DE69636046T2

DE69636046T2 - Verbindungen und Verfahren zur Immuntherapie und Diagnose von Tuberkulose

Info

Publication number: DE69636046T2
Application number: DE69636046T
Authority: DE
Inventors: Steven G. Bellevue Reed; Yasir A.W. Bellevue Skeiky; David C. Issaquah Dillon; Antonio Bainbridge Island Campos-Neto; Raymond L. Bothell Houghton; Thomas S. Federal Way Vedvick; Daniel R. Bainbridge Island Twardzik
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2016-08-31
Also published as: DE69630457D1; TR200901109T1; SI0851927T1; ATE337399T1; BR9612997B1; EP1712628B1; NO20070619L; PL186774B1; WO1997009428A2; KR19990044347A; ATE323165T1; KR100433750B1; MX9801638A; DE69637879D1; ATE426025T1; NZ319377A; PT1347055E; JP2007228972A; TR199800411T1; CZ300688B6

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein den Nachweis, die Behandlung und die Vorbeugung einer Infektion mit Mycobacterium tuberculosis. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Mycobacterium-tuberculosis-Antigen umfassende Polypeptide oder einen Teil oder eine andere Variante davon sowie die Verwendung solcher Polypeptide für die Diagnose einer und Impfung gegen eine Infektion mit Mycobacterium tuberculosis.
Hintergrund der Erfindung
Bei der Tuberkulose handelt es sich um eine chronische Infektionskrankheit, die im allgemeinen durch eine Infektion mit Mycobacterium tuberculosis verursacht wird. Es handelt es sich dabei um eine Hauptkrankheit in Entwicklungsländern ebenso wie ein zunehmendes Problem in den entwickelten Zonen der Welt, wobei etwa 8 Millionen neue Fälle sowie 3 Millionen Todesfälle pro Jahr auftreten. Zwar kann die Infektion über einen beträchtlichen Zeitraum asymptomatisch bleiben, doch zeigt sich die Krankheit am häufigsten als eine akute Entzündung der Lungen, was zu Fieber und einem nichtproduktiven Husten führt. Bleibt dies unbehandelt führt dies zu ernsten Komplikationen und typischerweise zum Tod.
Obwohl Tuberkulose sich im allgemeinen mit einer ausgedehnten Antiobiotikatherapie unter Kontrolle bringen läßt, reicht eine derartige Behandlung nicht aus, um die Verbreitung der Krankheit zu verhindern. Infizierte Individuen können zwar asymptomatisch sein, sind jedoch einige Zeit lang ansteckend. Darüber hinaus ist das Patientenverhalten schwer zu überwachen, obwohl ein Befolgen des Behandlungsplans kritisch ist. Einige Patienten führen die Behandlung nicht bis zum Ende durch, was zu einer ineffektiven Behandlung und der Entwicklung einer Arzneistoffresistenz führen kann.
Die Hemmung der Ausbreitung der Tuberkulose erfordert eine wirksame Impfung sowie eine genaue, frühe Diagnose der Krankheit. Zur Zeit ist die Impfung mit lebenden Bakterien die wirksamste Methode zur Induktion einer schützenden Immunität. Das für diesen Zweck am häufigsten eingesetzte Mycobakterium ist Bacillus Calmette-Guerin (BCG), ein avirulenter Stamm von Mycobacterium bovis. Allerdings ist die Sicherheit und Wirksamkeit von BCG eine Streitquelle, wobei einige Länder, wie beispielsweise die Vereinigten Staaten, keine allgemeine Impfung der Bevölkerung durchführen. Die Diagnose wird häufig über einen Hauttest erreicht, wobei ein interdermales Inkontaktbringen mit Tuberkulin-PPD (protein-purified derivative [= proteingereinigtes Derivat]) durchgeführt wird. Antigenspezifische T-Zellantworten führen zu einer meßbaren Verhärtung an der Injektionsstelle 48-72 Stunden nach der Injektion, was ein Inkontaktkommen mit mycobakteriellen Antigenen anzeigt. Allerdings sind die Empfindlichkeit und Spezifität dieses Tests bislang problematisch, wobei mit BCG geimpfte Individuen nicht von infizierten Individuen unterschieden werden können.
Während gezeigt werden konnte, daß Makrophagen als die Haupteffektoren einer Immunität gegenüber M. tuberculosis wirken, sind T-Zellen die hauptsächlichen Induktoren einer solchen Immunität. Die wesentliche Rolle von T-Zellen beim Schutz gegen eine Infektion mit M. tuberculosis wird durch das häufige Auftreten von M. tuberculosis in AIDS-Patienten aufgrund der mit der Infektion mit HIV (human immunodeficiency virus) assoziierten Verarmung an CD4-T-Zellen veranschaulicht. Es konnte gezeigt werden, daß Mycobacterium-reaktive CD4-T-Zellen potente Produzenten von gamma-Interferon (IFN-γ) sind, von dem wiederum gezeigt werden konnte, daß es die anti-mycobakteriellen Effekte von Makrophagen in Mäusen auslöst. Während die Rolle von IFN-γ im Menschen weniger klar ist, haben Untersuchungen gezeigt, daß 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 entweder allein oder zusammen mit IFN-γ oder Tumornekrosefaktor-alpha menschliche Makrophagen zur Hemmung einer Infektion M. tuberculosis aktiviert. Weiterhin ist bekannt, daß IFN-γ menschliche Makrophagen zur Herstellung von 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 anreizt. In ähnlicher Weise konnte gezeigt werden, daß IL-12 ein Rolle bei der Stimulierung der Resistenz gegenüber einer Infektion mit M. tuberculosis spielt. Hinsichtlich einer Übersicht einer Immunologie einer Infektion mit M. tuberculosis siehe Chan und Kaufmann in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (Hrsg.), ASM Press, Washington, DC, 1994).
In einem Artikel von Mahairas et al. Journal of Bacteriology 178(5): 1274-1282, März 1996, werden die genetischen Unterschiede zwischen Mycobacterium bovis BCG und virulentem M. bovis erörtert.
Dementsprechend besteht ein Bedarf im Fachgebiet an verbesserten Impfstoffen und Verfahren zur Vorbeugung, Behandlung und zum Nachweis von Tuberkulose. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und stellt ferner andere, damit verbundene Vorteile bereit.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Mycobacterium-Polypeptid, umfassend eine wie in SEQ ID No: 88 angegebene Aminosäuresequenz oder eine einen immunogenen Teil der SEQ ID No: 88 umfassende Aminosäuresequenz, bereitgestellt.
Ebenso wird ein das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthaltendes Fusionsprotein bereitgestellt. In einem weiteren Aspekt wird eine Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger, bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis von Tuberkulose in einem Individuum bereitgestellt. Weiterhin wird eine Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger, zur Verwendung beim Hervorrufen einer Immunantwort bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt wird ein diagnostischer Kit, umfassend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und eine dem Inkontaktbringen des Polypeptids mit den Dermiszellen eines Patienten genügende Vorrichtung, bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt wird ein Impfstoff, umfassend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger, bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt wird eine Nukleinsäure, codierend für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Nukleinsäure die Nukleotidsequenz der SEQ ID No: 46.
Ebenso wird ein Expressionsvektor, umfassend die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung, sowie eine Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung, bereitgestellt.
Kurz gesagt werden durch die vorliegende Erfindung Verbindungen sowie deren Verwendung zur Vorbeugung und Diagnose von Tuberkulose bereitgestellt. Dabei werden Polypeptide bereitgestellt, die einen immunogenen Anteil eines löslichen M. tuberculosis-Antigens oder einer Variante eines solchen Antigens, die sich lediglich in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen davon unterscheidet, umfassen.
In einem verwandten Aspekt umfassen die Polypeptide einen immunogenen Anteil eines M. tuberculosis-Antigens oder einer Variante eines solchen Antigens, die sich lediglich in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen davon unterscheidet, wobei das Antigen eine von einer DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der in SEQ ID No: 46 genannten Sequenz sowie DNA-Sequenzen, die an eine zu der in SEQ ID No: 46 genannten Sequenz komplementären Sequenz unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisieren, codierte Aminosäuresequenz umfaßt.
In verwandten Aspekten werden ebenso für die obigen Polypeptide codierende DNA-Sequenzen, diese DNA-Sequenzen umfassende Expressionsvektoren sowie mit solchen Expressionsvektoren transformierte oder transfizierte Wirtszellen bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt werden in der vorliegenden Erfindung Fusionsproteine, umfassend ein erstes und ein zweites erfindungsgemäßes Polypeptid oder alternativ ein erfindungsgemäßes Polypeptid sowie ein bekanntes M. tuberculosis-Antigen, bereitgestellt.
In weiteren Aspekten werden durch die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein oder mehrere der obigen Polypeptide oder ein für derartige Polypeptide codierendes DNA-Molekül sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger umfassen. Durch die Erfindung werden ebenso Impfstoffe, umfassend ein oder mehrere der wie oben beschriebenen Polypeptide sowie einen nichtspezifischen Immunantwort-Enhancer, zusammen mit Impfstoffen, umfassend eine oder mehrere für derartige Polypeptide codierende DNA-Sequenzen sowie einen nichtspezifischen Immunantwort-Enhancer, bereitgestellt.
In noch einem weiteren Aspekt werden Verfahren zur In duktion einer schützenden Immunität in einem Patienten offenbart, bei dem man einem Patienten eine wirksame Menge eines oder mehrerer der obigen Polypeptide verabreicht.
In weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Kits zum Nachweis von Tuberkulose in einem Patienten bereitgestellt. Die offenbarten Verfahren umfassen das Inkontaktbringen von Dermiszellen eines Patienten mit einem oder mehreren der obigen Polypeptide sowie das Nachweisen einer Immunantwort auf der Haut des Patienten. Die diagnostischen Kits umfassen eines oder mehrere der obigen Polypeptide in Kombination mit einer dem Inkontaktbringen des Polypeptids mit den Dermiszellen eines Patienten genügenden Vorrichtung.
Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung sowie die beigefügten Zeichnungen ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen und Sequenzkennzeichnungen
In 1A und B ist die Stimulierung der Proliferation und Interferon-γ-Produktion in T-Zellen, die aus einem ersten bzw. einem zweiten M. tuberculosis-Immunspender gewonnen wurden, durch die in Beispiel 1 beschriebenen Antigene mit einer Größe von 14 Kd, 20 Kd und 26 Kd dargestellt.
In 2 ist die Stimulierung der Proliferation und Interferon-γ-Produktion in T-Zellen, die von einem gegen M. tuberculosis immunen Individuum gewonnen wurden, durch die beiden repräsentativen Polypeptide TbRa3 und TbRa9 dargestellt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie oben angemerkt, richtet sich die vorliegende Erfindung allgemein auf Zusammensetzungen und Verwendungen davon zur Vorbeugung, Behandlung und Diagnose von Tuberkulose. Zu den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung gehören Polypeptide, die wenigstens einen immunogenen Anteil eines M. tuberculosis-Antigens oder einer Variante eines solchen Antigens, die sich lediglich in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen davon unterscheidet, umfassen. Zu den Polypeptiden im Rahmen der vorliegenden Erfindung gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, immunogene lösliche M. tuberculosis-Antigene. Ein „lösliches M. tuberculosis-Antigen" ist ein aus M. tuberculosis stammendes Protein, das in einem M. tuberculosis-Kulturfiltrat vorhanden ist. Der Begriff „Polypeptid", wie er hier verwendet wird, umfaßt Aminosäureketten einer beliebigen Länge, einschließlich Vollängenproteine (d.h. Antigene), wobei die Aminosäurereste durch kovalente Peptidbindungen verknüpft sind. Somit kann ein einen immunogenen Anteil eines der obigen Antigene umfassendes Polypeptid vollständig aus dem immunogenen Anteil bestehen oder zusätzliche Sequenzen enthalten. Die zusätzlichen Sequenzen können von dem nativen M. tuberculosis-Antigen abgeleitet sein oder können heterolog sein, wobei solche Sequenzen immunogen sein können (aber nicht immunogen zu sein brauchen).
„Immunogen", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit, eine Immunantwort (z.B. zellulär) in einem Patienten, wie z.B. einem Menschen, und/oder in einer biologischen Probe auszulösen. Insbesondere sind Antigene, die immunogen sind (sowie immunogene Anteile oder andere Varianten solcher Antigene), in der Lage, die Zellproliferation, Interleukin-12-Produktion und/oder Interferon-γ-Produktion in biologischen Proben, die eine oder mehrere Zellen, ausgewählt aus der Gruppe T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und Makrophagen, umfassen, wobei die Zellen aus einem gegen M. tuberculosis immunen Individuum gewonnen werden, zu stimulieren. Dabei können Polypeptide, die wenigstens einen immunogenen Anteil eines oder mehrerer M. tuberculosis-Antigene umfassen, allgemein zum Nachweis von Tuberkulose oder zur Induktion einer schützenden Immunität gegen Tuberkulose in einem Patienten verwendet werden.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen ebenso Varianten der obigen Polypeptide. Eine „Variante", wie sie hier verwendet wird, ist ein Polypeptid, das sich von dem nativen Antigen nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet, so daß die Fähigkeit des Polypeptids zur Induktion einer Immunantwort erhalten bleibt. Solche Varianten können allgemein durch die Modifikation einer der obigen Polypeptidsequenzen sowie die Beurteilung der immunogenen Eigenschaften des modifizierten Polypeptids, beispielsweise unter Verwendung der hier beschriebenen repräsentativen Verfahrensweisen, identifiziert werden.
Bei einer „konservativen Substitution" handelt es sich um eine Substitution, bei der eine Aminosäure gegen eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften ausgetauscht wird, so daß ein Fachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie erwarten würde, daß die Sekundärstruktur sowie die hydropathische Beschaffenheit des Polypeptids weitgehend unverändert ist. Im allgemeinen repräsentieren die folgenden Gruppen von Aminosäuren konservative Änderungen (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; und (5) phe, tyr, trp, his.
Varianten können auch (oder alternativ) durch beispielsweise die Deletion oder Addition von Aminosäuren, die einen minimalen Einfluß auf die immunogenen Eigenschaften, Sekundärstruktur und hydropathische Beschaffenheit des Polypeptids haben, modifiziert werden. So kann beispielsweise ein Polypeptid an eine Signal- (oder Leit-)Sequenz am N-terminalen Ende des Proteins konjugiert werden, durch die der Transfer des Proteins cotranslational oder posttranslational gesteuert wird. Das Polypeptid kann auch an einen Linker oder eine andere Sequenz zur leichten Synthese, Reinigung oder Identifizierung des Polypeptids (z.B. Poly-His) oder zur Verstärkung der Bindung des Polypeptids an einen festen Träger konjugiert werden. Beispielsweise kann ein Polypeptid an einen Immunglobulin-Fc-Bereich konjugiert werden.
In einem verwandten Aspekt werden Kombinationspolypeptide offenbart. Bei einem „Kombinationspolypeptid" handelt es sich um ein Polypeptid, das wenigstens einen der obigen immunogenen Anteile und eine oder mehrere zusätzliche immunogene M. tuberculosis-Sequenzen umfaßt, die über eine Peptidverknüpfung zu einer einzelnen Aminosäurekette verbunden sind. Dabei können die Sequenzen direkt (d.h. ohne dazwischenliegende Aminosäuren) oder über eine Linker-Sequenz (z.B. Gly-Cys- Gly), durch die die immunogenen Eigenschaften der zusammengesetzten Polypeptide nicht signifikant vermindert werden, verbunden werden.
Im allgemeinen können M. tuberculosis-Antigene und für solche Antigene codierende DNA-Sequenzen unter Verwendung einer beliebigen aus einer Vielfalt von Verfahrensweisen hergestellt werden. So können beispielsweise lösliche Antigene aus M. tuberculosis-Kulturfiltrat mit dem Durchschnittsfachmann bekannten Verfahrensweisen, einschließlich Anionenaustausch- und Reverse-Phase-Chromatographie, isoliert werden. Gereinigte Antigene werden dann auf ihre Fähigkeit, eine entsprechende Immunantwort (z.B. zellulär) hervorzurufen, beurteilt, wobei beispielsweise die hier beschriebenen repräsentativen Verfahren verwendet werden. Anschließend können immunogene Antigene partiell sequenziert werden, wobei Techniken, wie z.B. die traditionelle Edman-Chemie verwendet werden. Siehe Edman und Berg, Eur. J. Biochem. 80: 116-132, 1967.
Immunogene Antigene können auch rekombinant unter Verwendung einer DNA-Sequenz, die für das Antigen codiert und die in einen Expressionsvektor inseriert und in einen geeigneten Wirt exprimiert wurde, produziert werden. DNA-Moleküle, die für lösliche Antigene codieren, können durch Screening einer entsprechenden M. tuberculosis-Expressionsbibliothek mit Antiseren (z.B. Kaninchen), die spezifisch gegen lösliche M, tuberculosis-Antigene produziert wurden, isoliert werden. DNA-Sequenzen, die für Antigene codieren, die gegebenenfalls löslich sein können, können durch Screening einer entsprechenden genomischen M. tuberculosis-Expressionsbibliothek oder M. tuberculosis cDNA-Expressionsbibliothek mit von mit M. tuberculosis infizierten Patienten gewonnenen Seren identifiziert werden. Derartige Screening-Verfahren können allgemein unter Verwendung von dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannten Techniken durchgeführt werden, wie beispiels weise denen, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989, beschrieben sind.
DNA-Sequenzen, die für lösliche Antigene codieren, können auch durch Screening einer entsprechenden M. tuberculosis-cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek auf DNA-Sequenzen, die an degenerierte Oligonukleotide, die sich aus Teilaminosäuresequenzen isolierter löslicher Antigene ableiten, hybridisieren, erhalten werden. Dabei können zur Verwendung in einem solchen Screening geeignete degenerierte Oligonukleotidsequenzen konstruiert und synthetisiert werden und das Screening kann durchgeführt werden, wie (beispielsweise) bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (sowie den darin zitierten Literaturstellen) beschrieben, durchgeführt werden. Ebenso kann man die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der obigen Oligonukleotide in im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren zur Isolierung einer Nukleinsäuresonde aus einer cDNA- oder genomischen Bibliothek einsetzen. Das Bibliotheksscreening kann dann unter Verwendung der isolierten Sonde durchgeführt werden.
Alternativ können aus M. tuberculosis gewonnene genomische oder cDNA-Bibliotheken direkt einem Screening unter Verwendung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs [= peripheral blood mononuclear cells]) oder von aus einem oder mehreren gegen M. tuberculosis immunen Individuen stammenden T-Zellinien oder -klonen unterzogen werden. Dabei können im allgemeinen PBMCs und/oder T-Zellen zur Verwendung in derartigen Screening-Verfahren wie unten beschrieben hergestellt werden. Direkte Bibliotheksscreening-Verfahren können allgemein durchgeführt werden, indem man vereinte Mengen an exprimierten rekombinanten Proteinen auf die Fähigkeit zur Induktion der Proliferation und/oder Interferon-γ-Produktion in aus einem gegen M. tuberculosis immunen Individuum stammenden T-Zellen testet. Als Alternative können potentielle T-Zellen-Antigene zunächst auf Antikörperreaktivität bezogen ausgewählt werden, wie oben beschrieben.
Unabhängig vom Herstellungsverfahren weisen die hier beschriebenen (gegebenenfalls lösbaren) Antigene (und immunogene Anteile davon) die Fähigkeit zur Induktion einer immunogenen Antwort auf. Insbesondere weisen die Antigene die Fähigkeit auf, die Proliferation und/oder Zytokinproduktion (d.h. Interferon-γ- und/oder Interleukin-12-Produktion) in T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und/oder Makrophagen, die jeweils aus einem gegen M. tuberculosis immunen Individuum stammen, zu induzieren. Die Selektion des Zelltyps zur Verwendung bei der Beurteilung einer immunogenen Antwort auf ein Antigen hängt natürlich von der gewünschten Antwort ab. So wird beispielsweise die Interleukin-12-Produktion am einfachsten unter Verwendung von B-Zellen und/oder Makrophagen enthaltenden Präparationen beurteilt. Bei einem gegen M. tuberculosis immunen Individuum handelt es sich um ein Individuum, von dem angenommen wird, daß es gegen die Entwicklung von Tuberkulose aufgrund der Entwicklung einer wirksamen T-Zellen-Antwort auf M. tuberculosis resistent (d.h. weitgehend frei von Krankheitssymptomen) ist. Solche Individuen können anhand einer stark positiven (d.h. Verhärtung mit einem Durchmesser von mehr als etwa 10 mm) intradermalen Hauttestreaktion gegen Tuberkuloseproteine (PPD) sowie eines Fehlens jeglicher Anzeichen oder Symptome einer Tuberkuloseerkrankung identifiziert werden. Aus gegen M. tuberculosis immunen Individuen stammende T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und Makrophagen können mit dem Durchschnittsfachmann bekannten Verfahren präpariert werden. So kann beispielsweise eine Präparation von PBMCs (d.h. peripheren mononukleären Blutzellen) ohne weitere Trennung von Komponentenzellen eingesetzt werden. PBMCs können allgemein beispielsweise unter Verwendung von Dichtezentrifugation durch Ficoll^TM (Winthrop Laboratories, NY) hergestellt werden. Ebenso können T-Zellen zur Verwendung in den hier beschriebenen Tests direkt von PBMCs gereinigt werden. Als Alternative kann eine angereicherte, gegen mycobakterielle Proteine reaktive T-Zellinie oder können gegen individuelle mycobakterielle Proteine reaktive T-Zellen-Klone eingesetzt werden. Solche T-Zellen-Klone können beispielsweise erzeugt werden, indem man PBMCs aus gegen M. tuberculosis immunen Individuen mit mycobakteriellen Proteinen über einen Zeitraum von 2-4 Wochen kultiviert. Dies gestattet lediglich die Expansion von für das mycobakterielle Protein spezifischen T-Zellen, was zu einer einzig aus solchen Zellen zusammengesetzten Zellinie führt. Diese Zellen können dann kloniert und mit individuellen Proteinen unter Verwendung von dem Durchschnittsfachmann bekannten Verfahren getestet werden, um die individuelle T-Zellen-Spezifität genauer zu definieren. Im allgemeinen werden dabei Antigene, die in Tests zur Proliferation und/oder Zytokinproduktion (d.h. Interferon-γ- und/oder Interleukin-12-Produktion), die unter Verwendung von aus einem gegen M. tuberculosis immunen Individuum gewonnenen T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und/oder Makrophagen durchgeführt wird, positiv testen als immunogen betrachtet. Solche Assays können beispielsweise unter Verwendung der unten beschriebenen repräsentativen Verfahrensweisen durchgeführt werden. Immunogene Anteile solcher Antigene können mit ähnlichen Tests identifiziert werden und in den hier beschriebenen Polypeptiden vorhanden sein.
Die Fähigkeit eine Polypeptids (z.B. eines immunogenen Antigens oder eines Anteils oder einer anderen Variante davon) zur Induktion der Zellproliferation wird beurteilt, indem man die Zellen (z.B. T-Zellen und/oder NK-Zellen) mit dem Polypeptid in Kontakt bringt und die Proliferation der Zellen mißt. Dabei liegt die Menge an Polypeptid, die zur Beurteilung von ungefähr 10⁵ Zellen genügt, im Bereich von etwa 10 ng/ml bis etwa 100 μg/ml und vorzugsweise bei etwa 10 μg/ml. Die Inkubation von Polypeptid mit Zellen wird typischerweise etwa 6 Tage bei 37°C durchgeführt. Nach der Inkubation mit Polypeptid werden die Zellen auf eine proliferative Antwort getestet, die mit dem Durchschnittsfachmann bekannten Verfahren, wie beispielsweise das Aussetzen von Zellen gegebenenfalls einem Puls von radioaktiv markiertem Thymidin und Messen des Einbaus der Markierung in zelluläre DNA, beurteilt werden kann. Im allgemeinen wird ein Polypeptid, das zu einem wenigstens dreifachen Anstieg der Proliferation über Hintergrund (d.h. der bei ohne Polypeptid kultivierten Zellen beobachteten Proliferation) führt, als zur Induktion der Proliferation fähig angesehen.
Die Fähigkeit eines Polypeptids zur Stimulierung der Produktion von Interferon-γ und/oder Interleukin-12 in Zellen kann beurteilt werden, indem man die Zellen mit dem Polypeptid in Kontakt bringt und das Niveau des von den Zellen produzierten Interferon-γ oder Interleukin-12 mißt. Im allgemeinen liegt dabei die Menge an Polypeptid, die zur Beurteilung von etwa 10⁵ Zellen ausreicht, im Bereich von etwa 10 ng/ml bis etwa 100 μg/ml und vorzugsweise bei etwa 10 μg/ml. Das Polypeptid kann, braucht aber nicht, auf einem festen Träger, wie z.B. einem Kügelchen oder einem bioabbaubaren Mikrokügelchen, wie beispielsweise denen in den US-Patenten Nr. 4,897,268 und 5,075,109 beschriebenen, immobilisiert werden. Die Inkubation von Polypeptid mit den Zellen wird typischerweise etwa 6 Tage bei 37°C durchgeführt. Nach der Inkubation mit Polypeptid werden die Zellen auf Interferon-γ und/oder Interleukin-12 (oder eine oder mehrere Untereinheiten davon) getestet, die mit dem Durchschnittsfachmann bekannten Verfahren, wie z.B. einem ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) oder im Fall der IL-12-P70-Untereinheit einem Biotest, wie beispielsweise einem Test zur Messung der Proliferation von T-Zellen, beurteilt werden können. Dabei wird im allgemeinen ein Polypeptid, das zur Produktion von wenigstens 50 pg Interferon-γ pro ml kultiviertem Überstand (mit 10⁴-10⁵ T-Zellen pro ml) als zur Stimulierung der Produktion von Interferon-γ fähig angesehen. Ein Polypeptid, das die Produktion von wenigstens 10 pg/ml IL-12-P70-Untereinheit und/oder wenigstens 100 pg/ml Il-12-P40-Untereinheit, pro 10⁵ Makrophagen oder B-Zellen (oder pro 3 × 10⁵ PBMC) stimuliert, wird als zur Stimulierung der Produktion von IL-12 fähig angesehen.
Im allgemeinen handelt es sich bei immunogenen Antigenen um solche Antigene, die die Proliferation und/oder Zytokinproduktion (d.h. Interferon-γ- und/oder Interleukin-12-Produktion) in T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und/oder Makrophagen, die aus wenigstens etwa 25% gegen M. tuberculosis immunen Individuen stammen, stimulieren. Unter diesen immunogenen Antigenen können Polypeptide mit besseren therapeutischen Eigenschaften anhand der Größe der Antworten in den obigen Tests sowie anhand des Prozentanteils der Individuen, bei denen eine Antwort beobachtet wird, unterschieden werden. Darüber hinaus stimulieren Antigene mit besseren therapeutischen Eigenschaften nicht die Proliferation und/oder Zytokinproduktion in Zellen, die aus mehr als etwa 25% von Individuen, die nicht gegen M. tuberculosis immun sind, stammen, in vitro, wodurch Antworten, die nicht spezifisch auf auf M. tuberculosis reagierende Zellen zurückzuführen sind, eliminiert werden. Diejenigen Antigene, die eine Antwort in einem hohen Prozentsatz von T-Zellen-, NK-Zellen-, B-Zellen- und/oder Makrophagenpräparationen aus gegen M. tuberculosis immunen Individuen (bei einem geringen Auftreten von Antworten in Zellpräparationen von anderen Individuen) induzieren, weisen bessere therapeutische Eigenschaften auf.
Antigene mit besseren therapeutischen Eigenschaften können auch anhand ihrer Fähigkeit, die Schwere einer Infektion mit M. tuberculosis in Versuchstieren zu vermindern, wenn sie als Impfstoff verabreicht werden, identifiziert werden. Geeignete Impfstoffpräparationen zur Verwendung an Versuchstieren sind ausführlich unten beschrieben. Die Wirksamkeit kann anhand der Fähigkeit des Antigens, wenigstens eine 50%ige Reduktion der Bakterienanzahlen und/oder wenigstens eine etwa 40%ige Abnahme der Mortalität nach einer experimentellen Infektion zu liefern, bestimmt werden. Zu geeigneten Versuchstieren gehören Mäuse, Meerschweinchen und Primaten.
Antigene mit besseren diagnostischen Eigenschaften können allgemein anhand der Fähigkeit identifiziert werden, eine Antwort in einem an einem Individuum mit aktiver Tuberkulose durchgeführten intradermalen Hauttest jedoch nicht in einem an einem Individuum, das nicht mit M. tuberculosis infiziert ist, durchgeführten Test hervorzurufen. Hauttests können allgemein wie unten beschrieben durchgeführt werden, wobei eine Antwort von wenigstens 5 mm Verhärtung als positiv angesehen wird.
Immunogene Anteile der hier beschriebenen Antigene können mit allgemein bekannten Techniken, wie beispielsweise denjenigen, die bei Paul, Fundamental Immunology, 3. Ausg., Raven Press, 1993, S. 243-247 und den darin angegebenen Literaturstellen zusammengefaßt sind, hergestellt und identifiziert werden. Zu derartigen Techniken gehören das Screening von Polypeptidanteilen des nativen Antigens auf immunogene Eigenschaften. Die hier beschriebenen repräsentativen Proliferation- und Zytokinproduktionstests können dabei allgemein bei diesem Screening-Verfahren eingesetzt werden. Bei einem immunogenen Anteil eines Polypeptids handelt es sich um einen Anteil, der in solchen repräsentativen Tests eine Immunantwort (z.B. Proliferation, Interferon-γ-Produktion und/oder Interleukin-12-Produktion) erzeugt, die weitgehend ähnlich zu der durch das Vollängen-Antigen erzeugten Immunantwort ist. Mit anderen Worten: ein immunogener Anteil eines Antigens kann wenigstens etwa 20% und vorzugsweise etwa 100% der durch das Vollängen-Antigen in dem hier beschriebenen Prolifera tionstestmodell induzierten Proliferation erzeugen. Ebenso kann ein immunogener Anteil auch oder alternativ die Produktion von wenigstens etwa 20%, und vorzugsweise etwa 100, des durch das Vollängen-Antigen in dem hier beschriebenen Testmodell induzierten Interferon-γ und/oder Interleukin-12 stimulieren.
Anteile und andere Varianten von M. tuberculosis-Antigenen können mit synthetischen oder rekombinanten Mitteln erzeugt werden. Synthetische Polypeptide mit weniger als etwa 100 Aminosäuren und im allgemeinen weniger als etwa 50 Aminosäuren können mit dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannten Techniken erzeugt werden. So können beispielsweise derartige Polypeptide unter Verwendung einer der im Handel erhältlichen Festphasentechniken, wie beispielsweise dem Festphasensyntheseverfahren nach Merrifield, bei dem Aminosäuren sequentiell an eine wachsende Aminosäurekette addiert werden, synthetisiert werden. Siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. Geräte zur automatischen Synthese von Polypeptiden sind im Handel von Lieferfirmen, wie beispielsweise Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA erhältlich und können gemäß den Anweisungen des Herstellers betrieben werden. Varianten eines nativen Antigens können im allgemeinen unter Verwendung von Standardmutagenesetechniken, wie beispielsweise oligonukleotidgerichteter stellenspezifischer Mutagenese, hergestellt werden. Abschnitte der DNA-Sequenz können auch mit Standardtechniken entfernt werden, um die Herstellung verkürzter Polypeptide zu gestatten.
Rekombinante Polypeptide, die Anteile und/oder Varianten eines nativen Antigens enthalten, können leicht aus einer DNA-Sequenz, die für das Polypeptid codiert, unter Verwendung einer Vielzahl von dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannten Techniken produziert werden. So können beispielsweise Überstände von geeigneten Wirt/Vektor-Systemen, die rekombinantes Protein in Kul turmedien sezernieren, zunächst unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Filters aufkonzentriert werden. Nach der Aufkonzentrierung kann das Konzentrat auf eine geeignete Aufreinigungsmatrix, wie beispielsweise eine Affinitätsmatrix oder ein Ionenaustauschharz, aufgetragen werden. Schließlich können ein oder mehrere Reverse-Phase-HPLC-Schritte zur weiteren Aufreinigung eines rekombinanten Proteins eingesetzt werden.
Zur Expression rekombinanter Polypeptide der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger Expressionsvektor aus einer Vielzahl von Expressionsvektoren, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, eingesetzt werden. Die Expression läßt sich in einer beliebigen entsprechenden Wirtszelle, die mit einem ein für ein rekombinantes Polypeptid codierendes DNA-Molekül enthaltenden Expressionsvektor transformiert oder transfiziert wurde, erzielen. Zu geeigneten Wirtszellen gehören Prokaryonten, Hefe und höhere eukaryontische Zellen. Vorzugsweise handelt es sich bei den eingesetzten Wirtszellen um E. coli, Hefe oder eine SäugerZellinie, wie z.B. COS oder CHO. Die auf diese Weise exprimierten DNA-Sequenzen können für natürlich vorkommende Antigene, Anteile natürlich vorkommender Antigene oder andere Varianten davon codieren.
Im allgemeinen werden unabhängig von dem Herstellungsverfahren die hier offenbarten Polypeptide in weitgehend reiner Form hergestellt. Dabei sind die Polypeptide wenigstens etwa 80% rein, stärker bevorzugt wenigstens etwa 90% rein und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 99% rein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, die unten ausführlich beschrieben sind, sind die weitgehend reinen Polypeptide in pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Impfstoffen zur Verwendung in einem oder mehreren der hier offenbarten Verfahren enthalten.
In weiteren spezifischen Ausführungsformen offenbart die vorliegende Erfindung Polypeptide, die wenigstens einen immunogenen Anteil eines M. tuberculosis-Antigens (oder einer Variante eines solchen Antigens), der gegebenenfalls löslich sein kann und der eine oder mehrere der von (a) der DNA-Sequenz der SEQ ID No: 46, (b) weitgehend zu einer Sequenz in (a) homologen DNA-Sequenzen codierten Aminosäuresequenzen umfaßt.
In den oben erörterten spezifischen Ausführungsformen gehören zu den M. tuberculosis-Antigenen Varianten, die von DNA-Sequenzen codiert werden, die weitgehend homolog zu einer oder mehreren der hier spezifisch zitierten DNA-Sequenzen sind. „Weitgehende Homologie", wie hier verwendet, bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Hybridisierung unter mäßig stringenten Bedingungen fähig sind. Geeignete mäßig stringente Bedingungen umfassen das Vorwaschen in einer Lösung aus 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); Hybridisieren bei 50°C-65°C, 5 × SSC über Nacht oder, im Fall einer Kreuzspezies-Homologie bei 45°C, 0,5 × SSC und anschließendes zweimaliges Waschen für jeweils 20 Minuten bei 65°C mit jeweils 2 ×, 0, 5 × und 0, 2 × SSC mit 0,1% SDS). Derartige hybridisierende DNA-Sequenzen sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt, genauso wie Nukleotidsequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des Codes für ein immunogenes Polypeptid codieren, das von einer hybridisierenden DNA-Sequenz codiert wird.
In einem verwandten Aspekt werden durch die vorliegende Erfindung Fusionsproteine, umfassend ein erstes und ein zweites erfindungsgemäßes Polypeptid oder alternativ ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung sowie ein bekanntes M. tuberculosis-Antigen, wie z.B. das oben beschriebene 38-kD-Antigen oder ESAT-6 (SEQ ID No: 103 und 104), zusammen mit Varianten solcher Fusionsproteine bereitgestellt. Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung können auch ein Linkerpeptid zwischen dem ersten und dem zweiten Polypeptid enthalten.
Eine für ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung codierende DNA-Sequenz wird unter Verwendung bekannter rekombinanter DNA-Techniken konstruiert, um getrennte DNA-Sequenzen, die für das erste und das zweite Polypeptid codieren, zusammen in einen geeigneten Expressionsvektor zu bringen. Das 3'-Ende einer für das erste Polypeptid codierenden DNA-Sequenz wird dabei mit oder ohne einen Peptidlinker an das 5'-Ende einer für das zweite Polypeptid codierende DNA-Sequenz ligiert, so daß sich die Sequenzen im gleichen Leseraster befinden, um die mRNA-Translation der beiden DNA-Sequenzen in ein einziges Fusionsprotein zu gestatten, das die biologische Aktivität sowohl des ersten als auch des zweiten Polypeptids behält.
Zur Trennung des ersten und des zweiten Polypeptids in einem Abstand, der ausreicht, um sicherzustellen, daß jedes Polypeptid in seine jeweilige Sekundär- und Tertiärstruktur faltet, kann eine Peptid-Linkersequenz eingesetzt werden. Dabei wird eine solche Peptid-Linkersequenz in das Fusionsprotein unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Standardtechniken eingebaut. Geeignete Polypeptid-Linkersequenzen können anhand der folgenden Faktoren gewählt werden: (1) ihrer Fähigkeit zur Einnahme einer flexiblen erweiterten Konformation; (2) ihrer Unfähigkeit, eine Sekundärstruktur einzunehmen, die mit funktionsfähigen Epitopen auf dem ersten und dem zweiten Polypeptid Wechselwirken könnte; und (3) dem Fehlen hydrophober oder geladener Reste, die mit den funktionsfähigen Polypeptidepitopen reagieren könnten. Bevorzugte Peptid-Linkersequenzen enthalten die Reste Gly, Asn und Ser. Andere fast neutrale Aminosäuren, wie beispielsweise Thr und Ala können auch in der Linkersequenz verwendet werden. Aminosäuresequenzen, die als Linker in geeigneter Weise eingesetzt werden können, umfassen diejenigen, die bei Maratea et al., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; US-Patent Nr. 4,935,233 und US-Patent Nr. 4,751,180 offenbart sind. Die Linkersequenz kann eine Länge von 1 bis etwa 50 Aminosäuren aufweisen. Peptidsequenzen werden nicht benötigt, wenn das erste und das zweite Polypeptid keine nichtessentiellen N-terminalen Aminosäurebereiche besitzen, die dann zur Trennung der funktionsfähigen Domänen verwendet werden können und eine sterische Interferenz verhindern.
Die ligierten DNA-Sequenzen sind mit geeigneten transkriptions- oder translationsregulatorischen Elementen operativ verknüpft. Die für die Expression von DNA verantwortlichen regulatorischen Elemente sind nur 5' von der die ersten Polypeptide codierenden DNA-Sequenz lokalisiert. In ähnlicher Weise sind zur Beendigung der Translation benötigte Stopkodons und Transkriptionsterminationssignale nur 3' zur das zweite Polypeptid codierenden DNA-Sequenz vorhanden.
In einem weiteren Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung eines oder mehrerer der obigen Polypeptide oder Fusionsproteine (oder für solche Polypeptide codierender DNA-Moleküle) zur Induktion einer schützenden Immunität gegen Tuberkulose in einem Patienten. Ein „Patient", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen beliebigen Warmblüter, vorzugsweise einen Menschen. Ein Patient kann dabei an einer Krankheit leiden oder kann frei von einer nachweisbaren Krankheit und/oder Infektion sein. Mit anderen Worten: eine schützende Immunität kann zur Vorbeugung oder Behandlung von Tuberkulose induziert werden.
In diesem Aspekt liegt das Polypeptid, Fusionsprotein oder DNA-Molekül im allgemeinen in einer pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder einem Impfstoff vor. Pharmazeutische Zusammensetzungen können ein oder mehrere Polypeptide, die jeweils eine oder mehrere der obigen Sequenzen (oder Varianten davon) enthalten können, sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger umfassen. Impfstoffe können ein oder mehrere der obigen Polypeptide sowie einen nichtspezifischen Immunantwort-Enhancer, wie z.B. ein Adjuvans oder ein Liposom (in das das Polypeptid eingebaut ist) umfassen. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe können auch weitere M. tuberculosis-Antigene enthalten, wobei diese entweder in ein Kombinationspolypeptid eingebaut sind oder in einem getrennten Polypeptid vorliegen.
Als Alternative kann ein Impfstoff für ein oder mehrere wie oben beschriebene Polypeptide, wie etwa das in situ erzeugte Polypeptid, codierende DNA enthalten. In solchen Impfstoffen kann die DNA in einem beliebigen aus einer Vielfalt von Zuführungssystemen, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, einschließlich Nukleinsäureexpressionssystemen, bakteriellen und viralen Expressionssystemen, vorliegen. Geeignete Nukleinsäureexpressionssysteme enthalten die zur Expression in dem Patienten notwendigen DNA-Sequenzen (wie z.B. einen geeigneten Promotor und ein geeignetes Terminationssignal). Bei bakteriellen Zuführungssystemen wird ein Bakterium (wie z.B. Bacillus-Calmelte-Guerrin) verabreicht, das einen immunogenen Anteil des Polypeptids auf seiner Zelloberfläche exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA unter Verwendung eines viralen Expressionssystems (z.B. Vaccinia oder anderes Poxvirus, Retrovirus oder Adenovirus) eingeführt werden, wobei der Einsatz eines nichtpathogenen (defekten), replikationskompetenten Virus erfolgen kann. Techniken zum Einbau von DNA in solche Expressionssysteme sind dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannt. Die DNA kann auch „nackt" vorliegen, wie beispielsweise bei Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993 sowie in einem Übersichtsartikel von Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993 beschrieben. Die Aufnahme von nackter DNA kann durch Beschichten der DNA auf bioabbaubare Kügelchen, die effizient in die Zellen transportiert werden, erhöht werden.
In einem verwandten Aspekt kann ein wie oben beschriebener DNA-Impfstoff gleichzeitig mit oder im Anschluß an entweder ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein bekanntes M. tuberculosis-Antigen, wie z.B. das oben beschriebene 38-kD-Antigen, verabreicht werden. So kann sich beispielsweise an die Verabreichung von für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codierender DNA, entweder „in nackter" Form oder in Form eines wie oben beschriebenen Zuführungssystems, die Verabreichung eines Antigens anschließen, um den schützenden Immuneffekt des Impfstoffs zu verstärken.
Die Verabreichungswege und Häufigkeit der Verabreichung variieren ebenso wie die Dosierung von Individuum zu Individuum und können zu den zur Zeit bei der Immunisierung mit BCG verwendeten parallel verlaufen. Im allgemeinen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe durch Injektion (z.B. intrakutan, intramuskulär, intravenös oder subkutan), intranasal (z.B. durch Aspiration) oder oral verabreicht werden, dabei können über einen 1-36-wöchigen Zeitraum zwischen 1 und 3 Dosen verabreicht werden. Vorzugsweise werden 3 Dosen verabreicht, und zwar in Intervallen von 3-4 Monaten, wobei anschließend Auffrischungsimpfungen regelmäßig gegeben werden können. Bei individuellen Patienten können andersartige Regimes geeignet sein. Bei einer geeigneten Dosis handelt es sich um eine Menge an Polypeptid oder DNA, die bei wie oben beschriebener Verabreichung dazu in der Lage ist, eine Immunantwort in einem immunisierten Patienten zu produzieren, die ausreicht, um den Patienten vor einer Infektion mit M. tuberculosis mindestens 1 bis 2 Jahre zu schützen. Im allgemeinen liegt die in einer Dosis vorhandene Menge an Polypeptid (oder von der DNA in situ produzierten Menge in einer Dosis) im Bereich von etwa 1 pg bis etwa 100 mg pro kg Wirt, typischerweise von etwa 10 pg bis etwa 1 mg und vorzugsweise von etwa 100 pg bis etwa 1 μg. Geeignete Dosengrößen variieren mit der Größe des Patienten, liegen aber typischerweise im Bereich von etwa 0,1 ml bis etwa 5 ml.
Zwar können alle dem Durchschnittsfachmann bekannten geeigneten Träger in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, doch variiert die Art des Trägers je nach der Verabreichungsweise. Für die parenterale Verabreichung, wie z.B. subkutane Injektion, umfaßt der Träger vorzugsweise Wasser, Kochsalzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Zur oralen Verabreichung kann einer der obigen Träger oder ein fester Träger, wie z.B. Mannit, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Zellulose, Glukose, Saccharose und Magnesiumcarbonat eingesetzt werden. Ebenso können bioabbaubare Mikrokügelchen (z.B. Polymilchsäuregalaktid) als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Geeignete bioabbaubare Mikrokügelchen sind beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4,897,268 und 5,075,109 offenbart.
In den Impfstoffen der vorliegenden Erfindung können zur nichtspezifischen Verstärkung der Immunantwort beliebige vielfältige Adjuvantien eingesetzt werden. Die meisten Adjuvantien enthalten eine Substanz, die zum Schutz des Antigens vor schnellem Abbau vorgesehen ist, wie z.B. Aluminiumhydroxid oder Mineralöl, sowie einen nichtspezifischen Stimulator von Immunantworten, wie z.B. Lipid A, Bordatella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis. Geeignete Adjuvantien sind im Handel beispielsweise als Freund's Incomplete Adjuvans und Freund's Complete Adjuvans (Difco Laboratories) und Merck Adjuvans 65 (Merck und Company, Inc,. Rahway, NJ) erhältlich. Zu weiteren geeigneten Adjuvantien zählen Alaun, bioabbaubare Mikrokügelchen, Monophosphoryllipid A und Quil A.
In einem weiteren Aspekt werden durch die vorliegende Erfindung Verfahren zur Verwendung eines oder mehrerer der oben beschriebenen Polypeptide zur Diagnose von Tu berkulose unter Verwendung eines Hauttests bereitgestellt. Bei einem „Hauttest", wie hier verwendet, handelt es sich um einen beliebigen Test, der direkt am Patienten durchgeführt wird und bei dem eine DTH (delayed-type hypersensitivity)-Reaktion (wie z.B. Anschwellung, Rötung oder Dermatitis) nach intradermaler Injektion eines oder mehrerer wie oben beschriebener Polypeptide gemessen wird. Eine solche Injektion läßt sich unter Verwendung einer beliebigen geeigneten Vorrichtung, die dem Inkontaktbringen des Polypeptids oder der Polypeptide mit Dermiszellen des Patienten genügt, wie beispielsweise einer Tuberkulinspritze oder 1-ml-Spritze, erzielen. Vorzugsweise wird die Reaktion wenigstens 48 Stunden nach der Injektion, stärker bevorzugt 48-72 Stunden nach der Infektion gemessen.
Bei der DTH-Reaktion handelt es sich um eine zellenvermittelte Immunantwort, die bei Patienten, die zuvor dem Testantigen (d.h. dem immunogenen Anteil des eingesetzten Polypeptids oder einer Variante davon) ausgesetzt wurden, stärker ist. Die Antwort kann visuell unter Verwendung eines Lineals gemessen werden. Im allgemeinen handelt es sich bei einer Antwort, die einen Durchmesser von mehr als 0,5 cm, vorzugsweise einen Durchmesser von mehr als 1,0 cm, aufweist, um eine positive Antwort, die eine Tuberkuloseinfektion anzeigt, die sich gegebenenfalls als aktive Krankheit manifestieren kann.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise zur Verwendung in einem Hauttest als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert, die ein Polypeptid sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger, wie oben beschrieben, enthalten. Derartige Zusammensetzungen enthalten typischerweise ein oder mehrere der obigen Polypeptide in einer Menge im Bereich von etwa 1 μg bis etwa 100 μg, vorzugsweise von etwa 10 μg bis etwa 50 μm in einem Volumen von 0,1 ml. Vorzugsweise handelt es sich bei dem in derartigen pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzten Träger um eine Kochsalzlösung mit geeigneten Konservierungsstoffen, wie z.B. Phenol und/oder Tween 80^TM.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist ein in einem Hauttest eingesetztes Polypeptid eine Größe auf, die dazu ausreicht, daß es an der Injektionsstelle über die Länge des Reaktionszeitraums verbleibt. Dabei genügt im allgemeinen ein Polypeptid, das eine Länge von wenigstens 9 Aminosäuren aufweist. Das Polypeptid wird ebenso vorzugsweise von Makrophagen innerhalb von Stunden nach der Injektion abgebaut, um die Präsentation an T-Zellen zu gestatten. Solche Polypeptide können Wiederholungen von einer oder mehreren der obigen Sequenzen und/oder andere immunogene oder nichtimmunogene Sequenzen enthalten.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht als Beschränkung bereitgestellt.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON POLYPEPTIDEN AUS M. TUBERCULOSIS-KULTURFILTRAT
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von löslichen M. tuberculosis-Polypeptiden aus Kulturfiltrat. Wenn nicht anders angegeben, handelt es sich bei allen Prozentangaben im folgenden Beispiel um Gewicht pro Volumen.
M. tuberculosis (entweder H37Ra, ATTC Nr. 25177 oder H37Rv, ATTC Nr. 25618) wurde in sterilem GAS-Medium 14 Tage bei 37°C kultiviert. Das Medium wurde dann durch ein 0,45 μm-Filter in eine sterile 2,5 l-Flasche vakuumfiltriert (wobei der größte Teil der Zellen zurückbleibt). Das Medium wurde danach durch ein 0,2 μm- Filter in eine sterile 4 l-Flasche filtriert, wobei das Kulturfiltrat mit NaN₃ auf eine Konzentration von 0,04% versetzt wurde. Die Flaschen wurden dann bei 4°C in einen Kühlraum gestellt.
Das Kulturfiltrat wurde konzentriert, indem das Filtrat in ein 12 l-Reservoir, das zuvor autoklaviert wurde, gegeben wurde und das Filtrat in eine 400-ml-Amicon-Rührzelle eingeleitet wurde, die mit Ethanol gespült worden war und eine 10.000-kDa-MWCO-Membran enthielt. Der Druck wurde bei 60 psi mittels Stickstoffgas gehalten. Mit diesem Verfahren wurde das Volumen von 12 l auf ungefähr 50 ml reduziert.
Das Kulturfiltrat wurde in 0,1% Ammoniumhydrogencarbonat unter Verwendung einer 8000-kDa-MWCO-Zelluloseestermembram dialysiert, wobei zwei Wechsel von Ammoniumhydrogencarbonatlösung vorgenommen wurden. Anschließend wurde die Proteinkonzentration mittels eines im Handel erhältlichen BCA-Tests (Pierce, Rockford, IL) bestimmt.
Das dialysierte Kulturfiltrat wurde dann lyophilisiert und die Polypeptide in destilliertem Wasser resuspensiert. Die Polypeptide wurden gegen 0,01 mM 1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)-methylamino]propan, pH 7,5 (Bis-Tris-Propan-Puffer), den Anfangsbedingungen für die Anionenaustauschchromatographie, dialysiert. Die Fraktionierung wurde unter Verwendung einer Gelprofusionschromatographie an einer POROS 146 II Q/M-Anionenaustauschsäule, 4,6 mm × 100 mm (Perseptive Bio-Systems, Framingham, MA), äquilibriert in 0,01 mM Bis-Tris-Propan-Puffer, pH 7,5, durchgeführt. Die Polypeptide wurden mit einem linearen 0-0,5 M-NaCl-Gradienten in dem obigen Puffersystem eluiert. Das Säulenelutionsmittel wurde bei einer Wellenlänge von 220 nm beobachtet.
Die vereinten Mengen an aus der Ionenaustauschsäule e luierten Polypeptiden wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das erhaltene Material wurde in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), pH 1,9, in Wasser gelöst, und die Polypeptide wurden an einer Delta-Pak-C18-Säule (Waters, Milford, MA), Porengröße: 300 Angström, Partikelgröße 5 Mikrometer (3,9 × 150 mm) gereinigt. Die Polypeptide wurden aus der Säule mit einem linearen Gradienten aus 0-60% Verdünnungspuffer (0,1% TFA in Acetonitril) eluiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,75 ml/Minute, und das HPLC-Elutionsmittel wurde bei 214 nm beobachtet. Die eluierten Polypeptide enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, um die Reinheit der individuellen Proben zu maximieren. Dabei wurden ungefähr 200 gereinigte Polypeptide erhalten.
Die gereinigten Polypeptide wurden dann einem Screening auf die Fähigkeit zur Induktion der T-Zellen-Proliferation in PBMC-Präparationen unterzogen. Dabei wurden die PBMCs aus Spendern, von denen man wußte, daß sie PPD-Hauttest-positiv waren und bei denen gezeigt werden konnte, daß ihre T-Zellen als Antwort auf PPD proliferieren, sowie lösliche Rohproteine von MTB in Medium, umfassend RPMI 1640, suplementiert mit 10%igem gepoolten menschlichen Serum und 50 μg/ml Gentamizin, kultiviert. Gereinigte Polypeptide wurden in Doppelbestimmung bei Konzentrationen von 0,5 bis 10 μg/ml zugegeben. Nach 6 Tagen Kultivierung in 96-Loch-Platten mit Rundboden in einem Volumen von 200 μl wurden jeweils 50 μl Medium aus den Löchern zur Bestimmung der IFN-γ-Niveaus, wie unten beschrieben, entnommen. Die Platten wurden dann mit 1 μ Ci/Loch tritiertem Thymidin weitere 18 Stunden gepulst, dann geerntet, und die Tritiumaufnahme wurde unter Verwendung eines Gasszintillationszählers bestimmt. Dabei wurden Fraktionen, die zu einer Proliferation in beiden Replikaten führten, die dreimal größer war als die in in Medium allein kultivierten Zellen beobachtete Proliferation, als positiv angesehen.
IFN-γ wurde unter Verwendung eines ELISA-Tests (enzymelinked immunosorbent assay) gemessen. Dabei wurden ELI-SA-Platten mit einem gegen menschliches IFN-γ gerichteten monoklonalen Antikörper der Maus (PharMingen, San Diego, CA) in PBS vier Stunden bei Raumtemperatur beschichtet. Die Löcher wurden dann mit PBS mit 5% (W/V) fettfreier Trockenmilch eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurden die Platten sechsmal in PBS/0,2% TWEEN-20 gewaschen, und 1:2 in Kulturmedium verdünnte Proben in den ELISA-Platten über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wiederum gewaschen, und in jedes Loch wurde ein 1:3000 in PBS/10% normales Ziegenserum verdünntes polyklonales Kaninchen-Anti-Mensch-IFN-γ-Serum gegeben. Anschließend wurden die Platten zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen, und dann wurde Meerrettich-Peroxidase-gekoppeltes Anti-Kaninchen-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei einer Verdünnung von 1:2000 in PBS/5% fettfreie Trockenmilch zugegeben. Nach weiteren zwei Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen und mit TMB-Substrat versetzt. Die Reaktion wurde nach 20 Min. mit 1 N Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte wurde bei 450 nm bestimmt, wobei eine Referenzwellenlänge von 570 nm verwendet wurde. Fraktionen, die dazu führten, daß beide Replikate eine OD ergeben, die zweimal größer ist als die mittlere OD von in Medium allein kultivierten Zellen, plus 3 Standardabweichungen, wurden als positiv angesehen.
Zur Sequenzierung wurden die Polypeptide einzeln auf mit Biobrene^TM (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) behandelten Glasfaserfiltern getrocknet. Die Filter mit Polypeptid wurden auf ein Proteinsequenziergerät Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492 geladen. Die Polypeptide wurden vom Aminoende unter Verwendung der traditionellen Edman-Chemie sequenziert. Die Aminosäuresequenz wurde für je des Polypeptid bestimmt, indem die Retentionszeit des PTH-Aminosäurederivats gegenüber den entsprechenden PTH-Standardderivaten verglichen wurde.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Vorgehensweise wurden Antigene mit den folgenden N-terminalen Sequenzen isoliert:
wobei Xaa für eine beliebige Aminosäure stehen kann.
Zusätzliche lösliche Antigene wurden aus M. tuberculosis-Kulturfiltrat wie folgt isoliert. M. tuberculosis-Kulturfiltrat wurde wie oben beschrieben hergestellt. Nach der Dialyse gegen Bis-Tris-Propan-Puffer bei pH 5,5 wurde die Fraktionierung unter Verwendung von Anionenaustauschchromatographie an einer Poros-QE-Säule, 4,6 × 100 mm (Perseptive Biosystems), äquilibriert in Bis-Tris-Propan-Puffer, pH 5,5, durchgeführt. Die Polypeptide wurden mit einem linearen 0-1,5 M-NaCl-Gradienten in dem obigen Puffersystem bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. eluiert. Das Säulenelutionsmittel wurde bei einer Wellenlänge von 214 nm beobachtet.
Die aus der Ionenaustauschsäule eluierten Fraktionen wurden vereint und einer Reverse-Phase-Chromatographie unter Verwendung einer Poros-R2-Säule, 4,6 × 100 mm (Perseptive Biosystems), unterzogen. Polypeptide wurden aus der Säule mit einem linearen Gradienten von 0-100% Acetonitril (0,1% TFA) mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/Min. eluiert. Das Elutionsmittel wurde bei 214 nm beobachtet.
Die eluierten Polypeptide enthaltende Fraktionen wurden lyophylisiert und in 80 μl wäßriger 0,1% TFA resuspendiert und einer weiteren Reverse-Phase-Chromatographie an einer Vydac-C4-Säule, 4,6 × 150 mm (Western Analytical, Temecula, CA) mit einem linearen Gradienten von 0-100% Acetonitril (0,1% TFA) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min. unterzogen. Das Elutionsmittel wurde bei 214 nm beobachtet.
Die Fraktion mit biologischer Aktivität wurde in einen Hauptpeak plus weiteren kleineren Komponenten getrennt. Der Western-Blot dieses Peaks auf eine PVDF-Membran zeigte 3 Hauptbanden mit Molekulargewichten von 14 kD, 20 kD und 26 kD. Für diese Polypeptide wurden die folgenden N-terminalen Sequenzen bestimmt:
wobei Xaa für eine beliebige Aminosäure stehen kann.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Tests konnte gezeigt werden, daß diese Polypeptide die Proliferation und IFN-γ-Produktion in PBMC-Präparationen induzieren. In 1A und B sind die Ergebnisse solcher Tests unter Verwendung von PBMC-Präparationen aus einem ersten bzw. einem zweiten Spender dargestellt.
DNA-Sequenzen, die für die mit (a), (c) und (g) bezeichneten Antigene oben codieren, wurden durch Screening einer genomischen M. tuberculosis-Bibliothek unter Verwendung von ³²P-endmarkierten degenerierten Oligonukleotiden, die der N-terminalen Sequenz entsprachen und eine Tendenz zu M. tuberculosis-Kodons enthielten, erhalten. Das unter Verwendung einer dem Antigen (a) oben entsprechenden Sonde durchgeführte Screening identifizierte einen Klon mit der in SEQ ID No: 101 angegebenen Sequenz. Das von SEQ ID No: 101 codierte Polypeptid ist in SEQ ID No: 102 angegeben. Durch das unter Verwendung einer dem Antigen (g) oben entsprechenden Sonde durchgeführte Screening wurde ein Klon mit der in SEQ ID No: 52 angegebenen Sequenz identifiziert. Das von SEQ ID No: 52 codierte Polypeptid ist in SEQ ID No: 53 angegeben. Durch das mit einer dem Antigen (c) entsprechenden Sonde durchgeführte Screening wurde ein Klon mit der in SEQ ID No: 25 angegebenen Sequenz identifiziert.
Die obigen Aminosäuresequenzen wurden mit bekannten Aminosäuresequenzen in der Genbank unter Verwendung des DNA STAR-Systems verglichen. Die durchsuchte Datenbank enthält etwa 173.000 Proteine, wobei es sich um eine Kombination aus den Datenbanken Swiss, PIR zusammen mit translatierten Proteinsequenzen handelt (Version 87). Dabei wurden keine signifikanten Homologien zu den Aminosäuresequenzen für die Antigene (a)-(g) und (l) nachgewiesen.
Es stellte sich heraus, daß die Aminosäuresequenz für Antigen (j) zu einem bekannten, aus einer DNA-Sequenz translatierten M. tuberculosis-Protein homolog ist. Nach bestem Wissen der Erfinder konnte bislang nicht gezeigt werden, daß dieses Protein eine T-Zellen stimulierende Aktivität besitzt. Es stellte sich heraus, daß die Aminosäuresequenz für Antigen (k) mit einer Sequenz aus M. leprae verwandt ist.
Bei den oben beschriebenen Proliferations- und IFN-γ-Tests mit 3 PPD-positiven Spendern sind die Ergebnisse für die oben bereitgestellten repräsentativen Antigene in Tabelle 1 dargestellt:
TABELLE 1 ERGEBNISSE DER PBMC-PROLIFERATIONS- UND IFN-γ-TESTS
In Tabelle 1 erzielten Antworten, die einen Stimulationsidex (SI) zwischen 2 und 4 (verglichen mit in Medium allein kultivierten Zellen) ergaben, ein +, ein SI von 4-8 oder 2-4 bei einer Konzentration von 1 μg oder weniger erzielte ein ++ Zeichen und ein SI von mehr als 8 erzielte ein +++. Es stellte sich heraus, daß das Antigen der Sequenz (i) einen hohen SI-Wert (+++) für einen Spender und einen niedrigeren SI-Wert (++ und +) für die beiden anderen Spender in sowohl dem Proliferations- als auch dem IFN-γ-Test aufwies. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß diese Antigene zur Induktion der Proliferation und/oder Interferon-γ-Produktion fähig sind.
BEISPIEL 2
VERWENDUNG VON PATIENTENSEREN ZUR ISOLIERUNG VON M. TUBERCULOSIS-ANTIGENEN
Dieses Beispiel veranschaulicht die Isolierung von Antigenen aus M. tuberculosis-Lysat durch Screening mit Serum aus mit M. tuberculosis infizierten Individuen.
Der hydratisierte M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories) wurde zu einer 2%igen NP40-Lösung gegeben und abwechselnd dreimal homogenisiert und mit Ultraschall behandelt. Die erhaltene Suspension wurde bei 13.000 UpM in Mikrozentrifugenröhrchen zentrifugiert und der Überstand durch ein 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter gegeben. Das Filtrat wurde an Macro Prep DEAE- Kügelchen (BioRad, Hercules, CA) gebunden. Die Kügelchen wurden ausgiebig mit 20 mM Tris pH 7,5 gewaschen, und die gebundenen Proteine wurden mit 1 M NaCl eluiert. Das 1 M-NaCl-Eluat wurde über Nacht gegen 10 mM Tris, pH 7,5 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde mit DNase und RNase bei 0,05 mg/ml 30 Min. bei Raumtemperatur behandelt und anschließend mit ⎕-D-Mannosidase, 0,5 U/mg bei pH 4,5 3-4 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Nach Wiedereinstellung von pH 7,5 wurde das Material über FPLC an einer Bio Scale-Q-20-Säule (BioRad) fraktioniert. Die Fraktionen wurden in neun Pools vereinigt, in einem Centriprep 10 (Amicon, Beverley, MA) konzentriert und anschließend einem Screening durch Western-Blot auf serologische Aktivität unter Verwendung eines Serumpools von mit M. tuberculosis infizierten Patienten, der keine Immunoreaktion mit anderen Antigenen der vorliegenden Erfindung zeigte, unterzogen.
Die reaktivste Fraktion wurde auf SDS-PAGE gelaufen und auf PVDF übertragen. Eine Bande bei ungefähr 85 kD wurde ausgeschnitten, was die folgende Sequenz ergab:
wobei Xaa für eine beliebige Aminosäure stehen kann.
Ein Vergleich dieser Sequenz mit denen in der Genbank, wie oben beschrieben, zeigte keine signifikanten Homologien zu bekannten Sequenzen.
BEISPIEL 3
HERSTELLUNG VON DNA-SEQUENZEN, DIE FÜR M. TUBERCULOSISANTIGENE CODIEREN
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von DNA-Sequenzen, die für M. tuberculosis-Antigene codieren, durch ein Screening einer M. tuberculosis-Expressionsbibliothek mit aus mit M. tuberculosis infizierten Patienten erhaltenen Seren oder mit gegen lösliche M. tuberculosis-Antigene produzierten Antiseren.
A. HERSTELLUNG VON LÖSLICHEN M. TUBERCULOSIS ANTIGENEN UNTER VERWENDUNG VON KANINCHEN-ANTISEREN
Genomische DNA wurde aus dem M. tuberculosis-Stamm H37Ra isoliert. Die DNA wurde willkürlich geschert und zur Konstruktion einer Expressionsbibliothek unter Verwendung des Lambda-ZAP-Expressionssystems (Stratagene, La Jolla, CA) eingesetzt. Kaninchen-Antiseren wurden gegen sekretorische Proteine der M. tuberculosis-Stämme H37Ra, H37Rv und Erdman durch Immunisieren eines Kaninchens mit konzentriertem Überstand der M. tuberculosis-Kulturen erzeugt. Insbesondere wurde dabei das Kaninchen zunächst subkutan mit 200 μg Proteinantigen in einem Gesamtvolumen von 2 ml mit 10 μg Muramyl Dipeptid (Calbiochem, La Jolla, CA) und 1 ml inkomplettem Freund's Adjuvans immunisiert. Vier Wochen später wurde dem Kaninchen eine subkutane Auffrischimpfung mit 1 μg Antigen in inkomplettem Freund's Adjuvans verabreicht. Schließlich wurde das Kaninchen intravenös vier Wochen später mit 50 μg Proteinantigen immunisiert. Die Antiseren wurden zum Screening der Expressionsbibliothek, wie bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben, verwendet. Immunreaktive antigenexprimierende Bakteriophagen-Plaques wurden aufgereinigt. Phagemid wurde aus den Plaques gerettet, und die Nukleotidsequenzen der M. tuberculosis-Klone wurden abgeleitet.
32 Klone wurden gereinigt. Von diesen repräsentieren 25 Sequenzen, die bislang noch nicht in menschlichem M. tuberculosis identifiziert wurden. Rekombinante Antigene wurden exprimiert und gereinigte Antigene bei der in Beispiel 1 beschriebenen immunologischen Analyse verwendet. Proteine wurden durch IPTG induziert und durch Gelelution gereinigt, wie bei Skeiky et al., J. Exp. Med. 181: 1527-1537, 1995 beschrieben. In diesem Screening identifizierte repräsentative Sequenzen von DNA-Molekülen sind in SEQ ID Nos.: 1-25 angegeben. Die entsprechenden vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID Nos. 63-87 angegeben.
Beim Vergleich dieser Sequenzen mit bekannten Sequenzen in der Genbank unter Verwendung der oben beschriebenen Datenbanken stellte sich heraus, daß die im folgenden mit TbRA2A, TbRA16, TbRA18 und TbRA29 (SEQ ID Nos. 76, 68, 70, 75) bezeichneten Klone eine gewisse Homologie zu bereits in Mycobacterium leprae, jedoch nicht in M. tuberculosis identifizierten Sequenzen zeigen. TbRA11, TbRA26, TbRA28 und TbDPEP (SEQ ID Nos. 65, 73, 74, 53) wurden bereits in M. tuberculosis identifiziert. Keine signifikanten Homologien fanden sich für TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRR13, TbRA17, TbRa19, TbRA29, TbRA32, TbRA36 sowie die überlappenden Klone TbRA35 und TbRA12 (SEQ ID Nos. 63, 77, 81, 82, 64, 67, 69, 71, 75, 78, 80, 79, 66). Der Klon TbRa24 überlappt mit dem Klon TbRa29.
Die Ergebnisse der PBMC-Proliferations- und Interferon-γ-Tests, die an repräsentativen rekombinanten Antigenen und unter Verwendung von T-Zellen-Präparationen aus mehreren unterschiedlichen gegen M. tuberculosis immunen Patienten durchgeführt wurden, sind in den Tabellen 2 bzw. 3 dargestellt. TABELLE 2 ERGEBNISSE DER PBMC-PROLIFERATION AUF REPRÄSENTATIVE LÖSLICHE ANTIGENE

nt = not tested [nicht getestet]

nt = not tested [nicht getestet]

In Tabelle 2 und 3 erzielten Antworten, die einen Stimulationsindex (SI) zwischen 1,2 und 2 (verglichen mit in Medium allein kultivierten Zellen) ergaben, ein ±, ein SI von 2-4 erzielte ein +, wobei ein SI von 4-8 oder 2-4 bei einer Konzentration von 1 μg oder weniger ein ++ und ein SI-Wert von mehr als 8 ein +++ erzielte. Darüber hinaus ist der Effekt der Konzentration auf die Proliferation und Interferon-γ-Produktion für zwei der obigen Antigene in der beigefügten Figur gezeigt. Sowohl bei der Proliferation als auch der Interferon-γ-Produktion erzielte TbRa3 ein ++ und TbRa9 ein +.
Diese Ergebnisse deuten an, daß diese löslichen Antigene die Proliferation und/oder Interferon-γ-Produktion in aus einem gegen M. tuberculosis immunen Individuum stammenden T-Zellen induzieren können.
B. VERWENDUNG VON PATIENTENSEREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON FÜR M. TUBERCULOSIS-ANTIGENE CODIERENDEN DNA-SEQUENZEN
Die oben beschriebene genomische DNA-Bibliothek sowie eine zusätzliche H37Rv-Bibliothek wurden einem Screening unter Verwendung von Pools von Seren, die aus Patienten mit aktiver Tuberkulose erhalten wurden, unterzogen. Zur Herstellung der H37Rv-Bibliothek wurde genomische DNA des M. tuberculosis-Stamms H37Rv isoliert, einer Teilverdauung mit Sau3A unterzogen und zur Konstruktion einer Expressionsbibliothek unter Verwendung des Lambda ZAP-Expressionssystems (Stratagene, La Jol la, Ca) eingesetzt. Drei unterschiedliche Pools von Seren, die jeweils Seren, die aus drei Individuen mit aktiver Lungen- oder Pleurakrankheit erhalten wurden, enthielten, wurden beim Expressionsscreening verwendet. Die Pools wurden mit TbL, TbM und TbH bezeichnet, was sich auf die relative Reaktivität mit H37Ra-Lysat (d.h. TbL = geringe Reaktivität, TbM = mittlere Reaktivität und TbH = hohe Reaktivität) sowohl im ELISA- als auch im Immunoblot-Format bezieht. Ebenso wurde ein vierter Pool von Seren aus sieben Patienten mit aktiver Lungentuberkulose eingesetzt. Allen Seren fehlte eine erhöhte Reaktivität mit dem rekombinanten 38 kD großen phosphatbindenden Protein aus M. tuberculosis H37Ra.
Alle Pools wurden mit E. coli-Lysat voradsorbiert und zum Screening der H37Ra- und H37Rv-Expressionsbibliotheken, wie bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989, beschrieben verwendet. Immunreaktive Antigene exprimierende Bakteriophagen-Plaques wurden aufgereinigt. Phagemid wurde aus den Plaques gerettet und die Nukleotidsequenzen der M. tuberculosis-Klone wurden abgeleitet.
32 Klone wurden aufgereinigt. Von diesen repräsentierten 31 Sequenzen, die bislang noch nicht in menschlichem M. tuberculosis identifiziert worden waren. Repräsentative Sequenzen der identifizierten DNA-Moleküle sind in SEQ ID Nos. 26-51 und 105 angegeben. Von diesen handelt es sich bei TbH-8 und TbH-8-2 (SEQ ID No: 105) um nichtzusammenhängende DNA-Sequenzen aus dem gleichen Klon und bei TbH-4 (SEQ ID No: 43) und TbH-4-FWD (SEQ ID No: 44) um nichtzusammenhängende Sequenzen aus dem gleichen Klon. Aminosäuresequenzen für die im folgenden als Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9 und TbH-12 identifizierten Antigene sind in SEQ ID Nos. 88-92 gezeigt. Ein Vergleich dieser Sequenzen mit bekannten Sequenzen in der Genbank unter Verwendung der oben identifizierten Datenbanken zeigte keine signifikanten Homologien zu TbH-4, TbH-8, TbH-9 und TbM-3, obwohl schwache Homologien zu TbH-9 gefunden wurden. Es stellte sich heraus, daß TbH-12 homolog zu einem zuvor in M. paratuberculosis identifizierten 34 kD großen antigenen Protein war (Ace. No. 528515). Es stellte sich heraus, das Tb38-1 34 Basenpaare stromaufwärts des offenen Leserasters für das zuvor in M. bovis (Ace. No. U34848) sowie in M. tuberculosis (Sorensen et al., Infec. Immun 63: 1710-1717, 1995) identifizierte Antigen ESAT-6 lokalisiert war.
Von Tb38-1 und TbH-9, die beide aus einer H37Ra-Bibliothek isoliert wurden, abgeleitete Sonden wurden zur Identifizierung von Klonen in einer H37Rv-Bibliothek verwendet. Dabei hybridisierte Tb38-1 an Tb38-IF2, Tb38-1F3, Tb38-1F5 und Tb38-1F6 (SEQ ID Nos. 112, 113, 116, 118 und 119). (SEQ ID Nos. 112 und 113 sind nichtzusammenhängende Sequenzen aus Klon Tb38-1F2). Zwei offene Leseraster wurden in Tb38-1F2 abgeleitet; dabei entspricht eines Tb37FL (SEQ ID No: 114), wobei das zweite, eine Teilsequenz, das Homolog von Tb38-1 sein kann und mit Tb38-IN bezeichnet wird (SEQ ID No: 115). Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Tb38-1F3 ist in SEQ ID No: 117 dargestellt. Eine TbH-9-Sonde identifizierte drei Klone in der H37Rv-Bibliothek: TbH-9-FL (SEQ ID No: 106), bei dem es sich um das Homolog von TbH-9 (R37Ra), TbH-9-1 (SEQ ID No: 108) und TbH-9-4 (SEQ ID No: 110) handeln kann, bei denen es sich jeweils um mit TbH-9 eng verwandte Sequenzen handelt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für diese drei Klone sind in SEQ ID Nos. 107, 109 und 111 dargestellt.
Die Ergebnisse von an Tb38-1, ESAT-6 und anderen repräsentativen rekombinanten Antigenen durchgeführten T-Zellen-Tests sind in den Tabellen 4A, B bzw. 5 unten dargestellt: TABELLE 4A ERGEBNISSE DER PBMC-PROLIFERATION AUF REPRÄSENTATIVE ANTIGENE
TABELLE 4B ERGEBNISSE DER PBMC-INTERFERON-γ-PRODUKTION AUF REPRÄSENTATIVE ANTIGENE
TABELLE 5 ZUSAMMENFASSUNG DER T-ZELLEN-ANTWORTEN AUF REPRÄSENTATIVE ANTIGENE
Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl die erfindungsgemäßen M. tuberculosis-Antigene als auch ESAT-6 die Proliferation und/oder Interferon-γ-Produktion in aus einem gegen M. tuberculosis immunen Individuum gewonnenen T-Zellen induzieren können. Nach bestem Wissen der Erfinder konnte bislang nicht gezeigt werden, daß ESAT-6 menschliche Immunantworten stimuliert.
Ein Satz aus sechs überlappenden Peptiden, die die Aminosäuresequenz des Antigens Tb38-1 abdecken, wurde unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens konstruiert. Die Sequenzen dieser Peptide, die im folgenden mit pep 1-6 bezeichnet werden, sind in SEQ ID No: 93-98 angegeben. Die Ergebnisse von T-Zellen-Tests unter Verwendung dieser Peptide sind in Tabellen 6 und 7 gezeigt. Diese Ergebnisse bestätigen die Existenz und helfen bei der Lokalisierung von T-Zellen-Epitopen in Tb38-1, die zur Induktion der Proliferation und Interferon-γ-Produktion in aus einem gegen M. tuberculosis immunen Individuum gewonnenen T-Zellen fähig sind. TABELLE 6 ERGEBNISSE DER PBMC-PROLIFERATION AUF Tb38-1-ANTIGENE 20
TABELLE 7 ERGEBNISSE DER PBMC-INTERFERON-γ-PRODUKTION AUF Tb38-1-ANTIGENE
BEISPIEL 4
REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES POLYPEPTIDS AUS EINEM TUBERKULIN-GEREINIGTEN PROTEINDERIVAT
Ein M. tuberculosis-Polypeptid wurde aus Tuberkulingereinigtem Proteinderivat (PPD) wie folgt isoliert.
PPD wurde wie veröffentlicht mit geringen Modifikationen hergestellt (Seibert, F. et al., Tuberculin purified protein derivative. Preparation and analyses of a large quantity for standard. The American Review of Tuberculosis 44: 9-25, 1941).
Der Stamm M. tuberculosis Rv wurde 6 Wochen in synthetischem Medium in Rollflaschen bei 37°C angezogen. Flaschen, in denen Bakterienwachstum vorhanden war, wurden dann im Wasserdampf 3 Stunden bei 100°C erhitzt. Die Kulturen wurden unter Verwendung eines 0,22 μm-Filters sterilfiltriert und die Flüssigphase wurde 20mal unter Verwendung einer Membran mit 3 kD Ausschlußgrenze konzentriert. Die Proteine wurden einmal mit 50%iger Ammoniumsulfatlösung und achtmal mit 25%iger Ammoniumsulfatlösung gefällt. Die erhaltenen Proteine (PPD) wurden mittels Reverse-Phase-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) unter Verwendung einer C18-Säule (7,8 × 300 mM; Waters, Milford, MA) in einem Biocad HPLC-System (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) fraktioniert. Die Fraktionen wurden aus der Säule mit einem linearen Gradienten von 0-100% Puffer (0,1% TFA in Acetonitril) eluiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug 10 ml/Minute, und das Elutionsmittel. wurde bei 214 nm und 280 nm beobachtet.
Sechs Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet, in PBS suspendiert und einzeln in mit M. tuberculosis infizierten Meerschweinchen auf die Induktion einer DTH (delayed type hypersensitivity)-Reaktion getestet. Es stellte sich heraus, daß eine Fraktion eine starke DTH-Reaktion induziert, und diese Fraktion wurde anschließend weiter über RP-HPLC an einer microbore Vydac C18-Säule (Kat.-Nr. 218TP5115) in einem Model 172 HPLC-Gerät von Perkin Elmer/Applied Biosystems Division weiter fraktioniert. Die Fraktionen wurden mit einem linearen Gradienten von 5-100% Puffer (0,05% TFA in Acetonitril) mit einer Fließgeschwindigkeit von 80 μl/Minute eluiert. Das Elutionsmittel wurde bei 215 nm beobachtet. Acht Fraktionen wurden gesammelt und auf die Induktion von DTH in mit M. tuberculosis infizierten Meerschweinchen getestet. Es stellte sich heraus, daß eine Fraktion eine starke DTH-Reaktion mit einer Verhärtung von etwa 16 mm induzierte. Die anderen Fraktionen induzierten keine nachweisbare DTH-Reaktion. Die positive Fraktion wurde einer SDS-PAGE-Gelelektrophorese unterzogen, wobei sich herausstellte, daß sie eine einzige Proteinbande mit einem Molekulargewicht von ungefähr 12 kD enthielt.
Dieses Polypeptid, das nachfolgend mit DPPD bezeichnet wird, wurde vom Aminoende her unter Verwendung eines Proteinsequenzgeräts von Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492, wie oben beschrieben, sequenziert, wobei sich herausstellte, daß es die in SEQ ID No: 129 gezeigte N-terminale Sequenz aufwies. Ein Vergleich dieser Sequenz mit bekannten Sequenzen in der Genbank, wie oben beschrieben, zeigte keine bekannten Homologien. Vier Cyanogenbromidfragmente von DPPD wurden isoliert, wobei sich herausstellte, daß sie die in SEQ ID Nos. 130-133 gezeigten Sequenzen aufweisen.
Die Fähigkeit des Antigens DPPD, menschliches PBMC zur Proliferation und zur Produktion von IFN-γ zu stimulieren, wurde wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Wie in Tabelle 8 gezeigt, stellte sich heraus, daß DPPD die Proliferation stimuliert und die Produktion großer Mengen an IFN-γ hervorruft, und zwar mehr als von herkömmlichem PPD hervorgerufen wird.
TABELLE 8 ERGEBNISSE DER PROLIFERATIONS- UND INTERFERON-γ-TESTS AUF DPPD
BEISPIEL 5
SYNTHESE SYNTHETISCHER POLYPEPTIDE
Polypeptide können an einem Peptidsynthesegerät Millipore 9050 unter Verwendung von FMOC-Chemie mit Aktivierung durch HPTU (O-Benzotriazol-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat) synthetisiert werden. Dabei kann eine Gly-Cys-Gly-Sequenz an den Aminoterminus des Peptids angehängt werden, um ein Verfahren zur Konjugation oder Markierung des Peptids bereitzustellen. Die Abspaltung der Peptide von dem festen Träger kann unter Verwendung des folgenden Abspaltungsgemischs durchgeführt werden: Trifluoressigsäure : Ethandithiol : Thioanisol : Wasser : Phenol (40:1:2:2:3). Nach zweistündiger Abspaltung können die Peptide in kaltem Methyl-t-butylether ausgefällt werden. Die Peptidpellets können dann in Wasser mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gelöst und vor der Reinigung über C18-Reverse-Phase-HPLC lyophilisiert werden. Zur Elution der Peptide kann ein Gradient von 0%-60% Acetonitril (mit 0,1% TFA) in Wasser (mit 0,1% TFA) verwendet werden. Nach der Lyophilisierung der reinen Fraktionen können die Peptide unter Verwendung von Elektrospray-Massenspektrometrie und mittels Aminosäureanalyse charakterisiert werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Mycobacterium-Polypeptid, umfassend eine wie in SEQ ID No:88 angegebene Aminosäuresequenz oder eine einen immunogenen Teil der SEQ ID No:88 umfassende Aminosäuresequenz.
Isoliertes Mycobacterium-Polypeptid gemäß Anspruch 1, das aus der in SEQ ID No:88 angegebenen Aminosäuresequenz besteht.
Fusionsprotein, umfassend ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2.
Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 3 sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, ferner umfassend ein Mittel zur Verbesserung einer nichtspezifischen Immunantwort.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Mittel zur Verbesserung einer nichtspezifischen Immunantwort um ein Adjuvans handelt.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Verwendung in einem Nachweisverfahren für Tuberkulose.
Diagnostischer Kit, umfassend: a. ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, und b. eine dem Inkontaktbringen des Polypeptids mit den Dermiszellen eines Patienten genügende Vorrichtung.
Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger zur Verwendung beim Hervorrufen einer Immunantwort in einem Individuum.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, die ferner ein Mittel zur Verbesserung einer nichtspezifischen Immunantwort umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Mittel zur Verbesserung einer nichtspezifischen Immunantwort um ein Adjuvans handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei es sich bei dem Individuum um einen Menschen handelt.
Impfstoff, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 3 sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger.
Rekombinante desoxyribonucleinsäure, codierend für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2.
Nukleinsäure gemäß Anspruch 14, umfassend die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:46.
Expressionsvektor, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 14 oder 15.
Isolierte wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 16.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15 sowie einen physiologisch unbedenklichen Träger.
Impfstoff, umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15 sowie ein Mittel zur Ver besserung einer nichtspezifischen Immunantwort.
Impfstoff, umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15 innerhalb eines bakteriellen oder viralen Expressionssystems.