DE69630457T2

DE69630457T2 - Verbindungen zur immunotherapie und diagnose von tuberkulose

Info

Publication number: DE69630457T2
Application number: DE69630457T
Authority: DE
Inventors: G. Steven REED; A. Yasir SKEIKY; C. Davin DILLON; Antonio Campos-Neto; Raymond Houghton; H. Thomas VEDVICK; R. Daniel TWARDZIK
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2004-11-25
Anticipated expiration: 2016-08-31
Also published as: EP1203817A3; DE69636487D1; CY2612B2; PT851927E; JP2006149406A; CA2653566C; ATE513915T1; CZ297406B6; TR200806258T2; DK1347055T3; BR9610262A; CA2653566A1; ATE337399T1; BR9612997B1; EP1203817B1; EP1398379A3; CN1117149C; ES2324529T3; CZ300688B6; EP1203817A2

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen den Nachweis, die Behandlung und die Prävention von Mycobacterium tuberculosis-Infektion. Die Erfindung betrifft insbesondere Polypeptide, die ein Mycobacterium tuberculosis-Antigen oder einen Teil oder andere Variante davon umfassen und die Verwendung von solchen Polypeptiden für die Diagnose und Impfung gegen Mycobacterium tuberculosis-Infektion.
Hintergrund der Erfindung
Tuberkulose ist eine chronische infektiöse Erkrankung die im allgemeinen durch Infektion mit Mycobacterium tuberculosis verursacht wird. Sie ist eine hauptsächliche Erkrankung in Entwicklungsländern sowie ein zunehmendes Problem in entwickelten Bereichen der Welt, mit ungefähr 8 Millionen neuen Fällen und 3 Millionen Toten jedes Jahr. Obwohl die Infektion für eine beträchtliche Zeitdauer asymptomatisch sein kann, manifestiert sich die Erkrankung am häufigsten als eine akute Entzündung der Lungen, die zu Fieber und einen nicht produktiven Husten führt: Falls unbehandelt gelassen, ergeben sich typischerweise ernstzunehmende Komplikationen und Tod.
Obwohl Tuberkulose im allgemeinen unter der Verwendung von verlängerter Antibiotikumtherapie kontrolliert werden kann, ist solch eine Behandlung nicht ausreichend, um die Ausbreitung der Erkrankung zu verhindern. Infizierte Individuen können asymptomatisch, jedoch für einige Zeit ansteckend sein. Zusätzlich, obwohl eine Einhaltung des Behandlungsschemas wichtig ist, ist das Patientenverhalten schwierig zu überwachen. Einige Patienten vervollständigen den Durchlauf der Behandlung nicht, was zu ineffektiver Behandlung und der Entwicklung von Wirkstoffresistenz führen kann.
Eine Verhinderung der Ausbreitung von Tuberkulose erfordert eine effektive Impfung und eine genaue frühe Diagnose der Erkrankung. Im Augenblick ist die Impfung mit lebenden Bakterien das am meisten effiziente Verfahren zur Induktion von protektiver Immunität. Das für diesen Zweck am meisten verbreitet verwendete Mycobacterium ist Bacillus Calmette-Guerin (BCG), ein avirulenter Stamm von Mycobacterium bovis. Jedoch ist die Sicherheit und Effizienz von BCG eine Quelle von Kontroversen und einige Länder, wie zum Beispiel die Vereinigten Staaten, impfen die allgemeine Öffentlichkeit nicht. Die Diagnose wird herkömmlich unter der Verwendung eines Hauttests erreicht, der intradermales Aussetzen gegenüber Tuberculin PPD (Protein-gereinigtes Derivat) einschließt. Antigen-spezifische T-Zell-Antworten führen zur meßbaren Verhärtung an der Injektionsstelle bei 48–72 Stunden nach Injektion, was ein Aussetzen gegenüber mycobakteriellen Antigenen anzeigt. Die Sensitivität und Spezifität waren jedoch mit diesem Test ein Problem, und mit BCG geimpfte Individuen können nicht von infizierten Individuen unterschieden werden.
Während von Makrophagen gezeigt wurde, daß sie als die prinzipiellen Effektoren der M. tuberculosis-Immunität wirken, sind die T-Zellen die hauptsächlichen Induzierer einer solchen Immunität. Die wesentliche Rolle von T-Zellen beim Schutz gegen M. tuberculosis-Infektion wird durch das häufige Auftreten von M. tuberculosis in Aidspatienten aufgrund der Depletion von CD4 T-Zellen deutlich, die mit menschlicher Immundefizienzvirus (HIV)-Infektion assoziiert ist. Mycobacterium-reaktive CD4 T-Zellen wurden als potente Produzenten von Gamma-Interferon (IFN-γ) gezeigt, von dem im Gegenzug gezeigt wurde, daß es die anti-mycobakteriellen Effekte von Makrophagen in Mäusen auslöst. Währen die Rolle von IFN-γ in Menschen weniger klar ist haben Untersuchungen gezeigt, daß 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3, entweder allein oder in Kombination mit IFN-γ oder Tumornekrosefaktor-alpha menschliche Makrophagen aktiviert, um eine M. tuberculosis-Infektion zu inhibieren. Weiterhin ist bekannt, daß IFN-β menschliche Makrophagen stimuliert, um 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 herzustellen. Ähnlich wurde von IL-12 gezeigt, daß es eine Rolle bei der Stimulierung der Resistenz gegenüber M. tuberculosis-Infektion spielt. Für einen Übersichtsartikel der Immunologie von M. tuberculosis-Infektion, siehe Chan und Kaufmann in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press, Washington, DC, 1994.
Demzufolge besteht im Stand der Technik ein Bedarf für verbesserte Impfstoffe und Verfahren zur Verhinderung, der Behandlung und dem Nachweis von Tuberkulose. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und stellt weiterhin andere damit zusammenhängende Vorteile zur Verfügung.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid zur Verfügung gestellt, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die durch eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 4 kodiert wird.
Die Erfindung stellt auch ein DNA-Molekül zur Verfügung, das das Polypeptid der vorliegenden Erfindung einschließt und einen Expressionsvektor, der das DNA-Molekül in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung einschließt. Eine mit dem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformierte Wirtszelle. Ein Fusionsprotein, umfassend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung in Kombination mit TbH9, ESAT-6 oder Ra35. Eine pharmazeutische Zusammensetzung und Impfstoff, das das Polypeptid der vorliegenden Erfindung enthält, ein DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung oder Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung und einen physiologisch akzeptablen Träger.
Es wird auch die Verwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zum Nachweis von Tuberkulose in einem Patienten zur Verfügung gestellt, und ein diagnostischer Kit, umfassend a) das Polypeptid der vorliegenden Erfindung und b) eine Vorrichtung, die ausreichend ist, um das Polypeptid mit den Hautzellen eines Patienten in Kontakt zu bringen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen und der Sequenzidentifikatoren
1A und B zeigen die Stimulierung der Zellteilung und Interferon-γ-Produktion in T-Zellen, die jeweils von einem ersten und einem zweiten M. tuberculosis-Immundonor abgeleitet sind, durch die in Beispiel 1 beschriebenen 14 Kd-, 20 Kd- und 26 Kd-Antigene.
2 zeigt die Stimulierung der Zellteilung und Interferon-γ-Produktion in T-Zellen durch die zwei repräsentativen Polypeptide TbRa3 und RbRa9, die von einem M. tuberculosis-Immunindividuum abgeleitet sind.
SEQ ID NO: 1 ist die DNA-Sequenz von TbRa1.
SEQ ID NO: 2 ist die DNA-Sequenz von TbRa10.
SEQ ID NO: 3 ist die DNA-Sequenz von TbRa11.
SEQ ID NO: 4 ist die DNA-Sequenz von TbRa12.
SEQ ID NO: 5 ist die DNA-Sequenz von TbRa13.
SEQ ID NO: 6 ist die DNA-Sequenz von TbRa16.
SEQ ID NO: 7 ist die DNA-Sequenz von TbRa17.
SEQ ID NO: 8 ist die DNA-Sequenz von TbRa18.
SEQ ID NO: 9 ist die DNA-Sequenz von TbRa19.
SEQ ID NO: 10 ist die DNA-Sequenz von TbRa24.
SEQ ID NO: 11 ist die DNA-Sequenz von TbRa26.
SEQ ID NO: 12 ist die DNA-Sequenz von TbRa28.
SEQ ID NO: 13 ist die DNA-Sequenz von TbRa29.
SEQ ID NO: 14 ist die DNA-Sequenz von TbRa2A.
SEQ ID NO: 15 ist die DNA-Sequenz von TbRa3.
SEQ ID NO: 16 ist die DNA-Sequenz von TbRa32.
SEQ ID NO: 17 ist die DNA-Sequenz von TbRa35.
SEQ ID NO: 18 ist die DNA-Sequenz von TbRa36.
SEQ ID NO: 19 ist die DNA-Sequenz von TbRa4.
SEQ ID NO: 20 ist die DNA-Sequenz von TbRa9.
SEQ ID NO: 21 ist die DNA-Sequenz von TbRaB.
SEQ ID NO: 22 ist die DNA-Sequenz von TbRaC.
SEQ ID NO: 23 ist die DNA-Sequenz von TbRaD.
SEQ ID NO: 24 ist die DNA-Sequenz von YYWCPG.
SEQ ID NO: 25 ist die DNA-Sequenz von AAMK.
SEQ ID NO: 26 ist die DNA-Sequenz von TbL-23.
SEQ ID NO: 27 ist die DNA-Sequenz von TbL-24.
SEQ ID NO: 28 ist die DNA-Sequenz von TbL-25.
SEQ ID NO: 29 ist die DNA-Sequenz von TbL-28.
SEQ ID NO: 30 ist die DNA-Sequenz von TbL-29.
SEQ ID NO: 31 ist die DNA-Sequenz von TbH-5.
SEQ ID NO: 32 ist die DNA-Sequenz von TbH-8.
SEQ ID NO: 33 ist die DNA-Sequenz von TbH-9.
SEQ ID NO: 34 ist die DNA-Sequenz von TbM-1.
SEQ ID NO: 35 ist die DNA-Sequenz von TbM-3.
SEQ ID NO: 36 ist die DNA-Sequenz von TbM-6.
SEQ ID NO: 37 ist die DNA-Sequenz von TbM-7.
SEQ ID NO: 38 ist die DNA-Sequenz von TbM-9.
SEQ ID NO: 39 ist die DNA-Sequenz von TbM-12.
SEQ ID NO: 40 ist die DNA-Sequenz von TbM-13.
SEQ ID NO: 41 ist die DNA-Sequenz von TbM-14.
SEQ ID NO: 42 ist die DNA-Sequenz von TbM-15.
SEQ ID NO: 43 ist die DNA-Sequenz von TbH-4.
SEQ ID NO: 44 ist die DNA-Sequenz von TbH-4-FWD.
SEQ ID NO: 45 ist die DNA-Sequenz von TbH-12.
SEQ ID NO: 46 ist die DNA-Sequenz von Tb38-1.
SEQ ID NO: 47 ist die DNA-Sequenz von Tb38-4.
SEQ ID NO: 48 ist die DNA-Sequenz von TbL-17.
SEQ ID NO: 49 ist die DNA-Sequenz von TbL-20.
SEQ ID NO: 50 ist die DNA-Sequenz von TbL-21.
SEQ ID NO: 51 ist die DNA-Sequenz von TbH-16.
SEQ ID NO: 52 ist die DNA-Sequenz von DPEP.
SEQ ID NO: 53 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von DPEP.
SEQ ID NO: 54 ist die Proteinsequenz von DPV N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 55 ist die Proteinsequenz von AVGS N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 56 ist die Proteinsequenz von AAMK N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 57 ist die Proteinsequenz von YYWC N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 58 ist die Proteinsequenz von DIGS N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 59 ist die Proteinsequenz von AEES N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 60 ist die Proteinsequenz von DPEP N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 61 ist die Proteinsequenz von APKT N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 62 ist die Proteinsequenz von DPAS N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 63 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa1.
SEQ ID NO: 64 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa10.
SEQ ID NO: 65 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa11.
SEQ ID NO: 66 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa12.
SEQ ID NO: 67 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa13.
SEQ ID NO: 68 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa16.
SEQ ID NO: 69 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa17.
SEQ ID NO: 70 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa18.
SEQ ID NO: 71 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa19.
SEQ ID NO: 72 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa24.
SEQ ID NO: 73 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa26.
SEQ ID NO: 74 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa28.
SEQ ID NO: 75 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa29.
SEQ ID NO: 76 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa2A.
SEQ ID NO: 77 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa3.
SEQ ID NO: 78 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa32.
SEQ ID NO: 79 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa35.
SEQ ID NO: 80 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa36.
SEQ ID NO: 81 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa4.
SEQ ID NO: 82 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRa9.
SEQ ID NO: 83 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRaB.
SEQ ID NO: 84 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRaC.
SEQ ID NO: 85 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbRaD.
SEQ ID NO: 86 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von YYWCPG.
SEQ ID NO: 87 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbAAMK.
SEQ ID NO: 88 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von Tb38-1.
SEQ ID NO: 89 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbH-4.
SEQ ID NO: 90 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbH-8.
SEQ ID NO: 91 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbH-9.
SEQ ID NO: 92 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbH-12.
SEQ ID NO: 93 ist die Aminosäuresequenz von Tb38-1 Peptid 1.
SEQ ID NO: 94 ist die Aminosäuresequenz von Tb38-1 Peptid 2.
SEQ ID NO: 95 ist die Aminosäuresequenz von Tb38-1 Peptid 3.
SEQ ID NO: 96 ist die Aminosäuresequenz von Tb38-1 Peptid 4.
SEQ ID NO: 97 ist die Aminosäuresequenz von Tb38-1 Peptid 5.
SEQ ID NO: 98 ist die Aminosäuresequenz von Tb38-1 Peptid 6.
SEQ ID NO: 99 ist die DNA-Sequenz von DPAS.
SEQ ID NO: 100 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von DPAS.
SEQ ID NO: 101 ist die DNA-Sequenz von DPV.
SEQ ID NO: 102 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von DPV.
SEQ ID NO: 103 ist die DNA-Sequenz von ESAT-6.
SEQ ID NO: 104 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von ESAT-6.
SEQ ID NO: 105 ist die DNA-Sequenz von TbH-8-2
SEQ ID NO: 106 ist die DNA-Sequenz von TbH-9FL.
SEQ ID NO: 107 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbH-9FL.
SEQ ID NO: 108 ist die DNA Sequenz von TbH-9-1.
SEQ ID NO: 109 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbH-9-1.
SEQ ID NO: 110 ist die DNA Sequenz von TbH-9-4.
SEQ ID NO: 111 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von TbH-9-4.
SEQ ID NO: 112 ist die DNA Sequenz von Tb38-1F2 IN.
SEQ ID NO: 113 ist die DNA Sequenz von Tb38-2F2 RP.
SEQ ID NO: 114 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von Tb37-FL.
SEQ ID NO: 115 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von Tb38-IN.
SEQ ID NO: 116 ist die DNA Sequenz von Tb38-1F3.
SEQ ID NO: 117 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von Tb38-1F3.
SEQ ID NO: 118 ist die DNA Sequenz von Tb38-1F5.
SEQ ID NO: 119 ist die DNA Sequenz von Tb38-1F6.
SEQ ID NO: 120 ist die abgeleitete N-terminale Aminosäuresequenz von DPV.
SEQ ID NO: 121 ist die abgeleitete N-terminale Aminosäuresequenz von AVGS.
SEQ ID NO: 122 ist die abgeleitete N-terminale Aminosäuresequenz von AAMK.
SEQ ID NO: 123 ist die abgeleitete N-terminale Aminosäuresequenz von YYWC.
SEQ ID NO: 124 ist die abgeleitete N-terminale Aminosäuresequenz von DIGS.
SEQ ID NO: 125 ist die abgeleitete N-terminale Aminosäuresequenz von AEES.
SEQ ID NO: 126 ist die abgeleitete N-terminale Aminosäuresequenz von DPEP.
SEQ ID NO: 127 ist die abgeleitete N-terminale Aminosäuresequenz von APKT
SEQ ID NO: 128 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz von DPAS.
SEQ ID NO: 129 ist die Proteinsequenz von DPPD N-terminalem Antigen.
SEQ ID NO: 130–133 sind die Proteinsequenzen von vier DPPD Cyanogenbromid-Fragmenten.
SEQ ID NO: 134 ist die N-terminale Proteinsequenz von XDS-Antigen.
SEQ ID NO: 135 ist die N-terminale Proteinsequenz von AGD-Antigen.
SEQ ID NO: 136 ist die N-terminale Proteinsequenz von APE-Antigen.
SEQ ID NO: 137 ist die N-terminale Proteinsequenz von XYI-Antigen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Wie oben angegeben, ist die vorliegende Erfindung allgemein auf Zusammensetzungen und zur Verwendung bei der Vorbeugung, Behandlung und Diagnose von Tuberkulose gerichtet.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen ein Polypeptid, wie in Anspruch 1 definiert, ein. Polypeptide innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, immunogene lösliche M. tuberculosis-Antigene. Ein "lösliches M. tuberculosis-Antigen" ist ein Protein von M. tuberculosis-Abstammung, das in M. tuberculosis-Kulturfiltrat vorhanden ist.
"Immunogen", wie hier verwendet, betrifft die Fähigkeit, eine Immunantwort (zum Beispiel zellulär) in einem Patienten, wie zum Beispiel einem Menschen, und/oder in einer biologischen Probe hervorzurufen. Insbesondere sind Antigene, die immunogen sind (und immunogene Teile oder andere Varianten solcher Antigene) in der Lage, die Zellteilung, Interleukin-12-Produktion und/oder Interferon-γ-Produktion in biologischen Proben zu stimulieren, umfassend ein oder mehrere Zellen, ausgewählt aus der Gruppe von T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und Makrophagen, wobei die Zellen von einem M. tuberculosis-immunen Individuum abgeleitet sind. Polypeptide, die mindestens einen immunogenen Teil von einem oder mehreren M. tuberculosis-Antigenen umfassen, können im allgemeinen dazu verwendet werden, um Tuberkulose nachzuweisen oder eine protektive Immunität gegen Tuberkulose in einem Patienten zu induzieren.
In einem verwandten Aspekt werden Kombinationspolypeptide beschrieben. Ein "Kombinationspolypeptid" ist ein Polypeptid, das mindestens einen der oben genannten immunogenen Teile und einen oder mehrere zusätzliche immunogene M. tuberculosis-Sequenzen umfaßt, die über eine Peptidverbindung zu einer einzelnen Aminosäurekette verbunden sind. Die Sequenzen können entweder direkt aneinander gebunden sein (d. h. mit keinen dazwischenliegenden Aminosäuren) oder können mittels einer Linkersequenz (z. B. Gly-Cys-Gly) verbunden werden, die nicht die immunogenen Eigenschaften der Komponenten-Polypeptide signifikant verringert.
Im allgemeinen können M. tuberculosis-Antigene und DNA-Sequenzen, die für solche Antigene kodieren, unter der Verwendung einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können lösliche Antigene aus M. tuberculosis-Kulturfiltrat durch für den Fachmann bekannte Verfahren isoliert werden, einschließlich Anionen-Austausch- und reverse Phase-Chromatographie. Gereinigte Antigene werden dann auf ihre Fähigkeit hin untersucht, eine geeignete Immunantwort (z. B. zellulär) hervorzurufen, unter der Verwendung von, zum Beispiel, der hier beschriebenen repräsentativen Verfahren. Immunogene Antigene können dann unter der Verwendung von Techniken, wie zum Beispiel herkömmlicher Edman-Chemie, teilweise sequenziert werden. Siehe Edman und Berg, Eur. J. Biochem. 80: 116–132, 1967.
Immunogene Antigene können auch rekombinant unter der Verwendung einer DNA-Sequenz hergestellt werden, die für das Antigen kodiert, die in einen Expressionsvektor eingefüllt wurde und in einem geeigneten Wirt exprimiert wird. DNA-Moleküle, die für lösliche Antigene kodieren, können durch Screening einer geeigneten M. tuberculosis-Expressionsbibliothek mit Antiseren (z. B. Kaninchen) isoliert werden, die spezifisch gegen lösliche M. tuberculosis-Antigene erzeugt wurden. DNA-Sequenzen, die für Antigene kodieren, die löslich oder nicht-löslich sein können, können durch Screenen einer geeigneten M. tuberculosis-genomischen oder cDNA-Expressionsbibliothek mit Seren, die von Patienten erhalten wurden, die mit M. tuberculosis-infiziert sind, identifiziert werden. Solche Screens können im allgemeinen unter der Verwendung von dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannten Techniken durchgeführt werden, wie zum Beispiel denjenigen beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
DNA-Sequenzen, die für lösliche Antigene kodieren, können auch durch Screenen einer geeigneten M. tuberculosis-cDNA oder genomischen DNA-Bibliothek auf DNA-Sequenzen erhalten werden, die an degenerierte Oligonukleotide hybridisieren, die von teilweisen Aminosäuresequenzen von isolierten löslichen Antigenen abgeleitet sind. Degenerierte Oligonukleotidsequenzen zur Verwendung in solch einem Screen können aufgebaut und synthetisiert werden und der Screen kann wie beschrieben (zum Beispiel) in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (und den darin zitierten Referenzen) durchgeführt werden. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann auch unter der Verwendung der oben genannten Oligonukleotide in Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind verwendet werden, um eine Nukleinsäuresonde aus einer cDNA oder genomischen Bibliothek zu isolieren. Der Bibliothek-Screen kann dann unter der Verwendung der isolierten Sonde durchgeführt werden.
Alternativ können genomische oder cDNA-Bibliotheken, die von M. tuberculosis abgeleitet sind, direkt unter der Verwendung von peripheren Blut-mononuklearen Zellen (PBMCs) oder T-Zellinien oder Klonen, die von einem oder mehreren M. tuberculosis-immunen Individuum abgeleitet sind, gescreent werden. Im allgemeinen können PBMCs und/oder T-Zellen zur Verwendung in solchen Screens wie unten beschrieben hergestellt werden. Direkte Bibliotheksscreens können im allgemeinen durch Testen von Pools von exprimierten rekombinanten Proteinen auf die Fähigkeit hin, eine Zellteilung und/oder Interferon-γ-Produktion in T-Zellen zu induzieren, die von einem M. tuberculosis-immunen Individuum abgeleitet sind, durchgeführt werden. Alternativ können potentielle T-Zell-Antigene zuerst basierend auf Antikörperreaktivität selektiert werden, wie oben beschrieben.
Unabhängig von dem Herstellungsverfahren weisen die Antigene (und immunogenen Teile davon), die hier beschrieben sind (die löslich oder nicht-löslich sein können) die Fähigkeit auf, eine immunogene Antwort zu induzieren. Genauer gesagt, weisen die Antigene die Fähigkeit auf, die Zellteilung und/oder Zytokinproduktion (d. h. Interferon-γ- und/oder Interleukin-12-Produktion) in T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und/oder Makrophagen zu induzieren, die von einem M. tuberculosis-immunen Individuum abgeleitet sind. Die Auswahl des Zelltyps zur Verwendung bei der Evaluierung einer immunogenen Antwort auf ein Antigen wird natürlich von der gewünschten Antwort abhängen. Zum Beispiel wird eine Interleukin-12-Produktion am leichtesten unter der Verwendung von Präparationen evaluiert, die B-Zellen und/oder Makrophagen enthalten. Ein M. tuberculosis-immunes Individuum ist eines, das resistent als dadurch für die Entwicklung von Tuberkulose betrachtet wird, daß es eine effektive T-Zell-Antwort gegenüber M. tuberculosis-aufgebaut hat (d. h. im wesentlich frei von Erkrankungssymptomen ist). Solche Individuen können basierend auf einer stark positiven (d. h. Verhärtung größer als ungefähr 10 mm Durchmesser) intradermalen Hauttestantwort gegenüber Tuberkulose-Proteinen (PPD) und ein Fehlen von jeglichen Anzeichen oder Symptomen von Tuberkulose-Erkrankung identifiziert werden. T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und Makrophagen, die von M. tuberculosis-immunen Individuen abgeleitet sind, können unter der Verwendung von dem Fachmann im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Präparation von PBMCs (d. h. peripheren Blutmononuklearen Zellen) verwendet werden, ohne eine weitere Abtrennung von Komponentzellen. PBMCs können im allgemeinen zum Beispiel unter der Verwendung von Dichtezentrifugation durch Ficoll^TM (Winthrop Laboratories, NY) präpariert werden. T-Zellen zur Verwendung in den hier beschriebenen Tests können auch direkt aus PBMCs gereinigt werden. Alternativ kann eine angereicherte T-Zellinie, die gegen mycobakterielle Proteine reaktiv ist oder T-Zell-Klone, die gegen einzelne mycobakterielle Proteine reaktiv sind, verwendet werden. Solche T-Zell-Klone können zum Beispiel durch Kultivieren von PBMCs von M. tuberculosis-immunen Individuen mit mycobakteriellen Proteinen für eine Zeitdauer von 2–4 Wo chen erzeugt werden. Dies ermöglicht eine Expansion nur der mycobakteriellen Proteinspezifischen T-Zellen, was zu einer Linie führt, die ausschließlich aus solchen Zellen besteht. Diese Zellen können dann kloniert werden und unter der Verwendung von dem Fachmann im Stand der Technik bekannten Verfahren mit einzelnen Proteinen getestet werden, um die einzelne T-Zell-Spezifität genauer zu definieren. Im allgemeinen werden Antigene, die in Tests unter der Verwendung von T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und/oder Makrophagen, die von einem M. tuberculosis-immunen Individuum abgeleitet sind, positiv auf die Zellteilung und/oder Zytokinproduktion (d. h. Interferon-γ und/oder Interleukin-12-Produktion) Testen, als immunogen betrachtet. Solche Tests können zum Beispiel unter der Verwendung der unten beschriebenen repräsentativen Verfahren durchgeführt werden. Immunogene Teile solcher Antigene können unter der Verwendung ähnlicher Tests identifiziert werden und können innerhalb der hier beschriebenen Polypeptide vorhanden sein.
Die Fähigkeit eines Polypeptids (z. B. eines immunogenen Antigens oder eines Teils oder anderer Variante davon), die Zellteilung zu induzieren, wird durch in Kontakt bringen der Zellen (z. B. T-Zellen und/oder NK-Zellen) mit dem Polypeptid und der Messung der Zellteilung der Zellen evaluiert. Im allgemeinen reicht die Menge von Polypeptid, die für eine Evaluierung von ungefähr 10⁵-Zellen ausreichend ist von ungefähr 10 ng/ml bis 100 μg/ml und ist bevorzugterweise ungefähr 10 μg/ml. Die Inkubation von Polypeptid mit Zellen wird typischerweise bei 37°C für ungefähr 6 Tage durchgeführ. Im Anschluß an die Inkubation mit Polypeptid werden die Zellen auf eine Zellteilungsantwort hin getestet, die durch den Fachmann im Stand der Technik bekannte Verfahren evaluiert werden kann, wie zum Beispiel Aussetzen von Zellen gegenüber einem Puls von radiomarkiertem Thymidin und Messen der Inkorporation von Marker in zelluläre DNA. Im allgemeinen wird ein Polypeptid, das zu einer mindestens dreifachen Zunahme in der Zellteilung oberhalb des Hintergrunds (d. h. der Zellteilung, die für Zellen beobachtet wird, die ohne Polypeptid kultiviert werden) als in der Lage betrachtet, die Zellteilung zu induzieren.
Die Fähigkeit eines Polypeptids, die Produktion von Interferon-γ und/oder Interleukin-12 in Zellen zu stimulieren kann durch in Kontakt bringen der Zellen mit dem Polypeptid und Messen des Spiegels von Interferon-γ oder Interleukin-12, der durch die Zellen produziert wird, evaluiert werden. Im allgemeinen reicht die Menge von Polypeptid, die für die Evaluierung von ungefähr 10⁵-Zellen ausreichend ist, von ungefähr 10 ng/ml bis ungefähr 100 μg/ml und bevorzugterweise ist sie ungefähr 10 μg/ml. Das Polypeptid kann, muß jedoch nicht, auf ei nem festen Träger immobilisiert werden, wie zum Beispiel einer Perle oder einer bioabbaubaren Mikrosphäre, wie denjenigen beschrieben in U.S.-Patenten Nr. 4,897,268 und 5,075,109. Die Inkubation von Polypeptid mit den Zellen wird typischerweise bei 37°C für ungefähr 6 Tage durchgeführt. Im Anschluß an die Inkubation mit Polypeptid werden die Zellen auf Interferon-γ und/oder Interleukin-12 (oder eine oder mehrere Untereinheiten davon) hin getestet, was durch dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden kann, wie zum Beispiel einen Enzym-verbundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) oder, im Fall der IL-12 P70-Untereinheit, einem Biotest, wie zum Beispiel einem Test, der die Zellteilung von T-Zellen mißt. Im allgemeinen wird ein Polypeptid, das zu der Produktion von mindestens 50 pg Interferon-γ pro ml von Kulturüberstand (enthaltend 10⁴–10⁵ T-Zellen pro ml) führt, als in der Lage zu sein betrachtet, die Produktion von Interferon-γ zu stimulieren. Ein Polypeptid, das die Produktion von mindestens 10 pg/ml von IL-12 P70-Untereinheit und/oder mindestens 100 pg/ml IL-12 P40-Untereinheit pro 10⁵-Makrophagen oder B-Zellen (oder pro 3 × 10⁵ PBMC) stimuliert, wird als in der Lage zu sein betrachtet, die Produktion von IL-12 zu stimulieren.
Im allgemeinen sind immunogene Antigene diejenigen Antigene, die eine Zellteilung und/oder Zytokin-Produktion (d. h. Interferon-γ und/oder Interleukin-12-Produktion) in T-Zellen, NK-Zellen, B-Zellen und/oder Makrophagen stimulieren, die von mindestens ungefähr 25% von M. tuberculosis-immunen Individuen abgeleitet sind. Unter diesen immunogenen Antigenen können Polypeptide, die überlegene therapeutische Eigenschaften aufweisen, basierend auf der Größenordnung der Antwort in den oben genannten Tests und basierend auf dem Prozentsatz von Individuen, für die eine Antwort beobachtet wird, unterschieden werden. Zusätzlich werden Antigene, die überlegene therapeutische Eigenschaften aufweisen, nicht die Zellteilung und/oder Zytokin-Produktion in vitro in Zellen stimulieren, die von mehr als ungefähr 25% von Individuen abgeleitet sind, die nicht M. tuberculosis-immun sind, wodurch nicht spezifische Antworten aufgrund von M. tuberculosis-responsiven Zellen eliminiert werden. Diejenigen Antigene, die in einem hohen Prozentsatz von T-Zell-, NK-Zell-, B-Zell- und/oder Makrophagen-Präparationen von M. tuberculosis-immunen Individuen eine Antwort induzieren (mit einem niedrigen Auftreten von Antworten in Zellpräparationen von anderen Individuen) weisen überlegene therapeutische Eigenschaften auf.
Antigene mit überlegenen therapeutischen Eigenschaften können auch basierend auf ihre Fähigkeit identifiziert werden, die Schwere von M. tuberculosis-Infektion in experimentellen Tieren zu verringern, wenn als ein Impfstoff verabreicht. Geeignete Impfpräparationen zur Verwendung bei experimentellen Tieren sind unten genau beschrieben. Die Effizienz kann basierend auf der Fähigkeit des Antigens bestimmt werden, mindestens ungefähr eine 50%-Verringerung in bakteriellen Zahlen und/oder mindestens ungefähr eine 40%-Verringerung in der Mortalität im Anschluß an die experimentelle Infektion zur Verfügung zu stellen. Geeignete experimentelle Tiere schließen Mäuse, Meerschweinchen und Primaten ein.
Antigene, die überlegene diagnostische Eigenschaften aufweisen, können im allgemeinen basierend auf der Fähigkeit identifiziert werden, eine Antwort in einem intradermalen Hauttest hervorzurufen, der auf einem Individuum mit aktiver Tuberkulose durchgeführt wird, jedoch nicht einem Test, der auf einem Individuum durchgeführt wird, das nicht mit M. tuberculosis infiziert ist. Hauttests können im allgemeinen wie unten beschrieben durchgeführt werden, wobei eine Antwort von mindestens 5 mm Verhärtung als positiv betrachtet wird.
Immunogene Teile der hier beschriebenen Antigene können unter der Verwendung von gut bekannten Techniken hergestellt und identifiziert werden, wie denjenigen zusammengefaßt in Paul, Fundamental Immunology, 3d ed., Raven Press, 1993, pp. 243–247 und den darin zitierten Referenzen. Solche Techniken schließen ein Screening von Polypeptidteilen des nativen Antigens auf immunogene Eigenschaften ein. Die hier beschriebenen repräsentativen Zellteilungs- und Zytokin-Produktionstests können im allgemeinen in diesen Screenings angewendet werden. Ein immunogener Teil eines Polypeptids ist ein Teil, der innerhalb solcher repräsentativen Tests eine Immunantwort erzeugt (z. B. Zellteilung, Interferon-γ-Produktion und/oder Interleukin-12-Produktion) die im wesentlichen ähnlich zu derjenigen ist, die durch das Vollängen-Antigen erzeugt wird. In anderen Worten, ein immunogener Teil eines Antigens kann mindestens ungefähr 20% und bevorzugterweise ungefähr 100% der Zellteilung erzeugen, die durch das Vollängen-Antigen in dem hier beschriebenen Modell-Zellteilungstest induziert wird. Ein immunogener Teil kann auch oder alternativ die Produktion von mindestens ungefähr 20% und bevorzugterweise ungefähr 100% des Interferons-γ und/oder Interleukins-12 stimulieren, das durch das Vollängen-Antigen in dem hier beschriebenen Modelltest induziert wird.
Teile oder andere Varianten von M. tuberculosis-Antigenen können durch synthetische oder rekombinante Mittel erzeugt werden. Synthetische Polypeptide, die weniger als ungefähr 100 Aminosäuren und im allgemeinen weniger als ungefähr 50 Aminosäuren aufweisen, können durch für den Fachmann gut bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel können sol che Polypeptide unter der Verwendung jeder der käuflich erhältlichen Festphase-Techniken synthetisiert werden, wie zum Beispiel dem Merrifield Festphase-Syntheseverfahren, wobei die Aminosäuren nacheinander zu einer wachsenden Aminosäurekette hinzugefügt werden. Siehe Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 55: 2149–2146, 1963. Die Ausrüstung für die automatisierte Synthese von Polypeptiden ist von Zulieferern, wie zum Beispiel Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, käuflich erhältlich und kann gemäß den Anweisungen des Herstellers betrieben werden. Varianten eines nativen Antigens können allgemein unter der Verwendung von Standard-Mutagenesetechniken hergestellt werden, wie zum Beispiel einer Oligonukleotid-gerichteten Stellen-spezifischen Mutagenese. Abschnitte der DNA-Sequenz können auch unter der Verwendung von Standardtechniken entfernt werden, um die Herstellung von verkürzten Polypeptiden zu ermöglichen.
Rekombinanten Polypeptide, die Teile und/oder Varianten eines nativen Antigens enthalten, können leicht aus einer DNA-Sequenz hergestellt werden, die das Polypeptid kodiert, unter der Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannt sind. Zum Beispiel können Überstände von geeigneten Wirts-/Vektorsystemen, die rekombinante Proteine in Kulturmedium sekretieren, zuerst unter der Verwendung eines käuflich erhältlichen Filters konzentriert werden. Im Anschluß an die Konzentration können die Konzentrate auf eine geeignete Aufreinigungsmatrix, wie zum Beispiel einer Affinitätsmatrix oder einem Ionenaustauschharz, aufgetragen werden. Zuletzt kann einer oder mehrere reverse Phase HPLC-Schritte angewendet werden, um ein rekombinantes Protein weiter zu reinigen.
Jeder einer Vielzahl von Expressionsvektoren, die dem Fachmann im Stand der Technik bekannt sind, kann dazu verwendet werden, um rekombinante Polypeptide dieser Erfindung zu exprimieren. Die Expression kann in jeder geeigneten Wirtszelle erreicht werden, die mit einem Expressionsvektor transformiert oder transfiziert wurde, der ein DNA-Molekül enthält, das für ein rekombinantes Polypeptid kodiert. Geeignete Wirtszellen schließen Prokaryonten, Hefe und höhere eukaryontische Zellen ein. Bevorzugterweise sind die verwendeten Wirtszellen E. coli, Hefe oder eine Säugetierzellinie, wie zum Beispiel COS oder CHO. Die auf diese Weise exprimierten DNA-Sequenzen können für natürlich auftretende Antigene, Teile von natürlich auftretenden Antigenen oder anderen Varianten davon kodieren.
Im allgemeinen werden die hier beschriebenen Polypeptide, unabhängig von dem Verfahren der Herstellung, in ihrer im wesentlichen reinen Form hergestellt. Bevorzugterweise sind die Polypeptide mindestens ungefähr 80% rein, weiter bevorzugt mindestens ungefähr 80% rein, weiter bevorzugt mindestens ungefähr 90% rein und am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99% rein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, die genau unten beschrieben werden, werden die im wesentlichen reinen Polypeptide in pharmazeutische Zusammensetzungen oder Impfstoffe zur Verwendung in einem oder mehreren der hier beschriebenen Verfahren inkorporiert.
Es werden Polypeptide beschrieben, die mindestens einen immunogenen Teil eines löslichen M. tuberculosis-Antigens aufweisen, das eine der folgenden N-terminalen Sequenzen aufweist oder einer Variante davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet:

(a) Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu; (SEQ ID NO: 120)
(b) Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser; (SEQ ID NO: 121)
(c) Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg; (SEQ ID NO: 122)
(d) Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro; (SEQ ID NO: 123)
(e) Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val; (SEQ ID NO: 124)
(f) Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro; (SEQ ID NO: 125)
(g) Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser; (SEQ ID NO: 126)
(h) Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly; (SEQ ID NO: 127)
(i) Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-A1a-A1a-Gln-Leu-Thr-Ser-Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn; (SEQ ID NO: 128)
(j) Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser; (SEQ ID NO: 134)
(k) Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp; (SEQ ID NO: 135) oder
(l) Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly; (SEQ ID NO: 136)

Auch beschrieben werden Polypeptide, die mindestens einen immunogenen Teil eines M. tuberculosis-Antigen umfassen, das eine der folgenden N-terminalen Sequenzen aufweist, oder eine Variante davon, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifikationen unterscheidet:

(m) Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val; (SEQ ID NO: 137) oder
(n) Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe; (SEQ ID NO: 129)

Es werden auch Polypeptide beschrieben, die mindestens einen immunogenen Teil eines löslichen M. tuberculosis-Antigens (oder eine Variante von solch einem Antigen) umfassen, die eine oder mehrere der Aminosäuresequenzen umfassen, die durch (a) die DNA-Sequenzen der SEQ ID NO: 1, 2, 4–10, 13–25 und 52 kodiert werden, (b) den Komplementen von solchen DNA-Sequenzen oder (c) DNA-Sequenzen, die im wesentlichen homolog zu einer Sequenz in (a) oder (b) sind.
Es werden weiterhin Polypeptide beschrieben, die mindestens einen immunogenen Teil eines M. tuberculosis-Antigens (oder einer Variante von solch einem Antigen) umfassen, die löslich oder nicht-löslich sein können, die eine oder mehrere der Aminosäuresequenzen umfassen, die durch (a) die DNA-Sequenzen von SEQ ID NOS: 26–51 kodiert werden, (b) den Komplementen von solchen DNA-Sequenzen oder (c) DNA-Sequenzen, die im wesentlichen homolog zu einer Sequenz in (a) oder (b) sind.
In den oben diskutierten Offenbarungen schließen die M. tuberculosis-Antigene Varianten ein, die durch DNA-Sequenzen kodiert werden, die im wesentlichen homolog zu einer oder mehrerer der DNA-Sequenzen sind, die hier spezifisch angegeben sind. "Wesentliche Homologie", wie hier verwendet, betrifft DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, unter moderat stringenten Bedingungen zu hybridisieren. Geeignete moderate stringente Bedingungen schließen ein Vorwaschen in einer Lösung von 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); Hybridisieren bei 50°C–65°C, 5X SSC über Nacht oder im Fall von Kreuz-Spezieshomologie bei 45°C, 0,5X SSC; gefolgt von Waschen zweimal bei 65°C für 20 Minuten mit jeweils 2X, 0,5X und 0,2X SSC, enthaltend 0,1% SDS) ein. Solche hybridisierenden DNA-Sequenzen liegen auch innerhalb des Bereichs dieser Erfindung, genauso wie dies Nukleotidsequenzen tun, die aufgrund der Code-Degenerierung für ein immunogenes Polypeptid kodieren, das durch eine hybridisierende DNA-Sequenz kodiert wird.
Es werden hier Fusionsproteine beschrieben, die das erfindungsgemäße Polypeptid, oder alternativ ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung und ein bekanntes M. tuberculosis-Antigen umfassen, wie zum Beispiel das oben beschriebene 38 kD Antigen oder ESAT-6 (SEQ ID NOS: 103 und 104), zusammen mit Varianten von solchen Fusionsproteinen. Die Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung können auch ein Linkerpeptid zwischen den ersten und zweiten Polypeptiden enthalten.
Eine DNA-Sequenz, die für ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung kodiert, wird unter der Verwendung von bekannten rekombinanten DNA-Techniken in einen geeigneten Expressionsvektor hergestellt, um getrennte DNA-Sequenzen zusammenzufügen, die für die ersten und zweiten Polypeptide kodieren. Das 3'-Ende einer DNA-Sequenz, die für das erste Polypeptid kodiert, wird mit oder ohne einem Linker an das 5'-Ende einer DNA-Sequenz, die für das zweite Polypeptid kodiert, ligiert, so daß die Leserahmen der Sequenzen in Phase vor liegen, um so eine mRNA-Translation der zwei DNA-Sequenzen zu einem einzigen Fusionsprotein zu ermöglichen, das die biologische Aktivität von beiden ersten und zweiten Polypeptiden beibehält.
Eine Peptidlinkersequenz kann verwendet werden, um die ersten und zweiten Polypeptide in einem Abstand voneinander zu halten, der ausreichend ist, um sicherzustellen, daß jedes Polypeptid sich in seine Sekundär- und Tertiärstrukturen faltet. Solch eine Peptidlinkersequenz wird in das Fusionsprotein unter der Verwendung von Standardtechniken inkorporiert, die gut im Stand der Technik bekannt sind. Geeignete Peptidlinkersequenzen können basierend auf den folgenden Faktoren ausgewählt werden: (1) ihrer Fähigkeit, eine flexible ausgestreckte Konformation anzunehmen; (2) ihrer Unfähigkeit, eine Sekundärstruktur anzunehmen, die mit den funktionellen Epitopen auf den ersten und zweiten Polypeptiden interagieren könnte und (3) dem Fehlen von hydrophoben oder geladenen Resten, die möglicherweise mit den Polypeptid-funktionellen Epitopen reagieren können. Bevorzugte Peptidlinkersequenzen enthalten Gly-, Asn- und Ser-Reste. Andere nahezu neutrale Aminosäuren, wie zum Beispiel Thr und Ala können auch in der Linkersequenz verwendet werden. Aminosäuresequenzen, die als Linker brauchbar verwendet werden können, schließen diejenigen ein, die in Maratea et al., Gene 40: 39–46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258–8262, 1986; U.S. Patent Nr. 4,935,233 und U.S. Patent Nr. 4,751,180 beschrieben sind. Die Linkersequenz kann von 1 bis ungefähr 50 Aminosäuren lang sein. Peptidsequenzen sind nicht erforderlich, wenn die ersten und zweiten Polypeptide nicht-essentielle N-terminale Aminosäureregionen aufweisen, die dazu verwendet werden können, um die funktionellen Domänen voneinander zu trennen und eine sterische Interferenz zu vermeiden.
Die ligierten DNA-Sequenzen werden operativ mit geeigneten regulatorischen Transkriptions- oder Translationselementen verbunden. Die für die Expression von DNA verantwortlichen regulatorischen Elemente werden nur 5' zu der DNA-Sequenz angeordnet, die für die ersten Polypeptide kodiert. Ähnlich sind Stoppkodons, die erforderlich sind, um die Translation zu beenden und Transkriptions-Terminationssignale nur 3' zu der DNA-Sequenz vorhanden, die für das zweite Polypeptid kodiert.
Auch beschrieben werden Verfahren zur Verwendung eines oder mehrerer der oben genannten Polypeptide oder Fusionsproteine (oder DNA-Moleküle, die für solche Polypeptide kodieren), um eine protektive Immunität gegen Tuberkulose in einem Patienten zu induzieren. Wie hier verwendet, betrifft ein "Patient" jedes warmblütige Tier, bevorzugterweise einen Menschen. Ein Patient kann von einer Erkrankung betroffen sein, oder kann frei von nachweisbarer Erkrankung und/oder Infektion sein. In anderen Worten kann eine protektive Immunität induziert werden, um einer Tuberkulose vorzubeugen oder diese zu behandeln.
In diesen Verfahren liegt das Polypeptid, Fusionsprotein oder DNA-Molekül im allgemeinen innerhalb einer pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder einem Impfstoff vor. Pharmazeutische Zusammensetzungen können eines oder mehrere Polypeptide, wovon jedes eine oder mehrere der oben genannten Sequenzen (oder Varianten davon) enthalten kann und einen physiologisch akzeptablen Träger umfassen. Impfstoffe können eines oder mehrere der oben genannten Polypeptide und einen nicht-spezifischen Immunantwort-Verstärker umfassen, wie zum Beispiel ein Adjuvans oder ein Liposom (in das das Polypeptid inkorporiert wird). Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe können auch andere M. tuberculosis-Antigene enthalten, entweder in ein Kombinationspolypeptid inkorporiert oder innerhalb eines getrennten Polypeptids vorhanden.
Alternativ kann ein Impfstoff eine DNA enthalten, die für eines oder mehrere Polypeptide, wie oben beschrieben, kodiert, so daß das Polypeptid in situ erzeugt wird. In solchen Impfstoffen kann die DNA innerhalb einer Vielzahl von Zuführsystemen vorhanden sein, die dem Fachmann im Stand der Technik bekannt sind, einschließlich Nukleinsäure-Expressionssystemen, bakteriellen und viralen Expressionssysteme. Geeignete Nukleinsäure-Expressionssysteme enthalten die für die Expression in dem Patienten erforderlichen DNA-Sequenzen (wie zum Beispiel einen geeigneten Promotor und ein terminierendes Signal). Bakterielle Zuführsysteme schließen die Verabreichung eines Bakteriums (wie zum Beispiel Bacillus-Calmette-Guerrin) ein, das einen immunogenen Teil des Polypeptids auf seiner Zelloberfläche exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA unter der Verwendung eines viralen Expressionssystems eingeführt werden (z. B. Vaccinia oder anderer Pockenvirus, Retrovirus oder Adenovirus), was die Verwendung eines nicht-pathogenen (defektiven) Replikations-kompetenten Virus einschließen kann. Techniken zur Inkorporation von DNA in solche Expressionssysteme sind dem Fachmann im Stand der Technik gut bekannt. Die DNA kann auch "nackt" vorliegen, wie zum Beispiel in Ulmer et al., Science 259: 1745–1749, 1993 beschrieben und durch Cohen, Science 259: 1691–1692, 1993 zusammengefaßt beschrieben. Die Aufnahme von nackter DNA kann durch Beschichten der DNA auf bioabbaubare Perlen erhöht werden, die effizient in die Zellen transportiert werden.
Es wird auch beschrieben, daß ein DNA-Impfstoff, wie oben beschrieben, gleichzeitig oder nacheinander mit entweder einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder einem bekannten M. tuberculosis-Antigen, wie zum Beispiel dem oben beschriebenen 38 kD-Antigen, verabreicht werden kann. Zum Beispiel kann die Verabreichung von DNA, die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, entweder "nackt" oder in einem wie oben beschriebenen Zuführsystem von der Verabreichung eines Antigens gefolgt werden, um den protektiven Immuneffekt des Impfstoffes zu verstärken.
Die Routen und Frequenzen der Verabreichung, sowie die Dosierung, werden von Individuum zu Individuum variieren und können zu denjenigen, die im Augenblick bei der Immunisierung unter der Verwendung von BCG verwendet werden, parallel verlaufen. Im allgemeinen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Impfstoffe durch Injektion (z. B. intrakutan, intramuskulär, intravenös oder subkutan), intranasal (z. B. durch Aspiration) oder oral verabreicht werden. Zwischen 1 und 3 Dosen können für eine 1-36-wöchige Periode verabreicht werden. Bevorzugterweise werden 3 Dosen verabreicht, in Intervallen von 3–4 Monaten und Booster-Impfungen können periodisch danach gegeben werden. Veränderte Protokolle können für einzelne Patienten erforderlich sein. Eine geeignete Dosis ist eine Menge von Polypeptid oder DNA, die, wenn wie oben verabreicht, in der Lage ist, eine Immunantwort in einem immunisierten Patienten hervorzurufen, die ausreichend ist, um den Patienten vor einer M. tuberculosis-Infektion für mindestens 1–2 Jahre zu schützen. Im allgemeinen reicht die in einer Dosis vorhandene Menge an Polypeptid (oder produziert in situ durch die DNA in einer Dosis) von ungefähr 1 pg bis ungefähr 100 mg pro kg des Wirts, typischerweise von ungefähr 10 pg bis ungefähr 1 mg und bevorzugterweise von ungefähr 100 pg bis ungefähr 1 μg. Geeignete Dosisgrößen werden mit der Größe des Patienten variieren, werden jedoch typischerweise von ungefähr 0,1 ml bis ungefähr 5 ml reichen.
Während jeder dem Fachmann im Stand der Technik bekannte geeignete Träger in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden kann, wird der Typ von Träger in Abhängigkeit vom Modus der Verabreichung variieren. Für die parenterale Verabreichung, wie zum Beispiel subkutane Injektion, umfaßt der Träger bevorzugterweise Wasser, Kochsalz, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer, für die orale Verabreichung kann jeder der oben genannten Träger oder ein fester Träger, zum Beispiel Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glucose, Saccharo se und Magnesiumcarbonat verwendet werden. Bioabbaubare Mikrosphären (z. B. Polymilchsäure-Galactid) können auch als Träger für die pharmazeutischen Verwendungen dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete bioabbaubare Mikrosphären sind zum Beispiel in den U.S. Patenten Nrn. 4,897,268 und 5,075,109 beschrieben.
Jedes einer Vielzahl von Adjuvantien kann in den Impfstoffen dieser Erfindung verwendet werden, um die Immunantwort nicht-spezifisch zu verstärken. Die meisten Adjuvantien enthalten eine Substanz, die so aufgebaut ist, um das Antigen vor einer schnellen Verstoffwechselung zu schützen, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid oder Mineralöl, und einen nicht-spezifischen Stimulator von Immunantworten, wie zum Beispiel Lipid A, Bordetella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis. Geeignete Adjuvantien sind als zum Beispiel Freund's unvollständiges Adjuvans und Freund's vollständiges Adjuvans (Difco Laboratories) und Merck Adjuvans 65 (Merck und Company, Inc., Rahway, NJ) erhältlich. Andere geeignete Adjuvants schließen Alum, bioabbaubare Mikrosphären, Monophosphoryl-Lipid A und Quil A ein.
Auch hier beschrieben sind Verfahren zur Verwendung eines oder mehrerer der Polypeptide wie oben beschrieben, um unter der Verwendung eines Hauttests Tuberkulose zu diagnostizieren. Wie hier verwendet, ist ein "Hauttest" jeder Test, der direkt auf einem Patienten durchgeführt wird, in dem eine Hypersensitivitäts (DTH)-Reaktion verzögerten Typs (wie zum Beispiel Schwellung, Rötung oder Dermatitis) im Anschluß an die intradermale Injektion von einem oder mehreren der oben beschriebenen Polypeptide gemessen wird. Solche Injektion kann unter der Verwendung jeder geeigneten Vorrichtung erreicht werden, die ausreichend ist, um das Polypeptid oder die Polypeptide mit Hautzellen des Patienten in Kontakt zu bringen, wie zum Beispiel einer Tuberculin-Spritze oder 1 ml-Spritze. Bevorzugterweise wird die Reaktion mindestens 48 Stunden nach der Injektion gemessen, weiter bevorzugt 48–72 Stunden.
Die DTH-Reaktion ist eine Zell-vermittelte Immunantwort, die in denjenigen Patienten größer ist, die vorher gegenüber dem Test-Antigen ausgesetzt wurden (d. h. dem immunogenen Teil des verwendeten Polypeptids oder einer Variante davon). Die Antwort kann visuell unter der Verwendung eines Lineals gemessen werden. Im allgemeinen ist eine Antwort, die größer als ungefähr 0,5 cm im Durchmesser ist, bevorzugterweise größer als ungefähr 1,0 cm im Durchmesser, eine positive Antwort, die eine Tuberkulose-Infektion anzeigt, die sich als eine aktive Erkrankung manifestiert haben kann oder nicht manifestiert haben kann.
Das Polypeptid dieser Erfindung wird zur Verwendung in einem Hauttest bevorzugterweise als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert, die ein Polypeptid und einen physiologisch akzeptablen Träger, wie oben beschrieben, enthalten. Solche Zusammensetzungen enthalten typischerweise eines oder mehrere der oben angegebenen Polypeptide in einer Menge, die von ungefähr 1 μg bis ungefähr 100 μg reicht, bevorzugterweise von ungefähr 10 μg bis ungefähr 50 μg, in einem Volumen von 0,1 ml. Bevorzugterweise ist der in solchen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendete Träger eine Kochsalzlösung mit geeignten Konservierungsstoffen, wie zum Beispiel Phenol und/oder Tween 80^TM.
Die folgenden Beispiele werden als Verdeutlichung und nicht als Begrenzung angeboten.
BEISPIELE
VERGLEICHSBEISPIEL 1
REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON POLYPEPTIDEN AUS M. TUBERCULOSISKULTURFILTRAT
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von M. tuberculosis löslichen Polypeptiden aus Kulturfiltrat. Soweit nicht anders angegeben, sind alle Prozentangaben in den folgenden Beispiel Gewicht pro Volumen.
M. tuberculosis (entweder H37a, ATCC Nr. 25177 oder H37Rv, ATCC Nr. 25618) wurde in sterilem GAS-Medien bei 37°C für 14 Tage kultiviert. Die Medien wurde dann (wobei der Hauptteil der Zellen zurückgelassen wurde) durch einen 0,45 μ Filter in eine sterile 2,5 l Flasche Vakuum-filtriert. Die Medien wurden als nächstes durch einen 0,2 μ Filter in eine sterile 4 l Flasche filtriert, und NaN₃ wurde zu dem Kulturfiltrat bis zu einer Konzentration von 0,04% hinzugegeben. Die Flaschen wurden dann in einen 4°C-Kühlraum plaziert.
Das Kulturfiltrat wurde durch Plazieren des Filtrats in ein 12 l Reservoir, das autoklaviert wurde, und Zuführen des Filtrats in eine 400 ml Amicon-Rührzelle, die mit Ethanol ausgespült wurde und eine 10.000 kDa MWCO-Membran enthielt, konzentriert. Der Druck wurde bei 60 psi unter der Verwendung von Stickstoffgas gehalten. Dieses Verfahren reduzierte das 121 Volumen auf ungefähr 50 ml.
Das Kulturfiltrat wurde in 0,1% Ammonium-Bicarbonat unter der Verwendung einer 8.000 kDa MWCO-Zelluloseestermembran dialysiert, mit zwei Wechseln von Ammonium-Bicarbonatlösung. Die Proteinkonzentration wurde dann durch einen käuflich erhältlichen BCA-Test (Pierce, Rockford, IL) bestimmt.
Das dialysierte Kulturfiltrat wurde dann lyophilisiert und die Polypeptide in destilliertem Wasser resuspendiert. Die Polypeptide wurden gegen 0,01 mM 1,3 bis[tris(Hydroxymethyl)-methylamino]propan, pH 7,5 (Bis-Tris-Propanpuffer), dialysiert, die Ausgangsbedingungen für die Anionenaustausch-Chromatographie. Die Fraktionierung wurde unter der Verwendung von Gel Profusionschromatographie auf einer POROS 146 II Q/M Anionenaustauschsäule 4,6 mm × 100 mm (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) äquilibriert in 0,01 mM Bis-Tris-Propanpuffer, pH 7,5, durchgeführt. Die Polypeptide wurden mit einem linearen 0–0,5 M NaCl-Gradient in dem oben genannten Puffersystem eluiert. Das Säuleneluat wurde bei einer Wellenlänge von 220 nm überwacht.
Die Pools von Polypeptiden, die von der Ionenaustauschsäule eluierten, wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das erhaltene: Material wurde in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), pH 1,9 in Wasser gelöst und die Polypeptide wurden auf einer Delta-Pak C18-Säule (Waters, Milford MA) 300 Angström-Porengröße, 5 Micron Partikelgröße (3,9 × 150 mm) gereinigt. Die Polypeptide wurden von der Säule mit einem linearen Gradienten von 0–60% Verdünnungspuffer (0,1% TFA in Acetoniril) eluiert. Die Flußrate war 0,75 ml/Minute und das HPLC-Eluat wurde bei 214 mit verfolgt. Fraktionen, die die eluierten Polypeptide enthielten, wurden gesammelt, um die Reinheit der einzelnen Proben zu maximieren. Ungefähr 200 gereinigte Polypeptide wurden erhalten.
Die gereinigten Polypeptide wurden dann auf ihre Fähigkeit hin gescreent, T-Zell-Teilung in PBMC-Präparationen zu induzieren. Die PBMCs von Spendern, von denen bekannt war, daß sie PPD-Hauttest positiv waren und von deren T-Zellen gezeigt wurde, daß sie sich in Antwort auf PPD und ungereinigte lösliche Proteine von MTB teilten, wurden in Medium kultiviert, das RPMI 1640, ergänzt mit 10% gepooltem Human-Serum und 50 μg/ml Gentamicin umfaßte. Gereinigte Polypeptide wurden in zweifachen Ansätzen bei Konzentrationen von 0,5 bis 10 μg/ml hinzugefügt. Nach sechs Tagen Kultur in 96-Napf-Rundbodenplatten in einem Volumen von 200 μl wurden 50 μl Medium von jedem Napf zum Nachweis der IFN-γ- Spiegel, wie im folgenden beschrieben, entfernt. Die Platten wurden dann mit 1 μCi/Napf von tritiertem Thymidin für weitere 18 Stunden gepulst, geerntet und die Tritiumaufnahme unter der Verwendung eines Gas-Scintillationszählers bestimmt. Fraktionen, bei denen in beiden Replikaten zu einer Zellteilung, die dreifach größer war als bei Zellen die in Medium allein kultiviert wurden, beobachtet wurde, wurden als positiv betrachtet.
IFN-γ wurde unter der Verwendung eines Enzym-verbundenen Immunsorbent-Assays (ELISA) gemessen. Die ELISA-Platten wurden mit einem Maus-monoklonalen Antikörper, der gegen menschliches INF-γ gerichtet war (PharMingen, San Diego, CA) in PBS für vier Stunden bei Raumtemperatur beschichtet. Die Näpfe wurden dann mit PBS, das 5% (W/V) entfettete getrocknete Milch enthielt, für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Die Platten wurden dann sechsmal mit PBS/0,2% TWEEN-20 gewaschen und 1 : 2 mit Kulturmedium verdünnte Proben wurden in den ELISA-Platten über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden nochmals gewaschen und ein polyklonales Kaninchen-anti-Mensch IFN-γ-Serum, verdünnt 1 : 3000 in PBS/10% normales Ziegenserum, wurde zu jedem Napf hinzugefügt. Die Platten wurden dann für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gewaschen, und Meerrettichperoxidase-gekoppeltes Anti-Kaninchen IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde als eine 1 : 2000 Verdünnung in PBS/5% entfetteter getrockneter Milch hinzugefügt. Nach einer weiteren zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen und TMB-Substrat hinzugefügt. Die Reaktion wurde nach 20 Minuten mit 1 normaler Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte wurde bei 450 nm unter der Verwendung von 570 nm als einer Referenzwellenlänge bestimmt. Fraktionen, die bei beiden Replikaten dazu führten, daß eine OD ergeben wurde, die zweifach höher war als die mittlere OD von Zellen, die in Medium allein kultiviert wurden, plus 3 Standardabweichungen, wurden als positiv betrachtet.
Zur Sequenzierung wurden die Polypeptide einzeln auf Biobrene^TM (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) behandeltem Glasfaser-Filter getrocknet. Die Filter mit Polypeptid wurden auf einen Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492 Proteinsequencer geladen. Die Polypeptide wurden vom Aminoterminus unter der Verwendung von herkömmlicher Edman-Chemie sequenziert. Die Aminosäuresequenz wurde für jedes Polypeptid durch Vergleichen der Retentionszeit des PTH-Aminosäurederivats mit den geeigneten PTH-Derivat-Standards bestimmt.
Unter der Verwendung des oben angegebenen Verfahrens wurden Antigene isoliert, die die folgenden N-terminalen Sequenzen aufwiesen:

(a) Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Xaa-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu; (SEQ ID Nr. 54)
(b) Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser (SEQ ID Nr. 55)
(c) Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg; (SEQ ID Nr. 56)
(d) Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro; (SEQ ID Nr. 57)
(e) Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val; (SEQ ID Nr. 58)
(f) Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro; (SEQ ID Nr. 59)
(g) Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Pro-Ala; (SEQ ID Nr. 60) und
(h) Ala-Pro-Lys-Thr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly; (SEQ ID Nr. 61)

Ein weiteres Antigen wurde unter der Verwendung eines Microbor HPLC-Reinigungsschritts, zusätzlich zu dem oben beschriebenen Verfahren, isoliert. Genauer gesagt wurden 20 μl einer Fraktion, die ein Gemisch von Antigenen aus dem vorher beschriebenen Chromatographie-Reinigungsschritt umfaßte, auf einer Aquapor C18-Säule (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) mit einer 7 Micron-Porengröße, Säulengröße 1 mm × 100 mm, in einem Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modell 172 HPLC, gereinigt. Fraktionen wurden von der Säule mit einem linearen Gradienten von 1%/Minute Acetonirtil (enthaltend 0,05% TFA) in Wasser (0,05% TFA) bei einer Flußrate von 80 μl/Minute eluiert. Das Eluat wurde bei 250 nm überwacht. Die Ausgangsfraktion wurde in 4 Hauptpeaks plus weitere kleinere Komponenten aufgetrennt und ein Polypeptid wurde erhalten, von dem gezeigt wurde, das es ein Molekulargewicht von 12.054 Kd (durch Massenspektrometrie) und die folgenden N-terminale Sequenz aufwies:

(i) Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Gln-Thr-Ser-Leu-Leu-Asn-Asn-Leu-Ala-Asp-Pro-Asp-Val-Ser-Phe-Ala-Asp (SEQ ID Nr. 62).

Von diesem Polypeptid wurde gezeigt, daß es unter der Verwendung der oben beschriebenen Verfahren die Zellteilung und IFN-γ-Produktion in PBMC-Präparationen induzierte.
Weitere lösliche Antigene wurden aus M. tuberculosis Kulturfiltrat wie folgt isoliert. M. tuberculosis Kulturfiltrat wurde wie oben beschrieben hergestellt. Im Anschluß an die Dialyse gegen Bis-Tris-Propanpuffer bei pH 5,5 wurde eine Fraktionierung unter der Verwendung von Anionenaustausch-Chromatographie auf einer Poro-QE-Säule 4,6 × 100 mm (Perseptive Biosystems), äqulibriert in Bis-Tris-Propanpuffer pH 5,5, durchgeführt. Polypeptide wurden mit einem linearen 0–1,5 M NaCl-Gradienten in dem oben genannten Puffer-System bei einer Flußrate von 10 mm/Minute eluiert. Das Säulen-Eluat wurde bei einer Wellenlänge von 214 nm verfolgt.
Die von der Ionenaustauch-Säule eluierenden Fraktionen wurden gesammelt und einer Reverse-Phase-Chromatographie unter der Verwendung einer Poros-R2-Säule 4,6 × 100 mm (Perseptive Biosystems) unterzogen. Die Polypeptide wurden von der Säule mit einem linearen Gradienten von 0–100% Acetonitril (0,1% TFA) bei einer Flußrate von 5 ml/Minute eluiert. Das Eluat wurde bei 214 nm verfolgt.
Fraktionen, die die eluierten Polypeptide enthielten, wurden lyophilisiert und in 80 μl wäßriger 0,1% TFA resupendiert und weiter einer Reverse-Phase-Chromatographie auf einer Vydac-CA-Säule 4,6 × 150 mm (Western Analytical, Temecula, CA) mit einem linearen Gradienten von 0–100% Acetonitril (0,1% TFA) bei einer Flußrate von 2 ml/Minute unterzogen. Das Eluat wurde bei 214 nm verfolgt.
Die Fraktion mit biologischer Aktivität wurde in einem Haupt-Peak plus weitere kleinere Komponenten aufgetrennt. Western Blots dieses Peaks auf PVDF-Membran ergaben drei hauptsächliche Banden der Molekulargewichte 14 Kd, 20 Kd und 26 Kd. Diese Polypeptide wurden als jeweils die folgende N-terminale Sequenzen aufweisend bestimmt:

(j) Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser; (SEQ ID Nr. 134)
(k) Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp; (SEQ ID Nr. 135) und
(l) Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly; (SEQ ID Nr. 136), worin Xaa jede Aminosäure sein kann.

Unter der Verwendung der oben beschriebenen Tests wurde von diesen Polypeptiden gezeigt, daß sie die Zellteilung und die IFN-γ-Produktion in PBMC-Präparationen induzieren. 1A und B zeigen die Ergebnisse solcher Tests unter der Verwendung von PBMC-Präparationen von jeweils einem ersten und zweiten Spender.
DNA-Sequenzen, die die als (a), (c), (d) und (g) oben bezeichneten Antigene kodierten, wurden durch Screenen der genomischen M. tuberculosis Bibliothek unter der Verwendung von ³²P-End-markierten degenerierten Oligonukleotiden erhalten, die der N-terminalen Sequenz entsprachen und M. tuberculosis Codon-Verwendung enthielten. Der Screen der unter der Verwendung einer Sonde durchgeführt wurde die dem oben angegebenen Antigen (a) entsprach, identifizierte einen Klon, der die in SEQ ID Nr. 101 zur Verfügung gestellte Sequenz aufwies. Das durch SEQ ID Nr. 101 kodierte Polypeptid wird in SEQ ID Nr. 102 zur Verfügung gestellt. Der durchgeführte Screen unter der Verwendung einer Sonde, die dem oben angegebenen Antigen (g) entsprach, identifizierte einen Klon, der die in SEQ ID Nr. 52 zur Verfügung gestellte Sequenz aufwies. Das durch SEQ ID Nr. 52 kodierte Polypeptid wird in SEQ ID Nr. 53 zur Verfügung gestellt. Der unter der Verwendung einer Sonde durchgeführte Screen, die dem oben angegebenen Antigen (d) entsprach, identifizierte einen Klon, der die in SEQ ID Nr. 24 zur Verfügung gestellte Sequenz aufwies und der mit einer Sonde, die dem oben angegebenen Antigen (c) entsprach, identifizierte einen Klon, der die in SEQ ID Nr. 24 angegebenen Sequenz aufwies.
Die oben angegebenen Aminosäuresequenzen wurden mit bekannten Aminosäuresequenzen in der Genbank unter der Verwendung des DNA-STAR-Systems verglichen. Die durchsuchte Datenbank enthielt ungefähr 173.000 Proteine und ist eine Kombination der Swiss, PIR-Datenbanken, zusammen mit den translatierten Proteinsequenzen (Version 87). Keine signifikanten Homologien zu den Aminosäuresequenzen für Antigene (a)–(h) und (l) wurden gefunden.
Von der Aminosäuresequenz für Antigen (i) wurde gefunden, daß sie zu einer Sequenz von M. leprae homolog war. Die M. leprae Vollängen-Sequenz wurde aus genomischer DNA unter der Verwendung der aus der GENBANK enthaltenen Sequenz amplifiziert. Diese Sequenz wurde dann dazu verwendet, um die unten in Beispiel 2 beschriebene M. tuberculosis Bibliothek zu screenen, und eine Vollängen-Kopie des M. tuberculosis-Homologs wurde erhalten (SEQ ID Nr. 99).
Von der Aminosäuresequenz für Antigen (j) wurde gefunden, daß sie zu einem bekannten M. tuberculosis-Protein homolog war, das von einer DNA-Sequenz translatiert wurde. Soweit es den Erfindern bekannt ist, wurde von diesem Protein bisher nicht gezeigt, daß es T-Zell-stimulierende Aktivität aufweist. Von der Aminosäuresequenz für Antigen (k) wurde gefunden, daß sie zu einer Sequenz aus M. leprae verwandt ist.
In den oben beschriebenen Zellteilungs- und IFN-γ-Tests unter der Verwendung von drei PPD-positiven Spendern sind die erhaltenen Ergebnisse für die oben zur Verfügung gestellten repräsentativen Antigene in Tabelle 1 dargestellt:
TABELLE 1 ERGEBNISSE DER PBMC-ZELLTEILUNGS- UND INF-γ-TESTS
In Tabelle 1 wurden Antworten, die einen Stimulationsindex (SI) von zwischen 2 und 4 ergaben (verglichen zu Zellen, kultiviert in Medium alleine) als + bewertet, ein SI von 4–8 oder 2–4 bei einer Konzentration von 1 μg oder weniger wurde als ++ bewertet und ein SI von mehr als 8 wurde als +++ bewertet. Von dem Antigen der Sequenz (i) wurde gefunden, daß es einen hohen SI (+++) für einen Spender und niedrigeren SI (++ und +) für die zwei anderen Spender in sowohl Zellteilungs- als auch IFN-γ-Tests aufwies. Diese Ergebnisse zeigen, daß diese Antigene in der Lage sind, eine Zellteilung und/oder Interferon-γ-Produktion zu induzieren.
VERGLEICHSBEISPIEL 2
VERWENDUNG VON PATIENTENSEREN, UM M. TUBERULOSIS ANTIGENE ZU ISOLIEREN
Dieses Beispiel verdeutlicht die Isolierung von Antigenen aus M. tuberculosis Lysat durch Screenen mit Serum aus M. tuberculosis-infizierten Individuen.
Entwässertes M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories) wurde zu einer 2% NP40-Lösung hinzugefügt und dreimal nacheinander homogenisiert und beschallt. Die erhaltenen Suspension wurde bei 13.000 U/min in Microfuge-Röhrchen zentrifugiert und der Überstand durch einen 0,2 Micron Spritzenfilter hindurch filtriert. Das Filtrat wurde an Macro Prep DEAE-Perlen (BioRad, Hercules, CA) gebunden. Die Perlen wurden extensiv mit 20 mM Tris pH 7,5 gewaschen und gebundene Proteine mit 1 M NaCl eluiert. Das 1 M NaCl-Eluat wurde über Nacht gegen 10 mM Tris, pH 7,5 dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde mit DNase und RNase bei 0,05 mg/ml für 30 Minuten bei Raumtemperatur und dann mit α-D-Mannosidase, 0,5 U/mg bei pH 4,5 für 3–4 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Nach Rückkehr auf pH 7,5 wurde das Material über FPLC über eine Bio Scale-Q-20-Säule (BioRad) fraktioniert. Die Fraktionen wurden in neun Pools kombiniert, in einem Centriprep 10 (Amicon, Beverly, MA) konzentriert und dann durch Western Blot auf serologische Aktivität unter der Verwendung eines Serumpools von M. tuberculosis-infizierten Patienten, der nicht immunreaktiv mit anderen Antigenen der vorliegenden Erfindung war, gescreent.
Die am meisten reaktive Fraktion wurde in SDS-PAGE laufen gelassen und auf PVDF transerferiert. Eine Bande bei ungefähr 18 Kd wurde ausgeschnitten und ergab die Sequenz:

(m) Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val; (SEQ ID Nr. 137), worin Xaa jede Aminosäure sein kann.

Der Vergleich dieser Sequenz mit denjenigen in der Genbank wie oben beschrieben ergab keine signifikanten Homologien gegenüber bekannten Sequenzen.
BEISPIEL 3
PRÄPARATION VON DNA-SEQUENZEN, DIE FÜR M. TUBERCULOSIS ANTIGENE KODIEREN
Dieses Beispiel verdeutlicht die Präparation von DNA-Sequenzen, die für M. tuberculosis Antigene kodieren, durch Sreening einer M. tuberculosis-Expressionsbibliothek mit Seren, die von Patienten erhalten wurden, die mit M. tuberculosis infiziert waren oder mit Antiseren, die gegen lösliche M. tuberculosis Antigene gerichtet sind.
A. HERSTELLUNG VON M. TUBERCULOSIS LÖSLICHEN ANTIGENEN UNTER DER VERWENDUNG VON KANINCHEN ANTISEREN
Genomische DNA wurde aus dem M. tuberculosis-Stamm H37Ra isoliert. Die DNA wurde zufällig geschert und dazu verwendet, unter der Verwendung des Lambda-ZAP-Expressions-Systems (Stratagene, La Jolla, CA) eine Expressionsbibliothek herzustellen. Kaninchen-Antiseren wurden gegen sekretorische Proteine der M. tuberculosis-Stämme H37Ra, H37Rv und Erdmann durch Immunsierung eines Kaninchens mit einem konzentrierten Überstand der M. tuberculosis-Kulturen erzeugt. Genauer gesagt wurde das Kaninchen zuerst subkutan mit 200 μg von Protein-Antigenen in einem Gesamtvolumen von 2 ml, enthaltend 10 μg Muramyl-Dipeptid (Calbiochem, La Jolla, CA) und 1 ml unvollständiges Freund's Adjuvans immunisiert. Vier Wochen später wurde das Kaninchen subkutan mit 100 μg Antigen in unvollständigem Freud's Adjuvans geboosted. Zuletzt wurde das Kaninchen intravenös vier Wochen später mit 50 μg Protein-Antigen immunisiert. Die Antiseren wurden dazu verwendet, um die Expressionsbibliothek wie beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 zu screenen. Bakteriophagen-Plaques, die immunreaktive Antigene exprimierten, wurden gereinigt. Phagemide der Plaques wurden gerettet und die Nukleotidsequenzen der M. tuberculosis-Klone wurden abgeleitet.
Zweiunddreißig Klone wurden gereinigt. Von diesen stellten 25 Sequenzen dar, die bisher nicht in nicht-menschlichen M. tuberculosis identifiziert wurden. Die rekombinanten Antigene wurden exprimiert und gereinigte Antigene in der in Beispiel 1 beschriebenen immunologischen Analyse verwendet. Die Proteine wurden durch IPTG induziert und durch Gelelution wie beschrieben in Skeiky et al., J. Exp. Med. 181: 1527–1537, 1995 gereinigt. Die repräsentativen Sequenzen von in diesem Screen identifzierten DNA-Molekülen sind in SEQ ID Nrn. 1–25 zur Verfügung gestellt. Die entsprechenden vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind in SEQ ID Nrn. 63–87 gezeigt.
Bei Vergleichen dieser Sequenzen mit bekannten Sequenzen in der Genbank unter der Verwendung der oben beschriebenen Datenbanken wurde gefunden, daß die hier im folgenden als TbRA2A, TbRA16, TbRA18, TbRA29 (SEQ ID Nrn. 76, 68, 70, 75) bezeichneten Klone einige Homologie zu vorher identifizierten Sequenzen aus Mycobacterium leprae zeigten, jedoch nicht aus M. tuberculosis. TbRA11, TbRA26, TbRA28, TbDPEP (SEQ ID Nrn. 65, 73, 74, 53) wurden früher in M. tuberculosis identifiziert. Keine signifikanten Homologien wurden zu TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, TbRA19, TbRA29, TbRA32, TbRA36 und den überlappenden Klone TbRA35 und TbRA12 (SEQ ID Nrn. 63, 77, 81, 82, 64, 67, 69, 71, 75, 78, 80, 79, 66) gefunden. Der Klon TbRA24 überlappt mit Klon TbRA29.
Die Ergebnisse der PBMC-Zellteilungs- und Interferon-γ-Tests, die an repräsentativen rekombinanten Antigenen und unter der Verwendung von T-Zell-Präparationen aus verschiedenen unterschiedlichen M. tuberculosis-immunen Patienten durchgeführt wurden, sind jeweils in den Tabellen 2 und 3 dargestellt.
In den Tabellen 2 und 3 wurden Antworten, die einen Stimulationsindex (SI) von zwischen 1,2 und 2 (verglichen mit Zellen, die in Medium allein kultiviert wurden) ergaben, als ± bewertet, ein SI von 2–4 wurde als + bewertet, ein SI von 4–8 oder 2–4 bei einer Konzentration von 1 μg oder weniger wurde als ++ bewertet und ein SI von größer als 8 wurde als +++ bewertet. Zusätzlich ist der Effekt der Konzentration auf die Zellteilung und Interferon-γ-Produktion für zwei der oben genannten Antigene in der beigefügten Figur gezeigt. Für sowohl Zellteilung als auch Interferon-γ-Produktion wurde TbRa3 als ++ und TbRa9 als + bewertet.
Diese Ergebnisse zeigen, daß diese löslichen Antigene Zellteilung und Interferon-γ-Produktion in T-Zellen induzieren können, die von einem M. tuberculosis-immunen Individuum abgeleitet wurden.
B. VERWENDUNG VON PATIENTEN-SEREN UM DNA-SEQUENZEN ZU IDENTIFIZIEREN DIE FÜR M. TUBERCULOSIS ANTIGENE KODIEREN
Die oben beschriebene genomische DNA-Bibliothek und eine zusätzliche H37Rv-Bibliothek wurden unter der Verwendung von Pools von Seren gescreent, die aus Patienten mit aktiver Tuberkulose erhalten wurden. Um die H37Rv-Bibliothek herzustellen, wurde M. tuberculosis-Stamm H37Rv genomische DNA isoliert, einem partiellen Sau3A-Verdau unterzogen und dazu verwendet, eine Expressionsbibliothek unter der Verwendung des Lambda-ZAP-Expressionssystems (Stratagene, La Jolla, CA) zu konstruieren. Drei verschiedene Pools von Seren, die jeder Seren enthielten, die von drei Individuen aktiver pulmonarer oder pleuraler Erkrankung erhalten wurde, wurden in dem Expressionsscreening verwendet. Die Pools wurden in sowohl dem ELISA als auch Immunblot-Format, in Bezug auf die relative Reaktivität mit H37Ra-Lysat als TbL, TbM und TbH bezeichnet, (d. h., TbL = niedrigere Reaktivität, TbM = mittlere Reaktivität und TbH = hohe Reaktivität). Ein vierter Pool aus Seren von sieben Patienten mit aktiver pulmonarer Tuberkulose wurde ebenfalls verwendet. Allen Seren fehlte eine erhöhte Reaktivität mit dem rekombinanten 38 Kd M. tuberculosis H37Ra Phosphat-bindenden Protein.
Alle Pools wurden mit E. coli-Lysat prä-adsorbiert und dazu verwendet, die H37Ra- und H37Rv-Expressionsbibliotheken zu screenen, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 be schrieben. Bakteriophagen-Plaques, die immunreaktive Antigene exprimierten, wurden gereinigt. Phagemide von den Plaques wurden gerettet und die Nukleotidsequenzen der M. tuberculosis-Klone abgeleitet.
Zweiunddreißig Klone wurden gereinigt. Von diesen stellten 31 Sequenzen dar, die in menschlichem M. tuberculosis bisher nicht identifiziert wurden. Repräsentative Sequenzen der identifizierten DNA-Moleküle sind in SEQ ID Nrn. 26–51 und 105 zur Verfügung gestellt. Von diesen sind TbH-8 und TbH-8-2 (SEQ ID Nr. 105) nicht-durchgehende DNA-Sequenzen für denselben Klon und TbH-4 (SEQ ID Nr. 43) und TbH-4-FWD (SEQ ID Nr. 44) sind nicht-durchgehende Sequenzen von demselben Klon. Die Aminosäuresequenzen für die hier im folgenden als Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9 und TbH-12 angegebenen Antigene sind in den SEQ ID Nrn. 88–92 gezeigt. Der Vergleich dieser Sequenzen mit bekannten Sequenzen in der Genbank unter der Verwendung der oben angegeben Datenbanken ergab keine signifikanten Homologien zu TbH-4, TbH-8, TbH-9 und TbM-3, obwohl schwache Homologien zu TbH-9 gefunden wurden. TbH-12 wurde als homolog zu einem 34 Kd antigenen Protein gefunden, das vorher in M. tuberculosis identifiziert wurde (Acc. Nr. S28515). Tb38-1 wurde als 34 Basenpaare stromaufwärts des offenen Leserahmens für das Antigen ESAT-6 lokalisiert gefunden, das vorher in M. bovis (Acc. Nr. U34848) und M. tuberculosis (Sorensen et al., Infec. Immun. 63: 1710–1717, 1995) identifiziert wurde.
Von Tb38-1 und TbH-9 abgeleitete Sonden, die beide aus einer H37Ra-Bibliothek isoliert wurden, wurden dazu verwendet, um Klone in einer H37Rv-Bibliothek zu identifizieren. Tb38-1 hybridisierte an Tb38-1F2, Tb38-1F3, Tb38-1F5 und Tb38-1F6 (SEQ ID Nrn. 112, 113, 116, 118 und 119). (SEQ ID Nrn. 112 und 113 sind nicht-durchgehende Sequenzen von Klon Tb38-1F2.) Zwei offene Leserahmen wurden in Tb38-IF2 abgeleitet; einer entspricht Tb37FL (SEQ ID Nr. 114), der zweite, eine partielle Sequenz, kann das Homolog von Tb38-1 sein und wird Tb38-IN (SEQ ID Nr. 115) genannt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Tb38-1F3 ist in SEQ ID Nr. 117 dargestellt. Eine TbH-9-Sonde identifiziert drei Klone in der H37Rv-Bibliothek: TbH-9-FL (SEQ ID Nr. 196), der das Homolog von TbH-9 sein kann (R37Ra), TbH-9-1 (SEQ ID Nr. 108) und TbH-9-4 (SEQ ID Nr. 110), die alle eng verwandte Sequenzen mit TbH-9 sind. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für diese drei Klone sind in den SEQ ID Nrn. 107, 109 und 111 dargestellt.
Die Ergebnisse der mit Tb38-1, ESAT-6 und anderen repräsentativen Antigenen durchgeführten T-Zell-Tests sind jeweils in den Tabellen 4A, B und 5 unten dargestellt:
TABELLE 4A ERGEBNISSE VON PBMC-ZELLTEILUNG AUF REPRÄSENTATIVE ANTIGENE
TABELLE 4B ERGEBNISSE VON PBMC-INTERFERON-γ-PRODUKTION AUF REPRÄSENTATIVE ANTIGENE
TABELLE 5 ZUSAMMENFASSUNG DER T-ZELL-ANTWORTEN AUF REPRÄSENTATIVE ANTIGENE
Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl die erfindungsgemäßen M. tuberculosis-Antigene als auch ESAT-6 eine Zellteilung und/oder Interferon-γ-Produktion in T-Zellen induzieren können, die von einem M. tuberculosis-immunen Individuum abgeleitet sind. Nach dem besten Wissen der Erfinder wurde von ESAT-6 bisher nicht gezeigt, daß es menschliche Immunantworten stimuliert.
Ein Set von sechs überlappenden Peptiden, die die Aminosäuresequenz des Antigens Tb38-1 abdecken, wurde unter der Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens konstruiert. Die Sequenzen dieser Peptide, die hier im folgenden als pepl-6 bezeichnet werden, werden jeweils in den SEQ ID Nrn. 93–98 zur Verfügung gestellt. Die Ergebnisse von T-Zell-Tests unter der Verwendung dieser Peptide sind in Tabellen 6 und 7 gezeigt. Die Ergebnisse bestätigen die Existenz, und helfen dabei, T-Zell-Epitope innerhalb von Tb38-1 zu lokalisieren, die in der Lage sind, eine Zellteilung und Interferon-γ-Produktion in T-Zellen zu induzieren, die von einem M. tuberculosis-immunem Individuum abgeleitet sind.
VERGLEICHSBEISPIEL 4
REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES POLYPEPTIDS AUS TUBERCULIN GEREINIGTEM PROTEIN-DERIVAT
Ein M. tuberculosis-Polypeptid wurde aus Tuberculin gereinigtem Protein-Derivat (PPD) wie folgt isoliert.
PPD wurde präpariert wie publiziert, mit einigen Modifikationen (Seibert, F. et al., Tuberculin prified protein derivative. Preparation and analyses of a large quantity for standard. The American Review of Tuberculosis 44: 9–25, 1941).
Ein M. tuberculosis-Rv-Stamm wurde für 6 Wochen in synthetischem Medium in Rollflaschen bei 37°C wachsen gelassen. Die Flaschen, die das bakterielle Wachstum enthielten, wurden dann in Wasserdampf für 3 Stunden auf 100°C erhitzt. Die Kulturen wurden unter der Verwendung eines 0,22 μ Filters steril filtriert, und die flüssige Phase wurde unter der Verwendung einer 3 Kd Ausschlußmembran konzentriert. Die Proteine wurden einmal mit 50% Ammoniumsulfatlösung und achtmal mit 25% Ammoniumsulfatlösung ausgefällt. Die erhaltenen Proteine (PPD) wurden durch Umkehrphase-Liquid-Chromatographie (RP-HPLC) unter der Verwendung einer C18-Säule (7,8 × 300 mm; Waters, Milford, MA) in einem Biocad HPLC-System (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) fraktioniert. Die Fraktionen wurden von der Säule mit einem linearen Gradienten von 0–100% Puffer (0,1% TFA in Acetonitril) eluiert. Die Flußrate war 10 ml/Minute und wurde bei 214 nm und 280 nm verfolgt.
Sechs Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet, in PBS suspendiert und einzeln in M. tuberculosis-infizierten Meerschweinchen auf die Induktion von Hypersensitivitäts-Reaktion verzögerten Typs (DTH) getestet. Von einer Fraktion wurde gefunden, daß sie eine starke DTH-Reaktion induziert, und diese wurde anschließend weiter durch RG-HPLC auf einer Microbor-Vydac-Cl8-Säule (Kat. Nr. 218TP5115) in einem Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Modell 172 HPLC fraktioniert. Fraktionen wurden mit einem linearen Gradient von 5–100% Puffer (0,05% TFA in Acetonitril) mit einer Flußrate von 80 μl/Minute eluiert. Das Eluat wurde bei 215 nm verfolgt. Acht Fraktionen wurden gesammelt und auf die Induktion von DTH in M. tuberculosis-infizierten Meerschweinchen getestet. Von einer Fraktion wurde gefunden, daß sie eine starke DTH von ungefähr 16 mm Verhärtung induzierte. Die anderen Fraktionen induzierten keine nachweisbare DTH. Die positive Fraktion wurde einer SDS-PAGE-Gelelektrophorese unterzogen und gefunden, daß sie eine einzelne Proteinbande von ungefähr 12 Kd Molekulargewicht enthielt.
Dieses Polypeptid, hier im folgenden als DPPD bezeichnet, wurde von dem Aminoterminus unter der Verwendung eines Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Procis 492 Protein Sequencers wie oben beschrieben sequenziert, und es wurde von ihm gefunden, daß es die in SEQ ID Nr. 129 gezeigte N-terminale Sequenz aufweist. Der Vergleich dieser Sequenz mit bekannten Sequenzen in der Genbank wie oben beschrieben ergab keine bekannten Homologien. Vier Cyanogenbromid-Fragmente von DPPD wurden isoliert und es wurde von Ihnen gefunden, daß sie die in SEQ ID Nrn. 130–133 gezeigten Sequenzen aufweisen.
Die Fähigkeit des Antigens DPPD, menschliche PBMC zu stimulieren sich zu teilen und IFN-γ zu produzieren, wurde wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Wie in Tabelle 8 gezeigt, wurde von DPPD gefunden, daß es die Zellteilung stimuliert und eine Produktion von großen Mengen von IFN-γ stimuliert, mehr als die, die durch käuflich erhältliches DPPD hervorgerufen wird.
TABELLE 8 ERGEBNISSE DER ZELLTEILUNGS- UND INTERFERON-γ-TESTS AUF DPPD
BEISPIEL 5
SYNTHESE VON SYNTHETISCHEN POLYPEPTIDEN
Polypeptide können auf einem Millipor 9050-Peptid-Synthesizer unter der Verwendung von FMOC-Chemie mit HPTU (O-Benzotriazol-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat)-Aktivierung synthetisiert werden. Eine Gly-Cys-Gly-Sequenz kann an den Aminoterminus des Peptids angebracht werden, um ein Verfahren der Konjugation oder Markierung des Peptids zur Verfügung zu stellen. Das Abspalten der Peptide von dem festen Träger kann unter der Verwendung des folgenden Abspaltungsgemisches durchgeführt werden: Trifluoressigsäure : Ethandithiol : Thioanisol : Wasser : Phenol (40 : 1 : 2 : 2 : 3). Nach Abspalten für 2 Stunden können die Peptide in kaltem Methyl-t-butylether gefällt werden. Die Peptidpellets können dann in Wasser gelöst werden, das 0,1% Trifluressigsäure (TFA) enthält und vor der Reinigung durch C18-Reverse-Phase-HPLC lyophilisiert werden. Ein Gradient von 0%–60% Acetonitril (enthaltend 0,1% TFA) in Wasser (enthaltend 0,1% TFA) kann dazu verwendet werden, um die Peptide zu eluieren. Im Anschluß an die Lyophilisierung der reinen Fraktionen können die Peptide unter der Verwendung von Elektrospray-Massenspektrometrie und durch Aminosäureanalyse charakterisiert werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die durch eine DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 4 kodiert wird.
DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
Expressionsvektor, umfassend ein DNA-Molekül nach Anspruch 2.
Wirtszelle, transformiert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 3.
Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E. coli, Hefe und Säugerzellen.
Fusionsprotein, umfassend: ein Polypeptid nach Anspruch 1 und TbH9; oder ein Polypeptid nach Anspruch 1 und ESAT-6; oder ein Polypeptid nach Anspruch 1 und Ra35.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: ein Polypeptid nach Anspruch 1; ein DNA-Molekül nach Anspruch 2; oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 6; und einen physiologisch akzeptablen Träger.
Vakzin, umfassend: ein Polypeptid nach Anspruch 1; oder ein DNA-Molekül nach Anspruch 2; oder ein Fusionsprotein nach Anspruch 6; und einen nicht-spezifischen Immunantwortverstärker.
Vakzin nach Anspruch 8, wobei der nicht-spezifische Immunantwortverstärker ein Adjuvans ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung in einem Verfahren zur Induktion von protektiver Immunität in einem Patienten, wobei das Verfahren die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten umfaßt.
Vakzin nach Anspruch 8 oder 9 zur Verwendung in einem Verfahren zur Induktion von protektiver Immunität in einem Patienten, wobei das Verfahren die Verabreichung des Vakzins an einen Patienten umfaßt.
Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis von Tuberkulose in einem Patienten; wobei das Verfahren umfaßt: (a) in Kontakt bringen von dermalen Zellen eines Patienten mit einem oder mehreren Polypeptiden nach Anspruch 1; und (b) Nachweisen einer Immunantwort auf der Haut des Patienten und daraus Nachweisen von Tuberkulose in dem Patienten.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Immunantwort eine Induktion ist.
Diagnostischer Kit, umfassend: (a) ein Polypeptid nach Anspruch 1; und (b) eine Vorrichtung, die ausreichend ist, um das Polypeptid mit den dermalen Zellen eines Patienten in Kontakt zu bringen.