DE69628844T2

DE69628844T2 - Leishmania-antigene zur anwendung in der leishmaniasis therapie und diagnose

Info

Publication number: DE69628844T2
Application number: DE69628844T
Authority: DE
Inventors: G. Steven REED; Antonio Campos-Neto; R. John WEBB; C. Davin DILLON; A. Yasir SKEIKY
Original assignee: Corixa Corp
Current assignee: Corixa Corp
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2016-09-21
Also published as: PT854924E; DE69628844D1; BR9610679A; BRPI9610679B1; ES2205059T3; EP0854924A1; US6709661B1; MX9802284A; AU7242796A; EP0854924B1; ATE243750T1; WO1997011180A1; US5834592A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen und Verfahren zum Verhindern, Behandeln und Nachweisen von Leishmaniasis, und zum Stimulieren von Immunantworten bei Patienten. Die Erfindung betrifft insbesondere Polypeptide, umfassend einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens oder eine Variante davon, und Vakzine und pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend ein oder mehrere solche Polypeptide. Die Vakzine und pharmazeutischen Zusammensetzungen können z. B. zur Verhinderung und Therapie von Leishmaniasis ebenso wie zum Nachweis einer Leishmania-Infektion bei Patienten und in Blutvorräten verwendet werden.
Hintergrund der Erfindung
Leishmania-Organismen sind intrazelluläre Protozoen-Parasiten von Makrophagen, die ein breites Spektrum von klinischen Krankheiten bei Menschen und anderen Tieren, hauptsächlich Hunden, verursachen. Bei einigen Infektionen kann der Parasit für viele Jahre im Ruhezustand vorliegen. In anderen Fällen kann der Wirt eine aus einer Vielzahl von Formen der Leishmaniasis entwickeln. Zum Beispiel kann die Krankheit asymptomatisch sein oder sich als subklinische Viszeralleishmaniasis manifestieren, die durch milde Symptome von Übelkeit, Durchfall und intermittierender Hepatomegalie charakterisiert ist. Patienten mit subklinischer oder asymptomatischer Krankheit haben gewöhnlich niedrige Antikörper-Titer, was die Krankheit mit Standardtechniken schwierig nachzuweisen macht. Alternativ kann sich Leishmaniasis als eine Hautkrankheit manifestieren, die ein ernstes medizinisches Problem darstellt, aber im allgemeinen selbstbeschränkend ist, oder als eine stark zerstörerische Schleimhautkrankheit, die nicht selbstbeschränkend ist. Schließlich und am schwerwiegendsten kann sich die Krankheit als eine akute Viszeralinfektion manifestieren, die die Milz, Leber und Lymphknoten befällt, die, ohne Behandlung im allgemeinen eine tödliche Erkrankung ist. Symptome der akuten Viszeralleishmaniasis schließen Hepatosplenomegalie, Fieber, Leukopenie, Anämie und Hypergammaglobulinämie ein.
Leishmaniasis ist ein ernstes Problem in weiten Teilen der Welt, einschließlich Brasilien, China, Ostafrika, Indien und Teilen des mittleren Ostens. Die Krankheit ist ebenso in der me diteranen Region endemisch, einschließlich Südfrankreich, Italien, Griechenland, Spanien, Portugal und Nordafrika. Die Anzahl an Fällen von Leishmaniasis ist in den letzten 20 Jahren dramatisch angewachsen, und es existieren jetzt Millionen von Fällen dieser Krankheit weltweit. Ungefähr 2 Millionen neuer Fälle werden jedes Jahr neu diagnostiziert, von denen 25% Viszeralleishmaniasis sind. Es gibt jedoch keine Vakzine oder effektive Behandlungen, die gegenwärtig zur Verfügung stehen.
Eine genaue Diagnose von Leishmaniasis ist ebenso häufig schwierig zu erreichen. Es gibt 20 Spezies von Leishmania, die Menschen infizieren, einschließlich L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. tropica und L. guyanensis, und es gibt keine unterschiedlichen Zeichen oder Symptome die eindeutig die Anwesenheit einer Leishmania-Infektion anzeigen. Es sind Verfahren zum Parasitennachweis verwendet worden, aber solche Verfahren sind nicht empfindlich oder praktisch. Gegenwärtige serologische Tests (unter Verwendung von z. B. ELISA oder Immunfluoreszenztechniken) und Hauttests verwenden normalerweise ganze oder lysierte Parasiten. Solche Tests sind im allgemeinen unempfindlich, irreproduzierbar und neigen zu einer Kreuzreaktion mit einer Vielzahl von anderen Krankheiten. Zusätzlich sind die bei solchen Tests verwendeten Zubereitungen oft instabil.
Entsprechend gibt es einen Bedarf auf dem Gebiet für Impfstoffe, um Leishmaniasis in Menschen und Tieren zu verhindern, und für verbesserte therapeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Leishmaniasis. Ebenso gibt es einen Bedarf für verbesserte Verfahren zum Nachweis von Leishmania-Infektionen bei Patienten und in Blutvorräten. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse und stellt weiterhin weitere andere verwandte Vorteile bereit.
Unter einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid bereitgestellt, umfassend einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens mit der in SEQ ID NO: 2 aufgeführten Aminosäuresequenz oder eine Variante des besagten Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet und die die Fähigkeit beibehält, eine Immunantwort zu induzieren.
Unter einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes DNA-Molekül bereitgestellt, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert.
Unter einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Expressionsvektor bereitgestellt, umfassend das DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung.
Unter einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die mit dem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung transformiert oder transfiziert worden ist.
Unter einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein isoliertes Polypeptid der vorliegenden Erfindung und einen physiologisch annehmbaren Träger.
Unter einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vakzin bereitgestellt, umfassend ein isoliertes Polypeptid der vorliegenden Erfindung und einen nicht-spezifischen Immunantwort-Verstärker.
Unter einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zur Verwendung als ein Medikament bereitgestellt.
Kurz gesagt, stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verwendungen davon zum Verhindern, Behandeln und Nachweisen von Leishmaniasis ebenso wie zum Stimulieren von Immunantworten in Patienten bereit. Unter einem Aspekt werden Polypeptide bereitgestellt, umfassend wenigstens einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens oder eine Variante eines solchen Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet. In einer Ausführungsform dieses Aspekts hat das Leishmania-Antigen die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 aufgeführt ist. Ebenso wird ein Leishmania-Antigen offenbart, das die in SEQ ID NO: 4 aufgeführte Aminosäuresequenz hat. DNA-Sequenzen, die für die obigen Polypeptide kodieren, rekombinante Expressionsvektoren, umfassend diese DNA-Sequenzen, und Wirtszellen, die mit solchen Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert worden sind, werden ebenso bereitgestellt.
Unter verwandten Aspekten stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die wenigstens einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens (oder eine Variante eines solchen Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet), wie hierin beschrieben, und einen physiologisch annehmbaren Träger umfassen. Zusätzlich werden Vakzine, die wenigstens einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens (oder eine Variante eines solchen Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen) unterscheidet, wie hierin beschrieben, und einen nicht-spezifischen Immunantwort-Verstärker, bereitgestellt. In einer Ausführungsform dieser Aspekte hat das Leishmania-Antigen die in SEQ ID NO: 2 aufgeführte Aminosäuresequenz. Ein Leishmania-Antigen, das die in SEQ ID NO: 4 aufgeführte Aminosäuresequenz hat, wird ebenso offenbart.
Ebenso werden pharmazeutische Zusammensetzungen und Vakzine offenbart, die wenigstens zwei unterschiedliche Polypeptide umfassen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) einem Polypeptid, umfassend einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens mit der in SEQ ID NO: 2 aufgeführten Aminosäuresequenz oder eine Variante eines solchen Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet; (b) einem Polypeptid, umfassend einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens mit der in SEQ ID NO: 4 aufgeführten Aminosäuresequenz oder eine Variante eines solchen Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet; (c) einem Polypeptid, umfassend einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens mit der in SEQ ID NO: 6 aufgeführten Aminosäuresequenz oder eine Variante des besagten Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet; (d) einem Polypeptid, umfassend einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens mit der in SEQ ID NO: 8 aufgeführten Aminosäuresequenz oder eine Variante des besagten Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet; und (e) einem Polypeptid, umfassend einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens mit der in SEQ ID NO: 10 aufgeführten Aminosäuresequenz oder eine Variante des besagten Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet.
In anderen verwandten Ausführungsformen umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Vakzine lösliche Leishmania-Antigene.
Es werden Verfahren offenbart zum Induzieren einer schützenden Immunität gegen Leishmaniasis in einem Patienten, umfassend das Verabreichen an einen Patienten von einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Vakzins, wie oben beschrieben.
Unter weiteren Aspekten werden Verfahren offenbart und diagnostische Kits bereitgestellt zum Nachweisen einer Leishmania-Infektion in einem Patienten. Die Verfahren umfassen: (a) In-Kontakt-Bringen von Hautzellen eines Patienten mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie oben beschrieben; und (b) Nachweisen einer Immunantwort auf der Haut des Patienten, und damit Nachweisen einer Leishmania-Infektion bei dem Patienten. Die diagnostischen Kits umfassen: (a) eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie oben beschrieben; und (b) eine Vorrichtung, die es erlaubt, die pharmazeutische Zusammensetzung mit den Hautzellen eines Patienten in Kontakt zu bringen.
Es werden Verfahren zum Stimulieren einer zellulären und/oder humoralen Immunantwort bei einem Patienten offenbart, umfassend das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Vakzins, wie oben beschrieben, an einen Patienten.
Ebenso werden Verfahren zum Behandeln eines Patienten offenbart, der von einer Krankheit befallen ist, die gegenüber IL-12-Stimulation empfindlich ist, umfassend das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Vakzins, wie oben beschrieben, an einen Patienten.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die angehängten Zeichnungen offensichtlich werden. Alle hierin offenbarten Literaturstellen werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit miteinbezogen, so als ob jede einzelne individuell einbezogen worden wäre.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Stimulation der Proliferation von T-Zellen, die von L. donovaniimmunisierten BALB/c-Mäusen aus L. donovani-infizierten Makrophagen nach Inkubation für 24, 48 und 72 Stunden erhalten worden sind (dargestellt als Stimulationsindex).
2 veranschaulicht repräsentative HPLC-Profile von Peptiden, die aus MHC-Klasse-II-Molekülen von P388D1-Makrophagen isoliert worden sind. Tafel A zeigt Peptide, die aus nicht-infizierten Makrophagen isoliert worden sind, und Tafel B zeigt Peptide, die aus L. donovani-infizierten Makrophagen isoliert worden sind. Die Pfeile in Tafel B zeigen Peptid-Peaks an, die nur in der Zubereitung von infizierten Makrophagen vorhanden sind.
3 zeigt die Expression und Aufreinigung von Ldp23 als ein rekombinantes Fusionsprotein. Tafel A zeigt ein Coomassie-Blau-gefärbtes SDS-PAGE-Gel von lysierten E. coli ohne (Spur 1) und mit (Spur 2) IPTG-Induktion der Ldp23-Expression. Der Pfeil zeigt das rekombinante Fusionsprotein. Tafel B zeigt das Fusionsprotein nach Ausschneiden aus einem präparativen SDS-PAGE-Gel, Elektroelution, Dialyse gegen PBS und analytischer SDS-PAGE.
4 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von Gesamt-RNA, hergestellt aus L. donovani, L. major, L. amazonensis und L. pifanoi mit einem ³²P-markierten Ldp23-Gen. 1, 2 und 3 beziehen sich auf RNA, die von Promastigoten in der logarithmischen Wachstumsphase, Promastigoten in der stationären Wachstumsphase bzw. Amastigoten-Formen erhalten worden sind.
5 zeigt eine Western-Blot-Analyse von L. donovani-Promastigoten-Antigenen, die mit einem Prä-Immun-Kaninchenserum (Spur A) oder mit anti-Ldp23-Kaninchen-Antiserum (Spur B) inkubiert worden sind.
6 zeigt die Oberflächenexpression von Ldp23 auf lebenden L. donovani-Promastigoten. Die gepunktete Linie zeigt die indirekte Immunfluoreszenz, die bei Verwendung von Prä-Immun-Maus-Serum gezeigt wird, und die durchgezogene Linie zeigt das Ergebnis, das mit Maus-Anti-GST-Ldp23-Antiserum erhalten wird. Die Fluoreszenzintensität wurde mittels FACScan analysiert.
7 zeigt die Stimulation von Leishmania-spezifischer T-Zell-Proliferation durch Ldp23. Die Resultate werden als relative Zellzahl als eine Funktion der Fluoreszenzintensität dargestellt. T-Zellen (10⁵/Napf) wurden aus Lymphknoten von BALB/c-Mäusen aufgereinigt, die am Pfotenballen mit L. donovani-Promastigoten in CFA immunisiert worden waren, und wurden mit verschiedenen Konzentrationen des aufgereinigten rekombinanten Ldp23 in der Anwesenheit von 2 × 10⁵ Mitomycin C-behandelten normalen BALB/c-einkernigen Milzzellen kultiviert. Die Proliferation von T-Zellen wurde nach 27 Stunden Kultivierung gemessen.
Die Werte werden als cpm exprimiert und stellen den Mittelwert von [³H]TdR-Einbau von dreifachen Kulturen dar.
8 zeigt die Ldp-23-induzierte Cytokinproduktion von Lymphknotenzellen von BALB/c-Mäusen. Die Kulturen wurden mit verschiedenen Mengen von Ldp23 oder Leishmania-Lysat inkubiert, dargestellt als μg/ml, und wurden mittels ELISA auf die Produktion von Interferonγ (Tafel A) oder Interleukin-4 (Tafel B) getestet, die beide als ng/ml gezeigt werden.
9 zeigt die PCR-Amplifizierung von Cytokin-mRNAs, die aus ML-(Tafel A) und CL-(Tafel B) Patienten-PBMC vor und nach Stimulation mit repräsentativen Polypeptiden der vorliegenden Erfindung isoliert worden sind. Spuren O und – zeigen das Niveau von PCR-Produkten bei der Initiation der Kultur bzw. nach 72 Stunden Kultivierung in der Abwesenheit von zugegebenen Polypeptiden; Spuren Lb, 83a und 83b zeigen das Niveau der PCR-Produkte nach dem Kultivieren von PBMC mit L. braziliensis-Lysat, Lbhsp83a bzw. Lbhsp83b an.
10 stellt einen Vergleich der Niveaus von Interferon-γ (Tafel A) und TNF-α (Tafel B) in den Überständen von 72-stündigen PBMC-Kulturen von Leishmania-infizierten und Kontroll-Individuen in Antwort auf eine Stimulation mit Parasitenlysat oder den angezeigten Polypeptiden dar.
11 zeigt die Niveaus von IL-10 p40 (in pg/ml) im Überstand von PBMC-Kulturen von L. braziliensis-infizierten Individuen und nicht-infizierten Kontrollen 72 Stunden nach der Stimulation mit Parasiten-Promastigotenlysat (Lb), Lbhsp83a oder Lbhsp83b.
12 zeigt die Reaktivitäten von L. braziliensis-Infektionsseren von Patienten mit repräsentativen Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in einem Standard-ELISA. Die Werte werden als Extinktion bei 405 nm ausgedrückt.
13A und 13B zeigen das Niveau an sezerniertem IL-4 und IFN-γ (in pg/ml), stimuliert in Maus-Lymphknotenkulturen durch die Zugabe von repräsentativen Polypeptiden der vorliegenden Erfindung.
14 zeigt das Niveau von IFN-γ (in pg/ml), sezerniert von Leishmania-infizierten und nicht-infizierten menschlichen PBMC, stimuliert mit M15, im Vergleich mit den Niveaus, stimuliert durch L. major-Lysat und L-Rack, einem Antigen, das nicht von Leishmaniainfizierten Menschen erkannt zu werden scheint.
15 zeigt das Niveau von IFN-γ (in pg/ml), sezerniert von infizierten und nicht-infizierten menschlichen PBMC, stimuliert durch lösliche Leishmania-Antigene (S-Antigene), im Vergleich mit Niveaus, stimuliert durch L. major-Lysat und L-Rack.
16 zeigt die Proliferation von murinen Lymphknotenkulturen, stimuliert durch die Zugabe von repräsentativen Polypeptiden der vorliegenden Erfindung. Die Werte werden als cpm ausgedrückt.
17 zeigt die Proliferation von menschlichen PBMC, hergestellt aus Leishmaniaimmunen und nicht-infizierten Individuen, stimuliert durch M15, im Vergleich mit der Proliferation, die durch L. major-Lysat und L-Rack stimuliert worden ist. Die Werte werden als cpm ausgedrückt.
18 zeigt die Proliferation von menschlichen PBMC, hergestellt aus infizierten und nicht-infizierten Individuen, stimuliert durch lösliche Leishmania-Antigene, im Vergleich mit der Proliferation, stimuliert durch Kulturmedium, L. major-Lysat und L-Rack. Die Werte werden als cpm exprimiert.
19 zeigt einen Vergleich einer Lbhsp83-Sequenz mit homologen Sequenzen von L. amazonensis (Lahsp83), T. cruzi (Tchsp83) und Menschen (Huhsp89).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie oben bemerkt, ist die vorliegende Erfindung allgemein auf Zusammensetzungen und Verwendungen davon zum Verhindern, Behandeln und Nachweisen von Leishmaniasis ebenso wie zum Stimulieren von Immunantworten in Patienten gerichtet. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen Polypeptide ein, die wenigstens einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens oder eine Variante eines solchen Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vielfache Polypeptide ein, die dahingehend ausgewählt worden sind, daß sie verbesserten Schutz gegen eine Vielzahl von Leishmania-Spezies bieten.
Polypeptide innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Polypeptide, umfassend immunogene Teile von Leishmania-Antigenen mit den in SEQ ID NO: 2 aufgeführten Sequenzen (hierin bezeichnet als M15). Wie hierin verwendet, umfaßt der Begriff „Polypeptid" Aminosäureketten einer beliebigen Länge, einschließlich Proteine mit voller Länge, (d. h. Antigene), bei denen die Aminosäurereste durch kovalente Bindungen verknüpft sind. Daher kann ein Polypeptid, umfassend einen immunogenen Teil eines der obigen Antigene vollständig aus dem immunogenen Teil bestehen oder kann zusätzliche Sequenzen enthalten. Die zusätzlichen Sequenzen können aus dem nativen Leishmania-Antigen stammen oder können heterolog sein, und solche Sequenzen können (müssen aber nicht) immunogen sein. Ein Antigen „mit" einer besonderen Sequenz ist ein Antigen, das innerhalb seiner Vollängensequenz die aufgeführte Sequenz enthält. Das native Antigen kann zusätzliche Aminosequenz enthalten, muß dies aber nicht.
Ein immunogener Teil eines Leishmania-Antigens ist ein Teil, der in der Lage ist, eine Immunantwort (d. h. zellulär und/oder humoral) in einem gegenwärtig oder zuvor mit Leishmania-infizierten Patienten (wie etwa einem Menschen oder einem Hund) und/oder in Kulturen von Lymphknotenzellen oder einkernigen peripheren Blutzellen (PBMC) hervorzurufen, die aus gegenwärtig oder zuvor mit Leishmania-infizierten Individuen isoliert worden sind. Die Zellen, bei denen eine Antwort hervorgerufen wird, können eine Mischung von Zelltypen umfassen oder können isolierte Bestandteilzellen enthalten (einschließlich, aber nicht beschränkt auf T-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen, Monocyten und/oder B-Zellen). Insbesondere sind immunogene Teile in der Lage, eine T-Zell-Proliferation und/oder eine Cytokin-Antwort überwiegend vom Thl-Typ (z. B. IL-2, IFN-γ, und/oder TNF-α-Produktion durch T-Zellen und/oder NK-Zellen, und/oder IL-12-Produktion durch Monocyten, Makrophagen und/oder B-Zellen) hervorzurufen. Immunogene Teile der hierin beschriebenen Antigene können im allgemeinen unter Verwendung von Techniken, die für Fachleute auf dem Gebiet bekannt sind, identifiziert werden, wie etwa die hierin bereitgestellten repräsentativen Verfahren.
Die Zusammensetzungen und ihre Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ebenso Varianten der obigen Polypeptide. Eine „Variante", wie hierin verwendet, ist ein Polypeptid, das sich von dem nativen Antigen nur hinsichtlich konservativer Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet, so daß die Fähigkeit des Polypeptids, eine Immunantwort zu induzieren, beibehalten wird. Solche Varianten können im allgemeinen identifiziert werden, indem man eine der obigen Polypeptid-Sequenzen modifiziert und die immunogenen Eigenschaften des modifizierten Polypeptids bewertet unter Verwendung von z. B. den hierin beschriebenen repräsentativen Prozeduren.
Eine „konservative Substitution" ist eine, bei der eine Aminosäure gegen eine andere Aminosäure ausgetauscht wird, die ähnliche Eigenschaften hat, so daß ein Fachmann auf dem Gebiet der Peptid-Chemie erwarten würde, daß die Sekundärstruktur und Hydropathie-Eigenschaften des Polypeptids im wesentlichen unverändert bleiben. Im allgemeinen stellen die folgenden Gruppen von Aminosäuren konservative Veränderungen dar: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; und (5) Phe, Tyr, Trp, His.
Varianten können ebenso (oder alternativ) beispielsweise durch die Deletion oder Hinzufügung von Aminosäuren modifiziert sein, die einen minimalen Einfluß auf die immunogenen Eigenschaften, Sekundärstruktur und Hydropathie-Eigenschaften des Polypeptids haben. Zum Beispiel kann ein Polypeptid an eine Signal- (oder Leader-)Sequenz am N-terminalen Ende des Proteins konjugiert sein, die den Transfer des Proteins co-translational oder posttranslational steuert. Das Polypeptid kann ebenso an einen Linker oder eine andere Sequenz konjugiert sein, um die Synthese, Aufreinigung oder Identifizierung des Polypeptids zu erleichtern (z. B. Poly-His), oder um die Bindung des Polypeptids an einen festen Träger zu verbessern. Zum Beispiel kann ein Polypeptid an eine Immunglobulin-Fc-Region konjugiert sein.
„Polypeptide", wie hierin beschrieben, schließen ebenso Kombinationspolypeptide ein. Ein „Kombinationspolypeptid" ist ein Polypeptid, umfassend wenigstens einen der obigen immunogenen Teile und eine oder mehrere zusätzliche immunogene Leishmania-Sequenzen, die über eine Peptidbindung zu einer einzelnen Aminosäurekette verknüpft sind. Die Sequenzen können direkt verknüpft sein (d. h. ohne dazwischenliegende Aminosäuren) oder können mittels einer Linker-Sequenz (z. B. Gly-Cys-Gly) verknüpft sein, die die immunogenen Eigenschaften der bestandteiligen Polypeptide nicht signifikant verringern.
Im allgemeinen haben Leishmania-Antigene immunogene Eigenschaften, und die DNA-Sequenzen, die für solche Antigene kodieren, können mittels einer beliebigen aus einer Vielzahl von Prozeduren aus einer oder mehreren Leishmania-Spezies hergestellt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: L. donovani, L. chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. tropica und L. guyanensis. Solche Spezies sind z. B. von ATCC, Rockville, MD, erhältlich. Zum Beispiel können Peptide, die aus MHC-Klasse-II-Molekülen von mit einer Leishmania-Spezies infizierten Makrophagen isoliert worden sind, verwendet werden, um die entsprechenden Leishmania-Spender-Antigene zu gewinnen. MHC-Klasse-II-Moleküle werden hauptsächlich von Zellen des Immunsystems, einschließlich Makrophagen, exprimiert. Diese Moleküle präsentieren Peptide, die gewöhnlich 13–17 Aminosäuren lang sind, von fremden Antigenen stammend, die in zellulären Vesikeln abgebaut werden. Die gebundenen Peptidantigene werden dann durch CD4-T-Zellen erkannt. Entsprechend können fremde Peptide, die aus MHC-Klasse-II-Molekülen von beispielsweise Leishmania-infizierten murinen Makrophagen isoliert worden sind, verwendet werden, um immunogene Leishmania-Proteine zu identifizieren.
Kurz gesagt, können Peptide, die aus Leishmania-Antigenen stammen, isoliert werden, indem man das Umkehrphasen-HPLC-Profil von aus infizierten Makrophagen extrahierten Peptiden mit dem Profil von aus nicht-infizierten Zellen extrahierten Peptiden vergleicht. Peptide, die unterscheidbare HPLC-Peaks verursachen, die für infizierte Makrophagen einzigartig sind, können dann z. B. unter Verwendung von Edman-Chemie sequenziert werden, wie beschrieben in Edman und Berg, Eur J. Biochem, 80: 116–132 (1967). Ein DNA-Fragment, das einem Teil eines Leishmania-Gens entspricht, das für das Peptid kodiert, kann dann aus einer Leishmania-cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines Oligonukleotid-Sense-Primers, der aus der Peptid-Sequenz abgeleitet wird, und eines Oligo-dT-Antisense-Primers amplifiziert werden. Das resultierende DNA-Fragment kann dann als eine Sonde verwendet werden, um eine Leishmania-Bibliothek auf einen Vollängen-cDNA- oder genomischen Klon zu screenen, der für das Leishmania-Antigen kodiert. Solche Screens können im allgemeinen durchgeführt werden unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten wohlbekannt sind, wie etwa diejenigen, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind.
Dieser Ansatz kann verwendet werden, um ein 23 kD-Antigen aus Leishmania donovani zu identifizieren (hierin bezeichnet als Ldp23). Die Sequenz eines DNA-Moleküls, das für Ldp23 kodiert, wird in SEQ ID NO: 3 bereitgestellt, und die Aminosäuresequenz aus Ldp23 wird in SEQ ID NO: 4 bereitgestellt. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren ist gezeigt worden, daß Ldp23 eine Thl-Immunantwort in T-Zellen induziert, die aus Leishmania-infizierten Mäusen hergestellt worden sind.
Alternativ kann eine Leishmania-cDNA- oder genomische Expressionsbibliothek mit Serum von einem Leishmania-infizierten Individuum unter Verwendung von für Fachleute bekannten Techniken gescreent werden. DNA-Moleküle, die für reaktive Antigene kodieren, können dann verwendet werden, um das rekombinante Antigen zur Aufreinigung zu exprimieren. Die immunogenen Eigenschaften der aufgereinigten Leishmania-Antigene können dann unter Verwendung von bspw. den hierin beschriebenen repräsentativen Phasen bewertet werden.
Zum Beispiel können Seren von Leishmania-infizierten Mäusen verwendet werden, um eine cDNA-Bibliothek, die aus Leishmania-Amastigoten hergestellt worden ist, zu screenen. Reaktive Klone können dann exprimiert werden und rekombinante Proteine auf die Fähigkeit getestet werden, T-Zellen oder NK-Zellen zu stimulieren, die aus Leishmania-immunen Individuen stammen (d. h. Individuen, die Anzeichen einer Infektion aufweisen, dokumentiert anhand positiver serologischer Reaktivität mit Leishmania-spezifischen Antikörpern und/oder einer Leishmania-spezifischen DTH-Antwort, ohne klinische Symptome von Leishmaniasis). Diese Prozedur kann verwendet werden, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu erhalten, das für das als M15 bezeichnete Leishmania-Antigen kodiert. Die Sequenz eines solchen DNA-Moleküls wird in SEQ ID NO: 1 bereitgestellt, und die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins wird in SEQ ID NO: 2 bereitgestellt.
Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um ein genomisches DNA-Molekül zu isolieren, das für ein immunogenes Leishmania braziliensis-Antigen kodiert, das hierin als Lbhsp83 bezeichnet wird. Genauer kann ein genomischer Klon, der für Lbhsp83 kodiert, durch Screenen einer L. braziliensis-Expressionsbibliothek mit Seren von einem Leishmania-infizierten Individuum isoliert werden. Die DNA, die für Lbhsp83 kodiert, ist homolog zu dem Gen, das für das eukaryotische 83 kD-Hitzeschockprotein kodiert. Die Sequenz eines DNA-Moleküls, das für nahezu das gesamte Lbhsp83 kodiert, wird in SEQ ID NO: 5 dargestellt, und die kodierte Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 6 bereitgestellt. Unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren ist gefunden worden, daß Lbhsp83 die Proliferation und ein gemischtes Thl- und Th2-Cytokinprofil in PBMC, isoliert aus L. braziliensis-infizierten Patienten, stimuliert. Entsprechend ist Lbhsp83 ein immunogenes Leishmania-Antigen. Es ist gefunden worden, daß Regionen von Lbhsp83, die nicht innerhalb des Säugetiergens konserviert sind, besonders potent für eine T-Zell-Stimulation und Antikörperbindung sind. Solche Regionen können beispielsweise mittels visueller Inspektion des in 19 bereitgestellten Sequenzvergleichs identifiziert werden.
Dieser Ansatz kann ebenso verwendet werden, um ein DNA-Molekül zu isolieren, das für ein 210 kD-immunogenes L. tropica-Antigen kodiert, hierin bezeichnet als Lt-210. Die Zubereitung und Charakterisierung von Lt-210 sowie die immunogenen Teile davon (etwa wie Lt-1 und immunogene Repeat- und Nicht-Repeat-Sequenzen) wird im Detail in US-Patent Anmeldungs-Nr. 08/511,872, eingereicht am 4. August 1995, beschrieben. Die Sequenz eines DNA-Moleküls, das für Lt-1 kodiert, wird in SEQ ID NO: 7 bereitgestellt, und die kodierte Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 8 dargestellt.
Der obige Ansatz kann weiterhin verwendet werden, um ein DNA-Molekül zu isolieren, das für ein L. braziliensis-Antigen kodiert, das hierin als LbeIF4A bezeichnet wird. In Kürze, ein solcher Klon kann durch Screenen einer L. braziliensis-Expressionsbibliothek mit Seren, die von einem Patienten, der von Schleimhaut-Leishmaniasis betroffen ist, und durch Analysieren der reaktiven Antigene auf die Fähigkeit, proliferative Antworten und eine bevorzugte Thl-Cytokin-Produktion in PBMC, isoliert aus Leishmania-infizierten Patienten, wie unten beschrieben, zu stimulieren, isoliert werden. Die Zubereitung und Charakterisierung von LbeIF4A wird im Detail in US-Patentanmeldungs-Nr. 08/454,036 und 08/488,386 beschrieben, die Continuations-in-part-Anmeldungen der US-Patentanmeldung Nr. 08/232,534 sind, eingereicht am 22. April 1994. Die Sequenz eines DNA-Moleküls, das für LbeIF4A kodiert, wird in SEQ ID NO: 9 bereitgestellt, und die kodierte Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 10 dargestellt. Homologe von LbeIF4A, wie diejenige, die in L. major gefunden wird, können ebenso unter Verwendung dieses Ansatzes isoliert werden und liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenso oder alternativ lösliche Leishmania-Antigene enthalten. Wie hierin verwendet, bezeichnet „lösliche Leishmania-Antigene" eine Mischung von wenigstens 8 unterschiedlichen Leishmania-Antigenen, die aus dem Überstand von Leishmania-Promastigoten einer beliebigen Spezies isoliert werden können, die für 8–12 Stunden in Protein-freiem Medium wachsen gelassen wurde. In Kürze, die Organismen werden bis zur späten Log-Phase in komplexem Medium mit Serum wachsen gelassen, bis sie eine Dichte von 2–3 × 10⁷ lebensfähigen Organismen pro ml Medium erreichen. Die Organismen werden sorgfältig gewaschen, um Medienbestandteile zu entfernen, und als 2–3 × 10⁷ lebensfähige Organismen pro ml definiertem Serum-freien Medium resuspendiert, das aus gleichen Teilen RPMI 1640 und Medium 1999 besteht, beide von Gibco BRL, Gaithersburg, MD. Nach 8–12 Stunden wird der Überstand, enthaltend lösliche Leishmania-Antigene entfernt, 10-fach aufkonzentriert und gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung für 24 Stunden dialysiert. Die Anwesenheit von wenigstens 8 unterschiedlichen Antigenen innerhalb der Mischung der Leishmania-Antigene kann unter Verwendung von SDS-PAGE bestätigt werden (d. h. durch die Beobachtung von wenigstens 8 unterschiedlichen Banden). Die immunogenen Eigenschaften der löslichen Leishmania-Antigene kann durch Bewerten der Fähigkeit der Zubereitung bestätigt werden, eine Immunantwort in Kulturen von Lymphknotenzellen und/oder einkernigen Peripher-Blutzellen (PBMC) hervorzurufen, die aus gegenwärtig oder zuvor mit Leishmania infizierten Individuen isoliert worden sind. Eine solche Bewertung kann durchgeführt werden, wie unten beschrieben.
Unabhängig von dem Zubereitungsverfahren, sind die hierin beschriebenen Antigene immunogen. In anderen Worten, die Antigene (und immunogenen Teile davon) sind in der Lage, eine Immunantwort in Kulturen von Lymphknotenzellen und/oder einkernigen Peripherblutzellen (PBMC) hervorzurufen, die aus gegenwärtig oder zuvor mit Leishmania infizierten Individuen isoliert worden sind. Genauer haben die Antigene und immunogenen Teile davon die Fähigkeit, eine T-Zell-Proliferation zu induzieren und/oder eine Cytokinantwort überwiegend vom Thl-Typ hervorzurufen (z. B. IL-2, IFN-γ und/oder TNF-α-Produktion von T-Zellen und/oder NK-Zellen; und/oder IL-12-Produktion durch Monocyten, Makrophagen und/oder B-Zellen) in Zellen, die aus gegenwärtig oder zuvor mit Leishmania-infizierten Individuen isoliert worden sind. Ein mit Leishmania infiziertes Individuum kann durch eine Form der Leishmaniasis betroffen sein (wie etwa subklinisch, kutan, Schleimhaut oder aktiv viszeral) oder kann asymptomatisch sein. Solche Individuen können unter Verwendung von Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, identifiziert werden. Individuen mit Leishmaniasis können auf der Grundlage von klinischen Ergebnissen identifiziert werden, die mit wenigstens einem der Folgenden assoziiert sind. Isolierung des Parasiten aus Läsionen, ein positiver Hauttest mit Leishmania-Lysat oder ein positiver serologischer Test. Asymptomatische Indi viduen sind infizierte Individuen, die keine Zeichen oder Symptome der Krankheit haben, aber solche Individuen können auf der Grundlage eines positiven serologischen Tests und/oder eines Hauttests mit Leishmania-Lysat identifiziert werden.
Der Begriff „PBMC", der sich auf eine Zubereitung von kernhaltigen Zellen bezieht, die in Peripherblut vorhanden sind, umfaßt sowohl Mischungen von Zellen und Zubereitungen von einem oder mehreren aufgereinigten Zelltypen. PBMC können mittels Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, isoliert werden. Zum Beispiel können PBMC mittels mittels Dichtezentrifugation durch bspw. Ficoll^TM (Winthrop Laboratories, New York) isoliert werden. Lymphknotenkulturen können im allgemeinen durch Immunisieren von BALB/c-Mäusen (z. B. im hinteren Pfotenballen) mit Leishmania-Promastigoten hergestellt werden, emulgiert in vollständigem Freund'schen Adjuvans. Die drainierenden Lymphknoten können nach einer Immunisierung herausgeschnitten werden, und die T-Zellen können in einer Anti-Maus-Ig-Säule aufgereinigt werden, um die B-Zellen zu entfernen, gefolgt von einer Passage durch eine Sephadex-G10-Säule, um die Makrophagen zu entfernen. In ähnlicher Weise können Lymphknotenzellen aus einem Menschen nach Biopsie oder chirurgischer Entfernung eines Lymphknotens isoliert werden.
Die Fähigkeit eines Polypeptids (z. B. eines Leishmania-Antigens oder eines Teils oder anderen Variante davon), eine Antwort in PBMC oder Lymphknotenzellkulturen zu induzieren, kann bewertet werden, indem man die Zellen mit dem Polypeptid in Kontakt bringt und eine geeignete Antwort mißt. Im allgemeinen liegt die Menge an Polypeptid, die für die Bewertung von ungefähr 2 × 10⁵ Zellen ausreicht, ungefähr im Bereich von 10 ng bis ungefähr 100 μg, und ist bevorzugt ungefähr 1–10 μg. Die Inkubation des Polypeptids mit Zellen wird typischerweise bei 37°C für ungefähr 1–3 Tage durchgeführt. Nach der Inkubation mit Polypeptid werden die Zellen auf eine geeignete Antwort getestet. Wenn die Antwort eine proliferative Antwort ist, kann eine aus einer Vielzahl von für Fachleute auf dem Gebiet wohlbekannten Techniken verwendet werden, z. B. können die Zellen einem Puls von radioaktivem Thymidin ausgesetzt werden, und der Einbau an Markierungen in zelluläre DNA wird gemessen. Im allgemeinen wird ein Polypeptid, das zu wenigstens einer dreifachen Steigerung der Proliferation gegenüber dem Hintergrund führt (d. h. der Proliferation, die für Zellen beobachtet wird, welche ohne Polypeptid kultiviert werden), als in der Lage angesehen, Proliferation zu induzieren.
Alternativ kann die zu messende Antwort die Sezernierung von einem oder mehreren Cytokinen (wie etwa Interferon-γ (IFN-γ), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-12 (p70 und/oder p40), Interleukin-2 (IL-2) und/oder Tumornekrosefaktor-α (TNF-α)) oder das Niveau von mRNA, die für ein mehrere spezifische Cytokine kodiert, sein. Insbesondere weist die Sezernierung von Interferon-γ, Interleukin-2, Tumornekrosefaktor-α und/oder Interleukin-12 auf eine Thl-Antwort hin, die für den schützenden Effekt gegen Leishmania verantwortlich ist. Assays auf ein beliebiges der obigen Cytokine können im allgemeinen durchgeführt werden unter Verwendung von Verfahren, die für Fachleute auf dem Gebiet bekannt sind, wie etwa eines Enzym-verknüpften immunosorbierenden Assay (ELISA). Geeignete Antikörper zur Verwendung in solchen Assays können von einer Vielzahl von Quellen erhalten werden, wie etwa Chemicon, Temucula, CA and PharMingen, San Diego, CA, und können im allgemeinen gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. Das Niveau an mRNA, die für ein oder mehrere spezifische Cytokine kodiert, kann bspw. mittels Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bewertet werden. Im allgemeinen wird ein Polypeptid, das in der Lage ist, in einer Zubereitung von ungefähr 1–3 × 10⁵ Zellen die Produktion von 30 pg/ml von IL-12, IL-4, IFN-γ, TNF-α oder IL-12 p40 oder 10 pg/ml von IL-12 p70 zu induzieren, als in der Lage angesehen, die Produktion eines Cytokins zu stimulieren.
Immunogene Teile der hierin beschriebenen Antigene können unter Verwendung von wohlbekannten Techniken hergestellt und identifiziert werden, wie etwa denjenigen, die in Paul, Fundamental Immunology, 3^rd ed., 243–247 (Rauen Press, 1993) und darin zitierten Literaturangaben zusammengefaßt sind. Solche Techniken schließen das Screenen von Polypeptiden, die aus dem nativen Antigen stammen, auf Immunogene Eigenschaften unter Verwendung von bspw. den hierin beschriebenen repräsentativen Techniken ein. Ein immunogener Teil eines Polypeptids ist ein Teil, der in solchen repräsentativen Assays eine Immunantwort erzeugt (z. B. Proliferation und/oder Cytokinproduktion), die im wesentlichen derjenigen ähnlich ist, die durch das Antigen voller Länge erzeugt wird. In anderen Worten kann ein immunogener Teil eines Antigens wenigstens ungefähr 25% und bevorzugt wenigstens ungefähr 50% der Antwort erzeugen, die durch das Antigen voller Länge in den hierin beschriebenen Modell-Assays erzeugt wird.
Teile und andere Varianten von immunogenen Leishmania-Antigenen können mittels synthetischer oder rekombinanter Mittel erzeugt werden. Synthetische Polypeptide, die weniger als ungefähr 100 Aminosäuren und im allgemeinen weniger als ungefähr 50 Aminosäuren haben, können unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, erzeugt werden. Zum Beispiel können solche Polypeptide unter Verwendung einer der kommerziell erhältlichen Festphasentechniken synthetisiert werden, wie etwa der Merrifield-Festphasensynthese-Methode, bei der Aminosäuren sequentiell an eine wachsende Aminosäurenkette hinzugefügt werden. Siehe Merrifield, J. Am. Chem. 85: 2149–2146, 1963. Eine Ausrüstung für die automatisierte Synthese von Polypeptiden ist kommerziell erhältlich von Herstellern, wie etwa Applied BioSystems, Inc., Foster City, CA, und kann gemäß den Anweisungen des Herstellers betrieben werden.
Rekombinante Polypeptide, die Teile und/oder Varianten eines nativen Antigens enthalten, können in leichter Weise von einer DNA-Sequenz, die für das Antigen kodiert, hergestellt werden. Zum Beispiel können Überstände von geeigneten Wirt/Vektorsystemen, die rekombinantes Protein in Kulturmedium sezernieren, zuerst aufkonzentriert werden unter der Verwendung eines kommerziell erhältlichen Filters. Nach dem Aufkonzentrieren kann das Konzentrat auf eine geeignete Aufreinigungsmatrix, wie etwa eine Affinitätsmatrix oder ein Ionenaustauschharz aufgetragen werden. Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-HPLC-Schritte verwendet werden, um ein rekombinantes Protein weiter aufzureinigen.
Im allgemeinen kann ein beliebiger aus einer Vielzahl von Expressionsvektoren, die für Fachleute auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden, um rekombinante Polypeptide dieser Erfindung zu exprimieren. Die Expression kann in einer geeigneten Wirtszelle erzielt werden, die mit einem Expressionsvektor, enthaltend ein DNA-Molekül, das für ein rekombinantes Polypeptid kodiert, transformiert oder transfiziert worden ist. Geeignete Wirtszellen schließen Prokaryoten, Hefe und höhere eukaryotische Zellen ein. Bevorzugt sind die verwendeten Wirtszellen E. coli, Hefe oder eine Säugetierzellinie, wie etwa COS oder CHO. Die DNA-Sequenzen, die auf diese Weise exprimiert worden sind, können für natürlich vorkommende Antigene, Teile von natürlich vorkommenden Antigenen oder andere Varianten davon kodieren. Zum Beispiel können Varianten eines nativen Antigens im allgemeinen unter Verwendung von Standard-Mutagenese-Techniken, wie etwa Oligonukleotid-gesteuerte ortsspezifische Mutagenese hergestellt werden, und Abschnitte der DNA-Sequenz können entfernt werden, um die Herstellung von trunkierten Polypeptiden zu ermöglichen.
Unter bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung, die im einzelnen unten beschrieben wird, können die Polypeptide und/oder löslichen Leishmania-Antigene in pharmazeutische Zusammensetzungen oder Vakzine eingebaut werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen ein oder mehrere Polypeptide, von denen jedes eine oder mehrere der obigen Sequenzen (oder Varianten davon) und einen physiologisch annehmbaren Träger enthalten. Vakzine umfassen ein oder mehrere der obigen Polypeptide und einen nicht-spezifischen Immunantwort-Verstärker, wie etwa ein Adjuvans (z. B. LbeIF4A, Interleukin-12 oder andere Cytokine) oder ein Liposom (in welches das Polypeptid eingebaut ist). Vakzine können zusätzlich ein Abgabevehikel, wie etwa eine bioabbaubare Mikrosphäre (offenbart z. B. in US-Patent Nr. 4,897,268 und 5,075,109) enthalten. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Vakzine innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung können ebenso andere Leishmania-Antigene enthalten, die entweder in ein Kombinationspolypeptid eingebaut sind oder innerhalb eines oder mehrerer separater Polypeptide vorliegen.
Alternativ kann ein Vakzin DNA enthalten, die für ein oder mehrere der oben beschriebenen Polypeptide kodiert, so daß das Polypeptid in situ erzeugt wird. In solchen Vakzinen kann die DNA innerhalb eines aus einer Vielzahl von Abgabesystemen vorliegen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich Nukleinsäureexpressionssystemen, Bakterien und viralen Expressionssystemen. Geeignete Nukleinsäureexpressionssysteme enthalten die notwendigen DNA-Sequenzen zur Expression im Patienten (wie etwa ein geeigneter Promoter und ein Terminationssignal). Bakterielle Abgabesysteme beinhalten die Verabreichung eines Bakteriums (wie etwa eines Bacillus-Calmette-Guerrin), das einen immunogenen Teil des Polypeptids auf seiner Zelloberfläche exprimiert. Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA unter Verwendung eines viralen Expressionssystems eingeführt werden (z. B. Vaccinia oder ein anderer Pockenvirus, Retrovirus oder Adenovirus), was die Verwendung eines nicht-pathogenen (defektiven), Replikations-kompetenten Virus beinhalten kann. Techniken zum Einbau von DNA in solchen Expressionssystemen sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Die DNA kann ebenso „nackt" sein, wie z. B. in Ulmer et al., Science 259: 1745–1749 (1993) beschrieben und in einem Übersichtsartikel von Cohen, Science 259: 1691–1692 (1993) behandelt. Die Aufnahme von nackter DNA kann durch Auftragen der DNA auf bioabbaubare Kügelchen erhöht werden, die in effizienter Weise in die Zellen transportiert werden.
Während ein jeglicher geeigneter Träger, der Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, bei den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden kann, wird die Art des Trägers in Abhängigkeit von dem Verabreichungsmodus variieren. Für eine parente rale Verabreichung, wie etwa subkutane Injektion, umfaßt der Träger bevorzugt Wasser, Salzlösung, Alkohol, ein Fett, ein Wachs oder einen Puffer. Für die orale Verabreichung kann ein jeglicher der obigen Träger oder ein fester Träger wie etwa Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Zellulose, Glukose, Saccharose und Magnesiumcarbonat, verwendet werden. Bioabbaubare Mikrosphären (z. B. Polymilchsäuregalactid) können ebenso als Träger für die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden. Geeignete bioabbaubare Mikrosphären werden z. B. in US-Patent Nr. 4,897,268 und 5,075,109 offenbart.
Eins aus einer Vielzahl von Adjuvantien können in den Vakzinen dieser Erfindung verwendet werden, um die Immunantwort unspezifisch zu verstärken. Die meisten Adjuvantien enthalten eine Substanz, die darauf angelegt ist, das Antigen vor raschem Abbau zu schützen, wie etwa Aluminiumhydroxid oder Mineralöl, und einen unspezifischen Stimulator für Immunantworten, wie etwa Lipid A, Bordella pertussis oder Mycobacterium tuberculosis. Geeignete Adjuvantien sind kommerziell erhältlich als z. B. Freund'sches unvollständiges Adjuvans und vollständiges Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI), Merck Adjuvans 65 (Merck and Company, Inc. Rahway, NJ), Alaun, bioabbaubare Mikrosphären, Monophosphoryl-Lipid A und Quil A. Bevorzugte Adjuvantien schließen LbeIF4A, IL-12 und andere Cytokine, wie etwa IFN-γ oder Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) ein. Aufgrund seiner Fähigkeit, eine exklusive Thl-Immunantwort zu induzieren, ist die Verwendung von LbeIF4A und Varianten davon als ein Adjuvans in den Vakzinen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vielfache Polypeptide ein, die so ausgewählt sind, daß sie für einen verbesserten Schutz gegen eine Vielzahl von Leishmania-Spezies sorgen. Solche Polypeptide können auf der Grundlage der Ursprungsspezies des nativen Antigens oder auf Grundlage eines hohen Konservierungsgrades an Aminosäuresequenz unter unterschiedlichen Spezies von Leishmania ausgewählt werden. Eine Kombination einzelner Polypeptide kann als ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Vakzin besonders effektiv sein, da (1) die Stimulation der Proliferation und/oder Cytokinproduktion durch individuelle Peptide additiv sein kann, (2) die Stimulation der Proliferation und/oder Cytokinproduktion durch individuelle Polypeptide synergistisch sein kann, (3) individuelle Polypeptide Cytokinprofile auf eine solche Weise stimulieren können, daß sie einander komplementieren, und/oder (4) individuelle Polypeptide zueinander komplementär sein können, wenn bestimmte von ihnen in größerem Überschuß auf der individuellen Spezies oder dem Stamm von Leishmania exprimiert werden, die/der für die Infektion verantwortlich ist. Eine bevorzugte Kombination enthält Polypeptide, die immunogene Teile von M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 und LbelF4A umfassen. Alternativ oder zusätzlich kann die Kombination lösliche Leishmania-Antigene umfassen.
Die obigen pharmazeutischen Zusammensetzungen und Vakzine können z. B. verwendet werden, um eine schützende Immunität gegen Leishmania in einem Patienten zu induzieren, wie etwa einem Menschen oder einem Hund, um Leishmaniasis zu verhindern. Geeignete Dosen und Verfahren zur Verabreichung für diese Zwecke werden im Detail unten beschrieben.
Die hierin beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen und Vakzine können ebenfalls verwendet werden, um eine Immunantwort in einem Patienten zu stimulieren, die zellulär und/oder humoral sein kann. Für Leishmania-infizierte Patienten schließen die Immunantworten, die erzeugt werden können, eine präferientielle Thl-Immunantwort (d. h. eine Antwort, die durch die Produktion der Cytokine Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-12 und/oder Interferon-γ ebenso wie von Tumornekrosefaktor-α charakterisiert ist) ein. Für nicht-infizierte Patienten kann die Immunantwort die Produktion von Interleukin-12 und/oder Interleukin-2 oder die Stimulation der gamma-delta-T-Zellen sein. In beiden Patientenkategorien kann die stimulierte Antwort IL-12 Produktion einschließen. Solche Antworten können ebenso in biologischen Proben von PBMC oder Bestandteilen davon hervorgerufen werden, die aus Leishmania-infizierten oder nicht-infizierten Individuen stammen. Wie oben bemerkt, können Assays für jedes der obigen Cytokine im allgemeinen unter Verwendung von Verfahren durchgeführt werden, die für Fachleute auf dem Gebiet bekannt sind, wie etwa ein Enzym-veknüpfter Immunosorbens-Assay (ELISA).
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen und Vakzine zur Verwendung in diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung sind diejenigen, die wenigsten ein Polypeptid enthalten, umfassend einen immunogenen Teil von LbeIF4A (oder eine Variante davon), M15, lösliche Leishmania-Antigene und/oder Ldp23 (oder eine Variante davon). Polypeptide, umfassend einen immunogenen Teil von Lbhsp83 und/oder Lt-1 können ebenso verwendet werden, in Kombination mit einem Polypeptid, das wenigstens einen immunogenen Teil von LbeIF4A enthält. Bevorzugt sind die Polypeptide, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen und Vakzinen verwendet werden, komplementär, wie oben beschrieben. Eine besonders be vorzugte Kombination enthält Polypeptide, die immunogene Teile von M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 und LbeIF4A umfassen. Lösliche Leishmania-Antigene, mit oder ohne zusätzliche Polypeptide, können ebenso verwendet werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen und hierin beschriebenen Vakzine können ebenso verwendet werden, um einen Patienten zu behandeln, der von einer Krankheit betroffen ist, die auf eine IL-12-Stimulation eine Reaktion zeigt. Der Patient kann jedes warmblütige Tier sein, wie etwa ein Mensch oder ein Hund. Solche Krankheiten schließen Infektionen (die z. B. bakteriell, viral oder durch Protozon verursacht sein können) oder Krankheiten, wie etwa Krebs, ein. In einer Ausführungsform ist die Krankheit Leishmaniasis, und der Patient kann klinische Symptome aufweisen oder kann asymptomatisch sein. Im allgemeinen kann die Empfindlichkeit einer jeweiligen Krankheit gegenüber der Stimulation mit IL-12 bestimmt werden, indem man den Effekt einer Behandlung mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder Vakzin der vorliegenden Erfindung auf klinische Immunitätskorrelate bewertet. Zum Beispiel zeigt, wenn die Behandlung zu einer erhöhten Thl-Antwort oder die Umwandlung eines Th2- in ein Th1-Profil führt, mit einer einhergehenden klinischen Verbesserung bei dem behandelten Patienten, die Krankheit gegenüber IL-12-Stimulation eine Reaktion. Die Polypeptid-Verabreichung kann, wie unten beschrieben, stattfinden oder kann sich über eine längere Zeitperiode erstrecken, abhängig von der Indikation. Bevorzugt sind die bei den pharmazeutischen Zusammensetzungen und Vakzinen verwendeten Polypeptide komplementär, wie oben beschrieben. Eine besonders bevorzugte Kombination enthält Polypeptide, die immunogene Teile von M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1 undLbeIF4A umfassen. Lösliche Leishmania-Antigene mit oder ohne zusätzliche Polypeptide können ebenso verwendet werden.
Verabreichungsrouten und -Häufigkeit, ebenso wie die Dosierung für die obigen Aspekte der vorliegenden Erfindung werden von Individuum zu Individuum varrieren und können parallel zu denen verlaufen, die gegenwärtig bei der Immunisierung gegen andere Infektionen verwendet werden, einschließlich Protozoen-verursachte, virale und bakterielle Infektionen. Im allgemeinen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Vakzine durch Injektion (intrakutan, intramuskulär, intravenös oder subkutan), intranasal (z. B. durch Aspiration) oder oral verabreicht werden. Zwischen 1 und 12 Dosen können über eine 1-Jahresperiode verabreicht werden. Für die therapeutische Impfung (d. h. Behandlung eines infizierten Individuums) werden 12 Dosen in einmonatigen Intervallen bevorzugt verabreicht. Für die prophylak tische Verwendung werden 3 Dosen in 3-monatigen Intervallen bevorzugt verabreicht. In jedem Falle können Booster-Impfungen danach periodisch gegeben werden. Andere Protokolle können für einzelne Patienten geeignet sein. Eine geeignete Dosis ist eine Menge an Polypeptid oder DNA, die bei Verabreichung, wie oben beschrieben, in der Lage ist, eine Immunantwort in einem immunisierten Patienten hervorzurufen, die ausreicht, um den Patienten vor Leishmaniasis für wenigstens 1–2 Jahre zu schützen. Im allgemeinen liegt die Menge an Polypeptiden, die in einer Dosis vorhanden ist (oder in situ durch die DNA in einer Dosis erzeugt wird), im Bereich von ungefähr 100 ng bis ungefähr 1 mg pro kg Wirt, typischerweise von ungefähr 10 μg bis ungefähr 100 μg. Geeignete Dosierungsgrößen werden mit der Größe des Patienten variieren, werden aber typischerweise im Bereich von ungefähr 0,1 ml bis ungefähr 5 ml liegen.
Unter einem anderen Aspekt werden Verfahren offenbart zum Verwenden von einem oder mehreren der oben beschriebenen Polypeptide, um eine Leishmania-Infektion in einem Patienten unter Verwendung eines Hauttests zu diagnostizieren: Wie hierin verwendet, ist ein „Hauttest" jeder Test, der direkt auf einem Patienten durchgeführt wird, bei dem eine Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH) (wie etwa eine Induration und begleitende Rötung) nach einer intradermalen Injektion von einem oder mehreren Polypeptiden, wie oben beschrieben, gemessen wird. Eine solche Injektion kann unter Verwendung einer jeglichen geeigneten Vorrichtung erzielt werden, die dazu ausreicht, das Polypeptid oder die Polypeptide mit Hautzellen des Patienten in Kontakt zu bringen, wie etwa eine Tuberkulinspritze oder eine 1-ml-Spritze. Bevorzugt wird die Reaktion wenigstens 48 Stunden nach der Injektion, bevorzugter 72 Stunden nach der Injektion, gemessen.
Die DTH-Reaktion ist eine Zell-vermittelte Immunantwort, die bei Patienten größer ist, die zuvor einem Test-Antigen ausgesetzt worden sind (d. h. einem immunogenen Teil eines verwendeten Polypeptids oder einer Variante davon). Die Antwort kann visuell unter Verwendung eines Lineals gemessen werden. Im allgemeinen ist eine Induration, deren Durchmesser größer als ungefähr 0,5 cm, bevorzugt größer als ungefähr 1,0 cm ist, eine positive Antwort, die auf eine Leishmania-Infektion hinweist, die sich als eine aktive Krankheit manifestieren kann oder auch nicht.
Die Polpeptide dieser Erfindung werden bevorzugt zur Verwendung in einem Hauttest als pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend wenigstens 1 Polypeptid und einen phy siologisch akzeptablen Träger, wie oben beschrieben, formuliert. Solche Zusammensetzungen enthalten typischerweise ein oder mehrere der obigen Polypeptide in einer Menge im Bereich von ungefähr 1 μg bis 100 μg, bevorzugt von ungefähr 10 μg bis 50 μg in einem Volumen von 0,1 ml. Bevorzugt ist der in solchen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendete Träger einer Salzlösung mit geeignete Konservierungsmitteln wie etwa Phenol und/oder Tween80^TM.
Die folgenden Beispiele werden zu Illustrationszwecken und nicht zur Einschränkung dargeboten.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von M15
Dieses Beispiel veranschaulicht die Zubereitung eines Leishmania-Antigens M15 mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz.
Eine Amastigoten-cDNAExpressionsbibliothek von L. major (Friedlan-Stamm), hergestellt in dem λZAP II-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von Seren gescreent, die aus mit L. major infizierten BALB/c-Mäusen erhalten worden waren (8 Wochen nach der Impfung). Näherungsweise 40.000 Plaques wurden gescreent, und vier Klone, die reaktive Antigene exprimierten, wurden bis zur Homogenität durch zwei aufeinanderfolgende Runden eines Screening mit geringer Dichte aufgereinigt. Bluescript-Phagemid-Inserts wurden aus positiven Klonen für die weitere Analyse ausgeschnitten. Ein EcoRI/SstII-Restriktionsfragment von dem 5'-Ende eines partiellen cDNA-Insert, das während der ersten Screeningrunde isoliert worden war (pLmal-1), wurde im folgenden als eine Sonde verwendet, um erneut auf Klone zu screenen, die cDNA-Inserts voller Länge enthielten. Die Sonde wurde mit hoher spezifischer Aktivität (~ 10⁹cpm/μg) mit [α-³²P]dCTP unter Verwendung der Random-Primer-Methode markiert und wurde verwendet, um ~ 10.000 Plaques der oben beschriebenen L. major-Expressionsbibliothek zu screenen. Positive Klone wurde mittels Restriktionsenzymverdau verglichen, und der Klon mit dem größerten Insert (pfl1-1) wurde für eine darauffolgende Analyse ausgewählt.
Die DNA-Sequenz-Analysen wurden auf einem automatisierten Applied-Biosystems-Sequenzierer unter Verwendung von Taq-Polymerase und Farbstoff-gekoppelten ddNTP-Terminatoren oder Farbstoff-markierten Sequenzierungsprimern durchgeführt. Die vollständige Sequenz des 2685-bp-Inserts wurde unter Verwendung einer Kombination aus Primergesteuertem Sequenzieren und mittels Sequenzieren einer Reihe von überlappenden Exonuklease-III-Deletionssubklonen bestimmt, die unter Verwendung des Erase-α-base-Systems (Promega, Madison, WI) erzeugt wurden. Die Sequenz dieses Insert wird inSEQ ID NO: 1 dargestellt, und die abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 2 dargestellt.
Der vollständige Insert des Klon pfl-1 wurde durch Verdau mit BamHI/KpnI ausgeschnitten und im Leserahmen in BamHI/KpnI-verdauten pQE31 (QUIAGEN) subkloniert, um das Konstrukt pM151A zu erzeugen. E. coli, die dieses Konstrukt enthielten, exprimierten in induzierbarer Weise hohe Konzentrationen des L. major-Antigens, das durch pfl1-1 (bezeichnet als M15) kodiert wird, unter der Zugabe eines 6-Histidin-Tag am Aminoterminus. Großvolumige Kulturen (500 ml) von E. coli-Wirtszellen, enthaltend das pM151A-Konstrukt, wurden induziert, um rekombinantes Protein durch Zugabe von 2mM IPTG in der mittleren Log-Phase des Wachstums zu exprimieren. Das Wachstum wurde für 4 bis 5 Stunden fortgesetzt, und die Bakterien wurden dann pelletisiert und einmal mit kaltem PBS gewaschen. Die Bakterien wurden in 20 ml Lysepuffer (50 mM Na₂HPO₄, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM (β-Mercaptoethanol), enthaltend 20 mg Lysozym, resuspendiert und wurden durch eine 1-stündige Inkubation bei 4°C, gefolgt von einer kurzen Beschallung, lysiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Minuten entfernt, und obwohl gefunden wurde, daß das rekombinante Protein in gleichmäßiger Weise zwischen den löslichen und den unlöslichen Fraktionen verteilt war, wurde das unlösliche Material an diesem Punkt verworfen. Rekombinantes Protein, das den Amino-terminalen Histidin-Tag enthielt, wurde Affinitäts-aufgereinigt unter Verwendung eines Ni-NTA-Harzes (QIAGEN) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. In Kürze gesagt, 8ml des NI-NTA-Harzes, resuspendiert in Lysepuffer, wurde zu der löslichen Lysatfraktion zugegeben, und eine Bindung wurde unter konstantem Mischen für 1 Stunde bei 4°C durchgeführt. Die Mischung wurde dann in eine Säule unter Schwerkraftsfluß geladen, und man ließ das nicht-bindende Material durchfließen. Die Ni-NTA-Matrix wurde 3 mal mit 25 ml Waschpuffer gewaschen (50 mM Na₂HPO₄, pH 6,0, 300 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol), und gebundenes Material wurde in 25 ml Elutionspuffer eluiert (50 mM Na₂HPO₄, pH 5,0, 300 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol). Das eluierte Material wurde dann gegen 3 Wechsel von PBS dialysiert, steril gefiltert und bei –20°C gelagert. Mittels SDS-PAGE-Analyse wurde gezeigt, daß das aufgereinigte rekombinante Protein frei von jeglicher signifikanter Menge an E. coli-Protein war. Eine geringe Menge an Banden mit niedrigem Molekulargewicht wurden als proteolytische Produkte des L. major-Antigens angesehen, basierend auf ihrer Reaktivität in einer Western-Blot-Analyse. Ein polyklonales Antiserum gegen M15 mit hohem Titer wurde in Kaninchen erzeugt durch wiederholte subkutane Injektion von rekombinantem Protein. Eine Western-Blot-Analyse von Lysaten aus L. major-Promastigoten und -Amastigoten unter Verwendung dieses Antiserums deutete daraufhin, daß das Protein während des gesamten Lebenszyklus des Parasiten konstitutiv exprimiert wird.
Beispiel 2
Herstellung von Ldp23
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von einem Leishmania-Antigen Ldp23 mit der in SEQ ID NO: 4 aufgeführten Sequenz.
A. Aufreinigung von MHC-Klasse-II-assoziierten Peptiden aus P3881D1-Makrophagen die mit L. donovani infiziert sind
Um sicherzustellen, daß eine in-vitro-Infektion von Makrophagen ihre MHC-Klasse-II-Moleküle mit Parasitenpeptiden beladen würden, wurden anfängliche Experimente durchgeführt, um die Fähigkeit der L. donovani-infizierten Makrophagen-Zellinie P388D1 zu testen, Parasiten-Antigene für L. donovani-spezifische T-Zellen zu präsentieren. Diese Makrophagen-Zellinie wurde gewählt, weil sie denselben H-2-Haplotyp wie die BALB/c-Maus hat, die ein Mäusestamm ist, der gegenüber einer L. donovani-Infektion mäßig empfindlich ist und der ausgewählt wurde, um die in-vivo-Experimente durchzuführen. Unter Verwendung eines Anteils von 3–5 Parasiten pro Zelle und einer anfänglichen Inkubation bei Zimmertemperatur für 4–6 Stunden, gefolgt von 37°C für 24–48 Stunden, wurden nahezu bis zu 90% der Makrophagen infiziert. Das Niveau der MHC-Klasse-II-Molekül-Expression, bestimmt mittels FACS-Analyse, wies daraufhin, daß eine Infektion keinen Effekt auf die Niveaus der MHC-Klasse-II-Expression im Vergleich zu nicht-infizierten Kontrollzellen bewirkte.
Um die Fähigkeit der L. donovani-infizierten P388D1-Zellen zu testen, Parasiten-Antigene zu präsentieren, wurden Makrophagen infiziert, wie oben angezeigt, und bei 26°C für 6 Stunden und dann bei 37°C für entweder 24, 48 oder 72 Stunden inkubiert. Zu jedem dieser Zeitpunkte wurden die nicht-adhärenten Zellen und freie Parasiten ausgewaschen, und die adhärenten Zellen wurden mechanisch abgelöst, gewaschen und mit Paraformaldehyd fixiert. Diese Zellen wurden dann als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) für aufgereinigte Lymphknoten-T-Zellen von BALB/c-Mäusen verwendet, die mit L. donovani-Promastigoten immunisiert worden waren. Um diese Anti-L. donovani-spezifischen T-Zellen zu erzeugen, wurden BALB/c-Mäuse (H-2^d) beider Geschlechter (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), nach 8 bis 14 Lebensalterwochen am hinteren Pfotenballen mit 5–10 × 10⁶ L. donovani-Promastigoten immunisiert, die in vollständigem Freund'schem Adjuvans (CFA) emulgiert waren (Difco Laboratories, Madison, MI), wie beschrieben in Rodrigues et al., Parasite Immunol. 14: 49 (1992). Die drainierenden Lymphknoten wurden 8 Tage nach der Immunisierung ausgeschnitten, und die T-Zellen wurden in einer Anti-Maus-Ig-Säule aufgereinigt, um die B-Zellen zu entfernen, wie in Bunn-Moreno und Campos-Neto, J. Immunol. 127: 427 (1981) beschrieben, gefolgt von einer Passage durch eine Sephadex-G10-Säule, um die Makrophagen zu entfernen.
Der Stimulationsindex wurde durch Dividieren des cpm, der für die Zellen erhalten wurde, die in der Anwesenheit von infizierten P388D1-Makrophagen kultiviert worden waren, durch den cpm, der für die Zellen erhalten wurde, die in der Anwesenheit von nicht-infizierten Makrophagen kultiviert, aber denselben Bedingungen wie die infizierten Makrophagen ausgesetzt worden waren, berechnet. Die in 1 gezeigten Resultate deuten darauf hin, daß L. donovani-infizierte P388D1-Makrophagen Parasiten-Antigene verarbeiten, und daß eine optimale Präsentation nach 48 Stunden Infektion stattfindet. Keine Stimulation der T-Zellen durch die nicht-infizierten Makrophagen wurde beobachtet.
Um die mit MHC-Klasse-II-assoziierten L. donovani-Peptide zu isolieren, wurden P388D1-Makrophagen mit L. donovani-Promastigoten für eine anfängliche Inkubation von 6 Stunden bei Zimmertemperatur infiziert. Die Kulturen wurden dann auf 37°C für den Rest der 48-stündigen Inkubationsperiode übertragen. Bei einem Verhältnis von 3–5 Parasiten pro Makrophage waren nahezu 90% der Makrophagen nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C infiziert.
Die MHC-Klasse-II-Moleküle wurde dann Affinitäts-aufgereinigt. Näherungsweise 1,5 × 10¹⁰ L. donovani-infizierte oder eine gleiche Anzahl an nicht-infizierten P388D1-Makrophagen wurden für jede Aufreinigung verwendet. Die Zellen wurden geerntet, mit PBS gewaschen und für 30 Minuten in kaltem Lysepuffer inkubiert (PBS, 1% Nonidet P40, 25 mM Iodacetamid, 0,04% Natriumazid, 1 mM Aprotinin und 1 mM PMSF). Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 40.000 g für eine Stunde entfernt, und der Überstand wurde über Nacht bei 4°C über eine 5 ml Anti-MHC-Klasse-II-Moleküle-(H-2^d)-Sepharose-Säule recycelt (Protein-G-Sepharose-Säule, an die der monoklonale Antikörper MK-D6 gebunden worden ist). Kulturüberstände von MK-D6-Hybridomzellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden als die Quelle für Anti-MHC-Klasse-II-(H-2^d)-monoklonalen Antikörper verwendet. Die Säule wurde mit 50 ml Lysepuffer und dann mit 50 ml PBS, enthaltend 0,5% Octylglucopyranosid-Detergenz, gewaschen. Gebundene Moleküle wurden von der Säule mit 1M Essigsäure in 0,2% NaCl eluiert. Die MHC-Peptidmoleküle wurden von dem IgG (MK-D6-monoklonaler Antikörper) unter Verwendung einer Centricon-100-Filter-Einheit (Amicon Division, W. R. Grace&Co., Beverly, MA) getrennt. Die Peptide wurden dann von den Klasse-II-Molekülen durch Zugabe von Essigsäure auf 2,5 M dissoziiert, gefolgt von einer Trennung unter Verwendung einer Centricon-10-Filtereinheit. Die resultierende Peptidzubereitung, die in der Probe mit niedrigem Molekulargewicht vorhanden war, wurde dann getrocknet und unter Verwendung eines Speed-Vac-Aufkonzentrierers (Savant Instrument Inc., Farmingdale, NY).
Die Peptide wurden in 200 μl 0,05% TFA wieder aufgelöst und mittels Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC) unter Verwendung einer 2,1 nun × 25 cm Vydac C-18-Säule bei einer Flußrate von 0,15 ml/min unter Verwendung eines 1 bis 30% Acetonitril-Gradienten (60 min), gefolgt von einem 30 bis 60%-Gradienten (30 min) und dann einem 60- bis 80%-Gradienten (90–110 min) getrennt. Nicht-infizierte P388D1-Zellen wurden in ähnlicher Weise verarbeitet, um als eine Hintergrundkontrolle für endogene MHC-Klasse-II-assoziierte Peptide zu dienen. 2 zeigt ein repräsentatives Experiment; vier unterschiedliche Peaks, die nur in dem aus infizierten Makrophagen isolierten Material vorhanden waren (Tafel B) und nicht in dem Material, das aus nicht-infizierten Makrophagen isoliert worden war (Tafel A), werden angezeigt.
Aus drei unabhängigen Peptid-Extraktionen, wurden fünfundzwanzig unterschiedliche HPLC-Peptid-Peaks aus L. donovani-infizierten Makrophagen isoliert und wurden einer Proteinsequenzanalyse unter Verwendung von automatisiertem Edman-Abbau auf einem Applied Biosystems-477-Gasphasen-Protein-Sequenzierer unterzogen. Die Proteinsequenz- und Aminosäureanalyse wurden von der W. M. Keck-Foundation, Biotechnology Resource Laboratory, Yale University, New Haven, CT, durchgeführt. In praktisch allen Bestimmungen konnte keine Zuordnung für die erste Position gemacht werden. Ebenso beruhte in den meisten Fällen die Definition der Aminosäurereste der Positionen 10–15 auf der quantitativen Dominanz eines Restes gegenüber anderen. Unter Verwendung dieses Ansatzes zeigten die für mehrere Peptide erhaltenen Sequenzen die Anwesenheit von 3–6 unterschiedlichen Resten in vielen der 10–15 Sequenzzyklen, die für jede Bestimmung analysiert wurden, was eine Mischung von Peptiden widerspiegelt. Zusätzlich konnten für einige Peaks Sequenzen nicht erhalten werden, da die Peptide blockiert waren. Nichtsdestotrotz wurden drei Peptidsequenzen bestimmt. Aminosäuresequenzen wurden auf Identität mit Proteinen in der GenBank-Datenbank unter Verwendung der GENPETP-, PIR- und SWISSPROT-Programme untersucht. Die Sequenzdatenbankanalyse offenbarte, daß eines der Peptide stark homolog mit Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase verschiedener Spezies war. Ein anderes Peptid hatte Homologie mit einem Elongationsfaktor von mehreren Spezies, einschließlich Leishmania. Die dritte Sequenz hatte keinen deutlichen Bezug zu irgendeinem bekannten Protein und wird unten gezeigt: XQXPQ(L/K)VFDEXX
B. Klonieren und Sequenzieren des Ldp23-Gens
Um das L. donovani-Protein zu erhalten, das zu einem Peptid verarbeitet wurde, das mit den MHC-Klasse-II-Molekülen von infizierten Makrophagen assoziiert war, wurde die Peptidsequenz eines unbestimmten Ursprungs ausgewählt, um die Strategie zum Klonieren des entsprechenden Parasitengens zu steuern. Ein DNA-Fragment wurde anfänglich aus L. donovani-Promastigoten-cDNA mittels PCR amplifiziert. Der Sense-Primer war ein Peptid-abgeleitetes Oligonukleotid (5'>GGAATTCCCCInCAGCTInGTInTTCGAC<3'), enthaltend eine EcoRI-Restriktionsendonukleasenstelle (unterstrichen). Die Basen wurden gemäß der bevorzugten Codon-Verwendung von L. donovani ausgewählt, wie beschrieben in Langford et al., Exp. Parasitol. 74: 360 (1992). Inosin wurde für die Reste an Positionen 4, 6 und 7 verwendet, um die niedrige Codon-Verwendung für die entsprechenden Aminosäuren sicherzustellen. Zusätzlich wurde die Carboxy-terminale L-Glutaminsäure nicht für das Design des Primer eingeschlossen. Der Antisense-Primer war ein Poly-Thymidin-Oligonukleotid (oligo-dT, Stromabwärts-Primer), enthaltend eineXhoI-Restriktionendonukleasenstelle.
Das Genfragment wurde von einer L. donovani-Promastigoten-cDNA-Zubereitung unter Verwendung der folgenden Reaktionsbedingungen amplifiziert: ein Zyklus von 3 Minuten bei 94°C, unmittelbar gefolgt von 35 Zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 45°C und 1 min bei 72°C. Die L. donovani-cDNA wurde aus 5 × 10⁷ gewaschenen Promastigotenformen zubereitet, die in der Log-Wachstumsphase (3-Tage-Kultur) geerntet worden waren. Die cDNA wurde unter Verwendung eines Invitrogen cDNA-Cycle^TM-Kit (Invitrogen Co., San Diego, CA) erhalten. Oligonukleotidprimer wurden von dem DNA-Synthesis Laboratory, Department of Pathology, Yale University School of Medicine, synthetisiert.
Die PCR-Produkte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Nur eine Bande von näherungsweise 300 bp wurde erhalten. Dieses Fragment wurde kloniert, und seine Sequenz bestätigte die Sequenz des Peptid-basierenden Primers, einschließlich des Glutaminsäurecodons, das absichtlich nicht in der Primersequenz eingeschlossen war.
Das PCR-amplifizierte Genfragment wurde in den pCR^TM-Vektor unter Verwendung des TA-Kloniersystems (Invitrogen Co., San Diego, CA) ligiert. Transformanten wurden in LB-Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, ausgewählt, und die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Wizard^TM-Minipreps-DNA-Aufreinigungskit (Promega Co., Madison, WI) isoliert. Die Insert-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und XhoI (New England Biolabs, Beverly, MA) freigesetzt, aus einer Agarosegelelektrophorose aufgereinigt und mit Verwendung einer Random-Priming-Methode (Megaprime Labeling Kit, Amersham Life Science, Buckinghamshire, England) markiert.
Dieses DNA-Fragment wurde als eine Sonde verwendet, um eine L, donovani-Promastigoten-cDNA-Bibliothek, wie in Skeiky et al., Infect. Immun. 62: 1643 (1994) beschrieben, zu screenen. Eine näherungsweise 650 bp cDNA (Ldp23) wurde aus dem Phagemid durch in-vivo-Ausschneiden unter Verwendung des Stratagene-Protokolls ausgeschnitten. Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung des Sequenase-Version-2-Systems (DNA-Sequenzier-Kit) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 7-deaza-GTP (United States Biochemical, Cleveland, OH) durchgeführt. Die Sequenz wird als SEQ ID NO: 3 bereitgestellt und zeigt eine vollständige Homologie mit dem ursprünglichen 300 bp PCR-Fragment. Ein offener Leserahmen mit 525 bp, enthaltend ein ATG-Codon, das den letzten 4 Basen der gespleißten Leadersequenz folgt, und 3 Stopcodons, die an den Poly-A-Schwanz angrenzen, wurde identifiziert. Dieser Rahmen kodiert ebenso für die carboxyterminale Sequenz (KVFDE) des aufgereinigten MHC-Klasse-II-assoziierten Peptids. Die Sequenzanalyse der abgeleiteten Proteinsequenz offenbarte eine potentielle Glycosylierungsstelle (Asn-Cys-Ser) an den Positionen 68–70.
Eine Sequenzanalyse wurde unter Verwendung der University of Wisconsin Genetics Computer Group-Programme und der GenBank- und EMBL-Datenbanken von Protein- und DNA-Sequenzen durchgeführt. Die Suche nach Homologie des Ldp23-Gens mit bekannten Sequenzen erzeugte keine signifikante Homologie.
C. Bakterielle Expression und Aufreini und von rekombinantem Protein
Das rekombinante L. donovani-Peptid-Donor-Protein wurde in E. coli produziert, das mit dem pGEX-2T-Expressionsvektor transformiert worden war, in den das Ldp23-Gen im Leserahmen subkloniert worden war. PCR wurde verwendet, um das klonierte Gen im Leserahmen in den Expressionsvektor pGEX 2T zu subklonieren. Primer, die die entsprechenden Restriktionsstellenenzyme, Initiations- und Terminationscodons enthielten, waren: 5'>GGATCCATGGTCAAGTCCCACTACATCTGC<3' für den Primer stromauf und 5'>GAATTCAGACCGGATAGAAATAAGCCAATGAAA<3' für den Primer stromab (Restriktionsstellen von BamHI bzw. EcoRI sind unterstrichen). Die PCR-Bedingungen waren, wie oben für die Amplifikation des ursprünglichen Peptid-verwandten DNA-Fragments angezeigt. Die verwendete Matrize war pBluescript-Plasmid, enthaltend das klonierte Gen aus der cDNA-Bibliothek.
Die Überexpression des rekombinanten Fusionsproteins wurde durch Wachsenlassen der transformierten E. coli (DH5α) und Induzieren des tac-Promoter mit 1 mM Isopropyl-β-Thiogalactopyranosid (IPTG) (Stratagene, La Jolla, CA) erzielt. Die Zellen wurden gesammelt, zentrifugiert und auf die Anwesenheit des Fusionsproteins mit SDS-PAGE analysiert. Ein Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein von 43–44 kD wurde hergestellt, was auf ein Leishmania-Protein von näherungsweise 18 kD hinweist, da Glutathion-S-Transferase (GST) ein MW von 26 kD hat. Jedoch war das Fusionsprotein sehr unlöslich und konnte deshalb nicht mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Glutathionsäule aufgereinigt werden. Die Verwendung von niedrigen Konzentrationen von Detergentien, wie SDS, Sarcosyl, Deoxycolat und Octylglucopyranosid, während der Extraktionsschritte reichte aus, um das Protein zu solubilisieren, verhinderte aber leider seine Bindung an die Glutathionsäule.
Andere Manöver, wie etwa das Wachstum der E. coli und Inkubation und Induktion des Tac-Promoter mit IPTG bei 33°C verbesserte nicht die Proteinlöslichkeit. Jedoch wurde die Aufreinigung durch präparative SDS-PAGE erzielt. Die Bande wurde mit 0,1 M KCl visualisiert, geschnitten und aus dem Gel elektroeluiert, gefolgt von einer extensiven Dialyse gegen PBS und Aufkonzentrierung auf Centricon-10-Filtern.
Näherungsweise 500 μg aufgereinigtes Protein wurden erhalten. Das aufgereinigte Protein wird in 3 gezeigt. In Tafel A, wurde E. coli (DH5α), transformiert mit dem Expressionsvektor pGEX 2T, enthaltend das Ldp23-Gen, in LB-Medium wachsengelassen, und der tac-Promoter wurde mit IPTG für 3 Stunden induziert. Die Zellen wurde pelletiert, in Ladepuffer resuspendiert und SDS-PAGE (10%) unter reduzierenden Bedingungen unterzogen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt. Spur 1 zeigt die nicht-induzierten E. coli und Spur 2 zeigt die induzierten E. coli. Der Pfeil zeigt auf das rekombinante Protein. Tafel B zeigt das Protein, das in Tafel A hergestellt und einer präparativen SDS-PAGE unterzogen worden ist. Die Bande, entsprechend dem überexprimierten rekombinanten Fusionsprotein, wurde mit KCl identifiziert, ausgeschnitten, aus dem Gelstreifen elektroeluiert, gegen PBS dialysiert und einer analytischen SDS-PAGE (12%) unterzogen. Die Zahlen auf der linken Seite zeigen die Molekulargewichte der Marker an. Versuche, das Leishmania-Protein durch Herausspalten aus dem Fusionsprotein-GST mit Thrombin herauszuschneiden, waren nicht erfolgreich.
D. Expression von Ldp23
Um sicherzustellen, daß Ldp23-Peptid in Leishmania-Organismen exprimiert wird, wurde eine Northern-Blot-Analyse unter Verwendung von RNA durchgeführt, die von verschiedenen Promastigoten-Wachstumsphasen (logarithmisch und stationär) und von der Amastigoten-Form dieser Parasiten hergestellt worden war.
Die RNA wurde aus 2 × 10⁷ Parasitenzellen unter Verwendung des Micro RNA-Isolations-Kit (Stratagene, La Jolla, CA), gemäß den Anweisungen hergestellt, die von dem Unternehmen empfohlen werden. RNA wurde aus L. donovani-Promastigoten hergestellt (logarithmische Wachstumsphase); aus L. major-Promastigoten (logarithmische und stationäre Wachstumsphasen); aus L. amazonensis, sowohl Promastigoten-(logarithmische und stationäre Wachstumsphasen) als auch Amastigoten, aufgereinigt aus CBA/J-infizierten Mäusen; und aus L. pifanoi, sowohl Promastigoten (logarithmische und stationäre Wachstumsphasen) als auch Amastigoten (aus axenischem Kulturmedium). L. donovani (1S-Stamm), L. amazonensis (MHOM/BR/77/LTB0016), L. major (MHOM/IR/79/LRC-L251) und L. pifanoi (MHOM/VE/60/Ltrod)-Promastigoten wurden wachsen gelassen und bei 26°C in Schneiders Medium erhalten, enthaltend 20% FCS und 50μg/ml Gentamicin. Die Amastigoten-Formen von L. amazonensis wurden durch differentielle Zentrifugation einer „eiterartigen" Läsion am Pfotenballen einer CBA/J-Maus, die für 6 Monate mit diesem Parasiten infiziert war, erhalten. L. pifanoi-Amastigoten wurden aus axenischer Kultur erhalten, wie zuvor berichtet von Pan et al., J. Euk. Microbiol. 40: 213 (1993).
Die Hybridisierung wurde bei 45°C in der Anwesenheit von 50% Formamid, 5 × Denhardt'sche Lösung, 0,1% SDS, 100 μg/ml einzelstrangiger Lachsspermien-DNA und 5 × SSPE, unter Verwendung von 0,45 μm Nytranmembanfiltern durchgeführt (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Die Probe war das ³²P-markierte Ldp23-Gen.
4 zeigt, daß eine einzelne RNA-Bande von 680 bp für alle Wachstumsphasen und Formen aller getesteten Leishmania beobachtet wurde. In 4 beziehen sich die Zahlen 1, 2 und 3 auf RNA, die aus Promastigoten in der logarithmischen Wachstumsphase, Promastigoten in der stationären Wachstumsphase bzw. Amastigoten-Formen erhalten worden war, und die Zahlen auf der linken Seite zeigen die Molekulargewichte der Marker in Basenpaaren an. Dieses Resultat stimmt mit der entsprechenden Gengröße (525 bp) und mit dem Molekulargewicht des exprimierten Proteins überein und deutet auf die ubiquitäre Verteilung und Expression dieses Gens innerhalb des Genus Leishmania hin.
E. Induktion von Anti-L donovani-Antikörper-Antwort in Mäusen und Kaninchen durch aufgereinigtes rekombinantes Protein
Um die Immunogenität des rekombinanten Leishmania-Proteins zu bewerten und um seine Expression in den Parasiten zu erforschen, wurden Mäuse und Kaninchen mit dem GST-Fusionsprotein in CFA immunisiert. BALB/c-Mäuse wurden am hinteren Pfotenballen mit 5– 10 μg Protein, das in CFA emulgiert war, immunisiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Bio-Rad-Protein-Assay-Reagenz bestimmt (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Die Mäuse wurden 7 Tage später mit 5–10 μg Protein geboostet, das in unvollständigem Freund'schem Adjuvans (IFA) emulgiert war, inokuliert in die Peritonealhöhle.
Die Mäuse ließ man 7 Tage nach der zweiten Immunisierung bluten. Weiße Neuseelandkaninchen (Millbrook Farm, Amherst, MA) wurden gemäß dem folgenden Protokoll immunisiert: eine intramuskuläre (IM) Injektion von 25–30 μg von aufgereinigtem rekombinantem Protein, emulgiert in CFA, in jeden Schenkel am Tag eins; eine IM-Injektion von 25–30 μg von aufgereinigtem Protein, emulgiert in IFA, in jede Schulter am Tag 7; am Tag 15 wurden 25–30 μg des aufgereinigten Proteins in PB5 in das subkutane Gewebe injiziert. Das Kaninchen ließ man 7 Tage nach der letzten Immunisierung bluten.
Seren wurden hergestellt, und die Anti-Leishmania-Antikörper-Antwort wurde mit Western-Blot-Analyse und mit FACScan gemessen. In beiden Fällen wurden L. donovani-Promastigoten als Antigen verwendet. Näherungsweise 2 × 10⁶ L. donovani-Promastigoten wurden in Schneider'schem Medium für 3 Tage (Log-Phase) wachsen gelassen, wurden mit PBS gewaschen, mit SDS-PAGE-Ladepuffer lysiert und Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung eines 15% Polyacrylamidgels unterzogen. Die Proteine wurde auf eine 45 μ Immobilon-P-Transfermembran (Millipore Co., Bedford, MA) unter Verwendung eines Elektroblotters vom Naßtyp (Mini Trans-Blot-Electrophoretic Transfer Cell, Bio Rad Life Science Division, Richmond, CA) für 2 Stunden bei 50 V übertragen. Die Membranen wurden über Nacht bei Zimmertemperatur mit PBS, enthaltend 3% normales Ziegenserum (NGS), 0,2% Tween-20 und 0,05% Natriumazid, blockiert, gefolgt von 3 Waschungen mit PBS. Die Blots wurden dann für 3–4 Stunden bei 4°C mit einer 1/200-Verdünnung von Prä-Immun-Kaninchenserum (Spur A, 5) oder mit derselben Verdünnung von Anti-Fusionsprotein-Kaninchen-Antiserum (Spur B, 5) inkubiert. Die Seren wurden zuvor 2 × mit nicht-lebensfähigem, ausgetrockneten Mycobacterium tuberculosis H-37 RA (Difco Laboratories, Detroit, MI) absorbiert und wurden in PBS verdünnt, enthaltend 1% NGS und 5% pulvrige fettfreie Kuhmilch (Carnation, Nestle Food Company, Glendale, CA). Die Membranen wurden dann mit PBS gewaschen, für eine Stunde bei Zimmertemperatur mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Promega, Madison, WI), inkubiert, einmal mit PBS und 2 × mit Veronalpuffer pH 9,4 gewaschen. Die Reaktion wurde unter Verwendung der Substratmischung 5-Brom-4-chlor-3-indoyl-phosphat und Nitroblau-tetrazolium (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) gemäß den Herstelleranweisungen sichtbar gemacht.
5 zeigt, daß das Kaninchen-anti-rekombinante Protein-Antiserum ein einzelnes Protein von 23 kDa (Ldp23) in der Leishmania-Rohextrakt-Antigenzubereitung nachweist. Keine Banden wurden beobachtet, wenn ein anti-GST-Antiserum verwendet wurde (nicht gezeigt). Darüberhinaus zeigt die FACScan-Analyse (6), daß der Antikörper, der durch das rekombinante Ldp23 induziert wird, mit intakten lebenden L. donovani-Promastigoten reagiert, und damit auf eine Zelloberflächenexpression dieses Moleküls auf diese Organismen hinweist. Die gepunktete Linie in 6 zeigt die indirekte Immunfluoreszenz, die unter Verwendung von Prä-Immun-Mausserum erhalten wird, und die durchgezogene Linie in 6 zeigt das Resultat, das mit Maus-Anti-GSP-Ldp23-Antiserum erhalten wird. Beide Seren wurden 1/100 verdünnt. Parasiten wurden mit Färbepuffer gewaschen und mit FITCkonjugierten Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpern inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wurde mittels FACScan analysiert.
F. Erkennung von rekombinantem Ldp23 mit Leishmania-spezifischen Lymphknoten-T-Zellen
Um die Empfindlichkeit von T-Zellen auf das Ldp23-Protein zu testen, wurden zwei Sätze von Experimenten durchgeführt. In dem ersten Experiment wurden Lymphknoten-T-Zellen (10⁵/Napf) aus BALB/c-Mäusen, immunisiert mit L. donovani-Promastigoten (wie oben beschrieben), stimuliert, um mit 2 × 10⁵Mitomycin C-behandelten normalen einkernigen Milzzellen (APC) zu proliferieren, und mit dem aufgereinigten rekombinanten Fusionsprotein gepulst. Die Proliferation der T-Zellen wurde nach 72 Stunden Kultivierung gemessen. Werte werden in 7 als cpm ausgedrückt und stellen den Mittelwert des [³H]TdR-Einbau in dreifachen Kulturen dar. Der Hintergrund-cpm der Zellen (T-Zellen + APC), kultiviert in der Anwesenheit von Medium alleine, betrug 1291. 7 zeigt, daß Leishmania-spezifische T-Zellen gut und in einer dosisabhängigen Weise gegenüber rekombinantem Ldp23 proliferieren. Keine Antwort wurde beobachtet, wenn aufgereinigtes GST anstelle des rekombinanten Fusionsproteins zugegeben wurde, noch wenn Lymphknoten-T-Zellen aus Mäusen, die mit CFA alleine immunisiert worden waren, stimuliert wurden, um in der Anwesenheit des Leishmania-Fusionsproteins zu proliferieren (nicht gezeigt).
Die Erkennung des rekombinanten Ldp23-Proteins durch Leishmania-spezifische T-Zellen wurde ebenso getestet unter der Verwendung von zwei murinen Modellen von Leishmaniasis, den BALB/c-Mäusen, die gegnüber L. major hoch empfindlich sind, und den CBA/J-Mäusen, die gegenüber L. amazonensis empfindlich sind, wie beschrieben in Champsi and McMahon-Pratt, Infect. Immun. 56: 3272 (1988). Diese Modelle wurden gewählt, um das Cytokinmuster, das von Ldp23 induziert wird, zu erforschen. In dem Mausmodell von Leishmaniasis ist die Resistenz mit Th-1-Cytokinen assoziiert, während die Empfindlichkeit mit Th-2-Antworten verknüpft ist.
Lymphknotenzellen wurden drei Wochen nach der Initiation der Infektion von BALB/c-Mäusen mit L. major erhalten, und die Fähigkeit dieser Zellen, das rekombinante Ldp23 zu erkennen, wurde anhand der Proliferation und anhand der Produktion der Cytokine IFN-γ und IL-4 gemessen. 2 × 10⁶ Zellen, erhalten aus dem drainierenden poplitealen Lymphknoten von infizierten Mäusen, wurden für 72 Stunden in der Anwesenheit von rekombinantem Ldp23 oder Leishmania-Lysat kultiviert. Die Niveaus von IFN-γ und IL-4 in Kulturüberständen wurden mittels ELISA gemessen, wie zuvor beschrieben (Chatelain et al., J. Immunol. 148: 1172 (1992), Curry et al., J. Immunol. Meth. 104: 137 (1987), und Mossman and Fong, J. Immunol. Meth. 116: 151 (1989)), unter Verwendung von spezifischen Anti-IFN-γ-und IL-4-monoklonalen Antikörpern (PharMingen, San Diego, CA).
Ldp23 stimulierte diese Zellen zur Proliferation (nicht gezeigt) und induzierte eine Cytokinantwort, die für den Th-1-Typ typisch ist, wie angezeigt durch die Produktion von hohen Konzentrationen an IFN-γ (Tafel A aus 8) und keinem IL-4 (Tafel B aus 8). Die Stimulation dieser Zellen mit einem Leishmania-Rohlysat ergab ein gemischtes Th-Cytokin Profil. Genau das selbe Muster an Cytokinproduktionen wurde von den CBA/J-Mäusen erhalten, die mit L. amazonensis infiziert worden waren (nicht gezeigt). Diese Resultate zeigen deutlich an, daß Lpd23 ein starker und selektiver Aktivator der Th-1-Cytokine von Mauszellen ist.
Beispiel 3
Herstellung von Hsp83
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung eines Leishmania-Antigens Hsp83, mit der in SEQ ID NO: 6 aufgeführten Sequenz.
Eine genomische Expressionsbibliothek wurde konstruiert mit gescherter (sheared) DNA von L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) im Bakteriophagen λZAP II (Stratagene, La Jolla, CA). Die Expressionsbibliothek wurde mit Escherichia coli-vorabsorbiertem Serum von einem L. braziliensis-infizierten Individuum mit ML gescreent. Immunreaktive Plaques wurden aufgereinigt, und das pBSK(–)-Phagemid wurde mittels Protokollen ausgeschnitten, die von dem Hersteller vorgeschlagen worden sind. Eingenistete (nested) Deletionen wurden mit Exonuklease III durchgeführt, um überlappende Deletionen für einzelsträngige Matrizenzubereitungen und Sequenzierungen zu erzeugen. Einzelsträngige Matrizen wurden nach Infektion mit VCSM13-Helferphagen isoliert, wie vom Hersteller empfohlen ( Stratagene, La Jolla, CA), und sequenziert mittels des Dideoxykettenterminationsverfahrens oder mittels des Taq-Farbstoffterminationssystems unter Verwendung des automatisierten Applied Biosystems Sequenzierer, Modell 373A.
Rekombinante Antigene, die von diesen Klonen erzeugt wurden, wurden aus 500 ml Isopropyl-β-Thiogalaktopyranosid (IPTG)-induzierten Kulturen aufgereinigt, wie beschrieben in Skeiky et al., J. Exp. Med. 176: 201–211 (1992). Diese Antigene wurden dann auf die Fähigkeit getestet, PBMC von Leishmania-infizierten Individuen zur Proliferation und zur Sezenierung von Cytokinen zu stimulieren. Das Peripherblut wurde von Individuen erhalten, die in einem Gebiet leben (Corte de Pedra, Bahia, Brazil), in dem L. braziliensis endemisch ist und in dem epidemiologische, klinische und immunologische Studien für mehr als ein Jahrzehnt druchgeführt worden sind, und PBMC wurden aus Vollblut mittels Dichtezentrifugation durch Ficoll (Winthrop Laboratories, New York, N. Y.) isoliert. Für in-vitro-Proliferationsessays wurden 2 × 10⁵ bis 4 × 10⁵ Zellen pro Napf in vollständigem Medium kultiviert (RPMI 1640, supplementiert mit Gentamicin, 2-Mercaptoethanol, L-Glutamin und 10% gescreentem gepooltem A+ menschlichem Serum; Trimar, Hollywood, Calif.) in 96-Napf-Flachbodenplatten mit oder ohne 10μg der angezeigten Antigene pro ml oder 5μg Phytohemagglutinin pro ml (Sigma Immunochemicals, St. Louis, Mo.) für 5 Tage. Die Zellen wurden dann mit 1 μCi von [³H] Thymidin für die letzten 18h der Kultivierung gepulst. Zur Bestimmung der Cytokinproduktion wurden 0,5 bis 1 ml PBMC in 1 × 10⁶ bis 2 × 10⁶ Zellen pro ml mit oder ohne die Leishmania-Antigene für 48 und 72 Stunden kultiviert.
Die Überstände und Zellen wurden geerntet und auf sezerniertes Cytokin oder CytokinmRNAs analysiert. Aliquots der Überstände wurden auf Gamma-Interferon (IFN-γ), Tumornekrosefaktor α (TNF-α), Interleukin-4 (IL-4) und IL-10 getestet, wie beschrieben in Skeiky et al., J. Exp. Med. 181: 1527–1537 (1995). Für Cytokin-mRNA-PCR-Analyse wurde die gesamte RNA aus PBMC isoliert, und die cDNA wurde unter Verwendung von Poly(dT) (Pharmacia, Piscatway, NJ) und reverser Transkriptase aus Vogel-Mycoblastosevirus (avian mycoblastosis virus) synthetisiert. Nach einer Normalisierung gegen (3-Actin, wurde ver dünnte cDNA mittels PCR unter Verwendung von Taq-Polymerase amplifiziert (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, CA) mit 0,2 μM Konzentrationen der entsprechenden 5'- und 3'- externen Primer in einem Reaktionsvolumen von 50 μL. Die Nukleotidsequenzen der primären Paare und der PCR-Bedingungen, die verwendet worden waren, waren wie in Skeiky et al., J. Exp. Med. 181: 1527–1537 (1995) beschrieben. Wir verifizierten, daß unsere PCR-Bedingungen innerhalb des semiquantitativen Bereichs lagen, in dem anfänglich serielle Verdünnungen der cDNAs durchgeführt wurden und die Anzahl der für die PCR verwendeten Zyklen variiert wurde. Plasmide, die die menschlichen Sequenzen für IL-2 , IFN-γ, IL-4, IL-10 und β-Aktin enthielten, wurden verdaut, und die DNA-Inserts wurden nach Trennung auf 1%-Agarose-Gelen aufgereinigt. Radiokativmarkierte ³²P-Sonden wurden hergestellt mittels des Random-Priming-Verfahrens. PCR-Produkte wurden mittels Elektophorese auf 1,5% Agarose Gelen analysiert, auf Nylonmembranen übertragen und mit den geeigneten ³²P-markierten DNA-Inserts sondiert.
Ein rekombinanter Klon wurde in den obigen Assays identifiziert, der nach einem Sequenzvergleich seiner vorhergesagten Aminosäuresequenz mit Sequenzen von anderen Proteinen als ein Leishmania braziliensis-Homolog des eukaryotischen 83 kD-Hitzeschockproteins (Lbhsp83) identifiziert wurde. Die Sequenz des Klons wird in SEQ ID NO: 5 bereitgestellt, und die abgeleitete Proteinsequenz wird in SEQ ID NO: 6 bereitgestellt. Auf der Grundlage der Homologie scheint diesem Klon, der als Lbhsp83a bezeichnet wird, die ersten 47 Reste der 703 Aminosäurereste der vollen Länge zu fehlen. Lbhsp83 hat eine Homologie von 94% insgesamt (91% Identität,und 3% konservative Substitution), 91% (84% Identität und 7% konservative Substitution) und 77% ( 61 % Identität und 16% konservative Substitution) mit L. amazonensis-hsp83, T. cruzi-hsp83 bzw. menschlichem hsp89. Ein zweiter Klon ( bezeichnet als Lbhsp83b), der den 43-kD-C-Terminalen Teil von hsp83 enthielt (Reste 331 bis 703), wurde ebenso isoliert. 19 stellt einen Vergleich der Lbhsp83-Sequenz mit L. amazonensis-hsp83 (Lahsp83), T. cruzi -hsp83 (Tchsp83) und menschlichem hsp89 (Huhsp89) dar.
Die Resultate der Proliferationassays unter Verwendung von Lbhsp83a werden in Tabelle 1 gezeigt. Zellen von allen Schleimhaut-Leishmaniasis-Patienten (ML) proliferierten stark in Antwort auf Lbhsp83a, mit Stimulationsindices (SIs) im Bereich von 19 bis 558 ( im Vergleich mit 20 bis 1634 für Parasitenlysat). Die Proliferation von PBMC aus Haut-Leishmaniasis-Patienten (CL) war variierend, und außer den Niveaus in zwei Patienten (IV und VII) waren die Niveaus signifikant niedriger als diejenigen von ML-Patienten. Im Vergleich waren die proliferativen Antworten von Individuuen mit selbstheilender CL auf Lbhsp83a ähnlich denjenigen von Individuen mit ML. Jedoch waren die Anworten von allen sechs selbstheilenden Individuen auf Lbhsp83 konsistent höher als diejenigen auf Lbhsp83b. Dies legt nahe, daß PBMC von selbstheilenden CL-Patienten bevorzugt ein oder mehrere T-Zellen-Epitope erkennen, die sich innerhalb des Aminoteils von Lbhsp83 befinden.
Tabelle 1 In-vitro-Proliferation von PMBC aus L. braziliensis-infizierten Individuuen in Antwort auf Lbhsp83
Eine detailliertere Analyse der Cytokinmuster von PBMC aus ML-Patienten wurde mit reverser Transkriptase-PCR durchgeführt. Cytokin-mRNAs wurden in Zellen vor der Kultivierung (9, Spur O) oder nach Kultivierung in der Abwesenheit (Spuren-) oder Anwesenheit des angezeigten Antigens für 48 und 72 h bewertet. 4A zeigt die Resultate für fünf der sechs ML-Patienten, deren PBMC analysiert wurden. In ungefähr der Hälfte der ML-Patienten hatten nicht-kultivierte (ruhende) PBMC nachweisbare Konzentrationen an mRNA für IFN-γ, IL-2 und IL-4, aber nicht IL-10. PBMC von CL-Patienten hatten jedoch IL-10-mRNA im Ruhezustand zusätzlich zu mRNAs für die anderen getesteten Cytokine ( 4B). Nach einer in-vitro-Kultur ohne Antigen nahmen die Niveaus der mRNA für IFN-γ, Il-2 und IL-4 in ruhenden Zellen von ML-Patienten auf Hintergrundniveaus ab, während IL-10-mRNA-Niveaus stiegen. Im Gegensatz dazu hatten die PBMC der meisten CL-Patienten stabile oder erhöhte IL-10-mRNA, während die mRNAs für IL-2, IFN-γ und IL-4 auf kaum nachweisbare Niveaus in der Abwesenheit der Antigen-Stimulation reduziert wurden.
In den PBMC von drei ML-Patienten führte eine Stimulation mit Lysat zu einer erhöhten Expression der mRNA für IFN-γ, IL-2 und IL-4, aber nicht IL-10. Im Vergleich riefen beide Lbhsp83-Polypeptide die Produktion von mRNA für IFN-γ und IL-2 von allen getesteten PBMC von ML-Patienten hervor. Im Gegensatz unterschieden sich die Profile der mRNA für IL-10 und IL-4 für die beiden hsp83 Polypeptide. Lbhsp83a stimulierte die Produktion von IL-10, aber nicht IL-4-mRNA (Patienten I, II, III und IV), während Lbhsp83b die Produktion von IL-4 stimulierte, aber nicht von IL-10-mRNA in allen sechs Patienten.
Alle getesteten CL-Patienten zeigten eine Reaktion auf beide Lbhsp83-Polypeptide ebenso wie auf das Parasiten-Lysat durch Hochregulieren der Synthese der mRNAs für IL-2 und IFN-γ, und in zwei aus vier Patienten (I und IV) stieg das Niveau der IL-4-mRNA ebenso an, was auf eine Stimulation von sowohl Thl- als auch Th2-Cytokinen deutet. Interessanterweise und ebenso wie im Falle der nicht in Kultur gehaltenen PBMC aus ML-Patienten, die keine nachweisbaren Niveaus von IL-10-mRNA hatten, stimulierte Lbhsp83a die PBMC von einem CL-Patienten (IV) dahingehend, IL-10-mRNA zu synthetisieren, während Lbhsp83b dies nicht tat. Jedoch regulierten beide rLbhsp83-Polypeptide ebenso wie das Parasiten-Lysat in den anderen drei Patienten (I, II und III) mit Ruhe-Niveaus von IL-10-mRNA, die Expression von IL-10-mRNA herunter.
PBMC-Überstände wurden ebenso auf die Anwesenheit von sezernierten IFN-γ, TNF-α, IL-4 und IL-10 getestet. Zellen von allen ML- und selbstheilenden CL-Patienten (sieben bzw. sechs Patienten) und von vier der sieben CL-Patienten wurden auf sezerniertes IFN-γ nach einer Stimulation mit beiden rLbhsp83-Polypeptiden, Parasiten-Lysat und Lbhsp70 analysiert, einem L. braziliensis-Protein, das zu dem eukaryotischen 70 kD-Hitzeschockprotein homolog ist (10A). Im Allgemeinen stimulierte rLbhsp83a die Patienten-PBMC dahingehend, höhere Niveaus von IFN-γ zu sezernieren, als dies rLbhsp83b (0,2 bis 36 bzw. 0,13 bis 28 ng/ml) tat. Die Anwesenheit von sezerniertem IFN-γ korrelierte gut mit der entsprechenden mRNA, die mittels PCR nachgewiesen wurde.
PBMC aus vier von fünf ML-Patienten (I, II, V und VII) hatten Überstand-TNF-α-Niveaus (0,8 bis 2,2 ng/ml), die höher als diejenigen waren, die in Kulturen von PBMC aus nicht-infizierten Kontrollen nach einer Stimulation mit Parasiten-Lysat (10B) nachgewiesen wurden. In ähnlicher Weise wurden dieselben PBMC durch rLbhsp83 stimuliert, um Niveaus von TNF-α im Überstand im Bereich von 0,61 bis 2,9 ng/ml zu erzeugen. Im Vergleich mit denjenigen von nicht-infizierten Kontrollen erzeugten die PBMC von drei (I, V und VI), fünf (I, II, IV, V und VI), und zwei (II und V) aus sechs analysierten Individuen höhere Niveaus von TNF-α in Antwort auf Parasiten-Lysat, rLbhsp83a bzw rLbhsp83b. Die Niveaus an durch PBMC von CL-Patienten erzeugtem TNF-α in Antwort auf Parasiten-Lysat waren mit denjenigen vergleichbar, die durch nicht-infizierte Kontrollen erzeugt wurden. Jedoch stimulierte rLbhsp83 die TNF-α-Produktion in den PBMC von zweien aus diesen Patienten. rLbhsp83a stimulierte höhere Niveaus der TNF-α-Produktion, als dies rLbhsp83b tat. In der Abwesenheit der Antigenstimulation ezeugten nur PBMC aus ML-Patienten (fünf von sechs) nachweisbare Niveaus an Überstand-TNF-α (60 bis 190 pg/ml).
In Übereinstimmung mit der IL-10-mRNA wurde IL-10 mittels ELISA in den Antigenstimulierten PBMC-Kulturüberständen aus ML- und CL-Patienten nachgewiesen. Die Niveaus (49 bis 190 pg) waren signifikant höher (bis zu 10-fach) nach einer Stimulation mit rLbhsp83a im Vergleich mit denjenigen nach einer parallelen Stimulation der selben Zellen mit rLbhsp83b (11). Parasiten-Lysat stimulierte ebenso PBMC von einigen der Patienten, um IL-10 zu erzeugen. Obwohl rLbhsp83 PBMC von nicht-infizierten Individuen stimulierte, um IL-10 zu erzeugen, mit einer Ausnahme, waren die Niveaus niedriger als diejenigen, die bei Patienten-PBMC beobachtet wurden. IL-4 wurde in keinem der analysierten Überstände nachgewiesen. Deshalb liegt das Niveau von jeglichen sezerniertem IL-4 unter halb der Nachweisgrenze des verwendeten ELISA (50 pg/ml). Im Zusammenhang zeigen die Ergebnisse, daß ein Cytokin-Profil vom überwiegenden Thl-Typ mit PBMC aus L. braziliensis-infizierten Individuen nach einer Stimulation mit rLbhsp83-Polypeptiden assoziiert ist.
Um die Korrelation zwischen den beobachteten T-Zellen-Antworten und der Antikörperproduktion auf Lbhsp83 zu bestimmen, verglichen wir die Antikörper (Immunglobulin G)-Reaktivitäten auf Lbhsp83 in Seren von drei Patientengruppen (12). Die ELISA-Reaktivitäten der ML-Patienten-Seren mit rLbhsp83 waren mit denjenigen vergleichbar, die für Parasiten-Lysat beobachtet wurden, und im allgemeinen gab es eine direkte Korrelation zwischen ML-Patient-Anti-Lbhsp83-Antikörpertiter und T-Zell-Proliferation. Aus 23 Serumproben von den analysierten ML-Patienten waren 22 positiv (~ 96%) mit Extinktionswerten von 0,20 bis > 3,0. Elf der ML-Patienten-Serum-Proben hatten optische Dichtewerte, die > 1 waren. Im allgemeinen hatten CL-Patienten signifikant niedrigere anti-Lbhsp83-Antikörper-Titer (x = 0,74; Standardfehler des Mittelwerts [SEM] = 0,1) im Vergleich mit denjenigen von ML-Patienten. Deshalb korrelierten ML- und CL-Patient-Anti-rhsp83-Antikörpertiter mit ihren entsprechenden T-Zell-proliferativen Antworten. Anti-rLbhsp83-Antikörpertiter waren signifikant höher bei Patienten mit ML (x = 1,5; SEM = 0,2) als bei selbstheilenden CL-Patienten (x = 0,35; SEM = 0,056), obwohl ihre T-Zell-proliferativen Antworten ähnlich waren. In der Tat waren die anti-Lbhsp83-Antikörpertiter im Serum von selbst-heilenden CL-Patienten mit denjenigen vergleichbar aus nicht-infizierten Kontrollen (x = 0,24; SEM = 0,028). Unter Verwendung von zwei Standardabweichungen größer als der mittlere Extinktionswert der nicht-infizierten Kontrolle (0,484) als ein Kriterium für eine positive Reaktivität auf Lbhsp83, waren acht von neun der selbstheilenden Patientenserumproben, die getestet wurden, negativ.
Beispiel 4
Herstellung von Klonen, die für Lt-210 kodieren
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung von Klonen, die für Teile des Leishmania-Antigens Lt-210 kodieren, und das die in SEQIDNO: 8 aufgeführte Sequenz hat.
Eine Expressionsbibliothek wurde aus L. tropica (MHOM/SA/91/WR1063C)-genomischer DNA konstruiert. Die DNA wurde durch Solubilisieren von L. tropica-Promastigoten in 10mM Tris-HCl, pH 8,3, 50mM EDTA, 1% SDS, und Behandlung mit 100μg/ml RNaseA und 100μg/ml Proteinase K isoliert. Die Probe wurde dann sequentiell mit einem gleichen Volumen an Phenol, Phenol: Chloroform (1 : 1) und Chloroform extrahiert. Die DNA wurde durch die Zugabe von 0,1 Volumen 3M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumina 95% Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde in 10μM Tris, 1mM EDTA resuspendiert. Die DNA wurde durch Passage durch eine 30-Gauge-Nadel auf einen Größenbereich von 2-6-Kilobasen geschert und wurde mittels Inkubation mit DNA polI in der Anwesenheit von 100μM jedes dATP, dCTP, dGTP und dTTP repariert. EcoRI-Adapter wurden an die DNA-Fragmente ligiert. Nach Entfernen der nicht-ligierten Adapter durch Passage über eine G-25 Sephadex^TM-Säule wurden die Fragmente in EcoRI-geschnittenen Lambda-ZapII eingeführt (Stratagene, La Jolla, CA).
Näherungsweise 43.000 pfu wurden ausplattiert und mit Seren gescreent, die aus viszerotropen Leishmaniasis-Patienten (VTL) isoliert worden waren. Seren von VTL-Patienten wurden von Drs. M. Grogl und A. Magill erhalten. Die VTL-Patientengruppe schloß acht Individuen ein, aus denen Parasiten isoliert und kultiviert worden waren, von denen sieben eine bestätigte Infektion mit L. tropica hatten. Vier andere Patienten waren Kultur negativ, wurden aber immer noch als infiziert angesehen auf Grundlage von entweder einer PCR-Analyse oder einem positiven monoklonalen Antikörper-Abstrich (Dr. Max Grogl, persönliche Mitteilung). Serumproben der elf infizierten Patienten wurden vereinigt und die anti-E. coli-Reaktivität durch Affinitätschromatographie entfernt (Sambrook et al., oben, p. 12.27–12.28). Lambda Phagen, die reaktive Proteine exprimierten, wurden nach Antikörperbindung durch Protein-A-Meerrettichperoxidase und ABTS-Substrat nachgewiesen.
Drei Klone, Lt-1, Lt-2 und Lt-3, enthaltend einen Teil des Lt-210 Gens, wurden identifiziert und aufgereinigt. Die Klone reichten im Bereich von 1,4 bis 3,3 kb und kodierten für Polypeptide von 75 kD, 70 kD bzw. 120 kD. Diese drei Klone enthalten partielle Sequenzen des Lt-210-Gens. Lt-1 und Lt-2 sind überlappende Klone und wurden für weitere Studien ausgewählt.
Die DNA-Sequenzen von Lt-1 und Lt-2 wurden bestimmt. Exonuclease III-Verdauung wurde verwendet, um überlappende Deletionen der Klone zu erzeugen (Heinikoff, Gene 28: 351–359, 1984). Eine Einzelstrangmatrize wurde hergestellt, und die Sequenz mittels eines automatisierten Sequenzierer von Applied Biosystems, Modell 373A, oder mit dem Sanger-Dideoxy-Sequenzieren bestimmt. Die Sequenz an beiden Strängen des kodierenden Teils des Lt-1-Klons wurde bestimmt. Die partielle Sequnez eines Strangs von Lt-2 wurde bestimmt.
SEQ ID NO: 7 zeigt die DNA-Sequenz von Lt-1, und SEQ ID NO: 8 zeigt die vorgesagte Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens. Die DNA-Sequenz des kodierenden Teils des Lt-1-Klons beinhaltet eine sich wiederholende Nukleotidsequenz an dem 5'-Teil des Klons, enthaltend acht Kopien eines 99 bp-repeat, drei Kopien einer 60 bp-repeat-Einheit, die Teil des größeren 99 bp-repeat ist, und 800 bp einer nicht-Repeat-Sequenz. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des 99 bp-repeat enthält beschränkte Degenerationen. Die Masse des vorhergesagten rekombinanten Proteins ist 67.060 Daltons. Eine Datenbanksuche von PIR mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens ergab keine signifikante Homologie zu zuvor eingereichten Sequenzen. Die vorhergesagte Sekundärstruktur des Repeat-Teils des Klons ist vollständig α-helikal.
Eine Sequenzanalyse des Lt-2 zeigte, daß der 3'-Teil des Klons aus einer Mischung aus 60- und 99-bp-Repeats bestand, die mit den 60- und 99-bp-repeats, die in Lt-1 beobachtet wurden, identisch waren, abgesehen von gelegentlichen Degenerationen. Kollektiv legen die Sequenzierungsdaten nahe, daß Lt-1 und Lt-2 unterschiedliche Teile desselben Gens sind, wobei Lt-2 stromauf von Lt-1 ist, mit möglicherweise einer geringen Überlappung.
Eine Hybridisierungsanalyse bestätigte, daß rLt-2 und rLt-1 überlappende Sequenzen enthalten. Die genomischen DNAs verschiedender Leishmania Spezies wurden mit unterschiedlichen Enzymen restriktionsgeschnitten, mittels Agarose-Gelelektrophorese getrennt und auf Nytran-Membran-Filter geblottet. (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Inserts von rLt-1 und rLt-2 wurden mit ³²P-CTP mittels reverser Transkriptase von Random-Oligonucleotid-Primern markiert und als Sonden nach Trennung von nicht-eingebauten Nukleotiden auf einer Sephadex-G-50-Säule verwendet. Die Hybridisierungen unter Verwendung der rLt-1 oder der rLt-2-Sonde werden in 0,2M Na₂HPO₄/3,6M NaCl bei 65°C durchgeführt, während die Hybridisierung unter Verwendung der rLt-1r-Sonde in 0,2M Na₂HPO₄/3,6M NaCl/0,2 M EDTA bei 60°C über Nacht durchgeführt wird. Die Filter werden in 0,075 M NaCl/0,0075 M Natriumcitrat pH 7,0 (0,15 M NaCl/0,0150 M Natriumcitrat für die Lt-1r-Sonde) gewaschen, plus 0,5% SDS bei der selben Temperatur als Hybridisierung.
Die genomische DNA von einer Anzahl von Leishmania-Spezies, einschließlich L. tropica, wurden mit Southern Blots analysiert, wie oben beschrieben, unter Verwendung der Lt-1, Lt-2 und Lt-1r-Inserts getrennt als Sonde. Kollektiv zeigen verschiedene Verdaue von L. tropica- DNA, daß dieses Gen eine geringe Kopienzahl hat. Ein ähnliches, überlappendes Muster wurde beobachtet unter Verwendung von entweder dem Lt-1- oder Lt-2-Insert als eine Sonde, übereinstimmend mit der Annahme, daß diese beiden Klone Sequenzen enthalten, die nahe zueinander oder miteinander überlappend sind. Zusätzlich liegen Sequenzen, die mit diesen Klonen hybridisieren, in anderen Leishmania-Spezies vor.
L. tropica-Isolate haben eine beschränkte Heterogenität. Southern-Analysen der verdauten genomischen DNA von vier L. tropica-Parasiten-Stämmen, isoliert aus VTL-Patienten, und drei L. tropica-Parasiten-Stämme, isoliert aus CL-Fällen (zwei humane Fälle, ein Hund), wurden durchgeführt. Das unten beschriebene Lt-1r-insert wurde markiert und als eine Sonde verwendet. Die sieben unterschiedlichen L. tropica-Isolate ergaben ähnliche Intensitäten und Restriktionsmuster, mit nur einem einzelnen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus unter den Isolaten. Diese Daten zusammen mit den Southern-Analysen mit zusätzlichen Enzymen weisen auf eine beschränkte Heterogenität in dieser Region unter den L. tropica-Isolaten hin.
Die rekombinanten Proteine von Lt-1 und Lt-2 wurden exprimiert und aufgereinigt. Der eingenistete (nested) Deletionssatz von Lt-1, der zum Sequenzieren gebildet wurde, schloß einen Klon ein, der als Lt-1r bezeichnet wird, der ein und ein Drittel Repeats enthält. Dieses Polypeptid wurde ebenso exprimiert und aufgereinigt. Eine in-vivo-Exzision des pBluescript SK--Phagemid aus Lambda Zap II wurde durchgeführt gemäß dem Protokoll des Herstellers. Phagemid-Viruspartikel wurden verwendet, um E. coli XL-1-Blau zu infizieren. Die Herstellung von Protein wurde durch die Zugabe von IPTG induziert. Protein wurde gewonnen, indem man zuerst die Pellets von induzierten Bakterien in Puffer lysierte (LB, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100mM NaCl, 10 mM EDTA), unter Verwendung einer Kombination von Lysozym (750μg/mL) und Beschallung. rLt-1, rLt-2 und rLt-1r wurden aus den Inclusion Bodies nach Solubilisierung in 8M Harnstoff (rLt-1 und rLt-2) oder 4M Harnstoff (rLt-1r) gewonnen. Die Proteine rLt-1 und rLt-2 wurden angereichert und mittels Fällung mit 25%-40% Ammoniumsulfat abgetrennt, und rLt-1 r wurde mittels Fällung mit 10%–25% Ammoniumsulfat angereichert. Die Proteine wurden weiter mittels präparativer Gelelektrophorese in 10% SDS-PAGE aufgereinigt. Rekombinante Proteine wurden aus den Genen eluiert und in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) dialysiert. Die Konzentration wurde mit dem Pierce (Rockford, IL) BCA-assay gemessen, und die Reinheit mittels Coomassie-Blau-Färbung nach SDS-PAGE beurteilt.
Beispiel 5
Herstellung von LbeIF4A
Dieses Beispiel veranschaulicht das molekulare Klonieren einer DNA-Sequenz, die für das L. braziliensis ribosomale Antigen LbeIF4A kodiert.
Eine genomische Expressionsbibliothek wurde mit gescherter (sheared) DNA aus L. braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) in Bakteriophagen Lambda Zap II (Stratagene, La Jolla, CA) konstruiert. Die Expressionsbibliothek wurde mit E. coli-präadsorbierten Patienten-Serum von einem L. braziliensis-infizierten Individuum mit Schleimhaut-Leishmaniasis gescreent. Plaques, enthaltend immunreaktive rekombinante Antigene wurden aufgereinigt und das pBSK(–)-Phagemid unter Verwendung der Protokolle des Herstellers ausgeschnitten. Eingenistete (nested) Deletionen wurden mit Exonuklease III durchgeführt, um überlappende Deletionen für einzelsträngige Matrizenzubereitungen und das Sequenzieren zu erzeugen. Einzelsträngige Matrizen wurden nach einer Infektion mit VCSM13-Helfer-Phagen isoliert, wie von dem Hersteller empfohlen (Stratagene, La Jolla, CA) und mit dem Dideoxy-Kettenterminationsverfahren oder mit dem Taq-Farbstoffterminationssystem unter Verwendung des automatisierten Sequenzierers von Applied Biosystems, Modell 373A, sequenziert.
Die immunreaktiven rekombinanten Antigene wurden dann in Patienten-T-Zell-Assays auf ihre Fähigkeit analysiert, eine proliferative und Cytokin-Produktion zu stimulieren, wie in Beispielen 7 und 8 unten beschrieben.
Ein rekombinanter Klon wurde in den obigen Assays identifiziert, der nach Sequenzvergleich seiner vorhergesagten Aminosäuresequenz mit Sequenzen von anderen Proteinen als ein Leishmania braziliensis-Homolog des eukaryotischen Initiationsfaktors 4A identifiziert wurde (eIF4A). Dem isolierten Klon (pLeIF.I) fehlten die ersten 48 Aminosäurereste (144 Nukleotide) der Vollängenproteinsequenz. Das pLeIF.I -Insert wurde darauffolgend verwendet, um die genomische Vollängensequenz zu isolieren.
SEQ ID NO: 7 zeigt die gesamte Nukleotidensequenz des Vollängen-LbeIF4A-Polypeptids. Der offene Leserahmen (Nukleotide 115 bis 1323) kodiert für ein 403 Aminosäuren-Protein mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 45,3 kD. Ein Vergleich der vorhergesagten Proteinsequenz von LbeIF4A mit den homologen Proteinen von Tabak (TeIF4A), Maus (MeIF4A) und Hefe (YeIF4A) zeigt weitreichende Sequenzhomologie, wobei die ersten 20– 30 Aminosäuren die variabelsten sind. Die Längen (403, 413, 407 und 395 Aminosäuren), Molekulargwichte (45,3, 46,8, 46,4 und 44,7 kDa) und isoelektrischen Punkte (5,9, 5,4, 5,5,und 4,9) von LbeIF4A, TeIF4A, MeIF4A bzw. YeIF4A sind ähnlich. LbeIF4A zeigt eine Homologie insgesamt von 75,5% (57% Identität, 18,5% konservative Substitution) mit Te-FI4A, 68,6% (50% Identität, 18,6% konservative Substitution) mit MeIF4A und 67,2% (47,6% Identität, 19,6% konservative Substitution) mit YeIF4A.
Beispiel 6
Herstellung von löslichen Leishmania-Antigenen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von löslichen Leishmania-Antigenen aus einem Kulturüberstand von L. major. L. major-Promastigoten werden bis zur späten Log-Phase in Komplexmedium mit Serum wachsen gelassen, bis sie eine Dichte von 2–3 × 10⁷ lebensfähigen Organsmen pro mL Medium erreichen. Die Organismen werden vollständig gewaschen, um die Medienbestandteile zu entfernen und als 2–3 × 10⁷ lebensfähige Organismen pro mL von definiertem serumfreien Medium resuspendiert, bestehend aus gleichen Teilen RPMI 1640 und Medium 199, beide von Gibco BRL, Gaithersburg, MD. Nach 8–12 Stunden wird der Überstand entfernt, 10-fach aufkonzentriert und gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung für 24 Stunden dialysiert. Die Proteinkonzentration wird dann bestimmt und die Anwesenheit von wenigstens acht unterschiedlichen Antigenen mittels SDS-PAGE bestätigt. Diese Mischung wird hierin als „lösliche Leishmania-Antigene" bezeichnet.
Beispiel 7
Vergleich von Interleukin-4 und Interferon-γ-Produktion, die durch Leishmania-Antigene stimuliert worden ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht die immunogenen Eigenschaften der Antigene, die gemäß dem Beispielen 1, 2, 5 und 6 hergestellt worden sind, bestimmt anhand ihrer Fähigkeit, IL-4 und IFN-γ in Lymphknotenkulturen von infizierten Mäusen und in menschlichen PBMC-Zubereitungen zu stimulieren. Lymphknotenkulturen zur Verwendung in diesen Studien wur den aus L. major-infizierten BALB/c Mäusen 10 Tage nach der Infektion hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben. PBMC wurden unter Verwendung von Peripherblut zubereitet, das von Individuen mit ausgeheilten L. donovani-Infektionen erhalten worden war, die immunologisch auf Leishmania reagierten. Die Diagnose der Patienten wurde mittels klinischer Ergebnisse gemacht, die mit wenigstens einem der folgenden assoziiert waren: Isolierung von Parasiten aus Läsionen, ein positiver Hauttest mit Leishmania-Lysat oder einem positiven serologischen Test. Nicht infizierte Individuen wurden auf Grundlage eines Mangels an klinischen Anzeichen oder Symptomen, eines Mangels an einer Geschichte der Aussetzung oder der Reise in endemische Gebiete und auf Grundlage der Abwesenheit einer serologischen oder zellulären Antwort auf Leishmania-Antigene identifiziert. Peripherblut wurde gesammelt und PBMC isoliert mittels Dichtezentrifugation durch Ficoll^TM Winthrop Laboratories, New York).
Kulturüberstände wurden auf die Niveaus von sezernierten IL-4 und IFN-γ getestet. IFN-γ wurde mittels eines Doppel-Sandwich ELISA unter Verwendung von Maus-Anti-Mensch-IFN-γ-mAb (Chemicon, Temucula, CA) und eines polyklonalen Kaninchen-Anti-Mensch-IFN-γ-Serum quantifiziert. Menschliches rIFN-γ (Genentech Inc., San Francisco, CA) wurde verwendet, um eine Standardkurve zu erzeugen. IL-4 wurde in Überständen mittels eines Doppel-Sandwich-ELISA unter Verwendung eines Maus-Anti-Mensch-IL-4-mAb (M1) und eines polyklonalen Kaninchen-Anti-Mensch-IL-4-Serum (P3) quantifiziert. Menschliches IL-4 (Immunex, Corp., Seattle, WA) wurde verwendet, um eine Standardkurve im Bereich von 50 pg/ml bis 1 ng/ml zu erzeugen.
13A und 13B veranschaulichen das mittlere Niveau an sezerniertem IL-4 bzw. IFN-γ, 72 Stunden nach Zugabe von 10 μg/mL von jedem der folgenden Antigene zu einer Lymphknotenkultur, die wie oben beschrieben hergestellt wurde: Lösliches Leishmania-Antigen (d. h. ein Extrakt, hergestellt aus zerstörten Promastigoten, der Membran- und interne Antigene (SLA) enthält), Ldp23, LbeIF4A (LeIF), Lbhsp83, M15 und LmeIF (das L. major-Homolog zu LbeIF4A). Die Niveaus an sezerniertem Il-4 und IFN-γ im Medium alleine (d. h. nicht-simuliert) werden ebenso gezeigt. Während SLA überwiegend eine Th2-Antwort aus Lymphknotenzellen von Leishmania-infizierten Mäusen hervorruft, rief Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83 und M15 relativ wenig IL-4 und große Mengen an IFN-γ hervor, was mit einem Th1-Antwort-Profil übereinstimmt.
14 zeigt das Niveau an sezerniertem IFN-γ in einem Kulturfiltrat aus infizierten und nicht-infizierten menschlichen PBMC-Zubereitungen 72 Stunden nach der Zugabe von 10μg/mL L. major-Lysat, M15 oder L-Rack, einem immundominanten Leishmania-Antigen in muriner Leishmaniasis. In ähnlicher Weise veranschaulicht 15 das Niveau an sezerniertem IFN-γ in Kulturfiltrat aus infizierten und nicht-infizierten menschlichen PBMC-Zubereitungen 72 Stunden nach der Zugabe von 10μg/mL L. major-Lysat, löslichen Leishmania-Antigenen (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 6) oder L-Rack. Diese Resultate weisen darauf hin, daß M15 und lösliche Leishmania-Antigene, aber nicht L-Rack potente Stimulatoren der IFN-γ-Produktion in Patienten-PBMC, aber nicht in PBMC sind, die von nicht-infizierten Individuen erhalten worden sind. Daher rufen M15 und lösliche Leishmania-Antigene ein überwiegendes Th1-Cytokin-Profil bei sowohl Mäusen als auch Menschen hervor, die mit Leishmania infiziert sind.
Beispiel 8
Vergleich der Proliferation, die durch Leishmania-Antigene stimuliert wird.
Dieses Beispiel illustriert die immunogenen Eigenschaften der Antigene, die gemäß den Beispielen 1, 2, 5 und 6 hergestellt worden sind, bestimmt anhand ihrer Fähigkeit, die Proliferation in Lymphknotenkulturen aus infizierten Mäusen und in menschlichen PBMC-Zubereitungen zu stimulieren.
Für in-vitro-Proliferationsessays wurden 2–4 × 10⁵ Zellen/Napf in vollständigem Medium (RPMI 1640 supplementiert mit Gentamycin, 2-ME, L-Glutamin, und 10% gescreentes, vereintes A+-menschliches Serum; Trimar, Hollywood, CA) in 96-Napf-Platten mit flachem Boden mit oder ohne 10μg/ml der angezeigten Antigene oder 5μg/ml PHA (Sigma Immunochemicals, ST. Louis, MO) für fünf Tage kultiviert. Die Zellen wurden dann mit 1 μCi [³H]-Thymidin für die letzten 18 Stunden der Kultur gepulst.
16 zeigt die Proliferation, die nach Zugabe von 10 μg/mL oder 20 μg/mL von jedem der folgenden Antigene zu einer Lymphknotenkultur, beobachtete wurde, die, wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellt worden war: SLA, Ldp23, LbeIF4A, Lbhsp83 und M15. Das Niveau der Proliferation ohne die Zugabe von Antigen wird ebenso gezeigt. Daten werden als mittlere cpm dargestellt. Diese Resultate zeigen, daß eine Vielzahl von Leishmania-Antigenen zu ei ner stimulatorischen Lymphknotenzellproliferation von Leishmania-infizierten Mäusen in der Lage sind.
17 und 18 veranschaulichen die Proliferation, die in menschlichen PBMC-Zubereitungen aus Leishmania-immunen und nicht-infizierten Individuen beobachtet werden, nach der Zugabe von 10μg/mL M15 bzw. löslichen Leishmania-Antigenen. Diese Werte werden mit der Proliferation verglichen, die nach der Zugabe von Kulturmedium, L. major-Lysat oder L-Rack beobachtet wird. Die Resultate zeigen, daß M15 und lösliche Leishmania-Antigene die Proliferation in Leishmania-immunen PBMC stimulieren, aber nicht in PBMC, die von nicht-infizierten Individuen erhalten werden, was zeigt, daß M15 und lösliche Antigene (aber nicht L-Rack) von PBMC aus Individuen erkannt werden, die gegenüber Leishmania aufgrund einer früheren Infektion immun sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Polypeptid, umfassend einen immunogenen Teil eines Leishmania-Antigens mit der in SEQ ID NO: 2 aufgeführten Aminosäuresequenz oder eine Variante des besagten Antigens, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet und die die Fähigkeit beibehält, eine Immunantwort zu induzieren.
Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend Aminosäuren 1 – 546 von SEQ ID NO: 2.
Ein isoliertes DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei die Nukleotidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: a) Nukleotiden 421 bis 2058 von SEQ ID NO: 1, und b) DNA-Sequenzen, die an eine zu Nukleotiden 421 bis 2058 von SEQ ID NO: 1 komplementäre Nukleotidsequenz unter moderat stringenten Bedingungen hybridisieren.
Ein rekombinanter Expressionsvektor, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 3.
Eine Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 5.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1 und einen physiologisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, weiterhin umfassend lösliche Leishmania-Antigene.
Ein Vakzin, umfassend ein isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1 und einen nicht-spezifischen Immunantwort-Verstärker.
Vakzin nach Anspruch 9, weiterhin umfassend lösliche Leishmania-Antigene.
Vakzin nach Anspruch 9, wobei der nicht-spezifische Immunantwort-Verstärker ein immunogener Teil eines Leishmania-Antigens mit der in SEQ ID NO: 10 aufgeführten Aminosäuresequenz oder eine Variante des besagten Antigens ist, die sich nur in konservativen Substitutionen und/oder Modifizierungen unterscheidet.
Vakzin nach Anspruch 9 oder 11, weiterhin umfassend einen Träger zur Abgabe.
Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung als ein Medikament.