HU227778B1 - Immogen peptid of m. tuberculosis origin, therapeutic and diagnostic use thereof - Google Patents
Immogen peptid of m. tuberculosis origin, therapeutic and diagnostic use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- HU227778B1 HU227778B1 HU0900047A HUP0900047A HU227778B1 HU 227778 B1 HU227778 B1 HU 227778B1 HU 0900047 A HU0900047 A HU 0900047A HU P0900047 A HUP0900047 A HU P0900047A HU 227778 B1 HU227778 B1 HU 227778B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- seq
- polypeptide
- sequence
- amino acid
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title abstract description 23
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 173
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 156
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 149
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 39
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 86
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 28
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 claims description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 2
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 claims 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 claims 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 33
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 23
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 128
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 128
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 122
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 28
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 18
- 230000004044 response Effects 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 17
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 12
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 9
- UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N N,N'-diphenyl-1,4-phenylenediamine Chemical compound C=1C=C(NC=2C=CC=CC=2)C=CC=1NC1=CC=CC=C1 UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- -1 amyloxy Chemical group 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 235000017168 chlorine Nutrition 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 101100117387 Catharanthus roseus DPAS gene Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 4
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 4
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 4
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 4
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 101710166488 6 kDa early secretory antigenic target Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 3
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101100224410 Solanum tuberosum DPEP gene Proteins 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 244000182067 Fraxinus ornus Species 0.000 description 2
- 235000002917 Fraxinus ornus Nutrition 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 208000036981 active tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound ClC NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- NEVVHGHXJACRQZ-OCZHUQCSSA-N (7r,8s,9s,10r,13r,14r,17s)-17-acetyl-7,14-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,6,7,8,9,11,12,15,16,17-decahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-one Chemical compound C([C@H]1O)C2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@]1(O)CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 NEVVHGHXJACRQZ-OCZHUQCSSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXTGDCSMTYGJND-UHFFFAOYSA-N 1-dodecylazepan-2-one Chemical compound CCCCCCCCCCCCN1CCCCCC1=O AXTGDCSMTYGJND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMCUVBSHZXQITN-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(4-chlorophenyl)-5-(2-methoxy-2-oxoethyl)-1,3-thiazol-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound S1C(NC(=O)CCC(O)=O)=NC(C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1CC(=O)OC IMCUVBSHZXQITN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LIWMQSWFLXEGMA-WDSKDSINSA-N Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N LIWMQSWFLXEGMA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 240000002132 Beaucarnea recurvata Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 101100536546 Caenorhabditis elegans tcl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 1
- 206010008583 Chloroma Diseases 0.000 description 1
- 244000117499 Colubrina elliptica Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000219130 Cucurbita pepo subsp. pepo Species 0.000 description 1
- 235000003954 Cucurbita pepo var melopepo Nutrition 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102100037373 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 101100075837 Drosophila melanogaster Mabi gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical group C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical group [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001446467 Mama Species 0.000 description 1
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010029333 Neurosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- WXOMTJVVIMOXJL-BOBFKVMVSA-A O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)OS(=O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O[C@]2(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]2OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]1OS(=O)(=O)O[Al](O)O Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)O.O[Al](O)OS(=O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O[C@]2(COS(=O)(=O)O[Al](O)O)O[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]2OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H](OS(=O)(=O)O[Al](O)O)[C@@H]1OS(=O)(=O)O[Al](O)O WXOMTJVVIMOXJL-BOBFKVMVSA-A 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 AFWBWPCXSWUCLB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N Rohrzucker Natural products OCC1OC(CO)(OC2OC(CO)C(O)C(O)C2O)C(O)C1O CZMRCDWAGMRECN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010054000 Type II hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 102100023870 YLP motif-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940088990 ammonium stearate Drugs 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N azane;octadecanoic acid Chemical compound [NH4+].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O JPNZKPRONVOMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000009933 burial Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical class Cl* 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-BKFZFHPZSA-N lithium-12 Chemical compound [12Li] WHXSMMKQMYFTQS-BKFZFHPZSA-N 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003126 m-cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Chemical group 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229940050176 methyl chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000005987 myeloid sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 208000015238 neurotic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 208000024356 pleural disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 230000004434 saccadic eye movement Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000032922 susceptibility to mycobacterium tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000542 thalamic effect Effects 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098465 tincture Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 230000008026 type II hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000001515 vagal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
ÁlíKlátiosságbsn a találmány tárgyát K^wéac/m»;» lifberc-ulosis fertőzés kimutatása, kezelése és megelőzése képezi. Kőzelebbröt, a talábnársy tárgyát olya® polipeptidek képezik, amelyek Mycűbecterium tuberciűasix antigént tartalmaznak, vagy atmak egy részét vagy más yamasát tartalmazzák, valamint az ilyen polipeptidek alkalmazása .á^eoi&aetmj»»· /aáereaZosát fertőzés kimutatására és áittaimazásoá a fertőzés elleni védőoltásban.
A tuberkulózis egy krónikus, fertőző betegség, amelyet általában bfycísbacíeriun! (tiherculosis fertőzés okoz. Jelentős betegség a fejlődő országokban és éppúgy növekvő probléma a világ fejlett részein is, évente körülbelül 8 millió új megbetegedéssel és körülbelül 3 milliós halálozással. Bár & fertőzés jelentős időn keresztül tünetmentes lehet, a betegség leggyakoribb megtestesülése a tüdő akut gyulladása, amely lázas és száraz köhögést eredményez. Amennyiben kezeletlenül hagyjuk, tipikus esetben súlyos komplikációkkal és hálálsz! járhat.
Bár a tuberkulózis általában ellenőrzés alatt tartható hosszantartó antibiotikum kezeléssel, az ilyen kezelés nem elegendő ahhoz, hogy a betegség terjedését megelőzzük. A fertőzött egyének bizonyos ideig tünetmentesek lehetnek, de fertőznek. Hozzátehetjük még, hogy bár a kezelési rend betartása kritikus, a betegek viselkedése nehezen követhető. Néhány beteg megszakítja a kezelési folyamatot, ami hatástalan kezeléshez és gyógyszerreziszteneia kialakulásához, vezethet.
A tuberkolózis terjedésének meggátláss hatékony védőoltásokat és a betegség pontos, kort» .kimutatását Igényli, Jelenleg a vsdőhaíású ImmiHdtás kiváltására a leghatékonyabb eljárás az élő baktériumokkal történő védőoltás. Az erre a óéira alkalmazott legközönségesebb mikobaktérium a feöfe/brt Cafmette-Guerin (BCG), a Afycobaci&riwt! bovi-s egy avirusens iorzse. Azonban a BCG hatékonysága és biztonságossága ellentmondásos, és néhány ország, mint például az Egyesüli Államok, nem látja el védőoltással a lakosságot. kimutatást áhaIában börtesztíel végzik, amely tubereulin PPD-vel (fehérje-tisztított származék, „profein-purlfied derivsíívA történő, mlíaderrnális érmtkezteiést jelent. Az antigén-specifikus T-sejt válasz az injekció helyén mérhető szövet megkeményedési okoz az tájékeid után 48-72 órával, amely jelzi a snlkobakíérsum antigénekkel történt érintkezést fezzel a teszttel kapcsolatban azonban az érzékenység és a speeiííeitás kérdéses volt és a BCG-vel ohoií egyének nem különböztethetők meg a fertőzött egyénektől.
Mig a makroíágokröl kimutatták, hogy a AÍ ftíócí-cmesfe immunitás elsődleges étiék.toraiként hatnak, a Tsejtek az ilyen immunitás legfontosabb indukálok A T-sejíek lényeges szerepét a fid rmitvmyfosfe fertőzés elleni védelemben alátámasztja a M ííAnmArt gyakori eióferdaláss AiDS-hetegekben, amit a humán smmtmdencíeoeia vírus (HÍV) fertőzéshez társuló CD4 T-sejtek számának feesökkenése okoz. Mikobaktétinmreakíiv CD4 Γ-sejtekröl kimotötták, hogy erőteljes termelői a gamma-imerferormak (IFN-y), amelyről viszont kimutatták, hogy egerekben a makrofegok mlkohakíénum-ellenes hatásait beindítják. Mig az ifeN-y szerepe emberekben kevéssé tisztázott, kísérletek azt mutatták, hogy az léZS-dihldroxi-Yitamin ,D3. önmagában vagy kombinációban IFN-y-vai, vagy tumor neurózis fektor-alfával, humár! makrofegokat aktívái AJ mbereníOsA fertőzés gátlására, Továbbá az is ismert, hogy az IPN-y humán snakrotágokat stiínulál í,25-díhldroxí-vitamin f>3 előállítására. Hasonlóképpen az ÍL-12 esetében kimutatták, hogy szerepet játszik a IW í«f?erestó?sfe fertőzés ellem rezisztencia sthmilálásában, Á Aí fubercittesis fertőzés immunológiáját a következő kiadvány foglalja
54?ú -1463 í? fe A·· KOR A ♦ * . ...
össze: (Chsn és Katiimat!»: Tuberculosis: Psdrogenesis, Proteetion artd Gondol, szerk.; Bloom, ASM. Press, Washington DG, (3994)].
A tccbmka áiláGrtak az igényelt találmányhoz bizonyos szempontból legközelebb álló publikációjában Csnreton és mtsai, (Microbioiogv, vol. 140(8), p. 1977-1982 (1994); egy, a Mycobacteríum avium ssp, pííf-»Híó®'x:iíiízs;í-hól származó feltételezett szeríit-proteázt azonosítanak és jellemeznek.
Fentieknek megfelelően a technika állása szerint szükségünk van javított oltóanyagokra és eljárásokra a feberkükkzis tnegelőzésére, kezelésére és kitnutalására. A ialálmány megfelel ezeknek az igényeknek és további, ezzel kapcsolatos előnyöket is biztosit.
Röviden összefoglalva, a taláhnány tárgyát képezik vegyöletek. és eljárások tuberkulózis megelőzésére és· kimutatására. A találmány egy megvalósítást módja szerint ttolipeplideket állítunk elő, amelyek szolubills M. «foíveafosís antigén immunogén részletét tartalmazzák, vagy az ilyen antigén egy variánsát tarí&imazzák, amely csak konzervatív szubsztitúciókban és/vagy módosításokban különbözik, A megvalósítási mód szerint a szólítbilis antigén a következő N-terminális szekvenciák bármelyikével rendelkezhet:
(a) Α$ρ-ΡΓθ“ν0ΐ-Α»ρ-ΑΙο-ν£!-1Ιο-Α»η-ΊΒ:~Ί^Γ-€ν«-Ά8^ΐνΓ-θ1ν-<11η-ν;ιΙ-ν3.!-Αΐ3~ΑΝ-.Ιοο, {120. azonosítási szám .szerinti szekvencia):
(b) Ála-Val-Glu-Ser-öiy-Meí-i..en-Ahi-í.,e«-GÍy-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser, (121. azonosítási szám szerinti szekvencia);
(c) Ala-Als-Met-Lys-Pró-Aíg-Thr-Gly-Aj^-Gly-Pít^Leu-Giu-Ah-Ala-Lys-Glu-öty-Arg, ·( 12.2. azonosítási szám szerinti szekvencia);
(d) Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-öly-öls-Pro -Phc-Asp-Pro-Aia-Ttp-Gdy-Pro, (123. azonosítási szánt szerinti szekvencia);
(e) Asö-ife-Giy-Ser-Glu-Ser-ThtAzhi-Asp-Gln-GIn-Xsa-ÁkoVah (124. azonosítási szám szerinti szekvencia);
(íj Aia-GluXÍÍU-Ser-lle-Ser-Ths‘-Xüa-Gln-Xaa-IieAfoi~Pío, (I25. azonosítási szánt szerinti szekvencia);
(gr Asp-Pro-ölu-Pro-Áia-Pm-Pro-Val'Pro-Thr-Thr-Aia^Ala-Ser-Pro’Pro-Ser, (126. azonosítási szám szerinti szekvencia);
(hr Ala-lhO“Lys-'lfor~Tyr-Xaa-Gi»-Gia-Let!-LyS'Gíy-7hr-Asp-?br-GÍy, (127, azonosítási szán: szerinti szekvencia);
(i) Asp-Pro-Als-Ser-Als-Pro-Asp-Vai-Pro-Rír-Ala-A.iar-GIn-Leo-rhr-Ser-Leu-Len-Asn-Ser'Lea'Ala-ÁspP:ro-Aen~Vaí-Ser~Phe-.Ala~Ásn, (128,. azonosítási szám szerinti szekvencia); (j) Xaa-Asp-Ser-Gla-Lys-Ser-AlaTbr-lle-Lys~Vai-'fhr-Asp-Ala-Ser{ í 34, azonosítási szám szerinti szekvencia);
(k) Áin-Gly-?\sp-’i'br-Xsa-ile-'ryr-ne'Vai-GIy-.Asn-Le«-Thr-AÍa-As:p (135. azonosítás; szám. szerinti szekvencia); vagy (l) Ála-Pro-GlioSer-Gly~Ab-öiy-Leu-GÍY~Gly-Thr-VahGfe~Afe-öly, (13$, azonosítási szám szerinti szekvencia);
amelyekben Xaa tetszés szerint választható aminosav.
A találmány egy rokon megvalósítási módja szerint olyan polípeptideket állítunk ele, amelyek M mbeí-etífo.feí antigén immunogéa részletét tartalmazzák, vagy az ilye» antigén egy variánsát tartalmazzák, amely csak konzervatív szubsztitúciókban és/vagy módosításokban különbözik, és az antigén a következő N-ícrminális szekvenciák bármelyikével rendelkezhet;
- 3 tm) Xaa/fyr-lle-Ala-Tyr-Xaa-Thr-llsr-Ala-Gly-Ife--V'aí:-Pm-Gly-Lys-líerA8a-Val-His-Leu-Vai<. ({37. nzonosltási Mása szerinti szekvencia);
vagy (a) Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-Hís-Glö-Xaa-Asp-Met-'nu-Lys-Gly-Tw-Tyr-Pro-Gíy-öly-Arg-zkrg-Xaa-Pfee,. (129. azosíosftási szám szorioti szekvencia);
amelyekben Xaa tetszés szériái választható aminosav.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint kiválasztva az antigén olyan DNS-szekveneta által kődoh aminosav szekvenciát -tartalmaz, amely DNS-szekveacia az alábbiak bármelyike lehet: az 1, 2, 4-10, 13 -25, 32, 99. és Ibi. azonosítási szám szerinti szekvenciák; ezek komplementer szekvenciái, és olyan DNSszekvenciák, amelyek-az 1, 2, 4-10, 13-25, 52,99. es löl, azonosítási szám szerinti szekvenciákkal vagy azok komplemea-teseiyel mérsékelten sztringetis körülmények között hibribizáfeak.
A találmány egy rokon megvalósítási módja szerint olyan poiipeptideket alkalmazunk, amelyek Aí móemdövti antigén immunogén részletét tartalmazzák, vagy az antigén variánsát tartalmazzák, amely csupán konzervatív szubsztitúciókban és/vagy módosításokban különbözik es amely antigén olyan DNS-szekvemtía állat ködök aminosav szekvenciát tartalmaz, amely DNS-szekveacia az alábbiak bármelyike lehet; a 26-51. azonosítást szám szerinti szekvenciák; ezek köinplemeater szekvenciát, és olyan DNS-szekvenciák, amelyek a 26-51. azonosítás szám szerinti szekvenciákkal vagy azok -komplementer szekvenciáival mérsékelten szíri-ágens körülmények közön Itibridizálnak.
A találmány rokon megvalósítási módjaiban a lenti polipeptidéket kódoló DNS-szekvetrciákat, ezeket a DNS-szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorokat, és ezekkel az expressziós vektorokkal transzformált vagy transzfektáít gazdasejteket alkalmazunk,
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint fúziós fehérjéket állítunk elő, amelyek egy első és egy második találmány szerinti polipeptidet tartalmaznak, vagy alternatív módon egy találmány szerinti polipeptidet és egy ismert A-í tuberc-riíosré antigént tartalmaznak.
A találmány más megvalósítási módjai' szerint gyógyászati készítményeket állítunk elő, amelyek a fentiek szerinti egy vagy több polipeptidet, vagy az ilyen poiipeptideket kódoló DNS-molekulái és egy fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmaznak. Úgyszintén a találmány tárgyát képezik oltóanyagok, amelyek á fentiek szerinti egy vagy több polipeptidet és- egy aera-specifikus immunválasz serkentőt tartalmaznak, továbbá olyan oltóanyagok, amelyek egy vagy több, ilyen poiipeptideket kódoló DNS-szekvenciát és nem-specifikus immanyálasz serkentőt tartalmaznak.
A találmány egy ismét másik megvalósítási módja szerint eljárást dolgoztunk ki betegekben védöbalásw immunitás mdnkálására, amely során a betegnek a fenti egy vagy több poíipe-ptid Itatásos mennyiségét beadjuk.
A ialálmday egy további megvalósítási módja szerbit eljárásokat és diagnosztikai reagenxkészleíekei hozunk léire tuberkulózis kferutatására betegekben. .Az eljárások, során egy beteg dennális scjtieit érintkeztetjűk egy vagy több fentiekben leírt poiipeptíddel és immunválaszt mutatunk ki a beteg bőrén.. A diagnosztikai reagenskeszletek .a fenti polipeptídek közöl egyet vagy többet tarialatazrtak egy készülekkd kombinációban, ámély biztosiba. a polipeptídek érintkezteiesét a beteg dermátis sejtjeivel.
Ezek, és a találmány további megvalósítási módjainak jobb megértése érdekében az alábbi részletes leírás;
és a kapcsolódéi ábrákat biztosítjuk:. .Az itt közölt összes referencia teljes egészében a kiíardíás részének tekintendő,
Az la. és 1b. ábrák mutatják be a prolilcráció és az iracrferou-γ termelés stimulációját, sorrendben taegfelelteivé, egy elsó és· egy második AI. múe?z'uA;rt.$~ímmurrááísai reoáéikezö donorból származó T-sejtekben·, az 1. példában leirt: 14 ki), 20 ki) és 2b ki) nagyságú antigénekkel,
A 2, ábra muta^a be a probíemctó és az interfermt-γ termelés stimulációján egy A/, mbefCidosRimmunitással rendelkező egyénből származó Τ-sejtekben» a két reprezentatív pclipeptidóel, Tb&a3-mat és TbRa9-cel
Az 1. azonosítási szám szerinti szekvencia a TbSal DNS-szekvenciája.
A 2, azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRalí) DNS:-szeks'enoíája.
A 3. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRnl t. DNS-szekvencíáia,
A 4. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRnlz DNS-szekvencíáia.
Az 5. .azonosítási szám szerinti szekvencia a TbRal3 DNS-szekvenciája.
A 6. azonosítási szára .szerinti szekvencia a TbRalb DNS-szekvenciája.
A 7, azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRal? DNS-szekveucíája.
A 8. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRaíS DNS-szekvendája,
Á 9. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRaí9 DNS-szekvenciája.
A i ő. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbR«24 DNS-szekvenciája.
All. azonosítási szára szerinti szekvencia a ThRadb DNS-szekvenciáia.
A 12. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRa28 DNS-szekvenciája.
A 13. azonosítási szánt szerinti szekvencia a TbRa29 DNS-szekvenciája.
A 14. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRa2A DNS-szekvenciája,
A 15. azonosítási szám szerinti szekvencia a TbRaA DNS-szekveuciája.
A lő. azonosítási szám szerinti szekvencia a TbRa32 DNS-szekvenciája.
A 17. azonosítási szám szerinti szekvencia a TbRa'35 DNS-szekvenciája,
A IS. azonosítási szám szerinti szekvencia a ThRaAő DNS-szekvenciája.
A 19. azonosítási szám szerinti szekvencia a TbRs4 DN$~szekveaciá;a.
A 20. azonosítási szám szerinti szekvencia a TfcRsti DNS-szekvenciája,
A 21. azonosítást szám szerinti szekvencia a TbRaB DNS-szekvenciája.
A 22. azonosítási szám szerinti szekvencia a TbRaü DNS-szekvenciája.
A 23. azonosítási szám szerinti szekvencia.» TbRaü ÜRS-szekvenciája.
A 24. azonosítási szám szerinti szekvencia a YYWCPO DNS-szekveaeiája.
A 25. azonosítási szám szerinti szekvencia az AAMK DNS-szekvenciája.
A 2b. azonosítási szám szerinti szekvencia a TbL-23 DNS-szekvenciája.
A 27. azonosítási szám szerinti szekvencia a TbL-24 DNS-szekvenciája.
A 28. azonosítási szám szerinti szekvencia a 161,-25 DNS-szekvenciája.
A 29, azonosítási szám szerinti szekvencia a TbL-23 DNS-szekvenciája.
A 30. azonosítási szám szerinti szekvencia a 161,-29 DNS-szekvenciája.
A 31. azonosítási szám szerinti szekvencia a ’TbH-S DNS-szekvenciája.
A 32, azonosítási szára szerinti szekvencia a TbH-3. DNS-szekvenciája.
A 33, azonosítást szánt szerinti szekvencia a Ί6Η-9 DNS-szekvenciája.
A 34. azonosítási szám szerinti szekvencia a TbM-1 DNS-szekvenciája.
· 5 A 35. -azonosítási szára szerinti szekvencia a TbM-3 DNS-szekvenciája.
A 36. azonosítási szára szerinti szekvencia a Thfei-6 DNb-szekveríciájíí,
A 3 7. azonosítási szára szerinti szekvencia-a ThM-7 ÖNS-szekvenciája.
A 38. azonosítási szára szerinti szekvencia a· ThM-9 BNS-szekvenciája.
A 39. azonosítási szára szerinti: szekvencia a Thh-i-12 DHS-szekvenciája,.
A 40. azonosítási szára szerinti szekvencia a Fhfeí-43 DN'$~szekveaciája.
A 41. azonosítási szára szerinti szekvencia a Thfel-14 DNS-saekvencsája.
A42. -azonosítási szára szerinti szekvencia aThh-í-15 DNS-szekvetx-iája.
A 43. -azonosítási szára szerinti szekvencia a TbH-4 UNS-szekvemtiája,
A 44. azonosítást szára szerinti' szekvencia a TfcH-4-FWD-©RS-szekvenciája.
A 45. azonosítást szára szerinti szekvencia a ThH-i2 ÖNS-szekvencíája.
A 46. azonosítást szára szerinti szekvencia a TbJS-· 1 DNS-szekveneiája.
A 47. azonosítási szára szerinti szekvencia a Tb38-4 QNS-szekveaetája.
A 48. azonosítási szára szerinti szekvencia a Tbí..· 17 DNS-ssekvenciájü.
A 4-9. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbL’20 DNS-szekvette iája.
Az 50. azonosítási szára szerinti szekvencia a TCL-2 í DNS-szefcvendáia,
Az 51. azonosítási szára szerinti .szekvencia a TfeH-16 DNS-szekveöeiáia.
Az 52. azonosítási szára szerinti szekvencia a DEEP DNS-szekvenéíája.
Az 53. azonosítási szára szerinti .szekvencia» DPEP fevezetett aminosav -szekvenciája.
Az 54, azonosítási szára szerinti szekvencia a-DPV N-termináíts antigén fehérje szekvenciája.
Az 55, azonosítási szára szerinti szekvencia az .AVGS N-íerraixsális antigén fehérje. szekvenciája. Az 56. azonosítási szára szerinti szekvencia az AAMK N-iertninátis antigén feltétje szekvenciája. Az 57. azonosítási szára szerinti szekvencia a YVWC N-terminálís antigén fehérje szekvenciája.. Az 58. azonosítási szára szerinti -szekvencia a D1GS bi-terraináhs antigén, fehérje szekvenciája.
Az 59. azonosítási szára szerinti -szekvexteia az ABES 'N-termmális antigén fehérje szekvenciája. A 60. azonosítási szára szerinti szekvencia a DPEP N'-ierraináhs antigén fehérje szekvenciája.
A 61. azonosítási szára, szerinti szekvencia az APKT N-termmáks antigén fehérje szekvenciája.
A 62, azonosítási szára szerinti, szekvencia a DPAS N-íerrairtális antigén feltétje szekvenciája.
A 62. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRai levezetett axninosav szekvenciája.
A 64. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRalÖ levezetett araraosav .szekvenciája.
A 65. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbR&i 1 levezetett aminosav szekvenciája.
A 66. azonosítási szára szerinti szekvexteia a TbRal2 levezetett aminosav szekvenciája.
A 67. azonosítási szára szerinti szekvexteia a TbSalo levezetett aminosav szekvenciája.
A 68. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRaí6 levezetett aminosav szekvenciája.
A 69, azonosítási szara szerinti szekvencia a TbRaí?' levezetett aminosav szekvenciája.
A 70. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbRa-18 levezetett aminosav szekvenciája.
A 71. azonosítási szára szerinti' szekvencia a TbRal9 levezetett aminosav szekvenciája.
A 72. azonosítási szára szerinti szekvencia a TbR»24 levezetett aminosav szekvenciája.
A ?3, azonosítási szára szerinti szekvencia a 'l'hRa26 fevezetett axninosav szekvenciája,
A 74, azonosítási szára szerinti szekvencia a ThR»28 levezetett aminosav szekvenciája.
- 6 T6Ra39 levezetett aminosav szekvenciája. IhRa2-A levezetett aminosav szekvenciája. TbRa3 levezetett aminosav szekvenciája. TbRa32 levezetett aminosav szekvenciája. TbRa35 levezetett aminosav szekvenciája. TbRa36 levezetett aminosav szekvenciája. TltRa4 levezetek aminosav szekvenciája. TbRa9 levesetek aminosav szekvenciája. ThR&R levezetek aminosav szekvenciája. TbRaC levezetek aminosav szekvenciája. TbRaD levezetek aminosav szekvenciája. YYWCPG tévézőiéit aminosav szekvenciája, Tb-AAMK levezetett aminosav szekvenciája. Tb.38-1 levezetett aminosav szekvenciája. Tbi-1-4 levezetek aminosav szekvenciája, TbH-8 levezetek aminosav szekvenciája. Tbl.1-9 levezetek aminosav szekvenciája. TbH-12 levezetett aminosav szekvenciája, Tb38-1 1. pepiid aminosav szekvenciája. T638-1 2. pepiid aminosav szekvenciája. T638-1 3. pepiid aminosav szekvenciája.
Tbc 8-1 4. pepiid aminosav szekvenciája. T638-1 5. peptíd aminosav szekvenciája. T638-1 6, pepiid aminosav szekvenciája. DPAS DNS-szekveneiája.
a DPAS levezetett aminosav szekvenciája. a DPV DNS-szekveneiája. a DRV levezetek aminosav· szekvenciája, az ESAT'-ű DNS-szekvenciája, az FSAT-6 levezetett aminosav szekvenciája, a í'bH-8-2 DNS-szekvencláia, a TbH~9PL ÖNS-szekvenciája. a TbH-9:Pi. fövezetett aminosav szekvenciája, a Tbl-!-9·- i DNS-szckveadája. a Th:H~9~i levezetett aati&osav szekvenciája, a TbH-9-4 DNS-szekvencíája. a Tbil-9-4 levezetett aminosav szekvenciája, a Tb33- 1F2-1N DNS-szekvenciája, a Tb38-2F2-RP DNS-szekvenciája. a Tb3?-H.. levezetett, aminosav szekvenciája.
A. 75. azonosítási szám szerinti -szekvencia .a A 76. azonosítási szám szeristi szekvencia a A 77. azonosítási sóm szerinti szekvencia a A 75. azonosítási szám szer mii szekvencia a A 79. azonosítási sósa szedeti szekvencia a A 89. azonosítási szám .szerinti szekvencia a A 81. azonosítási szám .szerinti szekvencia a A 82. azonosítási szám szerinti szekvencia a A 83. azonosítási szám szerinti szekvencia a A 84. azonosítási szám szerinti szekvencia a A 85. azonosítási szám szerinti szekvencia a A 86. azonosítási szánt szerinti szekvencia a ,A. 87. azonosítási szám szerinti szekvencia a A 88; azonosítási szánt szerinti szekvencia a A 89. azonosításai szánt szerinti szekvencia a A. 90. azonosítási szánt szerinti szekvencia a A 9 1. azonosítási szán; szerinti szekvencia a A 92. azonosítási szán; szerinti szekvencia a A 93. azonosítási szánt szerinti szekvencia a A 94. azonosítási szánt szerinti szekvencia a A 95. azonosítási szánt szerinti szekvencia a A 96. azonosítási: szánt szerinti szekvencia a A 97. azonosítási szánt szerinti szekvencia a A 98. azonosítási szánt szerinti szekvencia a A 99. azonosítási szánt szerititi szekvencia a A 190. azonosítsd szám szerinti szekvencia Á 101. azonosítási szám szerinti szekvencia Á192. azonosítási szám szerinti szekvencia A 193. azonosítási .szám szerinti szekvencia A 194. azonosítási szám szerinti szekvencia A 195. azonosítási szám szerinti szekvencia A 196, azonosítási szám szerinti szekvencia A 197, azonosítási szám szerinti szekvencia A 198. azonosítási szánt szerinti szekvencia A. 109. azonosítási szánt szerinti szekvencia A1lö, azonosítási szánt szerinti szekvencia Alii, azonosítási szánt szerinti szekvencia A 112. azonosítási szánt szerimi szekvencia A 113. azonosítási szánt szerinti szekveiteta A 114. azonosítási szám szerimí. szekvencia •ί f
*4 «4 *♦
4 ♦ 4 4
Ο * 4 Ψ->ψ * « <
*·* *·
.. 7 A 115. azonosítási szám szerinti szekvencia a Tb3d-íN fevezetett atnaaosav szekvenciája.
A í ló, azonosítási szám szerinti szekvencia a Tb3S-lF3 BNS-szekvnncíája.
A. ΐ 17. azonosítás! szánt szerinti szekvencia aTb38-IF3 levezetett aminosav szekvenciája.
A 118. azonosítási szánt szerinti szekvencia a Tb38~iF5 DNS-szekveeciája.
A. 119. azonosítási szánt szerinti szekvenc ia a Tb38-IFó DTMS-székvenciája.
A 120. azonosítási szánt szerinti szekvencia a DPV levezetett N-terrninálís aminosav .szekvenciája.
A 121, azonosítási szánt szerinti szekvencia az AVGS fevezetett N-terminális amioasav szekvenciája.
A 122. azonosítási szám szerinti szekvencia az AAMK. levezetett N-tenxiíaáíts aminosav szekvenciája.
A 123. azonosítási szám szerinti szekvencia a YYWC tsveaeteit M-teraxmálxs aminosav szekvenciája.
A 124. azonosítási szánt szerinti szekvencia a D1GS levezetett bí-termiaális aminosav szekvenciája.
A 125, azonosítási szám szerinti szekvencia az A£ES levezetett N-termínáíis amixtosav szekvenciája..
A 126, azonosítási szám szerinti szekvencia a DPEP levezetett N-tennináiis aminosav szekvenciája.
A 127. azonosítási szánt szerinti szekvencia az APKT levezetett N-terminális aminosav szekvenciája.
A 128. azonosítási szánt szerinti szekvencia a DPAS levezetett aminosav szekvenciája.
A 129, azonosítási szám szerinti szekvencia a DPPD N-iermináhs antigén fehérje szekvenciája.
A 130-133. azonosítási szám szerinti szekvenciák négy DPED eianogén-bromid Snentens fehérje szekvenciái.
A 134. azonosítást szánt szerinti szekvencia az XÖS antigén N-tenaíxtáUs fehérje szekvenciája.
A 135. azonosítási, szánt szerinti szekvencia az AGD antigén N-terminális fehérje szekvenciája.
A 136. azonosítást szánt szerinti szekvencia az APE antigén N-terminális fehérje szekvenciája.
A. 137. azonosítási szánt szerinti szekvencia az XYÍ antigén N-terminális fehérje szekvenciája.
Ahogyan fentebb említettük, a találmány tárgyát általánosságban készítmények és eljárások képezik tuberkolózis megelőzésére, kezelésére és k.iiuutaiására. A. találmány szerinti készítmények magukba foglalnak olyan polipeptideket,, amelyek egy .Af mbercufosA antigén legalább egy immunogén részletét tartalmazzák, vagy egy ilyen antigén variánsát tartalmazzák, amely csak konzervatív szubsztitúciókban és/vagy módosításokban, különbözik. Az igényeli oltalmi körön belülinek tekintendő polípeptidek közé tartoznak - nem korlátozó értelemben immmxogén szolúbilis Af (nbereifiasis antigének is. A „szolúbrlis M tubercul&sis antigén kifejezés a leírás «inát· -olyan M (u&er-cutasis· eredetű fehérjét jelent, amely megtalálható a M tubereufasís· tenyészet szürleíében. A leírás során alkalmazott „polipeptid kifejezés tetszés szerinti hosszúságú aminosav láncot jelenthet, beleértve a teljes hosszúság» fehérjéket (például antigéneket) is, amelyekben az aminosavakat kovalens peptidkötések kapcsolják össze. így leirat a fentebb felsorolt antigének egyikének egy immunogén részletét tartalmazó polipeptid állhat teljes egészében az immunogén részletből vagy tartaimzhat további szekvenciákat is. A további szekvenciák származhatnak a természetes eredetű Af -Ínfoereulesis antigénből, vagy lehetnek heteroióg szekvenciák, és az ilyen szekvenciák lehetnek (de nem szükségszerűen azok) immunogén szekvenciák,
A leírás során alkalmazott „immunogén kifejezés alatt olyan képesseget értünk, amely immunválaszt (például sejtes immtmváiaszt) hoz létre egy páciensben, például egy emberben, és/vagy biológiai mintában.
Közelebbről, az immunogén antigének (és az ilyen antigének immunogén részletei és további variánsai) képesek sejtek proliferácíóját, mterlsukin-12 termelést és/vagy rsteríéron-γ termelést stimulálni biológiai mintákban, amelyek az alábbi, M ítí6erear/<rsA-imm;umíással rendelkező egyénből származó sejtek bármelyikét - illetve
Λ « ·\*
>- ·* Χ«»
- 8 ezek közül többet Is - tarmlmazhuíják: T-sejtek, NK-sejtek, B-sejtek és makrofágok. Egy vagy több. M tiiberenMiibí antigén legalább egy iertsrartogéts részletéi tartalmazó polipeptídek általánosságban aíkaliXfazhasók hd>«rkrdózís kimutatására, vagy arra, hogy betegben védőhatású jmtnu-nításí hozzunk létre tuberkulózis ellen.
A találmány szerinti készítmények és eljárások a fonti polipeptídek variánsait is magukba foglalják. Á leírás során egy „variáns” alatt olyan polípeptidet értünk, asnely a természetes körülmények között előforduló antigéntől esak konzervatív -szubsztitúciókban és/vagy módosításokban különbözik úgy, hogy a polipeptid immunválasz· indukáló képessége megmarad. Az ilyen variáns általánosságban felismerhető oly módon, hogy a polipeptid szekvenciák bármelyikét módosítjuk, és a módosított polipeptid Immunogén sajátosságán. például a kitanítás részét képező reprezentatív eljárás segítségével értékeljük.
A leírás során alkalmazott „konzervatív szubsztitúció’’ kifejezés alatt olyan szubsztinfeiót ériünk, amelyikben aminosavakat hasonló tulajdonságú ammosavskkaí helyettesítünk, amelyek cseréje esetén a pepiidkémiáhan jártas szakember számára elvárható, hogy a polipeptid szekunder struktúrája és hídropátiás jellege lényegében változatlan marad. Általánosságban a kővetkező aminosav csoportokon, belüliek tekinthetők konzervatív cseréknek: (Is Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gin, Asn. Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr;: (.)} Val, ile, Lest,, Met, Ala,. Phe; 14} Lys, Arg, Kis; és (5) Fhe, Tyr, Trp, His,
A variánsok úgyszintén (vagy alternatív módon) úgy is módosíthatók. hogy elhagyunk vagy hozzáadunk amtaosavakat, amelyek minimális hatással vasnak a polipeptid immunogén 'tulajdonságaira» szekunder struktúrájára és hidropátiás jellegére. Például egy polípeptidet hozzákapcsolhatunk egy szignál (vagy vezető) szekvenciához a fehétje N-terminálisán, amely szekvencia a transzlációval egyiáöbeo vagy a transzláció után .a fehérjeszállítást- irányít ja. A. polipeptid hozzákapcsolható egy Baker szekvenciához vagy egyéb szekvenciához a szintézis, tisztítás, vagy a polipeptid. azonosításának megkönnyítése céljából (mim például pob-hísztldin), vagy .azért, hogy elősegítsük a polipeptid kötődését szilárd hordozóhoz. Így például egy pepiid hozzákapcsolható immunglobulin. Ec-régiőhoz,
A találmány egy rokon, megvalósítási utódja szerint kombinációs polipeptideket állítunk elő; A leírás során a „kombinációs polipeptid” kifejezés olyan: polipeptídet jelent, amely legalább egy, fenti immunogén részletei és egy vagy több további M tuberadesis immuuogén szekvenciát tartalmaz, amelyek peptldkötésen keresztül kapcsolódnak össze egyetlen aenwsav láncba. A szekvenciák kapcsolódhatnak közvetlenül (azaz nem 'található közbeékelt aminosav), vagy összekapcsolödhamak linker-szekvencíát! keresztül (mint például Gly-Cys-Giy) amely nem változtatja meg jelentősen az összetevő polipeptidek itmnaoogén jellegét
Általánosságban M .tubarcuhsis antigének és ilyen antigénekéi kódoló DNS-szekvenciák a technika állása szerint Ismert különböző eljárások segítségével előállíthatok. Például, szolóbilis antigének izolálhatók M /«bereííiosó’ tenyészet sztirietébŐ! a szakember -számára Ismertnek tekinthető eljárások -segítségével, beleértve au ioncserélő és lordkoö-íázisű kromrstográőáh Ezt kővetően a tisztítod antigéneket értékeljük a megfelelő immunválaszt kiváltó képességükre (például sejtes immunválasz), a khanításhan megadott reprezentatív eljárásokat alkalmazva, Az -muuunogén antigéneket részlegesen szekvenálhatjuk olyan eljárások alkalmazásával, mint. például a hagyományos Fdman-kémia (Edmstt és Berg: Eur. J. Bíoehexn. 1 lő (1967)1.
immunogén antigének előállithatók rekombínáns úton Is olyan DNS-szekvenciát alkalmazva, amely az antigént kódolja és amelyet egy expressziós vektorba illesztettünk és a megfelelő gazdaszervezetben expresszáltunk. Szolübiíis antigéneket kódoló DNS-melékuIákat izolálhatunk megfelelő M rt<öezc«/osfs expressziós klótttár szkrinelésével specifikusan a szolóislüs M /ífoíozií/ösA antigének ellett termelt anliszéruna
- 9 (például nyál eredetű aauszérutu) alkalmazásával. Szoíúbibs vagy nern-szolűbiiis antigéneket kódoló DNSszekvenci-ák azonosíthatók oly módon,, hogy egy megfelelő M í«her<?«te.m· genom! eredetű, vagy cDNS-eredetű expressziós kiőntárat szkrinelnnk M íöőerariösri által megfertőzött betegekből származó szérummal. Az ilyen sztóadések a szakember számára általánosságba® ismert eljárások segítségével végrehajthatók, például a következő referenciában isirt módon: (Sambrook és mtsai.: Molecular Cloníng: A Laboratory Manna! Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, Π 989}].
Szolóhíiís antigéneket kódoló - DNS-szekvenciák úgy is eiőáliítbatők, hogy egy megfelelő M ínóemt/esfe cDNS-eredetü vagy genotai DNS eredetű idomárat olyan DNS-szefcvenciákra szkrlseiüsk. ajxtelyek izolált szólúbihs antigének részleges aminosav szekvenciája -alapján eíMííítotí degeneráh olígonukíeotídokkál Itibridizálnak. .Az ilyen szkrtneiés során alkalmazható degeneráh oítgoöukleotid szekvenciák megtervezhetők és megszíntetízálhatók, valamint a szkrin végrehajtható például a következő leírás szerint: [Sa-mbroe-k és mtsai.: Molecular Ciomríg:: Á Laboratory Mama! Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, G989}], vaiamint az ebbet: idézett referenciák szerint. -Poíimeráz. láncreakció (PCR) szintén számításba jöhet, a fenti ©i-ígonukleotidokat alkalmazva a technika állása szerint Ismert eljárásokban, hogy nukleinsav próbát izoláljunk cDN'S, vagy genomi eredetű klostárból. Ezt követően a megfelelő klóaíár szkrmefese az. izolált próbával végrehajtható.
Alternatív módón Aí íííberofetzsfe-böl származó genomi. eredetű vagy cDNS-klöstárak szkrínelése végrehajtható közvetlenül is perifériás vér moaonukleáris sejteket (PSMC) vagy T-sejt vonalakat, illetve kiónokat alkalmazva, amelyeket egy vagy több M. mómWósísrimmankással- rendelkező egyénből nyerőnk. Általánosságban az ilyet· szkrlnekhez álkukoazhatő PBMC és/vagy T-sejtek az alább, leírtak szerint állíthatók elő. A közvetlen idomár szkrinelést általánosságban ágy haj tjuk végre, hogy egyesített expresszált rekombínáns fehérjéket vizsgálunk prnllferácló és/vagy interferon-·/ termelés mdidcáló· képességre M mőercítteór-hnmuuitóssal rendelkező egyénből -származó T-sejtekhen. Alternatív módon a feltételezhetően T-sejt antigének először a fentebb leírtak szerint az antitest reaktivitás alapján szelefctáíhatóak.
Az. elóáih’Sás módjától függetlenül az írt leírt antigének (és ezek imm-unogén .részletei) - amely antigének lehetnek szoláöílbak és nem-szolúbllisak - immuno-gén választ indukáló képességgel rendelkeznek. Közelebbről, az antigének képesek proíhéráeiőt és/vagy eitokíxt termelést indokain: (azaz íníeríeron-γ és/vagy intetfeukio-12 termelést ladukálni) A/. mőerr-ö/osri-íínmuíiitással rendelkező egyénből származó T-sejtekheo, NK-sejickfeen, B-sejtekhca és/vagy makrofágokbam. Természetesen a sejttípus kiválasztása egy antigén .mmnHxogén válaszának értékeléséhez a kívánt választól -agg. Például, az interleukin-12 termelés legkönnyebben 8-sejteket és/vagy toakfotiigokat tartalmazó· preparátumokkal értékelhető.. M .'aóe«?K(o.ri$-immumiással. rendelkező egyénnek azt teki-nl-hetjtik, aki: rezisztens a tuberkulózis ki fejlődésével szentben, mert a Af. a<óere«ó?sís-sal szemben hatékony T-sejt választ hozott létre (azaz lényegében mentes a betegség tüneteitől). Az ilyen egyének felismerhetők az erősen pozitív (azaz· nagyobb, mint körülbelül 10 mm átmérőjű megkeményedés)- intradermálís bőrrészt válasz alapján a tuberkulózis fehérjékkel -(PPD> szemben-, és a tuberkulózis betegség bármilyen jele vagy tünete hiányának alapján:. AL íöóeríWesfs-immunhússal rendelkező egyénekből származó T-sejtek, NK-seítek. 8-sejtek és rnakrofágok a szakember számára is mert eljárások segítségévei előállhbaíök. Például, PBMC (azaz perifers&s vér reonosKíkleáris sejtek) preparátuma. alkalmazható a komponens sejtektől való további elválasztás, nélkül. PBMC általánosságba® előállítható például Ficoii™ (Wintbrop Laboratories, NY) sűrűség-gradiensen keresztül történő eenififegáiással. Az itt leirí vizsgálati rendszerben ai> χ χ ϊ
- Iökalroazásra kerülő- T-sejtek közvetlenül: a F8M'C-feöf is «sztílhatók. Alternatív módon egy fekzapöritott, mikobafctoriálb fehérjékkel szemben .reaktív T-sejt vonal, vagy az egyedi tntkobaktériált-s fehérjékkel szemben reaktív T-sejt k iónok alkalmazhatók. ilyen T-sejt kiőrtok előállíthatok például Aí í«őer<Wo.sís-imrminitással rendelkező egyénekből származó PBMC tenyésztésével mlkobaktenálts fehérjék jelenlétében, 2-4 hetes időtartamig. Ez csak a mikobakteriális fehérje specifikus T-sejtek növekedését teszi lehelévé, így ennek eredményeképpen csak ilyen sejtekből álló sejtvonalaá kapunk. Ezek a sejtek ezt kővetően klónozhatok és kipróbálhatók az egyedi fehérjékre a szakember számára ismeri eljárásokat alkalmazva, hogy pontosabban- meghatározhassuk, az egyedi ϊ-sejt spectíkhást. Általánosságban .azokat az antigénekéi tekintjük immunogéimek, amelyek -pozitív eredményt adnak proliferáeiás és/vagy citokin termeiéses vizsgálati eljárásokban (azaz interferon-y és interleukm-12 termelés), amelyeket M. ínó«rcafos«;-immunttássaí rendelkező egyénből származó T-sejtek. NKsejtek, B-sejtek és/vagy makrofágok alkalmazásával végzünk, ilyen vizsgálatok például az alább ismertetett reprezentatív eljárások -segítségével hajthatók végre. ?áz. ilyen antigének itnmunogén részleteit hasonló vizsgálati eljárások segítségével azonosíthatjuk, és a kitani-ásbas ismertetett poüpepháeken beiül helyezkedhetnek el.
Egy pohpepíidnek. (azaz egy bamtmogén antigénnek, vagy altnak egy részének, illetve variánsának) az a képessége, hogy sejtprolíforácíói indukál úgy értékelhető, hogy a sejteket (azaz T-sejteket és/vagy K.K-sejteket> a polípeplíddeí érintkeztetjök és meghatározzak a sejtek proliferációját. Általánosságban a polipeptíd mennyisége, amely elegendő körülbelül iö' sajl.értékeléséhez, körülbelül 10 ng/nd-től a löd pg/ml tartományig terjed, és előnyösen körülbelül lő ng/mt. A polipeptíd és. a sejtek inkabálását-tipikusan 37 X-on hajtjuk végre körülbelül fiat napig, A potípeptíddel történő- jnkabálást kővetően a sejteket proíiferációs válaszra vizsgáljuk, amely a .szakember számára ismert eljárásokkal megvalósítható, például ágy. hogy a sejteket, radíoakttvan jelölt drttídiEirtei pulzáljuk, és· meghatározzak a radioaktív jelölés beépülését a sejt DNS-be. Általánosságban olyan polípeptidet tekintünk képesnek prohferácio indukálására, amely a prolíferációbaa legalább háromszoros növekedést hoz létté a háttér értékhez képest (azaz a potípeptié jelenléte nélkül tenyésztett sejtek esetében mért proliferációi.
Egy polipeptklnek sejtekben mtecferon-v és/vagy iftterfettkln-i 2 termelést stimuláló képessége értékelhető oly módon, hogy a sejteket a polipeptlddel érintkeztetjük és meghatározzak a sejtek áltel termeit interferon-? vagy interleukin-12 szintjét Általánosságban a .polipeptíd mennyisége, amely -elegendő körülbelül lő5 sejt értékeléséhez, körülbelül iö ng/tsl-töl a I0Ő pg/sttí tartományig terjed, és előnyösen körülbelül lő ug/ml. A poíipeptid lehet rögzített - de m szükségszerűen az ~ egy szilárd hordozón, mini például egy gyöngy, vagy egy biológiailag lebontható mtkrogőntb hordozóm mint például a 4,897,268 és 5,075,109 iajstromszámd US szabadalmakban leírt hordozók, A poíipeptid és a sejtek irtkubálásái: tipikusan 37 X~on körülbelül hat sáp időtartamig végezzük. A pohpeptíddei- történő inkubációt követően a sejteket interferon-? és/vagy interleukin-12 termelésre (vagy ezek egy vagy több ategységése) vizsgáljuk, amely a szakember számára ismert eljárások segítségével végrehajtható, olyasok alkalmazásával, mint például enzim-kapcsok kmmmszorbens vizsgálati eljárás (ELlSA), vagy az IL-12 F7Ö alegység esetében- egy biológiai vizsgálati eljárás, min; például egy T-sejt proliferáciét meghatározó vizsgálati eljárás. Általánosságban olyan polipeptíd. te'sinthető képesnek interferon-? termelés stímulálásám, .amely legalább 5ö pg intetferou.-? termelését váltja ki a tenyésztés- felülüszojának milliliterében (amely tenyészet lő4-lő5/mí T-sejtef tartalmaz). Olyan poiipeptíd tekinthető képesnek ?L-12 termelés stimuláiására, amely legalább iö pg/tnl IL-12 P7ö alegység, és/vagy legalább 100 pg/nsd IL~; 2 F4Ö alegység termelését stimulálja Kt5 makrofágban vagy B-sejtben ívagy 3 x löJ .FBMC-hen),
-11 Általánosságban mímuno-géíi antigénnek tekinthetők azok az antigének, amelyek proíiíerációí és/vagy citokin temetést stmmláfosk (száz íaterforou-y és/vagy i?rterleukín-12 tenróést) Τ-sejtekben, NK.-sejtekben, Bsejtekbes és/vagv malu-oíagokban, amelyek legalább körülbelül 25 %-haa M íríóer-ite/osA-imínmütással feadelkező egyénekből származnak. Ezen bnmunogén antigének közül a legkiválóbb terápiás hatással rendelkezők megkülönböztethetők a fentebb leírt vizsgálati ellátásokban atkát válaszok nagysága alapján, és az egyének százalékos aránya szerint, akiknél válasz megfigyelhető. Hozzátehetjük még, hogy a legkiválóbb terápiás hatással rendelkező antigének netn stimulálnak proiiforáciőt és/vagy citokin termelést Zh vövo olyan sejtekben, amelyek több mint 25 %ihan olyan egyénekből származnak, akik nem rendelkeznek Af, mőenc«7»m:-mmiunitfcsal, ezzel tehát kizárhatjuk: azokat a válaszokat, amelyek nem specifikusan a A/, /«őmWaris-reagáfó sejteknek köszönhetők. Azok az antigének tekinthetők a legkiválóbb terápiás hatással rendelkező antigéneknek, amelyek a A/ ííióercKfoíÍS-itnntortitássa? rendelkező egyénekből származó T-sejiek, MK-sejíek, 8-sej.tek és/vagy makrókig preparátumok nagy százalékában indukálnak választ (és az. egyéb személyekből származó sejtpreparátumok esetében kis gyakorisággal fordul elő válasz).
A legkiválóbb terápiás toíaidonságokka! rendelkező- antigének azon az alapon Is azonosíthatók, hogy milyen mértékben képesek a Aí fertőzés súlyosságát csökkenteni kísérleti állatokban, amikor ezeket oltóanyagként beadjuk. A kísérleti állatok esetében alkalmazható megfelelő oltóanyag preparátumokat .a kővetkezőkben részletesen is ismertetjük. A hatékonyság meghatározható az antigén .azon képessége alapján, hogy legalább körülbelül 50 %-os csökkenést tud létrehozni a bskférinmszámban és/vagy legalább körülbelül 40 százalékos csökkenést tud létrehozni a mortalitásban a kísérleti fertőzést követően. A megfelelő kísérleti állatok közé tartozhatnak egerek, tengeri malacok es foemiösök.
A legkiválóbb diagnosztikai íulaldoaságokkal rendelkező antigének általánosságban azonosíthatók azon képességük alapján, milyen választ hoznak létre egy intradennális bőrrészt során aktív tuberkulózisban szenvedő egyénen, és egy Ad /«beft^fesA-sal nem fertőzött egyénen végrehajtott bőrteszt során. A bőrrészt általánosságban az alábbiakban megadott módot? hajtható- végre, amikor egy legalább 5 mm -átmérőjű megkeményedést tekintünk pozitív válasznak.
Az itt leirt antigének ímmunogéo részleteit a technika állasa szerint ismert eljárások, segítségével előállíthatjuk és azonosíthatjuk, például olyanok alkalmazásával, mint amit Paul foglalt össze: [Paul: Fuadameníaí Immunofogy, 243, old. 3, kiadás, Raven Press, (1993)), valamint az ebben idézett referenciák, Az ilyen eljárások magukba foglalják a természetes körülmények között előforduló antigén polipeptid részleteinek szkrfoelését immtmogén tulajdonságokra, A Riíamtás részét képező reprezentatív prolileráclós és citokin termeléses vizsgálati eljárások ezekben a szkrnrvizsgálaíofcban általánosan alkalmazhatók. Egy polipeptid immusiogén részlete egy olyan részlet, amely a reprezentadv vizsgálati eljárások során Immunválaszt hoz létre (azaz protíferáeíőt, mterfoon-γ termelést és/vagy mterleukiu-12 termelést):, amely lényegében megegyezik azzal, amit a teljes hosszúságé antigén hoz létre, Más szavakkal, egy antigén immusogén részlete legalább körülbelül 20 %, és előnyösen körülbelül: löt) % proiiforáciőt hoz létre a teljes hosszúságú antigénnel összehasonlítva az Itt leírt modell proliferációs vizsgálati eljárás során. Egy immtmogén részlet ezzel együtt, vagy alternatív módon legalább körülbelül 20 %-ban. előnyösen körülbelül löö %~b;m stimulálhatja az interferon-γ és/vagy az- hxterfeakio12 terntelését a teljes irosszóságú antigénnel összehasonlítva az itt leül modellként szolgáló vizsgálati eljárás során.
J ** «
M iubetvufosisi antigének fészletei és további variánsai előálilthatók szintetikus vagy rekomfeináns ötön. 100 ambtos&vnáí kevesebbet és általártosságban. 50 ammosavuál kevesebbet tartaltnazó· szmtetíkas polipeptídek a szakember számára ismert -eljárások segítségévei élőéi lühatdak, így például az ilyen poiípepíidek megsziutetizáihaiéak a kereskedelemben hözzáforhető szilárd-fázisú eljárások bármelyikével, mint például a Memfíeld-tele szilárd-fázisú szintézis eljárás, ahol az ammosavakat egymás után kapcsoljuk hozzá a növekvő aminosav lánchoz [Memfield: X Ara.. Cbem, Sec. 35 2149 t 1963)]. Poiípepíidek automatizált szintéziséhez szükséges készülékek a kereskedelemben hozzáférhetőek, mint példán! az Applied Riesysteras, bse. (Foster City, CA) készüléke és a gyártó használati utasításai alapján- üzsmsltetbeíő. A természetes: körülmények közöd előforduló antigének variánsai 'általánosságban előállíthatnak standard mutítgenezis eljárások alkalmazásával, mint például az öíigonukleotíd-írányított. heíyspecifikus sniatagenezxs. A DHS-szekvencía reszel úgyszintén el is távolithatóak Standard eljárások alkalmazásával, hogy lerövidített polipepikieket hozzunk léim.
Természetes körülmények között előforduló antigének részleteit és/vagy variánsait tartalmazó rekombináns poiipeptideket könnyen előállíthatunk egy, a poiipeptídet kódoló DNS-szekvencíábói, a szakember számára ismeri különböző eljárások alkalmazásával. Például az első lépésben egy kereskedelemben hozzáférhető szűrő segítségévei megfelelő gazdaszervezet/vektor rendszerből - amely rekombináns fehérjéi szekretál a tenyész tő Ivadékba - szármázd Íéíülúszót koncentrálunk. A koncentrálást követően a koncentrátumot megfelelő tisztítási mátrixra visszük, mint például egy affinitás mátrix vagy egy ioncserélő .gyanta; Végezetül egy vagy több fordíiott-iázisú HPLC lépési alkalmazónk, hogy a rekombináns fehérjét tovább tisztítsuk.
A szakember számára ismert különböző expressziós vektorok bármelyike alkalmazható a találmány szerinti rekombináns polipeptídek expresszi ójára. Az expresszié végrehajtható bármilyen megfelelő gazdasejtben, amelyet a rekombinám poiipeptídet kódoló DNS-molékulát tartalmazó expressziós vektorral transzformáltunk vagy tKsnszfektáitnnk. A megfelelő gazdasejtek magukba foglalnak prokarióta -sejteket, élesztő, valamint magasabb eukarióta sejteket. Előnyősén az alkalmazott gazdasejt A co/ΰ élesztő vagy egy emlős sejtvonaí, mint .például. COS vagy CHO. Az ilyen módon expressziül DNS-szekveneiák kódolhatnak természetes körülmények között előforduló antigéneket, természetes körülmények között előforduló antitestek részleteit, vagy azok további variánsait.
Általánosságban az előállítás módjától függetlenül, a kitamtás szerinti polipeptídek lényegében tiszta formában kerülnek előállításra. Előnyösen a polipeptídek legalább körűidéiül Üö %-os tlszíaságűak, előnyösebben legalább körülbelül 90 %--os tlszraságaak és legelőnyösebben legalább körülbelül 99 %-os tísztaságdak. A találmány egyes előnyős -megvalósítási módjai szerint úgy járunk el, hogy - az alábbiakban részletezve - a lényegében tiszta pobpeptíáeket gyógyászati készítményekbe vagy oltóanyagokba épíliük bele a kiíamíás szerinő egy vagy több eljárásban való alkalmazáshoz.
A találmány egyes speciális megvalósítási módjai szerint olyan polápeptídeket alkalmazunk, amelyek egy •szolúbilis ,áf. itsbercufasb antigén legalább egy immuno-gén részletét tartalmazzák, amely antigén a következő N-terminális· szekvenciák bármelyikét, vagy azok egy variánsát tartalmazzák, amely variáss csupán konzervatív szubsztitúciókban és/vagy módosításokban- tér el :
(a) Αχρ-ΡΓο-νο1-Α8ρ~Ά1ο-ν&1-?Ιε-Ακη~Τΐ5Γ-?!ιτ^/χ-ΑΒθ--ΤγΓ-01γ-01η-ν3ΐ-ν3ΐ~ΑΐΕί-Αΐ3·-ί.«η, (120, azonosítási szám szerinti szekvencia);
(bt Ala-Val-ölu-Ser-öly-Met-Leu-A.la-L-eurö'ly-Thr-Pro-.Ala-Pro-Ser, (121. azotmsitási szám szerinti szekvencia);
- Β (ej Aia^Ah-Mct-Lys-Pro-Arg-'íbr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Aía-Lys-Gni-Giy-Arg, (222. azonosíts.si áa szerinti szekvencia);
(á) 'PyT-I'yr-T:rp-Gys-Pro-Giy-GÍn-Pro-Phe~Asp-Pro-Al&-Típ-Gíy-Psvi, 023. azonosítási szára, szerinti .szekvencia);
<é) Asp-fíe-Gly-Ser-GItt-Ser-Thf-Giu-Asp-ötn-Gfe-Xsa’-Áte’Val, (124. .azonosítási szára -szerinti szekvencia):;
(í) /tía-öká''öin-Ser«He-Ser-'.nsr-Xáa-Gte-Xaa-lie-Val-Fn), (125. azonosítási -szára szerinti szekvencia);
(g) /(sp-Pro-Gln-Pro-Aíá-Pro-Pro-Vai-Pro-T&r-Aía-Aiá-Afe-SeE-Pío-Pío-Ser, (126. azonosítási szára szerinti szekveficG);
(h) A.la-Pro-Lys-Tbr-Tyr-X-aa-Gln-Glu-Leu-Lys-Gly-'íbr-A^-I’hrOly, (12?. azonosítási szára, szerinti szekvencia);
(i) .Asp-Pro-Ala-Ser-Ála-Pro-Asp-Val-Pn-t-Thr-Ala-Aila-Gín-leu-Tfer-Ser-Leu-Löit-Asn-Ser-Len-Áb-A!^ ProAsn-Val-Ser-Pbe-Ala-Asn. (128. azonosítási szára szerinti, szekvencia); (jj Xaa-As)p-Ser-Gl-u*Lys-Ser-2tiaThr-Iie-Lys-Vaí-Tkr-Asp-Ak-Se·· (134. .azonosítási szára szerinti szekvencia);
(k) Ala-öiy-Asp--fhr-Xaa-ÍIe-Tyr-He-VaWjiy-Asn-Len-Tbr-Áía’A8|> (135. azonosítási -szára szerinti szekvencia); vagy (l) Ala-Pre-GÍu-Ser-Giy-Aia-Gly-Leö-Gly-Gíy-rhr-Val-Gfe-Ab-Giy, (136. azonosítási szára szerinti, szekvencia);
amelyekben Xaa tetszés szerint választható araínosav, előnyösen cisztein aminosav lehet. A (g) pontban azonosított antigént kódoló íSNS-szekvenciát az 52. azonosítási szára szerinti .szekvencia rantatja be, és az 52. azonosítási szám szerinti szekvenciával kódolt polípeptidet az 53. azonosítási szám szerinti, szekvenciában nra> tatjuk fee. Az (a) pontban azonosított antigént kódoló DNS-szekveaciát a lói. azonosítást szára szerinti szekvencia mutatja be; levezetett antiaosav szekvenciáját a 102. azonosítási 'szára szerinti szekvenciában rautatjuk be. A (d) antigénnek megfelelő ONS-szekvencíát a 24. azenesiWi szám szerinti szekvenciában mutatjuk be; a (c) antigénnek megfelelő FJNS-szekvencíár a 25. azonosítási szára szerinti szekvenciában mataíitík be; ás az (1) antigénnek megiblelő DNS-szekvenciát a 99. azonosítási· szám szerinti szekvenciában rntftsayok be; ennek levezetett annoosav szekvenciáját a 100. azonosítási szára szerinti szekvenciában mutatjuk. be.
A találmány egy további specifikus megvalósítási utódja- szerint olyan polipeptidekeí alkalmazunk, amelyek egy M íuxeradösF antigén legalább egy immtmogén részletét tartalmazzák, amely antigén a kővetkező N~ terminális szekvenciák bármelyikét,, vagy azok variánsát tariaíraazza, amely variánsok csupán konzervatív szubsztitúciókban és/vagy módosításokban különböznek:
(ra) Xaa-Tyt-llo-Aia-Iyr-Xiaa-í'hr'-’f'hr-Ala-Gly-lie-Vai'Prö-G’yd.ys-iie-Asn-Val-His-LetJ-Vak (137. azonosítási szára· szerinti szekvencia); vagy (n) A^-Pro-Pro-Asp-Pro-tíis-Gls-Xaa-Asp-Met-'ntr’Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pnj-Gly-öly-Arg-Arg-Xas-Pfee, (129. azonosítási szám szerinti szekvencia);
amelyekben Xaa tetszés szerint választható -amisesav, előnyösen cisztein aminosav lehet.
A találmány ismét további specifikus megvalósítási módjai szerbi olyan, polipeptideket alkalmazunk, amelyek egy szolébilis AZ te&ercufos-is antigén (vagy egy ilyen antigén variánsának) legalább egy imnnmogén részletét tartalmazzák, amely antigén egy vagy több aminosav szekvenciát tartalmaz, amely szekvenciákat (a) az 1, a 2, a 4-Pl a 13-25, és az 52. azonosítási szára- szerinti GNS-szekvenoiák;. (b) ezeknek a DNS- 14 szekvenciáknak a líomplementerie·; vagy Ce) olyan DNS-szekvenciák kódolnak, amelyek lényegében homológok egy (a) vagy (b) pont szerinti szekvenciával.
A találmány további specifikus; nsegvatósításí módjai szerint olyan poiipeptideket alkalmazunk, amelyek «gy M. Mhnraf/ásis antigén (vagy egy ilyen, antigén variánsának), - amely lehet szolübilis vagy nem-szoióbills legalább egy mxmuapgé® részletét tartalmazzák, amely antigén egy vagy több aminosav szekvenciát tartalmaz, amely szekvenciákat (a) a 26-51, azonosítási szám szerinti DNS-szekvenciák; <b) ezeknek a DN-Sszékveaeiáknak a kompiementegei; vagy (c) olyan DNS-szekvenciák kódolnak, amelyek lényegében homológok egy (a? vagy (bi pont szenet· szekvenciával
A fentebb ismertetett speciális megvalósítási módokban a M labef'adaxF antigének magnkba foglalnak olyan variánsokat, amelyeket a leírásban specifikusan megemlített egy vagy több DNS-szekve?rcíával lényegében homológ DNS-szekvenciák kódolnak, A leirés -sorén alkalmazott „lényegében homológ” kifejezés .alatt olyan ONS-szekvenciáhat értünk, amelyek mérsékelten sztringens körülmények közöli hibridizálni képesek. Megfelelő mérsékeltei? sztringeus köröimérsyeket tercjnthetünk a következők szerint: előzetes mosást végzőnk 5x SSC,'0,5 % SDS, 1,0 stM H3TA (pH 8,0) oldatban; a hihrldízáíást 50-65 ”C-oh, Sx. SSC jehmiétéhen, éjszakán át, vagy fejők közötti homológja esetés 45 <;C-on, 0,Sx SSC jelenlétében végezzük; ezt kővetően kétszer mossuk 65 °C-on 20-20 percig a következő sorozattak 2x SSC, ö,5x SSC -és Ö,2x SSC, amelyek 0,1 % SDS-t i&rtalnxaznak. Az ilyen körülmények között hibridizálé DNb-szekvenciák az igényelt oltalmi kötött belülinek tekintendők, éppúgy, mint azok -a nukleotid szekvenciák, amelyek a genetikai kőd degenerábsága következtében olyan imruunogén poiipeptidet kódolnak, amit egy hibridizálé DNS-szekvencia is kódol
A találmány egy rokon megvalósítást módja szerint fúziós fehérjéket állítunk elő, amelyek egy első és egy másoihk: találmtré-y szerinti poiipeptidet tartalmaznak, vagy allemativ módon egy találmány szerinti poiipeptidet és egy ismeri df réótmdös& snrigéot tartalmaznak, taréi például a fentebb leírt 38 kD antigén vagy az BS'AT-6 (103. és 1-04. azonosítási szán? szerinti szekvenciák), beleértve az ilyen fúziós fehétjék variánsait is. A találmány szerinti fúziós fehérjék tartalmazhatnak egy línker pepiklet is az első és második polipeptid között.
A taláhmuiy szerifei fúziós fehérjét kódoló DNS-szekvencfet ismert -rekombináns DNS-eijárésok alkahnazásával szerkeszthetjük meg az első és második poiipeptidet kódoló különálló DNS-szekvenciák összeépítésével egy megfelelő expressziós vektorba. Az dso poKpeptidst kódoló DNS-szekvencta 3’-végét pepiid 'linkénél vagy anélkúl ligáljuk a második poiipeptidet kódoló DNS-szekveocio 5’-végéhez oly módon, hogy a szekvenciák leolvasás·? fázisai itsegegyezstek és ezzel lehetővé teszik, hogy a két DNS-szekvencia mRN'S-fransziáeiój.a sorén egyetlen fúziós fehérje jöjjön létre, amely mind az első, misxl a második polipeptid biológiai akti vitását megfejt ja.
Egy peprid-ltnke?· szekvenciát aikalmazhatmtk az első és a második polipeptid olyan mértékű távoltartására, amely biztosítja azt, hogy mindegyik polipeptid a saját szekunder és tercier struktúrájába rendeződik. ilyen pepíid-linker szekvenciát a füzlos fehérjébe a technika állása szerint -ismert ellátások segítségével beépíthetünk. Az alkalmazható peptid-lmker szekvenciák a következő tulajdonságok alapján választhatók: (I) köpések arra, hogy flexibilis megrsyújtotf konfemnaelőf vegyenek fel; (2) nem vesznek fel olyan szekunder struktúrát, amely kölesönbalásha léphet az első és a második poiipeptidet? táláíható iunkcionális epiiópokkal; és (3) hiányoznak a bidrofób vagy töltéssel rersdelhező ammosavak, amelyek reagálhatnak a polipeptid funkcionális epitöpokkai. Az előnyösen alkalmazható peprid-ltnker -szekvenciák Gly, Áss és: Ser amínostsvakat' tartalmaznak. További közei semleges aminosavak., mim például Tár és Alá szinten altómzhatőak a linket szekvenciában, A linkerként * *
X ««
-15szintéa eredményesen alkalmazható aminosav szekvenciák közé tarsozstak azok. melyek ismertetésit kerültek a következő pííbiikáeiőkhan: [Maratea és mtsai.:; Gene 49 .39 t1985); Murphy és sntsat.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83 8258 (1986); továbbá a 4,935,233 és 4,751,180 lajstromszámú US szabadalmak]. A h'nker szekvencia bosszúsága 3-től körülbelül 59 sminossvig terjedhet Nincs szükség peptid szekvenciákra akkor, amikor az első és második: poiipeptid rendelkezik neta-esszesciális N-tenaínálls aminosav régiókkal, atneiyek alkalmazhatók a funkcionális döntések elválasztására és a térbeli kölcsönhatók kivédésére,
A ligák DNS-szekvesciákat fenfccienálísas hozzákapcsoljak megfelelő transzkripciós vagy transzlációs szabályozó elemekhez, A DNS sxpresszidjáőtt felelős szabályozó elemek -csak az 5’-irányban helyezkedhetnek el az első polinepttdeket kódoló DN S-szek véne iához képest. Hasonló .taódon a transzláció befejezéséhez szükséges stop-kodenok és a transzkripciós befejezési szignálok csak a második polípeptidet kódoló DNSszekvenesához képest a 3 -irányban helyezkedhetnek el.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint eljárásokat hozunk létre a fenti egy vagy több poiipeptid vagy filzrós fehérje (vagy az ilyen polipeptideket kódoló DNS-molekuíák) alkahnazásáira páciensben tuberkulózis- elleni védőhatásá immunitás tndnkálására. A leírás sotátt alkalmazott „páciens’-' kifejezés alatt bármely melegvérű állatot, előnyösen embert értünk. Egy páciens szenvedhet betegségben vagy mentes lehet kimutatható· betegségfel és/vagy fertőzéstől. Más szavakkal kifejezve, védőhalású immunitás létrehozható tuberkulózis· megelőzése vagy kezelése céljából.
A taíálmátty e megvalósítást módja szerint a poiipeptid, fúziós fehérje vagy DNS-molekula általában gyógyászati készítmény részét és/vagy oltóanyag részét alkotja. Gyógyászati készítmények raítalmazhatnuk egy vagy több pohpcptiáeí, amelyek mindegyike a fenti szekvenciák (vagy azok variánsai) közöl egyet vagy többet tartalmazhat, valamint tartalmaz még fiziológiásán elfogadható 'hordozót is. Az oltóanyagok egy vagy több, a fentiek szerinti polipeptidet és egy nem-specifikus immunválasz serkentőt taríalmazhatnak, mim például egy adjuvánst vagy íiposzómát (amely magába foglalja a polipeptidet is). Az ilyen gyógyászati készítmények és oltóanyagok tiutalumzbetuak még további M íífeemuóisfe antigéneket, akár egy kombinációs polipeptídbe beépítve vagy «gy különálló pohpeptiden elhelyezkedve.
Alternatív módon egy oltóanyag tartalmazhat egy vagy több lentebb leirt polipeptidet kódoló DNS-t úgy, hogy a polipeptidet iv rím állítjuk elő. Az ilyen oltóanyagokban a DNS a szakember számára ismert különböző bejuttató rendszerek bármelyikében jelen lehet, beleértve nukieinsav expressziős rendszereket, valamint bakteriális és viruseredetű expresszíós rendszereket. A megfelelő nufelomsav -expresszíós rendszerek tartalmazzák a szükséges DNS-szekveneíákas a páciensben történő expresszióhoz (mini például egy megfelelő promóter és egy befejezési szignálj. A bakteriális bejuttató: rendszerek részét képezheti egy baktérium (mint például a Aacdóo-Caitveiíe- űvnfiv) amely a poiipeptid immonogér· részletét a sejtfelhieíén expresszálja. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a DNS-t viryseredetü expresszíós rendszer segítségévei juttatjuk be (például vaccinia, vagy más himlövlrus, retrovírus: vagy adeaovi-rus), amely magába fogkí&atia nem-patogén (hibás), replikádéra képes vírus alkalmazását is. Á szukeinher szánkás az Ilyen expresszíós rendszerekbe történő DNSheépítésre szolgáló eljárások jól ismertek. A DNS úgyszintén „csupasz”' is lehet, ahogy ezt például Uimet és rnankmársaí leírták (Ulrner és mtsai.: Science 259 1745 < 1993), átnézte és értékelte: Cohen; Science 259 1691 (1993)]. A csupasz DNS felvétele megnövelhető, amennyiben: a DNS-t biológiailag lebontható gyöngyök felületére visszük, amelyek jő hatásfokkal bekerülnek a sejtekbe.
• iöΑ találmány egy rokon megvalósítási módja során a fentiek szerinti DNS-oitóanyag bejuttatásával együtt vagy azt követően, egy találmány szerinti polipeptidet vagy egy ismert M óa$em/fe.sis antigént, mint példán! a 38 ki) antigént is beadnak. Példám, egy találmány szerinti polipeptidet: kódoló DNS beadását, akár-csupaszon, akár egy, a fentiekben leírt: bejuttató rendszeren keresztül követheti egy antigén beadása annak érdekében, hogy az oltóanyag védő ímmuuhatáaát megnöveljük.
A beadás módja és gyakorisága, éppúgy a dózis, egyénről egyénre változik és hasonló tehet azokhoz, amelyeket jelenleg is alkalmazunk a BCG segítségével történő immunizálás során. Általánosságban a gyógyászati készítmények és oltóanyagok beadhatók injekció formájában (például íntrakután, hnra-muszkulárisan, intravénásán vagy szubkután), mtranazáiisan (példán! belélegzés útján) vagy orálisan. 1~36 hetes Időtartamban 1-3 dózis adható be. Előnyösen 3 dózist sdtmk be, 3-4 hónapos Időközökben, és ezt követően gyorsító oltások adhatók Időszakosan, Az egyes páciensek esetében alternatív protokollok is alkalmazhatók. Megfelelő dózisnak tekintjük a polipepridrsek vagy a DNS-nek szt a mennyiségét, amely a fentiek szerint beadva elégséges mértékben képes immunválaszt kiváltani egy immunizált páciensben ahhoz, hogy a pácienst legalább 1-2 év időtartamig megvédje a M íaőmzíílosA fertőzés ellen. Általánosságban, a dózist alkotó polipeptid mennyisége (vagy amely in sü« termelődik a dózisban található DNS hatására) körülbelül 1 pg/kg-tó) körülbelül 101) mg/kg-ig terjedhet a gazdasz.szvezetben, tipikusan körülbelül W pg-lől körülbelül 1 mg-ig, és előnyösen körülbelül l öö pg-íől körülbelül 1 pg-ig. A megfelelő dózisméret a páciens testtömegével változhat, de tipikusan körülbelül fel ml-töl körülbelül 5 ml-ig terjedhet.
Míg a szakember szántára ismert megfelelő hordozók bármelyike alkalmazható n találmány szerinti gyógyászat! készítményekben, a hordozó típusa a beadás módja szerint változhat Parenterális beadáshoz - mini például szubkután injekció - a hordozó előnyösen vizet, fiziológiás sóoídatot. alkoholt, egy zsirszerü .anyagot, egy viaszt, vagy sgy pufíért tartalmazhat.. Orális beadáshoz a készítmény a festi hordozok bármelyikét, vagy egy szilárd hordozót tartalmazóra,, mint például martaitól, laktóz, keményítő, magnézium-sztearát, szaksain nátriumsója, tálkám (magnézíum-szildcát), cellulóz, glükóz, répacukor és magnézium-karbonát. Biológiailag, lebontható mikrogtaoMk. (tnim például polítejsavas-galaktíd) szinté»- alkalmazhatók, mint a találmány szerinti gyógyászati készítmény bordosöanynga, Megfelelő biológiáikig lebontható mikrogőmhöket írnak le például a 4,897,208 és 5,075,169 bjstremszámó US A-beb szabadaknak.
A találmány szerinti oltóanyagokban a különböző adjuvánsok bármelyike alkalmazható az Immunválasz nem-specifikus serkentésére. A legtöbb .adjuváns tartalmaz, egy anyagot, amelynek feladata, hogy az antigént megvédje a gyors kaiabolizssustöl - ilyen lehet például az- al.umlruun:-bidro;<íd vagy ásványi olaj — és tartalmaz egy nem-specifikus immunválasz. stimulótort mint például lípid-A, fförleieiíe pertussis vagy A/ycohucferium m.berzK/o.vis. Megfelelő adjuvánsok a kereskedelemben hozsáförheíök, mint például a f-'reund-iele hiányos .adjuváns és a Freund-tele teljes adhiváns (Difco Laboratories), es a Merck-fele Adjuvant-65 (Merek és Company, Inc, Rahwy, NJ). További alkalmazható adjuvánsok közé tartozik az ainm, a biológiailag lebontható mikrogőmbök, a mortofeszferi) lípid-A és guíi-A,
A találmány egy másik .megvalósítási módja szerint eljárást hozunk létre a fentebb leírt egy vagy több polipeptid alkalmazásával tuberkulózis kimutatására Pőrteszt segítségével, A leírás során a „bőrteszt” kifejezés alatt bármilyen: olyan vizsgálati eljárást értünk, amelyet közvetlenül a páciensen hajtunk végre és amelyben egy késleltetett típusú hiperszenzitívitási (DTH) reakciót (mint például duzzadás, krvorösődés vagy dormatitisz) mérünk a találmány szerinti egy vagy több polipeptid iníradeftnális imekorőját követően. Az ilyen iígektálás
-> * végrehajtható bármilyen megfelelő eszköz alkalmazásával, amely biztosítja a polípeptid vagy polipeptidek éríntkeztetését a páciensek dermálts sejtjeivel, máit például egy tuberkulln fecskendő vagy egy 1 ml-es fecskendő.. Előnyösen a reakció mértékét az injekciót követően legalább 48 órával határozzuk meg, előnyösebben 48-72. óra között.
A GTH-reakeió egy sejt-közvetített immunválasz, amely nagyobb mértékű olyan páciensekben, akik korábban érintkeztek a vizsgálati antigénnel (például az alkalmazót! polípeptid immunogén részével, vagy annak egy variánsával). A válasz vizuálisan értékelhető mérővonalzó alkalmazásával. Általánosságban egy olyan válasz, amely körülbelül 0,5 em-néi nagyobb átmérőjű, előnyösen amelyik nagyobb, mint körülbelül í,ő cm átmérőjű, tekinthető pozitív válasznak, tuberkulózis fertőzést jelezve, amely nem szükségszerűen -testesül meg -mint aktív betegség.
A találmány szerinti polipeptidek, mint gyógyászati: készítmények, előnyösen börtesztben történő alkalmazáshoz íormulázotíak, amelyek egy polípeptidet és egy fentiek. szerinti farmakolőgíailag elfogadható hordozót fartaimazsak. Az ilyen készítmények tipikusan a fenti polipeptidek közöl egyet vagy többet tartalmaznak, 'körülbelül I pg-tól körülbelül ÍOÖ pg-ig terjedő mennyiségben, előnyösen körülbelül lö ug-ról körülbelül 50 yg mennyiségig 0,I mi térfogatban. Előnyösen az ilyen gyógyászati készítményekben alkalmazott hordozó fiziológiás sóoldat a megfelelő tartósítószerekkel, mini például fenol és/vagy Tween 89m.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a börtesztben alkalmazott pollpepfidnek olyan polípeptidet választunk, amelynek mérete elegendően nagy ahhoz, hogy a reakció időtartamára az injekció helyén maradjon. Általánosságban egy polípeptid, amely legalább 9 annnosav hosszá, elegendő. Az alkalmazott polípeptid ugyanakkor & makrofágok hatására előnyősei! az Injekció beadását kővetően -étákon belül iebomiik, hogy létrejöhessen a T-sejtek felé történő prezentálás. Áz ilyen. polipeptidek tartalmazhatnak ismétlődéseket .a fenti egy vagy több szekvenciából, és/vagv taríuimszhuiaak további immunogén vagy nem-femmnogén'.szekvenciákat is.
Az alábbiakban következő példák csupán a leírás alátámasztására szolgálnak és nem korlátozó értelemben kerülnek bemutatásra.
/. Pi7á«
Ez a példa mutatja be M úfneívu/ovfe szelúbitis polipeptidek előállítását tenyészet szürletéböi. Amennyiben másként nem jelezzük, az itt következő példában az összes százalékos érték íömeg/téríbgatra vona-kozik.
M móerctf/ow-t (akár a H3?Rs, ATCC katalógusszám: 25177; vagy a I-.?37Rv, ATCC katalógusszám: 25618 törzset) tenyésztettünk steril GAS-táptalajban 37 5>C-on H napig. A láptalajt ezt kővetően vákuumban 0,45 μ pőmsttagyságú szűrőn keresztül (a sejtek ío tömegét visszatartva) 2,5 1-es steril palackba szűrtük, A táplálás; ezt követően (1,2 g-os szőrön szűrtük keresztül steril-4 1-es palackba, és a tenyészet szőriedhez NaN ?--ot adtunk 9,94 % koncentrációig. A palackokul ezt követően hidegszobábars, 4 Ál hőmérsékleten tároltuk,
A tenyészet szürleiét ágy koncentráltuk, hogy a szürletet egy ezt megelőzőleg autoklávözott 12 1-es tárolóedénybe helyeztük, és a szürfeteí részletekben 4-00 ml-es Asmeoi- kevert cellába vittük, amelyet megelőzőleg etanollal kiöblítettünk és egy 1.0.000 kD MWCÖ IMolecolar kVeight Cut-öff, nolekulatömeg-vágásü) memb» *
- 18rám helyeztünk bele. A nyomást 60 psi (pound-per-squat'e-inch, fon-t/négyzethüvelyk) értéken rmottuk rsitrogéngázt alkataazva, Ez az eljárás a 12 1-es térfogatot körülbelül 51) ml-re csökkentette.
A tenyészet szőrletét ö.l % ammóniam-bikarbonát oldatba dializálmk 8.000 ki) MWCO cellulóz-észter membránt alkalmazva, az ammónlum-bikarhonát oldat kétszeri cseréjével. Ezt kővetően a fehérje-koncentrációt kereskedelemben beszerezhető BCA vizsgálati eljárás reagenskészlet (Pferce, Rockfórd, IL) segítségével határoztuk: meg,
A tenyészet diaiizálí szörletét -ezt kővetően Mlízáhuk, és a polipeptideket desztillált vízben újraszuszpendáltuk. A polipeptideket ü.öl saM l^-b-iszffnszlbkiro-ximetilj-n^dlamiaoj-isropámiai, pH 7,5 (biszTrisz-propás purfer), szemben diaiizáiíuk, ameiy körülmények megegyeznek az anioncseréíö kfomatográfta kezdeti körülményeivel. A áakeionálásí gél-proíüziós kromaíográfia segítségével. 4.6 mm x 100 mm mérető POROS 14ő ü Q/M aotoncsetélö oszlopon {Persepirve BioSystems, FraminghaKí, MA) hajtottuk végre, amit pH 7,5-nél Ö.úí οϊΜ bisz-Trisz-propán pniferrel ekvilibráb-unk. A. poiípeptideket a fenti pnfter-tenászetben létrehozott,. 0-0,5 M NaCS lineáris gradienssel elaáitak. Az oszlopról lejövő oldatot 220 nm hullámhossznál monitoroztak.
Az ioncserélő .oszlopról elnált, polipeptidet. tartalmazó frakciókat összeöntve desztillált -vízzel szentben diaiisíálíuk és ho-fttó-ita'k. Az eredményül kapott anyagot 0,1 % vizes (pH 1,9 í trfí&or-ecetsavb-an (TFA) felöldőltük, és a polipeptideket 500 Angström póra-s-tnéretü, S mikro·» részecskemérető, 3,9 x ISO mm méretű DeliaPak Cl8-as oszlopon (Waters, Milford, MA) tisztítottuk, A. poíipeptideket az oszlopról a hígító poffer (Ö.l % TFA acetosutrilhea) 0-60 %. tartományban lineáris -gradiensével eíaáhuk. Az áramlási sebesség 0,75 tnl/pere volt és a HPEC-eluensí 2:.1-4 nm-en monítorozmk. Az ebiéit polipeptideket .tartalmazó frakciókat ősszegyöjtő-ttök, hogy az egyedi minták maximális tisztaságát biztosítsuk.. Körülbelül 209 tisztított polipeptidet kaptunk ily módon,.
Ezt .követően a tisztított polipeptideket T-sejt proliíéráeiót indukáló aktivitásokra szkríneitük PBMC preparátumokon. Az olyan donorokból származó PSMC-kei, akikről ismert, hogy PPD-börteszt pozitivok és akiknek 'T-sejtjetről kimutatták, hogy' a PPO-re és MTB-eredeíü nyers szelübiiis fehérjék hatására válaszként profrföráeió történik, olyan táptalajban tenyésztettük, amely 10 % egyesített humán szérummal és 50 pg/ml gentamícmnel kiegészített RPMi 1640 médiumot tartalmazott. Á tisztított polipeptideket dnplikáiumként adtuk hozza, Ö,5-IÖ pg/ml koncentrációban. Hatnapos tenyésztés ólán 96-lyukas lekerekített, fenekő lapokban, 200 pl térfogatban, mindegyik lyukból 50 td táptalajt vettünk kí az IFN-y szintek meghatározására, ahogyan ezt az alább lakban leírjuk. A lapokat ezt követően 1 uCi/lyuk triciáit timíditmel pttlzáituk további 18 óira időtartamig, begyűjtöttük és a tdclum felvételt gáz-szcintiliáoiós számiálőkészülék segítségével meghatároztuk. Azokat a frakciókat tekintettük pozitívnak, amelyek mindkét ismétlésben háromszor nagyobb proüíerációt eredményeztek, mint azoknak a sejteknek az esetében mért prolifeíáció, amelyeket csak a táptalaj: jelenlétében tenyésztettünk.
Az IFN-y meghatározáshoz egy enzim-kapcsok immanszorbens vizsgálati eljárást (BUSA) alkalmaztunk. Az FUSA-lapokat barnán IFN-y elleni egér eredetű monekfonáks antitesttel vontuk be (PbarMingen, San Diego, CA) 4 órán keresztül PBS-bes, szobahőmérsékleten. A lyukakat ezt követően 5 % zsírmentes tejport tartalmazó PBS-sei blokkoltuk 1 órán keresztül, szobahőmérsékleten, A lapokat ezután hatszor mostuk ö,2 %. Tweert-zö-at tartalmazó PBS-sel, és a tenyésztáptaiajjal 1:2 arányban bigitoít mintákat éjszakán át szobahőmérsékleten Inkubáituk az ELISA-lapokbaa. A lapokat ismét. mostak,, és lö % normál kecskeszérumot. tartalmazó PBS-ben i :3ööi) arányban bigitoít pohklonális, ovöil eredetű ami-humán- IFN-y .szérumot .adtunk mindegyik
...
fififi
- 19 Svukhoz. A lapokat ezután kei órán keresztül ínkubáltuk szobahőmérsékleten, mostuk, és tormaperoxídázkapcsolt snti-ayül TgG-t (Sigms Chemical Co. Sí. Louss, Mö) adtunk hozzá 1:2000 hígításban, 5 % zsírmentes tejport tartalmazó PSS-ben. 'További két órás. szobahőmérsékleten történő inkuhálás után a lapokat mostuk, és TMB szuhsztrátot adtunk hozzá. A reakciói 20 perc ebekével 1 N késsawal leállítottuk. Az oprikai einyeiőképességet. 450 nm-nél - referencia hullámhosszként 570 nm-t választva - meghatároztuk. Azokat a frakciókat lekfetettiik pozitívnak, amelyek mindkét ismétlésben kétszer nagyobb optikai elnyelést mutattak, mint a csak táptabjbao tenyésztett sejtekre kapott 'átlagérték, plusz 3 Standard deviáció.
Szehvenálás céljaira a polipepbdefeet egyesként Biobrene^’-kezclt (Berkin-ElmeriApplied Öiosystems Dívisioo, Fóster City, Kalifornia) üvegszálas filterekre, szárítottuk. A filtereket a polipepirdekkel egy Perkitt.Elmer/Applied Biosystems Division gyártotta Procsse 492 fehérje szekvenátorra vittük. A. polrpeptideket az amino terminálisról kezdve hagyományos Edman-kémiát alkalmazva szekvenáituk. Mindegyik polipeptid esetében az aminosav szekvenciát úgy határoztuk meg. hogy a PTH-aminosav származék retenciós idejét a megfelelő PTH-szátmazék standardok. teteociós idejével hasonlítottuk Össze.
A fentebb ismertetett' eljárást alkalmazva a kővetkező N-terminálís aminosav szekvenciával rendelkező antigéneket' izoláltuk:
(a) zlsp-Pro-V^-Asp-Ma^Val-lle-Asn-Tbr-Ilsr-Xaa'-Asa-Tyr-öiy-öla-Val-Vai-Ál.a’Ala-l^u (54. azonosítási szám szerinti -szekvencia);
(b) zMa-Val-öb-Ser-Ciiy-Met-ÍJíu-Aia-Leu-G'ly-Tla'-Pro-Ala-Pro-Ser (55, .azonosítási szám szerinti szekvencia);
(c) Aia-Aia-Met-.Lys-Pro-)Ug-Thf-'GÍy-A^3-Gly-Pro-Lea-öhí-Aía-Ala-Ly^Glu-<iiy-Ax;g <56. azosxosiiási szám szerinti szekvencia);
(d) Tyr’Tyr-Tqy-Cys-Pro-öiy-Glu-Pm-Phe-Asp-Pro-Ala-T^-Gly-Pfo <57. azonosítási szám szerinti szekvencia);
(e) Asp-íle-öiy-Ser-<51u-Ser-TbrA3hr’z\.^>-öla-Gln>-Xaa-.Ala-Val <58, azonorítási szám szerinti szekvencia);
ifi Aia-Glu-Glu-Ser-ile-Set-Thr-.Xaa-Glu-Xtta-ile~Vai-.Pro: (59. azonosítási szám szerinti szekvencia);
(g) Asp-PK>Glu-.fho-Ab-Pro-Pro-VaÍ-Pro-Thr”Akt-Aia“Ala-/kia*Pro*Pro-Ala (60. azonosítási szám szerinti szekvencia); és (h) Ala-Prö-Lys-Thr-TyT-Xa&-ö!u-Gfe~Leu-Lvs-G ly-W'-Asp- Thr-Gly (61. azonosítási szám szerinti szekvencia);
ahol Xaa tetszés szerinti aminosav lehet.
Egy további antigén kérőit izolálásra a fenti eljárást követő mteröhore-HPLC -imikro-átméröjö, azaz ;,ö mm átmérőjű kromatográfiás oszlopot alkalmazó) tisztítási lépés segítségével. Közelebbről, egy frakcióból amely a fentebb leírt kromatográfiás tisztítási lépésben kapott 'antigének keverékéi tartalmazza - 20 μ!-ΐ tisztítottunk 7 mikron pórusméretö, 1 mm x 100 mm oszlopméretü, Aquapore CT8 oszlopon (Perkm-Elmer/Applíed Biosysisms Dfefeion, Posfer City, Kalifornia) egy Perkic-EhaeriApplied Biósystems. Di-vision gyártotta Model '172 HPLC berendezésben. A frakelökaí az oszlopról felépert: meredekségé acetonítril (ö,05 % TFA-t tartalmaz) - víz (0,05 % TFA-t tartalmaz) lineáris gradienssel, 80 púpért; áramlási sebességgé; eluáljuk. Az eluens monitorozását 250 nns-íiél végezzük. Az eredeti frakciói négy fő csócsta és további kisebb komponensekre választottak
- 20 szét és egv polipeptidet kapttrttk, amelynek molekalatómege 12.054 kD-nafc adódott ftómegspektrometria segítségéve?) és a következő N-tertoináits szekvenciával; rendelkezik:
(i) Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Prö-zXsp.-Vaí-F-rö-T&'-Ate-Ála-Gbi-'G-la-Thr-Ser-Leu-Leu-Asa-Asn-lzíu-AláAsp-Pro-Ásp-Val-Ser-Píse-Ab-Asp (62, azonositási szára szerinti szekvencia).
Erről a polípeptidröl a fentebb leírt vizsgálati eljárások segítségévei kimutattuk, hogy proliferációt és 1FNY termelési indukál FBMC-pí'eparátun'tokbart.
További szoidbilís antigéneket izoláltunk M ütberctíÍosis tenyészet szürletéböl az alábbiak szerint A M, taberadosis tenyészet szürietet a fenitek szerint állítottak elő. Bisz-Trisz-propán pufferrel (pH 5,5) szembeni dialízis! követben frakcionálási: hajtottunk végre aníoncserélö kromatográfta segítségével 4,6 x IÖÖ mm méretű Poros QE oszlopon (Perseptive Biosystems) amelyet pH 5,5-0« hrsz-Trisz-propán pufferben ekvilíbráltunk. A polipeptideket a (fenti puffer rendszerben, (fel,5 M NáCl lineáris gradiens segítségével, 10 ml/perc áramlási sebességgel duálisak, Az oszlopról lejövő duenst 214nmlraHára)iossznái raondoroztnk.
Az ioncserélő oszlopról lejövő Iraké sókat összeöntóííük és fórtiitott-fázisú kromatográflának vetettük alá 4,6 χ 1 öö mm méretű Poros R2 oszlopot (Berseptive Biosystems) alkalmazva. A polipeptideket az oszlopról 0100 % acetonitril (0,1 % TEA) lineáris gradiensével eluáítuk, 5 mEpére áramlási sebesség mellett. Az eluenst 214 fisra hullámhossznál monítoroztuk.
A biológiai aktivitással rendelkező frakciót egy főesöcsra és további kisebb komponensekre választottuk szét. Ennek a csúcsnak az analízise Westem-blot: segítségével PVDF membránon három to sávot mutatott 14 kD, 20 kD és 26 kD molekulatömeggel Meghatároztak ezeknek a poíipeptidsknek: az N-termittáiis szekvenciáit, amelyek - sorban megfeleltetve - a következők:
(j) Xaa-.Asp-SerArlu-Lys-S&r-Aia-Tlm-Ile-Lys-val-Tlu'-Ásp-Ála-Ser (134, azonosítási szám szerinti szekvencia);
(k) Als-Gly-Asp-Thr-Xaa-íle-Tyrdle-Val-Gly-Asn-Letfríhr-Ala-Asp (135. azonosítási szám szerinti szekvencia); és (l) Ála-Pro-Glo-Set-öiyMla-Oly-Leu-Gly-OiyH'hr-Val-Gln-AIa-Gly, (136. azonosítási szám szerinti szekvencia);
ahol Xaa tetszés szerinti amíuosav felre·:,
A fentebb leírt vizsgálati eljárásokat alkalmazva ezekről a polipeptidekröl kimutattuk, hogy proliferáeiór és IFN-y termeléstindukálnak FBMC-preparálnmokbarí. Az la, és ib. ábrákon mutatjuk öé ezeknek a vizsgálatoknak az eredményeit, sorrendben megfeleltetve egy első és egy második donorból származó .PBMC-preparátumot alkalmazva.
Áz (a), (c), (d) és (gj jelölésű .antigéneket kódoló DNS-szekveueiákat úgy állítottuk elő, hogy genorai eredetű M ttiftizcHífesfr kíőntáral szkriueltűak P-végjelölí degenerált öligonukleoíidokat alkalmazva, amelyek .megfeleltek az N-tenináfe szekvenciának és a M fabercvkisis. kodos-használalának. A végrehajtott szfcrm, amikor a fenti ís) antigénnek megfelelő próbát alkalmazlak, olyast klóra azonosított, amelynek szekvenciája a 101. azonosiiási szám szerinti szekvencia. A· 101·. azonosítási szám szerinti szekvenciában kódolt polipeptid. szckvestciája a 102. azonosítási szám szerinti szekvencia. A végrehajtott szkrtn, amikor a fenti (gj antigénnek megfelelő próbát alkalmaztuk, olyan klóm azonosított, amelynek szekvenciája az 52. azonosítási szánt szerinti szekvencia. Az 52. azonosítási szám szerinti szekvenciában kódolt: polipeptid szekvenciája az 53. azonosítási szám szerinti szekvencia. A végrehajtott szkrin, amikor a fenti (ds araigétmex megfelelő próbái alkalmaztuk, »* *
fc·» · 21 olyan kiönt azonosiáát, amelynek -szekvextelája a 24. azonosítási szám szerinti szekveucia és a végrehajtott szkrín, amiket a (c) antigénnek megfelelő próbát alkalmsztak, olyan kiőni: azonosított, amelynek .szekvenciája a 25. azonosítási szám szerinti szekvencia.
A fenti atninosav szekvenciákat összeltssoniiieftiik a gsufeankbaxt található ismert aminosav szekvenciákkal a DNA STAR rendszert alkalmazva. A végsgkeresett adatbázis körülbelül 173.000 fehérjét tartalmaz, és a Swiss, PÍR adatbázisok kombinációja, a levezetett fehérje szekvenciákkal együtt (Verziószám: 87). Nem találtunk jelentős hornolőgiákat az (a)-(h) és (1) antigének annnösav szekvenciáihoz.
Az (i) antigén aminosav szekvexteiájárol megállapítottuk, hogy homológ egy M tepree szekvenciával A teljes hosszúságú M fepme szekvenciát genomi eredetű DNS-tói ampít'Skáítuk, a OENBANK-bóí kapott szekvencia segítségével. A továbbiakba® ezt a szekvenciái: alkalmaztuk az alábbi 2. példában leirt módon, hogy a M móívenforb klóatárat szteneljnk, és így a M. /uővfcu/osA-ltoutoléíg egy teljes hosszúságú másolatát kaptuk (99. azonosítási szám szerinti szekvencia).
A (j) antigén aminosav szekvenciáéról megállapítottuk, hogy homológ· egy ismert, ÖNS-szekveneiáfeói íe•vezeteti M. iubercufasis fehérjével. A íelfelálőfc legjobb tudomása szerint, erről a iéhérjérői korábban nem mutatták ki, hogy rendelkezne T-sejt stimuláló aktivitással,. A ik) antigén aminosav szekvenciájáról megállapítottuk, hogy rokonságot mutat egy M szekvenciá val.
Három PPD-pozitív donorral hajtottuk végre & fentiekben leírt protiferáeiős és IFN-y termeléses vizsgálati eljárásokat, és a fentiek szerinti reprezentatív antigénekkel kapott eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.
1. táblázati PBMC-prolitéráciös és IFN-y vizsgálati eljárások: eredményei.
| szekvencia | proliteráciő | IFN-γ termelés |
| (a) | b | - |
| (c) | •ts··;· | |
| (d) | •t-t | |
| (g) | A. .1.4. | s-H |
| <h) | ·> ··!··< | -h-r-r |
Az 1. táblázatban azokat a válaszokat, amelyek 2 és 4 közötti sfintnlációs indexet (SÍI adtak (azokkal a sejtekkel ősszebastmlítva, amelyek tenyésztése csak táptalajban történt) (t) jellét osztályoztuk, azokat ahol az Sl értéke 4-8 közöd va®, illetve 2-4 kőzet! van 1 pg vagy annál kisebb koncentráció esetén, t -κj jellel osztályoztuk, és a 8-nál nagyobb Sí érték esetében tsz oszrálybasoroiás (-t-t-t). Az (i) szekvenciának megfelelő ttntigénröl megállapítottuk, hogy az egyik donor esetében az Sl magas l-w+) és alacsonyabb Sí osztályozást matat (t t és ij a másik két donor esetében, ntind a prolsferácsós és az IFN-γ tersneléses vizsgálati eljárás esetében. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy ezek az antigének képesek proliferáctóí és/vagy interíéron-y termelés t indukálni.
.BefegbőLs2^^ő.;szé^<Mtefc^feJ£..Ű?teWö^^géoekigfiU^Ó
Ez a példa antigének izolálását mutatja be M mberculssís Ixzáíuxaból, M. tifóercyfesfe-feriózdti személyekből nyert szérum segítségével történő szkrinelessel.
-22Szárított Μ íaeőereöAms H37Rs törzset (Difco Laboratories) adtunk 2 %-os NP4Ö oldathoz, és váltakozva báróra ízben homegestizálíak ős szottikálmk. A kapott szuszpenzíót 13.000 ferd/pere sebességgel centrifugáltuk mikröcentrííuga osSvekben, és a felüfezöl 0,2 mikron pórusrnérető fecskendöszőrön álnyomíuk.. A szúrtetet MacroPrep DEAE gyöngyökhöz (BioRad,. Hercules, Kablbmia) kötöttük. A gyöngyöket 20 ®M Trisz pH 7,5 pnftértó alaposan mostuk, és a megkötött fehérjét 1 M Naö-tlal elváltuk. Az 1 M NaCl-os eluátumof éjszakán át dialrzáltnk. KI tnM 'írisz, pH 7,5 paííerrel szemben. A díallzált oldatot ö,05 mg/ml koaoentráoíójá DN-azzai es RN-ázzal kezeltük szobahőmérsékleten, 30 percig, majd ezt követően 0,5 egység/mg a-D-masmozrőázzal kezeltük (pH 4,5) 3-4 órás keresztül szobahőmérsékleten. Mintán a pH-t ismét 7,5-re állítottuk, az anyagot hPLC segitségével frakcionáituk BioSoale-Q-29 oszlopon keresztül (BíoSad). A íxakciókat kilenc csoportban összeöti!»ttük,Centriprep-10 segítségéve) (Ámieon, Beverley, MA) koncentráltuk, és ezt kővetően· Western-blot segítségével szerolőgiai aktivitásra szkriaeltiik M íKrierotífosri-ferrőzött egyénekből származó egyesített szérumot alkalmazva, amely a találmány szerinti egyéb antigénekkel szemben immunteaktivitást nem mutatott.
A legnagyobb rmmtmrerikriviíást mutató frakciót SDS-PAGE-gélea futtattuk, és PVDF-re átvittük. Egy körülbelül SS kD tnolektsbtomegű sávot vágtunk kk amelyből az: alábbi szekvenciát kaptuk: rins Xaa- -Tyr-lle-Alá·fy'r-Xaa-l Irr- l'br-Ala-Gly~lié-Vai-Ero-<jly-l..ys-íle-Asi3-X?ai-Hís~í..eu- Val, (137. azonosítási szám szerinti szekvencia):
ahol Xaa tetszés szerint választható aminosav leltet.
Ezt a szekvenciát a génlwácban található szekvenciákkal a fentiek szerint összehasonlítva nem találtunk jelentős hemolőgiát sz ismeri szekvenciákkal,
5. péáfe
Ez a példa A/. tttötuvííriívA antigéneket kódoló DNS-szek véne iák előállítását mutatja be, amely során áh raóeo??ífo.só-feítözötí egyénekből származó szérummal, vagy szoiúbihs M (ubercidosis antigének ellen termelt antíszéruraraal M mberaifosis' expressziós klóstáraí szkrirselűnk.
(A) M. .mborontosir szolébílis antigének előállítása nyúl antlszénsra alkalmazásával
Genomi eredetű DNS-t izoláltunk a éh mbemífosA H37Ra törzsből. A DNS-t rartdom «tódon összevágtuk, és a Eambda ZAE expressziós rendszer (Stratagene, La jolfe, CA) alkalmazásával egy expressziós kióntárat szerkesztettünk. Nyúl autiszéruraoi terme tatunk a 34 tuberculesis H37Ra, H3?Rv és Brémán törzsek szekretált fehétjéi ellen úgy, hogy egy ttyulaí a M m&ramfesA tenyészetek kcmcertttáh felülúszójával Immonlzálrtralí, Közelebbről, anyulat először szubkután immunizáltuk 200 pgíéhéije antigénnel 2 ml teljes térfogatban, amely tartalmazott még 10 pg mutsmil-dípepítáet (Calfcioehem, ka íölla, CA) és 1 ml nem-telíes Freund-féle adjuvánst. Négy héttel később a nyúlnak szubkután gyorsító injekciót adtunk, amely 100 pg antigént tartalmazott nem-teljes Ereund-íéle sidirtvánsbars. Végül négy héttel később a nynlat intravénását) immunizáltuk 5Ö ug fehérje attrigénuel. Az expressziós klőtstár sskrínelésére az autiszénasot a Saxubroofc által megadott módon alkalmaztuk s'Sambrook. és mtsai.: Moleoular Ciotting: A Eaboratory Mauuai, Coki Sprittg Karbor Laboratories, Cold Sprittg Harbor, NY, (1989)). ftrammreakiiv antigéneket expresszáló bakteriofág tarfoltokat tisztítottuk. A tarlóitokból fágntiáot rnentottütik és a 34 /trámzííovó-kióttok nakieotid szekvenciáit levezettük.
Harminckét klánt tisztítottunk. Értek közül 25 tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyeket korábbal! xtero azonosítottak hmnán áh. móezmrfesóí-ből. Rekonrhlnáns antigéneket expresszáltunk és tisztított antigéneket <♦ 9* «
X *
-23alkalmaztunk az 1. példában festek széria; végrehajtói; immanolőgiat analízis sorára A fehérjéket ÍPTG segítségével indukáltuk és gél-elúcíóvsl tisztítottuk Skeiky módszere szerint [Skeiky és mtsai.; 3. Exp. Med. 181. 152? {I995)'.j. Az ebben a szkríttbea azonosított DNS-moíeknlák reprezentatív szekvenciáit az 1-25. azonosítást szám szerinti szekvenciákban matatjuk be. Az ezeknek megfelelő levezetett: aminosav szekvenciákat' a 63-87. azonosítási szám szerinti szekvenciákban mutálják be..
Ezeket a szekvenciákat, a génfeankbói, a fentebb részletezet, adatbázisokat alkalmazva, ismert szekvenciákkal összehasonlítottak. és azt találtak, hogy a továbbiakban IhRAzA, TbRAló, TbRA18 és TbRA29 elnevezéssel említett klóitok {?ő, 68, 7ö, 75, azonosítási szám szerinti szekvenciák) némi homoíógiát mutatnak korábban Mveoénemriot» Ze^me-ba» azonosított szekvenciákkal, de nem mutatnak' homológját M «t<óem«Ws-ban. A ThRAlI, TbRA26, TbEA28 és IbDP'EP kiónokat (65, 73, 74. és 53. azonosítási szám szerinti szekvenciák) korábban azonosították már M Wíerodms-ban. Nem találtunk jelentős homológiákat á ThRAl, ThRA3, T6RA4, TbRA9. TbRAlO, TbRAIS, TbRAS7, EbRAIö, TbRA29, TbRA32, ThRA36 és az átfedő két klón, Tb&A35 és TbR.Á!2 esetében (65, 77, 81, 82, 64, 67, 69, 71,75, 78, 5ö, 79, 66. .azonosítási szám szerinti szekvenciák). A TbRa24 klón átfedésben van a ThRa29 klőnnré.
A reprezentatív rekotubináns antigénekkel megvalósítok PBMC proliferációs és lnteríérons-γ termeíéses vizsgálati eljárások eredményei, és a számos különböző A£ í«őere««»í5-tmmunttes'rél rendelkező páciensből ssátnsazö T-sejt preparátumot .alkalmazó vizsgálatok eredményeit sorrendben megfeleltetve a 2. táblázatban és a 3. táblázatban mmatjuk be.
24*
2, úblsM ?BMC',prffetóó eretóvd rtjprezenUis v szobibibs ffigéwte
| ffitié | B«§ | ||||||||||||
| I | ) Λ» | } | i 4 | 5 | K | 7 | 8 | 9 | lö | lí | 12 ........................ | ||
| Bal | - | i | i B | - | t | : t | * | t | i | - | |||
| Ba3 | • | í | tt | - | i | • | * | i B | 4; | * | A | ||
| Itta? | av | ÖV | Ή | B | av | ÖV | ÖV | KV | KV | av | KV | ||
| Ib | - | Á | : í | i | KV | í | - | V | t | t | • | ||
| 'Mali | i | í | ·: | B- | t+ | t | KV | B | •B | B | ...........í......... | ÖV | |
| »Í2 | * | A | V | B | t | t | t | V | - | ||||
| Maié | KV | »v | ÖV | KV | ' | t | ÖV | KV | KV | ÖV | ÖV | rv | ÖV ....................... |
| Mali | KV | KV | KV | ÖV | - | - | KV | KV | KV | KV | KV | KV | KV |
| W6 | t | KV | ÖV | • | - | KV | ÖV | KV | KV | nv | ......................... KV | ÖV | |
| wi | KV | av | av | ÖV | * | * | KV | ÖV | KV | KV | av | KV | KV |
| W5 | 'tr | «V | tt | B | B | tt | KV | B- | tt | tt | B | .lí. | KV |
| MaS | KV | KV | KV | KV | » | KV | KV’ | KV | ÖV | KV | KV | ÖV | |
| MaC | KV | ÖV | KV | av | - | KV | KV | kv | ÖV | ÖV | KV | ÖV | |
| w | KV | KV | KV | «V | KV | KV | KV | KV | KV | KV | KV | ||
| AAMK | - | * | i. | - | * | - | av | - | * | av | í | KV | |
| π | - | * | - | · | KV | - | » | * | KV | T | ÖV | ||
| iW | V | tt | * | * | KV | B | i | t | t | ÖV | |||
| KontKiíi | · | _ | - | - | * | • | - | « | - | .......................... |
x 4 m»x * X « » < x
XX * ♦ ♦ X
-251 Éfat PffitC Λ
| antigén | Beteg | ||||||||||||
| í | *. | 3 | 4 | 5 | A | K | § | <! | 10 | 11 | 12 | D | |
| Bal | : 7 | μ | 444 | 7 | - | 7 | - | 7 | ::: | ||||
| Bú | í | VT | - | 7 | - | TT | 4 | - | ......................... | * | |||
| W | :· | av | KV | 44 | KV | KV | KV | KV | av | KV | KV | ||
| Bit! | T | 7 | + | A .Ás | ΐ | 7 | KV | .f | i 7 | ··· | ,A. | - | |
| »li | + | 7 | 77 | 44 | 7 | KV | - | TT | 44 | 77 | •7 | KV | |
| »12 | · | - | 7 | 7 | t | 44.4 | 7 | í | í | - | 7 | - | |
| »K | KV | KV | av | KV | 7 | + | KV | av | KV | KV | av | KV | KV |
| »24 | av | KV | .av | KV | 7 | KV | av | 15 | av | av | KV | KV | |
| »26 | f7 | av | KV | 7 | 4 | KV | ......................... KV | ........................ KV | av | :av | KV | KV | |
| ftfeS | av | av | av | KV | : | KV | KV | KV | KV | KV | KV | KV | |
| w | 77 | av | Ή | H | 777 | '777 | KV | 44 | 44 | 7f7 | 'TTT | 44 | KV |
| IBS | av | κν | KV | KV | 44 | 7 | KV | av | KV | av | KV | KV | KV |
| TbRaC | av | κν | KV | KV | T | .7 | KV | av | KV | KV | KV | KV | KV |
| w | av | KV | av | av | 4 | 4. | av | KV | KV | av | av | KV | KV |
| AM | « | :a | - | - | KV | - | KV | 7 | KIK | ||||
| W | · | ·· | - | KV | > | - | KV | 7 | KV | ||||
| I® | T | 7' | 7 | +44 | .7· | - | KV | TTT | 7 ... | 4 | i | i | !5 |
| Konír<ill | - | '· | - | « | - | - | - | - |
KV ' KÖK vuígúil
♦. X *«tx »
X X 4 X 4 4 4 4
X X
XXX 4 X »
xxx * X X 4 4 » 44 »
♦ *
-26Α 2. és 3., táblázatokban azokat a válaszokat, amelyek 1,2 és 2 közötti stimuláció» indexet (Sí) adtak í azokkal a sejtekkel összehasonlítva, amelyek tenyésztése csak táptalajban történt) (±) jellel osztályoztuk, azokat ahol: az Sí érteke 2 -4 között van (4) jellel osztályoztok, azokat ahol az SÍ értéke 4-8 között van, illetve 2-4 között van 1 pg vagy annál kisebb tencentiáció esetén, (+·;-.) jellel osztályoztok, és a 8-nál nagyobb Sí érték esetében az osztályhasoroíás (t-e-e). Továbbá, a hozzátartozó ábrán mutatjuk be a fentiek közöl kél antigén esetében a koncentráció hatását a prollferáelóra és az laterférort-y termelésre. Mind a psroliferáoió és az imerferon-y termelés-esetében a TbRa3 osztályozása (4-t·) es a TbRa9 osztályozása (·<·).
Az eredmények azt mutalják, hogy ezek a szolólnlís antigének képesek proliferáoíót és/vagy interferen-y termelést indukálni Af. /«/jertinkfiás-ittmiumtássai rendelkező egyénnél származó· T-sejtekben.
(8) Betegből származó szétum alkalmazása M toberctefoste antigéneket kódoló DNS-szekvenciák azonosítására.
A fent leírt genomi eredetű DNS-klómáraí és egy további HS'/Rv-klóntárat szkrinoliünk aktív tuberkulózisban szenvedő betegekből származó egyesített szérumot alkalmazva. A H3?Rv-klóntár elkészítéséhez M íijöerealosó· H3?Rv törzsből származó genomi eredetű DNS-f izoláltunk, részlegesen emésztettük feíGA-va! és a Lambda ZAP expressziós rendszert alkalmazva (Stratagene, La .tolla, CA) expressziós kióntáxat szerkesztettünk. Három különböző egyesített szérumot alkalmaztunk az expressziós szkrinelésre, mindegyik egyesített szérum bárom, aktív pulmooárts vagy pleurális betegségben szenvedő egyénből származó szérumot tartalmazott, Az' egyesített szérumokat TbL, TbM és Tbíl jelöléssel láttok el, ami aH378a-íizátummal szemben mutatott relatív reaktivitásukat jelzi (azaz: TbL -- alacsony reaktivitás, TbM ~ közepes reaktivitás és TbH ~ magas reaktivitás),. mind EIJSA~ban, mind ímmnnhiot tb-mótuniban. Úgyszintén felhasználtunk egy negyedik, aktív tüdötuberkuíózisbap szenvedő bét betegből származó egyesített szérumot ís. Mindegy ik szérum: esetében hiányzott a rekombináns, 38 kDM mbezcu/osík H3?Ra Ibszfái-kötö fehérjével szembeni megnövekedőit reaktivitás.
Mindegyik egyesített szérumot eíö-adszorbeáltuk £. eo/r lizáttxmmal ós Sanibrook eljárása szerint: {Samhrook és mtsai.: Moiecular Cloaing: Á Laboratory Manna!, Cold Spring·Harbor Laborasorics, Cold Spring Harbor, NY, (1589)) a H37Ra és H37Rv expressziós klőrtlámk szkrínelésére alkaltaaztök. Immtmreaktiv antigéneket expresszáió bakteriofág tartóitokat tisztítottuk. A tarlóitokból fágmidot mentettünk és a 37, í«óere«/ósík-kíÓRofc nukieetid szekvenciáit levezettük.
Harminckét klóm tisztítottnak. Ezek közül 3! tartalmaz olyan szekvenciákat, amelyeket korábban sem azonosítottak, humán Af. ívöeroulosüí-böl. Az azonosított ÖNS-molekalák reprezentatív szekvenciáit a 26-51. és a 1.ÖS,. azonosítási szám szerinti szekvenciákban mutatjuk be. Ezek közül a TbM-8 és aTbH-8-2 (105. azonosítási szásn szerinti szekvencia) ugyanabból a kiónból származó nem-összeföggó DNS-szekvencia, és a TbH-4 s43. azonosítási szánj szerinti szekvencia) és a TbH-4-TWD (44. azonosítási, szám szerinti szekvencia.! nemösszefüggő szekvenciák azonos klónbói. A továbbiakban Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9 és TbH-12 elnevezéssel említett antigének amínosav szekvenciáit a. 88-92, azonosítási szásn szerinti szekvenciákban mutatjuk be. Ezeket a szekvenciákat a génbankbóí a fentebb részletezett adaíbázisokat alkalmazva ismert szekvenciákkal összehasonlítottuk, és jelentős homológját m találtunk a TbH-4, TbH-8, Thli-9 és TbM-3 kiónokhoz, bár gyenge homológiát találtunk a TbH-9 klánhoz. A TbH-12 esetében megáliapííoímk. hogy homológ egy 34 kD nagyságú antigén-jellegű fehérjével, amelyet korábban a M poroínóíuen/osö· (Katalógusszám: S28515) tömból azonosítottak. A Tb38~l esetében megállapítottuk, hogy a korábban a 37. óovA-ban (Katalógusszám: 1.134848)
- 27 és s M mőmsaZosiv-ban [Sorensen és mtsai.: fofee. Immun.. 63 1710 (1995)) azonosított ES'AT-6 antigén nyílt leolvasási fázishoz viszonyítva 34 bástspárral az 5 '-Irányban helyezkedik el.
A Tb3S-i-ből és- TbH-9-ből szánnazó próbákat ~ mindkettőt H3?Ka kióstárból izoiáitnk - alkalmaztak, hogy kiónokat azonosítsank B37R.V kiöntárbaa. A Tb38-Í hlbridizált a következőkkel: Tb.38-1E2, Th38-1E3, Tb38-tF5 ás Tb38-1.66, (112, 113, 116, 118. és 119. azonosítási szám szerinti szekvenciák). A 112. és 113. azonosítási szám .szerinti szekvenciák a Tb38-i F2 klónkét származó, noar-ősszéfögg-ő szek venciák. A Tb38-1F2 esetében tó nyílt leolvasási fázist vezettünk le; az egyik megfelel a Tb3?Fk-nek (114. azonosítási szám szerinti szekvencia), a második. egv rész-szekvencia, a 1638-1 .homológja Sehet és a Tb38-.fN elnevezést kapta (115. azonosítási szám szerinti szekvencia). A '11)38-163 levezetett .aminosav szekvenciáját a 117. azonosítási szára szerinti szekvencia mutatja be. Egy TbH-9 próba bárom klóm azonosított a H37Rv idomárban: ThH-9-FL (löó, azonosítási szám szerinti szekvencia), amely a TbH-9 (R3?Ra) homológja .lehet; Tbri-9-1 t 108, azonosítási szám szerinti szekvencia); és TbH-9-4 (1 Ki. azonosítási szára szerinti szekvencia), amelyek, mindegyike a 'fiái9 szekvenciával nagymértékben rokon szekvencia. Ennek a három «iónnak a levezeted aminosav szekvenciáit a 107, 109. és ill. azonosítási szám szerinti szekvenciák mutatják be.
A Tb38-1, ESzAT-6 és más -reprezentatív rekombináns antigénekkel végrehajtott T-sejt vizsgálati eljárások eredményeit - sorrendben megfeleltetve - a 4a. 4b. és 5. táblázatokban foglaljuk össze alább;
4a. táblázat. PBMC-prolíferáció eredményei reprezentatív antigénekre.
| antigén | donor | ||||||||||
| 1 | '4 X. | 3 | 4 | .5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 1 | 1 | |
| 0 | í | ||||||||||
| Tb38.1 | V | + | - | - | 4: | + | 4; | ||||
| -ri | •ri | -Η- | |||||||||
| FSAT-6 | ·«· | 4' | :· | 4 | 4- | -ri | •4 | -t- | 4' | ||
| ri- | -5-i- | ||||||||||
| rbl-1-9 | 3' | 4- | - | r | ± | -£ | -4 | •4 | 4- | ri | |
| 4 | ί | -4 | +- | 4‘ | 4- | 4 | -ri |
4b, táblázás. PBMC interfaon-y termelés eredményei reprezentatív amigénekre.
| iishigéii | donor | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | á | γ | 8 | 9 | 1 e | 1 1 | |
| Tb38.1. | -r : 4-4- | ................ 4 | -r | -4 | 4 4-4- | 4- 4- | -ri 4 4* | -·»ΐ· | |||
| ESAT-6 | -·· | 4' | 4 | ·; | 4' | -i- | '4 | 4- -44- | -ri : 4.4. | ||
| Tbíl-9 | 4- 4· | 4- | 4 4-·;- | i | ± | 4- i | + | 4- 4' | 4 4-4' | (ri i -4 |
φ φ · 28 5. táblázat. T-sejt válaszok összefoglalása reprezentatív antigénekkel szembe».
| antigén | proliféráció | inierferon-y | össze- sen | |||||
| be- feg-4 | be- teg-5 | beteg- ő | beteg- j 4 | 5 | beteg- | beteg- 6 | ||
| Tbi.19 | -44' | 4-4- | S-i. | 4..:...1. | 44 | 4-4 | 13 | |
| TbM? | - | ............-;· | - | ........... 44........ | 4- | - | 4 | |
| Tbffo | - | -H | 4- ............................ | •Í-+ | 44 | 8 | ||
| Tbi.,23 | - | 4 | 4-4· | v+. | -4 | 7,5 | ||
| Tblfo | - | 4-4- | -;-r | ± | 7 | |||
| neg. konboll | 0 |
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy mind a találmány szerinti M mfoven/nds antigének és ES.AT-6 képesek prallieráclóí és/vagy interferon-γ termelést indukálni egy M móteeufovA-immanitással rendelkező egyénből származó T-seitekben. A feltalálók legjobb tudomása szerint az ESAT-6 fehérjéről -korábban nem volt ismeri, hogy barnán nmmmválaszt képes stimulálni.
A Tb3'84 antigén aminosav szekvenciáját lefedő, hat átfedd pepidből álló csoportot hoztunk létre a 4, példában leírt eljárás szerint. Ezeknek a peptideknek a szekvenciáit ··· a továbbiakban pép 1-6 elnevezéssel etnlitjük - sorrendben megféleltetve, a 93-98. azonosítási szánt szerinti szekvenciák matatják be. Az ezen peptidek alkalmazásával kapott T-sejt vizsgálati eljárások eredményeit a 6. és 7, táblázatokban foglaljuk össze. Ezek: az eredmények megerősítik a Tb38-1 szekvencián belüli T-sejt epitőpok létezését és segítséget nyújtanak a lokalizálásukban; ezek :zz epitőpok képesek, proiííeráeiéi és mterférors-γ termelést indukálni áí. í«áerc»/<ms~ irttmumtással rendelkező egyénből származó T-sejtekben,
6, PMoproBfeidö erdrayei IW»I pepíiMre,
| i« | Beteg | ||||||||||||
| 1 | ’’J X, | 5 | Ί | 5 | 6 | / | $ | 9 | w | 11 | 12 | B | |
| Ρφί | * | - | í | * | * | - | í | ......................... | |||||
| '· | - | - | » | * | 4- | Σ | * | 4 | |||||
| * | - | * | • | - | ' i. | * | -- | 4 | |||||
| P«H | 44 | ’ | - | - | * | · | t | t | Ϊ' | ||||
| ΡΦ$ | 44 | έ | - | · | 4 | - | i | • | 4 | ||||
| Rl!> | - | 4-4 i | ‘ | ·· | » | i | * | i | * | • | 4 | ||
| So®i | * | '* | * | * | - | - |
* 4 » « ♦ ♦ » ♦ ♦ » «♦» » * «
*♦» ♦ * x ♦ « » «» ?BBC ög«3-vradesiU‘áaéii®
| Beseg | |||||||||||||
| í | 7 * | A | 4 | 5 | 7 | 3 | Ü | K | y | Í2 | ö | ||
| »1 | t | - | £ | - | * | ' | * | £ | * | * | * | ||
| · | • | · | f Á. | £ | |||||||||
| ¢¢3 | • | * | * | - | - | £ | * | * | f | ||||
| ?ep4 | j ff | • | « | * | ι | £ | £ | * | - | ||||
| sepj | ff' | i | - | - | * | - | - | £ | - | 4 | |||
| pépé | f | - | £ | f A« | * | Y | |||||||
| faíroH | - | ·' | '· | ·· | * |
» ♦ ***«» ♦
* « * ♦ * * < » * » m
< K t ♦ K« » .<’ t ♦ * il
4. pé/íííí
M tubercufoxis polípeptldet izoláltunk üiberkubn-ílsztitott fehérje származékból (PPD) az alábbiak szerint.
A PPD-t a leközöli eljárás segítségévei áíltteltuk elő néhány módosítással [Seibert és másai.; Tuberculíts Purified Protein Deriv&rive. Ereparattoa ttod .Annlyses of a Lsrga Qaaníitv for Standard. The American Review of Tubere tilosig 44 9 (I$4 í)|.
M íatezufosfr Rv törzsei tenyésztettünk é hétig szintetikus táptalajon görgő palackokban 37 <:C-en. A baktérium tenyészetet tartalmazó palackokat ezután 100 T--m melegítettük vízgőzben 3 órán kérésztől. A tenyészeteket sterilre szűrtük 0,22 mikron pónasmétetü szőrön és a fhlyadékfcifr huszadrészére koncentráltuk 3 kD molekulatönseg-vágásá membrán alkalmazásával. A fehérjéket -egyszer 50 %-os snnnóoüun-szalíáS: oldattal precipháituk és íjvoIűszoj- 25 %-os ammómum-sztdtát oldattal precipiíáhuk, A kapott fehérjéket .(PPO> fordítottílizisú folyadék-krotnatográfe f'RP-HPLC) segítségévei, frskcionáltuk, 7,8 x :5ÖO mos méretű Ci 8- oszlopot alkalmazva (Wuters, Miliőid, MA) Biocad HPLC rendszeren {Persepdve Biosystems, Framinghara, MA). Az oszlopról a frakciókat 0-100 % pallér (0,1 % TFA acctotnirilheü) lineáris gradiensével előéltük. Az áramlási sebesség 1b ml/perc volt és az elnenst 214 am-en és 280 am-ea monltoroztuk.
Hat frakciót gyűjtöttünk, heszáritoítuk, PBS-hen felszaszpendáímk és egyenként megvizsgáltuk M möívewfesA-fetiözöd teogerimalaeokoa késlelteteti típusú hiperszemsiíivrtás (DTH) reakció- indukáiására. Egy frakciót találtunk, amely erős OTH-reakcióí indukált és a frakciói ezt követően tovább frakefonáltnk RP-HPLC segítségévek microbore Vydae CB oszlopon (katalógus szánta: 218TP5115} egy Perkúr-Ehrter/Appned .Biosystems- Division gyártotta Model 172 HPLC készüléken. A frakciókat 5-100 % paffét (0,05 % TFA acetcmifrilbea) lineáris gradiensével, 80 μί/perc áramlási sebességgel elaáltuk. Az eluáfomot 215 unt-en mo-nho·· roztak. Nyolc frakciót gyűjtöttünk és PTH-máakálásra vizsgáltuk M mberca/osís-fettőzőtt tengerim&laeökbaa. Egy frakciót találtunk, amelyik erős OTH-válam Indukált, körülbelül 16 mm átmérőjű megkeményedéssei. A többi frakció a® indukált kimutatható DTH-t. A pozitív frakciót SDS-PAGE gélelekírofortósnek vetettük alá és teit találtuk, hogy egyetlen, körülbelül 12 k£> molekulatömegő fehérjesávot tartalmaz.
Ezt a polipeptiáet, amelyet a tövábbkíkbari DPPD elnevezéssel említünk, az amtao-termínáiísréi kiindulva szekvenálttik, Perkin-Bmer/Applied Bfosystents Dtvtsios gyártotta Procise 492 fehérje szekvenátor segítségével a fentiek szerint, és azt találtak, hogy a 129. azonosítási szám szerinti szekvenciában bemaiatott Nternanális szekvenciával rendelkezik. Ezt a szekvenciát a génbankban található ismert szekvenciákkal a fentiek szerint összebasonlitoRak és neta találtunk. ismert homoiögiát. Négy cianogén-brondd DPFD-fragmenst izoláltunk, és azt találtok, hogy ezek a 130-133. azonosítást szám szerimi szekvenciákban bemutatott szekvenciákkal rendelkeznek.
A DPPD-antigénnek azt ts képességét, hogy a humán PBMC-t proliferációra és iníerferon-y termelésre stimulálja, az I, példában leírtak szerint megvizsgáltuk. Ahogy ezt a 8. táblázatban Összefoglaljuk, a DPPD-ről megállapítottuk, hogy proliferáetót stimulál és nagytnennyiségű IFN-γ termelését váltja ki, többet, mint amennyit a kereskedelemben kapható FPD kivált.
8. táblázat. Proljferáelős és isterieton-y termeléses vjzsgálad eredtnények DRFD-re.
| P'BMC-deaor | stimnlátor | pmlsferáciö (cpm) | IFN-γ (ODíjo) |
| A | táptalaj | 1.089 | 0.17 |
| PPD (kereskedelmi) | 8.394 | 1,29 | |
| DPPD | 13.451 | 2.21 | |
| B | táptalaj | 450 | 9.99 |
| PPD (kereskedelmi) | 3.929 | 1,26 | |
| DPPD | 6.184 | 1,49 | |
| C | táptalaj | 541 | o,n |
| PPD (kereskedelmi) | 8907 | 0,76 | |
| DPPD | 23.024 | >2,70 |
5. példa
BÖÍSÍ
Poilpeptidek előállíthatok egy Mliltpore 9059 peptid-szlutetizátor segítségével FMOC-kémiát alkalmazva FlP'fU -(0-Ι>€ηζοιΠ8ζοΙ-Ν,Ν,Ν\Ν’’ίοΐΓ8η5θίίΙ-«Γόηίη}ϊί bexalluoro-foazf'át) akíiváiással. Egy öiy-Cys-Giy szekvenciát kapcsolhatunk a pepiid mmno-ferrnínálfsára, hogy .lehetőséget biztosítsunk a pepiid konjugálására vagy jelölésére. A sziláit! hordozóról a peptidek íehasítósa a kővetkező hasítási keverék alkalmazásával történhet: triflto'ecetsav-ettóadttioí-tioanizol-víz-fotioí 40:1:2:2:3 arányé elegye, Kétórás hasítás utón a peptidek hideg 'metll-íerc.hutiMtorrel kicsaphatok. A peptid üledéket ezt kővetően 8,1 % ttifiuor-eeetsavat (TEA) tartalmazó vízben feloldhatjuk és lioüiízáljuk, mielőtt C1S oszlopon, fordított lázlsü HPLC alkalmazásával tisztítjuk. 0-dÖ ·% aeetonítrií (0.1 % TFA-t tartalmaz) vízben (0,1 TFA-t tartalmaz) készük gradiensét alkalmazzuk a peptidek eluálására, A tiszta frakciók iiofiíízáiásái kővetően a peptidek elektrospr&y toínegspektrometria és ammasay analízis· segítségévei jeilemezhetóek.
Felhívjak a figyelmet arra, hogy az: előzőekben ismertetett specifikációk, megvalósítást módok és példák csupán a találmány jobb megérthetőségét szolgálják ás· nem korlátozó értelemben kerültek bemutatásra. Számos más, a fentiekkel egyenértékűi módosítás illetve változtatás hajtható végre, és az ilyen módosítások nem térnek el a találmányi gondolattól és a csatolt szabadalmi Igénypontok által meghatározott Igényelt oltalmi körön hetól mar adnak .
Claims (25)
- Sza hadaim; Igénypon tok1, Eolipepiid, amely képes inmniuválaszí kiváltani M t«óarc»&>.«ís elles, és amely tartalmazza, , íi) a 88. azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 88) szerinti antmosav-szekvenclát;(sí) a 88. azonosiíószámú szekvencia (SEC) lí> NO: 88) szerinti aminosav-szekvencía egy kmmmogén részletét; vagy (Ili) .a 88. azonosítószámú szekvencia. (SEQ ID NO: 88) szerinti ammosav-szekvencta olyan tetnanögén variánsát, amely attól csak konzervatív szubsztitúciókban -és/vagy módosításokban különbözik,
- 2. Az 1, igénypont szerinti polipeptid, amely a 88. azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 88) •szerinti ammosav-szskvencíáí tartalmazza,
- 3. A 2. igénypont szerinti polipeptid, melynek szekvenciája megegyezik a 88, azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 88) szerinti ammosav-szakveneiával.
- 4. Az 1, igénypont szerinti polipeptid, amely a 88, .azonosítószámú szekveticta (SEQ ÍD NO: 88) szerinti aminosav-szekvencía egy ánmunogés: részletéi tartalmszza.
- 5. Á 4, igénypont szerinti polipeptid, amely a 94. azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NQ: 94) szerinti rnnatosav-szekvenclát tartalmazza.
- 6. A 4. Igénypont szerinti poUpeptkí, melynek, szekvenciája megegyezik a 88. azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 88) szerinti aminosav-szekvencía egy immunogén részletével
- 7. A ö. igénypont szerinti polipeptid, melynek .szekvenciája- megegyezik a 94. azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 94) szerinti aminosav-szekveneiával.
- 8. Az ?. igénypont szerinti polipeptid, amely a 88. azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO: 88) szerinti ammesav-szekvencia olyan variánsát tartalmazza, amely attól csak konzervatív szubsztitúciókban és/vagy módosításokban különbözik..
- 9. A 8, igénypont szerinti polipeptid, tneiynek szekvenciája megegyezik a 88. azonosítószámú székvescla (SEQ ID NO: 88) szerinti aminosav-szekvencía -egy olyan variánsával, amely attól csak konzervatív szubsztitúciókban és/vagy módosításokban: különbözik.IQ. DNS-mofekülá, amely az 1-9. igénypontok báméiyike szerinti polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmaz.
- 1 1. A 10. igénypont szerinti DNS-moiekula, amely a 4ó. azonosítószámú nukieotídszekvenciát taríainwza,
- 12, A 11, igénypont szerinti DNS-rsolekula, melynek szekvenciája megegyezik a 46.. azonosítószámú nukleotídszekvencíával.
- 13. Expressziós vektor, amely 19-12. igénypontok bármelyike szerimi DNS-molekuiát tartalmaz.
- 14. Gazáasejt,.amely 13. igénypont szerinti expressziós vektorral van transzformálva.
- 15, A 14. igénypont szerinti gazdasejt, amely & következők óllal alkotott csoportból van kiválasztva: £ co/?-, élesztő- és emlőssejtek.ló. Fúziós protein, amely I -9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmaz.
- 17. Gyógyászati készítmény, amely 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és fiziológiailag elfogadható hordozót tartalmaz.* * ♦ * * · *-;♦ fi g
- 18. Gyógyászati készítmény,.amely 50-12. igénypontok bármelyike szerinti GNS-tnoiekulát és fiziológiailag elfogadható hordozót .tartalmaz.
- 19. Gyógyászati készítmény, amely 16. igénypont szerint! fiizíós proteint és fiziológiailag elfogadható hordozói: tartalmaz.29. Vakcina, amely 1-9.. igénypontok bármelyike szerion poiipeptidet -és nem-specifikus immunváiasz-fokozőt tartalmaz.
- 21. Vakcina, amely 10-12, igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekmát és nem-specifikus immuaválasz-fökozóí tartalmaz.
- 22. Vakcina, amely ló, igénypont szerinti fúziós proteint és· nem-specifikus immunválasz-fokozót. tartalmaz.
- 23. A 20-22. igénypontok 'bámtelyike szerinti vakcina, amelyben a nem-specifikus immunválaszfek-oző egy adjuváns..
- 24. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerint! ptóipepild alkalmazása M tuberciifosti fertőzés kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállításéra,
- 25. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti DNS-motekufe. alkalmazása M fuberculosis fertőzés kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítását»,
- 26. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid alkalmazása M íxbereufos-is' fertőzés kimutatására -szolgáló diagnoszrifcuta előállítására.
- 27. Diagnosztikai reagenskészlet, amely tartalmazza a következőket:(a) egy, az 1-9, igénypontok bármelyike -szerinti poiipeptidet; és (b) a polipeptid és egy páciens dermális sejtjeinek érintkezettét .lehetővé tévő eszközöket,
- 28. Eljárás egy, az 1-9. Igénypontok bármelyike szerinti -polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy az eljárás során végrehajtjuk a kővetkező lépéseket:(a) a poiipeptidet kódoló DNS-szekvencrát expressziós vektorba építjük;(b) az expressziős vektorral alkalmas gazdasejtet transzformálunk vagy transzföktáhrnk; és (d a poiipeptidet a gazdasejtixto expresszáitatjuk.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52343695A | 1995-09-01 | 1995-09-01 | |
| US53363495A | 1995-09-22 | 1995-09-22 | |
| US62087496A | 1996-03-22 | 1996-03-22 | |
| US65968396A | 1996-06-05 | 1996-06-05 | |
| US68057496A | 1996-07-12 | 1996-07-12 | |
| PCT/US1996/014674 WO1997009428A2 (en) | 1995-09-01 | 1996-08-30 | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU227778B1 true HU227778B1 (en) | 2012-02-28 |
Family
ID=27541835
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0900047A HU227778B1 (en) | 1995-09-01 | 1996-08-30 | Immogen peptid of m. tuberculosis origin, therapeutic and diagnostic use thereof |
| HU9900902A HU225979B1 (en) | 1995-09-01 | 1996-08-30 | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9900902A HU225979B1 (en) | 1995-09-01 | 1996-08-30 | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (5) | EP0851927B1 (hu) |
| JP (5) | JP4382160B2 (hu) |
| KR (1) | KR100433750B1 (hu) |
| CN (1) | CN1117149C (hu) |
| AT (5) | ATE252640T1 (hu) |
| AU (1) | AU727602B2 (hu) |
| BR (2) | BR9610262B1 (hu) |
| CA (3) | CA2684425A1 (hu) |
| CY (2) | CY2570B1 (hu) |
| CZ (3) | CZ297406B6 (hu) |
| DE (4) | DE69637879D1 (hu) |
| DK (4) | DK1398379T3 (hu) |
| ES (4) | ES2262595T3 (hu) |
| HK (1) | HK1059282A1 (hu) |
| HU (2) | HU227778B1 (hu) |
| IL (1) | IL123506A (hu) |
| MX (1) | MX9801638A (hu) |
| NO (4) | NO324372B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ319377A (hu) |
| PL (1) | PL186774B1 (hu) |
| PT (4) | PT1203817E (hu) |
| SI (1) | SI0851927T1 (hu) |
| TR (5) | TR200403064T2 (hu) |
| WO (1) | WO1997009428A2 (hu) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6991797B2 (en) | 1993-07-02 | 2006-01-31 | Statens Serum Institut | M. tuberculosis antigens |
| US6641814B1 (en) | 1997-04-02 | 2003-11-04 | Statens Serum Institut | Nucleic acids fragments and polypeptide fragments derived from M. tuberculosis |
| US6592877B1 (en) | 1995-09-01 | 2003-07-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6458366B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-10-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| US6290969B1 (en) | 1995-09-01 | 2001-09-18 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| BR9712298A (pt) * | 1996-10-11 | 2000-10-24 | Corixa Corp | Polipeptìdeo, molécula de dna, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira, processo para detectar infecção por m. tuberculosis em uma amostra biológica, kit diagnóstico, anticorpos monoclonal, e, policlonal, e, proteìna de fusão |
| US6544522B1 (en) | 1998-12-30 | 2003-04-08 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| US6627198B2 (en) | 1997-03-13 | 2003-09-30 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| US6350456B1 (en) | 1997-03-13 | 2002-02-26 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection |
| US6982085B2 (en) | 1997-04-02 | 2006-01-03 | Statens Serum Institut | TB diagnostic based on antigens from M. tuberculosis |
| ES2291810T3 (es) * | 1997-04-02 | 2008-03-01 | Statens Serum Institut | Fragmentos de acido nucleico y fragmentos de polpeptidos derivados de m. tuberculosis. |
| US7037510B2 (en) | 1997-04-18 | 2006-05-02 | Statens Serum Institut | Hybrids of M. tuberculosis antigens |
| US6555653B2 (en) * | 1997-05-20 | 2003-04-29 | Corixa Corporation | Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use |
| US6613881B1 (en) * | 1997-05-20 | 2003-09-02 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use |
| WO1999004005A1 (en) * | 1997-07-16 | 1999-01-28 | Institut Pasteur | A polynucleotide functionally coding for the lhp protein from mycobacterium tuberculosis, its biologically active derivative fragments, as well as methods using the same |
| AU750173B2 (en) * | 1997-11-10 | 2002-07-11 | Statens Serum Institut | Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from M. tuberculosis |
| EP1484405A1 (en) * | 1997-11-10 | 2004-12-08 | Statens Serum Institut | Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from M. Tuberculosis |
| TR200002938T2 (tr) * | 1998-04-07 | 2001-02-21 | Corixa Corporation | Mikrobakteri tüberküloz antijenlerinin füzyon proteinleri ve bunların kullanımı |
| GB9808720D0 (en) * | 1998-04-23 | 1998-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| WO2000026248A2 (en) * | 1998-11-04 | 2000-05-11 | Isis Innovation Limited | Tuberculosis diagnostic test |
| US6465633B1 (en) | 1998-12-24 | 2002-10-15 | Corixa Corporation | Compositions and methods of their use in the treatment, prevention and diagnosis of tuberculosis |
| AU2594500A (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-31 | Corixa Corporation | Methods for using mycobacterium tuberculosis molecules as immunological adjuvants |
| EP2087906A1 (en) | 1999-05-04 | 2009-08-12 | The University of Medicine and Dentistry of New Jersey | Proteins expressed by Mycobacterium tuberculosis and not by BCG and their use as diagnostic reagents and vaccines |
| US7009042B1 (en) * | 1999-10-07 | 2006-03-07 | Corixa Corporation | Methods of using a Mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of the heterologous proteins |
| US6316205B1 (en) | 2000-01-28 | 2001-11-13 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Assay devices and methods of analyte detection |
| AU2001241738A1 (en) | 2000-02-25 | 2001-09-03 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis |
| AU6867801A (en) | 2000-06-20 | 2002-01-02 | Corixa Corp | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| WO2003070187A2 (en) | 2002-02-15 | 2003-08-28 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| ITRM20040091A1 (it) | 2004-02-19 | 2004-05-19 | Istituto Naz Per Le Malattie | Test immunologico rapido per la diagnosi ed il monitoraggio dell'infezione tubercolare. |
| FI119445B (fi) * | 2004-10-29 | 2008-11-14 | Waertsilae Finland Oy | Polttomoottorin polttoaineen syöttöjärjestelmän paineen värähtelyn vaimennin |
| WO2006053871A2 (en) | 2004-11-16 | 2006-05-26 | Crucell Holland B.V. | Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors |
| CA2821389C (en) | 2005-04-29 | 2015-11-17 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel method for preventing or treating m tuberculosis infection |
| FR2952058B1 (fr) | 2009-10-29 | 2013-10-04 | Centre Nat Rech Scient | Procede de ligation native de polypeptides |
| MX2012008790A (es) | 2010-01-27 | 2012-08-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Antigenos de tuberculosis modificados. |
| KR20140029376A (ko) | 2010-12-14 | 2014-03-10 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 미코박테리움 항원성 조성물 |
| FR2971509B1 (fr) * | 2011-02-16 | 2013-02-22 | Centre Nat Rech Scient | Procede de preparation de peptides par assemblage de multiples fragments peptidiques |
| CN103290030A (zh) * | 2012-02-23 | 2013-09-11 | 上海交通大学 | 一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用 |
| EP2844282B1 (en) * | 2012-05-04 | 2019-06-12 | Pfizer Inc | Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens |
| BR112016023040A2 (pt) * | 2014-04-04 | 2018-01-16 | Vestaron Corporation | processo para aumentar a atividade ou toxicidade de um peptídeo |
| GB201513176D0 (en) | 2015-07-27 | 2015-09-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel methods for inducing an immune response |
| FR3048286B1 (fr) * | 2016-02-26 | 2021-01-22 | Omunis | Peptides immunogenes et leur utilisation |
| CN107304231B (zh) * | 2016-04-18 | 2021-01-01 | 华中农业大学 | 一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2244539A1 (en) * | 1973-07-13 | 1975-04-18 | Mitsui Pharmaceuticals | Tuberculin active proteins and peptides prepn - from tubercle bacillus |
| FR2265402A1 (en) * | 1974-03-29 | 1975-10-24 | Mitsui Pharmaceuticals | Tuberculin active proteins and peptides prepn - from tubercle bacillus |
| US4876089A (en) * | 1984-09-06 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Feline leukemia virus protein vaccines |
| US4751180A (en) | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
| US4935233A (en) | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
| US5075109A (en) | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
| US4897268A (en) | 1987-08-03 | 1990-01-30 | Southern Research Institute | Drug delivery system and method of making the same |
| FR2677365B1 (fr) * | 1991-06-07 | 1995-08-04 | Pasteur Institut | Proteines de mycobacterium et applications. |
| US5330754A (en) * | 1992-06-29 | 1994-07-19 | Archana Kapoor | Membrane-associated immunogens of mycobacteria |
| DK79793D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | Diagnostic test |
| DK79893D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | New vaccine |
-
1996
- 1996-08-30 DE DE69637879T patent/DE69637879D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 PT PT01126628T patent/PT1203817E/pt unknown
- 1996-08-30 DE DE69630457T patent/DE69630457T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 DE DE69636046T patent/DE69636046T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 ES ES01126628T patent/ES2262595T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 PT PT03005931T patent/PT1347055E/pt unknown
- 1996-08-30 DE DE69636487T patent/DE69636487T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 ES ES03005931T patent/ES2324529T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 JP JP51146497A patent/JP4382160B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 EP EP96933009A patent/EP0851927B1/en not_active Revoked
- 1996-08-30 PL PL96325373A patent/PL186774B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 DK DK03021501T patent/DK1398379T3/da active
- 1996-08-30 TR TR2004/03064T patent/TR200403064T2/xx unknown
- 1996-08-30 ES ES96933009T patent/ES2210392T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 AT AT96933009T patent/ATE252640T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 TR TR2009/01109T patent/TR200901109T1/xx unknown
- 1996-08-30 BR BRPI9610262-4B1A patent/BR9610262B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 PT PT96933009T patent/PT851927E/pt unknown
- 1996-08-30 AT AT03005931T patent/ATE426025T1/de active
- 1996-08-30 KR KR10-1998-0701589A patent/KR100433750B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 DK DK03005931T patent/DK1347055T3/da active
- 1996-08-30 AT AT06112509T patent/ATE513915T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 BR BRPI9612997-2A patent/BR9612997B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 WO PCT/US1996/014674 patent/WO1997009428A2/en active Application Filing
- 1996-08-30 AT AT01126628T patent/ATE323165T1/de active
- 1996-08-30 EP EP01126628A patent/EP1203817B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 MX MX9801638A patent/MX9801638A/es not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 HU HU0900047A patent/HU227778B1/hu unknown
- 1996-08-30 ES ES03021501T patent/ES2271449T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 TR TR2008/06258T patent/TR200806258T2/xx unknown
- 1996-08-30 CA CA002684425A patent/CA2684425A1/en not_active Abandoned
- 1996-08-30 HU HU9900902A patent/HU225979B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 CA CA2653566A patent/CA2653566C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 EP EP03005931A patent/EP1347055B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 DK DK01126628T patent/DK1203817T3/da active
- 1996-08-30 IL IL12350696A patent/IL123506A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 CZ CZ0062898A patent/CZ297406B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 AT AT03021501T patent/ATE337399T1/de active
- 1996-08-30 CZ CZ20090166A patent/CZ300953B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 DK DK96933009T patent/DK0851927T3/da active
- 1996-08-30 SI SI9630644T patent/SI0851927T1/xx unknown
- 1996-08-30 TR TR2008/06259T patent/TR200806259T2/xx unknown
- 1996-08-30 CZ CZ20060387A patent/CZ300688B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 PT PT03021501T patent/PT1398379E/pt unknown
- 1996-08-30 CN CN96197639A patent/CN1117149C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 TR TR1998/00411T patent/TR199800411T1/xx unknown
- 1996-08-30 NZ NZ319377A patent/NZ319377A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 EP EP03021501A patent/EP1398379B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 AU AU71586/96A patent/AU727602B2/en not_active Expired
- 1996-08-30 EP EP06112509A patent/EP1712628B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 CA CA002230885A patent/CA2230885C/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-02-27 NO NO19980883A patent/NO324372B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-03-08 HK HK04101684.5A patent/HK1059282A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-02-10 JP JP2006034592A patent/JP4324596B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-02-10 JP JP2006034593A patent/JP4324597B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2006-12-19 CY CY0600033A patent/CY2570B1/xx unknown
-
2007
- 2007-02-01 NO NO20070618A patent/NO336288B1/no not_active IP Right Cessation
- 2007-02-01 NO NO20070621A patent/NO20070621L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-02-01 NO NO20070619A patent/NO20070619L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-03-23 JP JP2007077972A patent/JP4324618B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-04-08 JP JP2009094008A patent/JP2009159982A/ja not_active Ceased
- 2009-06-05 CY CY0900006A patent/CY2612B2/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU227778B1 (en) | Immogen peptid of m. tuberculosis origin, therapeutic and diagnostic use thereof | |
| JP4227302B2 (ja) | Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の融合タンパク質およびその使用 | |
| US7335369B2 (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
| JP4516616B2 (ja) | Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の融合タンパク質およびその使用 | |
| JP2001501832A (ja) | 結核の免疫治療および診断用の化合物および方法 | |
| JP2002503683A (ja) | 結核の免疫療法および診断のための化合物および方法 | |
| JP2002514084A (ja) | 結核の免疫治療および診断のための化合物およびそれらの使用方法 | |
| WO1997009428A9 (en) | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
| US8143386B2 (en) | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses | |
| US6465633B1 (en) | Compositions and methods of their use in the treatment, prevention and diagnosis of tuberculosis | |
| WO2000039298A1 (en) | Chimeric gene encoding the antigenic determinants of four proteins of l. infantum | |
| US6436898B1 (en) | Compounds for treatment of infectious and immune system disorders and methods for their use | |
| CA2256124C (en) | Chimeric gene formed of the dna sequences that encode the antigenic determinants of four proteins of l. infantum, and protein encoded by said gene, and pharmaceutical composition useful for preventing and/or treating leishmaniosis in animals or humans |