ejemplos.

Los siguientes Ejemplos se presentan a modo de ilustración, y no como limitación.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Purificación y Caracterización de Polipéptidos procedentes de Filtrado de Cultivo de M. tuberculosis

Este ejemplo presenta la preparación de polipéptidos solubles de M. tuberculosis a partir de filtrado de cultivo. A menos que se indique lo contrario, todos los porcentajes del siguiente ejemplo están en peso referido a volumen.

Se cultivó M. tuberculosis (bien H37Ra, Nº ATCC 25177 o bien H37Rv, Nº ATCC 25618) en medio GAS estéril a 37ºC durante catorce días. A continuación se filtró a vacío el medio (dejando la masa celular) a través de un filtro de 0,45 µ en una botella esterilizada de 2,5 L. A continuación se filtro del medio a través de un filtro de 0,2 µ en una botella esterilizada de 4 L. Entonces se añadió NaN3 al filtrado de cultivo hasta una concentración de 0,04%. A continuación se colocaron las botellas en una cámara fría a 4ºC.

El filtrado de cultivo se concentró llevando el filtrado a un reservorio de 12 L que había sido autoclavado y alimentando el filtrado en una célula de agitación Amicon de 400 mL que había sido aclarada con etanol y que contenía una membrana MWCO de 10.000 kDa. Se mantuvo la presión a 4,4 bar (60 psi) usando gas nitrógeno. Este procedimiento redujo el volumen de 12 L a aproximadamente 50 mL.

A continuación se dializó el filtrado de cultivo en bicarbonato amónico al 0,1% usando una membrana de éster de celulosa MWCO de 8.000 kDa, con dos cambios de disolución de bicarbonato amónico. Entonces se determinó la concentración de proteína empleando un ensayo de BCA disponible comercialmente (Pierce, Rockford, IL).

A continuación el filtrado de cultivo se liofilizó, y los polipéptidos se volvieron a suspender en agua destilada. Los polipéptidos fueron dializados entonces frente a 1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino]-propano 0,01 mM, pH 7,5 (tampón de Bis-Tris propano), las condiciones iniciales para cromatografía de intercambio aniónico. Se llevó a cabo un fraccionamiento usando cromatografía de perfusión de gel en una columna de intercambio aniónico POROS 146 II Q/M de 4,6 mm x 100 mm (Perseptive BioSystems, Framingham, MA) equilibrada en tampón Bis-Tris propano 0,01 mM de pH 7,5. Los polipéptidos fueron eluídos con un gradiente lineal de NaCl de 0-0,5 M en el anterior sistema tamponante. Se monitorizó el eluyente de la columna a una longitud de onda de 220 nm.

Los grupos de polipéptidos que eluyen de la columna de intercambio iónico se sometieron a diálisis frente a agua destilada y se liofilizaron. El material resultante se disolvió en ácido trifluoroacético al 0,1% (TFA) pH 1,9 en agua, y los polipéptidos fueron purificados en una columna C18 Delta-Pak (Waters, Milford, MA) con tamaño de poro 300 Angstrom, tamaño de partícula 5 micras (3,9 x 150 mm). Los polipéptidos fueron eluídos de la columna con un gradiente lineal con 0-60% de tampón de dilución (TFA al 0,1% en acetonitrilo). El caudal fue de 0,75 mL/minuto y se monitorizó el eluyente de HPLC a 214 nm. Se recogieron las fracciones que contenían los polipéptidos eluídos para maximizar la pureza de las muestras individuales. Se obtuvieron aproximadamente 200 polipéptidos purificados.

A continuación los polipéptidos purificados fueron escrutados para determinar su capacidad para inducir la proliferación de células T en preparaciones de PBMC. Las PBMCs de donantes positivos en el ensayo cutáneo de PPD y cuyas células T proliferan en respuesta a PPD y a proteínas solubles crudas de MTB fueron cultivadas en un medio que comprende RPMI 1640 suplementado con un 10% se suero humano mixto y 50 µg/mL de gentamicina. Se añadieron los polipéptidos purificados por duplicado a concentraciones de 0,5 a 10 µg/mL. Tras seis días de cultivo en placas de 96 pocillos de fondo redondo en un volumen de 200 µL, se retiraron 50 µL de medio de cada pocillo para determinar los niveles de IFN-y, tal como se describe más adelante. A continuación las placas fueron sometidas a pulsos de 1 µCi/pocillo de timidina tritiada durante otras 18 horas, se recolectaron y se determinó la captación de tritio usando un contador de centelleo de gas. Se consideraron positivas las fracciones que dieron como resultado proliferaciones en ambas réplicas tres veces más altas que la proliferación observada en células

cultivadas solamente en medio.

Se midió el IFN-y usando unensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA). Las placas ELISA se recubrieron con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a IFN-y humano (Chemicon) en PBS durante cuatro horas a temperatura ambiente. Entonces los pocillos fueron bloqueados con PBS que contenía un 5% (p/v) de leche seca desnatada 5 durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación las placas se lavaron seis veces en PBS/TWEEN-20 al 0,2% y las muestras diluidas 1:2 en medio de cultivo en las placas ELISA fueron incubadas durante una noche a temperatura ambiente. Se volvió a lavar las placas y se añadió a cada pocillo un suero de IFN-y anti-humano de conejo policlonal diluido 1:3000 en PBS/suero de cabra normal al 10%. A continuación las placas fueron incubadas durante dos horas a temperatura ambiente, se lavaron y se añadió IgG anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano

10 (Jackson Labs.) a una dilución 1:2000 en PBS/leche seca desnatada al 5%. Tras otras dos horas de incubación a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas y se añadió sustrato de TMB. La reacción se detuvo después de 20 minutos con ácido sulfúrico 1 N. Se determinó la densidad óptica a 450 nm usando 570 nm como longitud de onda de referencia. Las fracciones que dieron como resultado en ambas réplicas una DO dos veces más elevada que la DO media de células cultivadas solamente en medio, más 3 desviaciones estándar, fueron consideradas positivas.

15 Para el secuenciamiento, los polipéptidos fueron secados individualmente sobre filtros de fibra de vidrio tratados con BiobreneTM (Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA). Los filtros con polipéptido fueron cargados en un secuenciador de proteínas Perkin Elmer/Applied BioSystems Division Procise 492. Los polipéptidos fueron secuenciados desde el extremo aminoterminal y usando química de Edman tradicional. Se determinó la secuencia de aminoácidos de cada polipéptido comparando el tiempo de retención del derivado de aminoácido PTH con los

20 patrones de derivados PTH apropiados.

Usando el procedimiento descrito antes, se aislaron los antígenos que presentan las siguientes secuencias:

(a): Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Xaa-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu (SEC ID Nº: 54);

(b): Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser (SEC ID Nº: 55);

(c): Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg (SED ID Nº: 56);

25 (d) Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro (SEC ID Nº: 57);

(e): Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val (SEC ID Nº: 58);

(f): Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro (SEC ID Nº: 59);

(g): Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Pro-Ala (SEC ID Nº: 60); y

(h): Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly (SEC ID Nº: 61);

30 en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

Se aisló un antígeno adicional empleando una etapa de purificación en HPLC de microboro además del procedimiento descrito anteriormente. Específicamente, se purificaron 20 µL de una fracción que comprendía una mezcla de antígeno procedentes de la etapa de purificación cromatográfica descrita previamente, en una columna C18 Aquapore (Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA) con una tamaño de poro de 7 micras, y

35 un tamaño de columna de 1 mm x 100 mm, en un HPLC Modelo 172 de Perkin Elmer/Applied Biosystems Division. Las fracciones fueron eluídas de la columna con un gradiente lineal de 1%/minuto de acetonitrilo (que contiene TFA al 0,05%) en agua (con TFA al 0,05%) a un caudal de 80 µL/minuto. Se monitorizó el eluyente a 250 nm. La fracción original se separó en 4 picos principales más otros componentes menores y se obtuvo un polipéptido con un peso molecular de 12,054 Kd (por espectrometría de masas) y con la siguiente secuencia N-terminal:

40 (i) Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Gln-Thr-Ser-Leu-Leu-Asn-Asn-Leu-Ala-Asp-Pro-Asp-Val-Ser-Phe-Ala-Asp (SEC ID Nº: 62).

Se demostró que este polipéptido induce la proliferación y la producción de IFN-y en preparaciones de PBMC usando los ensayos descritos anteriormente.

Se aislaron antígenos solubles adicionales procedentes de filtrado de cultivo de M. tuberculosis como se indica a

45 continuación. Se preparó el filtrado de cultivo de M. tuberculosis como se ha descrito anteriormente. Después de la diálisis contra tampón Bis-Tris propano, a pH 5,5, se llevó a cabo un fraccionamiento usando cromatografía de intercambio aniónico en una columna Poros QE de 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems) equilibrada en tampón Bis-Tris propano de pH 5,5. Los polipéptidos fueron eluídos con un gradiente lineal de NaCl 0-1,5 M en el anterior sistema tamponante con un caudal de 10 mL/min. Se monitorizó el eluyente de la columna a una longitud de onda

50 de 214 nm.

Las fracciones que eluían de la columna de intercambio iónico se reunieron y se sometieron a cromatografía de fase inversa usando una columna Poros R2 de 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems). Los polipéptidos fueron eluídos de la columna con un gradiente lineal de acetonitrilo de 0-100% (con TFA al 0,1%) con un caudal de 5 mL/min. El eluyente fue monitorizado a 214 nm.

Las fracciones que contenían los polipéptidos eluídos fueron liofilizadas y vueltas a suspender en 80 µL de TFA al 0,1% en agua y se sometieron adicionalmente a cromatografía de fase inversa en una columna Vydac C4 de 4,6 x 5 150 mm (Western Analytical, Temecula, CA) con un gradiente lineal de acetonitrilo de 0-100% (con un 0,1% de TFA) con un caudal de 2 mL/min. El eluyente fue monitorizado a 214 nm.

La fracción con actividad biológica se separó en un pico principal más otros componentes más pequeños. El análisis de transferencia Western de dicho pico sobre membrana de PVDF reveló tres bandas principales de pesos moleculares 14 Kd, 20 Kd y 26 Kd. Se determinó que estos polipéptidos tenían las siguientes secuencias N

10 terminales, respectivamente:

(k): Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp; (SEC ID Nº: 130) y

(l): Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly; (SEC ID Nº: 131

en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

15 Usando los ensayos descritos anteriormente, se demostró que estos polipéptidos inducen la proliferación y la producción de IFN-y en preparaciones de PBMC. Las �iguras 1A y B muestran los resultados de dichos ensayos que usan preparaciones de PBMC de un primer donante y de un segundo donante, respectivamente.

Las secuencias de ADN que codifican los antígenos designados anteriormente como (a), (c), (d) y (g) fueron obtenidas mediante escrutinio de una biblioteca genómica de M. tuberculosis usando oligonucleótidos degenerados 20 marcados en el extremo con 32P correspondientes a la secuencia N-terminal y que contienen una orientación de codón de M. tuberculosis. El escrutinio realizado usando una sonda correspondiente al antígeno (a) anterior identificó un clon que presenta la secuencia proporcionada en la SEC ID Nº: 96. El polipéptido codificado por la SEC ID Nº: 96 se proporciona en la SEC ID Nº: 97. El escrutinio realizado usando una sonda correspondiente al antígeno

(g) anterior identificó un clon que presenta la secuencia proporcionada en la SEC ID Nº: 52. El polipéptido codificado

25 por la SEC ID Nº: 52 se proporciona en la SEC ID Nº: 53. El escrutinio realizado usando una sonda correspondiente al antígeno (d) anterior identificó un clon que presenta la secuencia proporcionada en la SEC ID Nº: 24, y el escrutinio realizado con un sonda correspondiente al antígeno (c) anterior identificó un clon que tiene la secuencia proporcionada en la SEC ID Nº: 25.

Las anteriores secuencias de aminoácidos fueron comparadas con secuencias de aminoácidos conocidas del banco

30 de genes usando el sistema DNA STAR. La base de datos escrutada contiene unas 173.000 proteínas y es una combinación de las bases de datos Swiss y PIR, junto con secuencias de proteínas traducidas (Versión 87). No se detectaron homologías significativas con las secuencias de aminoácidos correspondientes a los antígenos (a)-(h) y (l).

Se observó que la secuencia de aminoácidos correspondiente al antígeno (i) era homóloga a una secuencia

35 procedente de M. leprae. La secuencia de longitud completa de M. leprae fue amplificada a partir de ADN genómico usando la secuencia obtenida del GENBANK. A continuación dicha secuencia fue usada para escrutar una biblioteca de M. tuberculosis y se obtuvo una copia de longitud completa del homólogo de M. tuberculosis (SEC ID Nº: 94).

Se observó que la secuencia de aminoácidos del antígeno (j) era homóloga respecto a una proteína conocida de M. tuberculosis traducida de una secuencia de ADN. Hasta donde alcanza el conocimiento de los inventores, no se

40 demostrado previamente que esta proteína posea actividad estimuladora de células T. Se observó que la secuencia de aminoácidos correspondiente al antígeno (k) está relacionada con una secuencia de M. leprae.

En los ensayos de proliferación y de IFN-y descritos anteriormente, usando tres donantes positivos de PP�, los resultados correspondientes a los antígenos representativos proporcionados antes se presentan en la Tabla 1:

TABLA 1

45 Resultados de los ensayos de proliferación de PBMC y de IFN-y En la Tabla 1, las respuestas que generaron un índice de estimulación (IE) entre 2 y 4 (en comparación con células cultivadas solamente en medio) fueron puntuadas como +, un IE de 4-8 ó de 2-4 a una concentración de 1 µg o menos fue puntuado como ++ y un IE de más de 8 fue puntuado como +++. Se observó que al antígeno de la secuencia (i) presenta un IE elevado (+++) para un donante y un IE menor (++ y +) para los otros dos donantes tanto en el ensayo de proliferación como en el de IFN-y. Estos resultados indican que dichos antígenos son capaces de inducir la proliferación y/o la producción de interferón-y.

Secuencia: Proliferación IFN-y

(a): + -

(c): +++ +++

(d): ++ ++

(g): +++ +++

(h): +++ +++

EJEMPLO 2

Uso de sueros de paciente para aislar antígenos de M. tuberculosis

Este ejemplo ilustra el aislamiento de antígenos procedentes de lisato de M. tuberculosis mediante escrutinio con suero de individuos infectados con M. tuberculosis.

Se añadió H37Ra de M. tuberculosis desecado (Difco Laboratories) a una disolución de NP40 al 2%, y alternativamente se homogeneizó y se sometió a ultrasonidos tres veces. La suspensión resultante se centrifugó a

13.000 rpm en tubos de microcentrífuga y el sobrenadante se hizo pasar a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras. El filtrado se ligó a esferas Macro Prep DEAE (BioRad, Hercules, CA). Las esferas se lavaron concienzudamente con Tris 20 mM de pH 7,5 y las proteínas ligadas se eluyeron con NaCl 1 M. El eluato de NaCl fue dializado durante la noche contra Tris 10 mM, pH 7,5. La disolución dializada fue tratada con ADNasa y ARNasa a 0,05 mg/mL durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación con� -D-manosidasa, 0,5 U/mg a pH 4,5 durante 3-4 horas a temperatura ambiente. Tras volver a pH 7,5, el material se fraccionó mediante HPLC en una columna Bio Scale-Q-20 (BioRad). Las fracciones fueron combinadas en nueve grupos, se concentraron en una Centriprep 10 (Amicon, Beverley, MA) y se escrutaron mediante transferencia Western para determinar la actividad serológica usando un grupo de sueros procedente de pacientes infectados con M. tuberculosis que no era inmunorreactivo con otros antígenos de la presente invención.

La fracción más reactiva se sometió a SDS-PAGE y se transfirió a PVDF. Se cortó una banda a aproximadamente 85 Kd dando lugar a la secuencia:

(m) Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val; (SEC ID Nº: 132)

en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

La comparación de esta secuencia con las del banco de genes, tal como se ha descrito antes, reveló que no había homologías significativas con secuencias conocidas.

EJEMPLO 3

Preparación de secuencias de ADN que codifican antígenos de M. tuberculosis

Este ejemplo ilustra la preparación de secuencias de ADN que codifican antígenos de M. tuberculosis mediante el escrutinio de una biblioteca de expresión de M. tuberculosis con sueros obtenidos de pacientes infectados con M. tuberculosis, o con anti-sueros producidos contra antígenos de M. tuberculosis.

A. Preparación de antígenos solubles de M. tuberculosis usando anti-sueros de conejo

Se aisló ADN genómico procedente de la cepa H37Ra de M. tuberculosis. El ADN se cortó aleatoriamente y se usó para construir una biblioteca de expresión usando el sistema de expresión Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA). Se generaron anti-sueros de conejo contra proteínas secretoras de las cepas H37Ra, H37Rv y Erdman de M. tuberculosis inmunizando un conejo con sobrenadante concentrado de los cultivos de M. tuberculosis. Específicamente, el conejo fue inmunizado primero subcutáneamente con 200 µg de proteína antígeno en un volumen total de 2 mL que contenían 100 µg de dipéptido de muramilo (Calbiochem, La Jolla, CA) y 1 mL de adyuvante incompleto de Freund. Cuatro semanas después se inyectó subcutáneamente al conejo con 100 µg de antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Finalmente, el conejo se inmunizó intravenosamente cuatro semanas después con 50 µg de proteína antígeno. Se usaron los antisueros para escrutar la biblioteca de expresión tal como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Se purificaron placas bacteriófagas que expresan antígenos inmunorreactivos. Se rescató fagémido de las placas y se dedujeron las secuencias de nucleótidos de los clones de M. tuberculosis.

Se purificaron treinta y dos clones. De ellos, 25 representan secuencias que no han sido identificadas previamente en M. tuberculosis. Se indujeron proteínas mediante IPTG y se purificaron mediante elución de gel, tal como se describe en Skeiky y col., J. Exp. Med. 181: 1527-1537, 1995. Las secuencias parciales representativas de moléculas de ADN identificadas en este escrutinio se proporcionan en las SEC ID Nº: 1-25. Las correspondientes secuencias de aminoácidos predichas se muestran en las SEC ID Nº: 64-88.

Comparando estas secuencias con secuencias conocidas del banco de genes usando las bases de datos descritas anteriormente, se descubrió que los clones denominados a partir de aquí TbRA2A, TbRA16, TbRA18 y TbRA29 (SEC ID Nº: 77, 69, 71, 76) muestran algo de homología con respecto a secuencias identificadas previamente en Mycobacterium leprae pero no en M. tuberculosis. TbRA11, TbRA26, TbRA28 y TbDPEP (SEC ID Nº: 66, 74, 75, 53) han sido identificadas previamente en M. tuberculosis. No se observaron homologías significativas en TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, TbRA19, TbRA29, TbRA32, TbRA36 y los clones solapantes TbRA35 y TbRA12 (SEC ID Nº: 64, 78, 82, 83, 65, 68, 76, 72, 76, 79, 81, 80, 67, respectivamente). El clon TbRA24 se solapa con el clon TbRA29.

B. Uso de sueros de paciente para identificar secuencias de ADN que codifican antígenos de M. tuberculosis

La biblioteca de ADN genómico descrita anteriormente, y una biblioteca adicional de H37Rv, fueron escrutadas usando conjuntos de sueros obtenidos de pacientes con tuberculosis activa. Para preparar la biblioteca de H37Rv, se aisló ADN genómico de la cepa H37Rv de M. tuberculosis, se sometió a una digestión parcial con Sau3A y se usó para construir una biblioteca de expresión usando el sistema de expresión Lambda Zap (Stratagene, La Jolla, CA). En el escrutinio de expresión se usaron tres conjuntos diferentes de sueros, cada uno compuesto por sueros obtenidos de tres individuos con enfermedad pulmonar o pleural activa. Los conjuntos se denominaron TbL, TbM y TbH, en referencia a la reactividad relativa con lisato de H37Ra (es decir, TbL = reactividad baja, TbM = reactividad media y TbH = reactividad alta) en formato ELISA y de inmunotinción. También se empleó un cuarto conjunto de sueros de siete pacientes con tuberculosis pulmonar activa. Todos los sueros carecían de reactividad incrementada con la proteína recombinante de unión de fosfato H37Ra de M. tuberculosis de 38 kD.

Todos los conjuntos fueron pre-adsorbidos con lisato de E. coli y se usaron para escrutar las bibliotecas de expresión de H37Ra y H37Rv, tal como se describe en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Se purificaron placas bacteriófagas que expresan antígenos inmunorreactivos. Se rescató el fagémido de las placas y se dedujeron las secuencias de nucleótidos de los clones de M. tuberculosis.

Se purificaron treinta y dos clones. De ellos, 31 representaban secuencias que no habían sido identificadas previamente en M. tuberculosis humano. En las SEC ID Nº: 26-51 y 100 se proporcionan secuencias representativas de las moléculas de ADN identificadas. De éstas, la TbH-8 y la TbH-8-2 (SEC ID Nº: 100) son secuencias de ADN no contiguas del mismo clon, y la TbH-4 (SEC ID Nº: 43) y la TbH-4-FWD (SEC ID Nº: 44) son secuencias no contiguas del mismo clon. Las secuencias de aminoácido correspondientes a los antígenos identificados a partir de aquí como Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9 y TbH-12 se muestran en las SEC ID Nº: 89-93. La comparación de estas secuencias con secuencias conocidas del banco de genes usando las bases de datos identificadas anteriormente no reveló una homología significativa con TbH-4, TbH-8, TbH-9 y TbM-3, aunque se observaron homologías débiles con TbH-9. Se observó que TbH-12 era homólogo a una proteína antigénica de 34 kD identificada previamente en M. paratuberculosis (Nº acceso S28515). Se observó que Tb38-1 está localizada 34 pares base por encima en el marco de lectura abierto correspondiente al antígeno ESAT-6 identificado previamente en M. bovis (Nº acceso U34848) y en M. tuberculosis (Sorensen y col., Infect. Immun. 63: 1710-1717, 1995).

Las sondas derivadas de Tb38-1 y TbH-9, ambas aisladas de una biblioteca de H37Ra, fueron usadas para identificar clones en una biblioteca de H37Rv. La Tb38-1 se hibridó con Tb38-1F2, Tb38-1F3, Tb38-1F5 y Tb38-1F6 (SEC ID Nº: 107, 108, 111, 113 y 114). (Las SEC ID Nº: 107 y 108 son secuencias no contiguas del clon Tb38-1F2). Se dedujeron dos marcos de lectura abiertos en Tb38-1F2; uno que corresponde a Tb37FL (SEC ID Nº: 109), y el segundo, una secuencia parcial, puede ser el homólogo de Tb38-1 y se denomina Tb38-IN (SEC ID Nº: 110). La secuencia de aminoácidos deducida de Tb38-1F3 se presenta en la SEC ID Nº: 112. Una sonda TbH-9 identificó tres clones en la biblioteca de H37Rv: TbH-9-FL (SEC ID Nº: 101), que puede ser homólogo de TbH-9 (R37Ra), TbH-9-1 (SEC ID Nº: 103) y TbH-9-4 (SEC ID Nº: 105), todos los cuales son secuencias altamente relacionadas con la TbH

9. Las secuencias de aminoácidos correspondientes a estos tres clones se presentan en las SEC ID Nº: 102, 104 y

106.

EJEMPLO 4

Purificación y caracterización de un polipéptido procedente de derivado de proteína purificado con de tuberculina

Se aisló un polipéptido de M. tuberculosis a partir de derivado de proteína purificado de tuberculina (PPD) como se indica a continuación.

Se preparó PPD como se ha publicado, con alguna modificación (Seibert, F. y col., Tuberculin purified protein derivative. Preparation and analyses of a large quantity for standard. The American Review of Tuberculosis 44: 9-25, 1941). Se cultivó la cepa Rv de M. tuberculosis durante 6 semanas en medio sintético en botellas de rodillo a 37ºC. Las botellas que contenían el crecimiento bacteriano fueron calentadas entonces a 100ºC en vapor de agua durante 3 horas. Los cultivos fueron filtrados en condiciones estériles usando un filtro de 0,22 µ y la fase líquida se concentró 20 veces usando una membrana con un corte de 3 kD. Las proteínas fueron precipitadas una vez con disolución de sulfato amónico al 50% y ocho veces con disolución de sulfato amónico al 25%. Las proteínas resultantes (PPD) fueron fraccionadas mediante cromatografía de líquidos de fase inversa (RP-HPLC) usando una columna C18 (7,8 x 300 mM; Waters, Milford, MA) en un sistema de HPLC Biocad (Perseptive Biosystems, Framingham, MA). Las fracciones fueron eluídas de la columna con un gradiente lineal de tampón 0-100% (con un 0,1% de TFA en acetonitrilo). El caudal fue de 10 mL/minuto y se monitorizó el eluyente a 214 nm y 280 nm.

Se recogieron seis fracciones, se secaron, se suspendieron en PBS y se evaluaron individualmente en cobayas infectadas con M. tuberculosis para determinar la inducción de reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). Se observó que una fracción inducía una fuerte reacción DTH y fue secuenciada posteriormente mediante RP-HPLC en una columna C18 de microboro Vydac (Nº de catálogo 218TP5115) en un HPLC modelo 172 de Perkin Elmer/Applied Biosystems Division. Las fracciones fueron eluídas con un gradiente lineal entre 5% y 100% de tampón (TFA al 0,05% en acetonitrilo) con un caudal de 80 µL/minuto. Se monitorizó el eluyente a 215 nm. Se recogieron ocho fracciones y se evaluaron para determinar la inducción de DTH en cobayas infectadas con M. tuberculosis. Se observó que una fracción inducía una fuerte DTH de aproximadamente 16 mm de induración. Las otras fracciones no indujeron una DTH detectable. La fracción positiva fue sometida a electroforesis de gel SDS-PAGE y se observó que contenía una única banda de proteína de aproximadamente 12 kD de peso molecular.

Este polipéptido, denominado a partir de aquí DPPD, fue secuenciado desde el extremo amino terminal usando un secuenciador de proteínas Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492 tal como se ha descrito anteriormente, y se obtuvo que tenía la secuencia N-terminal mostrada en la SEC ID Nº: 124. La comparación de esta secuencia con secuencias conocidas del banco de genes, tal como se ha descrito anteriormente, no reveló ninguna homología conocida. Se aislaron cuatro fragmentos de bromuro de cianógeno de DPPD y se observó que tenían las secuencias mostradas en las SEC ID Nº: 125-128.

EJEMPLO 5

Síntesis de polipéptidos sintéticos

Los polipéptidos se pueden sintetizar en un sintetizador de péptidos Millipore 9050 usando química de FMOC con activación de HPTU (O-benzotriazol-N,N,N’,N’-tetrametiluronio hexafluorofosfato). Se puede unir una secuencia Gly-Cys-Gly al extremo amino del péptido para proporcionar un método de conjugación o para marcar el péptido. La separación de los péptidos del soporte sólido puede llevarse a cabo usando la siguiente mezcla de separación: ácido trifluoroacético:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Tras someter a separación durante 2 horas, los péptidos pueden precipitarse en metil-t-butil-éter frío. Las partículas de péptido pueden disolverse a continuación en agua que contiene un 0,1% de ácido trifluoroacético y liofilizarse antes de ser purificadas mediante HPLC de fase inversa en una C18. Se puede usar un gradiente de 0-60% de acetonitrilo (que contiene un 0,1% de TFA) en agua (que contiene un 0,1% de TFA) para eluir los péptidos. Después de la liofilización de las fracciones puras, los péptidos pueden ser caracterizados usando espectrometría de masas de electropulverización y mediante análisis de aminoácidos.

Este procedimiento se usó para sintetizar un péptido TbM-1 que contiene una repetición y media de una secuencia TbM-1. El péptido TbM-1 presenta la secuencia GCGDRSGGNLDQIRLRRDRSGGNL (SEC ID Nº: 63).

EJEMPLO 6

Uso de antígenos representativos para la serodiagnosis de tuberculosis

Este ejemplo ilustra las propiedades diagnósticas de varios antígenos representativos. Las Figuras 1 y 2 presentan la reactividad de antígenos representativos con sueros procedentes de individuos infectados con M. tuberculosis y de individuos no infectados, en comparación con la reactividad de lisato bacteriano y del antígeno de 38 kD.

Los ensayos se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos que fueron cubiertas con 200 ng de antígeno diluido hasta 50 µL en tampón de recubrimiento de carbonato, pH 9,6. Los pocillos fueron recubiertos durante una noche a 4ºC (o 2 horas a 37ºC). El contenido de las placas se retiró a continuación y los pocillos fueron bloqueados durante 2 horas con 200 µL de PBS/BSA al 1%. Tras la etapa de bloqueo, los pocillos fueron lavados cinco veces con PBS/Tween 20TM al 0,1%. A continuación se añadieron 50 µL de sueros, diluidos 1:100 en PBS/Tween 20TM al 0,1%/BSA al 0,1%, a cada pocillo y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después las placas fueron lavadas de nuevo cinco veces con PBS/Tween 20TM al 0,1%.

El conjugado de enzima (peroxidasa de rábano – Proteína A, Zymed, San Francisco, CA) se diluyó a continuación

1:10.000 en PBS/Tween 20TM al 0,1%/BSA al 0,1%, y se añadieron 50 µL del conjugado diluido a cada pocillo y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, los pocillos fueron lavados cinco veces con PBS/Tween 20TM al 0,1%. Se añadieron 100 µL de sustrato de tetrametilbencidina peroxidasa (TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), sin diluir, y se incubó durante aproximadamente 15 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 µL de H2SO4 1 N a cada pocillo, y las placas fueron leídas a 450 nm.

La Figura 2 muestra la reactividad ELISA de dos antígenos recombinantes aislados usando el método A del Ejemplo 3 (TbRa3 y TbRa9) con sueros procedentes de pacientes positivos y negativos en M. tuberculosis. La reactividad de estos antígenos se compara con la lisato bacteriano aislado de la cepa H37Ra de M. tuberculosis (Difco, Detroit, MI). En ambos casos, los antígenos recombinantes diferenciaron sueros negativos de positivos. En base a los valores de corte obtenidos de las curvas receptor-operador, el TbRa3 detectó 56 de 87 sueros positivos, y el TbRa9 detectó 111 de 165 sueros positivos.

La Figura 3 ilustra la reactividad ELISA de antígenos representativos aislados usando el método B del Ejemplo 3. La reactividad de los antígenos recombinantes TbH4, TbH12, Tb38-1 y del péptido TbM-1 (tal como se describe en el Ejemplo 4) se compara con la del antígeno de 38 kD descrito por Andersen y Hansen, Infect. Immun. 57: 2481-2488, 1989. De nuevo, todos los polipéptidos evaluados diferenciaron entre sueros positivos y negativos. En base a los valores de corte obtenidos de las curvas receptor-operador, el TbH4 detectó 67 de 126 sueros positivos, el TbH12

5 detectó 50 de 125 sueros positivos, el 38-1 detectó 61 de 101 sueros positivos y el péptido TbM-1 detectó 25 de 30 sueros positivos.

También se examinó la reactividad de cuatro antígenos (TbRa3, TbRa9, TbH4 y TbH12) con sueros procedentes de un grupo de pacientes infectados con M. tuberculosis con diferentes reactividades en la tinción rápida ácida de esputo (Smithwick y David, Tubercle 52: 226, 1971), y se comparó con la reactividad de lisato de M. tuberculosis y el

10 antígeno de 38 kD. Los resultados se presentan en la Tabla 2, mostrada a continuación:

TABLA 2

Reactividad de antígenos con sueros procedentes de pacientes de M. tuberculosis

Paciente: Esputo rápido ácido Valores ELISA

Lisato: 38 kD TbRa9 TbH12 TbH4 TbRa3

Tb01B93I-2: ++++ 1,853 0,634 0,998 1,022 1,030 1,314

Tb01B93I-19: ++++ 2,657 2,322 0,608 0,837 1,857 2,335

Tb01B93I-8: +++ 2,703 0,527 0,492 0,281 0,501 2,002

Tb01B93I-10: +++ 1,665 1,301 0,685 0,216 0,448 0,458

Tb01B93I-11: +++ 2,817 0,697 0,509 0,301 0,173 2,608

Tb01B93I-15: +++ 1,28 0,283 0,808 0,218 1,537 0,811

Tb01B93I-16: +++ 2,908 >3 0,899 0,441 0,593 1,080

Tb01B93I-25: +++ 0,395 0,131 0,335 0,211 0,107 0,948

Tb01B93I-87: +++ 2,653 2,432 2,282 0,977 1,221 0,857

Tb01B93I-89: +++ 1,912 2,370 2,436 0,876 0,520 0,952

Tb01B94I-108: +++ 1,639 0,341 0,797 0,368 0,654 0,798

Tb01B94I-201: +++ 1,721 0,419 0,661 0,137 0,064 0,692

Tb01B93I-88: ++ 1,939 1,269 2,519 1,381 0,214 0,530

Tb01B93I-92: ++ 2,355 2,329 2,78 0,685 0,997 2,527

Tb01B94I-109: ++ 0,993 0,620 0,574 0,441 0,5 2,558

Tb01B94I-210: ++ 2,777 >3 0,393 0,367 1,004 1,315

Tb01B94I-224: ++ 2,913 0,476 0,251 0,140 0,181 1,586

Tb01B93I-9: + 2,649 0,278 0,210 0,140 0,181 1,586

Tb01B93I-14: + >3 1,538 0,282 0,291 0,549 2,880

Tb01B93I-21: + 2,645 0,739 2,499 0,783 0,536 1,770

Tb01B93I-22: + 0,714 0,451 2,082 0,285 0,269 1,159

Tb01B93I-31: + 0,956 0,490 1,019 0,812 0,176 1,293

Tb01B93I-32: - 2,261 0,786 0,668 0,273 0,535 0,405

Tb01B93I-52: - 0,658 0,114 0,434 0,330 0,273 1,140

Tb01B93I-99: - 2,118 0,584 1,62 0,119 0,977 0,729

Tb01B94I-130: - 1,349 0,224 0,86 0,282 0,383 2,146

Tb01B94I-131: - 0,685 0,324 1,173 0,059 0,118 1,431

AT4-0070: Normal 0,072 0,043 0,092 0,071 0,040 0,039

AT4-0105: Normal 0,397 0,121 0,118 0,103 0,078 0,390

3/15/94-1: Normal 0,227 0,064 0,098 0,026 0,001 0,228

4/15/93-2: Normal 0,114 0,240 0,071 0,034 0,041 0,264

5/26/94-4: Normal 0,089 0,259 0,096 0,046 0,008 0,053

5/26/94-3: Normal 0,139 0,093 0,085 0,019 0,067 0,01

En base a los valores de corte obtenidos de las curvas receptor-operador, el TbRa3 detectó 23 de 27 sueros positivos, el TbRa9 detectó 22 de 27, el TbH4 detectó 18 de 27 y el TbH12 detectó 15 de 27. Si se usan en combinación, estos cuatro antígenos habrían tenido una sensibilidad teórica de 27 sobre 27, lo que indica que estos antígenos se complementarían unos a otros en la detección serológica de infección de M. tuberculosis. 5 Adicionalmente, varios de los antígenos recombinantes detectaron sueros positivos que no fueron detectados usando el antígeno de 38 kD, lo que indica que dichos antígenos pueden ser complementarios al antígeno de 38 kD.

La reactividad del antígeno recombinante TbRa11 con sueros procedentes de pacientes de M. tuberculosis que resultaron negativos con el antígeno de 38 kD, así como con los sueros de donantes normales y positivos en PPD, se determinó mediante ELISA como se ha descrito anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 4 que 10 indica que el TbRa11, aún resultando negativo con sueros de donantes normales y positivos en PPD, detectó sueros que eran negativos con el antígeno de 38 kD. De los trece sueros negativos con 38 kD evaluados, nueve eran positivos con TbRa11, lo que indica que dicho antígeno puede estar reaccionando con un subgrupo de sueros negativos par antígeno de 38 kD. Por el contrario, en un grupo de sueros positivos para 38 kD en los que el TbRa11 fue reactivo, la DO 450 media para TbRa11 fue inferior a la correspondiente al antígeno de 38 kD. Los datos indican

15 una relación inversa entre la presencia de actividad de TbRa11 y la positividad de 38 kD.

El antígeno TbRa2A fue evaluado en un ELISA indirecto usando inicialmente 50 µL de suero a una dilución 1:100 durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido de un lavado en PBS-Tween e incubación durante 30 minutos con Proteína A biotinilada (Zymed, San Francisco, CA) a una dilución 1:10.000. Después de lavado, se añadieron 50 µL de estreptavidina-peroxidasa de rábano (Zymed) a una dilución 1:10.000 y la mezcla se incubó durante 30 20 minutos. Tras lavar, el ensayo se desarrolló con sustrato de TMB como se ha descrito anteriormente. La reactividad de TbRa2A con sueros procedentes de pacientes de M. tuberculosis y de donantes normales se muestra en la Tabla

3. El valor medio de reactividad de TbRa2A con sueros procedentes de pacientes de M. tuberculosis fue de 0,444 con una desviación estándar de 0,309. La media de reactividad con sueros procedentes de donantes normales fue de 0,109 con una desviación estándar de 0,029. La evaluación de los sueros negativos para 38 kD (Figura 5)

25 también indicó que el antígeno TbRa2A era capaz de detectar sueros en esta categoría.

TABLA 3

Reactividad de TbRa2A con sueros procedentes de pacientes de M. tuberculosis y de donantes normales La reactividad del antígeno recombinante (g) (SEC ID Nº: 60) con sueros procedentes de pacientes de M. tuberculosis y donantes normales se determinó mediante ELISA como se ha descrito anteriormente. La Figura 6 muestra los resultados de la valoración de antígeno (g) con cuatro sueros positivos en M. tuberculosis que fueron todos reactivos con el antígeno de 38 kD y con cuatro sueros de donante. Los cuatro sueros positivos fueron reactivos con antígeno (g).

ID de suero: Estado DO 450

Tb85: TB 0,680

Tb86: TB 0,450

Tb87: TB 0,263

Tb88: TB 0,275

Tb89: TB 0,403

Tb91: TB 0,393

Tb92: TB 0,401

Tb93: TB 0,232

Tb94: TB 0,333

Tb95: TB 0,435

Tb96: TB 0,284

Tb97: TB 0,320

Tb99: TB 0,328

Tb100: TB 0,817

Tb101: TB 0,607

Tb102: TB 0,191

Tb103: TB 0,228

Tb107: TB 0,324

Tb109: TB 1,572

Tb112: TB 0,338

DL4-0176: Normal 0,036

AT4-0043: Normal 0,126

AT4-0044: Normal 0,130

ID de suero: Estado DO 450

AT4-0052: Normal 0,135

AT4-0053: Normal 0,133

AT4-0062: Normal 0,128

AT4-0070: Normal 0,088

AT4-0091: Normal 0,108

AT4-0100: Normal 0,106

AT4-0105: Normal 0,108

AT4-0109: Normal 0,105

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Corixa Corporation

<120> Compuestos y métodos para la diagnosis de tuberculosis

<130> CRX-P417

<150> 08/523.435

<151> 1995-09-01

<150> 08/532.136

<151> 1995-09-22

<150> 08/620.280

<151> 1996-03-22

<150> 08/658.800

<151> 1996-06-05

<150> 08/680.573

<151> 1996-07-12

<160> 132

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 766

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (565) . . (565)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (584) . . (584)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (663) . . (663)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (673) . . (673)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (717) . . (717)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (722) . . (722)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (729) . . (729)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (732) . . (732)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 5 <222> (740) . . (742)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (746) . . (746) 10 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (748) . . (749)

<223> Desconocido

15 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (756) . . (756)

<223> Desconocido

<220> 20 <221> característica_miscelánea

<222> (759) . . (759)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 25 <222> (762) . . (762)

<223> Desconocido

<400> 1

<210> 2 30 <211> 752

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea 35 <222> (591) . . (591)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (618) . . (618)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (624) . . (624)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (630) . . (630)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (642) . . (642)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (647) . . (647)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (654) . . (654)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (660) . . (660)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (665) . . (665)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (671) . . (671)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (678) . . (678)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (685) . . (685)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (686) . . (686)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (696) . . (696)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (700) . . (700)

<223> Desconocido <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (710) . . (710)

<223> Desconocido

5 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (715) . . (715)

<223> Desconocido

<220> 10 <221> característica_miscelánea

<222> (719) . . (719)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 15 <222> (724) . . (724)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (731) . . (731) 20 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (736) . . (736)

<223> Desconocido

25 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (740) . . (740)

<223> Desconocido

<220> 30 <221> característica_miscelánea

<222> (745) . . (745)

<223> Desconocido

<400> 2

<210> 3

<211> 813

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (760) . . (760)

<223> Desconocido

5 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (779) . . (779)

<223> Desconocido

<220> 10 <221> característica_miscelánea

<222> (807) . . (807)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 15 <222> (811) . . (811)

<223> Desconocido

<400> 3

<210> 4 20 <211> 447

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 4

<210> 5

<211> 604

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (191) . . (191)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (223) . . (223)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (237) . . (237)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (255) . . (255)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (262) . . (262)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (266) . . (266)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (270) . . (270)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (319) . . (319)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (322) . . (322)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (331) . . (331)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (345) . . (345)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (352) . . (352)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (356) . . (356)

<223> Desconocido <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (361) . . (361)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (364) . . (364)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (366) . . (366)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (369) . . (369)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (387) . . (387)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (393) . . (393)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (400) . . (400)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (416) . . (416)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (421) . . (421)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (424) . . (425)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (428) . . (428)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (430) . . (430)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (433) . . (433)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (438) . . (438)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (440) . . (440)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (444) . . (447)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (454) . . (454)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (458) . . (458)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (463) . . (463)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (465) . . (465)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (468) . . (468)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (471) . . (471)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (478) . . (478)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (481) . . (481)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (493) . . (493)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (497) . . (500)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (503) . . (503)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (505) . . (505)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (507) . . (507)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (510) . . (510)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (513) . . (513)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (516) . . (516)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (519) . . (519)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (521) . . (523)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (525) . . (526)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (528) . . (529)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (531) . . (532)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (535) . . (535)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (537) . . (537)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (539) . . (539)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (541) . . (543)

<223> Desconocido <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (545) . . (545)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (548) . . (549)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (552) . . (558)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (561) . . (562)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (564) . . (565)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (567) . . (568)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (570) . . (573)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (577) . . (577)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (579) . . (581)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (583) . . (586)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (588) . . (588)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (591) . . (592)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (595) . . (595)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (598) . . (598)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (601) . . (601)

<223> Desconocido

<400> 5

<210> 6

<211> 633 10 <212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (6) . . (6) 15 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (39) . . (39)

<223> Desconocido

20 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (507) . . (507)

<223> Desconocido

<220> 25 <221> característica_miscelánea

<222> (583) . . (583)

<223> Desconocido

<400> 6

<210> 7

<211> 1362

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 7

<210> 8 10 <211> 1458

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 8

<210> 9

<211> 862

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 9

<210> 10

<211> 622

<212> ADN 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (578) . . (578)

<223> Desconocido

10 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (585) . . (585)

<223> Desconocido

<220> 15 <221> característica_miscelánea

<222> (614) . . (614)

<223> Desconocido

<400> 10

<210> 11

<211> 1200

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 11

<210> 12

<211> 1155

<212>: ADN 10 <213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 12

<210> 13

<211> 1771

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 13

<210> 14

<211> 1058

<212>: ADN 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1025) . . (1025)

<223> Desconocido

10 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1056) . . (1056)

<223> Desconocido

<400> 14

<210> 15

<211> 542

<212> ADN 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (406) . . (406)

<223> Desconocido

10 <400> 15

<210> 16

<211> 913

<212> ADN 15 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (614) . . (614)

<223> Desconocido

20 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (773) . . (773)

<223> Desconocido

<220> 25 <221> característica_miscelánea

<222> (886) . . (886)

<223> Desconocido

<400> 16

<210> 17

<211> 1872

<212> ADN 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1460) . . (1460)

<223> Desconocido

10 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1854) . . (1854)

<223> Desconocido

<400> 17

<210> 18

<211> 1482

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 18

<210> 19

<211> 876

<212> ADN 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (204) . . (204)

<223> Desconocido

10 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (343) . . (343)

<223> Desconocido

<220> 15 <221> característica_miscelánea

<222> (378) . . (378)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 20 <222> (870) . . (870)

<223> Desconocido

<400> 19

<210> 20

<211> 1021

<212> ADN 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (664) . . (664)

<223> Desconocido

10 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1010) . . (1010)

<223> Desconocido

<220> 15 <221> característica_miscelánea

<222> (1014) . . (1015)

<223> Desconocido

<400> 20

<210> 21

<211> 321

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (120) . . (120)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (179) . . (179)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (192) . . (192)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (219) . . (219)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (231) . . (231)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (236) . . (236)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (257) . . (257)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (267) . . (267)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (282) . . (282)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (285) . . (285)

<223> Desconocido <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (291) . . (291)

<223> Desconocido

5 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (294) . . (294)

<223> Desconocido

<220> 10 <221> característica_miscelánea

<222> (296) . . (296)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 15 <222> (303) . . (303)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (305) . . (305) 20 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (307) . . (307)

<223> Desconocido

25 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (312) . . (312)

<223> Desconocido

<220> 30 <221> característica_miscelánea

<222> (316) . . (316)

<223> Desconocido

<400> 21

35 <210> 22

<211> 373

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220> 40 <221> característica_miscelánea

<222> (34) . . (34)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 45 <222> (132) . . (132)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (159) . . (159)

<223> Desconocido

<400> 22

<210> 23

<211> 352

<212> ADN 10 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (272) . . (272)

<223> Desconocido

15 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (296) . . (296)

<223> Desconocido

<220> 20 <221> característica_miscelánea

<222> (298) . . (298)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 25 <222> (311) . . (311)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (321) . . (321) 30 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (329) . . (329)

<223> Desconocido

35 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (335) . . (335)

<223> Desconocido

<220> 40 <221> característica_miscelánea

<222> (347) . . (347)

<223> Desconocido

<400> 23

<210> 24

<211> 726

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 24

<210> 25

<211> 580 10 <212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 25

15 <210> 26

<211> 160

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 26

<210> 27

<211> 272

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 27

<210> 28

<211> 317

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

15 <400> 28

<210> 29

<211> 182

<212> ADN 20 <213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 29

<210> 30 25 <211> 308

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 30

<210> 31

<211> 267

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 31

<210> 32

<211> 189 10 <212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 32

<210> 33 15 <211> 851

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea 20 <222> (767) . . (767)

<223> Desconocido

<400> 33

<210> 34

<211> 254

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 34

<210> 35

<211> 408 10 <212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (265) . . (265) 15 <223> Desconocido

<400> 35

<210> 36 20 <211> 181

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (125) . . (125)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (143) . . (143)

<223> Desconocido

<400> 36

<210> 37

<211> 290

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

15 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (230) . . (230)

<223> Desconocido

<220> 20 <221> característica_miscelánea

<222> (266) . . (266)

<223> Desconocido

<400> 37

25 <210> 38

<211> 34

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220> 30 <221> característica_miscelánea

<222> (16) . . (16)

<223> Desconocido

<400> 38

35 <210> 39

<211> 155

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220> 40 <221> característica_miscelánea

<222> (141) . . (141)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (142) . . (142)

<223> n es a, c, g ó t

<400> 39

<210> 40

<211> 53

<212> ADN 10 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (38) . . (38)

<223> Desconocido

15 <400> 40

<210> 41

<211> 132

<212> ADN 20 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (98) . . (98)

<223> Desconocido

25 <400> 41

<210> 42

<211> 132

<212> ADN 30 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (14) . . (14)

<223> Desconocido

35 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (19) . . (19)

<223> Desconocido

<220> 40 <221> característica_miscelánea

<222> (41) . . (41)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 45 <222> (55) . . (55)

<223> Desconocido <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (63) . . (63)

<223> Desconocido

5 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (79) . . (79)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (84) . . (84)

<223> Desconocido

<220>

<221>: característica_miscelánea 15 <222> (124) . . (124)

<223> Desconocido

<400> 42

<210> 43

<211> 702

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>: característica_miscelánea 25 <222> (325) . . (325)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (328) . . (328)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (348) . . (348)

<223> Desconocido

35 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (353) . . (353)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (442) . . (442)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 45 <222> (659) . . (659)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (679) . . (679)

<223> Desconocido

<400> 43

<210> 44

<211> 298

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 44

<210> 45

<211> 1058 10 <212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 45

<210> 46

<211> 327

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 46

<210> 47 10 <211> 170

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea 15 <222> (93) . . (93)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (160) . . (160) 20 <223> Desconocido

<400> 47

<210> 48

<211> 127

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 48

<210> 49

<211> 81 10 <212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 49

<210> 50 15 <211> 149

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea 20 <222> (77) . . (77)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (113) . . (113) 25 <223> Desconocido

<400> 50

<210> 51

<211> 355 30 <212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (67) . . (67) 35 <223> Desconocido

<400> 51

<210> 52

<211> 999

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 52

<210> 53

<211> 332 10 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 53

<210> 54

<211> 20

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (11) . . (11)

<223> Desconocido

<400> 54

<210> 55

<211> 15

<212> PRT 10 <213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 55

<210> 56

<211> 19 15 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 56

<210> 57 20 <211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 57

25 <210> 58

<211> 14

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220> 30 <221> característica_miscelánea

<222> (12) . . (12)

<223> Desconocido

<400> 58

35 <210> 59

<211> 13

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220> 40 <221> característica_miscelánea

<222> (8) . . (8)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (10) . . (10)

<223> Desconocido

<400> 59

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 60

<210> 61

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (6) . . (6)

<223> Desconocido

<400> 61

<210> 62

<211> 30

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 62

<210> 63

<211> 24

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 63

<210> 64

<211> 187

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (187) . . (187)

<223> Desconocido

<400> 64

<210> 65

<211> 148

<212>: PRT 15 <213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 65

<210> 66

<211> 230

<212>: PRT 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (181) . . (181)

<223> Desconocido

<210> 67

<211> 132

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 67

<210> 68

<211> 100

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (64) . . (64)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (75) . . (75)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (79) . . (79)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (85) . . (85)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (88) . . (89)

<223> Desconocido

<400> 68

<210> 69

<211> 163

<212>: PRT 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

10 <400> 66

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (39) . . (39)

<223> Desconocido

10 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (41) . . (41)

<223> Desconocido

<220> 15 <221> característica_miscelánea

<222> (45) . . (45)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 20 <222> (147) . . (147)

<223> Desconocido

<400> 69

<210> 70

<211> 344

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 70

<210> 71

<211> 485

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 71

<210> 72

<211> 267

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 72

<210> 73

<211> 97

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 73

<210> 74

<211> 364

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 74

<210> 75

<211> 309

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 75

<210> 76

<211> 580

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 76

<210> 77

<211> 233

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 77

<210> 78

<211> 66

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 78

<210> 79

<211> 69 10 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 79

15 <210> 80

<211> 355

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 80

<210> 81

<211> 205

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 81

<210> 82

<211> 286

<212> PRT 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (63) . . (63)

<223> Desconocido

10 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (121) . . (121)

<223> Desconocido

<220> 15 <221> característica_miscelánea

<222> (285) . . (285)

<223> Desconocido

<400> 82

<210> 83

<211> 173

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 83

<210> 84

<211> 107

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (60) . . (60)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (64) . . (64)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (73) . . (73)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (77) . . (77)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (79) . . (79)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (86) . . (86)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (99) . . (99)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea 5 <222> (102) . . (103)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (106) . . (106) 10 <223> Desconocido

<400> 84

<210> 85

<211> 125 15 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (12) . . (12) 20 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (45) . . (45)

<223> Desconocido

25 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (54) . . (54)

<223> Desconocido

<400> 85

<210> 86

<211> 117

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (99) . . (100)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (104) . . (104)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (108) . . (108)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (112) . . (112)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (116) . . (116)

<223> Desconocido

<400> 86

<210> 87

<211> 103

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 87

<210> 88

<211>: 88 10 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 88

<210> 89

<211> 95

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 89

<210> 90

<211>: 166 10 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (41) . . (42) 15 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (49) . . (49)

<223> Desconocido

20 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (80) . . (80)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (152) . . (152)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (159) . . (159)

<223> Desconocido

<400> 90

<210> 91

<211> 5

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

15 <400> 91

<210> 92

<211> 263

<212> PRT 20 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (254) . . (254)

<223> Desconocido

<400> 92

<210> 93

<211> 303

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 93

<210> 94

<211> 168

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 94

<210> 95

<211> 332

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 95

<210> 96

<211> 500

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 96

<210> 97

<211>: 96 10 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 97

<210> 98

<211> 154

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 98

<210> 99

<211>: 51 10 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 99

<210> 100 15 <211> 282

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221>: característica_miscelánea 20 <222> (41) . . (41)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (154) . . (154)

<223> Desconocido

<220>

<221>: característica_miscelánea 5 <222> (165) . . (165)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (190) . . (190) 10 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (226) . . (226)

<223> Desconocido

15 <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (229) . . (229)

<223> Desconocido

<220> 20 <221> característica_miscelánea

<222> (255) . . (255)

<223> Desconocido

<400> 100

25 <210> 101

<211> 1565

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 101

<210> 102

<211> 391

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 102

<210> 103

<211> 259

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (18) . . (18)

<223> Desconocido

<400> 103

<210> 104 10 <211> 86

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 104

15 <210> 105

<211> 1109

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 105

<210> 106

<211> 341

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 106

<210> 107

<211> 1256

<212> ADN 5 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (48) . . (48)

<223> Desconocido

10 <400> 107

<210> 108

<211> 432

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 108

<210> 109 10 <211> 368

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea 15 <222> (10) . . (10)

<223> Desconocido

<400> 109

<210> 110

<211> 12

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 110

<210> 111

<211> 396 10 <212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 111

15 <210> 112

<211> 80

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 112

<210> 113

<211> 387

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 113

<210> 114 10 <211> 272

<212> ADN

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 114

15 <210> 115

<211> 20

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 115

<210> 116

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 116

<210> 117

<211> 19

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

10 <400> 117

<210> 118

<211> 15

<212> PRT 15 <213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 118

<210> 119

<211> 14 20 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (12) . . (12) 25 <223> Desconocido

<400> 119

<210> 120

<211> 13 30 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (8) . . (8) 35 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (10) . . (10)

<223> Desconocido

40 <400> 120

<210> 121

<211> 17

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 121

<210> 122

<211> 15

<212> PRT 10 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (6) . . (6)

<223> Desconocido

15 <400> 122

<210> 123

<211> 30

<212> PRT 20 <213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 123

<210> 124

<211> 22 25 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (8) . . (8) 30 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (21) . . (21)

<223> Desconocido

35 <400> 124

<210> 125

<211> 7

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 125

<210> 126 5 <211> 10

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea 10 <222> (1) . . (1)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (2) . . (2) 15 <223> Desconocido

<400> 126

<210> 127

<211> 9 20 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1) . . (1) 25 <223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (3) . . (3)

<223> Desconocido

30 <400> 127

<210> 128

<211> 9

<212> PRT 35 <213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1) . . (3)

<223> Desconocido

40 <400> 128

<210> 129

<211> 15

<212> PRT 45 <213> Mycobacterium tuberculosis <220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1) . . (1)

<223> Desconocido

<400> 129

<210> 130

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (5) . . (5)

<223> Desconocido

<400> 130

<210> 131

<211> 15

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<400> 131

<210> 132

<211> 21

<212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1) . . (1)

<223> Desconocido

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (6) . . (6)

<223> Desconocido

<400> 132

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Un método para detectar la sensibilización frente a un antígeno micobacteriano en un sujeto, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con un polipéptido que comprende una porción antigénica de SEC ID Nº: 89; y

(b)

detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unan al polipéptido. 2.-El método según la reivindicación 1, para detectar infección de M. tuberculosis en un sujeto, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto con un polipéptido que comprende una porción antigénica de SEC ID Nº: 89; y

(b)

detectar en la muestra biológica la presencia de anticuerpos que se unan al polipéptido. 3.-El método de la reivindicación 2, en el que la etapa (a) comprende adicionalmente poner en contacto la muestra

biológica con un antígeno de M. tuberculosis de 38 kD y la etapa (b) comprende adicionalmente detectar en la muestra la presencia de anticuerpos que se unan al antígeno de M. tuberculosis de 38 kD. 4.-El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el polipéptido está unido a un soporte sólido. 5.-El método de la reivindicación 4, en el que el soporte sólido comprende nitrocelulosa, látex o un material plástico. 6.-El método de la reivindicación 2, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre

entera, suero, plasma, saliva, fluido cerebroespinal y orina. 7.-El método de la reivindicación 6, en el que la muestra biológica es sangre entera o suero. 8.-Un kit diagnóstico que comprende:

(a) un polipéptido que comprende una porción antigénica de SEC ID Nº: 89; y

(b) un reactivo de detección. 9.-El kit diagnóstico de la reivindicación 8, en el que el polipéptido se inmoviliza sobre un soporte sólido. 10.-El kit de la reivindicación 9, en el que el soporte sólido comprende nitrocelulosa, látex o un material plástico. 11.-El kit de la reivindicación 8, en el que el reactivo de detección comprende un grupo indicador conjugado con un

agente de unión.
12.-El kit de la reivindicación 11, en el que el agente de unión se selecciona del grupo que consiste en antiinmunoglobulinas, Proteína G, Proteína A y lectinas. 13.-El kit de la reivindicación 11, en el que el grupo indicador se selecciona del grupo que consiste en radioisótopos,

grupos fluorescentes, grupos luminiscentes, enzimas, biotina y partículas de colorante.

Figuras (1/7) Figuras (2/7) Figuras (3/7) Figuras (4/7) Figuras (5/7) Figuras (6/7) Figuras (7/7)