DE69838948T2

DE69838948T2 - Epitopen eines extrazellulären antigens

Info

Publication number: DE69838948T2
Application number: DE69838948T
Authority: DE
Inventors: Marcus A. Los Angeles HORWITZ; Günter Los Angeles HARTH; Bai-Yu Los Angeles LEE
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2008-10-02
Anticipated expiration: 2018-01-16
Also published as: EP1005365A1; AU6029898A; EP1005365B1; CA2278116A1; WO1998031388A1; ATE382368T1; EP1005365A4; JP2001512435A; DE69838948D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf immunotherapeutische Mittel und Vakzine gegen pathogene Bakterien. Spezifischer verwendet die vorliegende Erfindung, anders als die Vakzine auf dem Stand der Technik und immunotherapeutische Mittel, die auf pathogenen Untereinheiten oder Produkten basieren, die die größte oder spezifischste molekulare Immunogenität aufweisen, die am stärksten prävalierenden oder in hohem Maße abundanten immunogenen Determinanten, die durch das ausgewählte Pathogen Mycobacterium tuberculosis freigesetzt werden, um eine wirksame Immunreaktion in einem Säugerwirt zu stimulieren. Dementsprechend richtet sich die erworbene Immunität und die immunotherapeutische Aktivität, die durch die vorliegende Erfindung produziert wird, auf jene Antigenmarker, die sich während des Verlaufs einer pathogenen Infektion am häufigsten auf infizierten Wirtszellen zeigen, ohne besonderer Berücksichtigung der relativen oder absoluten Immunogenität der verabreichten Verbindung.
STAND DER TECHNIK
Es ist schon seit langem bekannt, dass parasitische Mikroorganismen die Fähigkeit besitzen, Tiere zu infizieren, und dadurch Krankheit und häufig den Tod des Wirts verursachen. Pathogene Stoffe waren im Verlauf der Geschichte eine Haupttodesursache und sie bringen weiterhin großes Leid mit sich. Obgleich die letzten hundert Jahre dramatische Fortschritte bei der Vorbeugung und Behandlung vieler Infektionskrankheiten gesehen haben, begrenzen komplizierte Wirt-Parasit-Wechselwirkungen noch immer die universelle Wirksamkeit therapeutischer Maßnahmen. Die Schwierigkeiten beim Bekämpfen der komplizierten Invasionsmechanismen, die sich in vielen pathogenen Vektoren zeigen, werden durch das Wiederaufleben verschiedener Krankheiten, wie etwa Tuberku lose, sowie dem Auftreten zahlreicher medikamentenresistenter Bakterien- und Virenstämme belegt.
Unter diesen pathogenen Stoffen von großer epidemiologischer Bedeutung, haben sich intrazelluläre Bakterien als besonders widerständig gegenüber therapeutischen oder prophylaktischen Maßnahmen erwiesen. Intrazelluläre Bakterien, einschließlich der Gattung Mycobacterium und der Gattung Legionella, verbringen ihren gesamten Lebenszyklus oder einen Teil davon eher innerhalb der Zellen des infizierten Wirtsorganismus als außerhalb der Zellen. Überall auf der Welt sind intrazelluläre Bakterien jährlich für Millionen von Toten und unsägliches Leiden verantwortlich. Tuberkulose, verursacht von Mycobacterium tuberculosis, ist, mit jährlich 10 Millionen neuen Fällen und 2,9 Millionen Toten weltweit die Hauptursache für Tod durch Infektionskrankheit. Außerdem sind intrazelluläre Bakterien für Millionen von Leprafällen verantwortlich. Andere entkräftende Krankheiten, die durch intrazelluläre Stoffe übertragen werden, beinhalten kutane und viszerale Leishmaniasis, American trypanosomiasis (Chagas'sche Krankheit), Listeriose, Toxoplasmose, Histoplasmose, Trachom, Psittakose, Q-Fieber und Legionellose einschließlich der Legionärskrankheit. Momentan kann nur relativ wenig getan werden, um schwächenden Infektionen bei empfänglichen Individuen vorzubeugen, die diesen Organismen ausgesetzt sind.
Aufgrund dieses Unvermögens, Bevölkerungen wirksam vor Tuberkulose wirksam zu schützen und der inhärenten Morbidität und Mortalität von Menschen, die durch Tuberkulose verursacht wird, ist dies eine der wichtigsten Krankheiten, mit denen die Menschheit konfrontiert ist. Spezifischer ist Lungentuberkulose, die primär von M. tuberculosis verursacht wird, in Entwicklungsländern eine Haupttodesursache. M. tuberculosis, das in der Lage ist, im Innern von Makrophagen und Monozyten zu überleben, kann eine chronische intrazelluläre Infektion produzieren. Indem es sich innerhalb der Zellen verbirgt, die primär für die Detektion von Fremdelementen und die anschließende Aktivierung des Immunsystems verantwortlich sind, ist M. tuberculosis relativ erfolgreich, wenn es darum geht, den normalen Abwehrmechanismen des Wirtsorganismus zu entkommen. Eben diese pathogenen Merkmale haben früher die Entwicklung eines wirksamen immunotherapeutischen Stoffes oder einer Vakzine gegen tuberkulöse Infektionen verhindert. Gleichzeitig ist es relativ leicht, Tuberkelbazillen zu kultivieren und unter Laborbedingungen zu beobachten. Dementsprechend eignet sich M. tuberculosis besonders gut, um die Prinzipien und Vorteile der vorliegenden Erfindung nachzuweisen.
Es wird derzeit davon ausgegangen, dass ungefähr die Hälfte der Weltbevölkerung mit M. tuberculosis infiziert ist, was jährlich zu Millionen von Fällen von Lungentuberkulose führt. Zwar ist diese Krankheit in den Entwicklungsländern Lateinamerikas, Afrikas und Asiens ein akutes Gesundheitsproblem, sie breitet sich aber auch in der ersten Welt weiter aus. In den Vereinigten Staaten haben spezifische Bevölkerungsgruppen ein erhöhtes Risiko, insbesondere arme, immungeschwächte Individuen in Städten und Immigranten aus Gebieten, in denen die Krankheit weit verbreitet ist. Größtenteils aufgrund der AIDS-Epidemie steigt die Tuberkuloseinzidenz aktuell entwickelten Ländern an, häufig in Form von M. tuberculosis mit mehrfacher Medikamentenresistenz.
Unlängst wurde von einer Tuberkuloseresistenz gegenüber einem oder mehreren Medikamenten in 36 der 50 Staaten der USA berichtet. In New York City war ein Drittel aller 1991 getesteten Fälle gegen ein oder mehrere Hauptmedikamente resistent. Obgleich nicht resistente Tuberkulose mit einer langfristigen Antibiotikabehandlung geheilt werden kann, ist der Ausblick hinsichtlich medikamentenresistenter Stämme düster. Patienten, die mit Stämmen infiziert sind, die gegenüber zwei oder mehreren Hauptantibiotika resistent sind, haben eine Sterblichkeitsrate von etwa 50 Dementsprechend wird eine sichere und wirksame Vakzine gegen solche Varianten von M. tuberculosis dringend benötigt.
Erstinfektionen mit M. tuberculosis finden fast immer durch das Inhalieren aerosolierter Partikel statt, da das Pathogen Wochen- und monatelang in feuchtem oder trockenem Sputum lebensfähig bleiben kann. Obwohl der primäre Ort der Infektion in der Lunge ist, kann der Organismus auch eine Infektion von Knochen, Milz, Meninx und Haut verursachen. Abhängig von der Virulenz des besonderen Strangs und der Resistenz des Wirts, können die Infektion und der entsprechende Schaden am Gewebe geringer oder ausgedehnt sein. Bei Menschen wird die Erstinfektion bei der Mehrzahl der Individuen, die virulenten Bakterienstämmen ausgesetzt sind, kontrolliert. Die Entwicklung erworbener Immunität, die auf die erste Provokation folgt, reduziert die bakterielle Proliferation, wodurch die Läsionen heilen können und das Subjekt größtenteils symptomlos, aber möglicherweise ansteckend bleibt.
Wenn M. tuberculosis von dem infizierten Subjekt nicht kontrolliert wird, führt dies häufig zu einer ausgedehnten Schädigung von Lungengewebe. Bei empfindlichen Individuen werden die Läsionen üblicherweise in der Lunge gebildet, da die Tuberkelbazillen sich innerhalb von alveolaren oder pulmonaren Makrophagen reproduzieren. Mit der Vermehrung der Organismen können sie sich durch das lymphatische System in distale Lymphknoten und durch den Blutstrom in die Lungenspitzen, Knochenmark, Niere und Meninx, die das Gehirn umgibt, ausbreiten. Primär werden als Ergebnis der zellvermittelten Überempfindlichkeitsreaktionen charakteristische granulomatöse Läsionen oder Tuberkel anteilig zur Schwere der Infektion produziert. Diese Läsionen bestehen aus Epithelioidzellen, die von Monozyten, Lymphozyten und Fibroblasten umgeben sind. In den meisten Fällen wird eine Läsion oder ein Tuberkel schließlich nekrotisch und unterliegt der Verkäsung.
Zwar ist M. tuberculosis ein signifikantes Pathogen, jedoch verursachen auch andere Spezies der Gattung Mycobacterium Krankheiten bei Tieren, einschließlich Menschen, und sind ausdrücklich im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten. Zum Beispiel ist M. bovis eng mit M. tuberculosis verwandt und für tuberkulöse Infektionen bei Haustieren, wie etwa Rindern, Schweinen, Schafen, Pferden, Hunden und Katzen verantwortlich. Ferner kann M. bovis Menschen über den Verdauungstrakt infizieren, typischerweise durch die Ingestion von Rohmilch. Die lokalisierte intestinale Infektion breitet sich schließlich auf den Respirationstrakt aus und bald darauf folgen die klassischen Symptomen der Tuberkulose. Ein anderer wichtiger pathogener Vektor der Gattung Mycobacterium ist M. leprae, der millionenfach Fälle der uralten Krankheit Lepra verursacht. Andere Spezies dieser Gattung, die Krankheiten bei Tier und Mensch verursachen beinhalten M. kansasii, M. avium intracellulare, M. fortuitum, M. marinum, M. chelonei, M. africanum, M. ulcerans, M. microti und M. scrofulaceum. Die pathogenen mykobakteriellen Spezies weisen häufig einen hohen Grad an Homologie in ihrer jeweiligen DNA und den entsprechenden Proteinsequenzen auf, und einige Spezies, wie etwa M. tuberculosis und M. bovis sind nah verwandt.
Aus nahe liegenden praktischen und moralischen Gründen ist die Anfangsarbeit zur Bestimmung der Wirksamkeit der experimentellen Zusammensetzungen bezüglich solchen Leiden beim Menschen nicht möglich. Dementsprechend ist es bei der Frühentwicklung jedes Medikaments oder jeder Vakzine eine Standardprozedur, aus Sicherheits- und Kostengründen geeignete Tiermodelle zu benutzen. Der Erfolg des Einsatzes von Versuchstiermodellen beruht auf der Voraussetzung, dass immunodominante Epitope häufig in verschiedenen Wirtsspezies aktiv sind. Somit wird eine immunogene Determinante in einer Spezies, zum Beispiel einem Nagetier oder einem Meerschweinchen, im Allgemeinen in einer anderen Spezies, wie etwa dem Menschen, immunoreaktiv sein. Erst nachdem die geeigneten Tiermodelle ausreichend entwickelt wurden, werden klinische Versuche beim Menschen durchgeführt, um ferner die Sicherheit und Wirksamkeit einer Vakzine beim Menschen nachzuweisen.
Bezüglich der alveolaren oder pulmonaren Infektionen durch M. tuberculosis ähnelt das Meerschweinchenmodell der menschlichen Pathologie der Krankheit in vielerlei Hinsicht stark. Dementsprechend wird ein Fachmann gut verstehen, dass es geeignet ist, das Meerschweinchenmodell dieser Krankheit auf Menschen und andere Säuger zu extrapolieren. Wie der Mensch sind Meerschweinchen für eine tuberkuläre Infektion mit geringen Dosen des aerosolierten menschlichen Pathogens M. tuberculosis empfänglich. Anders als beim Menschen, bei dem die Erstinfektion üblicherweise kontrolliert wird, entwickeln Meerschweinchen nach dem Aussetzen an das aerosolierte Pathogen konsistent eine disseminierte Krankheit, wodurch die anschließende Analyse erleichtert wird. Ferner zeigen sowohl Meerschweinchen als auch Menschen kutane Überemfindlichkeitsreaktionen vom verzögerten Typ, die durch die Entwicklung einer dichten mononuklearen Zellinduration oder eines harten Bereichs auf der Haut der Teststelle gekennzeichnet sind. Schlussendlich weisen die charakteristischen tuberkulären Läsionen von Menschen und Meerschweinchen eine ähnliche Morphologie auf, einschließlich der Gegenwart von Langhans-Riesenzellen. Da Meerschweinchen gegenüber einer Erstinfektion und der Progression der Krankheit empfindlicher sind als Menschen, stellt jeder Schutz, der in den Versuchen unter Verwendung dieses Tiermodells verleihen wird, eine starke Indikation bereit, dass der gleiche Impfschutz beim Menschen oder anderen weniger empfindlichen Säugern erzeugt werden kann. Dementsprechend wird die vorliegende Erfindung nur zum Zwecke der Erläuterung und nicht zum Zweck der Beschränkung primär im Versuchskontext der Meerschweinchen als dem Sängerwirt nachgewiesen. Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass die vorliegende Erfindung mit anderen Sängerwirten, einschließlich Menschen und domestizierten Tieren, praktiziert werden kann.
Jedes Tier oder jeder Mensch, der mit einem pathogenen Vektor, und insbesondere einem intrazellulären Organismus infiziert ist, weist eine schwierige Provokation für das Immunsystem auf. Zwar können viele infektiöse Stoffe durch die humorale Reaktion und die entsprechende Produktion schützender Antikörper wirksam kontrolliert werden, aber diese Mechanismen sind primär nur gegen solche Pathogene wirksam, die sich in der Extrazellulärflüssigkeit des Körpers befinden. Insbesondere opsonierende Antikörper binden an extrazelluläre Fremdstoffe und machen sie dadurch anfällig für Phagozytose und anschließende intrazelluläre Vernichtung. Dies trifft auf andere Pathogen jedoch nicht zu. Zum Beispiel haben vorausgehende Untersuchungen darauf hingewiesen, dass die humorale Immunreaktion keine signifikante Schutzfunktion gegen Infektionen durch intrazelluläre Bakterien, wie etwa M. tuberculosis zu sein scheint. Die vorliegende Erfindung kann jedoch eine vorteilhafte humorale Reaktion auf das Zielpathogen erzeugen, und, als solches ist deren Wirksamkeit nicht auf irgendeine spezifische Komponente der stimulierten Immunreaktion beschränkt.
Spezifischer verhindern antikörpervermittelte Abwehrmechanismen anscheinend nicht die Erstinfektion intrazellulärer Pathogene und sie sind unwirksam, sobald die Bakterien innerhalb der Zellen des Wirts sequestriert wird. Als wasserlösliche Proteine können Antikörper das Extrazellulärflüssigkeit und Blut permeieren, haben aber Schwierigkeit, durch die Lipidmembranen der Zellen zu migrieren. Ferner kann die Produktion opsonierender Antikörper gegen bakterielle Oberflächenstrukturen tatsächlich intrazelluläre Pathogene beim Eindringen in die Wirtszelle unterstüt zen. Dementsprechend sollte jede wirksame prophylaktische Maßnahme gegen intrazelluläre Mittel, wie etwa Mycobacterium, eine aggressive zellvermittelte Immunreaktionskomponente aufnehmen, die zur schnellen Proliferation antigenspezifischer Lymphozyten führt, die die beeinträchtigten Phagozyten aktivieren oder sie zytotoxisch eliminieren. Jedoch gleicht, wie nachfolgend ausführlicher diskutiert wird, das Induzieren einer zellvermittelten Immunreaktion die Induktion von Impfschutz nicht aus. Obgleich zellvermittelte Immunität eine Voraussetzung für Impfschutz sein kann, erfordert die Produktion von Vakzinen gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung tierbasierte Provokationsuntersuchungen.
Diese zellvermittelte Immunreaktion beinhaltet im Allgemeinen zwei Schritte. Der erste Schritt, bei dem signalisiert wird, dass die Zelle infiziert ist, erfolgt durch Spezialmoleküle (Haupthistokompatibilitätskomplex- oder MHC-Moleküle) die Teile des Pathogens an die Oberfläche der Zelle bringen. Diese MHC-Moleküle binden an kleine Fragmente der bakteriellen Proteine, die innerhalb der infizierten Zelle beschädigt wurden, und präsentieren sie an der Oberfläche der Zelle. Deren Präsentation an T-Zellen stimuliert das Immunsystem des Wirts, um die infizierte Wirtszelle zu entfernen, oder induziert die Wirtszelle, alle Bakterien, die darin vorhanden sind, zu eliminieren.
Anders als die meisten infektiösen Bakterien neigt Mycobacterium, einschließlich M. tuberculosis, dazu, in Vakuolen zu proliferieren, die im Wesentlichen vom Rest der Zelle durch eine Membran abgeschlossen ist. Phagozyten formen diese schützenden Vakuolen auf natürliche Weise, was sie für eine Infektion mit dieser Pathogenklasse besonders empfindlich macht. In solchen Vakuolen werden die Bakterien wirksam vor der Beschädigung geschützt, was es für das Immunsystem schwierig macht, wesentliche bakterielle Komponenten an der Oberfläche infizierter Zellen zu präsentie ren. Die infizierten Zellen der MHC-Moleküle werden sich jedoch zur Vakuole bewegen und alle freien (freigesetzten) bakteriellen Produkte einsammeln, oder sich an andere Orte in der Wirtszelle bewegen, an die die fremden extrazellulären bakteriellen Produkte transportiert wurden, zur normalen Präsentation der Produkte an der Zelloberfläche. Wie zuvor angegeben, wird die Präsentation der fremden bakteriellen Produkte die passende Reaktion durch das Immunsystem des Wirts hervorrufen.
Die Probleme, die intrazelluläre Pathogene für das Immunsystem darstellen, bilden auch für die Vakzinentwicklung eine spezielle Herausforderung. So sind die meisten Forscher der Produktion einer wirksamen Vakzine gegen Mycobacterium-Infektionen und insbesondere gegen M. tuberculosis ausgewichen. Derzeit ist die einige in großem Umfang verfügbare Vakzine gegen intrazelluläre Pathogene die abgeschwächte Lebendvakzine BCG, einem avirulenten Stamm von M. bovis, der als prophylaktische Maßnahme gegen den Tuberkelbazillus verwendet wird. Schon 1988 haben umfassende Untersuchungen der Weltgesundheitsorganisation aus Indien ermittelt, dass die Wirksamkeit der besten BCG-Vakzine so geringfügig war, dass sie nicht messbar war. Trotz dieser zweifelhaften Wirksamkeit wurde die BCG-Vakzine auf der ganzen Welt in Gebieten mit hoher Tuberkuloseinzidenz ausgiebig benutzt. Was die Sache noch komplizierter macht ist, dass Individuen, die mit BCG geimpft wurden, häufig eine Empfindlichkeit gegenüber Tuberkulin entwickeln, was die Nützlichkeit des häufigsten Hauttests für Screening und Kontrolle von Tuberkulose aufhebt.
Ein anderes ernstes Problem, das die Verwendung einer abgeschwächten Lebendvakzine, wie etwa BCG, mit sich bringt, ist die Gefahr, bei immungeschwächten Patienten eine lebensbedrohliche Krankheit auszulösen. Diese Vakzine stellen für Personen mit verminderter zellvermittelter Immunität besonderes Risiko dar, wegen deren verringerter Fähigkeit, eine schnell proliferierende induzierte Infektion zu bekämpfen. Solche Individuen beinhalten jene, die durch Fehlernährung und schlechte Lebensbedingungen geschwächt sind, Empfänger von Organtransplantaten und Personen, die mit HIV infiziert sind. Bei der BCG-Vakzine beinhalten Individuen mit hohem Risiko auch jene, die an Lungenerkrankungen, wie etwa Emphysem, chronische Bronchitis, Pneumokoniose, Silikose oder vorausgehender Tuberkulose leiden. Dementsprechend ist die Verwendung abgeschwächter Vakzine auf genau die in Bevölkerung beschränkt, bei der sie den größten potentiellen Nutzen haben.
Die Verwendung von abgeschwächten Lebendvakzinen kann auch andere unerwünschte Nebenwirkungen produzieren. Da Lebendvakzine sich im Empfänger reproduzieren, lösen sie ein breiteres Spektrum an Antikörpern und eine weniger zielgerichtete zellvermittelte Immunreaktion aus als nicht infektiöse Vakzine. Oft neigt dieser polypragmatische Ansatz dazu, die Immunreaktion zu okkludieren, die auf die molekularen Strukturen gerichtet ist, die am stärksten an der zellulären Prophylaxe beteiligt sind. Überdies kann die Verwendung von Lebendvakzinen mit einer intakten Membran opsonierende Antikörper induzieren, die einen Fremdkörper auf eine wirksame Phagozytose vorbereiten. Somit könnte, wenn der Wirt virulenten Stämmen des Zielorganismus ausgesetzt wird, die Gegenwart solcher Antikörper tatsächlich die Aufnahme an nicht abgeschwächten Pathogenen in die Wirtszellen verbessern, wo sie überleben und sich vermehren können. Ferner enthält eine abgeschwächte Vakzine tausende verschiedener Molekülspezies und folglich eher eine Molekülspezies, die toxisch ist oder in der Lage, bei dem Patienten eine adverse Immunreaktion hervorzurufen. Andere Probleme mit Lebendvakzinen beinhalten Virulenzreversion, natürliche Ausbreitung an Kontakte, kontaminierende Viren und virale Interferenz und Mühe bei der Standardisierung.
Auf gleiche Weise sind nicht infektiöse Vakzine, wie etwa inaktivierte Organismen oder herkömmliche Subunit-Vakzine der zweiten Generation, die auf stark antigene membrangebundene Strukturen gerichtet sind, hinsichtlich der Inhibition intrazellulärer Bakterien beschränkt. Ebenso wie abgeschwächte Vakzine, rufen inaktivierte Bakterien eine willkürliche Reaktion hervor, die die wirksamsten prophylaktischen Determinanten inhibieren kann. Ferner weisen inaktivierte Vakzine noch große Mengen an für das Immunsystem potentiell antigener Strukturen auf, wodurch die Wahrscheinlichkeit toxischer Reaktionen oder Opsonierung durch das Immunsystem erhöht wird. Traditionelle Subunit-Vakzine, die membrangebundene Strukturen enthalten, egal ob synthetisiert oder gereinigt, können auch eine stark opsonische Wirkung induzieren, was den Eintritt des intrazellulären Pathogens in Phagozyten erleichtert, in denen sie sich vermehren. Durch die Erhöhung der bakteriellen Inklusionsrate können inaktivierte Vakzine, die auf intrazelluläre Oberflächenantigene gerichtet sind, die relative Virulenz des pathogenen Stoffs zu erhöhen. Somit können herkömmliche abgeschwächte oder inaktivierte Vakzine, die gegen stark antigene bakterielle Oberflächenkomponenten gerichtet sind, bei intrazellulären Pathogenen kontraindiziert sein.
Um die Probleme, die mit der Verwendung von traditionellen Vakzinen assoziiert sind, zu umgehen, wurden Entwicklungen unter Verwendung extrazellulärer Proteine oder deren immunogener Analoge gemacht, um Impfschutz gegen spezifische intrazelluläre Pathogene zu stimulieren. Zum Beispiel offenbart die US-Patentschrift Nr. 5,108,745 , ausgestellt am 28. April 1992 dieses Erfinders Vakzine und Verfahren zur Produktion von Impfschutz gegen Legionella pneumophila und M. tuberculosis sowie andere intrazelluläre Pathogene. Diese Vakzine des Stands der Technik basierend weitgehend auf extrazellulären Produkten, die ursprünglich aus proteinhaltigen Verbindungen abgeleitet sind, die von den pathogenen Bakterien in vitro in Bouillonkultur freigesetzt werden und von Bakterien innerhalb infizierter Wirtszellen in vivo extrazellulär freigesetzt werden. Wie hier offenbart, basieren diese Vakzine selektiv auf der Identifizierung extrazellulärer Produkte oder deren Analoge, die eine starke Immunreaktion gegen das Zielpathogen in einem Sängerwirt stimulieren.
Spezifischer wurden diese extrazellulären Kandidatenproteine des Stands der Technik gescreent, indem ihre Fähigkeit bestimmt wurde, entweder eine starke Stimulierbarkeit von Lymphozyten oder eine kutane Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ in Säugern hervorzurufen, die gegen das interessierende Pathogen immun sind. Obgleich dieses offenbarte Verfahren und assoziierte Vakzine viele der Nachteile vermeiden, die der Verwendung traditioneller Vakzine inhärent sind, können widersprüchliche Immunreaktionsergebnisse aufgrund der Kreuzreaktivität und Wirtsvariation die Auswahl wirksamer immunisierender Mittel erschweren. Somit können, während molekulare Immunogenität ein Hinweis für eine wirksame Vakzine ist, andere Faktoren deren Verwendung zum Auslösen einer wirksamen Immunreaktion in vivo erschweren.
Noch wichtiger ist, dass überraschenderweise entdeckt wurde, dass insbesondere hinsichtlich M. tuberculosis, herkömmliche Verfahren des Stands der Technik zum Identifizieren wirksamen Impfschutzes, den Vakzine induzieren, schwerfällig und potentiell unwirksam waren. Zum Beispiel produzierte SDS-PAGE-Analyse von extrazellulärem M.-tuberculosis-Ausgangsprotein gefolgt von herkömmlichen Western-Blot-Techniken, die auf das Identifizieren der am stärksten immunogenen dieser extrazellulären Komponenten zielten, inkonsistente Ergebnisse. Wiederholtes Testen konnte nicht identifizieren, welches extrazelluläre Produkt die stärkste immunogene Reaktion produzieren würde, und, konsistent mit dem Meinung des Stands der Technik, dadurch als die wirksamste Vakzine wirken würde. Viele der extrazellulären Produkte von M. tuberculosis sind dem Fachmann gut bekannt, da sie identifiziert und, in einigen Fällen, sequenziert wurden. Ferner kann, ebenso wie jedes andere Fremdprotein, gezeigt werden, dass diese bekannten Verbindungen eine Immunreaktion induzieren. Jedoch weist auf dem Stand der Technik nichts darauf hin, dass jede dieser bekannten Verbindungen Impfschutz induzieren wird, wie traditionell identifiziert.
Dementsprechend ist eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vakzine oder immunotherapeutische Mittel zum Aufbau einer wirksamen Immunreaktion gegen intrazelluläre Pathogene einschließlich M. tuberculosis, M. bovis, M. kansasii, M. avium-intrazellulare, M. fortuitum, M. chelonei, M. marinum, M. scrofulaceum, M. leprae, M. africanum, M. ulcerans und M. microti bereitzustellen.
Es ist eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, leicht produzierbare Vakzine und immunotherapeutische Mittel bereitzustellen, die bezüglich inaktivierter oder abgeschwächter Vakzine reduzierte Toxizität aufweisen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, erreicht die oben beschriebenen und andere Aufgaben durch das Bereitstellen von Verbindungen zur Verwendung als Vakzine und/oder immunotherapeutische Mittel und Verfahren zu deren Produktion und deren Verwendung, um Impfschutz oder therapeutische Immunreaktionen in Säugerwirten gegen Infektion durch Pathogene zu erzeugen.
Zum Zweck der vorliegenden Offenbarung sollte der Begriff „in hohem Maße abundant" als relativer Begriff verstanden werden, der jene extrazellulären Produkte identifiziert, die von dem interessierenden Pathogen in größter Menge freigesetzt werden. Zum Beispiel sollte hinsichtlich M. tuberculosis, das unter verschiedenen Kulturbedingungen bis auf eine optische Dichte von ungefähr 0,5 gewachsen wird, ein Fachmann erwarten, in der Größenordnung von 10 μg/l oder mehr eines in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkt zu erhalten. Somit werden aus dem gesamten beispielhaften 4 mg/l Gesamtoutput an extrazellulärem Produkt für M. tuberculosis, das unter normalen Bedingungen oder Hitzeschockbedingungen gewachsen wird, bilden ungefähr fünfzehn bis zwanzig (allein oder in Kombination) der etwa einhundert bekannten extrazellulären Produkte ungefähr neunzig Prozent der Gesamtmenge. Dies sind die in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte, die als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Offenbarung liegend erachtet werden und die leicht als die breiten Bande identifizierbar sind, die in SDS/PAGE-Gelen erscheinen. Außerdem können die interessierenden extrazellulären Produkte ferner durch Aminosäuresequenzierung charakterisiert und differenziert werden. Die verbleibenden extrazellulären Produkte sind geringer. Der Fachmann wird auch zu schätzen wissen, dass die relative quantitative Abundanz der spezifischen extrazellulären Hauptprodukte, abhängig von den Kulturbedingungen, variieren kann. In den meisten Fällen wird sich die Identifikation eines einzelnen in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkts verändern.
Dementsprechend können die Verbindungen der Offenbarung verwendet werden, um einen Säugerwirt gegen Infektion mit bakteriellen Pathogenen zu schützen. Die Vakzine der vorliegenden Erfindung sind bei der Erzeugung von Impfschutz gegen verschiedene Spezies und Serogruppen der Gattung Mycobacterium wirksam. Die Vakzine der vorliegenden Offenbarung sind als immunotherapeutische Mittel zur Behandlung von existierenden Krankheitsbedingungen wirksam.
Überraschenderweise wurde von diesem Erfinder herausgefunden, dass die Immunisierung mit den in höchstem oder in hohem Maße abundanten Produkten, die von bakteriellen Pathogenen oder deren immunogenen Analoge extrazellulär freigesetzt werden, eine wirksame Immunreaktion hervorrufen kann, unabhängig von der absoluten Immunogenität der verabreichten Verbindung. Aufgrund ihrer Freisetzung aus dem Organismus und daher deren Verfügbarkeit für Wirtsmoleküle, die an der Antigenverarbeitung und -präsentation beteiligt sind, und aufgrund ihrer hohen natürlichen Konzentration in Gewebe während der Infektion, werden die in hohem Maß abundanten extrazellulären Produkte eines pathogenen Bakteriums häufiger als andere bakterielle Komponenten verarbeitet und dem Wirtsimmunsystem präsentiert. Bei intrazellulären Pathogenen sind die in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte die wichtigsten immunogenen Determinanten, die auf der Oberfläche der infizierten Wirtzellen präsentiert werden, und daher eine größere Präsenz in dem umgebender Milieu aufweisen. Dementsprechend ermöglicht erworbene Immunität gegen die in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte eines pathogenen Bakteriums dem Abwehrsystem des Wirts Pathogene, die im Innern von Wirtszellen sequestriert sind, rasch zu detektieren und sie wirksam zu inhibieren.
Insbesondere scheinen die wesentlichen oder in hohem Maße abundanten Produkte, die von pathogenen Bakterien freigesetzt werden, von Phagozyten und anderen Mechanismen des Immunsystems des Wirts in größerem Tempo verarbeitet zu werden als weniger prävalierende oder membrangebundene pathogene Komponenten, unabhängig von deren jeweiliger immunogenen Aktivität oder Spezifität. Diese Ungleichheit bei der immunologischen Verarbeitung ist besonders signifikant wenn der pathogene Stoff ein intrazelluläres Bakterium ist, das von der normalen Immunaktivität sequestriert ist. Auf Grund ihrer profusen und kontinuierlichen Präsentation an das Immunsystem des infizierten Wirts, rufen die am stärksten prävalierenden bakteriellen extrazellulären Produkte oder deren immunogenen Analoge eine starke Immun reaktion hervor, die größtenteils von deren individuellen molekularen immunogenen Merkmalen unabhängig ist.
In hohem Maße abundante extrazelluläre Produkte sind die wesentlichen Bestandteile von Proteinen und anderen molekularen Objekten, die von dem Zielpathogen in das umgebende Milieu freigesetzt werden. Die gegenwärtige Forschung weist darauf hin, dass in einigen Fällen ein einziges in hohem Maße abundantes extrazelluläres Produkt bis zu 40 Gew.-% des Produkts umfassen kann, das von einem Mikroorganismus freigesetzt wird. Zumeist sind einzelne in hohem Maße abundante extrazelluläre Produkte für zwischen etwa 0,5% bis etwa 25% der gesamten Produkte verantwortlich, die von dem infektiösen Pathogen freigesetzt werden. Überdies kann festgestellt werden, dass die obersten fünf oder sechs in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte zwischen 60% bis 70% der gesamten Masse umfassen können, die von einem Mikroorganismus freigesetzt wird. Natürlich wird der Fachmann zu schätzen wissen, dass die relativen Level extrazellulärer Produkte, wie auch die absolute oder relative Menge an freigesetzten Produkten im Zeitablauf fluktuieren können. Zum Beispiel können pH-Wert, Oxidanzien, Osmolalität, Hitze und andere Stressbedingungen für den Organismus, Phase des Lebenszyklus, Reproduktionsstatus und die Zusammensetzung des umgebenden Milieus die Zusammensetzung und Menge an freigesetzten Produkten verändern. Ferner können die absoluten und relativen Level an extrazellulären Produkten sich von Spezies zu Spezies und sogar zwischen Stämmen innerhalb einer Spezies stark unterscheiden.
Bei intrazellulären Pathogenen scheinen extrazelluläre Produkte die Population von spezifisch immunen Lymphozyten auszubauen, die in der Lage sind, eine antimikrobielle Wirkung gegen Makrophagen, die lebende Bakterien enthalten, zu detektieren und auszuüben. Ferner wirken die in hohem Maße abundanten oder wesentlichen extrazellulären Produkte auf Grund ihrer wiederholten Ausstellung auf der Oberfläche infizierter Zellen als wirksame Antigenmarker. Dementsprechend bringen Impfung und die Induzierung von Impfschutz, der sich gegen die in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte eines pathogenen Bakteriums oder deren immunogen äquivalenten Determinanten richtet, das Immunsystem des Wirts dazu, eine schnelle und wirksame Immunreaktion mit einer starken zellvermittelten Komponente aufzubauen, wenn sie anschließend von dem Zielpathogen infiziert werden.
In direktem Gegensatz zu Immunisierungsaktivitäten des Stands der Technik, die sich primär auf die Produktion von Vakzinen und die Stimulierung der Immunreaktionen, basierend auf der hochspezifischen molekularen Antigenität einzelner gescreenter Pathogenkomponenten konzentrierten, nutzt die vorliegende Offenbarung vorteilhafterweise die relative Abundanz bakterieller extrazellulärer Produkte oder deren immunogener Analoge (anstelle ihrer immunogenen Spezifitäten), um Impfschutz mit Verbindungen zu etablieren oder zu induzieren, die tatsächlich niedrigere immunogene Spezifität als die weniger prävalierenden extrazellulären Produkte aufweisen. Zum Zweck dieser Offenbarung ist ein immunogenes Analog jedes Moleküls oder jeder Verbindung, das (die) mit mindestens einem in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkt ausreichend analog ist, das von dem Zielpathogen exprimiert wird, oder jede Fraktion davon, um die Fähigkeit zu haben, eine schützende Immunreaktion in einem geimpften Sängerwirt nach anschließender Infektion durch das Zielpathogen zu stimulieren. Kurz gesagt werden die Vakzine der vorliegenden Offenbarung identifiziert oder produziert, indem das in hohem Maße abundante Produkt oder Produkte, die extrazellulär von einem spezifischen Pathogen freigesetzt werden (oder molekulare Analoge, die in der Lage sind, eine im Wesentlichen äquivalente Immunreaktion zu stimulieren) ausgewählt werden und indem sie in einer relativ reinen Form isoliert werden oder indem anschließend die DNA oder RNA sequenziert wird, die für deren Produktion verantwortlich ist, um deren synthetische oder endogene Produktion zu ermöglichen. Die gesuchte prophylaktische Immunreaktion gegen das Zielpathogen kann dann ausgelöst werden, indem eine oder mehrere der isolierten immunoreaktiven Produkte oder des kodierenden genetischen Materials unter Verwendung von Techniken formuliert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, und indem ein Sängerwirt vor der Infektion durch das Zielpathogen immunisiert wird.
Die vorliegende Erfindung produziert konsistente, standardisierte Vakzine, die mit relativer Leichtigkeit und Geschwindigkeit entwickelt, getestet und verabreicht werden können. Ferner reduziert die Verwendung einiger weniger gut definierter Moleküle, die den in hohem Maße abundanten sekretorischen oder extrazellulären Produkten entsprechen, das Risiko adverser Nebenwirkungen stark, die mit herkömmlichen Vakzinen assoziiert sind, und eliminiert die mögliche Okklusion wirksamer immunogener Marker. Auf gleiche Weise wird, da die vorliegende Erfindung keine abgeschwächte oder inaktivierte Vakzine ist, das Risiko einer Infektion während der Produktion, Reinigung oder bei der Verabreichung wirksam eliminiert. Als solche können die Vakzine der vorliegenden Erfindung sicher an immungeschwächte Individuen verabreicht werden, einschließlich asymptomatischer Tuberkulosepatienten und Patienten, die mit HIV infiziert sind. Überdies gibt es, da sich die humorale Immunreaktion ausschließlich gegen Produkte richtet, die von dem Zielpathogen produziert werden, kaum eine Gefahr, eine schädliche opsonische Immunkomponente zu erzeugen. Dementsprechend ermöglicht es die vorliegende Erfindung der stimulierten humoralen Reaktion, die Elimination des Zielpathogens aus Antikörper-anfälligen Bereichen zu unterstützen.
Ein anderer günstiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Leichtigkeit, mit der die Vakzine geerntet oder produziert und anschließend gereinigt und sequenziert werden können. Zum Beispiel können die überwiegend abundanten extrazellulären Produkte mit geringem Aufwand aus Kulturen von M. tuberculosis erhalten werden. Da die gesuchten Verbindungen während des Wachstums in die Medien abgegeben werden, können sie aus den intrabakteriellen und membrangebundenen Komponenten des Zielpathogens unter Verwendung herkömmlicher Techniken leicht separiert werden. Stärker bevorzugt können die gesuchten immunoreaktiven Bestandteile der Vakzine der vorliegenden Erfindung aus gentechnisch hergestellten Organismen produziert und gereinigt werden, in die die Gene, die die spezifischen extrazellulären Produkte von M. tuberculosis exprimieren, kloniert wurden. Wie dem Fachmann bekannt ist, können solche gentechnisch hergestellten Organismen modifiziert werden, um höhere Level der ausgewählten extrazellulären Produkte oder modifizierten immunogenen Analoge zu produzieren. Alternativ können die immunschützenden Produkte, Teile davon oder Analoge davon, unter Verwendung von Techniken chemisch synthetisiert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind, oder direkt in Wirtszellen exprimiert werden, die mit nackten Genen, die dafür kodieren, injiziert wurden. Unabhängig davon, welche Produktionsquelle benutzt wird, können die immunogenen Komponente der vorherrschenden oder in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte separiert und anschließend in verabreichbare Vakzine formuliert werden, unter Verwendung üblicher biochemischer Prozeduren, wie etwa Fraktionierung, Chromatographie oder anderer Reinigungsmethoden und herkömmlicher Formulierungstechniken, oder direkt in Wirtszellen exprimiert werden, die Genkonstrukte direkt enthalten die dafür kodieren.
Zum Beispiel ist in der vorliegenden Erfindung das Zielpathogen M. tuberculosis, und die in hohem Maße abundanten Produkte, die extrazellulär von M. tuberculosis in Bouillonkultur freigesetzt werden, werden von anderen bakteriellen Komponenten separiert und verwendet, um eine Immunreaktion in Sängerwirten auszulösen. Einzelne Proteine oder Proteingruppen werden dann in tierbasierten Provokations versuchen benutzt, um jene zu identifizieren, die Impfschutz induzieren, was gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung sie geeignet macht für die Verwendung als Vakzine. Spezifischer werden, auf Grund ihrer physikalischen Abundanz, nach dem Wachsen und Ernten der Bakterien die wesentlichen extrazellulären Produkte von den intrabakteriellen und anderen Komponenten durch Zentrifugieren und Filtrieren separiert. Wenn gewünscht, wird das resultierende Ausgangsfiltrat dann einer Fraktionierung unter Verwendung von Ammoniumsulfatpräzipitation mit anschließender Dialyse unterzogen, um eine Mischung aus extrazellulären Produkten zu ergeben, die üblicherweise EP genannt wird. Die solubilisierten extrazellulären Produkte in den dialysierten Fraktionen werden dann gereinigt, bis sie im Wesentlichen homogen sind, unter Verwendung geeigneter chromatographischer Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, und die nachfolgend ausführlicher beschrieben werden.
Diese beispielhalften Prozeduren führen zur Produktion von vierzehn individuellen proteinhaltigen, in hohem Maße abundanten Produkten von M. tuberculosis, die Molekulargewichte im Bereich zwischen 110 Kilodalton (KD) bis 12 KD aufweisen. Nach der Reinigung weist jedes individuelle, in hohem Maße abundante extrazelluläre Produkt eine Bande auf, die ihrem jeweiligen Molekulargewicht entspricht, wenn es Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen wird, wodurch es ermöglicht wird, einzelne Produkte oder Produktgruppen, die den in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten entsprechen, zu identifizieren und für die Verwendung als Vakzine herzustellen. Die gereinigten, in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte können ferner durch das Bestimmen aller oder eines Teils ihrer jeweiligen Aminosäuresequenzen unter Verwendung von Techniken charakterisiert und unterschieden werden, die in diesem Fachgebiet üblich sind. Auch die Sequenzierung kann Informationen hinsichtlich möglicher struktureller Beziehungen zwischen den in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten bereitstellen.
Anschließend kann die Immunisierung und die Stimulierung erworbener Immunität in einem Säugerwirtsystem erreicht werden, indem diese gereinigten extrazellulären Produkte über einen Zeitraum in eine Reihe von subkutanen oder intradermalen Injektionen benutzt werden. Zum Beispiel kann eine Injektion mit einem gereinigten, in hohem Maße abundanten bakteriellen extrazellulären Produkt oder Produkten in inkomplettem Freund'schen Adjuvans, gefolgt von einer zweiter Injektion in dem gleichen Adjuvans ungefähr drei Wochen später, verwendet werden, um eine schützende Reaktion bei der anschließenden Provokation mit dem virulenten Pathogen auszulösen. Andere beispielhafte Immunisierungsprotokolle können eine Reihe von drei oder vier Injektionen mit gereinigtem extrazellulärem Produkt oder Produkten oder deren Analoge in Syntex Adjuvant Formulation (SAF) über einen Zeitraum beinhalten. Zwar kann sich eine Reihe von Injektionen im Allgemeinen als wirksamer erweisen, aber die einzelne Verabreichung eines ausgewählten, in hohem Maße abundante extrazellulären Produkts oder dessen immunogene Subunits oder Analoge können die gesuchte Immunreaktion verleihen.
Solche beispielhaften Protokolle können unter Verwendung von Labormodellen, die vom Fachmann anerkannt sind, wie etwa Meerschweinchen, nachgewiesen werden. Zum Beispiel wurde, wie ausführlicher diskutiert werden wird, die Immunisierung mehrerer Meerschweinchen mit einer Kombination aus fünf in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten (gereinigt aus M. tuberculosis, wie zuvor diskutiert) mit einer Immunisierungsreihe von drei Injektionen des bakteriellen Produkts in SAF-Adjuvant mit entsprechender Scheinimmunisierung von Kontrolltieren erreicht. Beispielhafte Dosierungen jedes Proteins reichten von 100 μg bis 2 μg. Nach der letzten Impfung wurden alle Tiere gleichzeitig einer infektiösen und potentiell letalen Dosis von aerosoliertem M. tuberculosis ausgesetzt und über einen längeren Zeitraum beobachtet. Die Kontrolltiere zeigten Im Vergleich zu den mit einer Kombination aus den in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten von M. tuberculosis immunisierten Tieren einen signifikanten Gewichtsverlust. Überdies starb die Hälfte der Kontrolltiere während des Beobachtungszeitraums, während keines der immunisierten Tiere der Tuberkulose erlag. Autopsien, die nach diesem Versuch durchgeführt wurden, offenbarten, dass die nicht immunisierten Kontrolltiere signifikant mehr koloniebildende Einheiten (CFU) und entsprechende Schädigung in ihren Lungen und Milzen hatten, als die geschützten Tiere. Siebzehn zusätzliche Kombinationen der gereinigten, in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte stellten Immunoprophylaxe bereit, als sie getestet wurden.
Es sollte jedoch betont werden, dass die vorliegende Offenbarung nicht auf Kombinationen aus sekretorischen oder extrazellulären Produkten beschränkt ist. Zum Beispiel beweisen mehrere alternative Versuchsprotokolle die Fähigkeit eines einzigen abundanten extrazellulären Produkts, schützende Immunität bei einem Säuger zu induzieren. In jedem Versuch wurden Meerschweinchen mit einem einzigen in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkt, das aus M. tuberculosis EP gereinigt wurde, immunisiert. Nach deren jeweiliger Immunisierung wurden beide Tiergruppen und die entsprechenden Kontrollen einer letalen Dosis aerosoliertem M. tuberculosis ausgesetzt, um die Wirksamkeit der Vakzine zu bestimmen.
Es ist wichtig, festzuhalten, dass die Formulierung der Vakzine für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend ist, und optimiert werden kann, um die Verabreichung zu erleichtern. Lösungen aus den gereinigten immunogenen Determinanten, die aus dem in hohem Maße abundanten pathogenen extrazellulären Produkten abgeleitet sind, können allein oder in Kombination auf jede Weise verabreicht werden, die ausgelegt ist, um eine schützende Immunreaktion zu erzeugen. Die gereinigten Proteinlösungen können allein zugeführt werden, oder vor der Verabreichung mit einem Adjuvans formuliert werden.
Alternativ kann genetisches Material, das die Gene für einen oder mehrere der immunogenen Determinanten kodiert, die von den in hohem Maße abundanten pathogenen extrazellulären Produkten abgeleitet sind, mit eukaryotischen Promoter- und/oder Sekretionssequenzen gekoppelt und direkt in einen Sängerwirt injiziert werden, um die endogene Expression der immunogenen Determinanten und die anschließende schützende Immunität zu induzieren.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann aus der Betrachtung der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen derselben in Verbindung mit den Figuren, die zunächst kurz beschrieben werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Darstellung von 4 Coomassie-Blau-gefärbten Gelen, die mit 1a bis 1d bezeichnet sind, die die Reinigung beispielhafter in hohem Maße abundanter extrazellulärer Produkte von M. tuberculosis illustrieren, die durch Natriumdeodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) identifiziert wurden.
2 ist eine tabellarische Darstellung, die die fünf N-terminalen Aminosäuren aus vierzehn beispielhaften in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten von M. tuberculosis (Sequenz-ID-Nr. 1–14) und das scheinbare Molekulargewicht für solche Produkte identifiziert.
3 ist eine tabellarische Darstellung der verlängerten N-terminalen Aminosäuresequenz von drei beispielhaften, in hohem Maße abundanten sekretorischen Produkten von M. tuberculosis (Sequenz-ID-Nr. 15–17), die von den fünf N-terminalen Aminosäuren nicht differenziert wurden die in 2 gezeigt werden.
4 ist ein grafischer Vergleich des mittleren Meerschweinchenkörpergewichts von Tieren, die mit der Vakzine immunisiert wurden, die eine Kombination aus extrazellulären Produkten umfasst, die gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung produziert wurden, mit nicht immunisierten Kontrollen nach dem Aussetzen an eine aerosolierte letale Dosis von M. tuberculosis.
5 ist ein grafischer Vergleich des mittleren Meerschweinchenkörpergewichts von Tieren, die mit drei verschiedenen Dosierungen einer Vakzine immunisiert wurden, die eine Kombination aus extrazellulären Produkten umfasst, die gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung produziert wurden, mit nicht immunisierten Kontrollen nach dem Aussetzen an eine aerosolierte letale Dosis von M. tuberculosis.
6 ist ein grafischer Vergleich des mittleren Meerschweinchenkörpergewichts von Tieren, die mit Vakzinen immunisiert wurden, die sechs verschiedene Kombinationen aus extrazellulären Produkten umfassen, die gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung produziert wurden, mit nicht immunisierten Kontrollen nach dem Aussetzen an eine aerosolierte letale Dosis von M. tuberculosis.
7 ist eine grafische Illustration der Kartierung der immunodominanten Epitope des 32A-KD-Proteins von M. tuberculosis.
8 stellt eine schematische Darstellung der Konstrukte bereit, die für die Expression des rekombinanten 32A-KD- Proteins verwendet wurden. Das Diagramm veranschaulicht den pSMT3-Vektor, der für die Expression des rekombinanten 32A-KD-Proteins verwendet wurde. In (A) ist das DNA-Fragment, das das Gen für das 32A-KD-Protein trägt, in der dem hsp-60-Promoter entgegengesetzten Richtung angeordnet. In (B) ist das DNA-Fragment, das das Gen für das 32A-KD-Protein trägt, in gleicher Richtung wie der hsp-60-Promoter angeordnet.
9 zeigt Elektrophorese-Testergebnisse, wobei die Sekretion des rekombinanten reifen in extrazellulären 32A-KD-Hauptproteins von M. tuberculosis bei 28°C (Spur 3) und 37°C (Spur 2) verglichen werden.
10 ist ein grafischer Vergleich des Wachstums von Meerschweinchen-Lymphoblasten in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von rekombinantem humanen und murinem IL-12.
11 ist ein grafischer Vergleich des Wachstums von Meerschweinchen-Lymphoblasten in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von rekombinantem humanen und murinem IL-12 eines Meerschweinchens, das nicht das Meerschweinchen aus 21 ist.
12 ist ein grafischer Vergleich der mittleren Meerschweinchenkörpergewichtszunahme oder -gewichtsverlusts von Tieren, die mit der Vakzine immunisiert wurden, die eine Kombination aus gereinigten extrazellulären 32A-KD-, 30-KD- und 16-KD-Proteinen, MF59-Adjuvans und IL-12 umfasst, mit nicht immunisierten Kontrollen nach dem Aussetzen an eine aerosolierte letale Dosis von M. tuberculosis.
13 ist ein grafischer Vergleich der mittleren Meerschweinchenkörpergewichtszunahme oder -gewichtsverlusts von Tieren, die mit der Vakzine immunisiert wurden, die eine Kombination aus gereinigten extrazellulären 32A-KD-, 30-KD- und 16-KD-Proteinen mit MF59-Adjuvans, mit IL-12 und mit einer Mischung aus MF59 und IL-12 umfasst, mit nicht immunisierten Kontrollen nach dem Aussetzen an eine aerosolierte letale Dosis von M. tuberculosis.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEISPIELHAFTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Verbindungen und Verfahren zu deren Produktion und deren Verwendung gegen pathogene Organismen als Vakzine und immunotherapeutische Mittel, wie in den Ansprüchen definiert. Spezifischer richtet sich die vorliegenden Offenbarung auf die Produktion und die Verwendung in hohem Maße abundanter extrazellulärer Produkte, die von pathogenen Organismen freigesetzt werden, deren immunogenen Analoge oder dem assoziierten genetischen Material, das dafür kodiert, als Vakzine oder immunotherapeutische Mittel und auf assoziierte Verfahren zum Erzeugen von Impfschutz gegen Infektion in Säugerwirten. Diese Verbindungen werden zum Zwecke der Vereinfachung in der gesamten Anmeldung als Vakzine bezeichnet.
In beispielhaften Ausführungsformen wurden die in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte von M. tuberculosis differenziert und anschließend gereinigt. Meerschweinchen wurden mit gereinigten Formen dieser in hohem Maße prävalierenden extrazellulären Produkte ohne Bestimmung der spezifischen molekularen Immunogenität des einzelnen Produkts immunisiert. Ferner wurden die beispielhaften Immunisierungen unter Verwendung der gereinigten extrazellulären Produkte allein oder in Kombination und mit verschiedenen Dosierungen und Verabreichungswegen durchgeführt. Die vorliegende Erfindung ist auf Vakzine begrenzt, die sich gegen M. tuberculosis richten.
In diesen beispielhaften Ausführungsformen wurden die in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte von M. tuberculosis unter Verwendung von Säulenchromatografie gereinigt. Die Bestimmung der relativen Abundanz und die Reinigung der extrazellulären Produkte wurden unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese erreicht. Nach der Reinigung der Vakzinkomponenten wurden Meerschweinchen mit den in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten allein oder in Kombination geimpft und anschließend mit M. tuberculosis provoziert. Wie ausführlicher diskutiert werden wird, haben die Vakzine der vorliegenden Erfindung zusätzlich zur Entwicklung der erwarteten messbaren Reaktionen auf diese extrazellulären Produkte, diesen Labortieren nach der Immunisierung unerwarteterweise eine wirksame Immunität gegen anschließende letale Dosen aerosoliertem M. tuberculosis verliehen.
Zwar werden in diesen beispielhaften Ausführungsformen gereinigte Formen der extrazellulären Produkte verwendet, der Fachmann wird es jedoch zu schätzen wissen, dass die vorliegende Erfindung leicht unter Verwendung von immunogenen Analoge ausgeführt werden kann, die durch rekombinante Mittel oder andere Formen der chemischen Synthese unter Verwendung von Techniken produziert werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Ferner können innerhalb des Umfangs und der Lehren der vorliegenden Erfindung immunogene Analoge, Homologe oder ausgewählte Segmente der in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte anstelle der natürlich vorkommenden Produkte benutzt werden.
Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung wird dem Fachmann durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele bereitgestellt, die beispielhafte Protokolle zur Identifikation, Isolation, Produktion und Verwendung der in hohem Maße abundante extrazellulären Produkte (allein oder in Kombination) als Vakzine illustrieren.
BEISPIEL 1
Isolation und Produktion aus extrazellulären Ausgangsproteinen (EP) aus Mycobacterium tuberculosis
Der Stamm M. tuberculosis Erdman n(ATCC 35801) wurden von der American Tissue Culture Collection (Rockville, Md.) erhalten. Die gefriergetrockneten Bakterien wurden in Middlebrook-7H9-Kulturmedium (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) rekonstituiert und auf Middlebrook-7H11-Agar erhalten. 7H11-Agar wurde unter Verwendung von Bacto Middlebrook-7H10-Agar (Difco), OADC Enrichment Medium (Difco), 0,1% enzymatischem Caseinhydrolysat (Sigma) und Glycerol hergestellt, wie bereits von Cohn (Cohn, .I., Am. Rev. Respir. Dis. 98: 295–296) beschrieben. Nach der Sterilisation durch Autoklavieren, wurde der Agar in bakteriologische Petri-Schalen (100 zu 15 mm) verteilt und zum Abkühlen stehen gelassen.
M. tuberculosis wurde dann unter Verwendung steriler Techniken plattiert und bei 37°C in 5% CO₂-95% Luft, 100% Feuchtigkeit gewachsen. Nach Kultur auf 7H11 für 7 Tage wurden die Kolonien von den Platten geschabt, in 7H9 Bouillon auf 10⁸ CFU/ml suspendiert und in 1,8-ml Nunc-Cryoröhrchen (Roskilde, Dänemark) aliquotiert. Jeder Liter der Bouillon wurde hergestellt, indem 4,7 g Bacto Middlebrook 7H9-Pulver mit 998 ml destilliertem Wasser und 2 ml Glycerol (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) erneut eingeweicht wurde, bevor die Mischung auf einen pH-Wert von 6,75 angepasst und die Bouillon für 15 Min. bei 121°C autoklaviert wurde. Die aliquotierten Zellen wurden dann langsam eingefroren und bei –70°C gelagert. Die unter diesen Bedingungen gelagerten Zellen blieben unbegrenzt lebensfähig und wurden nach Bedarf verwendet.
Präparate aus extrazellulärem Ausgangsprotein (EP) wurden aus Kulturen von M. tuberculosis erhalten, das in der Middlebrook-7H9-Bouillon, die wie oben hergestellt wurde, gewachsen wurde. Nach der Rekonstitution wurden 150-ml- Aliquots der Bouillon für 15 Min. bei 121°C autoklaviert und auf gelüftete 225-cm^2–Gewebekulturzylindern von Co-star verteilt. Die M.-tuberculosis-Zellen, die bei –70°C gelagert wurden, wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, wurden aufgetaut, und verwendet, um 7H11-Agarplatten zu inokulieren. Nach Kultur für 7 Tage wurden die Kolonien von den Platten geschabt, in einigen ml 7H9-Bouillon suspendiert und im Wasserbad beschallt, um eine Einzelzellsuspension zu bilden. Die M.-tuberculosis-Zellen wurden in den sterilen 150-ml-Aliquots bei einer optischen Dichte von 0,05, wie mit dem Perkin-Elmer Junior model 35 Spektrophotometer (Norwalk, Conn.) bestimmt, suspendiert. Die Zellen wurden dann bei 37°C in 5% CO₂-95% Luft für 3 Wochen inkubiert, bis die Suspension eine optische Dichte von 0,4 bis 0,5 zeigte. Diese Kulturen wurden als Vorratsflasche für die anschließenden Kulturen auch in 7H9-Bouillon verwendet. Die Vorratsflaschen wurden in einem Wasserbad beschallt, um eine Einzelzellsuspension zu bilden. Die M.-tuberculosis-Zellen wurden dann in 7H9-Bouillon auf eine anfängliche optische Dichte von 0,05 verdünnt und bei 37°C in 5% CO₂-95% Luft für 2,5 bis 3 Wochen inkubiert, bis die Suspension eine optische Dichte von 0,4 bis 0,5 zeigte. Die Kulturüberstände wurden dann dekantiert und nacheinander durch 0,8 μm und 0,2 μm Filter mit geringer Proteinbindung (Gelman Sciences Inc., Ann Arbor, Mich.) sterilfiltriert. Das Filtrat wurde dann in einer Filtron Minisette mit einer Omegamembran, die eine 10-KD-Trenngrenze aufweist, ungefähr 35-fach konzentriert und bei 4°C gelagert. Die Analyse der extrazellulären Ausgangsproteinherstellung durch Natriumdeodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektrophorese (SDS-PAGE) offenbarte eine Proteinzusammensetzung mit Mehrfachbanden. Die extrazelluläre Ausgangsproteinmischung (EP) wurde hergestellt, indem ein 40–95% Ammoniumsulfatschnitt aus dem Kulturfiltrat erhalten wurde.
BEISPIEL 2
Reinigung der in hohem Maße abundanten extrazellulären Hauptprodukte von Mycobacterium tuberculosis
Ammoniumsulfat (Qualität I, Sigma) wurde dem sterilen Kulturfiltrat aus Beispiel 1 bei 0°C in Konzentrationen zugefügt, die von 10% bis 95% reichten, und leicht gerührt, um die Proteine zu fraktionieren. Die Suspension wurde dann in Plastikflaschen übertragen und in einem Rotor mit frei aufschwingenden Bechern bei 3.000 U/Min. auf einer RC3B-Sorvall-Zentrifuge zentrifugiert, um das resultierende Präzipitat zu pelletieren. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert, und, abhängig von dem interessierenden Produkt, wurde die überstehende Flüssigkeit oder Pellet weiterer Reinigung unterzogen. Wenn das interessierende Produkt in der überstehenden Flüssigkeit enthalten war, wurde ein zweiter Ammoniumsulfatschitt ausgeführt, indem die Salzkonzentration über die des ersten Schnitts erhöht wurde. Nach einem Zeitraum leichten Rührens wurde die Lösung dann zentrifugiert, wie zuvor beschrieben, um das gesuchte Produkt zu präzipitieren, und die zweite überstehende Flüssigkeit wurde weiterer Reinigung unterzogen.
Nach dem Zentrifugieren wurden die präzipitierten Proteine in dem geeigneten Kältepuffer erneut solubilisiert und ausgiebig in einer Spectrapor-Dialysemembran (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, Calif.) mit einer Trenngrenze von 6.000 bis 8.000 Molekulargewicht dialysiert, um das Salz zu entfernen. Die Konzentration an extrazellulärem Protein wurde mit einem Bicinchoninsäure-Proteinassay (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.) bestimmt, und die Fraktionskomponenten wurden unter Verwendung von SDS-PAGE bestimmt. Die Fraktionen wurden dann zur weiteren Reinigung auf Chromatographiesäulen aufgetragen.
Unter Verwendung des allgemeinen Schemas, das im direkt vorhergehenden Abschnitt umrissen wurde, wurden vierzehn extrazelluläre Produkte aus dem extrazellulären Ausgangs proteinfiltrat gereinigt, das durch den Prozess erhalten wurde, der in Beispiel 1 ausführlich dargestellt wurde. Die genaue Ammoniumsulfat-Präzipitationsprozedur und das Chromatographieprotokoll wird nachfolgend für jedes extrazelluläre Produkt, das isoliert wurde, ausführlich dargestellt.
A. 110 KD Extrazelluläres Produkt

1. Ein 50–100% Ammoniumsulfatpräzipitat wurde erhalten, wie oben diskutiert.
2. Das erneut solubilisierte Präzipitat wurde dialysiert und auf eine DEAE-Sepharose-CL-6B- oder QAE-Sepharose-Ionenaustauschsäule in einem Säulenpuffer aufgetragen, der aus 10% Sorbitol, 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7, 5 mM 2-Mercaptoethanol und 0,2 mM EDTA bestand, und mit einem Natriumchloridgradienten eluiert. Fraktionen, die 110 KD Protein enthielten, eluieren bei ungefähr 550 mM Salz und wurden aufgefangen.
3. Die aufgefangenen Fraktionen wurden auf eine S200 Sepharose-Größenfraktionierungssäule in PBS-Puffer (Phosphatgepufferte Salzlösung) aufgetragen. Das Protein eluierte als homogenes 110 KD Protein.

B. 80 KD Extrazelluläres Produkt

1. Der 0–25% Ammoniumsulfatschnitt (1 Stunde bei 0°C) wurde verworfen und der 25–60% Ammoniumsulfatschnitt (über Nacht bei 0°C) wurde behalten, wie oben diskutiert.
2. Eine DEAE CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7 beladen, die 1 M NaCl enthielt und mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, 10 mM NaCl äquilibriert wurde, und die Proteinprobe wurden gegen 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, 10 mM NaCl dialysiert und auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde über Nacht mit dem gleichen Puffer gewaschen. Ein erster Salzgradient von 10 mM bis 200 mM NaCl in 25 mM Tris, pH-Wert 8,7 wurde durch die Säule laufen gelassen, um die anderen Proteine zu eluieren. Ein zweiter Salzgradient (200 bis 300 mM NaCl) wurde durch die Säule laufen gelassen und das 80 KD Protein eluierte bei ungefähr 275 mM NaCl.
3. Eine Q-Sepharose-HP-Säule wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 1 M 8,7, NaCl beladen und erneut auf 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, 10 mM NaCl äquilibriert. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, ph-Wert 8,7, 10 mM NaCl dialysiert und auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde in dem gleichen Puffer gewaschen und dann mit 200 bis 300 mM NaCl in 25 mM Tris, pH-Wert 8,7 eluiert.
4. Fraktionen, die das 80 KD Protein enthielten, wurden aufgefangen und gegen 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, 10 mM NaCl dialysiert, und dann in einem Speed-Vac-Konzentrator auf 1 bis 2 ml konzentriert. Die Proteinprobe wurde auf eine Superdex-75-Säule aufgetragen und mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, 150 mM NaCl eluiert. Das 80 KD Protein eluierte als homogenes Protein.

C. 71 KD Extrazelluläres Produkt

1. Ein 40–95% Ammoniumsulfatpräzipitat wurde erhalten, wie oben diskutiert, abgesehen davon, dass das 71 KD Produkt in 7H9-Bouillon bei einem pH-Wert von 7,4 und bei 0% CO₂ kultiviert wurde und bei 42°C für 3 Std. einmal pro Woche einer Hitzeschockbehandlung unterzogen wurde. Das Präziptitat wurde gegen Anfangspuffer (20 mM Hepes, 2 mM MgAc, 25 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,8 mM DL-Dithiothreitol, pH-Wert 7,0) dialysiert.
2. Das erneut solubilisierte Präzipitat wurde auf eine ATP-Agarosesäule aufgetragen, die mit Anfangspuffer äquilibriert wurde. Der Abfluss wurde aufgefangen und erneut auf die ATP-Agarosesäule aufgetragen. Das 71 KD Protein band an die Säule.
3. Anschließend wurde die ATP-Agarosesäule gewaschen, zuerst mit Anfangspuffer, dann mit 1 M KCl, dann mit Anfangspuffer.
4. Homogenes 71 KD Protein wurde aus der Säule mit 10 mM ATP eluiert und gegen Phosphatpuffer dialysiert.

D. 58 KD Extrazelluläres Produkt

1. Ein 25–50% Ammoniumsulfatpräzipitat wurde erhalten, wie oben diskutiert.
2. Das erneut solubilisierte Präzipitat wurde dialysiert und auf eine DEAE-Sepharose-CL-6B- oder QAE-Sepharosesäule aufgetragen und mit NaCl eluiert. Die aufgefangenen Fraktionen, die das 58 KD Protein enthielten, eluierten bei ungefähr 400 mM NaCl.
3. Die aufgefangenen Fraktionen wurden dann auf eine Sepharose-CL-6B-Größenfraktionierungssäule aufgetragen. Das Protein eluierte bei ungefähr 670 bis 700.000 Dalton.
4. Das eluierte Protein wurde auf eine Thiopropylsepharosesäule aufgetragen. Das homogene 58 KD Protein eluierte bei ungefähr 250 bis 350 mM 2-Mercaptoethanol. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung von SDS-PAGE überwacht und zeigte die Einzelbande, die in 1A, Spalte 2, gezeigt wird.

E. 45 KD Extrazelluläres Produkt

1. a. Ein 0–25% Ammoniumsulfatschnitt (1 Stunde bei 0°C) wurde verworfen.
b. Der 25–60% Ammoniumsulfatschnitt (über Nacht bei 0°C) wurde behalten.
2. a. Eine DEAE-CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 2,5 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde dann über Nacht mit dem gleichen Puffer gewaschen.
c. Die Säule wurde mit einem Salzgradienten (10 mM bis 200 mM) in 25 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,7 eluiert. Das 45 KD Protein eluierte bei ungefähr 40 mM NaCl.
3. a. Eine Q-Sepharose-HP-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 erneut äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen unter Verwendung des gleichen Puffers.
c. Die Säule wurde mit 10 bis 150 mM NaCl in 25 mM Tris, pH-Wert 8,7 eluiert.
4. a. Fraktionen, die das 45 KD Produkt enthielten, wurden aufgefangen und gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert, vor der Konzentration auf 1 ml in einem Speed-Vac-Konzentrator.
b. Das Konzentrat wurde auf eine Superdez-75-Säule aufgetragen, die mit 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 8,7, äquilibriert wurde. Das Produkt eluierte als homogenes Protein. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung von SDS-PAGE überwacht und führte zu der einzelnen Bande, die in 1B, Spalte 2 gezeigt wird.

F. 32 KD Extrazelluläres Produkt (A)

1. a. Ein 0–25% Ammoniumsulfatschnitt (1 Stunde bei 0°C) wurde verworfen.
b. Der 25–60% Ammoniumsulfatschnitt (über Nacht bei 0°C) wurde behalten.
2. a. Eine DEAE-CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen über Nacht mit dem gleichen Puffer.
c. Die Säule wurde mit einem Salzgradienten (10 mM bis 200 mM) in 25 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,7 eluiert. Das 32 KD Protein eluierte bei ungefähr 70 mM NaCl.
3. a. Fraktionen, die das 32 KD Produkt enthielten, wurden aufgefangen, gepoolt und gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert, bevor die Proteinprobe in einem Speed-Vac-Konzentrator auf 1 ml konzentriert wird.
b. Das Konzentrat wurde dann auf eine Superdez-75-Säule aufgetragen, die mit 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 8,7, äquilibriert wurde, und mit diesem Puffer eluiert. Das 32 KD Produkt eluierte als homogenes Protein.
4. a. Eine Q-Sepharose-HP-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 erneut äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen im gleichen Puffers.
c. Die Säule wurde mit einem 100 bis 300 mM NaCl-Gradienten eluiert. Mit 32A bezeichnet, eluiert das homogene Protein bei ungefähr 120 mM NaCl und wird als Einzelbande in 1B, Spalte 4 gezeigt.

G. 32 KD Extrazelluläres Produkt (B)

1. a. Ein 0–25% Ammoniumsulfatschnitt (1 Stunde bei 0°C) wurde verworfen.
b. Der 25–60% Ammoniumsulfatschnitt (über Nacht bei 0°C) wurde behalten.
2. a. Eine DEAE-CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen über Nacht mit dem gleichen Puffer.
c. Ein vorausgehender Salzgradient von 10 mM bis 200 mM NaCl in 25 mM Tris, pH-Wert 8,7 wurde laufen gelassen, um mehrere Proteine zu eluieren. Nach der Äquilibrierung der Säule wurde ein zweiter Salzgradient (200 bis 300 mM NaCl) laufen gelassen. Das 32 KD Protein eluierte bei ungefähr 225 mM NaCl.
3. a. Eine Q-Sepharose-HP-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 erneut äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen im gleichen Puffers.
c. Die Säule wurde mit einem 200 bis 300 mM NaCl-Gradienten in dem gleichen Puffer eluiert.
4. a. Fraktionen, die das 32 KD Produkt enthielten, wurden aufgefangen, gepoolt und gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert, bevor die Proteinprobe in einem Speed-Vac-Konzentrator auf 1 ml konzentriert wird.
b. Das Konzentrat wurde dann auf eine Superdez-75-Säule aufgetragen, die mit 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 8,7, äquilibriert wurde, und mit dem gleichen Puffer eluiert. Das 32 KD Produkt, mit 32B bezeichnet, um es von dem Protein mit 32 KD zu unterscheiden, das unter Verwendung des Protokolls H separiert wurde, eluierte als homogenes Protein und wird als Einzelbande in 1B, Spalte 3 gezeigt.

H. 30 KD Extrazelluläres Produkt

1. a. Ein 0–25% Ammoniumsulfatschnitt (1 Stunde bei 0°C) wurde verworfen.
b. Der 25–60% Ammoniumsulfatschnitt (über Nacht bei 0°C) wurde behalten.
2. a. Eine DEAE-CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen über Nacht mit dem gleichen Puffer.
c. Die Säule wurde mit einem Salzgradienten (10 mM bis 200 mM) in 25 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,7 eluiert. Das 30 KD Protein eluierte bei ungefähr 140 mM NaCl.
3. a. Fraktionen, die das 30 KD Produkt enthielten, wurden aufgefangen, gepoolt und gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert, bevor die Proteinprobe in einem Speed-Vac-Konzentrator auf 1 ml konzentriert wird.
b. Das Konzentrat wurde dann auf eine Superdex-75-Säule aufgetragen, die mit 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 8,7, äquilibriert wurde, und mit diesem Puffer eluiert. Das 30 KD Produkt eluierte als homogenes Protein und wird als Einzelbande in 1B, Spalte 5 gezeigt.

I. 24 KD Extrazelluläres Produkt

1. a. Ein 0–25% Ammoniumsulfatschnitt (1 Stunde bei 0°C) wurde verworfen.
b. Der 25–60% Ammoniumsulfatschnitt (über Nacht bei 0°C) wurde behalten.
2. a. Eine DEAE-CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen über Nacht mit dem gleichen Puffer.
c. Ein vorausgehender Salzgradient von 10 mM bis 200 mM NaCl in 25 mM Tris, pH-Wert 8,7 wurde laufen gelassen, um mehrere Proteine zu eluieren. Nach der Äquilibrierung der Säule wurde ein zweiter Salzgradient (200 bis 300 mM NaCl) laufen gelassen. Das 24 KD Protein eluierte bei ungefähr 250 mM NaCl.
3. a. Eine Q-Sepharose-HP-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 erneut äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen im gleichen Puffers.
c. Die Säule wurde mit einem 200 bis 300 mM NaCl-Gradienten in dem gleichen Puffer eluiert.
4. a. Fraktionen, die das 24 KD Produkt enthielten, wurden aufgefangen, gepoolt und gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert, bevor die Proteinprobe in einem Speed-Vac-Konzentrator auf 1 ml konzentriert wird.
b. Das Konzentrat wurde dann auf eine Superdex-75-Säule aufgetragen, die mit 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 8,7, äquilibriert wurde, und mit dem gleichen Puffer eluiert. Das 24 KD Produkt eluierte als homogenes Protein und wird als Einzelbande in 1B, Spalte 7 gezeigt.

J. 23,5 KD Extrazelluläres Produkt

1. a. Ein 0–25% Ammoniumsulfatschnitt (1 Stunde bei 0°C) wurde verworfen.
b. Der 25–60% Ammoniumsulfatschnitt (über Nacht bei 0°C) wurde behalten.
2. a. Eine DEAE-CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule vor dem anschließenden Waschen über Nacht mit dem gleichen Puffer aufgetragen.
c. Die Säule wurde mit einem Salzgradienten (10 mM bis 200 mM) in 25 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,7 eluiert. Das 23,5 KD Protein eluierte bei ungefähr 80 mM NaCl.
3. a. Eine Q-Sepharose-HP-Säule wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 erneut äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen im gleichen Puffers.
c. Die Säule wurde mit 100 bis 300 mM NaCl in 25 mM Tris, pH-Wert 8,7 eluiert.
d. Die Schritte 3a bis 3c wurden wiederholt.
4. a. Fraktionen, die das 23,5 KD Produkt enthielten, wurden aufgefangen, gepoolt und gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert, bevor die Proteinprobe in einem Speed-Vac-Konzentrator auf 1 ml konzentriert wird.
b. Das Konzentrat wurde dann auf eine Superdex-75-Säule aufgetragen, die mit 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 8,7, äquilibriert wurde, und mit dem gleichen Puffer eluiert. Das 23,5 KD Produkt eluierte als homogenes Protein. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung von SDS-PAGE überwacht und führte zu der einzelnen Bande, die in 1B, Spalte 6 gezeigt wird.

K. 23 KD Extrazelluläres Produkt

1. a. Ammoniumsulfatschnitte von 0 bis 25% (1 Std. bei 0°C) und 25 bis 60% (über Nacht bei 0°C) wurden verworfen.
b. Ein 60–95% Ammoniumsulfatschnitt wurde behalten.
2. a. Eine DEAE-CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 50 mM Bis-Tris, pH-Wert 7,0, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 50 mM Bis-Tris, 100 mM NaCl, pH-Wert 7,0 äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 50 mM Bis-Tris, pH-Wert 7,0, 100 mM NaCl-Puffer dialysiert und auf die Säule aufgetragen, vor dem anschließenden Waschen über Nacht mit dem gleichen Puffer.
c. Die Säule wurde mit einem linearen 100 mM bis 300 mM Gradienten in 50 mM Bis-Tris, pH-Wert 7,0 eluiert.
d. Die Fraktionen wurden aufgefangen, die das 23 KD Protein enthielten, das bei ungefähr 100 bis 150 mM NaCl eluierte.
3. a. Die Proteinfraktionen wurden gegen 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, 10 mM NaCl dialysiert, und auf einem Savant-Speed-Vac-Konzentrator auf 1 bis 2 ml konzentriert.
b. Das Konzentrat wurde auf eine Superdex-75-Säule aufgetragen, die mit 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 8,7 äquilibriert wurde. Das Produkt eluiert als homogenes Protein, wie in 1B, Spalte 8, gezeigt.

L. 16 KD Extrazelluläres Produkt

1. a. Ein 0–25% Ammoniumsulfatschnitt (1 Stunde bei 0°C) wurde verworfen.
b. Der 25–60% Ammoniumsulfatschnitt (über Nacht bei 0°C) wurde behalten.
2. a. Eine DEAE-CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 2,5 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen über Nacht in dem gleichen Puffer.
c. Die Säule wurde mit einem Salzgradienten (10 mM bis 200 mM) in 25 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,7 eluiert. Das 16 KD Protein eluierte bei ungefähr 50 mM NaCl.
3. a. Fraktionen, die das 16 KD Produkt enthielten, wurden aufgefangen, gepoolt und gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert, bevor die Proteinprobe in einem Speed-Vac-Konzentrator auf 1 ml konzentriert wird.
b. Das Konzentrat wurde dann auf eine Superdex-75-Säule aufgetragen, die mit 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 8,7, äquilibriert wurde, und mit dem gleichen Puffer eluiert. Ein 16 KD Produkt eluierte als homogenes Protein. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung von SDS-PAGE überwacht und führte zu der einzelnen Bande, die in 1B, Spalte 9 gezeigt wird.

M. 14 KD Extrazelluläres Produkt

1. a. Ein 0–25% Ammoniumsulfatschnitt (1 Stunde bei 0°C) wurde verworfen.
b. Der 25–60% Ammoniumsulfatschnitt (über Nacht bei 0°C) wurde behalten.
2. a. Eine DEAE-CL-6B-Säule (Pharmacia) wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen über Nacht in dem gleichen Puffer.
c. Die Säule wurde mit einem Salzgradienten (10 mM bis 200 mM) in 25 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8,7 eluiert. Das 14 KD Protein eluierte bei ungefähr 60 mM NaCl.
3. a. Eine Q-Sepharose-HP-Säule wurde mit 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, das 1 M NaCl enthielt, beladen und mit 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7 erneut äquilibriert.
b. Die Proteinprobe wurde gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, ph-Wert 8,7, dialysiert und auf die Säule aufgetragen, mit anschließendem Waschen im gleichen Puffers.
c. Die Säule wurde mit 10 bis 150 mM NaCl in 25 mM Tris, pH-Wert 8,7, eluiert.
d. Die Schritte 3a bis 3c wurden wiederholt.
4. a. Fraktionen, die das 14 KD Produkt enthielten, wurden aufgefangen, gepoolt und gegen 25 mM Tris, 10 mM NaCl, pH-Wert 8,7, dialysiert, bevor die Proteinprobe in einem Speed-Vac-Konzentrator auf 1 ml konzentriert wird.
b. Das Konzentrat wurde dann auf eine Superdex-75-Säule aufgetragen, die mit 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 8,7, äquilibriert wurde, und mit diesem Puffer eluiert. Das 14 KD Produkt eluierte als homogenes Protein. Das eluierte Protein wurde unter Verwendung von SDS-PAGE überwacht und führte zu der einzelnen Bande, die in 1C, Spalte 2 gezeigt wird.

N. 12 KD Extrazelluläres Produkt

1. A. Ein 0–10% Ammoniumsulfatpräzipitat wurde erhalten (über Nacht bei 4°C).
2. Das erneut solubilisierte Präzipitat wurde auf eine S200-Sephacryl-Größenfraktionierungssäule aufgetragen, die das Protein als ein 12 KD Moleküle eluierte.
3. Die Proteinfraktionen wurde auf eine DEAE-Sepharose-CL-6B- oder QAE-Sepharose-Ionenaustauschsäule aufgetragen und mit einem NaCl-Gradient eluiert, wie zuvor beschrieben. Fraktionen, die zwei homogene Proteine enthielten, die Molekulargewichte von ungefähr 12 KD aufwiesen, eluierten bei ungefähr 300 bis 350 mM NaCl und wurden aufgefangen. Die Proteine wurden mit 12A und 12B bezeichnet und als Dublett gereinigt, das in 1D, Spalte 2, gezeigt wird.

Wie in dem SDS-PAGE-Profil aus 1 illustriert, wurden die wesentlichen oder in hohem Maße abundanten extrazellulären Proteine von M. tuberculosis durch die Verwendung der Protokolle, die in den obigen Beispielen 2A–2N ausführlich dargestellt sind, bis zur Homogenität gereinigt. Insbesondere illustriert 1 vier beispielhafte 12,5 Acrylamidgele, die unter Verwendung von SDS-PAGE entwickelt, und mit 1A, 1B, 1C und 1D bezeichnet wurden. Der Standard in Spur 1 der Gele 1A bis 1C hat Protein mit Molekulargewichten von 66, 45, 36, 29, 24, 20 und 14 KD. In Gel 1D enthält der Standard in Spur 1 Proteine mit Molekulargewichten von 68, 45, 31, 29, 20 und 14 KD. Die Spuren, die die jeweiligen gereinigten extrazellulären Produkte enthalten, zeigen im Wesentlichen eine Bande bei dem berichteten Molekulargewicht des einzelnen Proteins. Es sollte festgehalten werden, dass in Gel 1D das 12 KD Protein als sichtbares Dublett in Spur 2 läuft. Die Sequenzanalyse zeigt, dass die untere 12 KD (oder 125 KD Bande) mit der oberen 12 KD (oder 12A KD) Bande äquivalent ist, abgesehen davon, dass ihr die ersten 3 N-terminalen Aminosäuren fehlen.
Die weitere Analyse dieser einzelnen beispielhaften, in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte wird in 2 bereitgestellt. Insbesondere 2 ist eine tabellari sche Zusammenstellung der N-terminalen Sequenzdaten, die aus diesen gereinigten extrazellulären Produkten erhalten wurden, die zeigt, dass sich der Großteil der isolierten Produkte in der Tat unterscheidet (Sequenz-ID-Nr. 1 bis 14). Die Proteine 32A, 32B und 30 haben alle die gleichen 5 N-terminalen Aminosäuren, daher war eine weitere Sequenzierung erforderlich, um sie vollständig zu charakterisieren und sie zu differenzieren. 3 zeigt die verlängerten N-terminalen Aminosäuresequenzen für diese drei gereinigten sekretorischen Produkte (Sequenz-ID-Nr. 15–17). Verschiedene Aminosäuren an den Positionen 16 (Sequenz-ID-Nr. 17), 31 (Sequenz-ID-Nr. 16) und 36 (Sequenz-ID-Nr. 16) beweisen, dass sich diese isolierten Proteine, trotz ihrer Ähnlichkeit beim Molekulargewicht, voneinander unterscheiden.
Zusätzlich zu den Proteinen 30, 32A und 32B wurden N-terminale Aminosäuresequenzen anderer in hohem Maße abundanter extrazellulärer Produkte bestimmt, um primäre Strukturdaten bereitzustellen und um mögliche Beziehungen zwischen den Proteinen aufzudecken. Die Sequenzierung wurde auf den extrazellulären Produkten durchgeführt, die gemäß Beispiel 2 gereinigt wurden, unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind. Die variierenden Längen der N-terminalen Aminosäuresequenz, die für jedes einzelne extrazelluläre Produkt bestimmt wurden, werden nachfolgend gezeigt, identifiziert durch das scheinbare Molekulargewicht des intakten Proteins, und dargestellt unter Verwendung von Standard-Einbuchstabenabkürzungen für die natürlich vorkommenden Aminosäuren. Unter Beibehaltung eingeführter Notationsregeln werden die N-terminalen Sequenzen von links nach rechts in der Richtung des Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben. Jene Positionen, an denen die Identität der bestimmten Aminosäure alles andere als sicher ist, sind unterstrichen. Wo die Aminosäure an eine besonderen Position unbekannt oder mehrdeutig ist, ist die Position in der Sequenz durch einen Strich dargestellt. Wo schließlich zwei Aminosäuren von einem Schrägstrich ge trennt sind, wurde der korrekte Bestandteil nicht ausdrücklich identifiziert, und einer von beiden kann die Position in dieser Sequenz einnehmen.
Die DNA-Sequenzierung wurde auf den 30, 32A, 16, 58, 23,5 und 24 KD Proteinen unter Verwendung von Techniken durchgeführt, die dem Fachmann gut bekannt sind. Diese DNA-Sequenzen und die entsprechenden Aminosäuren, einschließlich Upstream- und Downstream-Sequenzen, werden unten gezeigt, identifiziert durch das scheinbare Molekulargewicht des intakten Proteins und dargestellt unter Verwendung von Standardabkürzungen und Notationsregeln.
30 KD DANN-Sequenz
Diese Sequenzdaten ermöglichen, in Kombination mit den physikalischen Eigenschaften, die unter Verwendung von SDS-PAGE ermittelt wurden, die Charakterisierung und Differenzierung dieser repräsentativen in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte der vorliegenden Erfindung. Die beschriebene Analyse weist darauf hin, dass diese Proteine den Großteil der extrazellulären Produkte von M. tuberculosis bilden, wobei die 71 KD, 30 KD, 32A KD, 23 KD und 16 KD Produkte ungefähr 60 Gew.-% des gesamten verfügbaren extrazellulären Produkts umfassen. Es wird ferner geschätzt, dass das 30 KD Protein bis zu 25 Gew.-% der gesamten Produkte bilden kann, die von M. tuberculosis freigesetzt werden. Somit können die einzelnen beispielhalften in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte von M. tuberculosis, die bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, irgendwo von ungefähr 0,5% bis zu ungefähr 25% des Gesamtgewichts der extrazellulären Produkte reichen.
Wie zuvor diskutiert, hat sich, infolge der Unfähigkeit der traditionellen Western-Blot-Analyse, die am immunogen spezifischsten extrazellulären Produkte konsistent zu identifizieren, der betreffende Erfinder entschieden, die Immunogenität der in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte auf der Basis ihrer Abundanz und der daraus folgenden leichten Identifikation und Isolation zu analysieren. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass diese in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte unerwarteterweise wirksame Immunreaktionen induzieren, was diesen Erfinder zur Schlussfolgerung führte, dass sie als Vakzine wirken können. Diese überraschende Entdeckung führte zur Entwicklung der nicht beschränkenden Funktionaltheorie dieser Erfindung, die oben diskutiert wurde.
Um die Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung zu beweisen, wurden zusätzliche Versuche unter Verwendung einzelner in hohem Maße abundanter extrazellulärer Produkte und Kombina tionen davon in verschiedenen beispielhaften Dosierungen ausgeführt, um Impfschutz in vom Fachmann akzeptierten Labormodellen zu induzieren. Spezifischer wurden gereinigte einzelne, in hohem Maße abundante extrazelluläre Produkte verwendet, um Impfschutz bei Meerschweinchen zu induzieren, die dann mit M. tuberculosis provoziert wurden. Um zu zeigen, dass diese Proteine in der Lage waren, Impfschutz zu induzieren, wurden Kombinationen aus fünf gereinigten, in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten auf gleiche Weise, unter Verwendung verschiedener Verabreichungswege, getestet. Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen dieser beispielhaften Vakzine der vorliegenden Erfindung folgen.
Spezifische pathogenfreie männliche Hartley-Meerschweinchen (Charles River Breeding Laboratories, North Wilmington, Mass.) wurden in allen Versuchen verwendet, einschließlich immunogener oder aerosoler Provokationen mit M. tuberculosis. Die Tiere wurden zu zweit oder dritt in einem Edelstahlkäfig untergebracht und hatten freien Zugang zu Meerschweinchenstandardfutter und Wasser. Nach ihrer Ankunft in der Tiereinrichtung wurden die Meerschweinchen vor dem Beginn jedes Versuchs mindestens eine Woche lang beobachtet, um sicherzustellen, dass sie gesund waren.
Die Erstversuche wurden unter Verwendung individueller, in hohem Maße abundanten extrazellulärer Produkte durchgeführt, von denen angenommen wurde, dass sie zwischen 3% und 25% des gesamten extrazellulären Proteins enthielten, das normalerweise vorhanden ist. Diese Versuche beweisen, dass in hohem Maße abundante extrazelluläre Produkte eine wirksame Immunreaktion auslösen.
BEISPIEL 3
Protokoll der Hauttestung mit gereinigtem Protein auf zellvermittelte Immunität von mit 30 KD Protein immunisierten Meerschweinchen Um zu illustrieren, dass eine messbare Immunreaktion durch gereinigte Formen abundanter extrazellulärer Produkte induziert werden kann, wurde ein kutaner Überempfindlichkeitsassay durchgeführt. Meerschweinchen wurden mit einem beispielhaften in hohem Maße abundanten sekretorischen Produkt von M. tuberculosis immunisiert, das gemäß Beispiel 2 gereinigt wurde. In drei unabhängigen Versuchen wurden Meerschweinchen drei Mal im Abstand von drei Wochen mit 100 μg von im Wesentlichen gereinigtem Protein in SAF-Adjuvans immunisiert. Den Kontrolltieren wurde auf die gleiche Weise Puffer in SAF injiziert. Drei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Meerschweinchen mit dem Protein in einem kutanen Überempfindlichkeitsassay provoziert.
Den Meerschweinchen wurden der Rücken rasiert und Injektionen von 0,1, 1 und 10 μg des 30 KD Proteins wurden intradermal verabreicht, wobei das resultierende Erythem (Rötung der Haut) und die Induration nach 24 Stunden gemessen wurden. Die Daten werden als mittlere Messwerte für die Gruppe ± Standardfehler (SE), wie unter Verwendung traditioneller Verfahren bestimmt, ausgewiesen. ND gibt an, dass dieser besondere Aspekt der Erfindung nicht untersucht wurde.
BEISPIEL 4
Protokoll der Testung mit gereinigtem Protein auf zellvermittelte Immunreaktion von Meerschweinchen, die mit M. tuberculosis infiziert sind
Um Bakterien für die Verwendung in Versuchen zu erhalten, die die Infektion von Meerschweinchen erfordern, wurde M. tuberculosis zuerst auf 7Hll-Agar kultiviert und einmal durch eine Meerschweinchenlunge passagiert, um sicherzustellen, dass sie virulent sind. Zu diesem Zweck wurden die Meerschweinchen durch ein Aerosol mit einer 10-ml-Suspension aus Bakterien in 7H9-Bouillon provoziert, die ungefähr 5·10⁴ Bakterien/ml enthielt. Nachdem die Meerschweinchen krank wurden, wurden die Tiere getötet und die Lungen, die auffallende M.-tuberculosis-Läsionen enthielten, wurden entfernt. Jede Lunge wurde aufgemahlen und auf 7H11-Agar 7 bis 10 Tage kultiviert. Die Bakterien wurden von den Platten geschabt, in 7H9-Bouillon verdünnt, die 10% Glycerol enthielt, im Wasserbad beschallt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und langsam bei –70°C bei einer Konzentration von ungefähr 2·10⁷ lebensfähigen Bakterien/ml eingefroren. Die Lebensfähigkeit der eingefrorenen Zellen wurde gemessen, indem die bakterielle Suspension aufgetaut wurde und Reihenverdünnungen der Suspension auf 7H11-Agar kultiviert wurden. Unmittelbar vor der Provokation wurde eine Ampulle mit bakteriellen Zellen aufgetaut und in 7H9-Bouillon auf die gesuchte Konzentration verdünnt.
Die Meerschweinchen wurden Aerosolen lebensfähiger M. tuberculosis in einer speziell konzipierten Lucite-Aerosolkammer ausgesetzt. Die Masse der Aerosolkammer betrugen 14 mal 13 mal 24 Inch und enthielten an gegenüberliegenden Seiten zwei Eingänge mit einem Durchmesser von 6 Inch, um die Meerschweinchen einzuführen oder zu entfernen. Der Aerosoleinlass lag in der Deckenmitte der Kammer. Eine Vakuumpumpe (Gast Mfg. Co., Genton Harbor, Mich.) führte einer Venture-Verneblereinheit (Mes Inc., Burbank, Calif.) 30 lb/in² Luft zu, und aus einer 10-ml-Suspension auf Bazillen wurde ein Aerosol erzeugt. Eine 0,2 μm Atemzyklus-Filtereinheit (Pall Biomedical Inc., Fajardo, Puerto Rico) lag an einem Ende der Kammer, um den Druck innerhalb und außerhalb des Aufbaus auszugleichen. Aufgrund von Sicherheitserwägungen wurden die Aerosol-Provokationen so durchgeführt, dass die Kammer vollständig innerhalb einer Laminarbox angeordnet war.
Die Tiere wurden dem pathogenen Aerosol für 30 Minuten ausgesetzt, wobei die Suspension aus Bazillen in dem Vernebler während dieses Zeitraums vollständig aufgebraucht wurde. Jedes Aerosol wurde aus der 10-ml-Suspension erzeugt, die ungefähr 5,0·10⁴ bakterielle Partikel je ml enthielt. Vorausgehende Untersuchungen haben gezeigt, dass das Aussetzen von Meerschweinchen an diese Bakterienkonzentration konsistent Infektionen bei nicht geschützten Tieren produziert. Nach der Aerosolinfektion wurden die Meerschweinchen in Edelstahlkäfigen untergebracht, die in einem Laminar-flow-biohazard-Sicherheitsraums (Airo Clean Engineering Inc., Edgemont, Penn.) standen und auf Krankheitszeichen beobachtet. Die Tiere hatten während des gesamten Versuchs freien Zugang zu Meerschweinchenstandardfutter und Wasser.
Bei diesem Versuch wurden die infizierten Meerschweinchen getötet und die Milzlymphozytenproliferation wurde als Reaktion auf verschiedene Konzentrationen des 30 KD Proteins gemessen. Spezifischer wurden die Milzlymphozyten erhalten und gereinigt, wie von Brieman and Horwitz (J. Exp. Med. 164: 799–811) beschrieben. Die Lymphozyten wurden auf eine Endkonzentration von 10⁷/ml in RPMI 1640 (GIBCO Laboratories, Grand Island, N. Y.) das Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und 10% fötales Kälberserum (GIBCO) enthielt, und mit verschiedenen Konzentrationen an gereinigtem 30 KD sekretorischem Produkt in einem Gesamtvolumen von 100 μl in Vertiefungen von Mikrotestplatten (Gewebekulturplatte mit 96 Rundboden-Vertiefungen; Falcon Labware, Oxnard, Calif.) für 2 Tage bei 37°C in 5% CO₂-95% Luft und 100% Feuchtigkeit inkubiert. Nicht infizierte Tiere wurden als Negativkontrollen verwendet. Am Ende des Inkubationszeitraums wurden jeder Vertiefung 0,25 mCi [³H]thymidin (New England Nuclear, Boston, Mass.) zugefügt und die Zellen wurden weitere 2 Stunden bei 37°C in 5% CO₂-95% Luft bei 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Ein automatisierter Multisample-Zellharvester (Skatron Inc., Sterling, Va.) wurde verwendet, um jede Vertiefung zu waschen, und der Abfluss wurde durch eine Filtermatte (Skatron) passiert. Die Filtermattenabschnitte, die separate Mikrotestsvertiefungen darstellen, wurden in Szintillationsampullen angeordnet, und es wurde 2 ml flüssiger Ecoscint-H Szintillationscocktail (National Diagnostics, Manville, N. J.) zugefügt. Die Betateilchenemission wurde in einem Betaszintillationszähler (Beckman Instruments Inc., Fullerton, Calif.) gemessen.
Die Gewebeproben aus den infizierten und nicht infizierten Meerschweinchen wurden gegen 1 und 10 μg/ml des isolierten 30 KD sekretorischen Proteins getestet. Die Proben wurden dann auf ihre Fähigkeit hin überwacht, [³H]Thymidin einzubauen.
BEISPIEL 5
Protokoll der Provokation von mit Protein immunisierten Meerschweinchen mit aerosolierten M. tuberculosis
Wie zuvor wurden die Tiere drei Mal in Dreiwochenintervallen mit 100 μg des Proteins in SAF immunisiert. Kontrollmeerschweinchen wurden mit 120 μg von Ausgangs-EP in SAF oder immunisiert, oder mit Puffer in dem gleichen Adjuvans scheinimmunisiert. Drei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere mit aerosolierten M. tuberculosis provoziert, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Die Gewichtserhaltung der immunisierten Tiere wurde ebenfalls überwacht, um ferner die prophylaktische Fähigkeit der Vakzine zu illustrieren, die die in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte enthalten, die von pathogenen Bakterien produziert werden, wie von der vorliegenden Erfindung gelehrt wird.
Nach Abschluss der Gewichtsüberwachungsuntersuchung wurden die überlebenden Tiere getötet und die rechte Lunge und die Milz jedes Tiers wurde auf lebensfähige M. tuberculosis getestet. Die Tiere wurden in 2% Amphyllösung (National Laboratories, Montvale, N. J.) getränkt, und Lunge und Milz wurden steril entfernt. Die Anzahl der mikroskopisch primären Oberflächenläsionen in den Lungen wurden mittels Sichtprüfung gezählt. Koloniebildende Einheiten (CFU) von M. tuberculosis in der rechten Lunge und Milz wurden durch Homogenisierung jedes Organs in 10 ml 7H9 mit einem Mörser und Stößel und 90-Mesh-Norton-Alundum (Fisher) bestimmt, wobei das Gewebehomogenat in 7H9 reihenverdünnt, und die Verdünnungen auf Doppelplatten mit 7H11-Agar unter Verwendung von Tropfen von 0,1 ml/Tropfen kultiviert werden. Alle Platten wurden in modularen Inkubatorkammern aufbewahrt und 12 bis 14 Tage bei 37°C in 5% CO₂, 95% Luft bei 100% Feuchtigkeit inkubiert.
Es sollte wieder betont werden, dass das gereinigte, in hohem Maße abundante oder wesentlich extrazelluläre Produkt frei von den Problemen ist, die mit dem Stand der Technik oder Ausgangszusammensetzungen assoziiert sind, und leichter an die synthetische und kommerzielle Produktion anpassbar ist, wodurch die Vakzine der vorliegenden Erfindung dem Stand der Technik überlegen sind.
Insbesondere kann die Ausgangszubereitung mit modernen biomolekularen Techniken nicht leicht in großem Maßstab gefertigt werden. Jede kommerzielle Produktion dieser rohen Ausgangszubereitungen, die alle extrazellulären Produkte enthält, beinhaltet die Kultivierung großer Mengen des Zielpathogens oder einer nah verwandten Spezies und das Ernten der resultierenden überstehenden Flüssigkeit. Ein solche Herstellungsmethode ist stark anfällig für die Kontamination durch das Zielpathogen, toxische Nebenprodukte oder andere parasitäre Stoffe. Ferner ist es sehr viel wahrscheinlicher, dass die große Anzahl immunogener Determinanten in einer solchen Zubereitung eine toxische Immunreaktion in einem anfälligen Segment der immunisierten Population hervorzurufen. Unter Verwendung dieser rohen Ausgangszubereitungen negiert auch die Verwendung der verbreitetsten Hauttests, die derzeit für Tuberkulosescreening und -Kontrolle verwendet werden.
In direktem Gegensatz dazu können die Vakzine der vorliegenden Erfindung werden unter Verwendung von transformierten Hochausbeute-Wirten relativ sicher massengefertigt. Auf gleiche Weise können die Vakzine der vorliegenden Erfindung in identischen, leicht zu standardisierenden Chargen produziert werden, im Gegensatz zur stärker variablen Produktion extrazellulärer Ausgangsprodukte. Überdies sind, da die Anzahl der immunogenen Determinanten, die dem Immunsystem des Wirts präsentiert werden, relativ klein ist, toxische Reaktionen und die Gefahr, verbreitete Screeningtests außer Kraft zu setzen, stark reduziert.
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um zu ermitteln, ob Kombinationen aus in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten von M. tuberculosis ebenfalls Impfschutz bereitstellen würden. Im Allgemeinen wurden für diese Untersuchungen Meerschweinchen benutzt, die entweder intradermal oder subkutan mit verschiedenen Dosierungen von Vakzinen immunisiert wurden, die Kombinationen aus 5 gereinigten extrazelluläre Proteinen von M. tuberculosis in SAF drei Mal mit 3 oder 4 Wochen Abstand umfassten.
Die erste Proteinkombination, die für die Immunisierungsprozedur, als Kombination I bezeichnet, verwendet wurde, umfasste 71 KD, 32A KD, 30 KD, 23 KD und 16 KD Proteine, die gemäß den Protokollen gereinigt wurden, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Es wird davon ausgegangen, dass diese Kombination bis zu 60% des gesamten extrazellulären Proteins umfasst, das normalerweise in Kulturüberständen von M. tuberculosis vorhanden ist. Diese Proteine, die für die Verwendung in Kombination I ausgewählt wurden, werden in 2 durch ein Sternchen identifiziert. Eine Kombination-I-Vakzine, die 100 μg, 20 μg oder 2 μg jedes Proteins enthielt, wurde intradermal mit dem Adjuvans SAF verabreicht. Eine Kombination-I-Vakzine, die 20 μg jedes Proteins enthielt, wurde in ähnlichen Versuchen auch subkutan verabreicht. Für die Negativkontrolle wurden Meerschweinchen mit äquivalenten Volumen von SAF und Puffer mit dem gleichen Zeitplan scheinimmunisiert, während positive Kontrollen unter Verwendung von 120 μg der extrazellulären Ausgangsproteinzusammensetzung aus Beispiel 1 in SAF immunisiert wurden. Alle Injektionsvolumen wurden unter Verwendung von Puffer standardisiert.
BEISPIEL 6
Reaktion von Kombination-I-immunisierten Meerschweinchen auf eine Provokation mit einer Kombination-I-Vakzine
Um zu bestimmen, ob die Tiere nach der Impfung mit der Kombination-I-Mischung der wesentlichen extrazellulären Produkte eine messbare Immunreaktion entwickelt hatten, wurde ein kutaner Überemfpindlichkeitsassay durchgeführt. Den Meerschweinchen wurde der Rücken rasiert und es wurden intradermal 1,0 μg und 10,0 μg der gleichen Kombination aus den fünf gereinigten extrazellulären Proteinen injiziert. 10,0 μg Puffer wurde als Kontrolle verwendet und alle Injektionen wurden unter Verwendung eines Gesamtvolumens von 0,1 ml durchgeführt. Die Durchmesser von Erythem und Induration an den Hautteststellen wurden 24 Stunden nach der Injektion gemessen.

Die Ergebnisse der Messungen werden in der nachfolgenden Tabelle L präsentiert. Die Daten werden wieder als mittlere Messwerte für die Gruppe ± Standardfehler (SE), wie unter Verwendung traditioneller Verfahren bestimmt, ausgewiesen. ND gibt an, dass dieser besondere Aspekt des Versuchs nicht untersucht wurde. TABELLE L

			Erythem (mm) (Mittelwert ± SE
Meerschweinchen Status	n	PD	1,0 μg	10,0 μg
immunisiert	6	0	11.4 ± 4.6	17.4 ± 2.6
Kontrollen	6	0	ND	6.0 ± 0.5
			Induration (mm) (Mittelwert ± SE
	n	PD	1,0 μg	10,0 μg
immunisiert	6	0	7.3 ± 0.8	11.6 ± 1.2
Kontrollen	6	0	ND	4.2 ± 0.3

Die Daten beweisen eindeutig, dass bei den geimpften Tieren eine starke zellvermittelte Immunreaktion auf die extrazellulären Kombination-I-Proteine erzeugt wurde. Die immunisierten Meerschweinchen zeigen Erythem- und Indurationsmessungen, die beinahe drei Mal größer sind als die der Kontrolltiere.
BEISPIEL 7
Analyse des Immunschutzes der Kombination-I-Vakzine gegen aerosoliertes M. tuberculosis
Drei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Meerschweinchen, die für den vorherigen Überempfindlichkeitsassay verwendet wurden, mit aerosoliertem M. tuberculosis, Erdman-Stamm, provoziert und 10 Wochen lang wöchentlich gewogen. Diese Aerosolprovokation wurde unter Verwendung des Protokolls aus Beispiel 4 durchgeführt. Sechs Tiere, die mit 100 μg des wesentlichen extrazellulären Produkts der Kombination I, zusammen mit positiven und negativen Kontrollgruppen gleicher Größe immunisiert wur den, wurden gleichzeitig mit aerosoliertem M. tuberculosis provoziert. Die positiven Kontrollen wurden drei Mal mit 120 μg EP in SAF immunisiert.
Meerschweinchen, die vor dem Ende des Beobachtungszeitraums starben, wurden autopsiert und auf Anzeichen großer Tuberkuloseläsionen untersucht. Solche Läsionen wurden in allen Tieren gefunden, die während der Untersuchung verstarben.
Unterschiede zwischen immunisierten und Kontrolltieren bei den mittleren Gewichtsprofilen nach der Aerosolprovokation wurden durch wiederholte Varianzanalysemessungen (ANOVA) analysiert. Die Unterschiede zwischen immunisierten und Kontroll-Meerschweinchen beim Überleben nach der Provokation wurden durch den zweiseitigen Fisher-Exakttest analysiert. Die Daten sind die mittleren Gewichte ± Standardfehler (SE) für jede Gruppe von sechs Meerschweinchen.
Die Ergebnisse der wöchentlichen Gewichtsbestimmungen nach der Provokation werden in 4 gezeigt. Im Vergleich zu Meerschweinchen, die mit der Kombination extrazellulären Produkte immunisiert wurden, verloren scheinimmunisierte Tiere 15,9 ihres gesamten Körpergewichts. Die Gewichte der positiven Kontrollen glichen denen jener Tiere, die mit der Kombination aus fünf gereinigten extrazellulären Proteinen immunisiert wurden. Die Körpergewichte wurden unmittelbar vor der Provokation normiert. Der Unterschied zwischen Tieren, die mit Kombination I immunisiert wurden, und scheinimmunisierten Kontrollen war mit p < 0,0000001 bei wiederholten ANOVA-Messungen höchst signifikant.
Die Mortalität wurde zehneinhalb Wochen nach der Provokation bestimmt. Alle drei der scheinimmunisierten Mäuse starben mit drei Tagen Abstand voneinander zwischen zehn und zehneinhalb Wochen nach der Provokation. Die Mortalitätsergebnisse des Versuchs werden nachfolgend in Tabelle M bereitgestellt. TABELLE M

Überlebende/ Prozent

Status der Meerschweinchen Provoziert Überleben

Kombinationsimmunisiert 6/6 100%

EP-immunisiert 5/6 83%

scheinimmunisiert 3/6 50%

Nach Abschluss der Gewichtsüberwachungsuntersuchung wurden die überlebenden Tiere durch Hyperkapnie getötet und die rechte Lunge und die Milz jedes Tiers wurden unter Verwendung des Protokolls aus Beispiel 5 auf lebensfähige M. tuberculosis getestet. Die Ergebnisse der Zählungen, einschließlich der 3 Tiere, die in der letzten Woche des Versuchs starben, werden in der nachfolgenden Tabelle N als mittlere koloniebildende Einheiten (CFU) ± Standardfehler (SE) präsentiert. TABELLE N

		Mittlere CFU ± SE
Meerschweinchen Status	n	Rechte Lunge	Milz
scheinimmunisiert	6	8.9 ± 5.4·10⁷	1.3 ± 0.7·10⁷
immunisiert	6	3.4 ± 1.7·10⁶	1.8 ± 0.6·10⁶
EP-immunisiert	6	1.7 ± 0.7·10⁷	5.0 ± 2.8·10⁶

Die Log-Differenz zwischen der Konzentration an Bazillen in der Lunge von Tieren, die mit der Kombination aus gereinigten Proteinen immunisiert wurden, und der der scheinimmunisierten Tiere betrug 1,4, während die Log-Differenz der Bazillen in der Milz 0,9 betrug. Beim Vergleich hatten die immunisierten Tiere bei grober Prüfung während der Autopsie eine deutlich verringerte Tuberkulosebetroffenheit der Lunge verglichen mit den scheinimmunisierten Kontrollen. Die Tiere der positiven Kontrolle, die mit der extrazellulären Ausgangszubereitung (EP) aus Beispiel 1 immunisiert wurden, zeigten 0,7 Log mehr Bazillen in der Lunge und 0,5 Log mehr Bazillen in der Milz als Tiere, die mit der Kombination-I-Mischung aus gereinigten extrazellulären Proteinen immunisiert wurden.
BEISPIEL 8
Analyse des Immunschutzes der Kombination-I-Vakzine mit niedrigen Dosen bei intradermaler und subkutaner Zufuhr
Während Beispiel 7 bestätigte, dass die Kombination-I-Proteine bei Tieren Immunschutz bewiesen, die intradermal mit 100 μg jedes Proteins (30 + 32A + 16 + 23 + 71) 3 Mal, mit 4 Wochen Abstand, immunisiert wurden, wurde eine alternative Untersuchung durchgeführt, um die immunschützende Fähigkeit von niedrigeren Dosen der Kombination-I-Proteine, spezifisch 20 μg oder 2 μg jedes Proteins, zu beweisen. Wie in Beispiel 7 wurden Meerschweinchen (6 Tiere je Gruppe) mit Kombination-I-Proteinen (30 + 32A + 16 + 23 + 71) intradermal in SAF 4 Mal mit 3 Wochen Abstand immunisiert. Die Tiere erhielten entweder 20 μg jedes Proteins je Immunisierung oder 2 μg jedes Proteins je Immunisierung. Die Kontrolltiere wurden unter Verwendung des vorherigen Protokolls scheinimmunisiert. Drei Wochen später wurden die Tiere mit aerosoliertem M. tuberculosis provoziert und die Gewichte wurden 9 Wochen lang wöchentlich gemessen. Alle immunisierten Tiere überlebten bis zum Ende des Versuchs, während ein scheinimmunisiertes Tier vor dem Ende des Versuchs starb. Wie die folgenden Ergebnisse illustrieren, schützten Dosen, die 5-fach und sogar 50-fach niedriger waren als jene aus Beispiel 7, immunisierte Tiere vor aerosoliertem M. tuberculosis und, dass die Zufuhr sowohl auf intradermalem als auch subkutanem Weg wirksam war.
Im Vergleich zu Meerschweinchen, die mit 20 μg jedes Proteins der Kombination I immunisiert wurden, verloren scheinimmunisierte Tiere 12% ihres gesamten Körpergewichts während der 9 Wochen des Versuchs (die Gewichte wurden unmittelbar vor der Provokation normiert). Im Vergleich zu Meerschweinchen, die mit 20 μg jedes Proteins der Kombination I immunisiert wurden, verloren scheinimmunisierte Tiere 11% ihres normierten gesamten Körpergewichts. Somit waren Meerschweinchen, die intradermal mit geringen Dosen von Kombination-I-Proteinen immunisiert wurden, gegen Gewichtsverlust nach der Aerosolprovokation mit M. tuberculosis geschützt.
Auf gleiche Weise waren Meerschweinchen, die intradermal mit geringen Dosen von Kombination-I-Proteinen immunisiert wurden ebenfalls gegen Spelnomegalie geschützt, die mit der Dissemination von M. tuberculosis auf die Milz assoziiert ist. Wie in Tabelle O gezeigt, während Tiere, die mit 20 μg oder 2 μg jedes Proteins der Kombination I immunisiert wurden, Milzen hatten, die im Durchschnitt 4,6 ± 1,2 g bzw. 4,0 ± 0,8 g (Mittelwert ± SE) wogen, hatten scheinimmunisierte Tiere Milzen, die im Durchschnitt 9,6 ± 1,8 g (Tabelle 1), oder mehr als zwei Mal so viel wogen. TABELLE O

Milzgewicht (g)

Status der Meerschweinchen n Mittelwert ± SE

scheinimmunisiert 5 9.6 ± 1.8

immunisiert (20 μg) 6 4.6 ± 1.2

immunisiert (2 μg) 6 4.0 ± 0.8

Meerschweinchen, die intradermal mit niedrigen Dosen des Kombination-I-Proteins immunisiert wurden, hatten auch weniger CFU von M. tuberculosis in ihren Milzen. Wie in Tabelle P gezeigt, hatten Meerschweinchen, die mit 20 μg oder 2 μg jedes Proteins der Kombination I immunisiert wurden, Im Vergleich zu Meerschweinchen, die scheinimmunisiert wurden, einen Durchschnitt von 0,6 bzw. 0,4 Log weniger CFU in ihren Milzen. TABELLE P

		CFU in der Milz	Log
Meerschweinchen Status	n	Mittelwert ± SE	Differenz
scheinimmunisiert	5	3.1 ± 2.3·10⁶
immunisiert (20 μg)	6	8.1 ± 2.4·10⁵	–0.6
immunisiert (2 μg)	6	1.2 ± 0.6·10⁶	–0.4

Überdies waren Meerschweinchen, die subkutan mit Kombination-I-Proteinen immunisiert wurden, auch gegen Gewichtsverlust, Splenomegalie und Wachstum von M. tuberculosis in der Milz geschützt. In dem gleichen Versuch, der in Beispiel 8 beschrieben wird, wurden Meerschweinchen auch subkutan anstelle von intradermal mit 20 μg der Kombination-I-Proteine, 4 Mal mit 3 Wochen Abstand immunisiert. Diese Tiere waren gegen die Provokation beinahe genauso gut geschützt wie die Tiere, die intradermal mit 20 μg der Kombination-I-Proteine immunisiert wurden.
BEISPIEL 9
Reaktion von Kombination-I- und Kombination-II-immunisierten Meerschweinchen auf eine Provokation mit Kombination I und Kombination II
Es wurden zusätzliche Untersuchungen durchgeführt, um zu ermitteln, ob Kombinationen aus in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten von M. tuberculosis ebenfalls Impfschutz bereitstellen würden. Eine Untersuchung benutzte Meerschweinchen, die mit einer Vakzine immunisiert wurden, die zwei Kombinationen umfasste – Kombination I (71, 32A, 30, 23 und 16) und Kombination II (32A, 30, 24, 23 und 16).
Es wird davon ausgegangen, dass Kombination II bis zu 62% des gesamten extrazellulären Proteins umfasst, das normalerweise in Überständen von M. tuberculosis vorhanden ist. Die Tiere (6 je Gruppe) wurden vier Mal mit 100 μg jedes Proteins in Kombination I oder II in SAF mit 3 Wochen Abstand immunisiert. Die Tiere der negativen Kontrolle wurden mit dem gleichen Zeitplan mit äquivalenten Volumen von SAF und Puffer scheinimmunisiert.
Wie in Beispiel 6 wurden die Tiere auf kutane Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ getestet, um zu bestimmen, ob die Tiere nach der Impfung eine messbare Immunreaktion entwickelten. Tiere, die mit Kombination II immunisiert wurden, wiesen 16,8 ± 1,3 mm (Mittelwert ± SE) Erythem und 12,8 ± 1,2 mm Induration als Reaktion auf die Hauttestung mit Kombination II auf, während scheinimmunisierte Tiere nur 1,3 ± 0,8 mm Erythem und 0,3 ± 3 mm Induration als Reaktion auf Kombination II aufwiesen. Somit wiesen Tiere, die mit Kombination II immunisiert wurden, mehr als 12-fach mehr Erythem und mehr als 40-fach mehr Induration auf als die Kontrollen. Zum Vergleich: Tiere, die mit Kombination I immunisiert wurden, wiesen 21,3 ± 2,0 mm Erythem und 15,8 ± 0,1 mm Induration als Reaktion auf die Hauttestung mit Kombination I auf, während scheinimmunisierte Tiere nur 6,4 ± 0,8 mm Erythem und 2,6 ± 0,7 mm Induration als Reaktion auf Kombination I aufwiesen. Somit wiesen Tiere, die mit Kombination I immunisiert wurden, mehr als 3-fach mehr Erythem und mehr als 6-fach mehr Induration auf als die Kontrollen. Die Differenz aus den Kontrollen für Kombination-II-Proteine war sogar noch größer als die für Kombination-I-Proteine.
In dem gleichen Versuch entwickelten Tiere, die mit einer niedrigeren Dosis von Kombination-II-Proteinen (20 μg jedes Proteins zu 100 μg) immunisiert wurden, auch eine starke kutane Überempfindlichkeit gegen Kombination II. Sie wiesen 21,0 ± 2,0 mm Erythem und 15,3 ± 0,0 mm Induration als Reaktion auf Kombination II auf, während die scheinimmunisierten Tiere nur 1,3 ± 0,8 mm Erythem und 0,3 ± 0,3 mm Induration aufwiesen, wie oben festgehalten. Somit wiesen die Tiere, die mit einer niedrigeren Dosis von Kombination-II-Proteinen immunisiert wurden, mehr als 16-fach mehr Erythem und mehr als 50-fach mehr Induration auf als die Kontrollen, eine Differenz, die sogar noch größer war als für Tiere, die mit der höheren Dosis des Kombination-I-Proteins immunisiert wurden.
BEISPIEL 10
Analyse des Immunschutzes der Kombination-I- und -II-Vakzine gegen aerosoliertes M. tuberculosis
Drei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Meerschweinchen, die für den vorherigen Überempfindlichkeitsassay verwendet wurden, mit aerosoliertem M. tuberculosis, Erdman-Stamm, provoziert, wie in Beispiel 7, und 7 Wochen lang wöchentlich gewogen. Wie in Beispiel 7, waren in jeder Gruppe 6 Tiere. Während der ersten 7 Wochen nach der Provokation verloren die scheinimmunisierten Tiere durchschnittlich 19,5 g. Im Gegensatz dazu erhöhte sich das Gewicht der Tiere, die mit Kombination II (100 μg jedes Proteins) immunisiert wurden, um 52,4 g und bei den Tieren, die mit Kombination II mit einer niedrigeren Dosis (20 μg jedes Proteins) immunisiert wurden, erhöhte sich das Gewicht durchschnittlich um 67,2 g. Dagegen erhöhte sich das Gewicht der Tiere, die mit Kombination I immunisiert wurden, um 68 g. Somit verloren scheinimmunisierte Tiere im Vergleich zu Meerschweinchen, die mit der Kombination II (100 μg) immunisiert wurden, 11% ihres gesamten Körpergewichts. Im Vergleich zu Meerschweinchen, die mit Kombination II bei einer niedrigeren Dosis (20 μg) immunisiert wurden, verloren scheinimmunisierte Tiere 14% ihres gesamten Körpergewichts. Im Vergleich zu Tieren, die mit Kombi nation I immunisiert wurden, verloren scheinimmunisierte Tiere ebenfalls 14% ihres gesamten Körpergewichts.
BEISPIEL 11
Reaktion von Meerschweinchen, die mit den Kombinationen III bis XII immunisiert wurden, auf eine Provokation mit der gleichen Vakzine oder deren Komponenten
Zusätzliche Versuche wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit verschiedener Kombinationen von in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten von M. tuberculosis zu beweisen. Bei diesen Untersuchungen wurden Meerschweinchen vom Typ Hartley intradermal mit Vakzinen immunisiert, die Kombinationen aus 2 oder mehr in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten umfassen, die wie in Beispiel 2 gereinigt wurden. Die gereinigten extrazellulären Produkte werden unter Verwendung ihres scheinbaren Molekulargewichts identifiziert, das mit SDS-PAGE bestimmt wird. Die Meerschweinchen wurden mit den folgenden Kombinationen aus in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten immunisiert.

Kombination Proteinbestandteile

III 30 + 32A + 32B + 16 + 23

IV 30 + 32A

V 30 + 32B

VI 30 + 16

VII 30 + 23

VIII 30 + 71

IX 30 + 23.5

X 30 + 12

XI 30 + 24

XII 30 + 58
Jede Kombinationsvakzine beinhaltet 100 μg jedes aufgelisteten Proteins. Die Kombinationsvakzine wurden volumetrisch angepasst und intradermal in dem Adjuvans SAF injiziert. Wie zuvor wurden die Meerschweinchen vier Mal mit drei Wochen Abstand immunisiert.
Ein kutaner Überempfindlichkeitsassay wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Tiere nach der Impfung mit den Kombinationen III bis XII eine messbare Immunreaktion entwickelt hatten. Gruppen von sechs Meerschweinchen wurde der Rücken rasiert, und es wurde ihnen intradermal die gleiche Kombination aus gereinigten extrazelluläre Produkten injiziert, gegen die sie immunisiert wurden. Für diese Provokation wurden 10 μg jedes der Proteine in der Kombination injiziert. Alle Injektionen wurden unter Verwendung eines Gesamtvolumens von 0,1 ml durchgeführt. Die scheinimmunisierten Kontrollen, die nur mit SAF allein immunisiert wurden, wurden ebenfalls einer Hauttestung mit den Kombinationen III bis XII unterzogen, wobei wieder 10 μg jedes Proteins in der jeweiligen Kombination verwendet wurde. Die Durchmesser von Erythem und Induration an den Hautteststellen wurden 24 Stunden nach der Injektion gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben.

Die Ergebnisse dieser Messungen werden in der nachfolgenden Tabelle Q präsentiert. Die Daten werden wieder als mittlere Messwerte für die Gruppe ± Standardfehler (SE), wie unter Verwendung traditioneller Verfahren bestimmt, ausgewiesen. TABELLE Q

Vakzine	Hauttest	Durchmesser der Hautreaktion (mm)
Kombination	Kombination
		Erythem	Induration
III	III	12.2 ± 2.0	6.8 ± 0.8
IV	IV	9.9 ± 0.5	6.3 ± 0.2
V	V	13.0 ± 1.1	8.1 ± 0.7
VI	VI	19.2 ± 1.2	12.4 ± 0.5
VII	VII	14.3 ± 1.0	8.7 ± 0.4
VIII	VIII	18.9 ± 1.1	12.6 ± 0.8
IX	IX	17.0 ± 0.9	12.1 ± 0.9
X	X	19.3 ± 1.4	13.6 ± 1.2
XI	XI	18.3 ± 1.2	12.4 ± 0.8
XII	XII	17.7 ± 0.9	14.0 ± 1.2

Schein	III	4.8 ± 0.9	2.0 ± 0.0
Schein	IV	4.3 ± 1.1	2.0 ± 0.0
Schein	V	5.0 ± 0.5	2.0 ± 0.0
Schein	VI	4.5 ± 0.3	2.0 ± 0.0
Schein	VII	4.5 ± 0.3	2.0 ± 0.0
Schein	VIII	3.3 ± 0.3	2.3 ± 0.3
Schein	IX	3.7 ± 0.3	2.0 ± 0.0
Schein	X	3.7 ± 0.4	2.0 ± 0.0
Schein	XI	3.7 ± 0.2	2.0 ± 0.0
Schein	XII	3.8 ± 0.2	2.0 ± 0.0

Die Ergebnisse beweisen eindeutig, dass eine starke zellvermittelte Immunreaktion auf jede der Kombinationen aus gereinigten extrazellulären Produkten erzeugt wurde. Die immunisierten Meerschweinchen zeigten für alle Kombinationen Erythem, das mindestens doppelt und üblicherweise 3-fach größer war als das der Kontrollen. Ferner zeigten die immunisierten Meerschweinchen für alle Kombinationen Induration, die mindestens 3-fach größer war als die der Kontrollen.
BEISPIEL 12
Analyse des Immunschutzes der Kombinationen III–XII gegen aerosoliertes M. tuberculosis
Um die prophylaktische Wirksamkeit dieser beispielhaften Kombinationen aus gereinigten extrazellulären Produkten zu beweisen, wurden Meerschweinchen, die mit den Kombinationen III bis XII immunisiert wurden, drei Wochen nach der letz ten Immunisierung unter Verwendung des Protokolls aus Beispiel 4 mit M. tuberculosis provoziert.
Konsistent mit früheren Ergebnissen waren alle Meerschweinchen, die mit den Kombinationen III bis XII immunisiert wurden, gegen Tod nach der Provokation geschützt. 4 Wochen nach der Provokation starben 2 von 6 scheinimmunisierten Tieren (33%) im Vergleich zu 0 Tieren in Gruppen, die mit den Kombinationen IV bis XII immunisiert wurden, und 1 von 6 Tieren (17%) in der Gruppe, die mit Kombination III immunisiert wurden. 10 Wochen nach der Provokation waren 50% der scheinimmunisierten Tiere gestorben, in Vergleich zu 0 Todesfällen bei den Tieren der Gruppen, die mit den Kombinationen IX und XII (0%) immunisiert wurden, 1 von 6 Todesfällen (17%) bei den Tieren in den Gruppen, die mit Kombination III, IV, V, VI, X und XI immunisiert wurden, 1 von 5 Todesfällen (20%) bei den Tieren, die mit Kombination VIII immunisiert wurden, und 2 von 6 Todesfällen (33%) bei den Tieren, die mit Kombination VII immunisiert wurden.
Meerschweinchen, die vor dem Ende des Beobachtungszeitraums starben, wurden autopsiert und auf Anzeichen großer Tuberkuloseläsionen untersucht. Läsionen wurden in allen Tieren gefunden, die während der Untersuchung verstarben.

Nach Abschluss der Mortalitätsuntersuchung wurden die überlebenden Tiere durch Hyperkapnie getötet und die Milz jedes Tiers wurde unter Verwendung des Protokolls aus Beispiel 5 auf lebensfähige M. tuberculosis getestet. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle R als mittlere koloniebildende Einheiten (CFU) zusammen mit der log-Abnahme der scheinimmunisierten Tiere präsentiert. Ein Sternchen neben dem CFU-Wert ist ein Hinweis darauf, dass die Milzzählung bei einem Tier jeder Gruppe null betrug. Zum Zweck der Berechnung wurden Nullzählungen als 10³ CFU je Milz oder 3 Logs behandelt. TABELLE R

Vakzine	CFU in der Milz	Log-Abnahme
Gruppe	(mittleres Log)	Aus Scheinimmunisierung
III	5.99	0.5
IV	5.41	1.1
V	6.27	0.3
VI	< 5.80*	> 0.7
VII	< 5.61*	> 0.9
VIII	6.47	0.1
IX	< 5.85*	> 0.7
XXI	< 5.74*	> 0.8
XII	5.93	0.6
	6.03	0.5
Schein	6.53	-

Tiere, die mit den Kombinationen III, IV, VI, VII, IX, X, XI und XII immunisiert wurden, wiesen im Durchschnitt mindestens 0,5 Log weniger koloniebildende Einheiten von M. tuberculosis in ihren Milzen auf als die scheinimmunisierten Kontrollen. Insbesondere die Kombinationen IV und VII erwiesen sich als besonders wirksam, indem sie durchschnittliche Anzahl an koloniebildenden Einheiten annähernd um den Faktor zehn reduzierten. Tiere, die mit den Kombinationen V und VIII immunisiert wurden, wiesen im Durchschnitt 0,3 bzw. 0,1 Log weniger koloniebildende Elemente (CFU), in ihren hen auf als die scheinimmunisierten Kontrollen. Diese dramatische Reduktion bei den koloniebildenden Einheiten bei den Tieren, die gemäß den Lehren der vorliegende Erfindung immunisiert wurden, illustriert erneut die Anwendbarkeit beim Immunschutz der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 13
Reaktion von Meerschweinchen, die mit 3 verschiedenen Dosierungen der Kombination XIII immunisiert wurden auf eine Provokation mit Kombination XIII
Um ferner die Anwendbarkeit und den Umfang der vorliegenden Erfindung zu definieren sowie die Wirksamkeit zusätzlicher Kombinationen gereinigter extrazellulärer Produkte zu beweisen, wurden Meerschweinchen wie zuvor unter Verwendung alternativer Impfdosierungen immunisiert. Spezifisch 50 μg, 100 μg und 200 μg einer alternativen Kombination aus 3 in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte, die als Kombination XIII identifiziert werden und die 30 KD, 32(A) KD und 16 KD Proteine umfassen. Wie bei den vorhergehenden Beispielen wurden Gruppen von Tieren intradermal 4 Mal mit 3 Wochen Abstand mit den alternativen Dosierungen der Kombination XIII in SAF immunisiert.
Ein kutaner Überempfindlichkeitsassay wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Tiere nach der Impfung eine messbare Immunreaktion entwickelt hatten. Den Tieren wurde der Rücken rasiert und es wurde ihnen intradermal Kombination XIII injiziert, die 10,0 μg jedes der gereinigten extrazellulären Produkte enthielt. Alle Injektionen wurden unter Verwendung eines Gesamtvolumens von 0,1 ml durchgeführt. Die scheinimmunisierten Kontrollen wurden mit der gleichen Dosierung von Kombination XIII ebenfalls einer Hauttestung unterzogen. Die Durchmesser von Erythem und Induration an den Hautteststellen wurden 24 Stunden nach der Injektion gemessen.

Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle S als mittlere Messwerte für die Gruppe ± Standardfehler (SE), wie unter Verwendung traditioneller Verfahren bestimmt, ausgewiesen. TABELLE S

Vakzine	Vakzine	Durchmesser der Hautreaktion (mm)
Kombination	Dosis (μg)
		Erythem	Induration
XIII	50	17.8 ± 1.3	13.2 ± 1.0
XIII	100	11.2 ± 0.9	7.3 ± 0.4
XIII	200	10.0 ± 0.7	7.0 ± 0.4
Schein	0	5.7 ± 0.5	0.2 ± 0.2

Erneut beweisen diese Ergebnisse eindeutig, dass eine starke zellvermittelte Reaktion auf Kombination XIII bei Tieren erzeugt wurde, die mit jeder der drei Dosierungen von Kombination XIII immunisiert wurden. Die immunisierten Tiere wiesen Erythema auf, die etwa zwei bis drei Mal so groß waren wie die der Kontrollen. Sogar noch bemerkenswerter war, dass die immunisierten Tiere mindestens 35-fach größere Induration aufwiesen, als die der Kontrolltiere, die in allen Fällen eine minimale Reaktion aufwiesen.
BEISPIEL 14
Analyse des Immunschutzes der Kombination XIII in drei verschiedenen Dosierungen gegen aerosoliertes M. tuberculosis
Um ferner die Impfschutzsaspekte der Vakzine der vorliegenden Erfindung bei verschiedenen Dosierungen zu beweisen, wurden die immunisierten Meerschweinchen (6 je Gruppe), die für den vorhergehenden kutanen Überempfindlichkeitsassay verwendet wurden, mit aerosolierten M. tuberculosis drei Wochen nach der letzten Immunisierung provoziert. Die Aerosolprovokation wurde unter Verwendung des Protokolls aus Beispiel 4 durchgeführt. Die Kontrollgruppe mit 12 scheinimmunisierten Tieren wurde gleichzeitig provoziert.
Die Ergebnisse der wöchentlichen Gewichtsbestimmungen nach der Provokation sind grafisch in 5 dargestellt, und zeigen deutlich, das Meerschweinchen, die mit jeder der drei Dosierungen von Kombination XIII immunisiert wurden, vor Gewichtsverlust geschützt waren. Tiere, die mit höheren Dosierungen von XIII (100 und 200 μg) immunisiert wurden, zeigen tatsächlich eine Nettogewichtszunahme und Tiere, die mit der niedrigeren Dosierung (50 μg) immunisiert wurden, zeigten einen relativ kleinen Gewichtsverlust. Dagegen verloren die scheinimmunisierten Tiere ungefähr 22% ihres gesamten Körpergewichts in den Wochen unmittelbar nach der Provokation und hatten durchschnittlich einen Verlust von 182 g über die 10 Wochen des Beobachtungszeitraums.
Die nachfolgende Tabelle U illustriert die prozentuale Gewichtsveränderung für immunisierte Tiere und Kontrolltiere, die dadurch bestimmt wird, dass mittlere Gewichts am Ende der Provokation genommen wird, davon das mittlere Gewicht zu Beginn der Provokation abgezogen wird, und das Ergebnis durch das mittlere Gewicht zu Beginn der Provokation geteilt wird. Auf gleiche Weise wurde der prozentuale Schutz bestimmt, indem der mittlere prozentuale Gewichtsverlust der Kontrollen von dem mittleren prozentualen Gewichtszuwachs oder -verlust der immunisierten Tiere abgezogen wurde. TABELLE U

Immunogen Dosierung % Gewichtsveränderung % Schutz vor Gewichtsverlust

Kombination XIII 50 –4% 18%

Kombination XIII 100 +7% 29%

Kombination XIII 200 +5% 27%

Schein Schein –22% -
Tabelle U zeigt, dass die scheinimmunisierten Tiere über den Beobachtungszeitraum im Vergleich zu immunisierten Tieren eine beträchtliche Menge Gewicht (18% bis 29%) verloren haben. 5 stellt eine grafischere Illustration des Nettogewichtsverlusts für jede Gruppe immunisierter Tieren gegenüber scheinimmunisierter Tiere dar, die als wöchentliche Intervalle über den Beobachtungszeitraum von zehn Wochen eingezeichnet sind. Da der Verlust oder „Verbrauch" von Körpermasse einer der klassischen Nebenwirkungen von Tuberkulose ist, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass das Wachstum und die Proliferation von Tuberkelbazillen in den immunisierten Tieren durch die drei verschiedenen Dosierungen der beispielhaften Kombinationsvakzine der vorliegenden Erfindung inhibiert wurden.
BEISPIEL 15
Analyse des Immunschutzes der Kombinationen XIV bis XVIII gegen Provokation mit Kombinationen XIV bis XVIII

Um ferner den Umfang der vorliegenden Erfindung und das breite Spektrum an wirksamen Vakzinen zu beweisen, die gemäß deren Lehren formuliert werden können, wurden fünf zusätzliche Kombinationsvakzine, Kombinationen XIV bis XVIII, an Meerschweinchen getestet. Identifiziert durch das scheinbare Molekulargewicht des gereinigten extrazellulären Produkts, bestimmt unter Verwendung von SDS-PAGE, wird die Zusammensetzung jeder der Kombinationvakzine nachfolgend angegeben.

Kombination	Proteinbestandteile
XIV	30, 32A, 16, 32B, 24, 23, 45
XV	30, 32A, 16, 32B, 24, 23, 45, 23,5, 12
XVI	30, 32A, 16, 32B, 24,23
XVII	30, 32A, 16, 32B, 24, 71
XVIII	30, 32A, 32B
I	30, 32A, 16, 23, 71

Neben den neuen Kombinationvakzinen und den entsprechenden Kontrollen wurde Kombination I auch in dieser Versuchsreihe verwendet. Die Meerschweinchen wurden intradermal mit 50 μg jedes Proteins von Kombination XIV oder XV und mit 100 μg jedes Proteins der Kombinationen I, XVI, XVII und XVIII, all in SAF-Adjuvans, immunisiert. Die Tiere wurden insgesamt vier Mal immunisiert, wobei jede Injektion im Abstand von drei Wochen erfolgte.
Ein kutaner Überempfindlichkeitsassay wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Tiere nach der Impfung unter Verwendung des oben diskutierten Protokolls eine messbare Immunreaktion entwickelt hatten. Den Meerschweinchen wurde der Rücken rasiert, und es wurde ihnen intradermal die gleiche Kombination aus gereinigten extrazellulären Proteinen injiziert, gegen die sie immunisiert wurden. Für jede Provokation wurde die entsprechende Kombinationsvakzine injiziert, die 10 μg jedes Proteins enthielt. Alle Injektionen wurden unter Verwendung eines Gesamtvolumens von 0,1 ml durchgeführt. Die scheinimmunisierten Kontrollen wurden mit der gleichen Dosierung jeder Kombination ebenfalls einer Hauttestung unterzogen. Die Durchmesser von Erythem und Induration an den Hautteststellen wurden 24 Stunden nach der Injektion gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben.

Die Ergebnisse dieser Messungen werden in der nachfolgenden Tabelle V präsentiert, ausgewiesen als mittlere Messwerte für die Gruppe ± Standardfehler (SE), wie unter Verwendung traditioneller Verfahren bestimmt. TABELLE V

Vakzine	Hauttest	Durchmesser der Hautreaktion (mm)
Kombination	Kombination
		Erythem	Induration
XIV	XIV	13.3 ± 0.7	9.1 ± 0.4
XV	XV	10.4 ± 0.4	6.5 ± 0.4
XVI	XVI	8.0 ± 1.8	5.1 ± 1.0
XVII	XVII	9.4 ± 0.9	6.1 ± 1.1
XVIII	XVIII	13.6 ± 1.2	8.7 ± 0.7
I	I	10.0 ± 0.3	6.7 ± 0.2

Schein	XIV	5.5 ± 1.6	0.4 ± 0.2
Schein	XV	6.1 ± 0.5	0.4 ± 0.2
Schein	XVI	4.6 ± 1.4	0.4 ± 0.2
Schein	XVII	5.7 ± 1.2	0.2 ± 0.2
Schein	XVIII	2.1 ± 1.1	0 ± 0
Schein	I	6.0 ± 1.2	0.6 ± 0.2

Diese Ergebnisse beweisen eindeutig, dass eine starke zellvermittelte Immunreaktion auf die Kombinationen XIV bis XVIII, und, wie zuvor auf Kombination I erzeugt wurde. Die immunisierten Tiere wiesen Erythema, die etwa doppelt so groß waren wie die der Kontrollen. Sogar noch bemerkenswerter war, dass die immunisierten Tiere mindestens 10-fach größere Induration aufwiesen, als die scheinimmunisierten Kontrollen, die in allen Fällen eine minimale Reaktion aufwiesen.
BEISPIEL 16
Analyse des Immunschutzes der Kombinationen XIV bis XVIII und Kombination I gegen aerosoliertes M. tuberculosis
Um die Immunoreaktivität der Kombinationsvakzine aus Beispiel 15 zu bestätigen, und deren Anwendbarkeit auf infektiöse Tuberkulose zu beweisen, wurden die immunisierten Meerschweinchen, die für den vorhergehenden kutanen Überempfindlichkeitsassay verwendet wurden, drei Wochen nach der letzten Immunisierung mit aerosoliertem M. tuberculosis provoziert, und unter Verwendung des Protokolls aus Beispiel 4 überwacht. Eine Kontrollgruppe aus 12 scheinimmuni sierten Tieren, die gleichen, die in Beispiel 14 verwendet wurden, wurde auf die gleiche Weise provoziert. Die Ergebnisse diese Provokation sind in 6 grafisch dargestellt und werden direkt anschließend in Tabelle W gezeigt.

Die prozentuale Gewichtsveränderung wurde dadurch bestimmt, dass das mittlere Gewicht am Ende der Provokation genommen wird, davon das mittlere Gewicht zu Beginn der Provokation abgezogen wird, und das Ergebnis durch das mittlere Gewicht zu Beginn der Provokation geteilt wird. Auf gleiche Weise wurde der prozentuale Schutz bestimmt, indem der mittlere prozentuale Gewichtsverlust der Kontrollen von dem mittleren prozentualen Gewichtszuwachs oder -verlust der immunisierten Tiere abgezogen wurde. TABELLE W

Immunogen	% Gewichts- veränderung	% Schutz vor Gewichtsverlust
Kombination XIV	< > 3%	25%
Kombination XV	–4%	18%
Kombination XVI	–15%	7%
Kombination XVII	–11%	11%
Kombination XVIII	–12%	10%
Kombination I	–11%	11%

Schein	–22%

Wie in Tabelle W gezeigt, waren Meerschweinchen, die mit jeder der Kombinationsvakzine immunisiert wurden, vor Gewichtsverlust geschützt. Die scheinimmunisierten Tiere verloren ungefähr 22% ihres gesamten Körpergewichts.
Dagegen führte die prophylaktische Wirkung der Kombinationsvakzine zu einer tatsächlichen Gewichtszunahme bei einer der Testgruppen und einer reduzierten Menge an Gewichtsverlust bei der anderen. Spezifisch wurde bei Tieren, die mit Kombination XIV immunisiert wurden, ein 3%iger Gewichtszu wachs verzeichnet, während jene Tiere, die mit den anderen Kombinationen immunisiert wurden, nur 4% bis 15% ihres gesamten Gewichts verloren.
Diese Ergebnisse sind grafisch in 6 dargestellt, in der die wöchentlichen Gewichtsbestimmungen als Nettogewichtszuwachs oder -verlust für jede Gruppe von Tieren nach der aerosolierten Provokation eingezeichnet sind. Diese statistisch signifikante Differenz zwischen dem Nettogewichtsverlust der immunisierten Tiere und der scheinimmunisierten Kontrollen, der in 6 gezeigt wird, stellt ferner den Nachweis für die immunoprophylaktische Reaktion bereit, die von den Kombinationsvakzinen der vorliegenden Erfindung erzeugt wird.
BEISPIEL 17
Zellvermittelte Immunität bei Meerschweinchen, die mit drei verschiedenen Adjuvanzien immunisiert wurden
Immunogene Untersuchungen wurden unter Verwendung verschiedener Adjuvanzien durchgeführt. Spezifisch wurden drei verschiedene Immunogene, gereinigtes 30 KD Protein, Kombination I (30, 32A, 16, 23, 71) und Kombination XIII (30, 32A, 16) jeweils unter Verwendung drei verschiedener Adjuvanzien, Syntex-Adjuvans-Formulierung I (SAF), inkomplettes Freund'sches Adjuvans (IFA) und Monophosphoryllipid A enthaltendes Adjuvans (MPL). Solche Adjuvanzien sind im Allgemeinen dafür bekannt, die Immunreaktion eines Organismus zu verbessern, wenn sie mit einem Immunogen verabreicht werden.
Die Meerschweinchen wurden intradermal mit 100 μg jedes Proteins, das die Kombinationen I und XIII umfasst, und ungefähr 100 μg eines gereinigten 30 KD Proteins in jeder der drei verschiedenen Adjuvansformulierungen immunisiert. Die Meerschweinchen wurden mit jeder Formulierung insgesamt drei Mal mit Injektionen in dreiwöchigem Abstand immunisiert.
Nach der Immunisierung wurde ein kutaner Überempfindlichkeitsassay durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Meerschweinchen eine messbare Immunreaktion entwickelt hatten. Den Meerschweinchen wurde der Rücken rasiert, und es wurde ihnen intradermal das gleiche Immunogen injiziert, gegen das sie immunisiert worden wurden. Für die Provokation wurde 10 μg jedes Proteins in den Kombinationen I und XIII oder 10 μg des gereinigten 30 KD Proteins in einem Gesamtvolumen von 100 μl injiziert. Die scheinimmunisierten Meerschweinchen, die mit einer der drei Adjuvanzien geimpft wurden, wurden einer Hauttestung mit jeder der Immunogenformulierungen unterzogen, die das gleiche Adjuvans enthielten. Die Durchmesser von Erythem und Induration an den Hautteststellen wurden 24 Stunden nach der Provokation gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben.

Die Ergebnisse dieser Messungen werden in der nachfolgenden Tabelle X präsentiert. Wie bereits diskutiert, werden die Daten als mittlere Messwerte für die Gruppe ± Standardfehler, wie unter Verwendung anerkannter Techniken bestimmt, ausgewiesen. TABELLE X

Vakzine	Adjuvans	Hauttest Reagens	Durchmesser reaktion (mm)	der Haut
			Erythem	Induration
30	SAF	30	10.7 ± 1.6	5.8 ± 1.5
30	IFA	30	8.8 ± 0.7	4.6 ± 0.7
30	MPL	30	10.2 ± 1.7	5.3 ± 1.5

XIII	SAF	XIII	7.3 ± 0.5	4.1 ± 0.5
XIII	IFA	XIII	6.8 ± 0.9	3.5 ± 0.5
XIII	MPL	XIII	6.3 ± 0.4	3.4 ± 0.3

I	SAF	I	6.9 ± 0.6	4.0 ± 0.3
I	IFA	I	6.8 ± 0.2	3.6 ± 0.3
I	MPL	I	7.4 ± 0.4	3.9 ± 0.5

Schein	SAF	30	0.7 ± 0.7	1.0 ± 0
Schein	IFA	30	0 ± 0	0 ± 0
Schein	MPL	30	0 ± 0	0 ± 0

Schein	SAF	XIII	1.0 ± 1.0	1.0 ± 0
Schein	IFA	XIII	0 ± 0	0.3 ± 0.3
Schein	MPL	XIII	0 ± 0	0 ± 0

Schein	SAF	I	4.7 ± 0.3	1.0 ± 0
Schein	IFA	I	2.0 ± 1.0	0.7 ± 0.3
Schein	MPL	I	1.0 ± 1.0	0.7 ± 0.3

Wie in den Daten gezeigt, die in Tabelle X präsentiert werden, stellen die Kombinationsvakzine und die gereinigten extrazellulären Produkte der vorliegenden Erfindung eine starke zellvermittelte immunogene Reaktion bereit, wenn sie mit verschiedenen Adjuvanzien formuliert werden. Überdies stellte jede einzelne der drei Adjuvanzien etwa die gleiche immunogene Reaktion für jedes jeweilige Immunogen bereit. Im Allgemeinen wiesen die immunisierten Meerschweinchen Erythemdurchmesser auf, die ungefähr sieben bis zehn Mal so groß waren, wie die der scheinimmunisierten Meerschweinchen, während die Indurationen ungefähr vier bis sechs mal größer waren, als diejenigen, die in den Kontrolltieren gemessen wurden.
Die Fähigkeit der vorliegenden Erfindung, eine starke immunogene Reaktion in Kombination mit verschiedenen Adjuvanzien hervorzurufen, erleichtert die Optimierung der Vakzine. Das heißt, die Adjuvanzien, die verwendet werden, um wirksame Vakzinformulierungen gemäß den hier beschriebenen Lehren zu produzieren, können größtenteils basierend auf Überlegungen zu sekundären Kriterien, wie etwa Stabili tät, Fehlen von Nebenwirkungen, Kosten und leichte Lagerung, ausgewählt werden. Diese und andere Kriterien, die nicht direkt mit der Stimulierung einer Immunreaktion verbunden sind, sind besonders wichtig, wenn Vakzinformulierungen für die weit verbreitete Verwendung unter relativ primitiven Bedingungen entwickelt werden.
BEISPIEL 18
Analyse des Immunschutzes der Kombinationen XIX bis XXVIII gegen Provokation mit den Kombinationen XIX bis XXVIII

Die Erzeugung einer Immunreaktion unter Verwendung zusätzlicher Kombinationsvakzine, Kombinationen XIX bis XXVIII, wurde bewiesen. Neben den neuen Kombinationsvakzinen und den entsprechenden Kontrollen wurden die Kombinationen IV und XIII auch als positive Kontrollen verwendet, um eine Immunreaktion bei Meerschweinchen hervorzurufen. Identifiziert durch das scheinbare Molekulargewicht des gereinigten extrazellulären Produkts, bestimmt unter Verwendung von SDS-PAGE, wird die Zusammensetzung jeder der Kombinationvakzine nachfolgend angegeben.

Kombination	Proteinbestandteile
XIX	30, 32A, 23
XX	30, 32A, 23,5
XXI	30, 32A, 24
XXII	30, 32A, 71
XXIII	30, 32A, 16, 23
XXIV	30, 32A, 16, 23,5
XXV	30, 32A, 16, 24
XXVI	30, 32A, 16, 71
XXVII	30, 32A, 16, 32B
XXVIII	30, 32A, 16, 45
IV	30, 32A
XIII	30, 32A, 16

Die Meerschweinchen wurden insgesamt vier Mal immunisiert, wobei jede Injektion im Abstand von drei Wochen erfolgte. Jede Kombinationsvakzine, die verwendet wurde, um die Tiere zu immunisieren, bestand aus 100 μg jedes Proteins in SAF-Adjuvans, um ein Gesamtvolumen von 0,1 ml bereitstellen.
Unter Verwendung des Protokolls, das in Beispiel 3 diskutiert wurde, wurden kutane Überempfindlichkeitsassays durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Tiere nach der Impfung eine messbare Immunreaktion entwickelten. Den Meerschweinchen wurde der Rücken rasiert, und es wurde ihnen intradermal die gleiche Kombination aus gereinigten extrazellulären Proteinen injiziert, mit der sie immunisiert wurden. Die Proteinkombinationen, die verwendet wurde, um die Tiere zu provozieren, bestand aus 10 μg jedes Proteins. Die scheinimmunisierten Kontrollen wurden mit der gleichen Dosierung jeder Kombination ebenfalls einer Hauttestung unterzogen. Wie in Beispiel 3 wurden die Durchmesser von Erythem und Induration an den Hautteststellen 24 Stunden nach der Injektion gemessen.

Die Ergebnisse dieser Messungen werden in der nachfolgenden Tabelle Y präsentiert, ausgewiesen als mittlere Messwerte für die Gruppe von Tieren ± Standardfehler. TABELLE Y

Vakzine	Hauttest	Durchmesserder Hautreaktion (mm)
Kombination	Kombination
		Erythem	Induration
XIX	XIX	8.5 ± 0.6	3.9 ± 0.3
XX	XX	8.2 ± 0.3	3.7 ± 0.3
XXI	XXI	11.1 ± 1.1	4.5 ± 0.4
XXII	XXII	9.4 ± 0.8	4.3 ± 0.4
XXIII	XXIII	8.3 ± 1.1	3.0 ± 0.3
XXIV	XXIV	8.5 ± 0.9	3.4 ± 0.5
XXV	XXV	7.9 ± 0.5	3.2 ± 0.4
XXVI	XXVI	8.9 ± 0.7	3.3 ± 0.5
XXVII	XXVII	7.2 ± 1.0	2.8 ± 0.5
XXVIII	XXVIII	8.5 ± 0.5	2.8 ± 0.3
IV	IV	9.0 ± 0.9	4.1 ± 0.3
XIII	XIII	9.4 ± 0.9	4.3 ± 0.3

Schein	XIX		1.0 ± 0
Schein	XX	4.0 ± 2.6	1.0 ± 0
Schein	XXI	1.3 ± 1.3	1.3 ± 1.3
Schein	XXII	3.5 ± 1.0	1.0 ± 1.0
Schein	XXIII	1.3 ± 1.3	1.0 ± 0
Schein	XXIV	0 ± 0	1.0 ± 0
Schein	XXV	0 ± 0	1.0 ± 0
Schein	XXVI	0 ± 0	2.0 ± 1.0
Schein	XXVII	2.3 ± 2.3	1.0 ± 0
Schein	XXVIII	0 ± 0	1.0 ± 0
Schein	IV	2.0 ± 1.2	1.0 ± 0
Schein	XIII	2.8 ± 1.6	1.0 ± 0
		1.5 ± 1.5

Die in Tabelle Y präsentierten Ergebnisse zeigen explizit, dass eine starke zellvermittelte Immunreaktion auf die Kombinationen XIX bis XXVIII erzeugt wurde, wenn die Provokation mit den gleichen Immunogenen erfolgte. Wie zuvor wurde eine starke zellvermittelte Immunreaktion auch von den Kombinationen IV und XIII hervorgerufen. Das Erythem, das die immunisierten Meerschweinchen aufwiesen, war mindestens doppelt so groß, und erwies sich im Allgemeinen als mehr als vierfach größer als die Reaktion, die bei den entsprechenden scheinimmunisierten Kontrolltieren hervorgerufen wurde. Auf gleiche Weise war die Induration, die die immunisierten Tiere aufwiesen, mindestens doppelt, und im Allgemeinen drei bis vier Mal größer als die der nicht immunisierten Kontrollen. Die im Wesentlichen stärkere Immunreaktion, die unter den Tieren erzeugt wurde, die gemäß den Lehren der vorliegenden Offenbarung immunisiert wurden, illustrieren erneut die immunschützende Anwendbarkeit der Kombinationsvakzine der vorliegenden Offenbarung.
Der Fachmann wird den zusätzlichen Nutzen der Vakzine und Verfahren der vorliegenden Offenbarung ebenfalls zu schätzen wissen. Da zum Beispiel eher einzelne Verbindungen oder ausgewählte Kombinationen stark gereinigter Molekülspezies für die betreffenden Vakzine verwendet werden als ganze Bakterien oder Komponenten davon, ist es im Vergleich zu abgeschwächten oder inaktivierten bakteriellen Vakzinen des Stands der Technik sehr viel weniger wahrscheinlich, dass die Vakzine der vorliegenden Erfindung eine toxische Reaktion hervorzurufen. Überdies sind die molekularen Vakzine der vorliegenden Offenbarung für immungeschwächte Individuen nicht lebensbedrohlich. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können nämlich therapeutisch verwendet werden, um eine gerichtete Immunreaktion gegen einen pathogenen Stoff in einem infizierten Individuum stimulieren.
Die selektive Verwendung von in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten oder deren immunogenen Analoge verhindert auch die Entwicklung einer opsonierenden humoralen Reaktion, die die Pathogenese intrazellulärer Bakterien erhöhen kann. Da der Impfschutz, der durch diese Erfindung erzeugt wird, eher gegen ungebundene Proteine gerichtet ist, wird jede opsonische Reaktion einfach zu einer Phagozytose und zur Zerstörung des in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkts führen als zu der beschleunigten Inklusion der parasitischen Bakterien. Überdies reduziert die selektive Verwendung gereinigter extrazellulärer Produkte das Potential, eine Reaktion zu erzeugen, die die Verwendung von in großem Umfang verwendeter Screening- und Kontrolltechniken ausschließt, die auf dem Erkennen von immunogenen Stoffen durch den Wirt basieren. Anders als die Vakzine des Stands der Technik könnten die Screeningtests weiter unter Verwendung eines immunoreaktiven Moleküls durchgeführt werden, das von dem Pathogen exprimiert wird, aber nicht in den Vakzinen enthalten ist, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die Verwendung einer solchen immunogenen Determinante würde nur eine Reaktion in solchen Individuen hervorrufen, die dem Zielpathogen ausgesetzt waren, was es ermöglichen würde, die entsprechenden Messungen zu nehmen.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Offenbarung ist, dass die gereinigten extrazellulären Produkten leicht in großen Mengen zu erhalten sind und unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, leicht isoliert werden können, im Gegensatz zu den abgeschwächten Bakterien und bakteriellen Komponenten der Vakzine des Stands der Technik. Da die immunoreaktiven Produkte der vorliegenden Offenbarung für die meisten interessierenden Organismen auf natürliche Weise extrazellulär in die umgebenden Medien freigesetzt werden, ist das Entfernen der intrazellulären Kontaminanten und Zellbruchstücke vereinfacht. Ferner sind in den meisten Produktionssystemen, da die dominierendsten oder in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte oder immunogene Analoge davon verwendet werden, um die gesuchte Immunreaktion zu stimulieren, die Expressionslevel und Kulturkonzentrationen des erntbaren Produkts im Allgemeinen hoch. Dementsprechend ist, welche Form der Produktion auch immer benutzt wird, die Isolierung der gesuchten Produkte in großem Maßstab leicht durch biochemische Routineprozeduren, wie etwa Chromatographie oder Ultrafiltration, zu erreichen. Diese inhärenten Attribute und molekularen Merkmale der immunogenen Determinanten, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, erleichtern die Produktion einer konsistenten, standardisierten, hochwertigen Zusammensetzung zur Verwendung in großem Maßstab.
Alternativ macht die Verwendung der gereinigten Molekülverbindungen, die auf den immunogenen Eigenschaften der domi nierendsten oder in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte der Zielpathogene basieren, auch die synthetische Erzeugung der immunoaktiven Vakzinkomponenten der vorliegenden Offenbarung in großem Maßstab relativ leicht. Zum Beispiel können die interessierenden extrazellulären Produkte oder deren immunogene Analoge unter Verwendung DNA-Rekombinationstechik in nicht pathogene Wirtsbakterien kloniert und in Sicherheit geerntet werden. Molekulare Klonierungstechniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, können zum Isolieren und Exprimieren von DNA, die den interessierenden extrazellulären Produkten entspricht, deren Homologen oder allen Segmenten davon in ausgewählte starke Expressionsvektoren verwendet werden, zur Insertion in Wirtsbakterien, wie etwa Escherichia coli. Beispielhafte Techniken sind in II R. Anon, Synthetic Vaccines 31–77 (1987), Tam et al., Incorporation of T and B Epitopes of the Circumsporozoite Protein in a Chemically Defined Synthetic Vaccine Against Malaria, 171 J. Exp. Med. 299–306 (1990), und Stover et al., Protective Immunity Elicited by Recombinant Bacille Caimette-Guerin (BCG) Expressing Outer Surface Protein A (OspA) Lipoprotein: A Candidate Lyme Disease Vaccine, 178 J. Exp. Med. 197–209 (1993) zu finden.
Die vorliegende Offenbarung beinhaltet einen Prozess zur Verwendung einer Wirtszelle, um ein in hohem Maße abundantes extrazelluläres Produkt zu produzieren, welches aus der Gruppe, die aus M. tuberculosis 110 KD Protein, 80 KD Protein, 71 KD Protein, 58 KD Protein, 45 KD Protein, 32A KD Protein, 32B KD Protein, 30 KD Protein, 24 KD Protein, 23,5 KD Protein, 23 KD Protein, 16 KD Protein, 14 KD Protein, 12 KD Protein und den jeweiligen Analogen, Homologen und Untereinheiten davon besteht, ausgewählt ist. Praxisbeispiele, die die bevorzugten Verfahren zum Exprimieren der extrazellulären Proteine der vorliegenden Erfindung demonstrieren, sind Folgende:
BEISPIEL 19
Expression von löslichem, verstümmeltem, extrazellulärem, sekretorischem 32A KD Hauptprotein von M. tuberculosis unter Verwendung des Plasmids pSMT3 in Mycobacterium smegmatis und Mycobacterium vaccae
Dieses Beispiel richtet sich auf den Nachweis der Expression und Sekretion des sekretorischen 32A KD Hauptproteins M. tuberculosis in einem Mycobacterium. Wir verwendeten das pSMT3-Plasmid (Dr. Douglas B. Young, Dept. Medical Microbiology, St. Mary's Hospital Medical School, Norfolk Place, London, W2 1PG, United Kingdom, ein 5,7 kb (Kilobasenpaare) Plasmid mit Replikationsstartpunkten sowohl für E.-coli (col El ori) als auch für Mycobacterium (Mycobacterium fortuitum Plasmid pAL5000 ori).
Eine Leadersequenz vor dem Strukturgen war für die Expression erforderlich. Somit wurde eine erfolgreiche Expression in pET22b der 30 und 32A KD Proteine von M. tuberculosis erhalten, indem der die jeweilige Leadersequenz des Proteins vor dem Strukturgen zugefügt wurde. Für beide Proteine führte das zur Expression sowohl eines Volllängen- als auch eines verstümmelten Proteins. Diese Konstrukte waren in E. coli relativ stabil, d. h. sie exprimierten die rekombinanten Proteine nach 2 oder 3 Subkulturen, aber nicht nach zusätzlicher Subkultivierung.
Eine erfolgreiche Expression in pET22b der 30 und 32A KD Proteine von M. tuberculosis wurde auch erhalten, indem die die E.-coli-abgeleitete pelB Leadersequenz für jedes Protein vor dem Strukturgen zugefügt wurde. Die Expressionslevel in diesen Konstrukten waren sogar höher als in jenen, die die jeweiligen Leadersequenzen der 30 oder 32A KD Proteine benutzten. Ein Nachteil der pelB-Konstrukte war jedoch ihre Instabilität. Diese Konstrukte verloren ihre Fähigkeit, jedes rekombinante Protein zu exprimieren nach einer Subkultur. Zuvor wurde die Expression und Sekretion des 32A KD Proteins von M. tuberculosis in Mycobacterium smegmatis und Mycobacterium vaccae unter Verwendung von pSMT3-basierten Expressionskonstrukten erreicht, die ein –4,5 kb-DNA Fragment enthielten, das von EcoRV-Restriktionsorten flankiert war, und das das 32A-Protein-Volllängengen kodierte. Jedoch im Gegensatz zu dem Fall mit dem extrazellulären 30 KD Hauptprotein von M. tuberculosis und dem extrazellulären 16 KD Hauptprotein von M. tuberculosis führte die Verwendung dieser Konstrukte zu der intrazellulären Akkumulation von 32A KD Protein von M. tuberculosis und erbrachte keine Hochausbeute-Sekretion des 32A KD Proteins von M. tuberculosis.
Die vorliegenden Offenbarung funktioniert durch das Kultivieren der rekombinanten Stämme von Mycobacterium smegmatis, die DNA-Fragmente enthalten, die das extrazelluläre 32A KD Vollängen-Hauptprotein eher bei 28°C enthalten als bei 37°C, der üblichen Temperatur zur Kultivierung dieser Bakterien. Wenn es bei 28°C kultiviert wird, exprimiert und sekretiert das rekombinante Mycobacterium große Mengen des 32A KD Proteins. Das sekretierte Protein kann dann aus dem flüssigen Kulturüberstand durch herkömmliche Reinigungstechniken aufgereinigt werden.
Vor der vorliegenden Offenbarung konnten nur kleine Mengen an rekombinantem 32A KD Protein von M. tuberculosis aus rekombinanten Mycobakterien erhalten werden, die das Protein exprimieren. Die Erfindung ermöglicht es, große Mengen an rekombinantem 32A Protein aus dem Kulturfiltrat rekombinanter Mycobakterien zu erhalten, die das 32A KD Protein in das Kulturmedium sekretieren. Somit wird eine rentable Produktion von rekombinantem 32A KD Protein möglich.
BEISPIEL 20
Die Gene aus dem extrazellulären 32A KD Hauptprotein von M. tuberculosis wurden in Mycobacterium smegmatis unter Verwendung eines pSMT3-basierten Expressionskonstrukts klo niert, das ein 4,5 kb DNA-Fragment enthielt, das von EcoRV-Restriktionsorten flankiert ist, die das 32A KD Volllängenprotein kodierten (Konstrukt A in 19). Das rekombinante M. smegmatis wurde in 7H9-Medium, das 2% Glucose enthielt, bei 37°C und 28°C kultiviert. Das Kulturfiltrat jedes Organismus wurde dann aufgefangen und SDS-PAGE-Analyse unterzogen. Wenn M. smegmatis, das den pSMT3-vektor mit dem 32A KD Volllängenproteingen enthielt, bei 37°C kultiviert wurde, war praktisch kein 32A KD Protein in dem Kulturfiltrat vorhanden, (Spur 2 von 20). Wenn der gleiche M.-smegmatis-Stamm bei 28°C kultiviert wurde, wurde eine große Menge an 32A KD Protein sekretiert, und war in dem Kulturfiltrat vorhanden (Spur 3, Pfeilspitze). Spur 1 zeigt Molekulargewichtsstandards, wobei das Molekulargewicht·10^–3 links neben den Standard notiert ist. Spur 2 zeigt Filtrat von M. smegmatis, das den pSMT3-Vektor mit dem 32A KD Volllängenproteingen von M. tuberculosis enthält, das bei 37°C kultiviert wurde. Spur 3 zeigt Filtrat von M. smegmatis, das den pSMT3-Vektor mit dem 32A KD Volllängenproteingen von M. tuberculosis enthält, das bei 28°C kultiviert wurde.
M. smegmatis, das die Konstrukte B, D, E und G enthält, exprimierte und sekretierte auch große Mengen des rekombinanten 32A KD Proteins von M. tuberculosis, wenn es bei 28°C kultiviert wurde.
Eine N-terminale Aminosäurenanalyse des rekombinanten 32A KD Proteins von Mycobacterium tuberculosis, das von Mycobacterium smegmatis bei 28°C exprimiert und sekretiert wurde, ergibt die folgende Sequenz:
Zwei rekombinante M.-smegmatis-Stämme (Konstrukte A und D), die das 32A KD Volllängenproteingene M. tuberculosis enthielten, wurden bei 28°C kultiviert. Das Kulturfiltrat jedes Organismus wurde erhalten und ein Aliquot denaturierender SDS-PAGE-Analyse unterzogen. Die Proteine wurden auf Polyvinylidenfluoridmembranen (PVDF-Membranen) übertragen und die Coomassie-Blau-R-gefärbte Bande, die bei 32 KD migrierte, wurde ausgeschnitten und einer automatisierten Aminosäuresequenzbestimmung unterzogen. Die oben gezeigte Sequenz ist im herkömmlichen Einbuchstabencode.
Die N-terminale Sequenz des rekombinanten Proteins, das von M. smegmatis sekretiert wird, die entweder Konstrukt A oder D enthält, ist mit dem nativen 32A KD Protein von M. tuberculosis identisch, was bestätigt, dass das rekombinante 32A KD Protein von M. tuberculosis in M. smegmatis auf die gleiche Weise verarbeitet wird wie das native 32A KD von M. tuberculosis in M. tuberculosis.
Auf gleiche Weise können die extrazellulären Proteine, deren Analoge, Homologe oder immunoreaktiven Proteinuntereinheiten in einem großen Maßstab in einer relativ reinen Form unter Verwendung üblicher Labortechniken und automatisierter Sequenzer-Technologie chemisch synthetisiert werden. Diese Art der Produktion ist besonders attraktiv zum Konstruieren von Peptiduntereinheiten oder Analogen mit geringerem Molekulargewicht, die den antigenen Determinanten der extrazellulären Produkte entsprechen. Beispielhafte Techniken zur Produktion von kleineren Proteinuntereinheiten sind dem Fachmann gut bekannt, und sind in II R. Anon, Synthetic Vaccines 15–30 (1987), und in A. Streitwieser, Jr., Introduction to Organic Chemistry 953–55 (3rd ed. 1985) zu finden. Alternative Techniken können in Gross et al., „Nonenzymatic Cleavage of Peptide Bonds: The Methionine Residues in Bovine Pancreatic Ribonuclease," 237 The Journal of Biological Chemistry No. 6 (1962), Mahoney, „High-Yield Cleavage of Tryptophanyl Peptide Bonds by o-Iodosobenzoic Acid," 18 Biochemistry No. 17 (1979), and Shoolnik et al., „Gonococcal Pili," 159 Journal of Experimental Medicine (1984) gefunden werden. Andere immunogene Techniken, wie etwa Anti-idiotyping oder gerichtete molekulare Evolution unter Verwendung von Peptiden, Nukleotiden oder anderen Molekülen, wie etwa Mimetik können ebenfalls benutzt werden, um wirksame immunoreaktive Verbindungen zu erzeugen, die in der Lage sind, die gesuchte prophylaktische Reaktion zu produzieren.
Nukleinsäuremoleküle, die für die Anwendung der vorliegenden Offenbarung nützlich sein können, können aus einer Vielzahl von Vektoren exprimiert werden, einschließlich zum Beispiel viraler Vektoren, wie etwa viraler Herpesvektoren (z. B. US-Patentschrift Nr. 5,288,641 ), Retroviren (z. B., EP 0,415,731 ; WO 90/07936 , WO 91/0285 , WO 94/03622 ; WO 93/25698 ; WO 93/25234 ; US-Patentschrift Nr. 5,219,740 ; WO 89/09271 ; WO 86/00922 ; WO 90/02797 ; WO 90/02806 ; US-Patentschrift Nr. 4,650,764 ; US-Patentschrift Nr. 5,124,263 ; US-Patentschrift Nr. 4,861,719 ; WO 93/11230 ; WO 93/10218 ; Vile and Hart, Cancer Res. 53: 962–967, 1993; Ram et al., Cancer Res. 53: 83–88, 1993; Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33: 493–503, 1992; Baba et al., J. Neurosurg. 79: 729–735, 1993), pseudotypisierte Viren, adenovirale Vektoren (z. B., WO 94/26914 , WO 93/9191 ; Kolls et al., PNAS 91(1): 215–219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90(24): 11498–502, 1993; Guzman et al., Circulation 88(6): 2838–48, 1993; Guzman et al., Cir. Res. 73(6): 1202–1207, 1993; Zabner et al., Cell 75(2): 207–216, '993; Li et al., Hum. Gene Ther. 4(4): 403–409, 1993; Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5(10: 1287–1291, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5(2): 130–134, 1993; Jaffe et al., Nat. Genet. 1(5): 372–378, 1992; und Levrero et al., Gene 101(2): 195–202, 1991), adenovirusassoziierte virale Vektoren (Flotte et al., PNAS 90(22): 10613–10617, 1993), Parvovirusvektoren (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5: 457–463, 1994), und Pockenvirusvektoren (Panicali and Paoletti, PNAS 79: 4927–4931, 1982). Die Nukleinsäuremoleküle (oder Vektoren, d. h., eine Anordnung, die in der Lage ist, die Expression einer interessierenden Sequenz zu lenken) können mit einem breiten Spektrum an Mechanismen in Wirtszellen eingeführt werden, einschließlich zum Beispiel Transfektion, einschließlich zum Beispiel gekoppelte DNA, um Adenovirus zu inaktivieren (Michael et al., J. Biol. Chem. 268(10: 6866–6869, 1993; und Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3(2): 147–154, 1992), Cytofectin-vermittelte Einführung (DMRIE-DOPE, Vical, Calif.), direkte DNA-Injektion (Acsadi et al., Nature 352: 815–818, 1991); DNA-Ligand (Wu et al., J. of Biol. Chem. 264: 16985–16987, 1989); Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84: 7413–7417, 1989); Liposome (Pickering et al., Circ. 89(1): 13–21, 1994; und Wang et al., PNAS 84: 7851–7855, 1987); Mikroprojektionsbombardierung (Williams et al., PNAS 88: 2726–2730, 1991); und direkte Zuführung von Nukleinsäuren, die das Enzym selbst kodieren, entweder alleine (Vile and Hart, Cancer Res. 53: 3860–3864, 1993); oder unter Verwendung von PEG-Nukleinsäurekomplexen (vgl. auch WO 93/18759 ; WO 93/04701 ; WO 93/07283 und WO 93/07282 ).
Als zusätzliche Alternative können DNA oder anderes genetische Material, das ein oder mehrere Gene kodiert, die in der Lage sind, die Expression eines oder mehrerer der extrazellulären Produkte zu induzieren, Homologe, Analoge, oder Untereinheiten der vorliegenden Offenbarung unter Verwendung der so genannten „nackten DNA"-Technik direkt in einen Säugerwirt injiziert werden. Nach der In-vivo-Einführung und der resultierenden Aufnahme des genetischen Konstrukts durch die Zellen des Wirts, wird der Wirt die endogene Produktion eines oder mehrerer der kodierten immunoreaktiven Produkte beginnen, was eine wirksame Immunreaktion auf die anschließende Provokation entstehen lässt. Wie der Fachmann zu schätzen wissen wird, kann das Koppeln des genetischen Konstrukts an eukaryotische Promotersequenzen und/oder Sekretionssignale die endogene Expression und die anschließende Sekretion des kodierten immunoreaktiven Produkts oder der Produkte erleichtern. Beispielhafte Techniken für die Verwendung von nackter DNA als Vakzine sind in der internationalen Patentschrift Nr. WO 9421797 A (Merck & Co. Inc. and ViCal Inc.), der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 9011092 (ViCal Inc.), und, Robinson, Protection Against a Lethal Influenza Virus Challenge by Immunization with a Hemagglutinin-Expressing Plasmid DNA, 11 Vaccine 9 (1993), und in Ulmer et al., Heterologous Protection Against Influenza by Injection of DNA Encoding a Viral Protein, 259 Science (1993) zu finden.
Alternativ wurden Techniken zur Fusion eines stark immunogenen Proteinendes offenbart in Tao et al., Idiotype/Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Fusion Protein as a Vaccine for B-Ceo Lymphoma, 362 Nature (1993), und für T-Zellen-Epitop-Mapping in Good et al., Human T-Cell Recognition of the Circumsporozoite Protein of Plasmodium falciparum: Immunodominant T-Cell Domains Map to the Polymorphic Regions of the Molecule, 85 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), und Gao et al., Identification and Characterization of T Helper Epitopes in the Nucleoprotein of Influenza A Virus, 143 The Journal of Immunology No. 9 (1989).
Da viele bakterielle Gattungen Homologie aufweisen, werden die vorstehenden Beispiele zum Zweck der Illustration bereitgestellt. Es sollte ebenfalls betont werden, dass die Prävalenz von Homologie zwischen Spezies in der DNA und entsprechenden Proteinen von Mikroorganismen die Vakzine der vorliegenden Erfindung in die Lage versetzt, die kreuzreaktive Immunität zu induzieren. Da die immunodominanten Epitope der in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte kreuzschützende Immunität gegen Provokation mit anderen Serogruppen und Spezies der ausgewählten Gattungen bereitstellen können, wird der Fachmann zu schätzen wissen, dass Vakzine, die gegen eine Spezies gerichtet sind, unter Verwendung der extrazellulären Produkte oder immunogenen Analoge eine anderen Spezies entwickelt werden können.
Zum Beispiel ist M. bovis zwischen 90% und 100% homolog mit M. tuberculosis und ist hinsichtlich der Provokation einer Immunreaktion stark kreuzreaktiv. Dementsprechend können Vakzine, die auf in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten von M. bovis oder einem anderen Mycobacterium basieren, verschiedene Grade von Schutz gegen Infektion durch M. tuberculosis und umgekehrt bieten. Es wird somit als im Rahmen der vorliegenden Offenbarung liegend erachtet, eine immunoprophylaktische Reaktion gegen mehrere bakterielle Spezies der gleichen Gattungen unter Verwendung einer stark homologen immunogenen Determinante eines geeigneten, in hohem Maße abundante extrazellulären Produkts, bereitzustellen.
Es sollte ebenfalls betont werden, dass die immunogene Determinante, die ausgewählt wird, um die vorliegende Offenbarung anzuwenden, in vielen verschiedenen Formen verwendet werden kann, um eine wirksame schützende oder immunodiagnostische Immunreaktion auszulösen. Somit ist die Art der Präsentation einer oder mehrerer der immunogenen Determinanten ausgewählter in hohem Maße abundanter extrazellulärer Produkte an das Immunsystem des Wirts nicht entscheidend, und kann verändert werden, um die Produktion oder Verabreichung zu erleichtern. Zum Beispiel können die Vakzine der vorliegenden Offenbarung unter Verwendung ganzer extrazelluläre Produkte oder einer beliebigen immunostimulierenden Fraktion davon, einschließlich Peptiden, Proteinuntereinheiten, immunogener Analoge und Homologe, wie oben festgehalten, formuliert werden.
Gemäß den Lehren der vorliegenden Offenbarung können wirksame Proteinuntereinheiten der in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkte von M. tuberculosis in einer genetisch vielförmigen Population einer Sängerspezies identifiziert werden. Die identifizierten resultierenden immunodominanten T-Zellen-Epitope sollten von anderen Säugern, einschließlich Menschen und Rindern erkannt wer den. Diese immunodominanten T-Zellen-Epitope sind daher für Vakzine sowie für immunodiagnostische Reagenzien nützlich. Eine beispielhafte Untersuchung, die die immunodominanten T-Zellen-Epitope des sekretorischen 30 KD Hauptproteins von M. tuberculosis identifizierte, wurde folgendermaßen durchgeführt.
BEISPIEL 21
Protokoll für die Kartierung immunodominanter Epitope eines Proteins
Synthetische Peptide (15-mers), die das gesamte native Protein abdecken und um 10 Aminosäuren überlappen wurden für Milzlymphozytenproliferationsassays verwendet, um die immunodominanten T-Zellen-Epitope eines sekretorischen Hauptproteins von M. tuberculosis 55 zu identifizieren.
Die Kontrolltiere erhielten Phosphat-gepufferte Salzlösung in SAF. Die zellvermittelten Immunreaktionen wurden durch Hauttestung, wie oben beschrieben, bewertet. Die Lymphozyten wurden in 96-well Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon Labware) angesetzt und mit dem synthetischen 15-mer-Peptiden mit 20 μg ml^–1, gereinigtem Protein mit 20 μg ml^–1, gereinigtem Proteinderivat [(PPD); Connaught Laboratories LTD] mit 20 μg ml^–1, oder Concanavalin A mit 10 μg ml^–1 für 2 Tage in Gegenwart von 10 U Polymyxin B dreifach inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 16 Std. mit 1 μCi [³H]Thymidin (New England Nuclear) markiert und dann geerntet (Breiman and Horwitz, 1987). Eine positive proliferative Reaktion wurde folgendermaßen definiert: (dpm des Antigens)-(dpm des Mediums)³ 1500 und (dpm des Antigens)/(dpm des Mediums)³ 1,2.
Zuvor wurden zwei Arten von Untersuchungen, die auf die Identifikation von Epitopen des 32A KD Proteins von M. tuberculosis zielten, durchgeführt. Die erste Art über prüfte die T-Zellen-Reaktionen auf Peptide (die die gesamte Sequenz des Proteins überlappen) von Menschen, die a) Tuberkulin-positiv (PPD) waren; zum Teil infolge einer Impfung mit BCG; b) Lepromin-positiv waren; c) TB hatten; oder d) Lepra hatten. (P. Launois, R. Deleys, M. N. Niang, A. Drowart, M. Adrien, P. Deirckx, J.-L. Cartel, J.-L. Sarthou, J.-P. van Vooren, and K. Huygen, 1994, „T-Cell epitope mapping of the major secreted mycobacterial antigen AG85A in tuberculosis and leprosy", Infect. and Immun. 62: 3679–3687.) Die Reaktion dieser Menschen auf dieses Protein ist häufig schwach, was es schwierig macht, die Epitope exakt zu kartieren. Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurden ausgezüchtete Meerschweinchen mit gereinigtem Protein immunisiert, wobei das Immunsystem auf dieses einzige Protein fokussiert wurde und eine sehr starke zellvermittelte Immunreaktion produzierte. Die Reaktion wurde am Höchstwert der T-Zellen-Reaktionsbereitschaft untersucht, d. h. innerhalb weniger Wochen nach der Immunisierung.
Die zweite Art von vorheriger Untersuchung überprüfte die T-Zellen-Reaktionen auf Peptide von Inzuchtmäusen, die mit BCG infiziert waren. (K. Huygen, E. Lozes, B. Gilles, A. Drowart, K. Palfliet, F. Jurion, I. Roland, M. Art, M. DuFaux, J. Nyabenda, J. De Bruyn, J.-P. van Vooren, and R. Deleys, 1994, „Mapping of TH1 helper T-cell epitopes an major secreted mycobacterial antigen 85A in mice infected with live Mycobacterium bovis BCG", Infect. and Immun., 62: 363–370.) Es ist unwahrscheinlich, dass eine solche Untersuchung Ergebnisse erbringt, die die verschiedenen Reaktionen multipler MHC-Typen prognostiziert, die beim Menschen zu finden sind.
Um prognostische Ergebnisse zu erhalten, wurden gemäß der vorliegenden Erfindung eine große Anzahl an ausgezüchteten Meerschweinchen mit einer großen Diversität von HLA-Typen untersucht. Die Epitope des 32A KD Proteins, die zu 25 oder mehr von den Meerschweinchen erkannt wurden, sind daher stark immunodominant und werden von mehrfachen HLA-Typen erkannt. Daher ist es wahrscheinlich, dass sie generell von HLA-Molekülen anderer Spezies, einschließlich Menschen, Rinder und anderer Tiere, erkannt werden. Eine solche Untersuchung sollte stark prognostisch für immunodominante Epitope sein, die von Menschen und anderen Säugern erkannt werden. Außerdem beruhte die Untersuchung an Mäusen, auf die oben verwiesen wird, auf Reaktionen von Tieren, die mit BCG infiziert waren. Solche Tiere können a) mit M. tuberculosis infizierte Tiere nicht spiegeln, und b) keine so starke Reaktion auf ein spezifisches Protein – in diesem Fall, das 32A KD Protein -entwickeln, wie Tiere ohne aktive Krankheit.
BEISPIEL 22
Immunodominante Epitop-Kartierung des 32A KD Proteins
Die Prozedur aus Beispiel 21 wurde durchgeführt unter Verwendung der siebenundfünfzig synthetischen Peptide (15-mers), die das gesamte native 32A KD Protein abdecken. Die Sequenz jedes targetierten 15-mers wird in Tabelle AB gezeigt:
TABELLE AB
Wie in der folgenden Tabelle gezeigt differieren aus technischen Gründen die synthetischen Peptid Nummern 1A, 5A, 15A, 26A, 29A, 43A und 56A von den entsprechenden targetierten 15-mers.
TABELLE AC

Immunodominante T-Zellen-Epitope des sekretorischen 32A KD Hauptproteins von M. tuberculosis, die von mehr als 25% der Meerschweinchen erkannt wurden, die mit gereinigtem M. tuberculosis 32A KD Protein immunisiert wurden, werden in der nachfolgenden Tabelle AD präsentiert und grafisch in 7 illustriert. TABELLE AD

Peptid*	Einschließlich Aminosäuren für Reifes Protein	Sequence ID No
9	41–55	104
11	51–65	106
12	56–70	107
15	71–85	110
19	91–105	114
20	96–110	115
23	111–125	118
25	121–135	120
27	131–145	122
28	136–150	123
29	141–155	124
31	151–165	126
32	156–170	127
39	191–205	134
40	196–210	135
41	201–215	136
43	211–225	138

Gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung kann ein oder mehrere der immunodominanten Epitope, die oben identifiziert wurden, in eine Vakzine gegen Tuberkulose eingebaut werden. Zum Beispiel können einzelne immunodominante Epitope synthetisiert werden und einzeln oder in Kombination in einem multiplen Antigen-Peptidsystem verwendet werden.
Alternativ können zwei oder mehr immunodominante Epitope chemisch aneinander gekoppelt werden. Die Peptide können, entweder aneinander gekoppelt oder separat, in einem geeigneten Adjuvans kombiniert und in Untereinheit-Vakzinen für Menschen oder andere Säuger verwendet werden. Außerdem können die immunodominanten Epitope in neuen immunodiagnostischen Reagenzien, wie etwa neuen Hauttests verwendet werden.
Spezifische beispielhafte Adjuvanzien, die in der gegenwärtigen Erfindung verwendet werden, um die Aktivität der ausgewählten immunogenen Determinanten zu verbessern, sind SAF, Adjuvanzien, die Monophosphoryllipid A (MPL) enthalten, Freunds inkomplettes Adjuvans, Freunds komplettes Adjuvans, das inaktivierte Bakterien enthält, Gamma-Interferone (Radford et al., American Society of Hepatology 2008–2015, 1991; Watanabe et al., PNAS 86: 9456–9460, 1989; Gansbacher et al., Cancer Research 50: 7820–7825, 1990; Maio et al., Can. Immunol. Immunother. 30: 34–42, 1989; US-Patentschriften Nr. 4,762,791 und 4,727,138 ), IL-12, IL-15 (Grabstein et al., Science 264: 965–968, 1994), MF 59, MF 59 plus MTP, MF 59 plus IL-12, MPL plus TDM (Trehalosedimycolat), QS-21, QS-21 plus IL-12, IL-2 (American Type Culture Collection Nr. 39405, 39452 und 39516; vgl. auch US-Patentschrift Nr. 4,518,584 ), Dimethyldioctadecylammonium (ddA), ddA plus dextran, Alaun, Quil A, ISCOMS, (immunstimulierende Komplexe), Liposome, Lipidträger, Proteinträger und Mikroeinkapselungstechniken. Zusätzliche Adjuvanzien, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, sind Wasser-in-Ö1-Emulsionen, Mineralsalze (zum Beispiel Alaun), Nukleinsäuren, Blockpolymertenside und mikrobielle Zellwände (Peptidoglycolipide). Wenngleich es den Umfang der Erfindung nicht beschränkt, wird dennoch davon ausgegangen, dass Adjuvanzien die Immunreaktionen vergrößern können, indem sie die langsame Freisetzung von Antigenen von der Injektionsstelle und/oder die Modulation des Mediums an der Injektionsstelle, einschließlich der zellulären und zytokinen Bestandteile, ermöglichen.
Besonders bevorzugt ist IL-12, entweder allein oder in Verbindung mit einem anderen Adjuvans. Es wurde festgestellt, dass die Immunisierung von Meerschweinchen mit gereinigten extrazellulären Hauptproteinen von M. tuberculosis in Gegenwart von IL-12 allein, oder in Gegenwart von IL-12 plus einem anderen Adjuvans, zum Beispiel, MF 59, den Impfschutz gegenüber derjenigen, die ohne IL-12 erhalten wird, verbessert. Indem es die Fähigkeit der Vakzine, Impfschutz zu induzieren, erhöht, macht IL-12 die Vakzine wirksamer.
Es war bekannt, dass murines IL-12 sowohl murine Lymphoblasten als auch menschliche Lymphoblasten stimuliert, und dass menschliches IL-12 menschliche Lymphoblasten stimuliert, aber es war nicht bekannt, ob IL-12, entweder von der Maus oder vom Menschen, Meerschweinchen-Lymphoblasten stimuliert. Um zu bestimmen, ob murines oder menschliches IL-12 Meerschweinchenlymphoblasten stimuliert, wurde die IL-12-Aktivität unter Verwendung des Protokolls getestet, das in Current Protocols in Immunology, 1993, Cytokines and their Receptors entitled „Lymphoblasts Proliferation Assay for IL-12 Activity" Alternate Protocol), pages 6.16.3 through 6.16.5 beschrieben wird.
BEISPIEL 23
Milzzellen wurden aus einem männlichen Hartley-Meerschweinchen isoliert, bei einer Konzentration von 10⁷ Zellen/75 cm² Kulturkolben, der 20 ml angereichertes Medium enthält für 3 Tage mit PHA bei einer Konzentration von 8 μg/ml inkubiert, 1:1 mit zusätzlichem Medium verdünnt und für 1 Tag mit IL-2 bei einer Konzentration von 50 IU/ml inkubiert. Die Lymphoblasten wurden gewaschen, gezählt, in Mikrotiterplatten mit 96-Flachbodenvertiefungen mit einer Zelldichte von 2·10⁴ Lymphoblasten/Vertiefung verteilt, und für 24 Std. mit 0 bis 5 μg/ml IL-12 (R&D Systems, Minneapolis, Minn.) inkubiert. ³H-Thymidin (0,25 μCi) wurde jeder Vertiefung für weitere 18 Std. zugefügt, und die Zellen wurden dann geerntet und auf eingebautes ³H-Thymidin getestet.
Die Ergebnisse von zwei unabhängigen Versuchen unter Verwendung von Milzzellen von verschiedenen ausgezüchteten Meerschweinchen werden in 10 und 11 gezeigt. Die Daten sind mittlere DPM ± S. D. for sechsfache Vertiefungen.
In jedem Versuch stimulierten sowohl murines als auch menschliches IL-12 die Proliferation von Meerschweinchenlymphoblasten in dosisabhängiger Weise stark.
Um zu bestimmen, ob IL-12 die Wirksamkeit einer Vakzine verbessern würde, die aus gereinigten 30, 32A und 16 KD extrazellulären Hauptproteins von M. tuberculosis besteht, wurden Meerschweinchen mit der Vakzine in Gegenwart oder Abwesenheit von IL-12 immunisiert und mit virulentem M. tuberculosis durch Aerosol provoziert. Es wurde festgestellt, dass IL-12 die Fähigkeit der Vakzine, die Tiere gegen Gewichtsverlust und Wachstum von M. tuberculosis in den Lungen provozierter Tiere zu schützen, verbessert.
BEISPIEL 24
Meerschweinchen (6 je Gruppe) wurden intradermal drei Mal mit 100 μg gereinigtem 30, 32A und 16 KD extrazellulärem Hauptprotein von M. tuberculosis in Gegenwart von Adjuvans (MF 59) und rekombinantem Maus-IL-12, gekauft von R&D Systems (Minneapolis, Minn.), immunisiert. Kontrolltiere (6 je Gruppe) wurden nur mit Adjuvans und IL-12 scheinimmunisiert. Die Tiere wurden dann mit einem Aerosol eines virulenten M.-tuberculosis-Erdman-Stamms provoziert und danach wöchentlich gewogen, bis sie nach 10 Wochen getötet wurden.
Scheinimmunisierte Tiere wiesen einen größeren Gewichtsverlust auf als Tiere, die mit den Proteinen in Gegenwart von Adjuvans plus IL-12 immunisiert wurden. Die Ergebnisse werden in 12 gezeigt.
BEISPIEL 25
Meerschweinchen (6 je Gruppe) wurden intradermal drei Mal mit 100 μg gereinigtem 30, 32A und 16 KD extrazellulärem Hauptprotein von M. tuberculosis in Gegenwart von Adjuvans (MF 59) allein, IL-12 allein, oder Adjuvans + IL-12 immunisiert oder mit Adjuvans allein, oder Adjuvans + IL-12 scheinimmunisiert. IL-12 wurde von R&D Systems gekauft. Die Tiere wurden dann mit einem Aerosol eines virulenten M.-tuberculosis-Erdman-Stamms provoziert und danach wöchentlich gewogen, bis sie nach 10 Wochen getötet wurden. 13 zeigt die mittlere Nettogewichtszunahme oder -verlust jeder Gruppe vom Gewicht am Tag der Provokation. Tiere, die mit den Proteinen immunisiert wurden, wiesen weniger Gewichtsverlust auf beide Gruppen der scheinimmunisierten Kontrollen. Von den scheinimmunisierten Tieren verloren die Tiere, die mit Adjuvans in Gegenwart von IL-12 immunisiert wurden, weniger Gewicht als die Tiere, die nur mit Adjuvans immunisiert wurden. Von den mit Protein immunisierten Tieren, wiesen Tiere, die mit Proteinen in Gegenwart von Adjuvans plus IL-12 immunisiert wurden, über den Verlauf des Versuchs weniger Gewichtsverlust auf, als Tiere, die mit den Proteinen entweder nur in Gegenwart von IL-12 oder nur von Adjuvans immunisiert wurden. Somit wiesen Tiere, die mit Proteinen in Gegenwart sowohl von Adjuvans als auch IL-12 immunisiert wurden, während des kritischen Krankheitszeitraums von 4 bis 10 Wochen nach der Provokation die geringste Menge an Gewichtsverlust in den Wochen 5, 6, 7 und 10 und die zweitgeringste Menge an Gewichtsverlust in den Wochen 4 und 8 auf.
BEISPIEL 26

Tiere wurden drei Mal intradermal mit 100 μg extrazellulären 30, 32A und 16 KD Hauptproteinen von M. tuberculosis in Gegenwart von MF 59 oder MF 59 + IL-12 immunisiert, oder nur mit MF 59, nur mit IL-12 oder MF 59 + IL-12 scheinimmu nisiert. Die Tiere wurden mit virulentem M. tuberculosis durch Aerosol provoziert, 10 Wochen lang beobachtet und getötet. Die rechte Lunge wurde entfernt, und für M. tuberculosis auf 7H11-Agarplatten kultiviert. Die Daten, die in Tabelle AE gezeigt werden, sind mittlere CFU je rechter Lunge. TABELLE AE CFU in Lungen von Tieren, die mit 3 gereinigten extrazellulären Hautproteinen von M. tuberculosis (30, 32A, 16 KD) in Gegenwart verschiedener Adjuvanzien immunisiert wurden

	mittleres log₁₀ CFU
A. Scheinimmunisiert (nur MF 59)	7.7
B. Scheinimmunisisert (MF 59 + IL-12)	7.0
C. Protein-immunisiert (nur MF 59)	7.0
D. Protein-immunisiert (nur IL-12)	6.9
E. Protein-immunisiert (MF 59 + IL-12)	6.6

Tiere, die mit Proteinen immunisiert wurden, hatten weniger CFU als Tiere, die ohne Proteine aber mit der gleichen Adjuvanszubereitung immunisiert wurden. Somit hatten Tiere, die mit Proteinen plus MF 59 (C) immunisiert wurden, 0,7 Log weniger CFU in den Lungen als Tiere, die nur mit MF 59 (A) immunisiert wurden; und Tiere, die mit Proteinen mit MF 59 + IL-12 (E) immunisiert wurden, hatten 0,4 Log weniger CFU in den Lungen als Tiere, die nur mit MF 59 + IL-12 (B) immunisiert wurden, und 1,1 Log weniger CFU in den Lungen als Tiere, die nur mit MF 59 immunisiert wurden.
Tiere, die mit Proteinen in Gegenwart von IL-12 immunisiert wurden, hatten weniger CFU als Tiere, die mit Proteinen in Abwesenheit von IL-12 immunisiert wurden. Somit hatten Tiere, die mit Proteinen in MF 59 + IL-12 (E) immunisiert wurden, 0,4 Log weniger CFU in den Lungen als Tiere, die mit Proteinen nur in Gegenwart von MF 59 immunisiert wurden.
BEISPIEL 27
Meerschweinchen wurden intradermal drei Mal mit 100 μg gereinigtem 30, 32A und 16 KD extrazellulärem Hauptprotein von M. tuberculosis in Gegenwart von nur Adjuvans (MF 59) (9 Tiere), oder in Gegenwart von Adjuvans plus rekombinantem Maus-IL-12 (9 Tiere), gekauft von R&D Systems (Minneapolis, Minn.), immunisiert. Kontrolltiere wurden nur mit verschiedenen Adjuvanzien immunisiert (17 Tiere). Die Tiere wurden dann mit einem Aerosol eines virulenten M.-tuberculosis-Erdman-Stamms provoziert und danach wöchentlich gewogen, bis sie nach 10 Wochen getötet wurden. Die scheinimmunisierten Tiere wiesen einen größeren Gewichtsverlust auf als Tiere, die mit den Proteinen entweder nur in Gegenwart von Adjuvans oder Adjuvans plus IL-12 immunisiert wurden. Von den Tieren, die mit Proteinen immunisiert wurden, verloren Tiere, die mit Proteinen nur in Gegenwart von Adjuvans immunisiert wurden, mehr Gewicht als Tiere, die mit Proteinen in Gegenwart von Adjuvans plus IL-12 immunisiert wurden. Zudem hatten scheinimmunisierte Tiere eine höhere Mortalität während des Verlaufs des Versuchs, –24% der scheinimmunisierten Tiere starben, gegenüber nur 6% von Tieren, die mit Proteinen immunisiert wurden. Von den Tieren, die mit Proteinen immunisiert wurden, hatten Tiere, die mit Proteinen nur in Gegenwart von Adjuvans immunisiert wurden, eine größere Mortalität (11%) als Tiere, die mit Proteinen in Gegenwart von Adjuvans plus IL-12 (0%) immunisiert wurden. Die Ergebnisse werden in 14 gezeigt.
Der Fachmann wird ebenfalls zu schätzen wissen, dass DNA kodierende Peptide synthetisiert und verwendet werden können, um die Peptide, einzeln oder zusammen, zu exprimieren, oder um in einer DNA-Vakzine kombiniert werden können, die direkt in Menschen oder andere Säuger injiziert wird.
Ein Konstrukt, das nur aus den immunogenen Epitopen (oder der DNA, die dafür kodiert) besteht, würde die Immunreaktion auf die schützenden Abschnitte des Moleküls fokussieren. Indem irrelevante oder sogar immunsuppressive Epitope vermieden werden, kann so ein Konstrukt eine stärkere und schützendere Immunreaktion induzieren.
Kleinere Proteinuntereinheiten der in hohem Maße abundanten extrazellulären Produkten, molekulare Analoge davon, Gene, die dafür kodieren und jeweilige Kombinationen davon sind innerhalb des Umfangs der Erfindung solange sie eine wirksame Immunoprophylaxe herbeiführen oder als immunodiagnostisches Reagens wirken. Überdies sind rekombinante Proteinprodukte, wie etwa Fusionsproteine oder extrazelluläre Produkte, die durch bekannte molekulare Rekombinationstechniken modifiziert werden, völlig mit den Lehren der vorliegenden Erfindung kompatibel. Zusätzlich sind immunogen erzeugte Analoge der ausgewählten radioaktiven Determinanten oder Peptide und Nukleotide, die unter Verwendung gerichteter Entwicklung abgeleitet werden, ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung. Überdies können die ausgewählten immunoaktiven Determinanten modifiziert werde, um enger an spezifische MHC-Moleküle vom Menschen oder anderen Spezies zu binden, oder durch Antigen-präsentierende Zellen wirksamer präsentiert zu werden. Ferner können die ausgewählten immunoaktivem Determinanten modifiziert werden, um dem Abbau in dem geimpften Wirt zu widerstehen.
Auf gleiche Weise sind die Formulierung und Präsentation des immunogenen Mittels an das Immunsystem des Wirts nicht auf Lösungen von Proteinen oder deren Analoge in Adjuvans beschränkt. Zum Beispiel kann die immunogene Determinante, die von den geeigneten extrazellulären Proteinen abgeleite ist, von M. tuberculosis, verschiedenen Spezies von Mycobacterien, verschiedenen Spezies von Bakterien, Phage, Mykoplasma oder Virus, der nicht pathogen ist, exprimiert, und unter Verwendung von Rekombinationstechnik modifiziert werden. In solchen Fällen kann der ganze lebende Organismus formuliert und verwendet werden, um die gesuchte Reaktion zu formulieren. Umgekehrt können umfangreiche Impfprogramme in feindseligen Umgebungen sehr stabile Formulierungen, ohne komplizierende Adjuvanzien oder Zusatzstoffe, erfordern. Ferner könnte die Vakzinformulierung darauf gerichtet sein, die Stabilität oder Immunoreaktivität der aktiven Komponente zu erleichtern, wenn sie rauen Bedingungen, wie etwa Gefriertrocknung oder oraler Verabreichung oder Verkapselung unterworfen wird. Dementsprechend umschließt die vorliegende Erfindung äußerst verschiedene Formulierungen der immunogenen Determinanten, welche die betreffenden Vakzine, abhängig von der vorgesehenen Verwendung des Produkts, umfassen.
Der Fachmann wird zu schätzen wissen, dass die Vakzindosierungen für jedes Pathogen und Wirt unter Verwendung von Routineversuchen bestimmt werden sollen. Gegenwärtig wird davon ausgegangen, dass die niedrigste praktische Dosierung in der Größenordnung von 0,1 μg sein wird, obgleich Dosierungen von 2,0 μg, 20,0 μg, 100 μg und sogar 1 mg für das entsprechendes System optimal sein können. Die passende Dosierung kann unter Verwendung jeder herkömmlichen Immunisierungstechnik und -reihenfolge verabreicht werden, die dem Fachmann bekannt ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Impfstoff zur Verwendung bei der Förderung einer wirksamen Immunreaktion in einem Säugerwirt, umfassend ein Peptid, welches aus einem oder mehr immunodominanten Epitopen besteht, welche aus der Gruppe, die aus den folgenden Aminosäuregruppen besteht, ausgewählt sind:
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei der Stoff weiterhin das 30 kDa M. tuberculosis-Protein enthält.
Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin enthaltend IL-12 oder eine Mischung aus IL-12 und MF 59.
Stoff gemäß einem der vorangehenden Ansprüche zur Verwendung in einem Verfahren zur Immunisierung eines Säugerwirts gegen ein infektiöses Pathogen der Gattung Mycobacterium, wobei das Verfahren den Schritt des Einführens des Impfstoffs in den Säugerwirt zur Erzeugung einer wirksamen Immunreaktion auf eine nachfolgende Infektion durch das infektiöse Pathogen umfasst.
Immunodiagnostisches Mittel zur Verwendung bei der Förderung einer nachweisbaren Immunreaktion in einem Säugerwirt zur Identifikation eines infektiösen Pathogens der Gattung Mycobacterius, wobei das Mittel ein Peptid enthält, welches aus einem oder mehr immunodominanten Epitopen besteht, welche aus der Gruppe, die aus den folgenden Aminosäuregruppen besteht, ausgewählt sind:
Mittel gemäß Anspruch 5 zur Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Immunreaktion gegen ein Pathogen der Gattung Mycobacterium in einem Säugerwirt, wobei das Verfahren den Schritt der Verabreichung des Mittels an den Säuger und Bestimmung der resultierenden Immunreaktion umfasst.