KR20000049100A - 결핵을 진단하는 화합물 및 방법 - Google Patents

Abstract

결핵을 진단하는 화합물 및 방법에 대해 설명한다. 제공되는 화합물은 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 단백질의 하나이상의 항원성 부분을 최소한 포함하는 폴리펩티드로 구성되고, 이와 같은 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 제공한다. 이와 같은 폴리펩티드 또는 DNA 서열 및 적절한 감지 시약으로 구성된 진단 키트는 환자 및 생물학적 시료에서 결핵을 진단하는데 이용할 수 있다. 이와 같은 폴리펩티드에 대한 항체를 제공한다.

Description

결핵을 진단하는 화합물 및 방법{COMPOUNDS AND METHODS FOR DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS}

결핵은 만성적인 감염성 질환으로써, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 감염되어 발생되는 것이 일반적이다. 이 질환은 개발도상국에서 주로 발생되는 질병이고 뿐만 아니라 선진국에서도 그 문제가 점차 증가되는 것으로 매년 약 8만 명이 새로운 환자가 발생하고, 3만명 정도가 죽음에 이르게된다. 감염되었더라도 상당기간동안의 잠복기를 가지는 경우가 있지만, 질병은 주로 폐에 급성 염증을 일으켜, 열과 무생산성 기침이 수반된다. 치료를 하지 않고 방치하는 경우에 심각한 복합증 및 죽음에 이르는 것이 일반적이다.

결핵은 일반적으로 광범위한 항생제를 이용하여 치료를 하지만, 이와 같은 치료로는 질병이 만연하는 것을 방지하는데에는 역부족이다. 감염된 개체는 증상이 없고, 어느 정도는 전염성이 있다. EH한, 치료 섭생에 대한 적응성이 중요하지만, 환자의 거동을 모니터 한다는 것은 어려운 일이다. 일부 환자는 치료과정을 완전히 끝내지 않는 경우가 있고, 이는 약물에 대한 저항성을 가지게 하여 치료 효과가 없게 된다.

결핵이 만연되는 것을 막는데에는 효과적인 백신처리, 초기의 정확한 질병 진단이 필수적이다. 현재, 살아있는 세균으로 백신처리는 하는 것이 보호 면역을 유도하는 가장 효과적인 방법이다. 이와 같은 목적에 가장 흔히 사용되는 미코박테리움은 바실러스 칼미테-구에린[Bacillus Calmette-Guerin (BCG)]으로, 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 무독성 균주이다. 그러나, BCG의 안정성 및 효과는 미국등 일부 국가에서는 반대의견이 있고, 일반 대중에게 백신주사를 하지 않고 있다. 이 질병의 진단은 주로 피부 테스트를 이용하는데, 이 방법은 튜베로쿨린 PPD(단백질-정제된 유도체)에 피부 내부를 노출시키는 것이다. 주사 후 48-72시간 내에 주사부위에서 항원-특이적 T 세포 반응이 측정할 정도로 있는 경우에 미코박테리움 항원에 노출되었다는 것을 나타낸다. 그러나, 이 테스트의 감응성 및 특이성에 대한 논란이 있었고, BCG로 백신주사를 맞은 개체와 감염된 개체간에 구별을 할 수 없다.

대식세포는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 면역의 주요 효과물질이나, T 세포는 이와 같은 면역의 주요 유도물질이다. AIDS 환자에서 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)가 흔히 발생되는 것으로 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 대해 보호를 하는데 T 세포의 필수적인 역할을 설명할 수 있는데, 그 이유는 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 감염과 연관하여 CD4 T 세포가 고갈되기 때문이다. 미코박테리움 반응성 CD4 T 세포는 감마-인터페론(IFN-γ)의 강력한 유도물질로 알려져 있고, 감마 인터페론은 쥐에서 대식세포의 항-박테리아 효과를 촉진시키는 물질로 알려져 있다. 사람에서 IFN-γ의 역할에 대해서는 분명하게 밝혀지지는 않았지만, 연구에 따르면, 1,25-디하이드록시-비타민 D3 단독으로 또는 INF-γ또는 종양괴사 인자-알파와 복합하면 사람의 대식세포를 자극하여 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염을 저해한다는 것이다. 또한, IFN-γ는 사람 대식세포를 자극하여 1,25-디하이드록시-비타민 D3를 만든다. 유사하게, IL-12는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 저항을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 보인다. 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 대한 면역학 고찰은 Chan and Kaufmann, in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom(ed.), ASM Press, Washington, DC, 1994을 참고로 한다.

따라서, 결핵을 진단하는 방법을 개선시키는 것이 필요하다. 본 발명은 이와 같은 요구 및 추가로 다른 관련된 장점을 제공한다.

발명의 요약

간략하게 설명하면, 본 발명은 결핵을 진단하는 조성물 및 그 방법을 제공한다. 한 측면으로, 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원 또는 보존성 치환 또는 변형한 것만 차이가 있는 이와 같은 항원의 변이체로 구성된 폴리펩티드를 제공한다. 이와 같은 측면의 한 구체예에서, 가용성 항원은 다음의 N-말단 서열중 하나를 가지는데 이때, Xaa는 임의 아미노산을 의미한다.

관련된 측면에서, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원의 면역원 부분 또는 보존성 치환 또는 변형한 것만 차이가 있는 이와 같은 항원의 변이체로 구성된 폴리펩티드를 제공한다. 이와 같은 측면의 한 구체예에서, 가용성 항원은 다음의 N-말단 서열중 하나를 가지는데 이때, Xaa는 임의 아미노산을 의미한다.

또 다른 구체예에서, 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원은 서열 1,2,4-10,13-25,52,94,96에서 언급하는 서열; 적절한 스트린젼트(strigent) 조건하에서 서열 1,2,4-10,13-25,52,94,96에서 언급하는 서열에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열 또는 이의 상보체에서 선택된 DNA 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열로 구성된다.

관련 측면에서, 폴리펩티드는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원의 항원 부분 또는 보존성 치환 또는 변형한 것만 차이가 있는 이와 같은 항원의 변이체로 구성되는데, 이때 항원은 서열 26-51, 133, 134, 158-178, 196에서 언급하는 서열, 이 서열의 상보체 및 적절한 스트린젼트(strigent) 조건하에서 서열 26-51, 133, 134, 158-178, 196에서 언급하는 서열에 하이브리드할 수 있는 서열 또는 이의 상보체에서 선택된 DNA 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열로 구성된다.

관련 측면에서 상기 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열, 이들 DNA 서열로 구성된 재조합 발현 벡터, 이와 같은 발현 벡터에 의해 형질감염 또는 형질변환된 숙주 세포를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 제1과 제2 신규한 폴리펩티드 또는 새로운 폴리펩티드와 공지의 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원으로 구성된 융합 단백질을 제공한다.

본 발명의 또 다른 특징에서 환자에서 결핵을 진단하는 방법 및 진단 키트를 제공한다. 방법은 (a)상기 폴리펩티드중 적어도 한 개와 생물학적 시료를 접촉시키고; (b) 폴리펩티드에 결합하는 항체가 시료에 존재하는 지를 감지하여, 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 구성된다. 적절한 생물학적 시료는 전체 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 오줌을 포함한다. 진단 키트는 감지 시약과 상기 폴리펩티드 하나이상으로 구성된다.

본 발명은 또한 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염을 감지하는 방법을 제공하는데, 이때 방법은 (a)환자에서 생물학적 시료를 얻고; (b) 중합효소 연쇄 반응에서 적어도 한 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 시료를 접촉시키고, 이때 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열에 특이성이 있는 것이고; (c) 제 1 및 제 2 올리고뉴클레오티드 프라이머존재하에 시료에서 DNA 증폭이 있는지를 감지하는 것으로 구성된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 이와 같은 DNA 서열의 적어도 10개 연속하는 뉴클레오티드로 구성된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 환자에서 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염을 감지하는 방법을 제공하는데, 이때 이 방법은 (a)환자에서 생물학적 시료를 얻고; (b) 올리고뉴클레오티드 프로브와 시료를 접촉시키고, 이때 올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열에 특이성이 있는 것이고; (c) 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드하는 DNA 서열이 시료에 있는지를 감지하는 것으로 구성된다. 한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 이와 같은 DNA 서열의 적어도 15개 연속하는 뉴클레오티드로 구성된다.

본 발명의 이와 같은 특징 및 다른 특징은 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참고하면 명백하게 이해될 것이다. 여기에서 언급하는 모든 참고문헌은 전문이 첨부된다.

본 발명은 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염을 감지하는 것에 관계한다. 본 발명은 좀더 구체적으로는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원, 이의 일부분 또는 이의 다른 변이체로 구성된 폴리펩티드 및 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염의 혈청 진단을 위해 이와 같은 폴리펩티드를 이용하는 것에 관계한다.

도 1A와 B에서는 실시예 1에서 설명하는 14Kd, 20Kd, 26Kd의 항원에 의해 제 1 및 제 2 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)-면역 제공자로부터 유도한 T 세포의 증식 및 인터페론-γ 생산을 설명하는 것이다.

도 2A-D에서는 분비성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 단백질, 공지의 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원 85b, 신규한 항원 Tb38-1, TbH-9 각각에 대해 발생된 항혈청의 반응성을 나타내는데, 이때 라인 2는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 용해물, 라인 3은 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 분비성 단백질, 라인 4는 재조합 Tb38-1, 라인 5는 재조합 TbH-9, 라인 5는 재조합 85b을 나타낸다.

도 3A는 TbH-9-특이성 T 세포 클론에서 분비성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 단백질, 재조합 TbH-9, 기준 항원 TbRa11에 의한 증식 자극을 설명한다.

도 3B는 분비성 재조합 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 단백질, PPD, 재조합 TbH-9에 의해 TbH-9-특이성 T 세포에서 인터페론-γ 생산을 자극하는 것을 설명한다.

도 4는 박테리아 용해물질의 반응성과 비교할 때, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염된 개체 및 감염 안된 개체의 혈청에서 두 가지 대표적인 폴리펩티드의 반응성을 설명한다.

도 5는 38kD 항원의 반응성과 비교할 때, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염된 개체 및 감염 안된 개체의 혈청에서 네 가지 대표적인 폴리펩티드의 반응성을 설명한다.

도 6은 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 환자의 혈청 및 PDD 양성 기증자의 혈청, 정상적인 기증자의 혈청과 재조합 38kD 및 TbRa11 항원의 반응성을 나타낸 것이다.

도 7은 38kD 음성 혈청과 TbRa2A 항원의 반응성을 나타낸다.

도 8은 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 환자와 정상적인 기증자 혈청과 서열 60의 항원과의 반응성을 나타낸다.

도 9는 간접 ELISA에 의해 결정된 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 환자의 혈청 및 PDD 양성 기증자의 혈청, 정상적인 기증자의 혈청과 재조합 항원 Tbh-29(서열 137)의 반응성을 나타낸 것이다.

도 10은 직접 및 간접 ELISA에 의해 결정된 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 환자의 혈청 및 PDD 양성 기증자의 혈청, 정상적인 기증자의 혈청과 재조합 항원 Tbh-33(서열 140)의 반응성을 나타낸 것이다.

도 11은 ELISA에 의해 결정된 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 환자의 혈청 및 정상적인 기증자의 혈청과 재조합 항원 Tbh-33(서열 140)의(농도를 증가시키면서) 반응성을 나타낸 것이다.

서열 설명

서열 1; TbRa1의 DNA 서열

서열 2; TbRa10의 DNA 서열

서열 3; TbRa11의 DNA 서열

서열 4; TbRa12의 DNA 서열

서열 5; TbRa13의 DNA 서열

서열 6; TbRa16의 DNA 서열

서열 7; TbRa17의 DNA 서열

서열 8; TbRa18의 DNA 서열

서열 9; TbRa19의 DNA 서열

서열 10; TbRa24의 DNA 서열

서열 11; TbRa26의 DNA 서열

서열 12; TbRa28의 DNA 서열

서열 13; TbRa29의 DNA 서열

서열 14; TbRa2A의 DNA 서열

서열 15; TbRa3의 DNA 서열

서열 16; TbRa32의 DNA 서열

서열 17; TbRa35의 DNA 서열

서열 18; TbRa36의 DNA 서열

서열 19; TbRa4의 DNA 서열

서열 20; TbRa9의 DNA 서열

서열 21; TbRaB의 DNA 서열

서열 22; TbRaC의 DNA 서열

서열 23; TbRaD의 DNA 서열

서열 24; YYWCPG의 DNA 서열

서열 25; AAMK의 DNA 서열

서열 26; TbL-23의 DNA 서열

서열 27; TbL-24의 DNA 서열

서열 28; TbL-25의 DNA 서열

서열 29; TbL-28의 DNA 서열

서열 30; TbL-29의 DNA 서열

서열 31; TbH-5의 DNA 서열

서열 32; TbH-8의 DNA 서열

서열 33; TbH-9의 DNA 서열

서열 34; TbM-1의 DNA 서열

서열 35; TbM-3의 DNA 서열

서열 36; TbM-6의 DNA 서열

서열 37; TbM-7의 DNA 서열

서열 38; TbM-9의 DNA 서열

서열 39; TbM-12의 DNA 서열

서열 40; TbM-13의 DNA 서열

서열 41; TbM-14의 DNA 서열

서열 42; TbM-15의 DNA 서열

서열 43; TbH-4의 DNA 서열

서열 44; TbH-4-FWD의 DNA 서열

서열 45; TbH-12의 DNA 서열

서열 46; Tb38-1의 서열

서열 47; Tb38-4의 DNA 서열

서열 48; TbL-17의 DNA 서열

서열 49; TbL-20의 DNA 서열

서열 50; TbL-21의 DNA 서열

서열 51; TbH-16의 DNA 서열

서열 52; DPEP의 DNA 서열

서열 53; DPEP의 유초된 아미노산 서열

서열 54; DPV N-말단 항원의 단백질 서열

서열 55; AVGS N-말단 항원의 단백질 서열

서열 56; AAMK N-말단 항원의 단백질 서열

서열 57; YYWC N-말단 항원의 단백질 서열

서열 58; DIGS N-말단 항원의 단백질 서열

서열 59; AEES N-말단 항원의 단백질 서열

서열 60; DPEP N-말단 항원의 단백질 서열

서열 61; APKT N-말단 항원의 단백질 서열

서열 62; DPAS N-말단 항원의 단백질 서열

서열 63; TbM-1 펩티드의 유추된 아미노산 서열

서열 64; TbRa1의 유추된 아미노산 서열

서열 65; TbRa10의 유추된 아미노산 서열

서열 66; TbRa11의 유추된 아미노산 서열

서열 67; TbRa12의 유추된 아미노산 서열

서열 68; TbRa13의 유추된 아미노산 서열

서열 69; TbRa16의 유추된 아미노산 서열

서열 70; TbRa17의 유추된 아미노산 서열

서열 71; TbRa18의 유추된 아미노산 서열

서열 72; TbRa19의 유추된 아미노산 서열

서열 73; TbRa24의 유추된 아미노산 서열

서열 74; TbRa26의 유추된 아미노산 서열

서열 75; TbRa28의 유추된 아미노산 서열

서열 76; TbRa29의 유추된 아미노산 서열

서열 77; TbRa2A의 유추된 아미노산 서열

서열 78; TbRa3의 유추된 아미노산 서열

서열 79; TbRa32의 유추된 아미노산 서열

서열 80; TbRa35의 유추된 아미노산 서열

서열 81; TbRa36의 유추된 아미노산 서열

서열 82; TbRa4의 유추된 아미노산 서열

서열 83; TbRa9의 유추된 아미노산 서열

서열 84; TbRaB의 유추된 아미노산 서열

서열 85; TbRaC의 유추된 아미노산 서열

서열 86; TbRaD의 유추된 아미노산 서열

서열 87; YYWCPG의 유추된 아미노산 서열

서열 88; TbAAMK의 유추된 아미노산 서열

서열 89; Tb38-1의 유추된 아미노산 서열

서열 90; TbH-4의 유추된 아미노산 서열

서열 91; TbH-8의 유추된 아미노산 서열

서열 92; TbH-9의 유추된 아미노산 서열

서열 93; TbH-12의 유추된 아미노산 서열

서열 94; DPAS의 DNA 서열

서열 95; DPAS의 유추된 아미노산 서열

서열 96; DPV의 DNA 서열

서열 97; DPV의 유추된 아미노산 서열

서열 98; ESAT-6의 DNA 서열

서열 99; ESAT-6의 유추된 아미노산 서열

서열 100; TbH-8-2의 DNA 서열

서열 101; TbH-9FL의 DNA 서열

서열 102; TbH-9FL의 유추된 아미노산 서열

서열 103; TbH-9-1의 DNA 서열

서열 104; TbH-9-1의 유추된 아미노산 서열

서열 105; TbH-9-4의 DNA 서열

서열 106; TbH-9-4의 유추된 아미노산 서열

서열 107; Tb38-1F2 IN의 DNA 서열

서열 108; Tb38-1F2 RP의 DNA 서열

서열 109; Tb37-FL의 유추된 아미노산 서열

서열 110; Tb37-IN의 유추된 아미노산 서열

서열 111; Tb38-1F3의 DNA 서열

서열 112; Tb38-1F3의 유추된 아미노산 서열

서열 113; Tb38-1F5의 DNA 서열

서열 114; Tb38-1F6의 DNA 서열

서열 115; DPV의 유추된 N-말단 아미노산 서열

서열 116; AVGS의 유추된 N-말단 아미노산 서열

서열 117; AAMK의 유추된 N-말단 아미노산 서열

서열 118; YYWC의 유추된 N-말단 아미노산 서열

서열 119; DIGS의 유추된 N-말단 아미노산 서열

서열 120; AAES의 유추된 N-말단 아미노산 서열

서열 121; DPEP의 유추된 N-말단 아미노산 서열

서열 122; APKT의 유추된 N-말단 아미노산 서열

서열 123; DPAS 의 유추된 N-말단 아미노산 서열

서열 124; DPPD N-말단 항원의 단백질 서열

서열 125-128; 네개 DPPD 시아노겐 브로마이드 단편의 단백질 서열

서열 129; XDS 항원의 N-말단 단백질 서열

서열 130; AGD 항원의 N-말단 단백질 서열

서열 131; APE 항원의 N-말단 단백질 서열

서열 132; XYI 항원의 N-말단 단백질 서열

서열 133; TbH-29의 DNA 서열

서열 134; TbH-30의 DNA 서열

서열 135; TbH-32의 DNA 서열

서열 136; TbH-33의 DNA 서열

서열 137; TbH-29의 예측된 아미노산 서열

서열 138; TbH-30의 예측된 아미노산 서열

서열 139; TbH-32의 예측된 아미노산 서열

서열 140; TbH-33의 예측된 아미노산 서열

서열 141-146; TbRa3 38kD, Tb38-1을 포함하는 융합 단백질을 준비하는데 이용되는 PCR 프라이머

서열 147; TbRa3 38kD, Tb38-1을 포함하는 융합 단백질의 DNA 서열

서열 148; TbRa3 38kD, Tb38-1을 포함하는 융합 단백질의 DNA 서열

서열 149; 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원 38kD의 아미노산 서열

서열 150; 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 38kD의 아미노산 서열

서열 151; XP14의 DNA 서열

서열 152; XP24의 DNA 서열

서열 153; XP31의 DNA 서열

서열 154; XP32의 5'DNA 서열

서열 155; XP32의 3'DNA 서열

서열 156; XP14의 예측 아미노산 서열

서열 157; XP14의 역보체에 의해 인코드된 예측 아미노산 서열

서열 158; XP27의 DNA 서열

서열 159; XP36의 DNA 서열

서열 160; XP4의 5'DNA 서열

서열 161; XP5의 5'DNA 서열

서열 162; XP17의 5'DNA 서열

서열 163; XP30의 5'DNA 서열

서열 164; XP2의 5'DNA 서열

서열 165; XP2의 3'DNA 서열

서열 166; XP3의 5'DNA 서열

서열 167; XP3의 3'DNA 서열

서열 168; XP6의 5'DNA 서열

서열 169; XP6의 3'DNA 서열

서열 170; XP18의 5'DNA 서열

서열 171; XP18의 3'DNA 서열

서열 172; XP19의 5'DNA 서열

서열 173; XP19의 3'DNA 서열

서열 174; XP22의 5'DNA 서열

서열 175; XP22의 3'DNA 서열

서열 176; XP25의 5'DNA 서열

서열 177; XP25의 3'DNA 서열

서열 178; TbH4-XP1의 전체 길이 DNA 서열

서열 179; TbH4-XP1의 예측된 아미노산 서열

서열 180; TbH4-XP1의 역보체에 의해 인코드된 예측 아미노산 서열

서열 181; XP36에 의해 인코드되는 제 1 예측 아미노산 서열

서열 182; XP36에 의해 인코드되는 제 2 예측 아미노산 서열

서열 183; XP36 역보체에 의해 인코드되는 예측 아미노산 서열

서열 184; RDIF2의 DNA 서열

서열 185; RDIF5의 DNA 서열

서열 186; RDIF8의 DNA 서열

서열 187; RDIF10의 DNA 서열

서열 188; RDIF11의 DNA 서열

서열 189; RDIF2의 예측 아미노산 서열

서열 190; RDIF5의 예측 아미노산 서열

서열 191; RDIF8의 예측 아미노산 서열

서열 192; RDIF10의 예측 아미노산 서열

서열 193; RDIF11의 예측 아미노산 서열

서열 194; RDIF12의 5'DNA 서열

서열 195; RDIF12의 3'DNA 서열

서열 196; RDIF7의 DNA 서열

서열 197; RDIF7의 예측 아미노산 서열

서열 198; DIF2-1의 DNA 서열

서열 199; DIF2-1의 예측 아미노산 서열

서열 200-207; TbRa3, 38kD, Tb38-1, DPEP(이하 "TbF-2"라고 칭함)을 포함하는 융합 단백질을 준비하는데 이용되는 PCR 프라이머

서열 208; 융합 단백질 TbF-2의 DNA 서열

서열 209; 융합 단백질 TbF-2의 아미노산 서열

상기에서 언급한 것과 같이, 본 발명은 결핵을 진단하는 조성물 및 그 방법에 관계한다. 본 발명의 조성물에는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원 또는 보존된 치환 또는 변형을 한 것만 차이가 있는 이와 같은 항원의 변이체의 적어도 하나의 항원 부분으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 범위 내에 폴리펩티드는 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. "가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원"이란 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 배양 여과물에 존재하는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 원래 단백질을 말한다. 여기에서 언급한 것과 같이, "폴리펩티드"는 임의 길이의 아미노산 쇄를 말하는 것으로, 전체 길이 단백질(가령, 항원)을 포함하고, 이때 아미노산은 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다. 따라서, 상기 한가지 항원의 항원 부분을 포함하는 폴리펩티드는 전적으로 항원성 부분으로 구성되거나 또는 추가 서열을 포함할 수 있다. 추가 서열은 고유 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원에서 유도되거나 또는 이형성이 되는데, 이와 같은 서열은 항원성이 될 수 있다(반드시 그럴 필요는 없다).

항원(가용성 또는 비가용성)의 "항원성 부분"은 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)-감염된 개체에서 수득한 혈청과 반응할 수 있는 부분이다(예를 들면, 감염된 개체에서 수득한 흡수도는 여기에서 설명하는 대표적인 ELISA에서 감염 안된 개체의 혈청에서 수득한 흡수도보다 적어도 3개 표준 편차가 있는 것). "미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)-감염된 개체"는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 감염된 사람을 말한다(가령, PPD에 피부 테스트에 의해 직경이 적어도 0.5㎝인 반응을 가지는). 감염된 개체는 결핵 증후를 나타낼 수도 있고, 증후를 나타내지 않을 수도 있다. 여기에서 설명을 하고 있는 것과 같이 하나이상의 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원의 적어도 한 가지 항원성 부분으로 구성된 폴리펩티드 단독으로 또는 복합하여 환자에서 결핵을 감지하는데 이용된다.

본 발명의 조성물 및 방법은 상기 폴리펩티드 변이체를 포함한다. 여기에서 설명하는 "변이체"는 보존성 치환 또는 변형에 의해 고유 항원가 상이한 폴리펩티드를 말한다. 이와 같은 변이체를 확인하는 방법은 여기에서 설명하는 과정을 이용하여, 상기 폴리펩티드 서열중 한 개가 변형되어, 변형된 폴리펩티드의 항원 성질을 평가하는 것이다.

"보존성 치환"이란 한 개의 아미노산이 유사한 성질을 가지는 또 다른 아미노산으로 치환되는데, 이는 펩티드 화학에 숙지의 지식을 가진 자는 실제 폴리펩티드의 2차 구조 및 수치요법적 성질의 특징을 변화시키지 않는 범위의 아미노산 치환가능한 것을 알 고 있다. 일반적으로 다음의 집단에 있는 아미노산은 보존성 치환을 할 수 있는 것이다; (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; and (5) phe, tyr, trp, his.

폴리펩티드의 항원 성질, 2차 구조, 수치요법적 성질에 최소한의 영향을 주는 아미노산을 결손 또는 추가시켜 변이체를 얻을 수 있는 방법도 있다. 예를 들면, 단백질의 N-말단에 있는 단백질과 동시에 전사되는 또는 전사후 단백질 전달에 관계하는 시그날(또는 리더)서열에 폴리펩티드를 공액시킬 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 폴리펩티드의 합성, 정제 또는 동정에 용이하도록 또는 고형 서포트에 폴리펩티드가 결합되는 것을 강화시키기 위해 링커 또는 다른 서열(가령poly-His)을 공액시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드에 이뮤노글로블린 Fc 부분을 공액시킬 수 있다.

관련된 측면에서 복합 폴리펩티드에 대해 설명한다. "복합 폴리펩티드"는 상기 항원성 부분중 적어도 한 개, 한 개 이상의 추가되는 항원성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 서열로 구성된 폴리펩티드를 말하는 것으로 이는 단일 아미노산 사슬에 펩티드 결합을 통하여 결합된다. 서열은 직접적으로 결합되거나(가령, 아미노산의 중개 없이) 성분 폴리펩티드의 항원 성질에 영향을 주지않는 링커 서열(예를 들면 Gly-Cys-Gly)을 이용하여 결합될 수 있다.

일반적으로, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원, 이와 같은 항원을 인코드하는 DNA 서열은 다양한 과정을 이용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 당업자에 공지된 과정을 통하여 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 배양 여과물에서 가용성 항원을 분리할 수 있는데, 예를 들면, 음이온-교환 및 역상 크토마토그래피등의 방법이 포함된다. 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염된 개체에서 수득한 혈청과의 반응성등의 원하는 성질에 대해 정제된 항원을 평가한다. 이와 같은 선별과정은 여기에서 설명하는 대표적인 방법을 이용하여 실시할 수 있다. 통상적인 Edman 화학법을 이용하여 부분적으로 항원의 서열을 조사할 수 있다(Edman and Berg, Eur. J. Biochem. 80:116-132, 1967)

항원을 인코드하는 DNA 서열을 이용하여 재조합으로 항원을 만들 수 있는데, 이는 항원을 인코드하는 DNA 서열을 발현 벡터에 삽입시키고, 적절한 숙주에서 DNA 서열을 발현시키는 것이다. 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원에 대해 특이적으로 발생된 항-혈청(가령 토끼)으로 적절한 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 발현 라이브러리를 스크린하여 가용성 항원을 인코드하는 DNA 분자를 분리해낼 수 있다. 적절한 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈 또는 cDNA 발현 라이브러리를 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 감염된 환자에서 수득한 혈청으로 스크린하여 (가용성에는 상관없이)항원을 인코드하는 DNA 서열을 확인할 수 있다. 이와 같은 방법은 공지의 기술을 이용하는데, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989을 참고한다.

적절한 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) cDNA 또는 게놈 라이브러리를 분리한 가용성 항원의 부분 아미노산에서 유도한 축중 올리고뉴클레오티드에 하이브리드하는 DNA 서열에 대해 스크리닝하여 가용성 항원을 인코드하는 DNA 서열을 확인할 수 있다. 이와 같은 선별에 이용되는 축중 올리고뉴클레오티드를 고안하여 합성하고, 선별 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY에서 설명하는 내용을 참고로 한다. cDNA 또는 게놈 라이브러리에서 핵산 프로브를 분리하기 위해, 공지의 방법에서 상기 올리고뉴클레오티드를 이용한 폴리메라제 중합반응(PCR)을 이용할 수 있다. 라이브러리 스크린은 분리된 프로브를 이용하여 실시할 수 있다.

준비 방법과는 상관없이, 여기에서 설명하는 항원은 "항원성"이 있는 것이다. 좀더 구체적으로는 항원은 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 감염된 개체에서 취한 혈청과 반응할 수 있는 능력이 있다는 것이다. 반응성은 여기에서 설명하는 대표적인 ELISA 검사를 이용하는데, 감염된 개체에서 취한 혈청의 흡수도는 감염안된 개체에서 취한 혈청의 흡수도보다 적어도 3개 표준 편자를 가지는데 이 경우를 양성이라고 간주한다.

미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 항원성 부분은 공지 기술을 이용하여 준비하고 확인할 수 있는데, 그 내용은 Paul, Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, 1993, pp.243-247에 요약되어 있다. 이와 같은 기술에는 항원 성질에 대한 고유 항원의 폴리펩티드 부분을 스크리닝하는 것이 포함된다. 이와 같은 스크린에 여기에서 설명하는 대표적인 ELISAs가 이용될 수 있다. 폴리펩티드의 항원 부분은 이와 같은 검사에서 전체 길이 항원에 의해 발생되는 것과 실제 유사한 시그날을 발생시키는 부분을 말한다. 환언하면, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원의 항원성 부분은 여기에서 설명하는 ELISA 테스트에서 전체 길이 항원에 의해 발생되는 시그날의 적어도 20%, 적절하게는 약 100%를 발생시킨다.

미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원의 부분 및 다른 변이체는 합성 또는 재조합 수단에 의해 만들 수 있다. 당분야에 공지된 기술을 이용하면, 약 100개 이하, 일반적으로 약 50개 이하 아미노산을 가지는 합성 폴리펩티드를 만들 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 폴리펩티드는 Merrifield 고형상 합성 방법(이때, 아미노산을 연속적으로 첨가하여 아미노산 쇄의 길이를 증가시키는 방법)과 같은 상업적으로 이용 가능한 고형 상 기술을 이용하여 합성할 수 있다(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963).

폴리펩티드를 자동 합성하는 장비는 Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA에서 공급하는 장치를 이용할 수 있고, 이때 제조업자의 지시에 따라 작동을 시킨다. 올리고뉴클레오티드-직접 부위-특이적인 돌연변이등과 같은 표준 돌연변이 발생 기술을 이용하여 고유 항원의 변이체를 만들 수 있다. 절두된 폴리펩티드를 준비하기 위해 표준 기술을 이용하여 DNA 서열의 일부분을 제거할 수 있다.

고유 항원의 일부분 또는 변이체를 포함하는 재조합 폴리펩티드는 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 서열에서 만들 수 있다. 예를 들면, 배양 배지로 재조합 단백질을 배출하는 적절한 숙주/벡터 시스템의 상청액을 통상적인 필터를 이용하여 우선 농축을 시킨다. 농축후에, 농축물은 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 적절한 정제 매트릭스에 공급할 수 있다. 마지막으로, 재조합 단백질을 추가 정제하기를 원하는 경우 한 가지 이상의 역상 HPLC 단계를 이용할 수 있다.

여기에서 설명하는 것과 같이 재조합 폴리펩티드를 발현시키는데에는 당분야에 공지된 다양한 임의 발현 벡터를 이용할 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터에 형질감염 또는 형질변환된 적절한 임의 숙주 세포에서 발현을 시킬 수 있다. 적절한 숙주세포에는 원핵세포, 이스트, 고등 진핵세포등을 포함한다. 숙주 세포로 적절한 것은 대장균(E. coli), 이스트 또는 COS 또는 CHO와 같은 포유류 세포등이 된다. 이와 같은 방식으로 발현된 DNA 서열은 자연 발생 항원, 자연 발생 항원의 일부분 또는 이의 변이체를 인코드할 수 있다.

일반적으로, 여기에서 설명하는 준비방법에는 무관하게, 폴리펩티드는 실제 순수한 형태로 준비된다. 폴리펩티드는 적어도 약 80%정도의 순수성을 가지는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 적어도 90%이상, 가장 바람직한 것은 약 99%의 순도를 가지는 것이다. 그러나, 여기에서 설명하는 방법에 이용하기 위해서는 이와 같은 실제 순수한 폴리펩티드가 복합될 수 있다.

특정 구체예에서, 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원(또는 이와 같은 항원의 변이체)의 항원성 부분을 최소한 포함하는 폴리펩티드에 대해 설명하는데, 이때 항원은 다음과 같은 N-말단 서열중 한 가지를 가진다;

이때, Xaa는 임의 아미노산이 될 수 있지만, 시스테인이 적절하다. 상기 (g)에서 확인된 것과 같은 항원을 인코드하는 DNA 서열은 서열 52에 기술되어 있고, 이의 유추된 아미노산 서열은 서열 53으로 나타낸다. 상기 (a)에서 확인된 것과 같은 항원을 인코드하는 DNA 서열은 서열 96에 기술되어 있고, 이의 유추된 아미노산 서열은 서열 97으로 나타낸다. 항원(d)에 상응하는 DNA 서열은 서열 24에 기술되어 있고, 항원(c)에 상응하는 DNA 서열은 서열 25에 기술되어 있고, (I)항원에 상응하는 DNA 서열은 서열 94에 기술되어 있고, 이의 유추된 아미노산 서열은 서열 95으로 나타낸다.

추가 구체예에서, 본 발명은 다음의 N-말단 서열중 한가지 또는 단지 보존성 치환 또는 변형을 한 것만 차이가 있는 이의 변이체를 가지는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원의 면역원 부분을 최소한 구성 요소로 가지는 폴리펩티드에 대해 설명한다;

이때, Xaa는 임의 아미노산이 될 수 있지만, 시스테인이 적절하다.

다른 특이적인 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 2, 4-10, 13-25, 52, 94, 96; (b) 이와 같은 DNA 서열의 상보체; (c) (a) 또는 (b)의 서열에 상동성을 가지는 DNA 서열에 의해 인코드되는 하나이상의 아미노산 서열로 구성된 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원(또는 이와 같은 항원의 변이체)의 항원성 부분을 필수적으로 포함하는 폴리펩티드에 대해 설명한다.

추가 특정 구체예에서, 본 발명은 (a) 서열 26-51, 133, 134, 158-178, 196 ; (b) 이와 같은 DNA 서열의 상보체; (c) (a) 또는 (b)의 서열에 상동성을 가지는 DNA 서열에 의해 인코드되는 하나이상의 아미노산 서열로 구성된 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원(또는 이와 같은 항원의 변이체)의 항원성 부분을 필수적으로 포함하는 폴리펩티드에 대해 설명한다.

상기에서 설명하는 특정 구체예에서, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원에는 여기에서 언급하는 하나이상의 DNA 서열에 실제 상동성인 DNA 서열을 인코드하는 변이체를 포함한다. 여기에서 사용된 "실제 상동성을 가지는"이란 적절한 스트린젼트 조건에서 하이브리드할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 적절한 스트린젼트 조건이란 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA (pH 8.0)용액으로 미리 세척을 하고; 50℃-65℃, 5X SSC에서 하이브리드하고, 단, 종강 상동성의 경우에는 45℃에서 0.5X SSC로 하이브리드시키고; 65℃에서 20분간 각 2X, 0.5X, 0.2X SSC(0.1% SDS 포함) 용액으로 세척을 하는 것을 포함한다. 이와 같은 DNA 서열에 하이브리드하는 것은 본 발명의 범위에 속하는 것으로, 뉴클레오티드의 경우 코드의 축중성으로 인하여, DNA 서열에 하이브리드시켜 인코드된 면역원 폴리펩티드를 인코드하는 것이다.

관련된 측면에서, 본 발명은 융합 단백질을 제공하는데, 이 융합 단백질은 제 1 및 제 2 신규 폴리펩티드로 구성되거나 또는 본 발명의 폴리펩티드와 상기에서 설명하는 38kD 항원 또는 ESAT-6 (SEQ ID NOS: 98 and 99)과 같은 공지의 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원 및 다양한 항원 단백질 변이체와 융합된 것으로 구성된다. 본 발명의 융합 단백질은 제 1과 제 2 폴리펩티드간에 링커 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질을 인코드하는 DNA 서열은 공지의 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들 수 있는데, 이는 적절한 발현 벡터 내로 제 1과 제 2 폴리펩티드를 인코드하는 별도 DNA 서열로 합체한다. 제 1 폴리펩티드를 인코드하는 3'말단은 펩티드 링커 유무에 상관없이 제 2 폴리펩티드의 5'말단에 결찰시켜, 서열의 리딩 프레임이 상안에 있게 하여, 두 가지 DNA 서열을 mRNA 해독시켜 제 1 과 제 2 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모두 가지는 한 개의 융합 단백질이 되도록 한다.

각 폴리펩티드가 이들의 2차 또는 3차 구조로 접힐 수 있도록, 제 1과 제 2 폴리펩티드간에 충분한 거리를 유지시키도록 펩티드 링커를 이용할 수 있다. 이와 같은 펩티드 링커는 당분야에 공지의 기술을 이용하여 융합 단백질에 결합시킬 수 있다. (1) 유연하여 연장된 모양을 채택하는 능력; (2) 제1과 제2 폴리펩티드에서 에피토프 기능에 간섭하는 2차 구조는 채택하지 않는 능력; (3) 폴리펩티드의 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 전하를 띈 잔기의 부족 등의 요인을 기초하여, 적절한 펩티드 링커 서열을 선택할 수 있다. 적절한 펩티드 링커 서열에는 Gly, Asn, Ser 잔기를 포함한다. 다른 거의 중성에 해당되는 아미노산 가령, Thr, Ala을 링커 서열에 이용할 수도 있다. 링커에 이용하면 유용한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8562, 1986; 미국 특허 4,935,233 ; 미국 특허 4,751,180에 설명한다. 링커 서열은 길이가 약 1 내지 50개 아미노산으로 구성된다. 기능 도메인을 분리하고, 공간적으로 방해되지 않도록 하는 역할에 이용할 수 있는 비-필수 N-말단 부분이 제 1 과 제 2 폴리펩티드 사이에 존재하는 경우에는 펩티드 링커가 필요 없다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 결핵을 진단하는데 상기 폴리펩티드를 이용하는 방법을 제공한다. 이에 대해, 상기 하나이상의 폴리펩티드를 단독 또는 복합하여 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염을 감지하는 방법을 제공한다. 다중 폴리펩티드를 이용하는 구체예의 경우에, 여기에서 설명하는 특정 폴리펩티드 가령, Andersen and Hansen, Infect. Immun. 57:2481-2488, 1989,에서 설명하는 38kD 항원이외의 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 여기에서 사용된 것과 같이, "생물학적 샘플"는 환자에서 취한 임의 항체를 포함하는 샘플을 말한다. 샘플로는 전체 혈액, 가래, 혈장, 침, 뇌척수 액 또는 오줌등이 적절하다. 좀더 적절하게는 샘플은 환자 또는 혈액 공급체에서 취한 혈액, 혈청, 혈장이다. 하기에서 상술하게 되는 검사에 폴리펩티드를 이용하여 예정 차단 값에 대해 샘플에서의 폴리펩티드에 대한 항체의 존재 유무를 결정한다. 이와 같은 항체가 존재한다면, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원에 이미 감응성이 있어, 이는 결핵이 있다는 것을 암시한다.

한 개 폴리펩티드 이상을 이용하는 구체예에서, 이용된 폴리펩티드는 상보적인 것이 바람직하다(가령, 한 성분 폴리펩티드는 샘플에서 또 다른 성분의 폴리펩티드가 감지하지 못하는 감염을 감지하는 경향이 있는 것). 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 감염된 것으로 공지된 일련의 환자에서 수득한 혈청 샘플에 대해 각 폴리펩티드를 개별적으로 평가하기 위하여 상보적인 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 각 폴리펩티드로 샘플 테스트 양성(하기에서 설명)를 결정한 후에, 테스트할 모든 샘플에서 감염을 감지할 수 있도록 두 개이상의 폴리펩티드를 복합한다. 이와 같은 폴리펩티드는 상보적이다. 예를 들면, 결핵에 감염된 개체에서 취한 혈청의 약 25-30%가 임의 한 개 단백질(가령 상기에서 설명한 38kD)에 대한 항체에 음성이다. 따라서, 진단 테스트에 감응성을 개선시키기 위해 38kDa 항원과 상보 폴리펩티드를 복합하여 이용할 수 있다.

샘플에서 항체를 감지하는데 하나이상의 폴리펩티드를 이용하는 방법은 당업자에 공지된 다양한 검사 방법이 있다(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 적절한 구체예에서, 검사는 고형 서포트에 고정된 폴리펩티드를 이용하여 샘플에 있는 항체에 결합하여, 이를 제거하는 것과 연관된다. 결합된 항체는 리포터 기가 있는 감지 시약을 이용하여 감지할 수 있다. 적절한 감지 시약에는 리포터 기가 라벨된 항체/폴리펩티드 복합체 및 자유 폴리펩티드에 결합하는 항체를 포함한다(반-경쟁성 검사). 또는 경쟁성 검사를 이용할 수도 있는데, 폴리펩티드에 결합하는 항체는 리포터기를 라벨시키고, 샘플과 항원을 배양한 후에 고정된 항원에 결합되도록 한다. 샘플 성분이 폴리펩티드에 라벨된 항체가 결합되는 것을 방해하는 정도가 고정된 폴리펩티드에 대한 샘플의 반응성을 나타내는 것이다.

항원을 부착시키는 고형 서포트은 당분야에 공지된 임의 물질을 이용할 수 있다. 예를 들면, 고형 서포트는 미량적정 플레이트의 테스트 웰 또는 니트로셀룰로오즈 또는 다른 적절한 막이 될 수 있다. 또는, 서포트는 비드, 유리, 섬유 유리, 라텍스 또는 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌과 같은 플라스틱 물질이 될 수 있다. 미국 특허 5,359,681에서 설명하는 것과 같이 자석 입자 또는 광 섬유 센서등이 서포트로 될 수 있다.

폴리펩티드는 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 고형 서포트에 결합될 수 있는데, 이는 특허 문헌 등에 상세하게 설명된다. 본 발명의 명세서에서 "결합된" 용어는 흡착과 같은 비공유 결합 및 공유 부착(항원과 서포트에 있는 기능기산에 직접적인 연결 또는 교차 결합제에 의한 연결)을 의미한다. 미량적정 판 또는 막에 흡착에 의한 결합이 바람직하다. 이와 같은 경우에, 적절한 완충액에서, 적절한 시간동안 고형 서포트에 폴리펩티드 접촉시켜 흡착시킬 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 달라지지만, 일반적으로 약 1 시간 내지 하루정도가 된다. 일반적으로, 약 10ng 내지 1㎍ 범위의 폴리펩티드, 적절하게는 약 100ng의 폴리펩티드를 플라스틱 미량적정판에 접촉시키면, 적정량의 항원에 결합된다.

고형 서포트에 폴리펩티드를 공유 결합시키는 것은 폴리펩티드에 하이드록실 또는 아미노기와 같은 기능기와 서포트간에 반응을 할 수 있는 이가기능기 시약을 우선 서포트와 반응시켜 이루어진다. 예를 들면, 폴리펩티드는 벤조퀴논과 같은 적절한 고분자 코팅을 가지는 서포트에 결합되거나 또는 폴리펩티드에 아민과 활성 수소로 서포트에 있는 알데히드기와 축합하여 얻을 수 있다(Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13).

특정 구체예에서, 검사는 효소 연결된 면역흡착 검사(ELISA)를 이용한다. 이 검사는 주로 미량적정판이 되는 고형 서포트에 고정된 폴리펩티드 항원에 샘플을 접촉시키고, 샘플에 있는 폴리펩티드에 대한 항체가 고정된 폴리펩티드에 결합되도록 하는 것이다. 고정된 폴리펩티드에서 결합 안된 샘플을 제거하고, 고정된 항체-폴리펩티드 복합체에 결합할 수 있는 감지 시약을 첨가한다. 특정 감지 싱??에 적합한 방법을 이용하여, 고형 서포트에 결합된 잔류 감지 시약의 양을 결정한다.

좀더 구체적으로는, 상기에서 설명하는 일단 폴리펩티드를 상기에서 설명하는 것과 같이 서포트에 고정을 시킨 후에, 서포트에 남아있는 단백질 결합 부위는 일반적으로 차단시킨다. 당분야에 공지된 임의 적절한 차단제 가령 소 혈청 알부민 또는 Tween 20^TM(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)등을 이용할 수 있다. 고정된 폴리펩티드를 샘플과 배양시키고, 항체가 항원에 결합되도록 한다. 배양전제 샘플인 임의 적절한 희석제 가령 인산완충염(PBS)으로 희석시킬 수 있다. 일반적으로 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염된 샘플 내에 항체의 존재를 감지하는데 충분한 시간이 적절한 접촉시간(배양 시간)이 된다. 적절하게는 결합된 항체와 결합안된 항체에 균형을 이루는 적어도 95%의 결합 수준을 얻는데 걸리는 시간이 충분한 시간이 된다. 당업자는 상당시간동안 발생되는 결합의 수준을 검사하여 이와 같은 평형을 이루는 시간을 결정할 수 있다. 일반적으로, 실온에서는 약 30분정도의 배양시간이면 충분하다.

그 다음 결합안된 샘플은 적절한 완충액 가령 0.1% Tween 20^TM를 포함하는 PBS로 고형 서포트를 세척하여 제거한다. 그 다음 감지 시약을 고형 서포트에 첨가한다. 적절한 감지 시약은 고정된 항체-폴리펩티드 복합체에 결합하고, 다양한 방법에 의해 감지될 수 있는 임의 화합물이 된다. 적절하게는, 감지 시약에는 리포터기에 공액되는 결합제(가령, Protein A, Protein G, 이뮤노글로블린, 렉틴 또는 자유 항원)을 포함한다. 적절한 리포터기에는 효소(양고추냉이 과산화효소), 기질, 공인자. 저해물질, 염료, 방사능뉴클리드, 형광기, 발광기 및 바이오틴을 포함한다. 리포터기에 결합제를 공액시키는 방법은 당분야에 공지된 방법을 이용한다. 통상적인 결합제는 다양한 공급원(Zymcd Laboratories, San Francisco, CA, and Pierce, Rockford IL)에서 제공하는 다양한 리포터 기에 공액된 것으로 구입할 수 있다.

그 다음, 결합된 항체를 감지하기위해, 충분한 시간동안 고정된 항체-폴리펩티드 복합체와 감지 시약을 배양한다. 적절한 시간은 일반적으로 제조업자의 지시에 따르거나 또는 시간에 따른 결합 정도를 검사하여 결정할 수 있다. 그 다음 결합안된 감지 시약은 제거하고, 결합된 감지 시약은 리포터 기를 이용하여 감지할 수 있다. 리포터 기를 감지하는데 이용되는 방법은 리포터기의 성질에 따라 달라진다. 방사능활성기의 경우에는 신틸레이션 카운터 또는 자가방사그래프 방법이 일반적으로 이용되는 방법이다. 상이한 리포터기에 결합된 아미딘을 이용하면 바이오틴을 감지할 수 있다(통상적으로 방사능활성 또는 형광기 또는 효소). 효소 리포터기는 일반적으로 기질(일반적으로 충분한 시간동안)을 첨가하고, 반응 생성물의 분광광도계 또는 다른 분석을 이용하여 감지한다.

샘플에 항-미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항체의 유무를 감지하기 위해, 고형 서포트에 결합되어 남아있는 리포터기에서 감지되는 시그날을 일반적으로 예정된 차단치에 상응하는 시그날과 비교한다. 한 적절한 구체예에서, 차단치는 감염 안된 환자에서 취한 샘플과 고정된 항원을 배양시켰을 때 발생되는 평균 시그날을 말한다. 일반적으로 예정된 차단값보다 세 개 평균 편차이상의 시그날을 발생시키는 샘플은 결핵에 대해 양성으로 간주한다. 또 다른 구체예에서, 차단치는 Receiver Operator Curve을 이용하여 결정할 수 있는데, 이때 방법은 Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, pp. 106-107에서 설명하고 있다. 간략하면, 이 구체예에서, 차단치는 실제 양성 비율(가령, 감응성)과 가짜 양성 비율(가령 100% 특이성)의 짝 플롯으로 결정하는데, 이는 진단 테스트 결과에 대한 각 차단치에 해당되게 된다. 상위 좌측 코너에 가장 근접한 플롯에 있는 차단치(예를 들면, 최대 면적을 포함하는 값)가 가장 적확한 차단치가 되고, 이 방법에 의해 결정된 차단치이상의 시그날을 발생시키는 샘플은 양성으로 간주한다. 또는, 가짜 양성 비율을 최소화시키기 위해 차단치는 플롯의 좌측으로 이동될 수 있고 또는 가짜 음성 비율을 최소화시키기 위해 플롯의 우측으로 이동될 수 잇다. 일반적으로 이 방법에 의해 결정된 차단치이상의 시그날을 발생시키는 샘플은 결핵에 대해 양성으로 간주한다.

관련 구체예에서, 검사는 신속한 관통 또는 스트립 테스트 포맷으로 실행하는데, 이때 항원은 니트로셀룰로오즈와 같은 막에 고정된다. 관통 테스트에서, 샘플내에 있는 항체는 샘플이 막을 관통할 때 고정된 폴리펩티드에 결합된다. 그 다음 감지 시약을 포함하는 용액이 막을 통과할 때 감지 시약(가령 단백질 A-콜로이드성 금)이 항체-폴리펩티드 복합체에 결합된다. 결합된 감지 시약을 감지하는 것은 상기에서 설명하는 것과 같이 실행된다. 스트립 테스트 포맷에서, 폴리펩티드가 결합되는 막의 한 단부를 샘플이 포함된 용액에 담근다. 샘플은 감지 시약을 포함하는 부분을 통하여 막을 따라 이동하고, 고정된 폴리펩티드가 있는 위치까지 이동된다. 폴리펩티드에서 감지 시약의 농도는 샘플에 있는 항-미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항체의 존재를 나타낸다. 일반적으로, 그 부위에서 감지 시약의 농도는 시각적으로 볼 수 있는 라인과 같은 패턴을 만든다. 일반적으로 상기에서 설명하는 것과 같이, 샘플에 ELISA에서 양성 시그날을 방생시키는데 충분한 수준의 항체를 포함하는 경우에 시각적으로 구별할 수 있는 패턴을 발생시키도록 막에 고정되는 폴리펩티드의 양을 선택한다. 적절하게는 막에 고정된 폴리펩티드의 양은 약 25ng 내지 1㎍이 되고, 좀더 적절하게는 약 50ng 내지 500ng이 된다. 이와 같은 테스트에서는 환자 혈청 또는 혈액 소량(가령 한 방울)로 실행할 수 있다.

물론, 본 발명의 폴리펩티드에 이용될 수 있는 많은 다른 검사 과정이 있다. 상기 설명은 구체예에 불과하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 신규한 폴리펩티드에 대한 항체를 제공하는 것이다. 항체는 당업자에 공지된 다양한 방법을 이용하여 준비할 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 한 기술에서 항원성 폴리펩티드를 포함하는 이뮤노겐은 우선 다양한 포유류(가령, 쥐, 토끼, 들쥐, 양, 염소)에 주사한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩티드는 변형없이 이뮤노겐으로 이용된다. 또는 상대적으로 짧은 폴리펩티드의 경우에는 폴리펩티드를 소 혈청 알부민 또는 키홀 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)과 같은 캐리어 단백질에 결합시키는 경우에 우수한 면역 반응을 유도할 수 있다. 이뮤노겐은 동물 숙주에 주사하는데, 이때 하나이상의 부스터 면역과정을 복합시켜 예정된 과정에 따라 실시하는 것이 바람직하고, 동물로부터 주기적으로 피를 뽑는다. 그 다음 폴리펩티드에 특이적인 다클론성 항체는 적절한 고형 서포트에 결합되는 폴리펩티드를 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 항혈청으로부터 정제해낼 수 있다.

관심이 있는 항원성 폴리펩티드에 특이적인 단클론성 항체는 Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976의 기술을 이용하고, 이에 개선된 점을 복합시켜 준비한다. 간략하게 설명하면, 이들 방법은 원하는 특이성(가령, 원하는 폴리펩티드와의 반응성)을 가지는 항체를 만들 수 있는 불사화 세포주를 준비하는 것과 관계한다. 예를 들면, 이와 같은 세포주는 상기에서 설명하는 것과 같이 면역처리된 동물에서 수득된 지라 세포에서 만들 수 있다. 그 다음, 골수종 세포 융합 짝 적절하게는 면역화된 동물과 동계의 짝과 융합시켜 불사화시킨다. 다양한 융합 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 지라 세포와 골수종 세포는 수 분간 비이온성 계면활성제로 복합시키고, 그 다음 골수종 세포의 생장은 돕지않고 하이브리드 세포의 생장을 돕는 선택성 배지에서 저밀도로 도말한다. 적절한 선택 기술은 HAT(하이포산틴, 아미노프테린, 티미딘)선별이다. 충분한 시간 후에 통상 약 1 내지 2주, 하이브리드 콜로니를 관찰할 수 있다. 단일 콜로니를 선택하고, 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 테스트한다. 높은 반응성 및 특이성을 가지는 하이브리도마가 바람직하다.

단클론성 항체는 하이브리도마 콜로니를 생장시킨 상청액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포주를 적절한 척추동물 숙주 가령 쥐의 복강으로 주사하여 생산성을 강화시키는데 이용할 수 있다. 그 다음 단클론항체는 복수 또는 혈액에서 수득할 수 있다. 통상적인 기술 가령, 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출들의 방법을 이용하여 항체에서 오염물질을 제거한다. 본 발명의 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피와 같은 정제 공정에 이용할 수 있다.

상기에서 설명하는 것과 유사한 검사를 이용하여 또는 당분야에 공지된 다른 방법을 이용하여 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원의 존재를 감지하기 위해서 진단 테스트에 항체를 이용하고, 환자에서 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염을 감지하는 방법을 제공한다.

본 발명의 진단 시약은 하나이상의 상기 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 인코드하는 DNA로 구성된다. 예를 들면, 생물학적 시료에서 유도한 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)-특이적 cDNA를 증폭시키기 위해 폴리메라제 연쇄 반응(PCR) 기초한 시험에 적어도 두 개 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용할 수 있는데, 이때 올리고뉴클레오티드 프라이머중 적어도 한 개는 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA에 특이성이 있어야 한다. 그 다음 증폭된 cDNA가 존재하는 지는 겔 전기영동등의 공지 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드를 인코드하는 DNA 분자에 특이성이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 하이브리드 검사에 이용하여, 생물학적 시료에서 신규한 폴리펩티드가 존재하는지를 감지할 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, "DNA에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머/프로브"는 문제의 DNA 서열에 적어도 약 80%, 적절하게는 약 90%, 가장 적절하게는 약 95% 상동성을 가지는 올리고뉴클레오티드 서열을 말한다. 본 발명의 진단 방법에 이용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머/프로브는 적어도 약 10-40 뉴클레오티드를 가진다. 적절한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 여기에서 상술하는 폴리펩티드 중 하나를 인코드하는 DNA 분자의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드를 가진다. 적절하게는 신규한 진단방법에 이용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브는 여기에서 상술되는 폴리펩티드 중 적어도 한 개를 인코드하는 DNA 분자의 15개 연속 뉴클레오티드로 구성된다. PCR검사 및 하이브리드 검사 기술은 당업자에게 공지된 것이다(Mullis et al. Ibid; Ehrlich, Ibid). 따라서, 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 서열을 감지할 수 있다. 상기에서 설명하는 올리고뉴클레오티드 서열로 구성된 DNA 프로브 또는 프라이머를 단독으로 또는 다른 것과 복합하여 또는 기존의 확인된 서열 가령, 38kD 항원과 복합하여 사용할 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명을 설명하기 위함이고, 이에 한정시키고자 함은 아니다.

실시예 1

미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 배양 여과물에서 폴리펩티드를 정제 및 특징 조사

이 실시예에서는 배양 여과물에서 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 가용성 폴리펩티드를 준비하는 것을 설명한다. 다른 언급이 없는 한, 다음의 실시예에서 이용되는 백분율은 부피에 대한 중량비를 말한다.

미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)[H37Ra, ATCC No. 25177, H37Rv, ATCC No. 25618]는 14일간 37℃에서 멸균 GAS 배지에서 배양한다. 배지는 0.45μ 필터를 통하여 진공 여과(대부분 세포만 남겨둠)하여, 멸균된 2.5ℓ병에 넣는다. 그 다음 배지는 0.2μ필터를 통하여 여과시켜 멸균된 4ℓ병에 넣는다. 그 다음 NaN₃를 배양 여과물에 첨가하여 0.04%로 농축한다. 그 다음 병은 4℃ 방에 넣는다.

배양 여과물은 증기 멸균한 12ℓ저장기에 넣고, 에탄올로 씻어내고, 10,000kDa MWCO 막을 가지는 400㎖ 아미콘 교반 쎌에 여과물을 공급하여, 배양 여과물을 농축시킨다. 질소 기체를 이용하여 압력은 60psi로 유지시킨다. 이 공정은 12ℓ 용적을 약 50㎖로 감소시킨다.

그 다음 배양 여과물은 8,000kDa MWCO 셀룰로오즈 에스테르 막을 이용하여 0.1% 중탄산암모니움으로 투석을 하는데, 이때 중탄산 암모니움 용액은 2회 교환한다. 그 다음 상업적으로 이용할 수 있는 BCA 검사(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 단백질 농도를 결정한다.

투석된 배양 여과물은 냉동건조시키고, 폴리펩티드는 증류수에 재현탁시킨다. 그 다음 폴리펩티드는 0.01mM 1,3 비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판, pH 7.5(비스-트리스 프로판 완충액); 음이온 교환 크로마토그래피 초기 조건에 대해 투석을 한다. 0.01mM 비스-트리스 프로판 완충액 pH 7.5로 균형을 맞춘 POROS 146 II Q/M 음이온 교환 컬런 4.6㎜X100㎜(Perseptive BioSystems, Framingham, MA)에서 겔 크로마토그래피를 실행하여 분취한다. 상기 완충 시스템에서 0 - 0.5M NaCl 농도차를 이용하여 폴리펩티드를 용출한다. 컬럼 용출물은 220㎚에서 모니터한다.

이온 교환 컬럼에서 용출된 폴리펩티드를 모아서, 증류수에 대해 투석하고, 냉동건조시킨다. 생성된 물질은 물에 0.1% 트리플로로아세트산(TFA) pH 1.9에 용해시키고, 폴리펩티드는 Delta-Pak C18 column (Waters, Milford, MA) 300Å 포어 크기, 5 미크론 입자 크기(3.9 ×150㎜)에서 정제하였다. 폴리펩티드는 0 - 60% 희석 완충액(0.1% TFA/아세토니트릴)로부터 선형 농도 차를 이용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 유속은 분당 0.75㎖이고, HPLC 용출물은 214㎚에서 모니터한다. 용출된 폴리펩티드를 포함하는 분취물을 수집하여 개별 샘플의 순도를 최대화시킨다. 약 200개 정제된 폴리펩티드를 수득한다.

정제된 폴리펩티드는 PBMC 준비물에서 T-세포 증식을 유도하는 능력에 대해 스크리닝한다. PDD 피부 테스트 양성으로 알려진 기증자와 이 기증자의 T 세포가 PDD에 반응하여 증식하는 것으로 보이는 기증자의 PBMC와 MTB의 정제 안된 가용성 단백질은 10% 사람 혈청 및 50㎍/㎖ 젠타미이신이 보충된 RPMI 1640로 구성된 배지에 배양한다. 정제된 폴리펩티드는 0.5 내지 10 ㎍/㎖ 농도로 2회 첨가한다. 200㎕ 용적에서 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 6일간 배양후에, 50㎕ 배지를 각 웰에서 제거하여 하기에서 설명하는 IFN-γ수준을 결정한다. 그 다음 플레이트는 추가 18시간동안 3중수소결합된 티미딘 1μCi로 펄스시키고, 수득시키고, 기체 신틸레이션 카운터를 이용하여 3중수소 흡취량을 결정한다. 배양 배지만으로 배양된 세포에서 관찰되는 증식보다 3배 이상 증식되는 분취물은 양성인 것으로 간주한다.

효소-결합된 면역흡착 검사(ELISA)를 이용하여 IFN-γ를 측정하고, ELISA 플레이트는 실온에서 4시간동안 PBS에서 사람 IFN-γ(Chemicon)에 대한 쥐 단클론 항체로 피복한다. 웰은 실온에서 1시간동안 5%(W/V) 탈지우유를 포함하는 PBS로 차단한다. 그 다음 플레이트는 PBS/0.2% TWEEN-20으로 6회 세척하고, ELISA에서 배양 배지 2에 대해 샘플 1로 희석시켜 실온에서 하룻밤동안 배양시켰다. 플레이트는 다시 세척하고, PBS/10% 정상 염소 혈청에 1:3000으로 희석시킨 다클론성 토끼 항-사람 IFN-γ을 각 웰에 첨가한다. 그 다음 플레이트는 실온에서 2시간동안 배양시키고, 양고추냉이 과산화효소-결합된 항-토끼 IgG(Jackson Labs)를 PBS/5%탈지 우유에 1:2000 희석비로 첨가한다. 실온에서 추가로 2시간 배양후에, 플레이트는 세척하소, TMB 기질을 첨가한다. 20분 후에, 1N 황산을 첨가하여 반응을 종료시킨다. 광학 밀도는 기준 파장을 570㎚로 하여 450㎚에서 결정한다. 배지만으로 배양시킨 세포의 평균 OD보다 약 2배 이상의 OD+3 표준 편차를 두 경우에 모두 발생시키는 분취물은 양성인 것으로 간주한다.

서열을 조사하기 위해, 폴리펩티드는 여리 섬유 필터로 처리한 Biobrene^TM(Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA)에서 개별적으로 건조시킨다. 폴리펩티드가 있는 필터는 Perkin Elmer/Applied BioSystems Division Procise 492 단백질 서열화기에 적하시킨다. 통상적인 Edman 화학을 이용하여, 폴리펩티드는 아미노산 단부에서 서열화시킨다. 적절한 PTH 유도 표준에 대한 PTH 아미노산 유도체의 유지 시간을 비교하여 각 폴리펩티드의 아미노산 서열을 결정한다.

상기 폴리펩티드를 이용하여, 다음의 N-말단 서열을 가지는 항원을 분리하였다;

이때, Xaa는 임의 아미노산이 될 수 있다.

상기 과정에 추가하여, 마이크로보어 HPLC 정제 단계를 이용하여 추가 항원을 분리하였다. 특히, 상기에서 설명하는 크로마토그래피 정제 단계에서 얻은 항원 혼합물로 구성된 분취물 20㎕은 Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Model 172 HPLC에서 7미크론 포어 크기, 컬럼 크기가 1㎜ ×100㎜인 Aquapore C18 column (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA)에서 정제한다. 컬럼으로부터 아세토니크릴(0.05% TFA)/물(0.05% TFA)을 분당 80㎕로 분당 1% 선형 농도로 컬럼으로부터 분취물을 용출시킨다. 용출물은 250㎚에서 모니터한다. 고유 분취물은 4가지 주요 피크와 더 작은 성분으로 분리되는데, 수득된 폴리펩티드는 분자량이 12.054Kd(질량 스펙트럼에 의하면)이고, 다음의 N-말단 서열을 가지는 것으로 나타났다;

이 폴리펩티드는 상기에서 설명하는 PBMC 준비물에서 증식 및 IFN-γ생산을 유도하는 것으로 보인다.

추가 가용성 항원은 다음과 같이 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 배양 여과물에서 분리하였다. 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 배양물은 상기와 같이 준비하였다. 비스-트리스 완충액 pH5.5에 대해 투석을 한 후에, 비스-트리스 프로판 완충액 pH 5.5에서 평형을 맞춘 Poros QE column 4.6 ×100㎜ (Perseptive Biosystems)에서 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한다. 폴리펩티드는 분당 10㎖ 유속으로 상기 완충액 시스켐에서 0 - 1.5M NaCl 선경사를 이용하여 용출시킨다. 컬럼 용출물은 214㎚에서 모니터한다.

이온 교환 컬럼에서 용출되는 분취물을 모으고, 이를 Poros R2 column 4.6 ×100㎜ (Perseptive Biosystems)를 이용하여 역상 크로마코그래피한다. 폴리펩티드는 분당 2㎖ 유속으로 상기 완충액 시스템에서 0 - 100% 아세토니트릴(0.1% TFA) 선경사를 이용하여 용출시킨다. 컬럼 용출물은 214㎚에서 모니터한다.

용출된 폴리펩티드를 포함하는 분취물은 냉동 건조시키고, 80㎕ 수용성 0.1% TFA에 재현탁시키고, 추가로 Vydac C4 column 4.6 ×150㎜ (Western Analytical, Temecula, CA)에서 0-100% 아세토니트릴(0.1% TFA) 선경사를 이용하여 분당 2㎖ 속도로 역상 크로마코그래피하고, 용출물은 214㎚에서 모니터한다.

생물학적 활성을 가지는 분취물은 한 개 주요 피크와 다른 작은 성분으로 분리된다. 이 피크를 PVDF 막에 웨스턴 블랏 시키면, 14Kd, 20Kd, 26Kd 세 가지 분자량 밴드가 나타난다. 이와 같은 폴리펩티드는 다음의 각 N-말단 서열을 가지는 것으로 결정되었다;

이때, Xaa는 임의 아미노산을 말한다. 상기에서 설명하는 검사를 이용하여, 이들 폴리펩티드는 PBMC 준비물에서 IFN-γ생산 및 증식을 유도하는 것으로 나타났다. 도 1A와 1B에서는 각 제 1 제공자 및 제 2 제공자에서 준비한 PBMC를 이용한 각 검사 결과를 나타낸다.

상기 (a), (c), (d), (g)의 항원을 인코드하는 DNA 서열은 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 코돈을 포함하고, N-말단 서열에 상응하는³²P-라벨된 축중 올리고뉴클레오티드를 이용하여 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 게놈 라이브러리에서 얻는다. 상기(a)항원에 상응하는 프로브를 이용하여 실행한 검사에서 서열 96에 제공된 서열을 가지는 클론을 학인하였다. 서열 96에 의해 인코드되는 폴리펩티드는 서열 97에 제공한다. 상기(g)항원에 상응하는 프로브를 이용하여 실행한 검사에서 서열 52에 제공된 서열을 가지는 클론을 학인하였다. 서열 52에 의해 인코드되는 폴리펩티드는 서열 53에 제공한다. 상기(d)항원에 상응하는 프로브를 이용하여 실행한 검사에서 서열 24에 제공된 서열을 가지는 클론을 학인하였고, 상기(c)항원에 상응하는 프로브를 이용하여 실행한 검사에서 서열 25에 제공된 서열을 가지는 클론을 학인하였다.

상기 아미노산 서열은 DNA STAR 시스템을 이용하여 유전자 은행에 있는 공지의 아미노산 서열과 비교하였다. 조사된 데이터베이스에는 일부 173,000단백질을 포함하고, 이는 해독된 단백질 서열(Version 87)과 함께 Swiss, PIR databases에 복합되었다. 항원 (a)-(h),(I)에 대한 아미노산 서열에 유의성이 있을 정도의 상동성은 감지되지 않았다.

항원(i)에 대한 아미노산 서열은 미코박테리움 레프라(Mycobacterium leprae)의 서열과 상동성이 있는 것으로 밝혀졌다. GENBANK에서 수득한 서열을 이용하여, 전체 길이의 미코박테리움 레프라(Mycobacterium leprae) 서열을 증폭시켰다. 이 서열을 이용하여, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 라이브러리를 스크린하고, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 상동체의 전체 길이 복사체를 수득하였다(서열 94).

DNA 서열에서 해독된 공지의 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 항원(j)의 아미노산 서열이 상동성이 있는 것으로 밝혀졌다. 발명자의 지식범위에서는, 이 단백질은 T-세포 자극 활성을 가지지 않는 것으로 나타났다. 항원(k)에 대한 아미노산 서열은 미코박테리움 레프라(Mycobacterium leprae)에서 얻은 서열과 관련이 있는 것을 밝혔다.

상기에서 설명하는 증식 및 IFN-γ검사에서, 세 가지 PPD 양성 제공자를 이용하면, 상기에서 제공하는 결과는 표 1에 나타내었다.

표 1에서, 농도가 1㎍에서, 자극 지수(SI) 2 내지 4(배지 단독으로 배양된 세포와 비교)를 제공하는 반응은 +로 기록하고, SI가 4-8 또는 2-4는 ++로 기록하고, SI가 8이상인 경우는 +++로 기록하였다. 두 가지 증식 및 IFN-γ검사에서, 서열(i)의 항원은 한 제공자의 경우에는 최대 SI(+++)를 가지고, 두가지 다른 제공자의 경우에는 더 낮은 SI(++ 또는 +)를 가지는 것으로 밝혀졌다. 이와 같은 결과에서 이들 항원은 증식 또는 인터페론-γ생산을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2

환자의 혈청을 이용한 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원을 분리

이 실시예에서는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 감염된 개체에서 혈청을 스크린하여 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 용해물에서 항원을 분리하는 것을 설명한다.

건조된 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Ra (Difco Laboratories)는 2% NP40 용액에 첨가하고, 또는 균질화시켜, 3회 초음파 파쇄한다. 생성된 현탁액은 미아크로퓨즈 튜브에서 13,000rpm으로 원심분리하고, 상청액은 0.2미크론 주사기 필터를 통과시킨다. 여과물은 Macro Prep DEAE 비드(BioRad, Hercules, CA)에 결합시킨다. 비드는 20mM Tris pH 7.5로 강력하게 세척하고, 결합된 단백질은 1M NaCl으로 용출시킨다. NaCl 용출물은 10mM 트리스 pH7.5에 대해 하룻밤동안 투석시킨다. 투석된 용액은 DNase와 RNase로 0.05㎎/㎖에서 실온 30분간 처리한 다음, α-D-만노시다제, 0.5U/㎎ pH4.5와 3-4시간동안 실온에서 처리한다. pH를 7.5로 하고, 물질은 FPLC를 통하여 Bio Scale-Q-20 column (BioRad)상에서 분취한다. 분취물은 9개 푸울로 복합시키고, Centriprep 10 (Amicon, Beverley, MA)으로 농축시키고, 본 발명의 다른 항원에는 면역반응성이 없는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)-감염된 환자의 혈청을 이용하여, 혈액학적 활성에 대해 웨스턴 블랏으로 스크린한다.

가장 활성이 큰 분취물은 SDS-PAGE를 하고, PVDF에 옮긴다. 약 85Kd에서 생긴 밴드는 다음의 서열을 가지는 것으로 나타났다;

이때, Xaa는 임의 아미노산이 될 수 있다.

이 서열을 상기에서 설명하는 유전자 뱅크의 것과 비교하였을 경우에 공지 서열과 유의성 있는 상동성이 나타나지 않았다.

상기(m)항원을 인코드하는 DNA 서열은 서열 137의 N-말단 서열에 상응하는 라벨된 축중 올리고뉴클레오티드를 이용하여 게놈 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) Erdman 균주 라이브러리를 스크린하여 수득하였다. 클론은 서열 198의 DNA 서열을 가지는 것으로 확인되었다. 유전자은행의 폴리펩티드 서열과 이 서열을 비교하면, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)에서 이미 확인된 거열과 어느정도 유사성이 있는 것으로 나타났다.

실시예 3

미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원을 인코드하는 DNA 서열 준비

이 실시예는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 감염된 환자에서 수득한 혈청과 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 발현 라이브러리를 스크린하거나 또는 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원에 대한 항-혈청과 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 발현 라이브러리를 스크린하여, 미코박테리움 튜베로클로시스(Mycobacterium tuberculosis) 항원을 인코드하는 DNA 서열을 준비하는 것을 설명한다.

A. 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 상청액에 대해 발생된 토끼 항-혈청을 이용하여 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 가용성 항원을 준비

미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 균주 H37Ra에서 게놈 DNA를 분리하였다. DNA는 무작위로 절단하여, 이를 이용하여 람다 ZAP 발현 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)에서 발현 라이브러리를 구축한다. 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 균주의 농축 상청액을 토끼에 면역시켜 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 균주 H37Ra, H38Rv, Erdman의 배출 단백질에 대해 토끼 항-혈청이 발생된다. 특히, 토끼는 100㎍ 뮤라밀 디펩티드(Calbiochem, La Jolla, CA)와 1㎖ 불완전 Freund's 어쥬번트를 포함하는 총 용적 2㎖에 200㎍ 단백질 항원과 동시에 면역화시킨다. 4주후에, 토끼는 불완전한 Freund's 어쥬번트에 100㎍ 항원으로 동시에 부스터한다. 마지막으로 토끼는 50㎍ 단백질 항원으로 4주뒤에 정맥으로 면역주사한다. 항-혈청을 이용하여 발현 라이브리러를 스크린한다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 플락에서 파지미드를 분리해내고, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 클론의 뉴클레오티드 서열을 이끌어낸다.

32개 클론을 정제하였다. 이들중, 25개는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)에서 기존에 확인 안된 서열인 것으로 나타났다. IPTG에 의해 단백질을 유도하고, 겔 용출로 정제한다(Skeiky et al., J. Exp. Med. 181:1527-1537, 1995). 이 스크린에서 확인된 DNA 분자의 부분적인 서열은 서열 1-25에 제공한다. 이에 상응하는 예상 아미노산 서열은 서열 64-88에 나타낸다.

상기에서 설명하는 데이터베이스를 이용하여, 유전자은행에 공지된 서열과 이들 서열을 비교하면, 이하에서 설명하는 TbRA2A, TbRA16, TbRA18, TbRA29(서열 77, 69, 71, 76)은 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)에서는 확인 안된 그러나 미코박테리움 레프라(M. leprae)에서 확인된 서열에는 일부 상동성이 있는 것으로 나타났다. TbRA11, TbRA26, TbRA28, TbDPEP(서열 66, 74, 75, 53)은 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)에서 이미 확인된 것이다. TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, TbRA19, TbRA29, TbRA32, TbRA36 그리고 겹쳐지는 클론 TbRA35 및 TbRA12(서열 64, 78, 82, 83, 65, 68, 76, 72, 76, 79, 81, 80, 67)에 대해서는 유의성있는 상동성이 발견되지 않았다. 클론 TbRa24는 클론 TbRa29와 겹쳐진다.

B. 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원을 인코드하는 DNA 서열을 확인하기 위해 폐 또는 늑막 결핵을 가지는 환자의 혈청 이용

활성 결핵 환자에서 수득한 혈청을 이용하여, 상기에서 설명하는 게놈 DNA 라이브러리, 추가 H37Rv 라이브러리를 스크린하였다. H37Rv 라이브러리를 준비하기 위해, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) H37Rv 게놈 DNA를 분리하고, 이는 부분적인 Sau3A 절단을 시키고, 람다 Zap 발현계(Stratagene, La Jolla, Ca)를 이용하여 발현 라이브러리를 만드는데 이용한다. 세 가지 상이한 혈청을 발현 스크린에 이용되는데, 각 혈청은 활성 폐 결핵 또는 늑막 질환이 있는 세 명의 개체에서 수득된 혈청을 가진다. 푸울은 TbL, TbM, TbH로 지정하고, 이는 ELISA와 이뮤노블랏 포맷에서 H37Ra 용해물질에 대한 상대적인 반응성(TbL=반응성이 낮음 TbM=중간정도의 반응성 TbH=반응성이 높음)을 나타낸다. 활성 폐 결핵이 있는 7명 환자의 네 번째 혈청을 이용한다. 모든 혈청은 재조합 38kD 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) H37Ra 인산-결합 단백질과의 반응성이 증가된 정도가 결여되었다.

모든 푸울은 대장균(E. coli)으로 미리 흡수를 시키고, 이를 이용하여, H37Ra 와 H37Rv 발현 라이브러리를 스크린한다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 면역반응성 항원을 발현시키는 박테리오파아지 플락을 정제하였다. 플락에서 파아지미드를 빼내고, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 클론의 뉴클레오티드 서열을 유추한다.

32개 클론을 정제하였다. 이중, 31개는 사람 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)에서 기존에 확인 안된 서열이었다. 확인된 DNA 분자의 대표적인 서열은 서열 26-51, 100에 나타내었다. 이들 중, TbH-8-2(서열 100)은 TbH-8와 TbH-4(서열 43)의 부분 클론이고, TbG-4-FWD(서열 44)는 동일한 클론에서 비-연속 서열이다. Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9, TbH-12로 확인된 항원의 아미노산 서열은 서열 89-93에 나타내었다. 상기에서 설명하는 데이터베이스를 이용하여 이들 서열과 유전자 은행에 공지된 서열을 비교하면, TbH-9에 대해서는 약한 상동성이 나타나지만, TbH-4, TbH-8, TbH-9, TbM-3에대해서는 유의성있는 상동성은 없었다. TbH-12는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)[Acc. No.S28515]에서 기존에 확인된 34kD 항원성 단백질에 상동성이 있는 나타났다. Tb38-1은 미코박테리움 보비그(M. bovis)(Acc. No. U34848)와 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)에서 이미 확인된 항원 ESAT-6의 오픈 리딩 프레임의 상류 34bp에 위치하는 것으로 밝혀졌다(Sorensen et al., Infec. Immun. 63:1710-1717, 1995).

H37Ra 라이브러리에서 분리한 Tb38-1와 TbH-9에서 유도한 프로브를 이용하여 H37Rv 라이브러리에서 클론을 확인하였다. Tb38-1은 Tb38-1F2, Tb38-1F3, Tb38-1F5, Tb38-1F6(서열 107, 108, 111, 113, 114)(서열 107, 108은 클론Tb38-1F2의 비-접촉서열)에 하이브리드된다. 두 개 오픈 리딩 프레임은 Tb38-1F2에서 유도된다; 하나는 Tb37FL(서열 109)에 상응하고, 두 번째 부분 서열은 Tb38-1에 상동성이 있고, 이는 Tb38-1N(서열 110)으로 불린다. 유추된 아미노산 서열 Tb38-1F3은 서열 112에 나타내었다. TbH-9 프로브는 H37Rv 라이브러리에 세 개 클론을 확인하였는데; TbH-9-FL(서열 101), 이는 TbH-9 (R37Ra), TbH-9-1(서열 103)에 상동성이 있고, TbH-8-2(서열 105)은 TbH-8의 부분적인 클론이다. 이들 세 개 클론의 유추 아미노산 서열은 각 서열 102, 104, 106에 제공한다.

상기에서 설명하는 것과 같이 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 게놈 DNA 라이브러리를 추가 스크린하면, 7가지 상이한 유전자를 나타내는 10개 추가 반응성 클론을 회수한다. 이들 유전자중 하나는 상기에서 설명하는 38Kd 항원으로 확인되었는데, 이는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)에서 이미 확인된 14Kd 알파 결정 열 쇼크 단백질과 동일한 것으로 결정되었고, 세 번째 것은 상기에서 설명하는 항원 TbH-8에 동일한 것으로 결정났다. 남아있는 다섯 개 클론(이하 TbH-29, TbH-30, TbH-32, TbH-33로 명명함)에 대한 결정된 DNA 서열은 서열 133-136에 제공하고, 이에 상응하는 예측 아미노산 서열은 서열 137-140에 제공한다. 이들 항원에 대한 DNA와 아미노산 서열은 상기에서 설명하는 것과 같이 유전자은행의 것과 비교하였다. TbH-29의 5'단부에 대해서는 상동성이 없고(이는 반응성이 있는 오픈 리딩 프레임을 포함), TbH-29의 3'단부는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 코스미드 Y227에 동일한 것으로 나타났다. TbH-32와 TbH-33는 이미 확인된 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 삽입 원소 IS6110와 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 코스미드 Y50과 각각 동일한 것으로 밝혀졌다. TbH-30에 상동성이 있는 것은 발견되지 않았다.

Samnrrok에서 설명하는 것과 같이 이들 추가 스크린에서 양성 파지미드를 이용하여 대장균(E. coli) XL-1 Blue MRF'를 감염시킬 수 있다. IPTG를 첨가하면 재조합 단백질을 유도할 수 있다. 유도된 용해물과 유도안된 용해물은 SDS-PAGE에 이중으로 실시하고, 니트로셀룰로오즈 필터에 옮긴다. 여과물은 TbH와 반응성이 있는 사람 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 혈청(1:200 희석)과 반응시키고, lacZ의 N-말단 4Kd 부분과 반응성이 있는 토끼 혈청(1:200 또는 1:250 희석)과 반응을 시킨다. 실온에서 2시간동안 혈청을 배양한다. 결합된 항체는¹²⁵I-Protein A를 첨가하고, 연속하여 16시간 내지 11일 동안의 다양한 시간동안 필름에 노출시켜 감지하고, 이뮤노블랏의 결과는 표 2에 나타내었다.

사람 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 혈청 및 항-lacZ 혈청과 재조합 사람 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원의 양성 반응은 사람 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 혈청의 반응성이 융합 단백질에 관한다는 것을 나타낸다. 항-lacZ 혈청과는 반응성이 있으나, 사람 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 혈청과는 반응성이 없는 항원은 사람 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 혈청이 에피토프 모양을 인지한다는 결과거나 항원-항체 결합 역학은 이뮤노블랏에 2시간 혈청을 노출시키는 것이 불충분하다는 것이다.

항원 TbH-9 및 Tb38-1이 세포 단백질을 나타내는지 또는 이들이 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 배양 배지로 배출되는 지를 결정하는 연구를 실행하였다. 제 1 연구에서, 실시예 3A에서 설명하는 것과 같은 실제 프로토콜을 이용하여, a)미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)의 방출 단백질; b) 공지의 분비 재조합 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원 85b; C) 재조합 Tb38-1; D) 재조합 TbH-9에 대해 토끼 혈청을 만든다. 총 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 용해물질, 농축된 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 배양물 상청액, 재조합 항원 85b, TbH-9, Tb38-1을 변성 겔에 용해시키고, 니트로셀룰로오즈 막에 고정시키고, 이중 블랏은 상기에서 설명하는 토끼 혈청을 이용하여 프로브한다.

분비 단백질, 재조합 85b, 재조합 Tb38-1, 재조합 TbH-9에 대한 기준 혈청(판넬 I)와 항혈청(판넬 II)을 이용하여 분석 결과는 도 2A-D에 나타내었다. 이때, 라인은 다음과 같이 지정하였다. 1)분자량 표준 단백질; 2) 5㎍ 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 용해물질; 3) 5㎍ 분비 단백질; 4) 50ng 재조합 Tb38-1; 4) 50ng 재조합 Tb38-1; 5) 50ng 재조합 TbH-9; 6) 50ng 재조합 85b. 재조합 항원은 6개 말단 히스티딘 잔기를 가지도록 조작하고, 따라서, 고유 단백질보다 약 1kD 더 큰 이동성을 가지고 이동할 것으로 기대된다. 도 2D에서, 재조합 TbH-9는 전체 길이 42kD 항원중 약 10kD이 부족하여, 용해물질 라인(화살표로 표시)에서 면역활성 고유 TbH-9 항원의 크기와 상당히 다르게 된다. 이 결과에서 Tb38-1와 TbH-9는 세포내 항원이고, 실제 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)에서 활성적으로 방출되지 않는다는 것을 설명한다.

재조합 TbH-9, 분비 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 단백질, PPD에 TbH-9-특이적인 사람 T 세포 클론의 반응성을 결정하여, TbH-9가 세포내 항원이라는 발견을 확인하였다. TbH-9-특이적인 T 세포 클론(131TbH-9로 지정)은 건강안 PPD-양성 제공자의 PBMC에서 만든다. 실시예 1에서 설명하는 것과 3중수소결합된 티미딘의 수용을 결정하여, 분비 단백질, 재조합 TbH-9, 기준 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원, TbTa11에 대한 131TbH-9의 증식 반응을 결정하였다. 도 3A에서 볼 수 있는 것과 같이, 클론 131TbH-9은 TbH-9에 특이적인 것으로 나타났는데, 이는 TbH-9가 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 분비 단백질에 중요한 성분은 아니라는 것을 설명한다. 도 3B에서는 T 세포 클론을 분비 단백질, PPD 또는 재조합 TbH-9로 자극한 후에, 건강한 PPD-양성 제공자의 PBMC에서 준비한 제2TbH-9-특이적인 T 세포 클론(PPD 800-10)에 의해 IFN-γ의 생산을 나타낸다. 이 결과에서 TbH-9는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)에 의해 분비되는 것이 아니라는 것을 다시 확인하였다.

C. 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원을 인코드하는 DNA 서열을 확인하기 위해 폐외 결핵을 가지는 환자에서 취한 혈청을 이용

게놈 DNA는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) Erdman 균주에서 분리하고, 무작위로 전단시키고, 이를 이용하여, 람다 ZAP 발현계(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용한 발현 라이브러리를 작제한다. 생성된 라이브러리는 실시예 3B에서 설명하는 것과 같이 폐외 결핵을 가지는 개체에서 수득한 혈청을 이용하여 알칼리 포스포타제공액된 염소 항-사람 IgG + A + M (H+L)인 제 2 항체로 스크린한다.

18개 클론을 정제하였다. 이들중, 4개 클론(이하 XP14, XP24, XP31, XP32로 칭함)는 공지 서열에 어느 정도 유사성을 가지는 것으로 밝혀졌다. XP14, XP24, XP31에 대한 결정된 DNA 서열은 서열 151-153에 각각 나타내었고, XP32의 5'와 3'DNA 서열은 각각 서열 154와 155에 나타내었다. XP14의 예측 아미노산 서열은 서열 156에 제공된다. XP14의 역 상보체는 서열 157에서 제공되는 것과 같은 아미노산을 인코드하는 것으로 밝혀졌다.

남아있는 14개 클론(이하 XP1-XP6, XP17-XP19, XP22, XP25, XP27, XP30, XP36라 칭함)에 대한 서열과 상기에서 설명하는 유전자은행의 서열과 비교해보면, 공지의 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 코스미드에 어느 정도 상동성을 가지는 XP2와 XP6의 3'말단을 제외하고는 상동성이 전혀없었다. XP27와 XP36의 DNA 서열은 각각 서열 158, 159에 나타내고, XP4, XP5, XP17, XP30의 5'서열은 각각 서열 160-163에 나타내고, XP2, XP3, XP6, XP18, XP19, XP22, XP25의 5'와 3'서열은 각각 164, 165; 166, 167; 168, 169; 170, 171; 172, 173; 174, 175; 176, 177에 나타낸다. XP1은 여기에서 상술하는 TbH4의 DNA 서열과 겹치는 것을 알 수 있다. TbH4-XP1의 전체 길이 DNA 서열은 서열 178에 제공된다. 이와 같은 DNA 서열은 서열 179에 나타낸 아미노산 서열을 인코드하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것으로 밝혀졌다. TbH4-XP1의 역 상보체는 서열 180에 나타낸 아미노산 서열을 인코드하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것으로 밝혀졌다. XP36의 DNA 서열은 서열 181과 182에 나타낸 아미노산 서열을 인코드하는 두 개 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것으로 밝혀졌고, 서열 183에 나타낸 아미노산 서열을 인코드하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 역 상보체가 발견되었다.

재조합 XP1 단백질은 실시예 3B에서 설명한 것에 따라 준비하고, 정제를 위해서는 금속 이온 친화성 크로마토그레피 컬럼을 이용한다. 재조합 XP1은 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)-면역 제공자에서 분리한 T 세포에서 세포 증식 및 IFN-γ생산을 자극한다는 것을 밝혔다.

D. 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 분취 단백질에 대해 생성된 토끼 항-혈청을 이용하여 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 가용성 항원의 준비

실시예 2에서 설명하는 것과 같이 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 용해물질을 준비한다. 생성된 물질은 HPLC에 의해 분취시키고, 분취물은 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염된 환자에서 취한 혈청 푸울과 혈액학적으로 활성이 있는 지에 대한 웨스턴 블랏으로 스크린하면, 본 발명의 다른 항원과는 거의 또는 전혀 면역반응성이 없는 것으로 나타났다. 실시예 3A에서 설명하는 방법을 이용하여, 가장 반응성이 큰 분취물에 대해 토끼 항-혈청을 만든다. 항-혈청을 이용하여, 상기에서 설명한 것과 같은 준비된 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) Erdman 균주 게놈 DNA 발현 라이브러리를 스크린한다. 면역반응성 항원을 발현시키는 박테리오파아지 플락을 정제하였다. 플락으로부터 파아지미드를 분리해내고, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)의 뉴클레오티드 서열을 결정한다.

10개 상이한 클론을 정제하였다. 이들중, 한 개는 상기에서 설명하는 TbRa35인 것으로 밝혀졌고, 한 개는 이미 확인된 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원 HSP60인 것으로 밝혀졌다. 나머지 8개 클론중에서, 6개(이하 RDIF2, RDIF5, RDIF8, RDIF10, RDIF11, RDIF12로 칭함)는 이미 확인된 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 서열과 어느 정도의 유사성을 가지는 것으로 밝혀졌다. RDIF2, RDIF5, RDIF8, RDIF10, RDIF11의 결정된 DNA 서열은 각 서열 184-188에 나타내고, 이에 상응하는 예측 아미노산 서열은 서열 189-193에 나타낸다. RDIF12의 5'와 3'DNA 서열은 각 서열 194와 195에 나타낸다. 항원 RDIF-7에 대해서는 상동성이 없었다. RIDF7의 결정된 DNA 및 아미노산 서열은 각 서열 196 및 197에 나타내었다. 추가로 한 개의 RDIF6라고 칭하는 클론은 분리하였으나 RDIF5와 동일한 것으로 밝혀졌다.

재조합 RDIF6, RDIF8, RDIF10, RDIF11은 상기에서 설명하는 것과 같이 준비한다. 이들 항원은 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)-면역 제공자에서 분리된 T 세포에서 세포 증식 및 IFN-γ생산을 자극하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4

튜베로클린 정제된 단백질 유도체로부터 폴리펩티드의 정제 및 특징조사

다음과 같이 튜베로클린 정제된 단백질 유도체로부터 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 폴리펩티드를 분리하였다.

PPD는 공지된 내용을 약간 변형시켜 준비한다(Seibert, F. et al., Tuberculin purified protein derivative. Preparation and analyses of a large quantity for standard. The American Review of Tuberculosis 44:9-25, 1941). 37℃에서 회전하는 병에 합성 배지상에서 6주간 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) Rv 균주를 생장시켰다. 그 다음 세균 생장물을 포함하는 병은 3시간동안 수증기를 이용하여 100℃로 가열시킨다. 배양물은 0.22μ필터를 이용하여 멸균 여과시키고, 액상은 3kD 차단 막을 이용하여 20배로 농축시킨다. 단백질은 50% 암모니움 설페이트 용액으로 일단 침전시키고, 25% 암모니움 설페이트 용액으로 8회 침전시킨다. 생성된 단백질(PPD)은 Biocad HPLC system (Perseptive Biosystems, Framingham, MA)에서 C18 컬럼(7.8 ×300mM; Waters, Milford, MA)을 이용하여 역상 액체 크로마코그래피(RP-HPLC)하여 분취한다. 분취물은 0-100% 완충액(0.1% TFA/아세토니트릴) 선형 경사를 이용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 유속은 분당 10㎖이고, 용출물은 214㎚와 280㎚에서 모니터한다.

6개 분취물을 모으고, PBS에 현탁시키고, 개별적으로 지연된 과민성(DTH)반응의 유도에 대해 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염된 기니아 피그에서 테스트하였다. 한 개 분취물은 강력한 DTH 반응을 유도하였고, 이는 Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Model 172 HPLC에서 마이크로보어 Vydac C18 컬럼(Cat. No. 218TP5115)에서 RP-HPLC에 의해 분취시킨다. 분취물은 5-100% 완충액(0.05% TFA/아세토니트릴) 선형 농도차를 이용하여 용출시키는데, 이때 유속은 분당 80㎕이다. 용출물은 215㎚에서 모니터한다. 8개 분취물을 수득하고, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염된 기니아 피그에서 DTH 유도에 대해 테스트한다. 한 분취물은 약 16분간 강하게 DTH를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 다른 분취물은 감지할 정도의 DTH 반응을 유도하지 않았다. 양성 분취물은 SDS-PAGE 전기영동을 시켜, 약 12kD 분자량의 단일 단백질 밴드를 포함한다는 것을 밝혀냈다.

상기에서 설명하는 Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492 단백질 서열화기를 이용하여 DPPD라고 불리는 이 폴리펩티드의 아미노 말단을 서열화하여, 서열 124에 나타낸 것과 같은 N-말단 서열을 가진다는 것을 밝혀냈다. 유전자 은행에 있는 서열과 이 서열을 비교한 결과 공지의 상동성이 나타나지 않았다. DPPD의 네 가지 시아노겐 브로마이드 단편을 분리하였고, 이는 서열 125-128에 나타낸 것과 같은 서열을 가지는 것을 밝혀냈다.

실시예 5

합성 폴리펩티드의 합성

FMOC 화학물질과 HPTU(O-벤조트라이졸-N,N,N',N'-테트라메틸우라니움 헥사플로로포스페이트)를 이용하여 Milipore 9050 펩티드 합성기에서 폴리펩티드를 합성하였다. Gly-Cys-Gly 서열을 펩티드의 아미노 말단에 부착시켜, 펩티드의 라벨링 또는 공액 방법을 제공한다. 고형 서포트에서 펩티드를 절단해내는 것은 다음의 절단 혼합물(트리플로로아세트산:에탄올디티올:티오아니졸:물:페놀(40:1:2:2:3))을 이용한다. 2시간동안 절단한 후에, 펩티드는 차가운 메틸-t-부틸-에테르에서 침전시킨다. 펩티드 펠렛은 0.1% 트리플로로아세트산(TFA)을 포함하는 물에 용해시키고, 냉동건조시키고, C18 역상 HPLC에 의해 정제한다. 0-60% 아세토니트릴(0.1% TFA)/물(0.1% TFA)을 이용하여 펩티드를 용출시킨다. 정제된 분취물을 냉동 건조한 후에, 펩티드는 일렉트로스프레이 질량 스펙트로메터(eletrospray mass spectrometry) 및 아미노산 분석을 이용하여 특징을 조사한다.

이 과정을 이용하여, TbM-1 서열의 1½반복체를 포함하는 TbM-1 펩티드를 합성할 수 있다. TbM-1 펩티드는 GCGDRSGGNLDQIRLRRDRSGGNL(서열 63)을 가진다.

실시예 6

결핵의 혈액진단을 위해 준비된 항원을 이용

이 실시예에서는 몇 가지 대표적인 항원의 진단 성질을 설명한다.

탄산염 피복 완충액 pH9.6 50㎕에 희석한 200ng 항원이 피복된 96웰 플레이트에서 검사를 실행한다. 웰은 4℃에서 하룻밤(또는 37℃에서 2시간)동안 피복시킨다. 플레이트 내용물을 제거하고, 웰은 2시간동안 200㎕ PBS/1% BSA로 차단시킨다. 차단 단계 후에, 웰은 PBS/0.1% Tween 20^TM로 5회 세척학고, 50㎕ 혈청(PBS/0.1% Tween 20^TM/0.1% BSA 으로 1:100으로 희석한 혈청을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30분간 배양시킨다. 플레이트는 그 다음 PBS/0.1% Tween 20^TM으로 5회 세척한다.

효소 공액물(양고추냉이 과산화효소-Protein A, Zymed, San Francisco, CA)은 PBS/0.1% Tween 20^TM/0.1% BSA으로 1:10,000으로 희석시키고, 희석된 공액물 50㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30분간 배양시킨다. 배양 후에, 웰은 PBS/0.1% Tweem20^TM으로 5회 세척하고, 100㎕ 테트라메틸벤지딘 퍼옥시다제(TMB) 기질(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 첨가하고, 희석을 하지 않고, 약 15분간 배양한다. 100㎕ 1N H₂SO₄을 각 웰에 첨가하여 반응을 종료시키고, 플레이트는 450㎚에서 판독한다.

도 4에서는 실시예 3의 방법 A를 이용하여 분리한 두 개 재조합 항원(TbRa3, TbRa9)과 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 양성 및 음성 환자의 혈청의 ELISA 반응성을 나타낸다. 이들 항원의 반응성은 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 균주 H37Ra(Difco, Detroit, MI)에서 분리한 세균성 용해물질의 반응성과 비교한다. 두 가지 경우에서 재조합 항원은 음성 혈청과 양성혈청을 구별하였다. 수용자-작업자 곡선에서 수득한 차단값에 기초하여, TbRa3는 87개 양성 혈청중 56개를 감지하였고, TbRa9는 165개 양성 혈청중 111개를 감지하였다.

도 5에서는 실시예 3의 B 방법을 이용하여 분리한 대표적인 항원의 ELISA 반응성을 설명한다. 재조합 항원 TbH4, TbH12, Tb38-1과 펩티드 TbM-1(실시예 4에서 설명함)의 반응성을 Andersen and Hansen, Infect. Immun. 57:2481-2488, 1989에서 설명하는 38Kd 항원의 반응성과 비교하였다. 다시, 모든 폴리펩티드는 음성 혈청과 양성 혈청을 구별하였다. 수용자-작업자 곡선에서 수득한 차단값에 기초하여, TbH4는 126개 양성 혈청중 67개를 감지하였고, TbH12는 125개 양성 혈청중 50개를 감지하였고, 38-1은 101개 양성 혈청중 61개를 감지하였고, TbM-1 펩티드는 30개 양성 혈청중 25개를 감지하였다.

가래에서 산 신속한 착색[acid fast stain](Smithwick and David, Tubercle 52:226, 1971)에서 다른 활성을 가지는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)-감염된 환자집단에서 취한 혈청에 대한 네 가지 항원(TbRa3, TbRa9, TbH4, TbH12)의 반응성을 검사하였고, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 용해물질과 38kD 항원의 반응성과 비교하였다. 결과는 아래 표 3(제목; 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자의 혈청과 항원의 반응성)에 나타내었다.

수용자-작업자 곡선에서 얻은 차단값을 기초하여, TbRa3는 27개 양성 혈청중에서 23개를 감지하고, TbRa9는 27개 양성 혈청중에서 22개를 감지하고, TbH4는 27개중에서 18개를 감지하고, TbH12는 27개중에서 15개를 감지하였다. 복합하여 이용하면, 이들 네 가지 항원은 27개중에 이론상으로 27개를 감지한다는 것으로 이는 이들 항원이 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 혈액상으로 감지하는데 있어서 서로 상보적이라는 것을 말한다. 또한, 재조합 혈청의 일부가 38kD 항원을 이용하여 감지되지 않는 양성 혈청을 감지한다는 것은 이들 항원이 38kD 항원에 상보적이라는 것을 말하는 것이다.

38kD에 음성인 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자의 혈청과 재조합 항원 TbRa11의 반응성 및 PPD 양성 및 정상 제공자의 혈청과 재조합 항원 TbRa11의 반응성은 상기에서 설명하는 ELISA을 이용하여 결정한다. 결과는 도 6에 나타내었는데, 이는 PPD 양성 및 정상 제공자의 혈청과는 음성이나, TbRa11은 38kD 항원에 대해 음성인 혈청을 감지한다는 것을 나타낸다. 테스트한 13개 38kD 음성 혈청중에서, 9개가 TbRa11에 양성인 것으로 나타났는데, 이는 이 항원이 38kD항원 음성 혈청의 하위 집단과 반응한다는 것을 나타낸다. 대조적으로 TbRa11과 반응하는 38kD 양성 혈청집단에서, TbRa11의 평균 OD 450 값은 38kD 항원의 값보다 더 낮다. 이 데이터에서 TbRa11 활성의 존재와 38kD양성간에 역관계가 있다는 것을 알 수 있다.

TbRa2A 항원을 간접 ELISA에서 테스트하였는데, 실온에서 30분간 1:100으로 희석된 혈청 50㎕을 이용하고, PBS Tween으로 세척하고, 바이오티닐화된 단백질 A(Zymed, San Francisco, CA)와 30분간 배양한다. 세척후에, 50㎕ 스트렙타아비딘-양고추냉이 과산화효소(Zymed) 1:10,000 희석물을 첨가하고, 혼합물은 30분간 배양시킨다. 세척 후에, 검사는 상기에서 설명한 것과 같이 TMB 기질로 실행한다. TbRa2A과 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자 및 정상 제공자의 혈청간에 반응성은 표 4에 나타내었다. TbRa2A와 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자의 혈청간의 반응 평균 값은 0.444이고 표준 편차는 0.309이다. 정상 제공자와의 평균 반응성은 0.109이고, 표준 편차는 0.029이다. 38kD 음성 혈청의 테스트(도 7)에서 TbRa2A 항원은 이 범주에서 혈청을 감지할 수 있다는 거을 나타낸다.

상기에서 설명하는 것과 같이, ELISA를 이용하여 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자와 정상 제공자의 혈청과 재조합 항원(g)(서열 60)의 반응성을 결정하였다. 도 8에서는 38kDa 항원과 네 개 제공자 혈청에 모두 반응성이 있는 네 개 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 양성 혈청과 항원(g)의 적정 결과를 나타내었다. 네 개 양성 혈청 모두 항원(g)과 반응성이 있었다.

재조합 항원 TbH-29(서열 137)과 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자, PPD 양성 제공자, 정상 제공자의 혈청간에 반응성은 상기에서 설명하는 간접 ELISA에 의해 결정한다. 그 결과는 도 9에 나타내었다. TbH-29는 60개 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 혈청 중에 30개, 8개 PPD 양성 혈청중에 2개, 27개 정상 혈청 중에 2개를 감지하였다.

도 10에서는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자, 정상 제공자의 혈청 및 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자의 혈청 푸울과 항원 TbH-33(서열 140)의 ELISA 테스트 결과(직간접)를 나타내었다. 평균 OD 450에서 정상 제공자보다 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자의 혈청에서 더 높은 값이 나왔고, 평균 OD 450은 직접 ELISA 보다는 간접 방법에서 상당히 높은 것으로 나타났다. 도 11에서는 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자와 정상 제공자의 혈청과 재조합 TbH-33항원의 반응성에 대한 적정 곡선을 나타내는데, 항원의 농도가 증가될수록 OD 450이 증가한다는 것을 알 수 있다.

미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자와 정상 제공자의 혈청과 재조합 항원 RDIF6, RDIF8, RDIF10(서열 184-187)의 반응성은 상기에서 설명하는 것과 같이 ELISA에 의해 결정하였다. RDIF6는 32개 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 혈청중 6개를 감지하였고, 15개 정상 혈청중에서는 어느 것도 감지하지 않았고; RDIF8는 32개 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 혈청중 14개를 감지하였고, 15개 정상 혈청중에서는 아무것도 감지하지 않았고; RDIF10는 27개 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 혈청중 4개를 감지하였고, 15개 정상 혈청중 1개를 감지하였다. 또한, RDIF10은 PPD-양성 제공자의 5개 혈청중 한 개도 감지하지 못하였다.

실시예 7

미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 융합 단백질의 준비 및 특징 조사

TbRa3, 38kD 항원, Tb38-1을 포함하는 융합 단백질은 다음과 같이 준비하였다.

DNA 구조 TbRa3, 38kD, Tb38-1 각각은 PCR을 이용하여 변형시켜, 융합단백질 TbRa3-38kD-Tb38-1의 융합 및 이를 발현시켰다. 프라이머로 각각 PDM-64 및 PDM-65(서열 141, 142), PDM-57 및 PDM-58(서열 143, 144), PDM-69 및 PDM-60(서열 145-146)을 이용하여, PCR에서 TbRa3, 38kD, Tb38-1 DNA를 이용하였다. 각 경우에서 DNA 증폭은 10㎕ 10X Pfu 완충액, 2㎕ 10mM dNTPs, 2㎕ 각 PCR 프라미어(10μM 농도), 81.5㎕ 물, 1.5㎕ Pfu DNA 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA), 1㎕ DNA[각 70ng/㎕(TbRa3 경우) 또는 50ng/㎕(38kD 및 Tb38-1의 경우)를 이용하여, 실행한다. TbRa3의 경우에, 94℃에서 변성은 2분간 실시하고, 96℃에서 15초, 72℃에서 1분, 마지막으로 72℃에서 4분간의 과정을 40회 반복한다. 38kD의 경우에는 96℃에서 변성은 2분간 실시하고, 96℃에서 30초, 68℃에서 15초, 72℃에서 3분, 마지막으로 72℃에서 4분간의 과정을 40회 반복한다. Tb38-1경우에, 94℃에서 변성은 2분간 실시하고, 96℃에서 15초, 68℃에서 15초, 72℃에서 1.5분 과정을 10회, 96℃에서 15초, 64℃에서 15초, 72℃에서 1.5분, 마지막으로 72℃에서 4분간의 과정을 30회 반복한다.

TbRa3 PCR 단편은 NdeI과 EcoRI으로 절단하고, pT7^L2 IL 1 벡터의 NdeI와 EcoRI 부위에 바로 클론시킨다. 38kD PCR 단편은 Sse8387I으로 절단하고, T4 DNA 폴리메라제로 처리하여, 블런트 단부로 만들고 그 다음 EcoRI으로 처리하여, 미리 StuI과 EcoRI으로 절단된 pT7^L2Ra3-1 벡터에 바로 클론시킨다. 38-1 PCR 단편은 Eco47III와 EcoRI으로 절단하고, 동일한 효소로 절단된 pT7^L2Ra3/38kD-17에 서브클론시킨다. 전체 융합물은 NdeI와 EcoRI 부위를 이용하여 pET28b에 전달한다. 융합 구조는 DNA 서열를 조사하여 확인할 수 있다.

발현 구조는 BLR pLys S E. coli(Novagen, Madison, WI)으로 형질변화시키고, 카나마이신(30㎍/㎖)과 클로람페니콜(34㎍/㎖)이 첨가된 LB배지에서 하룻밤동안 생장시킨다. 배양물(12㎖)을 이용하여 동일한 항생제를 포함하는 500㎖ 2XYT에 접종시키고, 배양물은 IPTG로 유도하여, 최종 농도가 1.2mM인 경우에, OD560 0.44인 것으로 나타났다. 유도후 네 시간 뒤에, 박테리아를 회수하고, 20mM 트리스(8.0), 100mM NaCl, 0.1% DOC, 20㎍/㎖ 류페틴(Leupeptin), 20mM PMSF에서 초음파파쇄하고, 26,000 X g에서 원심분리한다. 생성된 펠렛은 8M 요소, 20mM Tris (8.0), 100 mM NaCl에서 재현탁시키고, Pro-bond 니켈 수지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 결합시킨다. 컬럼은 상기 완충액으로 여러 차례 세척하고, 그 다음 이미다졸 농도차를 이용하여(50mM, 100mM, 500mM 이미다졸을 8M 요소, 20mM 트리스(8.0), 100mM NaCl에 첨가) 용출시킨다. 원하는 단백질을 포함하는 용출물은 10mM 트리스(8.0)에 대해 투석한다.

생성된 융합 단백질(이하 TbRa3-38 kD-Tb38-1로 칭함)의 DNA 및 아미노산 서열은 각 서열 147, 148에 제공한다.

힌지 서열 없는 두 개 항원 TbH-9, Tb38-1(이하 TbH9-Tb38-1이라 칭함)을 포함하는 융합 단백질는 상기에서 설명하는 유사한 방법으로 만들 수 있다. TbH9-Tb38-1 융합 단백질의 DNA 서열은 서열 151에 제공된다.

TbRa3, 항원 38kD, Tb38-1 및 DPEP을 포함하는 융합 단백질은 다음과 같이 준비한다.

각 TbRa3, 38 kD, Tb38-1 DNA 구조는 PCR로 변형을 시키고, 상기와 같은 필수적인 벡터에 클론시키고, 프라이머 PDM-69(서열 145) 및 PDM-83(서열 200)을 이용하여, Tb38-1A를 증폭시킨다. Tb38-1A는 최종 아미노산 고유 성징을 유지하는 코딩 부분의 3'말단에서 DraI 부위로 인해 Tb38-1와 상이한데, 이는 프레임에서 블런트 제한 부위를 만든다. TbRa3/38kD/Tb38-1A 융합 단백질은 NdeI와 EcoR1을 이용하여, pET28b에 전달한다.

DPEP DNA를 이용하여, PCR을 실시하는데, 프라이머는 PDM-84와 PDM-85(서열 201, 202)을 이용하고, 1㎕ DNA(농도 50ng/㎕)를 이용한다. 94℃에서 2분간 변성시키고, 96℃에서 15초, 68℃에서 15초, 72℃에서 1.5분간의 과정을 10회; 96℃에서 15초, 64℃에서 15초, 72℃에서 1.5분간의 과정을 30회; 마지막으로 72℃에서 4분간 과정을 거친다. DPEP PCR 단편은 EcoRI 및 Eco72I로 절단하여, DraI과 EcoRI으로 절단된 pET28Ra3/38kD/38-1A에 바로 클론시킨다. 융합 구조는 DNA 서열화하여 확인한다. 재조합 단백질은 상기와 같이 준비한다. 생성된 융합 단백질(이하 TbF-2)의 DNA 및 아미노산 서열은 각 서열 203 및 204에 나타내었다.

실시예 8

결핵 혈액 진단을 위해 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 융합 단백질을 이용

결핵 감염을 혈액으로 진단하는데 있어서, 상기에서 준비된 TbRa3-38kD-Tb38-1 융합 단백질의 효과를 ELISA로 검사하였다.

ELISA 과정은 실시예 6에 설명된 것과 같고, 융합 단백질은 200ng/웰로 피복된다. 혈청 패널은 ELISA, 웨스턴 블랏 분석등의 방법으로 나타난 결핵 환자에서 선택하여, 세 가지 항원을 각 개별적으로 그리고 복합하여 테스트하였다. 각 팬넬은 융합 단백질의 혈액 반응성으로 분리하여, 세 가지 에피토프가 융합 단백질과 기능을 하는지에 대해 결정한다. 표 5(제목; 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 환자의 혈청과 세 개 펩티드 융합 단백질의 반응성)에서 볼 수 있는 것과 같이, TbRa3하고만 반응을 하는 세 가지 혈청이 감지될 수 있고, 두개는 38kDa 하고만 반응한다. 나머지 15개 혈청은 평균 음성+3 표준편차 검사에서 차단치에 기초한 융합단백질과 모두 양성이다. 이 데이터에서 융합 단백질에서 모두 세 개 에피토프의 기능 활성을 설명하고 있다.

미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염된 환자의 혈청과 융합 단백질 TbF-2의 활성은 상기에서 설명하는 프로토콜을 이용하여 ELISA로 검사한다. 이 연구 결과에 따르면, 융합 단백질은 각각 독립적으로 네 개 항원 기능을 한다는 것을 설명한다. 아래 표6(제목;TB와 정상 혈청과 TbF-2 융합 단백질의 반응성)

당업자는 융합 단백질에서 개별 항원의 순서를 바꿀 수 있으며, 각 에피토프가 제공된다면, 필적할 정도의 활성을 기대할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또한, 활성 에티토프를 가지는 절두형도 융합 단백질을 작제하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 구체예의 설명은 본 발명을 설명하기 위함이고, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변화가 가능하다는 것을 인지할 것이다

서열표 리스트

(1)일반정보

(i)출원인;

리드, 스티븐 쥐.

스카이키, 야시르 에이.더블유

딜론, 데이븐 씨.

캄포우-네토, 안코니아.

하우톤, 토마스 에스.

베드비크, 토마스 에스.

트와드릭, 다니엘 케이.

로드슨, 마이클 제이.

(ii) 발명의 명칭; Compounds and Method for diagnosis of tuberculosis

(iii) 서열의 수; 209

(iv) 서신 주소

(A) 주소; SEED and BERRY LLP

(B) 거리; 6300 Columbia Center, 701 fifth Avenue

(C) 도시; Seattle

(D) 주; Washington

(E) 나라; USA

(F) 우편코드; 98104-7092

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A)매체형태; 플로피 디스크

(B)컴퓨터;IBM PC 호환성

(C)작동시스템; PC-DOS/MS-DOS

(D)소프트웨어; PatentIn Release#1.0, Version #1.30

(vi) 현재 출원 자료

(A) 출원번호;

(B) 출원일; 97, 10.1

(C) 분류

(viii) 대리인 정보

(A) 이름; Maki, David J.

(B) 등록번호; 38,392

(C) 문서 번호; 210121.417C7

(ix) 통신정보

(A) 전화번호; 206 622 4900

(B) 펙스번호; 206 682 6031

(2)서열 1에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 766bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 1

(2)서열 2에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 752bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 2

(2)서열 3에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 813bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 3

(2)서열 4에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 447bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 4

(2)서열 5에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 604bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 5

(2)서열 6에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 633bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 6

(2)서열 7에대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1362bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 7

(2)서열 8에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1458bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 8

(2)서열 9에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 862bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 9

(2)서열 10에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 622bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 10

(2)서열 11에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1200bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 11

(2)서열 12에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1155bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 12

(2)서열 13에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1771bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 13

(2)서열 14에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1058bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 14

(2)서열 15에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 542bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 15

(2)서열 16에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 913bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 16

(2)서열 17에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1872bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 17

(2)서열 18에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1482bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 18

(2)서열 19에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 876bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 19

(2)서열 20에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1021bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 20

(2)서열 21에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 321bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 21

(2)서열 22에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 373bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 22

(2)서열 23에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 352bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 23

(2)서열 24에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 726bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 24

(2)서열 25에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 580bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 25

(2)서열 26에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 160bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 26

(2)서열 27에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 272bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 27

(2)서열 28에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 317bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 28

(2)서열 29에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 182bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 29

(2)서열 30에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 308bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 30

(2)서열 31에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 267bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 31

(2)서열 32에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1539bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 32

(2)서열 33에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 851bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 33

(2)서열 34에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 254bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 34

(2)서열 35에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1227bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 35

(2)서열 36에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 181bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 36

(2)서열 37에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 290bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 37

(2)서열 38에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 34bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 38

(2)서열 39에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 155bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 39

(2)서열 40에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 53bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 40

(2)서열 41에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 132bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 41

(2)서열 42에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 132bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 42

(2)서열 43에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 702bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 43

(2)서열 44에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 298bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 44

(2)서열 45에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1058bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 45

(2)서열 46에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 327bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 46

(2)서열 47에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 170bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 47

(2)서열 48에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 127bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 48

(2)서열 49에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 81bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 49

(2)서열 50에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 149bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 50

(2)서열 51에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 355bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 51

(2)서열 52에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 999bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 52

(2)서열 53에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 332개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 53

(2)서열 54에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 54

(2)서열 55에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 55

(2)서열 56에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 19개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 56

(2)서열 57에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이;15개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 57

(2)서열 58에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 14개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 58

(2)서열 59에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 13개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 59

(2)서열 60에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 17개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 60

(2)서열 61에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 61

(2)서열 62에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 30개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 62

(2)서열 63에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 24개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;

(D)위상;선형

(xi)서열 63

(2)서열 64에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 187개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 64

(2)서열 65에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 148개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 65

(2)서열 66에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 230개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 66

(2)서열 67에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 132개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 67

(2)서열 68에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 100개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 68

(2)서열 69에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 163개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 69

(2)서열 70에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 344개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 70

(2)서열 71에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 485개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 71

(2)서열 72에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 267개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 72

(2)서열 73에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 97개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 73

(2)서열 74에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 364개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 74

(2)서열 75에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 309개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(ii)분자형; 단백질

(xi)서열 75

(2)서열 76에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 508개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 76

(2)서열 77에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 233개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 77

(2)서열 78에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 66개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 78

(2)서열 79에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 69개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 79

(2)서열 80에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 355개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 80

(2)서열 81에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 205개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 81

(2)서열 82에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 286개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 82

(2)서열 83에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 173개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 83

(2)서열 84에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 107개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 84

(2)서열 85에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 125개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 85

(2)서열 86에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 117개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 86

(2)서열 87에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 103개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상;선형

(xi)서열 87

(2)서열 88에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 88개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 88

(2)서열 89에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 95개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 89

(2)서열 90에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 166개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 90

(2)서열 91에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 5개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 91

(2)서열 92에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 263개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 92

(2)서열 93에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 303개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 93

(2)서열 94에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 507bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 94

(2)서열 95에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 168개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 95

(2)서열 96에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 500bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 96

(2)서열 97에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 96개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 97

(2)서열 98에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 154bp

(B)형태;핵산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 98

(2)서열 99에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 51개 아미노산

(B)형태;아미노산

(C)가닥;단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 99

(2)서열 100에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 282bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 100

(2)서열 101 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3058bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열101

(2)서열 102 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 391개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 102

(2)서열 103 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1725bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 103

(2)서열 104 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 359개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 104

(2)서열 105 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 3027bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 105

(2)서열 106 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 396개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 106

(2)서열 107 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1616bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 107

(2)서열 108 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 432bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 108

(2)서열 109 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 368개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 109

(2)서열 110 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 100개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 110

(2)서열 111 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 396bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 111

(2)서열 112 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 80개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 112

(2)서열 113 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 387bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 113

(2)서열 114 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 272bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 114

(2)서열 115 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 20개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 115

(2)서열 116 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 116

(2)서열 117 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 19개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 117

(2)서열 118 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 118

(2)서열 119 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 14개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 119

(2)서열 120 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 13개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 120

(2)서열 121 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 17개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 121

(2)서열 122 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 122

(2)서열 123 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 30개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 123

(2)서열 124 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 22개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 124

(2)서열 125 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 7개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 125

(2)서열 126 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 10개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix) 다른 특징;/="두번째 잔기는 Pro 또는 Thr"이 될 수 있음"

(xi)서열 126

(2)서열 127 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 9개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(ix) 다른 특징;/="두번째 잔기는 Glu 또는 Leu"이 될 수 있음"

(xi)서열 127

(2)서열 128 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 9개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 128

(2)서열 129 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 129

(2)서열 130 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 130

(2)서열 131 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 15개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 131

(2)서열 132 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 21개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 132

(2)서열 133 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 882bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; DNA(게놈)

(xi)서열 133

(2)서열 134 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 815bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; DNA(게놈)

(xi)서열 134

(2)서열 135 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1152bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; DNA(게놈)

(xi)서열 135

(2)서열 136 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 655bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; DNA(게놈)

(xi)서열 136

(2)서열 137 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 267개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 펩티드

(xi)서열 137

(2)서열 138 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 174개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 펩티드

(xi)서열 138

(2)서열 139 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 35개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 펩티드

(xi)서열 139

(2)서열 140 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 104개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 펩티드

(xi)서열 140

(2)서열 141 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 53bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 다른 핵산

(A)설명;/desc="PCR primer"

(vi)기원

(A)유기체; 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)

(xi)서열 141

(2)서열 142 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 42bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 다른 핵산

(A)설명;/desc="PCR primer"

(vi)기원

(A)유기체; 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)

(xi)서열 142

(2)서열 143 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 31bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 다른 핵산

(A)설명;/desc="PCR primer"

(vi)기원

(A)유기체; 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)

(xi)서열 143

(2)서열 144 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 31bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 다른 핵산

(A)설명;/desc="PCR primer"

(vi)기원

(A)유기체; 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)

(xi)서열 144

(2)서열 145 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 33bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 다른 핵산

(A)설명;/desc="PCR primer"

(vi)기원

(A)유기체; 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)

(xi)서열 145

(2)서열 146 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 33bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 다른 핵산

(A)설명;/desc="PCR primer"

(vi)기원

(A)유기체; 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)

(xi)서열 146

(2)서열 147에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1993bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; DNA(게놈)

(vi)기원

(A)유기체; 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis)

(ix)특징

(A)이름/키; CDS

(B)위치; 152..1273

(xi)서열 147

(2)서열 148 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 374개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(ii)분자형; 단백질

(xi)서열 148

(2)서열 149 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1993bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 149

(2)서열 150 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 374개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 150

(2)서열 152 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 324bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 152

(2)서열 153 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1338bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 153

(2)서열 154 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 321bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 154

(2)서열 155 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 492bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 155

(2)서열 156 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 536개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 156

(2)서열 157에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 284개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 157

(2)서열 158 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 264bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 158

(2)서열 159 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1171bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 159

(2)서열 160 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 227bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 160

(2)서열 161 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 304bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 161

(2)서열162 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1439bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 162

(2)서열 163 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 329bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 163

(2)서열 164 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 80bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 164

(2)서열 165 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 392bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 165

(2)서열 166 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 535bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 166

(2)서열 167 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 690bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 167

(2)서열 168 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 407bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 168

(2)서열 169 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 468bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 169

(2)서열 170 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 219bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 170

(2)서열 171 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 494bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 171

(2)서열 172 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 220bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 172

(2)서열 173 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 388bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 173

(2)서열 174 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 400bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 174

(2)서열 175 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 538bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 175

(2)서열 176 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 239bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 176

(2)서열 177에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 985bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 177

(2)서열 178 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 2138bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 178

(2)서열 179에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 460개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 179

(2)서열 180에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 277개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 180

(2)서열 181에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 192개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 181

(2)서열 182에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 196개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 182

(2)서열 183에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 311개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 183

(2)서열 184에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 2072bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 184

(2)서열 185에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1923bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 185

(2)서열 186에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 1055bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 186

(2)서열 187에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 359bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 187

(2)서열 188에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 350bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 188

(2)서열 189에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 679개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 189

(2)서열 190에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 120개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 190

(2)서열 191에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 89개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 191

(2)서열 192에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 119개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 192

(2)서열 193에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 116개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 193

(2)서열 194에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 811bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 194

(2)서열 195에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 966bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 195

(2)서열 196에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 2367bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 196

(2)서열 197에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 376개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 197

(2)서열 198에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 2852bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 198

(2)서열 199에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 943개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥;

(D)위상; 선형

(xi)서열 199

(2)서열 200에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 53bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 200

(2)서열 201에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 42bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 201

(2)서열 202에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 31bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 202

(2)서열 203에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 31bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 203

(2)서열 204에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 33bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 204

(2)서열 205에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 38bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 205

(2)서열 206에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 30bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 206

(2)서열 207에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 37bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 207

(2)서열 208에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 7676bp

(B)형태; 핵산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 208

(2)서열 209에 대한 정보

(i)서열특징

(A)길이; 802개 아미노산

(B)형태; 아미노산

(C)가닥; 단일가닥

(D)위상; 선형

(xi)서열 209

산업상이용가능성 누락

Claims (53)

1. 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원의 항원성 부분 또는 이 항원에서 보존성 치환 또는 변형으로 상이하게된 변이체로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 이 항원은 다음에서 선택된 N-말단 서열을 가지고, 이때 서열에서 Xaa는 임의 아미노산이 될 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
2. 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원의 면역원 부분 또는 이 항원에서 보존성 치환 또는 변형으로 상이하게된 변이체로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 이 항원은 다음에서 선택된 N-말단 서열을 가지고, 이때 서열에서 Xaa는 임의 아미노산이 될 수 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원의 항원성 부분 또는 이 항원에서 보존성 치환 또는 변형으로 상이하게된 변이체로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 이 항원은 서열 1, 2, 4-10, 13-25, 52, 94, 96에서 언급된 서열; 적절한 스트린젼트 조건하에서 서열 1, 2, 4-10, 13-25, 52, 94, 96에서 언급된 서열에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열; 이의 상보체에서 선택된 DNA 서열에 의해 인코드되는 아미노산로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 가용성 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원의 항원성 부분 또는 이 항원에서 보존성 치환 또는 변형으로 상이하게된 변이체로 구성된 폴리펩티드에 있어서, 이 항원은 서열 25-51, 133, 134, 158-178, 196에서 언급된 서열; 적절한 스트린젼트 조건하에서 서열 25-51, 133, 134, 158-178, 196에서 언급된 서열에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열; 이의 상보체에서 선택된 DNA 서열에 의해 인코드되는 아미노산로 구성된 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
6. 제 5 항에 따른 DNA 분자로 구성된 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
7. 제 6 항에 따른 발현 벡터로 형질변환된 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
8. 제 7 항에 있어서, 숙주 세포는 대장균(E. coli), 이스트 및 포유류 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
9. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

   (a) 제1-4항에 따른 하나이상의 폴리펩티드와 생물학적 시료를 접촉시키고;

   (b) 폴리펩티드중 적어도 한 개에 결합하는 항체가 생물학적 시료에 존재하는지를 감지하여 생물학적 시료에 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염이 있는 지를 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
10. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

    (a) 서열 129와 130에서 선택된 N-말단 서열을 가지는 폴리펩티드와 생물학적 시료를 접촉시키고;

    (b) 폴리펩티드중 적어도 한 개에 결합하는 항체가 생물학적 시료에 존재하는지를 감지하여 생물학적 시료에 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염이 있는 지를 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
11. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

    (a) 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198; 이들 서열의 상보체, 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198의 서열에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열에서 선택된 N-말단 서열을 가지는 폴리펩티드와 생물학적 시료를 접촉시키고; 그리고

    (b) 폴리펩티드중 적어도 한 개에 결합하는 항체가 생물학적 시료에 존재하는지를 감지하여 생물학적 시료에 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염이 있는 지를 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제9-11항중 어느 한항에 있어서, (a)단계에서 생물학적 시료와 38kD 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원을 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고; (b) 단계에서 38kD 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 항원에 결합하는 항체가 생물학적 시료에 존재하는 지를 감지하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제9-11항중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 고형 서포트에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 고형 서포트는 니트로셀롤로오즈, 라텍스 또는 플라스틱 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제9-11항중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 시료는 전체 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 오줌에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 생물학적 시료는 전체 혈액 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

    (a) 폴리메라제 사슬 반응에서 적어도 두 개 올리고뉴클레오티드 프라이머와 시료를 접촉시키고, 이때 올리고뉴클레오티드 프라이머중 적어도 한 개는 제5항에 따른 DNA 분자에 특이적이고;

    (b) 올리고뉴클레오티드 프라이머 존재하에 증폭된 DNA 서열이 샘플에 있는 지를 감지하여, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머중 적어도 한 개는 제5항에 따른 DNA 분자의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
19. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

    (a) 폴리메라제 사슬 반응에서 적어도 두 개 올리고뉴클레오티드 프라이머와 시료를 접촉시키고, 이때 올리고뉴클레오티드 프라이머중 적어도 한 개는 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 서열에 특이적이고;

    (b) 올리고뉴클레오티드 프라이머 존재하에 증폭된 DNA 서열이 샘플에 있는 지를 감지하여, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머중 적어도 한 개는 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 분자의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 19 항에 있어서, 생물학적 시료는 전체 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 오줌에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

    (a) 제 5 항에 따른 DNA 분자에 특이적인 한 개 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브와 시료를 접촉시키고;

    (b) 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드되는 DNA 서열이 샘플에 있는 지를 감지하여, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 제5항에 따른 DNA 분자의 적어도 15개 연속 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
24. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

    (a) 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 서열에 특이적인 한 개 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브와 시료를 접촉시키고;

    (b) 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드되는 DNA 서열이 샘플에 있는 지를 감지하여, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 서열의 적어도 15개 연속 뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 22 또는 24 항에 있어서, 생물학적 시료는 전체 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 오줌에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

    (a) 제 1-4 항에 따른 폴리펩티드에 결합할 수 있는 결합제와 시료를 접촉시키고;

    (b) 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드되는 DNA 서열이 샘플에 있는 지를 감지하여, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
28. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

    (a) 서열 129, 130에서 제공되는 서열에서 선택된 N-말단 서열을 가지는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 결합제와 시료를 접촉시키고;

    (b) 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드되는 DNA 서열이 샘플에 있는 지를 감지하여, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
29. 생물학적 시료에서 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 방법에 있어서,

    (a) 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 서열에; 이 서열에 상보체; 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198의 서열에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열의해 인코드되는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 결합제와 시료를 접촉시키고;

    (b) 올리고뉴클레오티드 프로브에 하이브리드되는 DNA 서열이 샘플에 있는 지를 감지하여, 미코박테리움 튜베로클로시스(M. tuberculosis) 감염을 감지하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제27-29항중 어느 한 항에 있어서, 결합제는 다클론성 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
31. 진단 키트에 있어서,

    (a) 제1-4항중 어느 한 항에 따른 한 개 이상의 폴리펩티드; 그리고

    (b) 감지 시약으로 구성된 것을 특징으로 하는 진단키트.
32. 진단 키트에 있어서,

    (a) 서열 129, 130에서 제공되는 서열에서 선택된 N-말단 서열을 가지는 하나 이상의 폴리펩티드; 그리고

    (b) 감지 시약으로 구성된 것을 특징으로 하는 진단키트.
33. 진단 키트에 있어서,

    (a) 서열 129, 130에서 제공되는 서열에서 선택된 N-말단 서열을 가지는 하나 이상의 폴리펩티드; 그리고

    (b) 감지 시약으로 구성된 것을 특징으로 하는 진단키트.
34. 진단 키트에 있어서,

    (a) 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 서열; 이 서열에 상보체 서열; 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198의 서열에 하이브리드할 수 있는 DNA 서열에서 선택된 서열에 의해 인코드되는 하나 이상의 폴리펩티드; 그리고

    (b) 감지 시약으로 구성된 것을 특징으로 하는 진단키트.
35. 제32-34항중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 고형 서포트에 고정된 것을 특징으로 하는 키트.
36. 제 35 항에 있어서, 고형 서포트는 니트로셀롤로오즈, 라텍스 또는 플라스틱 물질인 것을 특징으로 하는 키트.
37. 제 32-34 항중 어느 한 항에 있어서, 감지 시약은 결합제에 공액된 리포터기로 구성된 것을 특징으로 하는 키트.
38. 제37항에 있어서, 결합제는 항-이뮤노글로블린, Protein G, Protein A, 렉틴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
39. 제 37 항에 있어서, 리포터기는 방사능동위원소, 형광기, 발광기, 효소, 바이오틴, 염료 입자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
40. 적어도 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 구성된 진단 키트에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머중 한 개는 제5항에 따른 DNA 분자에 특이성이 있는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
41. 제 40 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머중 적어도 한 개는 제 5 항에 따른 DNA 분자의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
42. 적어도 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 구성된 진단 키트에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머중 한 개는 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 서열에 특이성이 있는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
43. 제 42 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머중 적어도 한 개는 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 서열의 적어도 10개 연속 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
44. 적어도 두 개의 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성된 진단 키트에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머중 한 개는 제5항에 따른 DNA 분자에 특이성이 있는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
45. 제 44 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브중 적어도 한 개는 제 5 항에 따른 DNA 분자의 적어도 15개 연속 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
46. 적어도 두 개의 올리고뉴클레오티드 프로브로 구성된 진단 키트에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머중 한 개는 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 서열에 특이성이 있는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
47. 제 46 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프라이머중 적어도 한 개는 서열 3, 11, 12, 135, 136, 151-155, 184-188, 194-195, 198에서 선택된 DNA 서열의 적어도 15개 연속 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
48. 제1-4항중 어느 한 항에 EK른 폴리펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 단클론성 항체.
49. 제1-4항중 어느 한 항에 EK른 폴리펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 다클론성 항체.
50. 제1-4항중 어느 한 항에 따른 두 개 이상의 폴리펩티드로 구성된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
51. 제1-4항중 어느 한 항, ESTA-6(서열 99)에 따른 두 개 이상의 폴리펩티드로 구성된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
52. 서열 129, 130에서 선택된 N-말단 서열을 가지는 폴리펩티드로 구성된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
53. 진단 키트에 있어서,

    (a) 제50-53항중 어느 한 항에 따른 한 개 이상의 융합 단백질; 그리고

    (b) 감지 시약으로 구성된 것을 특징으로 하는 진단키트.