ES2445209T3

ES2445209T3 - Compuestos para inmunoterapia y diagnóstico de la tuberculosis y métodos de su uso

Info

Publication number: ES2445209T3
Application number: ES10174426T
Authority: ES
Inventors: Mark Alderson; Davin Dillon; Yasir A. W. Skeiky; Antonio Campos-Neto
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1997-05-20
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 2014-02-28
Anticipated expiration: 2018-05-20
Also published as: CY1108864T1

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138; (ii) una variante inmunogénica de la SEQ ID NO: 138, en donde dicha variante tiene al menos un 90% deidentidad respecto a la SEQ ID NO: 138; (iii) una porción inmunogénica de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, para uso comomedicamento.

Description

Compuestos para inmunoterapia y diagnóstico de la tuberculosis y métodos de su uso

Campo técnico

La presente invención se refiere de forma general a la detección, tratamiento y prevención de la infección de Mycobacterium tuberculosis. La invención también se refiere más particularmente a polipéptidos que comprenden un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, o una porción u otra variante del mismo, y al uso de dichos polipéptidos para diagnosticar y vacunar contra la infección de Mycobacterium tuberculosis.

Antecedentes de la invención

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica que generalmente es causada por la infección de Mycobacterium tuberculosis. Es una enfermedad importante en los países en desarrollo, así como un problema creciente en áreas desarrolladas del mundo, con aproximadamente 8 millones de nuevos casos y 3 millones de muertes cada año. Aunque la infección puede ser asintomática durante un periodo de tiempo considerable, la enfermedad se manifiesta más comúnmente como una inflamación pulmonar aguda, qgaue da como resultado fiebre y tos no productiva. Si no se trata, normalmente se producen complicaciones graves o la muerte.

Aunque la tuberculosis generalmente puede controlarse usando una terapia con antibióticos extendida, dicho tratamiento no es suficiente para evitar la propagación de la enfermedad. Los individuos infectados pueden ser asintomáticos, pero contagiosos, durante un determinado tiempo. Además, aunque el cumplimiento del régimen de tratamiento es crítico, el comportamiento del paciente es difícil de monitorizar. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, lo que puede conducir a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de resistencia a los fármacos.

La inhibición de la propagación de la tuberculosis requiere una vacunación eficaz y un diagnóstico temprano y preciso de la enfermedad. Actualmente, la vacunación con bacterias vivas es el método más eficaz para inducir una inmunidad protectora. El Mycobacterium usado más habitualmente para este fin es el Bacillus Calmette-Guerin (BCG), una cepa no virulenta del Mycobacterium bovis. Sin embargo, la seguridad y la eficacia del BCG es una fuente de controversia y algunos países, tal como los Estados Unidos, no vacunan al público en general. El diagnóstico se realiza normalmente a través de un ensayo cutáneo, que implica una exposición intradermal a tuberculina PPD (derivado purificado de proteína, del inglés “protein-purified derivative”). Las respuestas de células T específicas de antígeno dan como resultado una induración medible en la zona de inyección a las 48-72 horas de la inyección, lo que indica una exposición a antígenos Mycobacterianos. Sin embargo, la sensibilidad y la especificidad han sido un problema en este ensayo, y no se pueden distinguir los individuos vacunados con BCG de los individuos infectados.

Aunque se ha demostrado que los macrófagos actúan como efectores principales en la inmunidad frente a M. tuberculosis, las células T son los inductores predominantes de dicha inmunidad. La función esencial de las células T en la protección contra la infección de M. tuberculosis queda ilustrada por la frecuente aparición de M. tuberculosis en pacientes de SIDA, debido al agotamiento de células T CD4 asociado a la infección de virus de inmunodeficiencia humano (VIH). Se ha demostrado que las células T CD4 reactivas frente a Mycobacterium son potentes productores de interferón gamma (IFN-γ), el cual, a su vez, se ha demostrado que activa los efectos anti-micobacterianos de macrófagos en ratones. Aunque el papel del IFN-γ en humanos está menos claro, hay estudios que han demostrado que la 1,25-dihidroxi-vitamina D3, tanto sola como en combinación con IFN-γ o factor alfa de necrosis tumoral, activa los macrófagos humanos para que inhiban la infección de M. tuberculosis. Además, se sabe que el IFN-γ estimula los macrófagos humanos para que fabriquen 1,25-dihidroxi-vitamina D3. De forma similar, se ha demostrado que la IL-12 desempeña una función en la estimulación de la resistencia frente a la infección de M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de la infección de M. tuberculosis véase Chan y Kaufmann en “Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control”, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC, 1994.

Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de mejores vacunas y métodos de prevención, tratamiento y detección de la tuberculosis. La presente invención cubre estas necesidades y además proporciona otras ventajas relacionadas.

Resumen de la invención

En pocas palabras, esta invención proporciona compuestos para prevenir y diagnosticar la tuberculosis.

La presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende: (i) una porción inmunogénica de un antígeno de M. tuberculosis que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 138; ó (ii) una variante del antígeno de M. tuberculosis presentado en la SEQ ID NO: 138, que tiene al menos un 90% de identidad con la SEQ ID NO: 138.

En aspectos relacionados, también se proporcionan secuencias de ADN que codifican los anteriores polipéptidos, vectores de expresión que comprenden dichas secuencias de ADN y células hospedantes transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresión.

En otro aspecto, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un primer y un segundo polipéptidos de la invención o, alternativamente, un polipéptido de la invención y un antígeno de M. tuberculosis conocido.

Entre otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los anteriores polipéptidos, o una molécula de ADN que codifica dichos polipéptidos, y un vehículo fisiológicamente aceptable. La invención también proporciona vacunas que comprenden uno o más de los polipéptidos tal como se han descrito anteriormente y un potenciador de respuesta inmune no específica, junto con vacunas que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican dichos polipéptidos y un potenciador de respuesta inmune no específica.

Se describen métodos para inducir inmunidad protectora en un paciente, que comprenden la administración a un paciente de una cantidad eficaz de uno o más de los anteriores polipéptidos.

En otros aspectos de esta invención, se proporcionan kits de diagnosis para detectar tuberculosis en un paciente.

Los kits de diagnosis comprenden uno o más de los anteriores polipéptidos en combinación con un aparato que sea suficiente para poner en contacto el polipéptido con células dérmicas de un paciente.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A y 1B ilustran la estimulación de la proliferación y de la producción de interferón γ, respectivamente, en células T derivadas de un donante PPD positivo (designado D7) mediante ORF-2 recombinante y péptidos sintéticos a ORF-2.

Las Figuras 2A y 2B ilustran la estimulación de la proliferación y de la producción de interferón γ, respectivamente, en células T derivadas de un segundo donante PPD positivo (designado D160) mediante ORF-2 recombinante y péptidos sintéticos a ORF-2.

Descripción detallada de la invención

Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención está dirigida de forma general a composiciones para prevenir, tratar y diagnosticar la tuberculosis. Las composiciones de la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden al menos una porción inmunogénica de un antígeno de M. tuberculosis, o una variante de dicho antígeno que difiere sólo en sustituciones y/o modificaciones conservativas. Tal como se usa en la presente memoria, el término “polipéptido” abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, que incluyen proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), donde los residuos de aminoácidos están unidos mediante enlaces peptídicos covalentes. Así, un polipéptido que comprende una porción inmunogénica de uno de los anteriores antígenos puede consistir por completo en la porción inmunogénica, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivar del antígeno de M. tuberculosis nativo o pueden ser heterólogas, y dichas secuencias pueden ser inmunogénicas (aunque no es necesario).

“Inmunogénico”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad de provocar una respuesta inmune (por ejemplo, celular) en un paciente, tal como un humano, y/o en una muestra biológica. En particular, los antígenos que son inmunogénicos (y las porciones u otras variantes inmunogénicas de dichos antígenos) son capaces de estimular la proliferación celular, la producción de interleucina-12 y/o la producción de interferón γ en muestras biológicas que comprenden una o más células seleccionadas del grupo de células T, células NK, células B y macrófagos, donde las células derivan de un individuo inmune a M. tuberculosis. Los polipéptidos que comprenden al menos una porción inmunogénica de uno o más antígenos de M. tuberculosis pueden usarse de forma general para detectar tuberculosis, o para inducir inmunidad protectora contra tuberculosis, en un paciente.

Las composiciones y métodos de esta invención también abarcan variantes de los anteriores péptidos. Una “variante” de polipéptido, tal como se usa en la presente memoria, es un polipéptido que difiere del polipéptido presentado solamente en sustituciones y/o modificaciones conservativas, de tal modo que se mantienen las propiedades terapéuticas, antigénicas y/o inmunogénicas del polipéptido, y que tiene al menos un 90%, y más preferiblemente al menos un 95%, de identidad con los polipéptidos identificados. Para polipéptidos con propiedades inmunorreactivas, alternativamente se pueden identificar variantes modificando la secuencia de aminoácidos de uno de los anteriores péptidos, y evaluando la inmunorreactividad del polipéptido modificado. Para polipéptidos útiles para la generación de agentes de unión de diagnosis, se puede identificar una variante evaluando un polipéptido modificado en términos de su capacidad para generar anticuerpos que detecten la presencia o la ausencia de tuberculosis. Alternativamente, se pueden identificar variantes de los antígenos que pueden ser empleados de forma útil en los métodos diagnósticos de la invención a través de la evaluación de polipéptidos modificados en términos de su capacidad para detectar anticuerpos presentes en sueros de pacientes infectados con tuberculosis. Dichas secuencias modificadas pueden prepararse y evaluarse usando, por ejemplo, los procedimientos representativos descritos en la presente memoria.

Una “sustitución conservativa” es aquella en la que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de tal modo que el especialista en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente inalteradas. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservativos: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Las variantes pueden también (o alternativamente) ser modificadas mediante, por ejemplo, la eliminación o la adición de aminoácidos que tengan una influencia mínima sobre las propiedades inmunogénicas, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Por ejemplo, se puede conjugar un polipéptido a una secuencia señal (o líder) en el extremo N de la proteína, que dirija la transferencia de la proteína de forma cotraduccional o post-traduccional. El polipéptido también se puede conjugar con un ligando u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse con una región Fc de inmunoglobulina.

En general, los antígenos de M. tuberculosis, y las secuencias de ADN que codifican dichos antígenos, pueden prepararse usando cualquiera de una serie de procedimientos. Por ejemplo, se pueden escrutar bibliotecas genómicas o de ADNc derivadas de M. tuberculosis directamente usando células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) o líneas de células T o clones derivados de uno o más individuos inmunes a M. tuberculosis. Los escrutinios directos de bibliotecas pueden realizarse generalmente analizando conjuntos de proteínas recombinantes expresadas para determinar su capacidad para inducir la proliferación y/o la producción de interferón γ en células T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis. Los antígenos de células T potenciales pueden seleccionarse en primer lugar en base a la reactividad con anticuerpos, tal como se ha descrito antes.

Alternativamente, se pueden identificar secuencias de ADN que codifican antígenos mediante escrutinio de una biblioteca de expresión genómica o de ADNc de M. tuberculosis apropiada con sueros obtenidos de pacientes infectados con M. tuberculosis. Dichos escrutinios pueden llevarse a cabo de forma general usando técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica, tal como las descritas en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

A continuación se evalúan los antígenos purificados para determinar su capacidad para provocar una respuesta inmune apropiada (por ejemplo, celular) usando, por ejemplo, los métodos representativos descritos en la presente memoria. Luego los antígenos inmunogénicos pueden ser secuenciados parcialmente usando técnicas tales como la química de Edman tradicional. Véase Edman y Berg, Eur. J. Biochem. 80: 116-132, 1967. Los antígenos inmunogénicos también pueden ser producidos de manera recombinante usando una secuencia de ADN que codifique el antígeno, que ha sido insertada en un vector de expresión y expresada en un anfitrión apropiado.

Las secuencias de ADN que codifican los antígenos de la invención también pueden obtenerse mediante escrutinio de una librería de ADNc o de ADN genómico de M. tuberculosis apropiada para obtener secuencias de ADN que se hibriden con oligonucleótidos degenerados derivados de secuencias de aminoácidos parciales de antígenos aislados. Las secuencias de oligonucleótidos degenerados para su uso en un escrutinio de este tipo pueden diseñarse y sintetizarse, y el escrutinio puede llevarse a cabo, tal como se describe (por ejemplo) en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (y las referencias citadas en dicho documento). También se puede emplear la reacción en cadena de polimerasa (PCR), usando los anteriores oligonucleótidos en métodos bien conocidos en la técnica, para aislar una sonda de ácido nucleico a partir de una biblioteca genómica o de ADNc. El escrutinio de la biblioteca se puede llevar a cabo entonces usando la sonda aislada.

Independientemente del método de preparación, los antígenos (y las porciones inmunogénicas de los mismos) descritos en la presente invención tienen la capacidad de inducir una respuesta inmunogénica. Más específicamente, los antígenos tienen la capacidad de inducir la proliferación y/o la producción de citocinas (es decir, la producción de interferón γ y/o de interleucina-12) en células T, células NK, células B y/o macrófagos derivados de un individuo inmune a M. tuberculosis. La selección del tipo de célula para su uso en la evaluación de una respuesta inmunogénica frente a un antígeno dependerá, por supuesto, de la respuesta deseada. Por ejemplo, la producción de interleucina-12 se evalúa más fácilmente usando preparaciones que contienen células B y/o macrófagos. Un individuo inmune a M. tuberculosis es aquel que es considerado resistente al desarrollo de tuberculosis en virtud a haber generado una respuesta de células T eficaz contra M. tuberculosis (es decir, que está sustancialmente libre de síntomas de la enfermedad). Dichos individuos pueden identificarse en base a una respuesta fuertemente positiva en el ensayo cutáneo intradermal (es decir, una induración superior a aproximadamente 10 mm de diámetro) frente a proteínas de tuberculosis (PPD), y a una ausencia de cualquier signo o síntoma de la enfermedad de tuberculosis. Se pueden preparar células T, células NK, células B y macrófagos derivados de individuos inmunes a M. tuberculosis usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, se puede emplear una preparación de PBMCs (es decir, células mononucleares sanguíneas periféricas) sin separación adicional de componentes celulares. Las PBMCs se preparan generalmente, por ejemplo, usando centrifugación de densidad a través de FicollTM (Winthrop Laboratories, NY).

Las células T para su uso en los ensayos descritos en la presente memoria también pueden purificarse directamente a partir de PBMCs. Alternativamente, se puede emplear una línea de células T enriquecida que sea reactiva contra proteínas micobacterianas, ó clones de células T reactivos a proteínas micobacterianas individuales. Dichos clones de células T pueden generarse, por ejemplo, mediante el cultivo de PBMCs a partir de individuos inmunes a M. tuberculosis con proteínas micobacterianas durante un periodo de 2-4 semanas. Esto permite la expansión sólo de las células T específicas de proteínas micobacterianas, lo que da como resultado una línea compuesta únicamente por dichas células. Estas células pueden clonarse a continuación y evaluarse con proteínas individuales usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica, para definir con mayor precisión la especificidad de células T individuales. En general, los antígenos que son positivos en ensayos de proliferación y/o producción de citocinas (es decir, producción de interferón γ y/o de interleucina-12) llevados a cabo usando células T, células NK, células B y/o macrófagos derivados de un individuo inmune a M. tuberculosis son considerados inmunogénicos. Dichos ensayos pueden llevarse a cabo, por ejemplo, usando los procedimientos representativos descritos a continuación. Se pueden identificar las porciones inmunogénicas de dichos antígenos usando ensayos similares, y pueden estar presentes dentro de los polipéptidos descritos en la presente memoria.

La capacidad de un polipéptido (por ejemplo, un antígeno inmunogénico, o una porción u otra variante del mismo) para inducir proliferación celular se evalúa poniendo en contacto las células (por ejemplo, células T y/o células NK) con el polipéptido y midiendo la proliferación de las células. En general, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de aproximadamente 105 células oscila entre aproximadamente 10 ng/mL y aproximadamente 100 μg/mL, y preferiblemente es aproximadamente 10 μg/mL. La incubación de polipéptido con células se lleva a cabo típicamente a 37ºC durante aproximadamente seis días. Después de la incubación con polipéptido, las células son evaluadas para determinar una respuesta proliferativa, que puede ser analizada mediante métodos conocidos por los especialistas en la técnica, tal como exponer las células a un pulso de timidina radiomarcada y medir la incorporación de marca al ADN celular. En general, un polipéptido que da como resultado al menos un aumento del triple en la proliferación respecto al ruido de fondo (es decir, la proliferación observada para células cultivadas sin polipéptido) se considera capaz de inducir proliferación.

La capacidad de un polipéptido para estimular la producción de interferón γ y/o de interleucina-12 en células puede evaluarse poniendo en contacto las células con el polipéptido y midiendo el nivel de interferón γ o de interleucina-12 producido por las células. En general, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de aproximadamente 105 células oscila entre aproximadamente 10 ng/mL y aproximadamente 100 μg/mL y preferiblemente es aproximadamente 10 μg/mL. El polipéptido puede, aunque no es necesario, encontrarse inmovilizado sobre un soporte sólido, tal como una bolita o una microesfera biodegradable, tal como las descritas en las Patentes de EE.UU. Nº 4.897.268 y 5.075.109. La incubación de polipéptido con las células se lleva a cabo típicamente a 37ºC durante aproximadamente seis días. Después de la incubación con polipéptido, las células son evaluadas para determinar interferón γ y/o interleucina-12 (o una o más subunidades de los mismos), que pueden evaluarse mediante métodos conocidos por los especialistas en la técnica, tal como un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) o, en el caso del heterodímero P70 de IL-12, un bioensayo tal como un ensayo que mida la proliferación de células T. En general, un polipéptido que da como resultado la producción de al menos 50 pg de interferón γ por mL de sobrenadante cultivado (que contiene 104-105 células T por mL) es considerado capaz de estimular la producción de interferón γ. Un polipéptido que estimula la producción de al menos 10 pg/mL de subunidad P70 de IL-12, y/o al menos 100 pg/mL de subunidad P40 de IL-12, por cada 105 macrófagos o células B (o por cada 3 x 105 PBMC) es considerado capaz de estimular la producción de IL-12.

En general, los antígenos inmunogénicos son aquellos antígenos que estimulan la proliferación y/o la producción de citocinas (es decir, la producción de interferón γ y/o interleucina-12) en células T, células NK, células B y/o macrófagos derivados de al menos aproximadamente el 25% de individuos inmunes a M. tuberculosis. Entre estos antígenos inmunogénicos, los polipéptidos que tienen propiedades terapéuticas superiores pueden distinguirse en base a la magnitud de las respuestas en los anteriores ensayos y en base al porcentaje de individuos en los que se observa una respuesta. Además, los antígenos que tienen propiedades terapéuticas superiores no estimularán la proliferación y/o la producción de citoquinas in vitro en células derivadas de más de aproximadamente el 25% de individuos que no son inmunes a M. tuberculosis, eliminando con ello las respuestas que no son debidas específicamente a células que responden a M. tuberculosis. Los antígenos que inducen una respuesta en un alto porcentaje de preparaciones de células T, células NK, células B y/o macrófagos de individuos inmunes a M. tuberculosis (con una baja incidencia de respuestas en preparaciones celulares de otros individuos) tienen propiedades terapéuticas superiores.

Los antígenos con propiedades terapéuticas superiores también pueden ser identificados en base a su capacidad para disminuir la gravedad de la infección de M. tuberculosis en animales experimentales, cuando se administran como vacuna. Las preparaciones de vacuna adecuadas para su uso en animales experimentales se describen más detalladamente a continuación. La eficacia puede determinarse en base a la capacidad del antígeno para proporcionar al menos aproximadamente una reducción del 50% en el número de bacterias y/o al menos un descenso del 40% en la mortalidad tras la infección experimental. Los animales experimentales adecuados incluyen ratones, cobayas y primates.

Los antígenos que tienen propiedades diagnósticas superiores pueden identificarse generalmente en base a su capacidad para provocar una respuesta en un ensayo cutáneo intradérmico llevado a cabo con un individuo con tuberculosis activa, pero no en un ensayo llevado con un individuo que no esté infectado con M. tuberculosis. Los ensayos cutáneos pueden llevarse a cabo generalmente como se describe a continuación, considerando positiva una respuesta de al menos 5 mm de induración.

Las porciones inmunogénicas de los antígenos descritos en la presente memoria se pueden preparar e identificar usando técnicas bien conocidas, tales como las resumidas en Paul, Fundamental Immunology, 3ª edición, Raven Press, 1993, páginas 243-247, y las referencias citadas en la misma. Dichas técnicas incluyen el escrutinio de porciones de polipéptido del antígeno activo para determinar propiedades inmunogénicas. En dichos escrutinios se pueden emplear de forma general los ensayos representativos de proliferación y producción de citocinas descritos en la presente memoria. Una porción inmunogénica de un polipéptido es una porción que, en dichos ensayos representativos, genera una respuesta inmune (por ejemplo, proliferación, producción de interferón γ y/o producción de interleucina-12) que es sustancialmente similar a la generada por el antígeno de longitud completa. En otras palabras, una porción inmunogénica de un antígeno puede generar al menos aproximadamente un 20%, y preferiblemente aproximadamente el 100%, de la proliferación inducida por el antígeno de longitud completa en el ensayo de proliferación modelo descrito en la presente memoria. Una porción inmunogénica puede también, o alternativamente, estimular la producción de al menos un 20%, y preferiblemente de aproximadamente el 100%, del interferón γ y/o de la interleucina-12 inducida por el antígeno de longitud completa en el ensayo modelo descrito en la presente memoria.

Las porciones y otras variantes de los antígenos de M. tuberculosis pueden generarse a través de medios sintéticos

o recombinantes. Los polipéptidos sintéticos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, pueden generarse usando técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden sintetizarse usando cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles comercialmente, tal como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos son añadidos secuencialmente a una cadena de aminoácidos que va creciendo. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos se encuentra disponible comercialmente a través de suministradores como Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA, y pueden operarse según las instrucciones del fabricante. Las variantes de un antígeno nativo pueden prepararse generalmente usando técnicas de mutagénesis estándares, tal como la mutagénesis específica de posición dirigida de oligonucleótidos. También se pueden eliminar secciones de la secuencia de ADN usando técnicas estándares para permitir la preparación de polipéptidos truncados.

Se pueden preparar fácilmente polipéptidos recombinantes que contengan porciones y/o variantes de un antígeno nativo a partir de una secuencia de ADN que codifique el polipéptido usando una serie de técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, los sobrenadantes de sistemas hospedante/vector adecuados que secretan proteína recombinante al medio de cultivo pueden concentrarse en primer lugar usando un filtro disponible comercialmente. Después de la concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, se puede emplear una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar aún más una proteína recombinante.

Se puede usar cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los especialistas en la técnica para expresar los polipéptidos recombinantes de esta invención. La expresión se puede lograr en cualquier célula hospedante apropiada que haya sido transformada o transfectada con un vector de expresión que contenga una molécula de ADN que codifique un polipéptido recombinante. Las células hospedantes adecuadas incluyen células procarióticas, de levadura y eucarióticas superiores. Preferiblemente, las células hospedantes empleadas son de una línea celular de E. coli, de levadura o de mamífero, tal como COS ó CHO. Las secuencias de ADN expresadas de este modo pueden codificar antígenos que existen de forma natural, porciones de antígenos que existen de forma natural, u otras variantes de los mismos.

En general, independientemente del método de preparación, los polipéptidos descritos en la presente memoria se preparan en forma sustancialmente pura. Preferiblemente, los polipéptidos son puros en al menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente son puros en al menos aproximadamente un 90%, y aún más preferiblemente son puros en al menos aproximadamente un 99%. En determinadas realizaciones preferidas, descritas en detalle más adelante, los polipéptidos sustancialmente puros se incorporan en composiciones farmacéuticas o en vacunas para su uso en uno o más de los métodos descritos en la presente memoria.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un primer y un segundo polipéptido de la invención o, alternativamente, un polipéptido de la presente invención y un antígeno de M. tuberculosis conocido, tal como el antígeno de 38 kD descrito por Andersen y Hansen, Infect. Immun. 57: 2481-2488, 1989 (Número de Acceso de Genbank M30046), o ESAT-6, identificado previamente en M. bovis (Número de Acceso de Genbank U34848) y en M. tuberculosis (Sorensen y col., Infec. Immun. 63: 1710-1717, 1995). También se proporcionan variantes de dichas proteínas de fusión. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden incluir un péptido ligando entre el primer y segundo polipéptido.

Una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión de la presente invención se construye usando técnicas de ADN recombinantes conocidas para ensamblar secuencias de ADN separadas que codifican el primer y el segundo polipéptido en un vector de expresión apropiado. El extremo 3’ de una secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido es ligado, con o sin un enlace peptídico, al extremo 5’ de una secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido de tal modo que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase para permitir la traducción de ARNm de las dos secuencias de ADN en una única proteína de fusión que retenga la actividad biológica tanto del primer como del segundo polipéptido.

Se puede emplear una secuencia de enlace peptídico para separar el primer y el segundo polipéptidos mediante una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Dicha secuencia de enlace peptídico se incorpora a la proteína de fusión usando técnicas estándares bien conocidas en la técnica. Las secuencias de enlace peptídico adecuadas pueden seleccionarse en base a los siguientes factores: (1) por su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) por su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pudiera interactuar con epítopos funcionales del primer y segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos hidrofóbicos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias de enlace peptídico preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. También pueden usarse en la secuencia de enlace otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala. Las secuencias de aminoácidos que pueden ser empleadas de forma útil como enlaces incluyen las descritas por Maratea y col., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; la Patente de EE.UU. Nº 4.935.233 y la Patente de EE.UU. Nº 4.751.180. La secuencia de enlace puede tener una longitud de entre 1 y 50 aminoácidos. No se requieren secuencias de péptidos cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos Nterminales no esenciales que pueden ser usadas para separar los dominios funcionales y para prevenir una interferencia estérica.

Las secuencias de ADN enlazadas están ligadas operativamente a elementos adecuados reguladores transcripcionales o de la traducción. Los elementos reguladores responsables de la expresión de ADN están localizados sólo en 5’ respecto a la secuencia de ADN que codifica el primer polipéptido. De forma similar, los codones de parada requeridos para finalizar las señales de terminación de la traducción y de la transcripción sólo están presentes en 3’ respecto a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.

Se describen métodos para usar uno o más de los anteriores polipéptidos o proteínas de fusión (o moléculas de ADN que codifican dichos polipéptidos) para inducir inmunidad protectora contra la tuberculosis en un paciente. Tal como se usa en la presente memoria, un “paciente” se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un humano. Un paciente puede estar afligido por una enfermedad, o puede estar libre de enfermedades y/o infecciones detectables. En otras palabras, la inmunidad protectora puede ser inducida para prevenir o para tratar la tuberculosis.

En dichos métodos, el polipéptido, proteína de fusión o molécula de ADN generalmente se encuentra presente en una composición farmacéutica y/o en una vacuna. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más polipéptidos, cada uno de los cuales puede contener una o más de las anteriores secuencias (o variantes de las mismas), y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o más de los anteriores polipéptidos y un potenciador de la respuesta inmune no específico, tal como un adyuvante o un liposoma (en el que se incorpora el polipéptido). Dichas composiciones farmacéuticas y vacunas también pueden contener otros antígenos de M. tuberculosis, tanto incorporados en un polipéptido de combinación o presentes en polipéptidos separados.

Alternativamente, una vacuna puede contener ADN que codifica uno o más polipéptidos como los anteriormente descritos, de tal modo que el polipéptido se genera in situ. En dichas vacunas, el ADN puede estar presente en cualquiera de una variedad de sistemas de administración conocidos por los especialistas en la técnica, incluyendo sistemas de expresión de ácido nucleico, y sistemas de expresión bacterianos y víricos. Los sistemas de expresión de ácido nucleico apropiados contienen las secuencias de ADN necesarias para la expresión en el paciente (tal como un promotor adecuado y una señal de terminación adecuada). Los sistemas de administración bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que exprese una porción inmunogénica del polipéptido sobre su superficie celular. En una realización preferida, el ADN puede introducirse usando un sistema de expresión vírica (por ejemplo, virus vaccinia u otros virus de la viruela, retrovirus o adenovirus), que pueden implicar el uso de un virus de replicación competente no patogénico (defectuoso). Las técnicas para incorporar ADN en dichos sistemas de expresión son bien conocidas por los especialistas en la técnica. El ADN también puede estar “desnudo”, tal como se describe, por ejemplo, en Ulmer y col., Science 259: 1745-1749, 1993, y como se revisa en Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993. La captación de ADN desnudo puede incrementarse aplicando el ADN sobre bolitas biodegradables, que son transportadas de forma eficaz al interior de las células.

En un aspecto relacionado, se puede administrar una vacuna de ADN como la descrita antes simultáneamente o secuencialmente respecto a un polipéptido de la presente invención o a un antígeno de M. tuberculosis conocido, tal como el antígeno de 38 kD descrito anteriormente. Por ejemplo, la administración de ADN que codifica un polipéptido de la presente invención, “desnudo” o en un sistema de administración como los descritos antes, puede ir seguida de la administración de un antígeno con el fin de potenciar el efecto inmune protector de la vacuna.

Las rutas y la frecuencia de administración, así como la dosis, variarán de individuo a individuo y pueden ser iguales a las empleadas actualmente en inmunización con BCG. En general, las composiciones farmacéuticas y las vacunas pueden administrarse mediante inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), intranasalmente (por ejemplo, mediante aspiración) u oralmente. Se pueden administrar entre 1 y 3 dosis durante un periodo de 1-36 semanas. Preferiblemente, se administran 3 dosis, a intervalos de 3-4 meses, y después de eso se pueden administrar periódicamente vacunas de recuerdo. Para pacientes individuales pueden ser apropiados protocolos alternativos. Una dosis adecuada es una cantidad de polipéptido o de ADN que, cuando se administra como se ha indicado anteriormente, es capaz de producir una respuesta inmune en un paciente inmunizado que sea suficiente para proteger al paciente frente a la infección de M. tuberculosis durante al menos 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis (o producida in situ mediante el ADN en una dosis) oscila entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 100 mg por kg de anfitrión, normalmente entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 1 mg, y preferiblemente entre aproximadamente 100 pg y aproximadamente 1 μg. Los tamaños de dosis adecuados variarán con el tamaño del paciente, pero típicamente oscilarán entre aproximadamente 0,1 mL y aproximadamente 5 mL.

Aunque se puede emplear cualquier vehículo adecuado conocido por los especialistas en la técnica para las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Para administración parenteral, tal como una inyección subcutánea, el vehículo preferiblemente comprende agua, disolución salina, alcohol, lípidos, una cera o un tampón. Para administración oral se puede emplear cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato magnésico, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y carbonato magnésico. También se pueden emplear microesferas biodegradables (por ejemplo, galactide poliláctico) como vehículo para las composiciones farmacéuticas de esta invención. Microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 4.897.268 y 5.075.109.

Se puede emplear cualquiera de una variedad de adyuvantes en las vacunas de esta invención para potenciar de forma no específica la respuesta inmune. La mayoría de adyuvantes contiene una sustancia diseñada para proteger el antígeno frente a un catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador no específico de respuestas inmunes, tal como lípido A, Bortadella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Se encuentran disponibles comercialmente adyuvantes adecuados tales como, por ejemplo, Adyuvante Incompleto de Freund y Adyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories) y Adyuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Otros adyuvantes adecuados incluyen alumbre, microesferas biodegradables, monofosforil lípido A y quil A.

En otro aspecto, esta invención proporciona kits de diagnóstico adecuados para su uso en un ensayo cutáneo. Tal como se usa en la presente memoria, un “ensayo cutáneo” es cualquier ensayo llevado a cabo directamente sobre un paciente en el que se mide una reacción (tal como hinchamiento, enrojecimiento o dermatitis) de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH, del inglés “delayed-type hypersensitivity”) después de una inyección intradermal de uno o más polipéptidos como los descritos anteriormente. Dicha inyección se puede lograr usando cualquier dispositivo adecuado que sea suficiente para poner en contacto el polipéptido o polipéptidos con células dérmicas del paciente, tal como una jeringa de tuberculina o una jeringa de 1 mL. Preferiblemente, la reacción se mide al menos 48 horas después de la inyección, más preferiblemente 48-72 horas.

La reacción DTH es una respuesta inmune mediada por células, que es mayor en pacientes que hayan sido expuestos previamente al antígeno evaluado (es decir, la porción inmunogénica del polipéptido empleado, o una variante del mismo). La respuesta puede medirse visualmente, usando una regla. En general, una respuesta que sea superior a aproximadamente 0,5 cm de diámetro, preferiblemente superior a aproximadamente 1,0 cm de diámetro, es una respuesta positiva, indicativa de infección de tuberculosis, que puede o no manifestarse como enfermedad activa.

Los polipéptidos de esta invención se formulan preferiblemente para su uso en un ensayo cutáneo, como composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido y un vehículo fisiológicamente aceptable, tal como se ha descrito anteriormente. Dichas composiciones contienen típicamente uno o más de los anteriores polipéptidos en una cantidad que oscila entre aproximadamente 1 μg y aproximadamente 100 μg, preferiblemente entre aproximadamente 10 μg y aproximadamente 50 μg en un volumen de 0,1 mL. Preferiblemente, el vehículo empleado en dichas composiciones farmacéuticas es una disolución salina con los conservantes apropiados, tal como fenol y/o Tween 80TM.

En una realización preferida, un polipéptido empleado en un ensayo cutáneo tiene un tamaño suficiente para permanecer en la zona de inyección mientras dure el periodo de reacción. En general, es suficiente un polipéptido que tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos. El polipéptido es descompuesto también preferiblemente por acción de macrófagos en cuestión de horas desde la inyección, para permitir la presentación de células T. Dichos polipéptidos pueden contener repeticiones de una o más de las anteriores secuencias y/u otras secuencias inmunogénicas o no inmunogénicas.

Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1 Purificación y caracterización de polipéptidos de M. Tuberculosis usando líneas de células T CD4+ generadas a partir de PBMC humanas

Los antígenos de M. tuberculosis de la presente invención fueron aislados mediante clonación de expresión de bibliotecas de ADNc de las cepas de M. tuberculosis H37Rv y Erdman esencialmente como han descrito Sanderson y col. (J. Exp. Med., 1995, 182: 1751-1757) y se demostró que inducían proliferación de PBMC y de IFN-γ en una línea de células T inmunorreactivas.

Se generaron dos líneas de células T CD4+, denominadas DC-4 y DC-5, contra células dendríticas infectadas con

M. tuberculosis. Específicamente, las células dendríticas fueron preparadas a partir de PBMC adherentes procedentes de un donante único, y a continuación fueron infectadas con tuberculosis. Se cultivaron linfocitos procedentes del mismo donante en condiciones de dilución limitantes con las células dendríticas infectadas para generar las líneas de células T CD4+, DC-4 y DC-5. Estas líneas celulares demostraron ser reactivas con proteínas solubles no purificadas procedentes de M. tuberculosis pero no con Tb38-1. Se emplearon condiciones de dilución limitante para obtener una tercera línea de células T CD4+, denominada DC-6, que demostró ser reactiva tanto con proteínas solubles no purificadas como con Tb38-1.

Se aisló ADN genómico a partir de las cepas de M. tuberculosis H37Rv y Erdman, y se usó para construir bibliotecas de expresión en el vector pBSK(-) usando el sistema de expresión Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA). Estas bibliotecas fueron transformadas en E. coli, se incubaron grupos de cultivos de E. coli inducidos con células dendríticas, y se examinó la capacidad de las células dendríticas incubadas resultantes para estimular la proliferación celular y la producción de IFN-γ en la línea de células T CD4+ DC-6 tal como se describe más adelante en el Ejemplo 2. Los grupos positivos fueron fraccionados y re-evaluados hasta que se obtuvieron clones puros de

M. tuberculosis. Se aislaron diecinueve clones, de los cuales se observó que nueve contenían los antígenos de M. tuberculosis identificados previamente como TbH-9 y Tb38-1, descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº 08/533.634. Las secuencias de ADNc determinadas para los otros diez clones (denominados de aquí en adelante Tb224, Tb636, Tb424, Tb436, Tb398, Tb508, Tb441, Tb475, Tb488 y Tb465) se proporcionan en las SEQ ID NO: 110, respectivamente. Las correspondientes secuencias de aminoácidos predichas para el Tb224 y el Tb636 se proporcionan en la SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente. Se descubrió que los marcos de lectura abiertos correspondientes a estos dos antígenos muestran homología con respecto al anteriormente descrito TbH-9. También se observó que el Tb224 y el Tb636 son clones solapados.

Se observó que los clones Tb424, Tb436, Tb398, Tb508, Tb441, Tb475, Tb488 y Tb465 contenían dos marcos de lectura abiertos pequeños (denominados ORF-1 y ORF-2) o formas truncadas de los mismos, encontrándose variaciones menores en el ORF-1 y el ORF-2 en cada clon. Las secuencias de aminoácidos predichas del ORF-1 y ORF-2 correspondientes a Tb424, Tb436, Tb398, Tb508, Tb441, Tb475, Tb488 y Tb465 se proporcionan en la SEQ ID NO: 16 y 17, 18 y 19, 20 y 21, 22 y 23, 24 y 25, 26 y 27, 28 y 29, y 30 y 31, respectivamente. Además, se observó que los clones Tb424 y Tb436 contienen un tercer marco de lectura abierto aparente, denominado ORF-U. Las secuencias de aminoácidos predichas del ORF-U de Tb424 y Tb436 se muestran en las SEQ ID NO: 32 y 33, respectivamente. Se descubrió que el Tb424 y el Tb436 son clones solapados o copias recién duplicadas/traspuestas. De forma similar, se descubrió que el Tb398, el Tb508 y el Tb465 son clones solapados o copias recién duplicadas/traspuestas, como también lo fueron el Tb475 y el Tb488.

Estas secuencias fueron comparadas con secuencias conocidas del banco de genes usando el sistema BLASTN. No se observaron homologías con los antígenos Tb224 y Tb431. Se observó que el Tb636 es idéntico al 100% a un cósmido identificado previamente en M. tuberculosis. De forma similar, se descubrió que Tb508, Tb488, Tb398, Tb424, Tb436, Tb441, Tb465 y Tb475 muestran homología con respecto a cósmidos de M. tuberculosis conocidos. Adicionalmente, se descubrió que el Tb488 presenta una homología del 100% con la topoisomerasa I de M. tuberculosis.

Se sintetizaron diecisiete péptidos solapados con el marco de lectura abierto ORF-1 (denominados 1-1 – 1-17; SEQ ID NO: 34-50, respectivamente) y treinta péptidos solapados con el marco de lectura abierto ORF-2 (denominados 21 – 2-30, SEQ ID NO: 51-80) usando el procedimiento descrito más adelante en el Ejemplo 3.

Se evaluó la capacidad de los péptidos sintéticos, y de ORF-1 y ORF-2 recombinantes, para inducir la proliferación de células T y la producción de IFN-γ en PBMC procedentes de donantes positivos en PPD tal como se describe más adelante en el Ejemplo 2. Las Figuras 1A-B y 2A-B ilustran la estimulación de la proliferación de células T y de IFN-γ mediante ORF-2 recombinante y los péptidos 2-1 – 2-16 para dos donantes, referidos como D7 y D160, respectivamente. El ORF-2 recombinante (referido como MTI) estimuló la proliferación de células T y la producción de IFN-γ en PBMC de ambos donantes. La cantidad de estimulación de PBMC observada con los péptidos sintéticos individuales varía con cada donante, lo que indica que cada donante reconoce diferentes epítopos sobre el ORF-2. Las proteínas codificadas por ORF-1, ORF-2 y ORF-U fueron denominadas posteriormente MTS, MTI y MSF, respectivamente.

Se sintetizaron dieciocho péptidos solapados con la secuencia de MSF (referidos como MSF-1 – MSF-18; SEQ ID NO: 84-101, respectivamente) y se examinó su capacidad para estimular la proliferación de células T y la producción de IFN-γ en una línea de células T CD4+ generada contra filtrado de cultivo de M. tuberculosis, tal como se describe más adelante. Se descubrió que los péptidos denominados MSF-12 y MSF-13 (SEQ ID NO: 95 y 96, respectivamente) muestran los mayores niveles de reactividad. Se sintetizaron dos péptidos solapados (SEQ ID NO: 81 y 82) con el marco de lectura abierto del Tb224 y se demostró que inducían la proliferación de células T y la producción de IFN-γ en PBMC procedentes de donantes positivos en PPD.

Se generaron dos líneas de células T CD4+ de donantes diferentes contra células dendríticas infectadas de M. tuberculosis usando la anterior metodología. El escrutinio de la biblioteca de expresión de ADNc de M. tuberculosis descrito anteriormente usando esta línea celular dio como resultado el aislamiento de dos clones denominados Tb867 y Tb391. Se descubrió que la secuencia de ADNc determinada para Tb867 (SEQ ID NO: 102) es idéntica a la del cósmido SCY22G10 de M. tuberculosis identificado previamente, con el marco de lectura abierto reactivo candidato que codifica una proteína quinasa de M. tuberculosis de 750 aminoácidos. La comparación de la secuencia de ADNc determinada para Tb391 (SEQ ID NO: 103) con las del banco de genes no reveló homologías significativas con secuencias conocidas.

En estudios adicionales, se generaron líneas de células T CD4+ contra filtrado de cultivo de M. tuberculosis, esencialmente como se ha esbozado antes, y se usaron para escrutar la biblioteca de expresión de ADNc de M. tuberculosis Erdman descrita anteriormente. Se aislaron cinco clones reactivos, referidos como Tb431, Tb472, Tb470, Tb838 y Tb962. Las secuencias de ADNc determinadas para Tb431, Tb472, Tb470 y Tb838 se proporcionan en las SEQ ID NO: 11, 12, 104 y 105, respectivamente, proporcionándose las secuencias de ADNc determinadas para el Tb962 en las SEQ ID NO: 106 y 107. La secuencia de aminoácidos predicha correspondiente a Tb431 se proporciona en la SEQ ID NO: 15.

Estudios posteriores condujeron al aislamiento de una secuencia de ADNc de longitud completa para Tb472 (SEQ ID NO: 108). Se sintetizaron péptidos solapados y se usaron para identificar el marco de lectura abierto reactivo. La secuencia de aminoácidos predicha correspondiente a la proteína codifica por Tb472 (denominada MSL) se proporciona en la SEQ ID NO: 109. La comparación de las secuencias correspondientes a Tb472 y MSL con las del banco de genes, tal como se ha descrito antes, no reveló homología con secuencias conocidas. Se sintetizaron quince péptidos solapados con la secuencia de MSL (referidos como MSL-1 – MSL-15; SEQ ID NO: 110-124, respectivamente) y se examinó, tal como se describe más adelante, su capacidad para estimular la proliferación de células T y la producción de IFN-γ en una línea de células T CD4+ generada contra filtrado de cultivo de M. tuberculosis. Se observó que los péptidos denominados MSL-10 (SEQ ID NO: 119) y MSL-11 (SEQ ID NO: 120) presentaban el mayor nivel de reactividad.

La comparación de la secuencia de ADNc determinada para Tb838 con las del banco de genes reveló una identidad con el cósmido SCY07H7 de M. tuberculosis identificado previamente. La comparación de las secuencias de ADNc determinadas para el clon Tb962 con las del banco de genes reveló algo de homología con dos cósmidos de M. tuberculosis identificados previamente, uno que codifica una porción de bactoferritina. Sin embargo, no se observó que la bactoferritina recombinante fuera reactiva con la línea de células T usada para aislar el Tb962.

El clon Tb470, descrito anteriormente, se usó para recuperar un marco de lectura abierto de longitud completa (SEQ ID NO: 125) que mostró homología con TbH9 y que se observó codificaba un antígeno de 40 kDa, referido como Mtb40. La secuencia de aminoácidos determinada para el Mtb40 se proporciona en la SEQ ID NO: 126. De forma similar, ESTUDIOS POSTERIORES CONDUJERON AL AISLAMIENTO DE LA SECUENCIA DE ADNc DE LONGITUD COMPLETA CORRESOPONDIENTE A TB431, PROPORCIONADA EN LA SEQ ID NO: 83, que se determinó contenía un marco de lectura abierto que codifica Mtb40. También se observó que el Tb470 y el Tb431 contenían un marco de lectura abierto potencial que codifica un antígeno de tipo U-ORF.

El escrutinio de una biblioteca de expresión de ADNc de M. tuberculosis Erdman con múltiples líneas de células T CD4+ generada contra filtrado de cultivo de M. tuberculosis, dio como resultado el aislamiento de tres clones, referidos como Tb366, Tb433 y Tb439. Las secuencias de ADNc determinadas para Tb366, Tb433 y Tb439 se proporcionan en las SEQ ID NO: 127, 128 y 129, respectivamente. La comparación de estas secuencias con las del banco de genes no reveló homologías significativas con el Tb366. Se observó que el Tb433 muestra algo de homología con el antígeno MPT83 de M. tuberculosis identificado previamente. Se observó que el Tb439 muestra una identidad del 100% con el cósmido SCY02B10 de M. tuberculosis aislado previamente.

Se generó una línea de células T CD4+ contra PPD de M. tuberculosis, esencialmente descrita antes, y se usó para escrutar la anterior biblioteca de expresión de ADNc de M. tuberculosis Erdman. Se aisló un clon reactivo (referido como Tb372), proporcionándose las secuencias de ADNc determinadas en las SEQ ID NO: 130 y 131. La comparación de estas secuencias con las del banco de genes no reveló homologías significativas.

En estudios adicionales, el escrutinio de una biblioteca de expresión de ADNc de M. tuberculosis con una línea de células T CD4+ generada contra células dendríticas que habían sido infectadas con tuberculosis durante 8 días, tal como se ha descrito anteriormente, condujo al aislamiento de dos clones denominados Tb390R5C6 y Tb390R2C11. La secuencia de ADNc determinada para el Tb390R5C6 se proporciona en la SEQ ID NO: 132, proporcionándose las secuencias de ADNc determinadas para el Tb390R2C11 en las SEQ ID NO: 133 y 134. Se observó que el Tb390R5C6 mostraba una identidad del 100% con un cósmido de M. tuberculosis identificado previamente.

En estudios posteriores; la metodología descrita anteriormente se usó para escrutar una biblioteca de ADN genómico de M. tuberculosis preparada como se indica a continuación. Se desgajó ADN genómico de la cepa Erdman de M. tuberculosis hasta un tamaño medio de 2 kb, y se redondearon los extremos con polimerasa Klenow, seguido de la adición de adaptadores EcoRI. Seguidamente se ligó el injerto en el vector fago Screen (Novagen, Madison, WI) y se empaquetó in vitro usando el extracto PhageMaker (Novagen). La biblioteca de fagos (denominada biblioteca Erd λScreen) se amplificó y se convirtió una porción en una biblioteca de expresión de plásmidos mediante un mecanismo de autosubclonación usando la cepa BM25.8 de E. coli (Novagen). Se purificó el ADN de plásmido a partir de cultivos de BM25.8 que contenían recombinantes pSCREEN y se usó para transformar células competentes de la cepa de expresión anfitriona BL21 (DE3)pLysS. Se llevaron alícuotas de las células transformadas a placas de microtitulación de 96 pocillos, poniendo en cada pocillo un conjunto de aproximadamente 50 colonias. Se indujeron placas de réplica de formato de biblioteca de plásmido de 96 pocillos con IPTG para permitir la expresión de proteína recombinante. Después de la inducción, las placas fueron centrifugadas hasta obtener una partícula de E. coli que fue usada directamente en la clonación de expresión de células T de una línea de células T CD4+ preparada a partir de un donante positivo en PPD (donante 160), tal como se ha descrito anteriormente. Los conjuntos que contenían antígenos de células T de M. tuberculosis que expresan E. coli fueron separados a continuación hasta obtener colonias individuales, y se volvieron a evaluar de un modo similar para identificar coincidencias positivas.

El escrutinio de la línea de células T procedente del donante 160 con una librería Erd λScreen de placa de 96 pocillos proporcionó un total de nueve coincidencias positivas. Experimentos previos de escrutinio de la biblioteca pBSK descrita anteriormente con células T del donante 160 sugirieron que la mayoría o todos los clones positivos serían TbH-9, Tb38-1 ó MTI, o variantes de los mismos. Sin embargo, el análisis de transferencia Southern reveló que sólo tres pocillos se hibridaron con una sonda mixta de TbH-9, Tb38-1 y MTI. De los seis pocillos positivos restantes, se observó que dos eran idénticos. Las secuencias de ADNc 5’ determinadas para dos de los clones aislados (referidos como Y1-26C1 e Y1-86C11) se proporcionan en las SEQ ID NO: 135 y 136, respectivamente. La secuencia de ADNc de longitud completa correspondiente al clon aislado denominado hTcc#1 se proporciona en la SEQ ID NO: 137, proporcionándose la correspondiente secuencia de aminoácidos predicha en la SEQ ID NO: 138. La comparación de las secuencias de hTcc#1 con las del banco de genes, como se ha descrito anteriormente, reveló algo de homología con el cósmido MTCY07H7B.06 de M. tuberculosis previamente aislado.

Ejemplo 2

Inducción de la proliferación de células T y de la producción de interferón-γ mediante antígenos de M. Tuberculosis

La capacidad de los antígenos de M. tuberculosis recombinantes para inducir la proliferación de células T y la producción de interferón γ se puede determinar como se indica a continuación.

Las proteínas pueden ser inducidas mediante IPTG y purificadas mediante elución de gel, tal como se describe en Skeiky y col., J. Exp. Med., 1995, 181: 1527-1537. Los polipéptidos purificados se escrutan a continuación para determinar su capacidad para inducir la proliferación de células T en preparaciones de PBMC. Las PBMCs procedentes de donantes que se sabe son positivos en el ensayo cutáneo de PPD y de los cuales se sabe que sus células T proliferan como respuesta a PPD, son cultivadas en un medio que comprende RPMI 1640 suplementado con un 10% de conjunto de suero humano y 50 μg/mL de gentamicina. Se añaden los polipéptidos purificados por duplicado en concentraciones de 0,5 a 10 μg/mL. Después de seis días de cultivo en placas de 96 pocillos de fondo redondo en un volumen de 200 μL, se retiran 50 μL de medio de cada pocillo para la determinación de los niveles de IFN-γ, tal como se describe a continuación. Las placas son pulsadas entonces con 1 μCi/pocillo de timidina tritiada durante otras 18 horas, son recolectadas y se determina la captación de tritio usando un contador de centelleo de gas. Las fracciones que dan como resultado la proliferación en ambas réplicas en un nivel tres veces superior a la proliferación observada en células cultivadas únicamente en medio son consideradas positivas.

El IFN-γ se mide usando un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA). Las placas ELISA son recubiertas con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a IFN-γ humano (PharMingen, San Diego, CA) en PBS durante cuatro horas a temperatura ambiente. A continuación los pocillos son bloqueados con PBS que contiene un 5% (p/v) de leche desnatada deshidratada durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas son lavadas seis veces en PBS/0,2% TWEEN-20 y las muestras diluidas 1:2 en medio de cultivo en las placas ELISA son incubadas durante una noche a temperatura ambiente. Las placas son lavadas nuevamente y a cada pocillo se añade un suero de IFNγ policlonal de conejo anti-humano diluido 1:3000 en PBS/10% suero normal de cabra. Entonces las placas son incubadas durante dos horas a temperatura ambiente, lavadas, y se añade IgG anti-conejo de rábano acoplada a peroxidasa (Sigma Chemical So., St. Louis, MO) con una dilución 1:2000 en PBS/5% de leche desnatada deshidratada. Después de otras dos horas de incubación a temperatura ambiente, las placas son lavadas y se añade sustrato TMB. La reacción es detenida después de 20 minutos con ácido sulfúrico 1 N. Se determina la densidad óptica a 450 nm usando 570 nm como longitud de onda de referencia. Las fracciones que dan como resultado en las dos réplicas una DO del doble que la DO media de células cultivadas únicamente en medio, más 3 desviaciones estándar, son consideradas positivas.

Ejemplo 3 Purificación y caracterización de polipéptidos de M. Tuberculosis usando líneas de células T CD4+ generadas a partir de un modelo de M. Tuberculosis de ratón

La infección de ratones C57BL/6 con M. tuberculosis da como resultado el desarrollo de una enfermedad progresiva durante aproximadamente 2-3 semanas. La progresión de la enfermedad es detenida entonces como consecuencia de la aparición de una respuesta inmune mediada por células T fuertemente protectora. Este modelo de infección se usó para generar líneas de células T capaces de reconocer antígenos protectores de M. tuberculosis.

Específicamente, se obtuvieron células de bazo de ratones C57BL/6 infectados con M. tuberculosis durante 28 días y se usaron para activar líneas de células T específicas anti-M. tuberculosis tal como se ha descrito anteriormente. Se usaron las líneas de células T CD4+ resultantes, en conjunción con células (de bazo) normales presentadoras de antígeno procedentes de ratones C57BL/6, para escrutar la biblioteca Erd λScreen de M. tuberculosis descrita anteriormente. Se seleccionó uno de los conjuntos reactivos de la biblioteca, que se descubrió era altamente estimulador de células T, y se aisló el correspondiente clon activo (referido como Y288C10).

El secuenciamiento del clon Y288C10 reveló que contenía dos genes potenciales, emparejados. Las secuencias de ADNc determinadas para estos dos genes (referidos como mTCC#1 y mTCC#2) se proporcionan en las SEQ ID NO: 139 y 140, respectivamente, proporcionándose las correspondientes secuencias de aminoácidos en las SEQ ID NO: 141 y 142, respectivamente. La comparación de estas secuencias con las del banco de genes reveló una identidad con secuencias desconocidas, observadas previamente en el cósmido MTY21C12 de M. tuberculosis. Se observó que las secuencias de aminoácidos predichas correspondientes a mTCC#1 y mTCC#2 mostraban algo de homología con miembros previamente identificados de la familia de proteínas TbH9, discutida anteriormente.

Ejemplo 4

Síntesis de polipéptidos sintéticos

Los polipéptidos pueden sintetizarse en un sintetizador de péptidos Millipore 9050 usando química FMOC con activación con HPTU (hexafluorofosfato de o-benzotriazol-N,N,N’,N’-tetrametiluronio). Se puede acoplar una secuencia Gly-Cys-Gly al extremo amino del péptido para proporcionar un método de conjugación o marcado del péptido. La separación de los péptidos del soporte sólido puede llevarse a cabo usando la siguiente mezcla de ruptura: ácido trifluoroacético:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Después de someter a ruptura durante 2 horas, los péptidos pueden ser precipitados en metil t-butil éter frío. A continuación, las partículas de péptidos pueden disolverse en agua con un 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) y ser liofilizadas antes de purificación mediante HPLC de fase inversa con una columna C18. Para eluir los péptidos, se puede usar un gradiente de 0%60% de acetonitrilo (que contiene un 0,1% de TFA) en agua (que contiene un 0,1% de TFA). Después de la liofilización de las fracciones puras, se pueden caracterizar los péptidos usando espectrometría de masas de electropulverización y análisis de aminoácidos.

LISTADO DE SECUENCIAS

(1): INFORMACIÓN GENERAL:

(i): SOLICITANTES: Alderson, Mark Dillon, Davin C. Skeiky, Yasir A.W. Campos-Neto, Antonio

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTO PARA INMUNOTERAPIA Y DIAGNOSIS DE LA TUBERCULOSIS, Y MÉTODOS PARA SU USO

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 144

(iv): DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

(A): DESTINATARIO: SEED and BERRY

(B): CALLE: 6300 Coumbia Center, 701 Fifth Ave.

(C): CUIDAD: Seattle

(D): ESTADO: Washington

(E): PAÍS: EE.UU.

(F): CÓDIGO POSTAL: 98104

(v): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

(A): TIPO DE MEDIO: disquete

(B): ORDENADOR: Compatible con PC IBM

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): PROGRAMA: PatentIn Edición nº 1.0, Versión nº 1.30

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-MAYO- 1998

(C): CLASIFICACIÓN:

(viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

(A): NOMBRE: Maki, David J.

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 31,392

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 210121.440C1

(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

(A): TELÉFONO: 206-622-4900

(B): TELEFAX: 206-682-6031

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1886 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2305 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1742 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2836 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:5:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 900 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:6:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1905 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:7:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2921 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:8:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1704 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:9:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2286 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:10:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1136 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:11:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 967 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:12:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 585 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: doble

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:12:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:13:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 144 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:13:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:14:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 352 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:15:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 141 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:15:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:16:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 58 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:16:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:17:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 67 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:17:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:18:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 58 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:18:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:19:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 94 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:20:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:20:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:21:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 94 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:21:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:22:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 69 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:22:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:23:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 94 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:23:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:24:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 52 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:24:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:25:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 94 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:25:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:26:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 98 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:26:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:27:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 94 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:27:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:28:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 81 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:28:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:29:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 94 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:29:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:30:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:30:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:31:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 94 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:31:

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 32:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 99 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:32:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:33:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 99 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:33:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:34:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:34:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:35:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:35:

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:36:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:36:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:37:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:37:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:38:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:38:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:39:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:39:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:40:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:40:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:41:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:41:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:42:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:42:

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:42:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:43:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:43:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:44:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:44:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:45:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:45:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:46:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:45:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:47:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:47:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:48:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:48:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:49:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:16 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:49:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:50:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:17 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:50:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:51:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:51:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:52:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:52:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:53:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:53:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:54:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:54:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:55:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:55:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:56:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:56:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:57:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:57:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:58:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:16 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:58:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:59:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:59:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:60:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:60:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:61:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:18 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:61:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:62:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:62:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:63:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:63:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:64:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

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(A): LONGITUD:15 aminoácidos

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(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

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(A) ORGANISMO: Mycobacterium tuberculosis

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:14 aminoácidos

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(A): LONGITUD:1784 pares de bases

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:766 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:104:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:1231 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:2041 pares de bases

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:1202 pares de bases

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:496 pares de bases

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:849 pares de bases

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:97 aminoácidos

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(A): LONGITUD:15 aminoácidos

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

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(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:117:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:15 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:124:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:18 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:124:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:125:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:1752 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:125:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:126:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:400 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:127:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:474 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:1431 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:129:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:279 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:129:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:130:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:1470 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:130:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:131:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:1059 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:131:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:153 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:132:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:387 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:134:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:387 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:480 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:587 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:1200 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:137:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:138:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:392 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:138:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:139:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:439 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:139:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:140:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:1441 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:140:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:141:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:99 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:141:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:142:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:423 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:142:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:143:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:97 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:143:

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:144:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD:99 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:144:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que comprende:

(i)

la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138;

(ii)

una variante inmunogénica de la SEQ ID NO: 138, en donde dicha variante tiene al menos un 90% de identidad respecto a la SEQ ID NO: 138;

(iii) una porción inmunogénica de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
2.

El polipéptido aislado según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
3.

El polipéptido aislado según la reivindicación 1, que consiste en una variente inmunogénica de la SEQ ID NO: 138, donde dicha variante tiene al menos un 90% de identidad respecto a la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
4.

El polipéptido aislado según la reivindicación 1, que consiste en una porción inmunogénica de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
5.

El polipéptido aislado según la reivindicación 1, que comprende (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, o (ii) una variante inmunogénica de la SEQ ID NO: 138, donde dicha variante tiene al menos un 90% de identidad con respecto a la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
6.

El polipéptido aislado según la reivindicación 1, que comprende (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, o (ii) una porción inmunogénica de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
7.

El polipéptido aislado según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
8.

Una proteína de fusión que comprende un polipéptido que comprende:

(i)

la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138;

(ii)

una variante inmunogénica de la SEQ ID NO: 138, donde dicha variante tiene al menos un 90% de identidad respecto a la SEQ ID NO: 138; ó

(iii) una porción inmunogénica de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, y un antígeno de M. tuberculosis conocido.
9.

Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende:

(i)

la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138;

(ii)

una variante inmunogénica de la SEQ ID NO: 138, donde dicha variante tiene al menos un 90% de identidad respecto a la SEQ ID NO: 138; ó

(iii) una porción inmunogénica de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
10.

La molécula de ADN aislada según la reivindicación 9, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138 ó (ii) una variante inmunogénica de la SEQ ID NO: 138 donde dicha variante tiene al menos un 90% de identidad respecto a la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
11.

La molécula de ADN aislada según la reivindicación 9, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende (i) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138 ó (ii) una porción inmunogénica de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
12.

La molécula de ADN aislada según la reivindicación 9, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, para uso como medicamento.
13.

Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión según la reivindicación 8.
14.

Una composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una proteína de fusión según la reivindicación 8 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
15.

Una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 y un vehículo fisiológicamente aceptable.
16.

Una vacuna que comprende al menos un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una proteína de fusión según la reivindicación 8 y un potenciador de respuesta inmune no específico.
17.

Una vacuna que comprende al menos una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 y un potenciador de la respuesta inmune no específico.
18.

Una vacuna de la reivindicación 16 ó de la 17, donde el potenciador de la respuesta inmune no específico es un adyuvante.
19.

El uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infección de Mycobacterium tuberculosis.
20.

El uso según la reivindicación 19, donde el polipéptido es una proteína de fusión según la reivindicación 8.
21.

El uso de una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende:

(i)

la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138;

(ii)

una variante inmunogénica de la SEQ ID NO: 138, donde dicha variante tiene al menos un 90% de identidad respecto a la SEQ ID NO: 138; ó

(iii) una porción inmunogénica de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de tuberculosis.
22.

El uso de un polipéptido que comprende:

(i)

la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138;

(ii)

una variante inmunogénica de la SEQ ID NO: 138, donde dicha variante tiene al menos un 90% de identidad respecto a la SEQ ID NO: 138; ó

(iii) una porción inmunogénica de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 138, en la fabricación de un medio diagnóstico para tuberculosis.