ES2324529T3

ES2324529T3 - Compuestos para inmunoterapia y diagnostico de la tuberculosis.

Info

Publication number: ES2324529T3
Application number: ES03005931T
Authority: ES
Inventors: Steven G. Reed; Yasir A.W. Skeiky; Antonio Campos-Neto; Raymond L. Houghton; Thomas S. Vedvick; Daniel R. Twardzik; Davin C. Dillon
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2009-08-10
Anticipated expiration: 2016-08-30
Also published as: EP1398379A2; ATE252640T1; TR200901109T1; NO980883L; DE69636487T2; EP1347055A3; CN1117149C; JP2001517069A; NO20070621L; JP2009159982A; EP1203817B9; CZ62898A3; EP1347055B1; ES2262595T3; NO980883D0; BR9610262A; HK1059282A1; NO20070619L; EP1712628A3; SI0851927T1

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o una de sus variantes que tiene una sustitución conservadora de aminoácidos.

Description

Compuestos para inmunoterapia y diagnóstico de la tuberculosis.

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a la detección, el tratamiento y la prevención de la infección por Mycobacterium tuberculosis. La invención se refiere más particularmente a polipéptidos que comprenden un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, o una de sus variantes, y al uso de dichos polipéptidos para el diagnóstico y la vacunación contra la infección por Mycobacterium tuberculosis.

Fundamento de la invención

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica que generalmente es causada por la infección con Mycobacterium tuberculosis. Es una enfermedad importante en los países desarrollados, así como un problema creciente en zonas desarrolladas del mundo, con aproximadamente 8 millones de nuevos casos y 3 millones de muertes cada año. Aunque la infección puede ser asintomática durante un periodo de tiempo considerable, la enfermedad se manifiesta más comúnmente en forma de una inflamación aguda de los pulmones, dando como resultado fiebre y una tos molesta. Si se deja sin tratar se producen graves complicaciones y típicamente la muerte.

Aunque la tuberculosis puede controlarse generalmente usando una terapia prolongada con antibióticos, dicho tratamiento no es suficiente para prevenir la extensión de la enfermedad. Los individuos infectados pueden ser asintomáticos, pero contagiosos, durante algún tiempo. Además, aunque es crítico el cumplimiento con el régimen de tratamiento, el comportamiento del paciente es difícil de controlar. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, lo cual puede conducir a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de resistencia a los fármacos.

Inhibir la extensión de la tuberculosis requiere una vacunación eficaz y un diagnóstico preciso y temprano de la enfermedad. Comúnmente, la vacunación con bacterias vivas es el método más eficaz para inducir una inmunidad protectora. El Mycobacterium más común empleado para este fin es el Bacillus-Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Sin embargo, la seguridad y eficacia del BCG es una fuente de controversia y algunos países, como Estados Unidos, no vacunan en general a la población. El diagnóstico se consigue comúnmente usando un ensayo en la piel, que implica la exposición intradérmica a un derivado purificado de la proteína (abreviadamente PPD por la expresión inglesa protein-purified derivative) tuberculina. Las respuestas de los linfocitos T específicos del antígeno dan como resultado una induración medible en el sitio de la inyección a las 48-72 horas después de la inyección, lo cual indica una exposición a los antígenos micobacterianos. Sin embargo la sensibilidad y la especificidad han sido un problema con este ensayo, e individuos vacunados con BCG no pueden ser distinguidos de individuos infectados.

Aunque los macrófagos han demostrado actuar como los principales efectores de la inmunidad para M. tuberculosis, los inductores predominantes de dicha inmunidad son los linfocitos T. La función esencial de los linfocitos T en la protección contra la infección por M. tuberculosis se ilustra por la frecuente aparición de M. tuberculosis en paciente con SIDA, debido al empobrecimiento de linfocitos T CD4 asociados con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana virus (VIH). Los linfocitos T CD4 reactivos con Mycobacterium han demostrado ser potentes productores de gamma-interferón (IFN-\gamma), el cual, a su vez, ha demostrado desencadenar los efectos anti-micobacterianos de los macrofágos en ratones. Aunque la función del IFN-\gamma en seres humanos es menos clara, hay estudios que han mostrado que la 1,25-dihidroxi-vitamina D3, bien sea sola o en combinación con IFN-\gamma o el factor de necrosis tumoral-alfa, activa a los macrófagos humanos para inhibir la infección por M. tuberculosis. Además, se sabe que el IFN-\gamma estimula los macrófagos humanos para sintetizar la 1,25-dihidroxivitamina D3. Similarmente, la IL-12 ha demostrado desempeñar una función en estimular la resistencia a la infección por M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de la infección por M. tuberculosis véase Chan y Kaufmann en Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC, 1994.

Por consiguiente, existe en la técnica la necesidad de vacunas y métodos mejorados para impedir, tratar y detectar la tuberculosis. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

Expresado de un modo breve, esta invención proporciona compuestos y su uso para prevenir y diagnosticar la tuberculosis. En un aspecto, se proporcionan polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, o una variante de SEQ ID No: 66 que tiene una sustitución conservadora de aminoácidos.

En aspectos relacionados, también se proporcionan secuencias de DNA que codifican los polipéptidos anteriores, vectores de expresión que comprenden estas secuencias de DNA y células hospedantes transformadas o transfectadas con dichos vectores de expresión.

En otro aspecto, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un primer y un segundo polipéptido de la invención o, alternativamente, un polipéptido de la invención y un antígeno conocido de M. tuberculosis.

Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los polipéptidos anteriores, o una molécula de DNA que codifica dichos polipéptidos, y un vehículo fisiológicamente aceptable. La invención también proporciona vacunas que comprenden uno o más de los polipéptidos como los que se han descrito antes y un potenciador de la respuesta inmune no específico, junto con vacunas que comprenden una o más secuencias de DNA que codifican dichos polipéptidos y un potenciador de la respuesta inmune no específico.

En incluso otro aspecto, se describen métodos para inducir inmunidad protectora en un paciente, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de uno o más de los polipéptidos anteriores.

En otros aspectos de esta invención, se proporcionan kits de diagnóstico para detectar tuberculosis en un paciente. Los métodos descritos comprenden poner en contacto células dérmicas de un paciente con uno o más de los polipéptidos anteriores y detectar una respuesta inmune de la piel del paciente. Los kits de diagnóstico comprenden uno o más de los polipéptidos anteriores en combinación con un aparato suficiente para poner en contacto el polipéptido con las células dérmicas de un paciente.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes tras la lectura de la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos y los identificadores de secuencias

Las Figuras 1A y B ilustran estimulación de la proliferación y la producción de interferón-\gamma en linfocitos T procedentes de un primer y un segundo donantes inmunes a M. tuberculosis, respectivamente, por los antígenos de 14 Kd, 20 Kd y 26 Kd descritos en el Ejemplo 1.

La Figura 2 ilustra la estimulación de la proliferación y la producción de interferón-\gamma en linfocitos T procedentes de individuos inmunes a M. tuberculosis por dos polipéptidos representativos TbRa3 y TbRa9.

SEQ. ID NO. 1 es la secuencia de DNA de TbRa1.

SEQ. ID NO. 2 es la secuencia de DNA de TbRa10.

SEQ. ID NO. 3 es la secuencia de DNA de TbRa11.

SEQ. ID NO. 4 es la secuencia de DNA de TbRa12.

SEQ. ID NO. 5 es la secuencia de DNA de TbRa13.

SEQ. ID NO. 6 es la secuencia de DNA de TbRa16.

SEQ. ID NO. 7 es la secuencia de DNA de TbRa17.

SEQ. ID NO. 8 es la secuencia de DNA de TbRa18.

SEQ. ID NO. 9 es la secuencia de DNA de TbRa19.

SEQ. ID NO. 10 es la secuencia de DNA de TbRa24.

SEQ. ID NO. 11 es la secuencia de DNA de TbRa26.

SEQ. ID NO. 12 es la secuencia de DNA de TbRa28.

SEQ. ID NO. 13 es la secuencia de DNA de TbRa29.

SEQ. ID NO. 14 es la secuencia de DNA de TbRa2A.

SEQ. ID NO. 15 es la secuencia de DNA de TbRa3.

SEQ. ID NO. 16 es la secuencia de DNA de TbRa32.

SEQ. ID NO. 17 es la secuencia de DNA de TbRa35.

SEQ. ID NO. 18 es la secuencia de DNA de TbRa36.

SEQ. ID NO. 19 es la secuencia de DNA de TbRa4.

SEQ. ID NO. 20 es la secuencia de DNA de TbRa9.

SEQ. ID NO. 21 es la secuencia de DNA de TbRaB.

SEQ. ID NO. 22 es la secuencia de DNA de TbRaC.

SEQ. ID NO. 23 es la secuencia de DNA de TbRaD.

SEQ. ID NO. 24 es la secuencia de DNA de YYWCPG.

SEQ. ID NO. 25 es la secuencia de DNA de AAMK.

SEQ. ID NO. 26 es la secuencia de DNA de TbL-23.

SEQ. ID NO. 27 es la secuencia de DNA de TbL-24.

SEQ. ID NO. 28 es la secuencia de DNA de TbL-25.

SEQ. ID NO. 29 es la secuencia de DNA de TbL-28.

SEQ. ID NO. 30 es la secuencia de DNA de TbL-29.

SEQ. ID NO. 31 es la secuencia de DNA de TbH-5.

SEQ. ID NO. 32 es la secuencia de DNA de TbH-8.

SEQ. ID NO. 33 es la secuencia de DNA de TbH-9.

SEQ. ID NO. 34 es la secuencia de DNA de TbM-1.

SEQ. ID NO. 35 es la secuencia de DNA de TbM-3.

SEQ. ID NO. 36 es la secuencia de DNA de TbM-6.

SEQ. ID NO. 37 es la secuencia de DNA de TbM-7.

SEQ. ID NO. 38 es la secuencia de DNA de TbM-9.

SEQ. ID NO. 39 es la secuencia de DNA de TbM-12.

SEQ. ID NO. 40 es la secuencia de DNA de TbM-13.

SEQ. ID NO. 41 es la secuencia de DNA de TbM-14.

SEQ. ID NO. 42 es la secuencia de DNA de TbM-15.

SEQ. ID NO. 43 es la secuencia de DNA de TbH-4.

SEQ. ID NO. 44 es la secuencia de DNA de TbH-4-FWD.

SEQ. ID NO. 45 es la secuencia de DNA de TbH-12.

SEQ. ID NO. 46 es la secuencia de DNA de Tb38-1.

SEQ. ID NO. 47 es la secuencia de DNA de Tb38-4.

SEQ. ID NO. 48 es la secuencia de DNA de TbL-17.

SEQ. ID NO. 49 es la secuencia de DNA de TbL-20.

SEQ. ID NO. 50 es la secuencia de DNA de TbL-21

SEQ. ID NO. 51 es la secuencia de DNA de TbH-16.

SEQ. ID NO. 52 es la secuencia de DNA de DPEP.

SEQ. ID NO. 53 es la secuencia de aminoácidos deducida de DPEP:

SEQ. ID NO. 54 es la secuencia proteínica del antígeno N-terminal de DPV.

SEQ. ID NO. 55 es la secuencia proteínica del antígeno N-terminal de AVGS.

SEQ. ID NO. 56 es la secuencia proteínica del antígeno N-terminal de AAMK.

SEQ. ID NO. 57 es la secuencia proteínica del antígeno N-terminal de YYWC.

SEQ. ID NO. 58 es la secuencia proteínica del antígeno N-terminal de DIGS.

SEQ. ID NO. 59 es la secuencia proteínica del antígeno N-terminal de AEES.

SEQ. ID NO. 60 es la secuencia proteínica del antígeno N-terminal de DPEP.

SEQ. ID NO. 61 es la secuencia proteínica del antígeno N-terminal de APKT.

SEQ. ID NO. 62 es la secuencia proteínica del antígeno N-terminal de DPAS.

SEQ. ID NO. 63 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa1.

SEQ. ID NO. 64 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa10.

SEQ. ID NO. 65 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa11.

SEQ. ID NO. 66 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa12.

SEQ. ID NO. 67 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa13.

SEQ. ID NO. 68 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa16.

SEQ. ID NO. 69 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa17.

SEQ. ID NO. 70 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa18.

SEQ. ID NO. 71 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa19.

SEQ. ID NO. 72 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa24.

SEQ. ID NO. 73 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa26.

SEQ. ID NO. 74 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa28.

SEQ. ID NO. 75 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa29.

SEQ. ID NO. 76 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa2A.

SEQ. ID NO. 77 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa3.

SEQ. ID NO. 78 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa32.

SEQ. ID NO. 79 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa35.

SEQ. ID NO. 80 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa36.

SEQ. ID NO. 81 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa4.

SEQ. ID NO. 82 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRa9.

SEQ. ID NO. 83 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRaB.

SEQ. ID NO. 84 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRaC.

SEQ. ID NO. 85 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbRaD.

SEQ. ID NO. 86 es la secuencia de aminoácidos deducida de YYWCPG.

SEQ. ID NO. 87 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbAAMK.

SEQ. ID NO. 88 es la secuencia de aminoácidos deducida de Tb38-1.

SEQ. ID NO. 89 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-4.

SEQ. ID NO. 90 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-8.

SEQ. ID NO. 91 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-9.

SEQ. ID NO. 92 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-12.

SEQ. ID NO. 93 es la secuencia de aminoácidos del péptido 1 de Tb38-1.

SEQ. ID NO. 94 es la secuencia de aminoácidos del péptido 2 de Tb38-1.

SEQ. ID NO. 95 es la secuencia de aminoácidos del péptido 3 de Tb38-1.

SEQ. ID NO. 96 es la secuencia de aminoácidos del péptido 4 de Tb38-1.

SEQ. ID NO. 97 es la secuencia de aminoácidos del péptido 5 de Tb38-1.

SEQ. ID NO. 98 es la secuencia de aminoácidos del péptido 6 de Tb38-1.

SEQ. ID NO. 99 es la secuencia de DNA de DPAS.

SEQ. ID NO. 100 es la secuencia de aminoácidos deducida de DPAS.

SEQ. ID NO. 101 es la secuencia de DNA de DPV.

SEQ. ID NO. 102 es la secuencia de aminoácidos deducida de DPV.

SEQ. ID NO. 103 es la secuencia de DNA de ESAT-6.

SEQ. ID NO. 104 es la secuencia de aminoácidos deducida de ESAT-6.

SEQ. ID NO. 105 es la secuencia de DNA de TbH-8-2.

SEQ. ID NO. 106 es la secuencia de DNA de TbH-9FL.

SEQ. ID NO. 107 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-9FL.

SEQ. ID NO. 108 es la secuencia de DNA de TbH-9-1.

SEQ. ID NO. 109 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-9-1.

SEQ. ID NO. 110 es la secuencia de DNA de TbH-9-4.

SEQ. ID NO. 111 es la secuencia de aminoácidos deducida de TbH-9-4.

SEQ. ID NO. 112 es la secuencia de DNA de Tb38-1F2 IN.

SEQ. ID NO. 113 es la secuencia de DNA de Tb38-2F2 RP.

SEQ. ID NO. 114 es la secuencia de aminoácidos deducida de Tb37-FL.

SEQ. ID NO. 115 es la secuencia de aminoácidos deducida de Tb38-IN.

SEQ. ID NO. 116 es la secuencia de DNA de Tb38-1F3.

SEQ. ID NO. 117 es la secuencia de aminoácidos deducida de Tb38-1F3.

SEQ. ID NO. 118 es la secuencia de DNA de Tb38-1F5.

SEQ. ID NO. 119 es la secuencia de DNA de Tb38-1F6.

SEQ. ID NO. 120 es la secuencia de aminoácidos N-terminal deducida de DPV.

SEQ. ID NO. 121 es la secuencia de aminoácidos N-terminal deducida de AVGS.

SEQ. ID NO. 122 es la secuencia de aminoácidos N-terminal deducida de AAMK.

SEQ. ID NO. 123 es la secuencia de aminoácidos N-terminal deducida de YYWC.

SEQ. ID NO. 124 es la secuencia de aminoácidos N-terminal deducida de DIGS.

SEQ. ID NO. 125 es la secuencia de aminoácidos N-terminal deducida de AEES.

SEQ. ID NO. 126 es la secuencia de aminoácidos N-terminal deducida de DPEP.

SEQ. ID NO. 127 es la secuencia de aminoácidos N-terminal deducida de APKT.

SEQ. ID NO. 128 es la secuencia de aminoácidos deducida de DPAS.

SEQ. ID NO. 129 es la secuencia proteínica N-terminal del antígeno DPPD.

SEQ. ID NO. 130-133 son las secuencias proteínicas de cuatro fragmentos obtenidos por tratamiento con bromuro de cianógeno de DPPD.

SEQ ID NO. 134 es la secuencia proteínica N-terminal del antígeno XDS.

SEQ ID NO. 135 es la secuencia proteínica N-terminal del antígeno AGD.

SEQ ID NO. 136 es la secuencia proteínica N-terminal del antígeno APE.

SEQ ID NO. 137 es la secuencia proteínica N-terminal del antígeno XYI.

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Descripción detallada de la invención

Como se ha indicado antes, la presente invención se refiere generalmente a composiciones y sus usos para prevenir, tratar y diagnosticar la tuberculosis. Las composiciones de la presente invención incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, o una variante de la SEQ ID NO: 66 que tiene sustitución conservadora de aminoácidos. Los polipéptidos dentro del alcance de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, antígenos de M. tuberculosis solubles e inmunógenos. Un "antígeno de M. tuberculosis soluble" es una proteína de origen M. tuberculosis que está presente en un filtrado de cultivo de M. tuberculosis. Como se usa en la presente memoria, el término "polipéptido" abarca cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), en donde los residuos de aminoácidos están unidos por enlaces covalentes peptídicos. Por tanto, un polipéptido que comprende una porción inmunógena de uno de los antígenos anteriores puede consistir enteramente de la porción inmunógena, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales puede proceder del antígeno de M. tuberculosis natural o pueden ser heterólogas, y dichas secuencias pueden (aunque no necesariamente) ser inmunógenas.

"Inmunógeno", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a la capacidad de desencadenar una respuesta inmune (por ejemplo, celular) en un paciente, tal como un ser humano, y/o en una muestra biológica. En particular, los antígenos que son inmunógenos (y las variantes de dichos antígenos) son capaces de estimular la proliferación celular, la producción de interleuquina-12 y/o la producción de interferón-\gamma en muestras biológicas que comprenden una o más células seleccionadas del grupo de linfocitos T, células naturales asesinas (abreviadamente en lo sucesivo células NK por la expresión inglesa natural killer cells), linfocitos B y macrófagos, en donde las células proceden de un individuo inmune a M. tuberculosis. Los polipéptidos que comprenden uno o más antígenos de M. tuberculosis pueden usarse para detectar la tuberculosis o inducir inmunidad protectora contra la tuberculosis en un paciente.

Las composiciones y usos de esta invención también abarcan variantes de los polipéptidos anteriores. Una "variante", tal como se usa en la presente memoria, es un polipéptido que difiere del antígeno natural solamente en sustituciones conservadoras, tales que se retiene la capacidad del polipéptido para inducir una respuesta inmune. Dichas variantes pueden ser identificadas generalmente modificando una de las secuencias de los polipéptidos anteriores, y evaluando las propiedades inmunógenas del polipéptido modificado usando, por ejemplo, los métodos representativos descritos en la presente memoria.

Una "sustitución conservadora" es una en la que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de tal modo que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente inalteradas. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Un polipéptido puede estar conjugado a una secuencia de señal (o delantera) en el extremo N-terminal de la proteína que co-traduccionalmente o post-traduccionalmente dirige la transferencia de la proteína. El polipéptido también puede estar conjugado a un enlazador u otra secuencia para facilidad de síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la unión polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede estar conjugado a una región Fc de una inmunoglobulina.

En un aspecto relacionado, se describen polipéptidos combinado. Un "polipéptido combinado" es un polipéptido que comprende al menos uno de los polipéptidos inmunógenos anteriores y una o más secuencias inmunógenas adicionales de M. tuberculosis, que están unidos mediante un enlace peptídico formando una sola cadena de aminoácidos. Las secuencias puede estar unidas directamente (es decir, sin aminoácidos intercalados) o pueden estar unidas por medio de una secuencia enlazadora (por ejemplo, Gly-Cys-Gly) que no disminuye significativamente las propiedades inmunógenas de los polipéptidos componentes.

En general, los antígenos de M. tuberculosis, y las secuencias de DNA que codifican dichos antígenos, pueden ser preparados usando cualquiera de una variedad de métodos. Por ejemplo, los antígenos solubles pueden ser aislados del filtrado de cultivos de M. tuberculosis por métodos conocidos por los expertos ordinarios en la técnica, incluyendo cromatografía de cambio iónico y de fase inversa. Los antígenos purificados se evalúan luego por su capacidad para desencadenar una respuesta inmune apropiada (por ejemplo, celular) usando, por ejemplo, los métodos representativos descritos en la presente memoria. Los antígenos inmunógenos pueden ser parcialmente secuenciados usando técnicas tales como química de Edman tradicional. Véase Edman y Berg, Eur. J. Biochem. 80:116-132.1967.

Los antígenos inmunógenos pueden producirse recombinantemente usando una secuencia de DNA que codifica el antígeno, que ha sido insertado en un vector de expresión y expresado en un hospedante apropiado. Las moléculas de DNA que codifican antígenos solubles pueden ser aisladas por escrutinio de una genoteca de expresión apropiada de M. tuberculosis con anti-sueros (por ejemplo, de conejo) producidos específicamente contra antígenos solubles de M. tuberculosis. Las secuencias de DNA que codifican antígenos que pueden o no pueden ser solubles pueden ser identificadas escrutando una genoteca de expresión de cDNA genómico de M. tuberculosis o de expresión de cDNA con sueros obtenidos de pacientes infectados con M. tuberculosis. Tales escrutinios pueden realizarse generalmente usando métodos bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Las secuencias de DNA que codifican antígenos solubles también pueden obtenerse escrutando un cDNA de M. tuberculosis apropiado o una genoteca de cDNA genómico para secuencias de DNA que se hibridan degenerando oligonucleótidos derivados de secuencias parciales de aminoácidos de antígenos solubles aislados. Las secuencias de oligonucleótidos degeneradas para uso en dicho escrutinio pueden ser diseñadas y sintetizadas, y el escrutinio puede realizarse, como se ha descrito (por ejemplo) en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (y las referencia citadas en dicho texto). También puede emplearse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando los oligonucleótidos anteriores en métodos muy conocidos en la técnica, para aislar una sonda de ácido nucleico de un cDNA o una genoteca genómica. El escrutinio de la genoteca puede realizarse luego usando la sonda aislada.

Alternativamente, las genotecas genómicas o de cDNA derivadas de M. tuberculosis pueden escrutarse directamente usando células mononucleares de sangre periférica (abreviadamente en lo sucesivo CMSP) o líneas de linfocitos T o clones derivados de uno o más individuos inmunes a M. tuberculosis. En general, las CMSP y/o los linfocitos T para uso en dichos escrutinios pueden prepararse tal y como se describe a continuación. Los escrutinios directos de genotecas pueden realizarse generalmente analizando mezclas de proteínas recombinantes expresadas en cuanto a su capacidad para inducir proliferación y/o producción de interferón-\gamma en linfocitos T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis. Alternativamente, se pueden seleccionar primeramente antígenos de linfocitos T potenciales basándose en su reactividad con anticuerpos, como se ha descrito antes.

Independientemente del método de preparación, los antígenos (y sus porciones inmunógenas) descritos en la presente memoria (que pueden ser o no ser solubles) tienen la capacidad de inducir una respuesta inmunógena. Más específicamente, los antígenos tienen la capacidad de inducir la proliferación y/o la producción de citoquinas (es decir, la producción de interferón-\gamma y/o la producción de interleuquina-12) en linfocitos T, células NK, linfocitos B y/o macrófagos derivados de un individuo inmune a M. tuberculosis: La selección del tipo de células para uso en evaluar una respuesta inmunógena a un antígeno dependerá, naturalmente, de la respuesta deseada. Por ejemplo, la producción de interleuquina-12 se evalúa más fácilmente usando preparaciones que contienen linfocitos B y/o macrófagos. Un individuo inmune a M. tuberculosis es uno que se considera resistente al desarrollo de tuberculosis en virtud de tener montada una respuesta eficaz de los linfocitos T a M. tuberculosis (es decir, sustancialmente exento de síntomas de la enfermedad). Tales individuos pueden ser identificados basándose en respuestas fuertemente positivas en el ensayo de la piel intradérmica (es decir, induraciones mayores de aproximadamente 10 mm de diámetro) para PPD de tuberculosis y ausencia de signos o síntomas de la enfermedad tuberculosis. Los linfocitos T, las células NK, los linfocitos B y los macrófagos procedentes de individuos inmunes a M. tuberculosis pueden prepararse usando métodos conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, puede emplearse una preparación de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) sin separación adicional de los componentes celulares. Las CMSP pueden prepararse generalmente, por ejemplo, usando centrifugación en gradiente de densidad a través de Ficoll^{TM} (Winthrop Laboratories, NY). Los linfocitos T para uso en los ensayos descritos en la presente memoria también pueden ser purificados directamente a partir de las CMSP. Alternativamente, puede ser empleada una línea de linfocitos T enriquecida reactiva contra las proteínas micobacterianas, o clones de linfocitos T reactivos para proteínas micobacterianas individuales. Tales clones de linfocitos T pueden ser generados, por ejemplo, cultivando las CMSP de individuos inmunes a M. tuberculosis con proteínas micobacterianas durante un periodo de 2 a 4 semanas. Esto permite la expansión de solamente los linfocitos T específicos de proteínas micobacterianas, dando como resultado una línea compuesta solamente de dichas células. Estas células pueden ser clonadas luego y ensayadas con proteínas individuales, usando métodos conocidos por los expertos ordinarios en la técnica, para definir más precisamente la especificidad de los linfocitos T individuales. En general, los antígenos que dan ensayo positivo en valoraciones para la proliferación y/o producción de citoquinas (es decir, producción de interferón-\gamma y/o interleuquina-12) realizados usando linfocitos T, células NK, linfocitos B y/o macrófagos derivados de un individuo inmune a tuberculosis se consideran inmunógenos. Dichas valoraciones se pueden realizar, por ejemplo, usando los métodos representativos descritos más adelante. Las porciones inmunógenas de dichos antígenos pueden ser identificadas usando valoraciones similares, y pueden estar presentes dentro de los polipéptidos descritos en la presente memoria.

La capacidad de un polipéptido (por ejemplo, un antígeno inmunógeno, o una de sus porciones u otras variantes) para inducir la proliferación celular se evalúa poniendo en contacto las células (por ejemplo, los linfocitos T y las células NK) con el polipéptido y midiendo la proliferación de las células. En general, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de aproximadamente 10^{5} células varía desde aproximadamente 10 ng/mL a aproximadamente 100 \mug/mL y preferiblemente es aproximadamente 10 \mug/mL. La incubación del polipéptido con células se realiza típicamente a 37ºC durante aproximadamente seis días. Después de la incubación con el polipéptido, las células se valoran en cuanto la respuesta proliferativa, que puede evaluarse por métodos bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica, tales como la exposición de las células a un pulso de timidina radiomarcada y medir la incorporación del marcador en el DNA celular. En general, un polipéptido que dé como resultado al menos un aumento de tres veces la proliferación por encima del nivel de fondo (es decir, la proliferación observada para células cultivadas sin polipéptido) se considera capaz de inducir la proliferación.

La capacidad de un polipéptido para estimular la producción de interferón -\gamma y/o interleuquina-12 en células puede ser evaluada poniendo en contacto las células con el polipéptido y midiendo el nivel de interferón-\gamma o interleuquina-12 producido por las células. En general, la cantidad de polipéptido que es suficiente para la evaluación de aproximadamente 10^{5} células varía desde aproximadamente 10 ng/mL a aproximadamente 100 \mug/mL y preferiblemente es aproximadamente 10 \mug/mL. El polipéptido puede, pero no necesariamente, estar inmovilizado en un soporte sólido, tal como microbolitas esféricas biodegradables, tales como las descritas en las patentes de EE.UU. 4.897.268 y 5.075.109. La incubación del polipéptido con las células se realiza típicamente a 37ºC durante aproximadamente seis días. Después de la incubación con el polipéptido, las células se valoran en cuanto a la producción de interferón-\gamma y/o interleuquina-12 (o una o más de sus subunidades), pudiendo dichas células evaluarse por métodos conocidos por los expertos ordinarios en la técnica, tales como ensayo con inmunosorbente unido a enzima (ELISA) o, en el caso de la subunidad P70 de IL-12, una valoración biológica, tal como una valoración que mide la proliferación de los linfocitos T. En general, un polipéptido que da como resultado la producción de al menos 50 pg de interferón-\gamma por mL de líquido sobrenadante cultivado (que contiene 10^{4}-10^{5} linfocitos T por mL) se considera capaz de estimular la producción de interferón-\gamma. Un polipéptido que estimula la producción de al menos 10 pg/mL de subunidad P70 de IL-12, y al menos 100 pg/mL de subunidad P40 de IL-12, por 10^{5} macrófagos o linfocitos B (o por 3 x 10^{5} CMSP) se considera capaz de estimular la producción de IL-12.

En general, los antígenos inmunógenos son aquellos antígenos que estimulan la proliferación y la producción de citoquinas (es decir, producción de interferón-\gamma y/o interleuquina-12) en linfocitos T, células NK, linfocitos B y macrófagos procedentes de al menos aproximadamente 25% de individuos inmunes al M. tuberculosis. Entre estos antígenos inmunógenos, pueden distinguirse los polipéptidos que tienen propiedades terapéuticas superiores basadas en la magnitud de las respuestas en las valoraciones anteriores y basadas en el porcentaje de individuos para los cuales se observa una respuesta. Además, los antígenos que tienen propiedades terapéuticas superiores no estimularan la proliferación y la producción de citoquinas in vitro en células procedentes de más de aproximadamente 25% de los individuos que no son inmunes a M. tuberculosis, eliminando con ello las respuestas que no son debidas específicamente a células sensibles a M. tuberculosis. Los antígenos que inducen una respuesta en un alto porcentaje de preparaciones de linfocitos T, células NK, linfocitos B y macrófagos procedentes de individuos inmunes a M. tuberculosis (con una baja incidencia de respuestas en preparaciones de células de otros individuos) tienen propiedades terapéuticas superiores.

Los antígenos con propiedades terapéuticas superiores también pueden ser identificados basándose en su capacidad para disminuir la gravedad de la infección por M. tuberculosis en animales experimentales, cuando se administran como una vacuna. Las preparaciones de vacunas adecuadas para uso en animales experimentales, se describen con detalle más adelante. La eficacia puede determinarse basándose en la capacidad del antígeno de proporcionar al menos aproximadamente una reducción del 50% en el número de bacterias y/o al menos aproximadamente una disminución de 40% en la mortalidad que sigue a la infección experimental. Los animales experimentales adecuados incluyen ratones, cobayas y primates.

Los antígenos que tienen propiedades de diagnóstico superiores pueden ser identificados generalmente basándose en su capacidad para desencadenar una respuesta en un ensayo sobre piel intradérmica realizado a un individuo con tuberculosis activa, pero no en un ensayo realizado a un individuo que no está infectado con M. tuberculosis. Los ensayos en piel pueden realizarse generalmente como se describe más adelante, considerándose positiva una respuesta de una induración de al menos 5 mm.

Las porciones inmunógenas de los antígenos descritos en la presente memoria pueden ser preparadas e identificadas usando técnicas muy conocidas, tales como las resumidas en el texto de Paul, Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, 1993, pp. 243-247 y en las referencias citadas en el mismo. Dichas técnicas incluyen escrutar porciones de polipéptidos del antígeno natural en cuanto a las propiedades inmunógenas. La proliferación representativa y las valoraciones de producción de citoquinas descritas en la presente memoria pueden emplearse generalmente en estos escrutinios. Una porción inmunógena de un polipéptido es una porción que, dentro de dichas valoraciones representativas, genera una respuesta inmune (por ejemplo, proliferación, producción de interferón-\gamma y producción de interleuqina-12) que es sustancialmente similar a la generada por el antígeno de longitud completa. En otras palabras, una porción inmunógena de un antígeno puede generar al menos aproximadamente 20% y preferiblemente aproximadamente 100% de la proliferación inducida por el antígeno de longitud completa en la valoración modelo de proliferación descrita en la presente memoria. Una porción inmunógena también puede, o alternativamente, estimular la producción de al menos aproximadamente 20%, y preferiblemente aproximadamente 100%, del interferón-\gamma y la interleuquina-12 inducidos por el antígeno de longitud completa en el modelo de valoración descrito en la presente memoria.

Las porciones y otras variantes de los antígenos de M. tuberculosis pueden ser generadas por medios sintéticos o recombinantes. Los polipéptidos sintéticos que tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, y generalmente menos de aproximadamente 50 aminoácidos, pueden ser generados usando métodos que son bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden ser sintetizados usando cualquiera de las técnicas de fase sólida comercialmente disponibles, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en donde los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está comercialmente disponible de proveedores tales como Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA, y puede ser hecho funcionar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las variantes de un antígeno natural pueden ser preparadas generalmente usando técnicas de mutagénesis estándares, tales como mutagénesis, específica de un sitio, dirigida por oligonucleótidos. También pueden ser separadas fracciones o fragmentos de la secuencia de DNA usando técnicas estándares para permitir la preparación de polipéptidos truncados.

Los polipéptidos recombinantes que contienen porciones y/o variantes de un antígeno natural pueden ser preparados fácilmente a partir de una secuencia de DNA que codifica el polipéptido usando una variedad de métodos muy conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Por ejemplo, los líquidos sobrenadantes de sistemas hospedante/vector adecuados que secretan proteínas recombinantes en los medios de cultivo pueden ser concentrados primeramente usando un filtro comercialmente disponible. Tras la concentración, el concentrado puede ser aplicado a una matriz de purificación adecuada, tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Finalmente, pueden ser empleadas una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente una proteína recombinante.

Para expresar los polipéptidos recombinantes de esta invención puede emplearse cualquiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. La expresión puede conseguirse en cualquier célula hospedante apropiada que haya sido transformada o transfectada con un vector de expresión que contiene una molécula de DNA que codifica un polipéptido recombinante.

Las células hospedantes adecuadas incluyen células procariotas, levadura y células eucariotas superiores. Preferiblemente, las células hospedantes empleadas son E. coli, levadura o una línea celular de mamífero, tal como COS o CHO. Las secuencias de DNA expresadas de este modo pueden codificar antígenos naturales, porciones de antígenos naturales, u otras de sus variantes.

En general, independientemente del método de preparación, los polipéptidos descritos en la presente memoria se preparan en forma sustancialmente pura. Preferiblemente, los polipéptidos son al menos aproximadamente 80% puros, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% puros y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 99% puros. En ciertas realizaciones preferidas, descritas con detalle más adelante, los polipéptidos sustancialmente puros se incorporan en composiciones farmacéuticas o vacunas para uso en uno o más de los métodos descritos en la presente memoria.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un primer y un segundo polipéptido de la invención o, alternativamente, un polipéptido de la presente invención y un antígeno conocido de M. tuberculosis, tal como el antígeno de 38 kD descrito antes o ESAT-6 (SEQ ID NO. 103 y 104), junto con variantes de dichas proteínas de fusión. Las proteínas de fusión de la invención también pueden incluir un péptido enlazador entre el primer y el segundo polipéptidos.

Una secuencia de DNA que codifica una proteína de fusión de la presente invención se construye usando técnicas de DNA recombinante conocidas para ensamblar secuencias de DNA separadas que codifican el primer y el segundo polipéptidos en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de una secuencia de DNA que codifica el primer polipéptido se liga, con o sin un enlazador peptídico, al extremo 5' de una secuencia de DNA que codifica el segundo polipéptido de modo que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase para permitir la traducción del mRNA de las dos secuencias de DNA en una sola proteína de fusión que retiene la actividad biológica de tanto el primer como el segundo polipéptidos.

Puede emplearse una secuencia enlazadora peptídica para separar el primer y el segundo polipéptidos un distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundarias y terciarias Dicha secuencia enlazadora peptídica se incorpora en la proteína de fusión usando métodos estándares muy conocidos en la técnica. Las secuencias enlazadoras peptídicas adecuadas pueden ser elegidas basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad en adoptar una estructura secundaria que pueda interaccionar con epítopos funcionales del primer y segundo polipéptidos; y (3) la ausencia de residuos hidrófobos o cargados que pudieran reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias enlazadoras peptídicas preferidas contienen residuos de Gly, Asn y Ser. También pueden ser usados en la secuencia enlazadora otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse útilmente como enlazadores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1968; la patente de EE.UU. Nº 4.935.233 y la patente de EE.UU. Nº 4.751.180. La secuencia enlazadora puede tener una longitud de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos. Las secuencias peptídicas no se requieren cuando el primer y el segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que pueden ser usadas para separar los dominios funcionales e impedir la interferencia estérica.

Las secuencias de DNA ligadas se unen operativamente a elementos reguladores de la transcripción o traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión de DNA esta localizados solamente en 5' respecto a la secuencia de DNA secuencia que codifica el primer polipéptido. Similarmente, los codones de parada requieren para terminar la traducción y la transcripción señales que solamente están presentes en 3' respecto a la secuencia de DNA que codifica el segundo polipéptido.

En otro aspecto, la presente invención describe métodos para usar uno o más de los polipéptidos o proteínas de fusión anteriores (o moléculas de DNA que codifican dichos polipéptidos) para inducir inmunidad protectora contra tuberculosis en un paciente. Como se usa en la presente memoria, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano. Un paciente puede estar afligido con una enfermedad o puede estar libre de la enfermedad y/o infección detectable. En otras palabras, la inmunidad protectora puede ser inducida para prevenir o tratar la tuberculosis.

En este aspecto, la molécula de polipéptido, proteína de fusión o DNA está generalmente presente dentro de una composición farmacéutica y/o una vacuna. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más polipéptidos, cada uno de los cuales puede contener una o más de las secuencias anteriores (o sus variantes), y un vehículo fisiológicamente aceptable. Las vacunas pueden comprender uno o más de los polipéptidos anteriores y un potenciador de la respuesta inmune no específico, tal como un adyuvante o liposoma (en el cual está incorporado el polipéptido). Dichas composiciones farmacéuticas y vacunas también pueden contener otros de antígenos de M. tuberculosis ya sea incorporados en un polipéptido combinado o presentes dentro de un polipéptido separado.

Alternativamente, una vacuna puede contener DNA que codifica uno o más polipéptidos como los descritos anteriormente, de tal modo que el polipéptido se genera in situ. En dichas vacunas, el DNA puede estar presente dentro de una variedad de sistemas de administración conocidos por los expertos ordinarios en la técnica, incluyendo los sistemas de expresión de ácidos nucleicos, y sistemas de expresión bacterianos y virales. Los sistemas de expresión de ácidos nucleicos apropiados contienen las secuencias de DNA necesarias para la expresión en el paciente (tal como un promotor adecuado y una señal de terminación). Los sistemas de administración bacterianos implican la administración de una bacteria (tal como el Bacillus-Calmelte-Guerin) que expresa una porción inmunógena del polipéptido en su superficie celular. En una realización preferida, el DNA puede ser introducido usando un sistema de expresión viral (por ejemplo, virus vacinia u otros poxvirus, retrovirus o adenovirus), que pueden implicar el uso de un virus de replicación competente, no patógeno (defectuoso). Los métodos para incorporar DNA en dichos sistemas de expresión son bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. El DNA también puede ser "desnudo," como se describe, por ejemplo, en Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 y en la revisión de Cohen, en Science 259:1691-1692, 1993. La captación de DNA desnudo puede ser aumentada revistiendo el DNA sobre perlas biodegradables, que son transportadas eficazmente al interior de las células.

En un aspecto relacionado, una vacuna de DNA como las descritas anteriormente puede ser administrada simultáneamente con o secuencialmente a cualquier polipéptido de la presente invención o un antígeno conocido de M. tuberculosis, tal como el antígeno de 38 kD descrito anteriormente. Por ejemplo, la administración de DNA que codifica un polipéptido de la presente invención, ya sea "desnudo" o en un sistema de administración como se ha descrito antes, puede ir seguida por la administración de un antígeno con el fin de potenciar el efecto inmune protector de la vacuna.

Las vías y la frecuencia de la administración, así como las dosificaciones, variarán dependiendo de un individuo a otro y pueden ser administradas en paralelo a las corrientemente utilizadas en inmunización usando el BCG. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden ser administradas por inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), intranasalmente (por ejemplo, por aspiración) u por vía oral. Entre 1 y 3 dosis pueden ser administradas durante un periodo de 1-36 semanas. Preferiblemente, se administran 3 dosis, a intervalos de 3-4 meses, y posteriormente pueden administrarse periódicamente vacunaciones de refuerzo. Para pacientes individuales pueden ser apropiados protocolos alternativos. Una dosis adecuada es una cantidad de polipéptido o DNA que, cuando se administra como se ha descrito antes, es capaz de producir una respuesta inmune en un paciente inmunizado suficiente para proteger al paciente de la infección por M. tuberculosis durante al menos 1-2 años. En general, la cantidad de polipéptido presente en una dosis (o producida in situ por el DNA en una dosis) varía desde aproximadamente 1 pg a aproximadamente 100 mg por kg de hospedante, típicamente desde aproximadamente 10 pg a aproximadamente 1 mg, y preferiblemente desde aproximadamente 100 pg a aproximadamente 1 \mug. Los tamaños de dosis adecuados variarán con el tamaño del paciente, pero típicamente variarán desde aproximadamente 0,1 mL a aproximadamente 5 mL.

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Aunque en las composiciones de esta invención puede emplearse cualquier vehículo adecuado conocido por los expertos ordinarios en la técnica, el tipo de vehículo variará dependiendo del modo de administración. Para la administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo comprende preferiblemente agua, solución salina, alcohol, una grasa, una cera o un tampón. Para la administración oral, puede usarse cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, y carbonato de magnesio. También pueden emplearse como vehículos para las composiciones farmacéuticas de esta invención microbolitas esféricas biodegradables (por ejemplo, poli(galactida láctica)). Las microbolitas esféricas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nº 4.897.268 y 5.075.109.

En las vacunas de esta invención puede emplearse cualquiera de una variedad de adyuvantes para potenciar no específicamente la respuesta inmune. La mayoría de los adyuvantes contiene una sustancia diseñada para proteger al antígeno del catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulante no específico de las respuestas inmunes, tal como lípido A, Bordatella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Los adyuvantes adecuados están disponibles comercialmente como, por ejemplo, el adyuvante incompleto de Freund y el adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories) y el adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Otros adyuvantes adecuados incluyen alumbre, microbolitas biodegradables, monofosforil-lípido A y quil A.

En otro aspecto, esta invención describe métodos para usar uno o más de los polipéptidos descritos antes para diagnosticar la tuberculosis usando un ensayo en la piel. Como se usa en la presente memoria, un "ensayo en la piel" es cualquier ensayo realizado directamente en un paciente en el cual se mide una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (HTR) (tal como hinchazón, enrojecimiento o dermatitis) después de la inyección intradérmica de uno o más polipéptidos como los descritos anteriormente. Dicha inyección puede ser realizada cualquier dispositivo suficiente para poner en contacto el polipéptido o polipéptidos con células dérmicas del paciente, tal como una jeringa para tuberculina o una jeringa de 1 mL. Preferiblemente, la reacción se mide al menos 48 horas después de la inyección, más preferiblemente 48-72 horas.

La reacción de HTR es una respuesta inmune mediada por células, que es mayor en pacientes que han estado expuestos previamente al antígeno del ensayo (es decir, la porción inmunógena del polipéptido empleado, o una de sus variantes). La respuesta puede ser medida visualmente, usando un regla. En general, una respuesta cuyo diámetro es mayor que aproximadamente 0,5 cm, preferiblemente mayor que aproximadamente 1,0 cm, es una respuesta positiva, indicativa de infección por tuberculosis, que puede manifestarse o no como una enfermedad activa.

Los polipéptidos de esta invención se formulan preferiblemente, para uso en un ensayo en la piel, como composiciones farmacéuticas que contienen un polipéptido y un vehículo fisiológicamente aceptable, como se ha descrito antes. Dichas composiciones típicamente contienen uno o más de los polipéptidos anteriores en una cantidad que varía desde aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 100 \mug, preferiblemente desde aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 50 \mug en un volumen de 0,1 mL. Preferiblemente, el vehículo empleado en dichas composiciones farmacéuticas es una solución salina con conservantes apropiados, tales como fenol y Tween 80^{TM}.

En una realización preferida, un polipéptido empleado en un ensayo en la piel es de un tamaño suficiente que permanece en el sitio de la inyección toda la duración del periodo de reacción. En general, es suficiente un polipéptido que tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos. El polipéptido también es roto por los macrófagos horas después de la inyección para permitir la presentación a los linfocitos T. Dichos polipéptidos pueden contener repeticiones de una o más de las secuencias anteriores y otras secuencias inmunógenas o no inmunógenas.

Los siguientes Ejemplos se facilitan sólo como ilustración y de ningún modo como limitación.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación y caracterización de polipéptidos procedentes de filtrados de cultivos de M. tuberculosis

Este ejemplo ilustra las preparación de polipéptidos solubles de M. tuberculosis procedentes de filtrados de cultivos. Salvo que se establezca otra cosa, todos los porcentajes en el siguiente ejemplo son en peso por volumen.

Se cultivó M. tuberculosis (ya sea H37Ra, ATCC Nº 25177, o H37Rv, ATCC Nº 25618) en medios GAS estériles a 37ºC durante catorce días. Los medios se filtraron a vacío (dejando una masa de las células) a través de un filtro de 0,45 \mu en un frasco estéril de 2,5 L. Los medios se filtraron a continuación a través de un filtro de 0,2 \mu en un frasco estéril de 4 L y se añadió NaN_{3} al filtrado del cultivo hasta una concentración de 0,04%. Los frascos se colocaron luego en un recinto frío a 4ºC.

El filtrado del cultivo se concentró colocando el filtrado en un recipiente de 12 L que había sido tratado en autoclave y colocando el filtrado en una celda de agitación Amicon de 400 ml que había sido lavada con etanol y contenía una membrana MWCO de 10.000 kDa. La presión se mantuvo a 0,414 MPa (60 psi) usando nitrógeno gaseoso. Este método redujo el volumen de 12 L a aproximadamente 50 ml.

El filtrado del cultivo se dializó en bicarbonato de amonio al 0,1% usando una membrana MWCO de éster de celulosa de 8.000 kDa, con dos cambios de solución de bicarbonato de amonio. La concentración de proteína se determinó luego mediante una valoración con ácido bicinconínico (abreviadamente BCA por la expresión inglesa Bicinchoninic Acid) comercialmente disponible (Pierce, Rockford, IL).

El filtrado de cultivo dializado se liofilizó luego, y los polipéptidos se volvieron a suspender en agua destilada. Los polipéptidos se dializaron frente a 1,3-bis[tris(hidroximetil)-metilamino]propano 0,01 mM, a pH 7,5 (tampón Bis-Tris propano), que son las condiciones iniciales para la cromatografía de cambio aniónico. El fraccionamiento se realizó usando cromatografía de permeación en gel en una columna de cambio aniónico Poros 146 II Q/M de 4,6 mm x 100 mm (Perseptive BioSystems, Framingham, MA) equilibrada en tampón de Bis-Tris propano 0,01 mM a pH 7,5. Los polipéptidos se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-0,5 M en el sistema de tampón anterior. El eluato de la columna se monitorizó a una longitud de onda de 220 nm.

Las mezclas de polipéptidos que se eluían de la columna de cambio iónico se dializaron contra agua destilada y se liofilizaron. El material resultante se disolvió en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%, pH 1,9 en agua, y los polipéptidos se purificaron en una columna Delta-Pak C18 (Waters, Milford, MA) (de 3,9 x 150 mm), con un tamaño de poros 300 Angstrom y tamaño de partículas 5 micrómetros. Los polipéptidos se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de tampón de dilución 0-60% (TFA al 0,1% en acetonitrilo). El caudal fue 0,75 ml/minuto y el eluato de la HPLC se monitorizó a 214 nm. Las fracciones que contenían los polipéptidos eluídos se recogieron para maximizar la pureza de las muestras individuales. Se obtuvieron aproximadamente 200 polipéptidos
purificados.

Los polipéptidos purificados se sometieron a escrutinio en cuanto a su capacidad de inducir la proliferación de linfocitos T en preparaciones de CMSP. Las CMSP de los donantes conocidos eran positivas en el ensayo en la piel de PPD y cuyos linfocitos T mostraron proliferar en respuesta a PPD y a las proteínas solubles en bruto de MTB se cultivaron en un medio que comprendía RPMI 1640 suplementado con suero humano mezclado al 10% y 50 \mug/mL de gentamicina. Los polipéptidos purificados se añadieron por duplicado a concentraciones de 0,5 a 10 \mug/mL. Después de seis días de cultivo en placas de 96 pocillos de fondo redondo en un volumen de 200 \mul se retiraron de cada pocillo 50 \mul de medio de cada pocillo para la determinación de los niveles de IFN-\gamma, como se describe más adelante. Las placas se pulsaron luego con 1 \muCi/pocillo de timidina tritiada durante 18 horas más, se cosecharon y se determinó la absorción de tritio usando un contador de centelleo en gases. Las fracciones que dieron como resultado en ambos duplicados la proliferación tres veces mayor que la proliferación observada en células cultivadas en medio solo se consideraron positivas.

El IFN-\gamma se midió usando un ensayo con inmunosorbente unido a enzimas (ELISA). Las placas para el ensayo ELISA se revistieron con un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a IFN-\gamma (PharMingen, San Diego, CA) en PBS durante cuatro horas a temperatura ambiente. Los pocillos se bloquearon luego con PBS que contenía leche seca no grasa al 5% (p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron luego seis veces PBS/TWEEN-20 al 0,2% y muestras diluidas 1:2 en medio de cultivo en las placas para el ensayo ELISA se incubaron durante una noche a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo y a cada pocillo se añadió suero de anti-IFN-\gamma humano policlonal de conejo diluido 1:3000 en PBS/suero de cabra normal al 10% normal. Las placas se incubaron luego durante dos horas a temperatura ambiente, se lavaron y se añadió IgG anti-conejo acoplada con peroxidasa de rábano picante (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a una dilución de 1:2000 en PBS/leche seca no grasa al 5%. Después de dos horas más de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron y se añadió como sustrato TMB. La reacción se detuvo después de 20 minutos con ácido sulfúrico 1 N. La densidad óptica (D.O.) se determinó a 450 nm, usando 570 nm como longitud de onda de referencia. Las fracciones que en ambos duplicados daban una D.O. dos veces mayor que la D.O. de las células cultivadas en medio solo, más 3 desviaciones típicas se consideraron
positivas.

Para secuenciar los polipéptidos se secaron individualmente en un aparato Biobrene^{TM} (Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA) y se trataron en filtros de fibra de vidrio. Los filtros con polipéptido se cargaron en un secuenciador de proteínas Perkin Elmer/Applied BioSystems Division Procise 492. Los polipéptidos se secuenciaron a partir del amino terminal y usando la química de Edman tradicional. Para cada polipéptido se determinó la secuencia de aminoácidos comparando el tiempo de retención del derivado de aminoácido PTH con los patrones de derivado de PTH apropiado.

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Usando el método descrito anteriormente, se aislaron los antígenos que tienen las siguientes secuencias N-terminales:

1

2

en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

\vskip1.000000\baselineskip

Se aisló un antígeno adicional empleando una etapa de purificación de HPLC en un aparato Microbore además del método antes descrito. Específicamente, 20 \mul de una fracción que comprende una mezcla de antígenos de la etapa de purificación descrita previamente, se purificaron en una columna Aquapore C18 (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division. Foster City, CA) con un tamaño de poros de 7 micrómetros, tamaño de la columna 1 mm x 100 mm, en un aparato de HPLC de Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modelo 172. Las fracciones se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de 1% por minuto de acetonitrilo (que contenía TFA al 0,05%) en agua (TFA al 0,05%) a un caudal de 80 \mul/minuto. El eluato se monitorizó a 250 nm. La fracción original se separó en 4 picos principales más otros componentes más pequeños y se obtuvo un polipéptido que mostró tener un peso molecular de 12,054 Kd (por espectrometría de masas) y la siguiente secuencia N-terminal:

1000

Este polipéptido demostró inducir la proliferación y la producción de IFN-\gamma en preparaciones de CMSP usando las valoraciones descritas anteriormente.

Del filtrado de cultivo de M. tuberculosis se aislaron antígenos soluble adicionales como sigue. El filtrado del cultivo de M. tuberculosis se preparó como se ha descrito antes. Después de diálisis contra tampón de Bis-Tris propano, a pH 5,5, se realizó un fraccionamiento usando cromatografía de cambio aniónico en una columna Poros QE de 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems) equilibrada en tampón de Bis-Tris propano a pH 5,5. Los polipéptidos se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-1,5 M en el sistema tampón anterior a un caudal de 10 ml/minuto. El eluato de la columna se monitorizó a una longitud de onda de 214 nm.

Las fracciones efluidas de la columna de cambio iónico se reunieron y sometieron a cromatografía de fase inversa usando una columna Poros R2 de 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems). Los polipéptidos se eluyeron de la columna con un gradiente lineal de 0-100% de acetonitrilo (en TFA al 0,1%) a un caudal de 5 ml/minuto. El eluato se monitorizó a 214 nm.

Las fracciones que contenían los polipéptidos efluidos se liofilizaron y volvieron a poner en suspensión en 80 \mul de TFA acuoso al 0,1% y posteriormente se sometieron a cromatografía de fase inversa en una columna Vida C4 de 4,6 x 150 mm (Western Analytical, Temecula, CA) con un gradiente lineal de 0-100% de acetonitrilo (TFA al 0,1%) a un caudal de 2 ml/minuto. El eluato se monitorizó a 214 nm.

La fracción con actividad biológica se separó en un pico principal más otros componentes más pequeños. La transferencia Western de este pico sobre una membrana de PVDF reveló tres bandas principales de pesos moleculares 14 Kd, 20 Kd y 26 Kd. Se determinaron las secuencias N-terminales de estos polipéptidos que eran respectivamente las siguientes:

3

4

en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

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Usando las valoraciones descritas anteriormente, estos polipéptidos demostraron inducir la proliferación y producción de IFN-\gamma en preparaciones de CMSP. Las Figuras 1A y B muestran los resultados de dichas valoraciones usando las preparaciones de CMSP de un primer y un segundo donante, respectivamente.

Las secuencias de DNA que codifican los antígenos denominados (a), (c), (d) y (g) anteriormente se obtuvieron escrutando una genoteca genómica de M. tuberculosis usando oligonucleótidosdegeneradosmarcados en sus extremos conP correspondientes a la secuencia N-terminal y que contienen predisposición de codones de M. tuberculosis. El escrutinio realizado usando una sonda correspondiente al antígeno (a) anterior identificó un clon que tenía la secuencia proporcionada en SEQ ID NO. 101. El polipéptido codificado por la SEQ ID NO. 101 es proporcionado en la SEQ ID NO. 102. El escrutinio realizado usando una sonda correspondiente al antígeno (g) anterior identificó un clon que tenía la secuencia proporcionada en SEQ ID NO. 52. El polipéptido codificado por la SEQ ID No: 52 es proporcionado en la SEQ ID NO. 53. El escrutinio realizado usando una sonda correspondiente al antígeno (d) anterior identificó un clon que tenía la secuencia proporcionada en SEQ ID NO. 24, y el escrutinio realizado usando una sonda correspondiente al antígeno (c) identificó un clon que tenía la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25.

Las secuencias de aminoácidos anteriores se compararon con las secuencias de aminoácidos conocidas en el banco de genes usando el sistema DNA STAR. La base de datos investigada contiene unas 173.000 proteínas y es una combinación de bases de datos PIR suizas junto con secuencias de proteínas traducidas (Versión 87). No se detectaron homologías significativas de las secuencias de aminoácidos para los antígenos (a)-(h) y (l).

La secuencia de aminoácidos para el antígeno (i) se encontró que era homóloga a una secuencia de M. leprae. La secuencia de la longitud completa de M. leprae se amplificó a partir del DNA genómico usando la secuencia obtenida de GENBANK. Esta secuencia se usó luego para escrutar la genoteca de M. tuberculosis descrita más adelante en el Ejemplo 2 y se obtuvo una longitud completa del homólogo de M. tuberculosis (SEQ ID NO. 99).

La secuencia de aminoácidos para el antígeno (j) se encontró que era homóloga a una proteína de M. tuberculosis conocida traducida de una secuencia de DNA. Según el mejor conocimiento de los inventores para esta proteína no se ha mostrado previamente que posea actividad estimuladora de los linfocitos T. La secuencia de aminoácidos para el antígeno (k) se encontró que estaba relacionada con una secuencia de M. leprae.

En la proliferación y las valoraciones de interferón de IFN-\gamma descritas anteriormente, usando tres donantes positivos al PPD, los resultados para los antígenos representativos se recogen en la Tabla 1:

TABLA 1

5

En la Tabla 1, las respuestas que dan un índice de estimulación (IE) de entre 2 y 4 (comparadas con las células cultivadas en medio solo) se puntuaron como +, un IE de 4-8 o 2-4 a una concentración de 1 \mug o menos se puntuó como ++ y un IE mayor que 8 se puntuó como +++. El antígeno de la secuencia (i) se encontró que tenía un alto IE (+++) para un donante y un IE más bajo (++ y +) para los otros dos donantes en ambas valoraciones de proliferación y IFN-\gamma. Estos resultados indican que estos antígenos son capaces de inducir proliferación y producción de

\hbox{interferón- \gamma .}

Ejemplo 2 Uso de sueros de pacientes para aislar antígenos de M. tuberculosis

Este ejemplo ilustra el aislamiento de antígenos de lisado de M. tuberculosis por escrutinio con suero de individuos infectados con M. tuberculosis.

M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories) desecado se añadió a una solución de NP40 al 2%, y se homogeneizó y sometió a tratamiento con ultrasonidos alternativamente tres veces. La suspensión resultante se centrifugó a 13.000 rpm en tubos de microcentrífuga y el líquido sobrenadante se hizo pasar a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros. El filtrado se fijó en perlas de Macro Prep DEAE (BioRad, Hercules, CA). Las perlas se lavaron exhaustivamente con Tris 20 mM de pH 7,5 y las proteínas unidas se eluyeron con NaCl 1 M. El eluato de NaCl 1 M se dializó durante una noche contra Tris 10 mM de pH 7,5.

La solución dializada se trató con DNasa y RNasa a 0,05 mg/ml durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego con \alpha-D-manosidasa 0,5 U/mg a pH 4,5 durante 3-4 horas a temperatura ambiente. Después de volver a pH 7,5 el material se fraccionó por HPLC en una columna Bio Scale-Q-20 (BioRad). Las fracciones se reunieron en nueve mezclas, se concentraron en una Centriprep 10 (Amicon, Beverley, MA) y luego se escrutaron por transferencia Western en cuanto a la actividad serológica usando una mezcla de suero de pacientes infectados con M. tuberculosis que no eran inmuno-reactivos con otros antígenos de la presente invención.

La fracción más reactiva se hizo correr en SDS-PAGE y se transfirió a PVDF. Se recortó una banda de aproximadamente 85 Kd que proporcionó la secuencia:

1001

en donde Xaa puede ser cualquier aminoácido.

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La comparación de esta secuencia con las de Genebank como se ha descrito antes, no revelo homología con secuencias conocidas.

Ejemplo 3 Preparación de secuencias de dna que codifican antígenos de M. tuberculosis

Este ejemplo ilustra la preparación de secuencias de DNA que codifican antígenos de M. tuberculosis por escrutinio de una genoteca de expresión de M. tuberculosis con sueros obtenidos de pacientes infectados con M. tuberculosis, o con anti-sueros producidos contra antígenos solubles de M. tuberculosis.

A. Preparación de antígenos solubles de M. tuberculosis usando antisueros de conejos

El DNA genómico se aisló de la cepa de M. tuberculosis H37Ra. El DNA se cizalló al azar y se usó para construir una genoteca de expresión usando el sistema de expresión Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA). Se generaron antisueros de conejo contra las proteínas secretoras de las cepas de M. tuberculosis H37Ra, H37Rv y Erdman inmunizando un conejo con líquido sobrenadante concentrado de cultivos de M. tuberculosis. Específicamente, el conejo se inmunizó primero subcutáneamente con 200 \mug del antígeno proteínico en un volumen total de 2 ml que contenía 10 \mug muramil-dipéptido (Calbiochem, La Jolla, CA) y 1 ml de adyuvante incompleto de Freund. Cuatro semanas más tarde el conejo se sometió a una vacunación de refuerzo subcutáneamente con 100 \mug de antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Finalmente, el conejo se inmunizó intravenosamente cuatro semanas más tarde con 50 \mug de antígeno proteínico. Los antisueros se usaron para escrutar la genoteca de expresión como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Se purificaron las placas de bacteriófagos que expresan antígenos inmuno-reactivos. Se rescataron los fagémidos de las placas y se dedujeron las secuencias de nucleótidos de los clones de M. tuberculosis.

Se purificaron treinta y dos clones. De estos, 25 representan secuencias que no han sido previamente identificadas en M. tuberculosis humano. Los antígenos recombinantes se expresaron y los antígenos purificados se usaron en el análisis inmunológico descrito en el Ejemplo 1. Las proteínas se indujeron por isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG) y se purificaron por elución a través de gel, como se describe en Skeiky et al., J. Exp. Med. 181: 1527-1537, 1995. Las secuencias representativas de las moléculas de DNA identificadas en este escrutinio se muestran en las SEQ ID NO: 1-25. Las secuencias de aminoácidos predichas se muestran en SEQ ID NO: 63-87.

En la comparación de estas secuencias con las secuencias conocidas en el banco de datos usando las bases de datos descritas anteriormente, se encontró que los clones denominados en lo sucesivo TbRA2A, TbRA16, TbRA18, y TbRA29 (SEQ ID NO. 76, 68, 70, 75) muestran alguna homología con las secuencias previamente identificadas en Mycobacterium leprae, pero no en M. tuberculosis. TbRA11, TbRA26, TbRA28 y TbDPEP (SEQ ID NO: 65, 73, 74, 53) habían sido identificadas previamente en M. tuberculosis. No se encontraron homologías significativas para TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, TbRa19, TbRA29, TbFA32, TbFA36 y los clones solapantes TbRA35 y TbRA12 (SEQ ID NO. 63, 77, 81, 82, 64, 67, 69, 71, 75, 78, 79, 66). El clon TbRa24 está solapado con el clon TbRa29.

Los resultados de las valoraciones de proliferación de CMSP y de interferón-\gamma realizadas en antígenos recombinantes representativos, y usando preparaciones de linfocitos T de diferentes pacientes inmunes a M. tuberculosis se presentan en las Tablas 2 y 3 respectivamente.

TABLA 2

6

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TABLA 3

7

En las Tablas 2 y 3, las respuestas que dan un índice de estimulación (IE) de entre 1,2 y 2 (comparadas con las células cultivadas solo en medio) se puntuaron como \pm, un IE de 2-4 fue puntuado como +, un IE de 4-8 ó 2-4 a una concentración de 1 \mug o menos se puntuó como ++ y un IE mayor que 8 se puntuó +++. Además, se muestra el efecto de la concentración sobre la proliferación y la producción de interferón-\gamma para dos de los antígenos anteriores en la Figura de los dibujos adjunta. Tanto para proliferación como para la producción interferón-\gamma, el TbRa3 se puntuó como ++ y TbRa9 como +.

Estos resultados indican que estos antígenos solubles pueden inducir proliferación y producción de interferón-\gamma producción en linfocitos T derivadas de un individuo inmune a M. tuberculosis.

B. Uso de sueros de pacientes para identificar secuencias de dna que codifican antígenos de M. tuberculosis

La genoteca de DNA genómico descrita anteriormente, y una genoteca H37Rv adicional, se escrutaron usando mezclas de sueros obtenidos de pacientes con tuberculosis activa. Para preparar la genoteca H37Rv, se aisló el DNA genómico de la cepa H37Rv de M. tuberculosis, se sometió a digestión parcial con Sau3A y se usó para construir una genoteca de expresión usando el sistema de expresión lambda Zap (Stratagene, La Jolla, Ca). En el escrutinio por expresión se usaron tres mezclas diferentes de sueros, que contenía cada una sueros obtenidos de tres individuos con enfermedad pulmonar o pleural activa. Las mezclas se denominaron TbL, TbM y TbH, que hace referencia a las iniciales en inglés de la reactividad relativa con el lisado de H37Ra (es decir, TbL = baja reactividad, TbM = media reactividad y TbH = alta reactividad) en ambos formatos ELISA e inmunotransferencia. También se empleó una cuarta mezcla de sueros de siete pacientes con tuberculosis pulmonar. Todos los sueros carecían de reactividad aumentada con la proteína de unión a fosfato H37Ra de M. tuberculosis de 38 kD.

Todas las mezclas se pre-adsorbieron con lisado de E. coli y se usaron para escrutar las genotecas de expresión H37Ra y H37Rv, como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Las placas de bacteriófagos que expresan antígenos inmuno-reactivos se purificaron. Se rescataron los fagémidos de las placas y se dedujeron las secuencias de nucleótidos de los clones de M. tuberculosis.

Se purificaron treinta y dos clones. De estos, 31 representaban secuencias que no habían sido identificadas previamente en M. tuberculosis humano. Las secuencias representativas de las moléculas de DNA se proporcionan en SEQ ID NO: 26-51 y 105. De estas, TbH-8 y TbH-8-2 (SEQ. ID NO. 105) son secuencias de DNA no contiguas del mismo clon, y TbH-4 (SEQ. ID NO. 43) y TbH-4-FWD (SEQ. ID NO. 44) son secuencias no contiguas del mismo clon. Las secuencias de aminoácidos para los antígenos identificados más adelantes como Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9, y TbH-12 se muestra en SEQ ID NO: 88-92. La comparación de estas secuencias con secuencias conocidas en el banco de genes que usa las bases de datos antes identificadas no reveló homologías significativas para TbH-4, TbH-8, TbH8 y TbM-3, aunque se encontraron débiles homologías para TbH-9. Se encontró que TbH-12 era homólogo a la proteína antigénica de 34 kD previamente identificada en M. paratuberculosis (Ace. Nº S28515). Tb38-1 se encontró que estaba localizado 34 pares de bases aguas arriba (en dirección 5') del marco de lectura abierto para el antígeno ESAT-6 previamente identificado en M. bovis (Ace. Nº U34848) y en M. tuberculosis (Sorensen et al., Infec. Immun. 63:1710-1717, 1995).

Sondas derivadas de Tb38-1 y TbH-9, ambas aisladas de una genoteca de H37Ra, se usaron para identificar clones en una genoteca H37Rv. Tb38-1 se hibridó a Tb38-1F2, Tb38-1F3, Tb38-1F5 y Tb38-1F6 (SEQ ID NO. 112, 113, 116, 118 y 119). (Las SEQ ID NO. 112 y 113 son secuencias no contiguas del clon Tb38-1F2). En Tb38-1F2 se dedujeron dos marcos de lectura abiertos; uno corresponde a Tb37FL (SEQ. ID. NO. 114), el segundo una secuencia parcial, puede ser homólogo de Tb38-1 y se denomina Tb38-IN (SEQ ID NO. 115). La secuencia de aminoácidos deducida de Tb38-1F3 está presente en la SEQ. ID. NO. 117. Una sonda de TbH-9 identificó tres clones en la genoteca H37Rv: TbH-9-FL (SEQ ID NO. 106), que puede ser la homóloga de TbH-9 (R37Ra), TbH-9-1 (SEQ. ID NO. 108) y TbH-9-4 (SEQ ID NO. 110), todas las cuales son secuencias altamente relacionadas con TbH-9. Las secuencias de aminoácidos deducidas para estos tres clones se presentan en las SEQ ID NO. 107, 109 y 111.

Los resultados de las valoraciones de linfocitos T realizadas en Tb38-1, ESAT-6 y otros antígenos recombinantes representativos se presentan en las Tablas 4A, B y 5, respectivamente, a continuación:

TABLA 4A

8

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TABLA 4B

9

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TABLA 5

10

Estos resultados indican que tanto los antígenos M. tuberculosis del invento como el ESAT-6 pueden inducir la proliferación y la producción de interferón-\gamma en linfocitos T derivados de un individuo inmune a M. tuberculosis. Según el mejor conocimiento de los inventores, no se había mostrado previamente que el ESAT-6 estimulara respuestas inmunes en seres humanos.

Se construyó un conjunto de seis péptidos solapantes que cubren la secuencia de aminoácidos del antígeno Tb38-1 usando el método descrito en el Ejemplo 4. Las secuencias de estos péptidos, denominadas en lo sucesivo pep1-6, se proporcionan en las SEQ ID NO. 93-98, respectivamente. Los resultados de las valoraciones de linfocitos T usando estos péptidos se muestran en la Tablas 6 y 7. Estos resultados confirman la existencia, y ayudan a localizar epítopos de linfocitos T dentro de Tb38-1 capaces de inducir la proliferación y la producción de interferón-\gamma en linfocitos T derivados un individuo inmune a M. tuberculosis.

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TABLA 6

11

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TABLA 7

12

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Ejemplo 4 Purtificación y caracterización de un polipéptido a partir de un derivado proteínico purificado de tuberculina

Se aisló un polipéptido de M. tuberculosis de un derivado proteínico purificado (PPD) de tuberculina como sigue.

El PPD se preparó como se ha publicado con algunas modificaciones (Selbert, F. et al., Tuberculin purified protein derivative. Preparation and analyses of a large quantity for standard. The American Review of Tuberculosis, 44:9-25, 1941).

La cepa Rv de M. tuberculosis se hizo crecer durante 6 semanas en un medio sintético en frascos rodantes a 37ºC. Los frascos que contenían el crecimiento bacteriano se calentaron luego a 100ºC en vapor de agua durante 3 horas. Los cultivos se filtraron en condiciones estériles usando un filtro de 0,22 \mu y la fase líquida se concentró 20 veces usando una membrana con un umbral de exclusión de 3 kD. Las proteínas se precipitaron una vez con solución de sulfato de amonio al 50% y ocho veces con solución de sulfato de amonio al 25%. Las proteínas resultantes (PPD) se fraccionaron por cromatografía de líquidos en fase inversa (RP-HPLC) usando una columna C 18 (7,8 x 300 mm; Waters, Milford, MA) en un aparato de HPLC Biocad HPLC (Perseptive Biosystems, Framingham, MA). Las fracciones se eluyeron desde la columna con un tampón de gradiente lineal 0-100% (TFA al 0,1% en acetonitrilo). El caudal fue 10 ml/minuto y el eluato se monitorizó a 214 nn y 280 nn.

Se recogieron seis fracciones, se secaron, se suspendieron en PBS y se analizaron individualmente en cobayas infectados con M. tuberculosis para la inducción de la reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (HTR). Se encontró una fracción que inducía una fuerte reacción HTR y subsiguientemente se fraccionó adicionalmente por RP-HPLC en una columna Microbore Vydac C18 (Nº de Cat. 218TP5115) en un cromatógrafo de HPLC Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modelo 172. Las fracciones se eluyeron con un tampón de gradiente lineal de 5-100% (TFA al 0,05% en acetonitrilo) con un caudal de 80 \mul/minuto. El eluato se monitorizó a 215 nm. Se recogieron ocho fracciones y se analizaron en cuanto a inducción de HTR en cobayas infectados con M. tuberculosis. Se encontró una fracción que induce una fuerte reacción de HTR de una induración de aproximadamente 16 mm. Las otras fracciones no indujeron reacción de HTR detectable. La fracción positiva se sometió a electroforesis en gel de SDS-PAGE y se encontró que contenía una sola banda de proteína de peso molecular aproximadamente 12 kD.

Este polipéptido, denominado en la presente memoria DPPD, se secuenció a partir del extremo amino usando un secuenciador de proteínas Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492 como se ha descrito antes y se encontró que tenía la secuencia N-terminal mostrada en la SEQ ID NO: 129. La comparación de esta secuencia con secuencias conocidas de bancos de genes que se han descrito antes no reveló homologías conocidas. Se aislaron cuatro fragmentos de DPPD obtenidos por tratamiento con bromuro de cianógeno y se encontró que tenían las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 130-133.

La capacidad del antígeno DPPD para estimular las CMSP humanas para proliferar y producir IFN-\gamma se valoró como se describe en el Ejemplo 1. Como se muestra en la Tabla 8, se encontró que el DPPD estimula la proliferación y desencadena la producción de grandes cantidades de IFN-\gamma, más que la desencadenada por PPD comercial.

TABLA 8

13

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Ejemplo 5 Síntesis de polipéptidos sintéticos

Los polipéptidos puede ser sintetizados en un sintetizador de péptidos Millipore 9050 que usa química de FMOC con activación por hexafluorofosfato de O-benzotriazol-N,N,N',N'-tetrametiluronio (abreviadamente HPTU por sus iniciales en inglés). Una secuencia Gly-Cys-Gly puede ser unida al extremo amino del péptido para proporcionar un método de conjugación o marcaje del péptido.

La escisión de de los péptidos del soporte sólido puede llevarse a cabo usando la siguiente mezcla de escisión: ácido trifluoroacético:etanoditiol:tioanisol:agua:fenol (40:1:2:2:3). Después de escindir durante 2 horas, los péptidos pueden ser precipitados en metil-t-butil-éter frío. Los pelets de péptido pueden disolverse luego en agua que contiene ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y ser liofilizados antes de la purificación por HPLC de fase inversa en columna C18. Para eluir los péptidos puede usarse un gradiente de acetonitrilo al 0%-60% (que contiene TFA al 0,1%) en agua (que contiene TFA al 0,1%). Después de la liofilización de las fracciones puras, los péptidos pueden ser caracterizados usando espectrometría de masas con electropulverización y por análisis de aminoácidos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTES: Corixa Corporation

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPUESTOS Y MÉTODOS PARA INMUNOTERAPIA Y DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 137

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(iv): DOMICILIO DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: SEED and BERRY LLP

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(B): CALLE: 6300 Columbia Center, 701 Fifth Avenue

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(C): CIUDAD: Seattle

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(D): ESTADO: Washington

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(E): PAÍS: ESTADOS UNIDOS

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(F): CÓDIGO POSTAL: 98104-7092

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(v): FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA:

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete

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(B): COMPUTADORA: compatible con PC IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0. Versión #1.30

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-AGOSTO-1996

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE LEGAL:

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(A): NOMBRE: Maki. David J.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 31.392

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 210121.411PC

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: (206) 622-4900

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(B): TELEFAX: (206) 682-6031

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 766 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

14

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

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(A): LONGITUD: 752 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

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15

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 813 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

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16

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 447 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

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17

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 604 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

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18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 633 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1362 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1458 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 862 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 622 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1200 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1155 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1771 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1058 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 542 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 913 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1872 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1482 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 876 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1021 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 321 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 373 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 352 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 726 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 580 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 160 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 272 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 317 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 182 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 308 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 267 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 189 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 851 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 254 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 408 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 181 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 290 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 155 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 132 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41:

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 132 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42:

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 702 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43:

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 298 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44:

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1058 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45:

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 327 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ 10 NO:46:

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 170 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47:

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 127 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48:

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 81 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49:

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 149 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50:

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 355 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51:

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ 10 NO:52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 999 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52:

\vskip1.000000\baselineskip

71

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 332 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53:

\vskip1.000000\baselineskip

73

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54:

75

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55:

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56:

77

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57:

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58:

79

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59:

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60:

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ IO NO:61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:61:

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62:

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 187 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63:

84

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 148 aminoácidos.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64:

85

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 230 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65:

86

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 132 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66:

87

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67:

88

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 163 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68:

89

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 344 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:69:

90

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 485 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:70:

92

93

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 267 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:71:

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 97 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:72:

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 364 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:73:

\vskip1.000000\baselineskip

96

97

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 309 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:74:

\vskip1.000000\baselineskip

98

99

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 580 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75:

100

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 233 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76:

103

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 66 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77:

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 69 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78:

\vskip1.000000\baselineskip

106

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 355 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79:

\vskip1.000000\baselineskip

107

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 205 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80:

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 286 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81:

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 173 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:82:

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:83:

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 125 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:84:

\vskip1.000000\baselineskip

113

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 117 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:85:

\vskip1.000000\baselineskip

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 103 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:86:

115

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 88 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:87:

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 95 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:88:

117

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 166 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:89:

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:90:

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 263 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:91:

121

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 303 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:92:

122

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:93:

124

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:94:

125

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:95:

126

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:96:

127

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:97:

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:98:

\vskip1.000000\baselineskip

129

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 507 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:99:

130

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 168 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:100:

\vskip1.000000\baselineskip

131

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 500 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ 10 NO:101:

\vskip1.000000\baselineskip

132

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID. NO:102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:102:

\vskip1.000000\baselineskip

133

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:103:

\vskip1.000000\baselineskip

(1) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 154 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:103:

134

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:104:

\vskip1.000000\baselineskip

(1) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 51 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:104:

\vskip1.000000\baselineskip

135

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 282 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:105:

\vskip1.000000\baselineskip

136

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1565 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:106:

\vskip1.000000\baselineskip

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 391 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:107:

\vskip1.000000\baselineskip

138

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 259 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:108:

\vskip1.000000\baselineskip

140

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 86 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:109:

\vskip1.000000\baselineskip

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION FOR SEO ID NO:110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1109 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:110:

142

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 341 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEO ID NO:111:

143

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1256 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:112:

\vskip1.000000\baselineskip

145

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 432 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:113:

\vskip1.000000\baselineskip

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 368 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:114:

147

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:115:

\vskip1.000000\baselineskip

149

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 396 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:116:

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 80 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:117:

\vskip1.000000\baselineskip

151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 387 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:118:

152

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 272 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:119:

\vskip1.000000\baselineskip

153

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:120:

\vskip1.000000\baselineskip

154

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:121:

\vskip1.000000\baselineskip

155

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:122:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:122:

\vskip1.000000\baselineskip

156

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:123:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:123:

\vskip1.000000\baselineskip

157

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:124:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:124:

\vskip1.000000\baselineskip

158

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:125:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): SEQUENCE OESCRIPTION: SEQ ID NO:125:

\vskip1.000000\baselineskip

159

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:126:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:126:

\vskip1.000000\baselineskip

160

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:127:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:127:

\vskip1.000000\baselineskip

161

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:128:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:128:

\vskip1.000000\baselineskip

162

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:129:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:129:

\vskip1.000000\baselineskip

163

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ 10 NO:130:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:130:

\vskip1.000000\baselineskip

164

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:131:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "El Segundo residuo puede ser bien una Pro o bien Thr"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:131:

\vskip1.000000\baselineskip

165

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:132:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "El tercer residuo puede ser bien una Gln o bien Leu"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:132:

\vskip1.000000\baselineskip

166

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:133:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:133:

\vskip1.000000\baselineskip

167

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:134:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:134:

\vskip1.000000\baselineskip

168

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:135:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:135:

\vskip1.000000\baselineskip

169

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:136:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:136:

\vskip1.000000\baselineskip

170

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:137:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:137:

\vskip1.000000\baselineskip

171

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:66 o una de sus variantes que tiene una sustitución conservadora de aminoácidos.

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en una de secuencia aminoácidos de SEQ ID NO:66 o una de sus variantes que tiene una sustitución conservadora de aminoácidos.

3. Un polipéptido combinado que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, y una o más secuencias inmunógenas adicionales de M. tuberculosis, que están unidos mediante un enlace peptídico formando una sola cadena de aminoácidos.

4. Una molécula de DNA aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una molécula de DNA de acuerdo con la reivindicación 4, que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Un vector de expresión que comprende una molécula de DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5.

7. Una célula hospedante aislada transformada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Una célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en células de E. Coli, de levadura y de mamíferos.

9. Una composición farmacéutica que comprende: (i) un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o (ii) una molécula de DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5; y un vehículo fisiológicamente aceptable.

10. Una vacuna que comprende: (i) un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o (ii) una molécula de DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5; y un potenciador de la de la respuesta inmune no específico.

11. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el potenciador de la respuesta inmune no específico es un adyuvante.

12. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso como un medicamento.

13. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 12, para uso en inducir inmunidad protectora contra la tuberculosis.

14. Una molécula de DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, para uso como un medicamento.

15. Una molécula de DNA de acuerdo con la reivindicación 14 para uso en inducir inmunidad protectora contra la tuberculosis.

16. Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una molécula de DNA de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la tuberculosis.

17. Un kit de diagnóstico que comprende:

(i): un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

(ii): un aparato suficiente para poner en contacto dicho polipéptido con las células dérmicas de un paciente.

\vskip1.000000\baselineskip

18. Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la fabricación de un kit de diagnóstico para detectar tuberculosis.

19. Un método para la producción de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la expresión recombinante de una molécula de DNA de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 en una célula hospedante apropiada.