JP2001512435A

JP2001512435A - 豊富な細胞外産物ならびにそれらの産生および使用方法

Info

Publication number: JP2001512435A
Application number: JP53459398A
Authority: JP
Inventors: エイ．ホーウィッツ，マーカス; ハース，グンター; リー，バイ−ユ
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2001-08-21
Also published as: EP1005365A1; EP1005365A4; DE69838948D1; AU6029898A; CA2278116A1; WO1998031388A1; ATE382368T1; EP1005365B1; DE69838948T2

Abstract

(57)【要約】病原体の主として豊富な細胞外産物の１またはそれ以上の組合せに基づくワクチン、およびその使用および産生の方法が提示される。標的病原体の最も優勢なまたは主として豊富な細胞外産物が、その絶対的な分子の免疫原性に拘わらずに選択され、そしてワクチンとして使用されて、哺乳動物宿主において、標的病原体による後の感染に対する防御免疫応答を刺激する。主として豊富な細胞外産物は、それぞれのＮ末端アミノ酸、アミノ酸配列またはＤＮＡ配列によって特徴付けられ得、そして区別され得る。ワクチンは、細胞外産物、そのサブユニット、またはコード核酸の異なる組合せを含み得るので、広い範囲の有効な免疫治療組成物が、本発明によって提供される。他の感染因子に加えて、このように産生されたワクチンは細胞内病原体、および特に、Mycobacterium tuberculosisに対する有効な免疫応答を刺激するために使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】豊富な細胞外産物ならびにそれらの産生および使用方法関連出願への言及本出願は、1996年５月23日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/652,8 42号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/652,842号は、1995年12月６日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/568,357号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/568,357号は、1995年10月31日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/551,149号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/551,149号は、 1995年５月23日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/447,398号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/447,398号は、1994年８月12日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/289,667号の一部継続出願であり、米国特許出願第 08/289,667号は、1993年11月23日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/1 56,358号の一部継続出願であり、すべての出願が本明細書中に参考として援用される。本出願はまた、1995年10月20日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/5 45,926号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/545,926号は、1995年５月23 日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/447,398号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/447,398号は、1994年８月12日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/289,667号の一部継続出願であり、米国特許出願第08/289,667号は、1993年11月23日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/156,358号の一部継続出願であり、すべての出願が本明細書中に参考として援用される。発明の分野本発明は、一般的に、細菌、原生動物、ウイルス、および真菌のような病原性生物に対する免疫治療剤およびワクチンに関する。より詳細には、最大または最も特異的な分子的免疫原性を示す病原性サブユニットまたは産物に基づく先行技術のワクチンおよび免疫治療剤とは異なり、本発明は、哺乳動物宿主における効果的な免疫応答を刺激するために、Mycobacterium tuberculosisのような選択された病原体によって放出される、最も優勢なまたは主として豊富な免疫原性決定基を用いる。したがって、本発明によって生じる獲得免疫および免疫治療活性は、投与された化合物の相対的または絶対的な免疫原性とは特に関係なく、病原体が感染する過程で、感染した宿主細胞上に最も頻繁に提示される抗原マーカーに対して向けられる。発明の背景寄生微生物は、動物に感染し、それにより、宿主の疾患およびしばしばその死をもたらす能力を有することが、長い間認識されている。病原性因子は、歴史を通じて、死亡の主な原因であり、そして測り知れない苫しみを与え続けている。この百年間で、多くの感染病の予防および処置において、劇的な進歩が認められたが、複雑な宿主−寄生体相互作用のため、治療的方策の普遍的な有効性がなお限定されている。多くの病原性ベクターが示す精巧な侵襲機構を阻止することの難しさは、結核のような種々の疾患の復活、ならびに細菌およびウイルスの多数の薬物耐性株の出現により証明される。疫学的な関心の主な対象であるこれらの病原性因子のうち、細胞内細菌は、治療的方策または予防的方策にもかかわらず、特に難治性であることが証明されてきた。Mycobacterium属およびLegionella属を含む、細胞内細菌は、その生活環の全部または一部を、細胞外よりもむしろ、感染した宿主生物の細胞内で完了する。世界中で、細胞内細菌は、毎年の何百万人もの死亡、および数え切れない苦痛の原因となる。Mycobacterium tuberculosisによって生じる結核は、世界的に、感染性疾患による死亡の主要な原因であり、毎年、一千万の新たな症例が生じ、そして290万人が死亡する。さらに、細胞内細菌は、何百万ものハンセン病の症例の原因となる。細胞内因子によって伝達される、他の消耗性の疾患には、皮膚および内臓のリーシュマニア症、アメリカトリパノソーマ症（シャーガス病）、リステリア症、トキソプラスマ症、ヒストプラスマ症、トラコーマ、オウム病、Ｑ熱、および、在郷軍人病を含むレジオネラ症が含まれる。今でも、これらの生物に曝露された感受性の個体における消耗性の感染を防ぐためにできることは比較的少ない。集団を結核から効果的に防御できないこと、および結核による、固有のヒトの病的状態および死のため、これは、人類が直面している最も重要な疾患の一つである。より詳細には、M．tuberculosisによって主に起こるヒトの肺結核は、発展途上国における主要な死亡原因である。マクロファージおよび単球の中で生存できるため、M．tuberculosisは、慢性的な細胞内感染を引き起こし得る。外来因子の検出、続く免疫系の活性化を主に担う細胞の中にそれ自体が隠れることにより、M．tuberculosisは、宿主生物の正常な防御の回避を比較的上首尾にしている。これらの同一の病原特性が、結核菌感染に対する効果的な免疫治療剤またはワクチンの開発をこれまで妨げてきた。同時に、結核菌は、実験室の条件下での培養および観察が比較的容易である。従って、M．tuberculosisは、本発明の原理および利点を実証するのに、特によく適している。当業者は、M．tuberculosisに関する以下の例示的な議論が、決して、M．tube rculosisの処置に本発明の範囲を限定することは意図しないことを理解する。同様に、本明細書における教示は、決して、結核菌感染の処置に限定されない。反対に、本発明を用いて、細胞外産物を発現する任意の病原性因子の免疫原性決定因子に対する、安全で効果的なワクチンおよび免疫治療剤を有利に提供し、それによって、これらの生物の感染伝播を阻害し得る。現在、世界人口の約半分がM．tuberculosisに感染し、毎年何百万症例の肺結核をもたらしていると考えられている。この疾患は、ラテンアメリカ、アフリカ、およびアジアの発展途上国において特に深刻な健康問題である一方、第一世界においてもまた、より流行してきている。米国においては、特定の集団、特に、都市の貧しい免疫無防備状態の個人、および高い疾患罹患率の地域からの移民は危険性が増加している。主としてAIDSの流行により、現在、先進国において結核の発生率が、しばしば、多剤耐性M．tuberculosisの形熊で増加している。最近、米国の50州のうち36州で、１種以上の薬物に対して抵抗性の結核が報告された。ニューヨーク市では、1991年に試験されたすべての症例のうちの３分の１が、１種類以上の主要な薬物に抵抗性であった。非抵抗性の結核は、長期間の治療方針で抗生物質を用いて治癒され得るが、薬物抵抗性株に関する見通しは厳しい。２種類以上の主要な抗生物質に抵抗性の株に感染した患者は、ほぼ50％の致死率を有する。したがって、このような種々のM．tuberculosisに対する安全かつ効果的なワクチンが非常に必要とされる。 M．tuberculosisの初期感染は、ほぼ常に、エアロゾル化した粒子の吸入によって起こる。なぜなら、この病原体は、湿った痰または乾いた痰の中で、数週間または数カ月間生存可能なままであり得るからである。感染の原発部位は肺であるが、この生物はまた、骨、脾臓、髄膜、および皮膚の感染も引き起こし得る。特定の株の毒性、および宿主の抵抗性に依存して、組織に対する感染および対応する損傷は小さい場合もあり、もしくは大きい場合もある。ヒトの場合には、初期感染は、細菌の毒性株に曝露された個体の大多数では制御される。最初のチャレンジ後の獲得免疫の発達により、細菌の増殖が減少し、それによって、病変は回復し、そして被験体は、主に無症候のままであるが、あるいは感染性のままである。 M．tuberculosisが、感染した被験体によって制御されない場合、肺組織の広範な退化がしばしば生じる。結核菌が、肺胞または肺マクロファージ内で繁殖するので、感受性個体においては、通常、肺中で病変が形成される。この生物は繁殖するにつれて、リンパ系を介して遠位のリンパ節に広がり得、血流を介して、肺の頂、骨髄、腎臓、および脳を囲む髄膜に広がり得る。主に、細胞媒介の過敏性反応の結果として、感染の重篤度に比例して、特徴的な肉芽腫性の病変または結節が生じる。これらの病変は、単球、リンパ球、および線維芽細胞に隣接した類上皮細胞からなる。ほとんどの症例において、病変または結節は最終的に壊死性になり、そして乾酪化をうける。 M．tuberculosisは、重要な病原体であるが、Mycobacterium属の別の種もまた、ヒトを含む動物の疾患の原因となり、そして明らかに本発明の範囲内に含まれる。例えば、M．bovisは、M．tuberculosisに密接に関連し、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、およびネコのような家畜における結核菌感染の原因である。さらに、M．bovisは、腸管を介して、代表的には、生のミルクの摂取から、ヒトに感染し得る。局所的な腸感染は、最終的に気道に拡がり、続いてまもなく古典的な結核の症状を引き起こす。Mycobacterium属の別の重要な病原性ベクターは、古来からの疾患であるハンセン病の何百万の症例の原因となるM．lepraeである。動物およびヒトにおいて疾患の原因となるこの属の別の種には、M．kansasii、M．av ium intracellulare、M．fortuitum、M．marinum、M．chelonei、M．africanum 、M．ulcerans、M．microti、およびM．scrofulaceumが含まれる。病原性のマイコバクテリウムの種は、しばしば、それらのそれぞれのDNAおよび対応するタンパク質配列において高度の相同性を示し、そしてM．tuberculosisおよびM．bovi sのようないくつかの種は、高度に関連している。明らかに実際的かつ倫理的な理由のため、このような苦痛をもたらすものに関する実験的組成物の効力を決定するためのヒトにおける最初の研究は、実行不可能である。したがって、任意の薬物またはワクチンの最初の開発において、安全性および費用の理由から、適切な動物モデルを用いることが、標準的な手順である。免疫優性エピトープが、しばしば異なる宿主種において活性であるという理解から、実験動物モデルの実行の成功が予測される。このように、一つの種（例えば、齧歯類またはモルモット）における免疫原性決定因子は、一般的に、ヒトのような異なる種においても免疫反応性である。適切な動物モデルが十分に開発された後にのみ、ヒトにおけるワクチンの安全性および効力をさらに実証するために、ヒトにおける臨床試験が行われる。 M．tuberculosisによる肺胞または肺の感染に関しては、モルモットモデルが、多くの点で、この疾患のヒトの病理と密接に類似している。したがって、ヒトおよび他の哺乳動物に対するこの疾患のモルモットモデルを外挿するのが適切であることが、当業者によく理解される。ヒトのように、モルモットは、低用量のエアゾール化したヒト病原体M．tuberculosisの結核菌感染に感受性である。初期感染が通常制御されるヒトとは異なり、モルモットは、エアゾール化した病原体に曝される際、散在性の疾患を一貫して発症し、その後の解析を容易にする。さらに、モルモットとヒトとは両方、稠密な単核細胞の硬化、または皮膚の試験部位の硬直した領域の発症によって特徴づけられる、皮膚性遅延型過敏性反応を示す。最後に、ヒトおよびモルモットの特徴的な結核性病変は、ラングハンス型巨細胞の存在を含む、類似の形態を示す。モルモットは、この疾患の初期感染および進行に対してヒトよりも感受性であるので、この動物モデルを用いる実験において付与される任意の防御は、ヒトまたは他のより感受性の少ない哺乳動物において、同じ防御免疫が生じ得るという強い示唆を提供する。従って、制限する目的ではなく、説明する目的のためにのみ、本発明を、哺乳動物宿主としてのモルモットの例示的な文脈において、最初に実証する。本発明が、ヒト、および家畜化された動物を含む、他の哺乳動物宿主を用いて実施され得ることは、当業者に理解される。病原性ベクター、および特に、細胞内生物に感染した動物またはヒトは、宿主免疫系に困難な挑戦を与える。多くの感染性因子は、体液性応答および対応する防御抗体の産生によって、効果的に制御され得るが、これらのメカニズムは、身体の細胞外体液中に位置するこれらの病原体に対してのみ主に有効である。詳細には、オプソニン作用を有する（opsonizing）抗体は、細胞外の外来因子に結合し、それにより、それらを食作用およびその後の細胞内殺傷に対して感受性にする。さらに、これは、他の病原体には当てはまらない。例えば、以前の研究では、液性免疫応答が、M．tuberculosisのような細胞内細菌による感染に対して重要な防御的役割を果たさないようであることを示していた。しかし、本発明は、標的病原体に対する有益な液性応答を生じさせ得、そしてそのこと自体、その有効性は、刺激された免疫応答の任意の特定の構成成分に限定されない。より詳細には、抗体に媒介される防御は、外見上、細胞内病原体の初期感染を阻止せず、そして一旦、細菌が宿主細胞の中に隔離されると効力がなくなる。水溶性タンパク質として、抗体は、細胞外の体液および血液に浸透し得るが、細胞の脂質膜を通って移動することは困難である。さらに、細菌の表面構造に対してオプソニン作用を有する抗体の産生は、実際、細胞内病原体が宿主細胞に侵入するのを補助し得る。したがって、Mycobacteriumのような細胞内因子に対する効果的な予防測定法は、無防備な食細胞を活性化するか、または、細胞傷害的にそれらを排除する、抗原特異的リンパ球の迅速な増殖をもたらす、攻撃的な細胞媒介免疫応答成分を取り込むべきである。しかし、以下に詳細に議論するように、細胞媒介免疫応答を誘導することは、防御免疫を誘導することと等しくはない。細胞媒介免疫は、防御免疫の前提となる先行条件であり得るが、本発明の教示にしたがうワクチンの産生は、動物に基づいたチャレンジ実験が必要である。この細胞媒介免疫応答は、一般的に２つの工程を含む。細胞が感染したというシグナルを送る第一の工程は、細胞の表面に病原体の断片を送達する特別な分子（主要組織適合性分子、すなわちMHC分子）によって達成される。これらのMHC分子は、感染細胞の中で分解された細菌タンパク質の小フラグメントに結合し、そしてそれらを細胞表面に提示する。Ｔ細胞に対するこれらの提示は、宿主の免疫系を刺激して、感染宿主細胞を除去するか、または、宿主細胞の中に存在している全ての細菌を根絶するように宿主細胞を誘導する。ほとんどの感染性細菌とは異なり、M．tuberculosisを含むMycobacteriumは、膜によって細胞の残りの部分から実質的に密封されている液胞の中で増殖する傾向がある。食細胞はこれらの防御的な液胞を自然に形成し、このことは、このクラスの病原体による感染に対して食細胞を特に感受性にする。このような液胞において、細菌は、分解から効果的に防御され、免疫系が、感染した細胞の表面に完全な細菌成分を提示するのを困難にする。しかし、感染細胞のMHC分子は、液胞に移動し、そして遊離の（解離した）細菌産物を収集するか、または、細胞表面における産物の正常な提示のために、外来の細胞外細菌産物が輸送された、宿主細胞の他の部位に移動する。以前に示されたように、外来細菌産物の提示は、宿主の免疫系による適正な応答を誘発する。免疫系に対して提出された問題の細胞内病原体はまた、ワクチン開発に対する特別な挑戦を構成する。これまで、ほとんどの研究者には、Mycobacterium感染、および特に、M．tuberculosisに対する効果的なワクチンの産生を見出さなかった。現在、細胞内病原体に対して広範に利用可能なワクチンは、M．bovisの無毒性株である、生菌弱毒化ワクチンのBCGのみであり、これは、結核菌に対する予防測定法として用いられる。さらに、1988年には、インドの世界保健機構の広範な研究によって、最良のBCGワクチンの効力は測定できないほど僅かであると決定された。この問題となり得る効果にも関わらず、世界中の結核の高発生地域で、BCGワクチンが広範に用いられてきた。問題をなおさらに複雑にしているのは、BCGでワクチン接種された個体が、しばしば、結核のスクリーニングおよびコントロールに関する最も一般的な皮膚試験の有効性を打ち消す、ツベルクリンに対する感受性を発生することである。 BCGのような生菌弱毒化ワクチンを用いることに関する別の深刻な問題は、免疫無防備状態の患者が、生命を脅かす疾患を起こす可能性があることである。迅速に増殖する誘導された感染と闘う能力が低下しているので、これらのワクチンは、細胞媒介免疫が低下している人に特別の危険を与える。このような個体には、栄養不良および劣悪な生活状態によって弱っている個体、器官移植のレシピエント、ならびに、HIVに感染した人が含まれる。BCGワクチンの場合には、危険性の高い個体には、気腫、慢性気管支炎、塵肺、珪肺、および以前の結核のような肺疾患を患っている人も含まれる。したがって、弱毒化ワクチンの使用は、まさに、それらが最も高い潜在的有益性を有する集団に限られている。生菌弱毒化ワクチンの使用はまた、他の望ましくない副作用をもたらし得る。生ワクチンはレシピエント中で繁殖するので、非感染性ワクチンよりも広範な抗体および方向性のより少ない細胞媒介免疫応答を誘発する。このショットガンアプローチは、細胞性の防御に最も関与する分子構造に向けられた免疫応答を妨害する傾向を有する。さらに、インタクトな膜を有する生ワクチンの使用は、効果的な食作用のため外来の物体（body）を調製するオプソニン作用を有する抗体を誘導し得る。したがって、宿主が標的生物の毒性株に曝される際、このような抗体の存在により、弱毒化されていない病原体が生存し、そして増殖し得る宿主細胞へのこれらの病原体の取り込みが実際に促進され得る。さらに、弱毒化ワクチンは、何千もの異なる分子種を含み、その結果、おそらく患者において毒性であるか、または、有害な免疫応答を誘発し得る分子種を含む。生ワクチンが有する他の問題には、毒性の復活、接触による自然の伝染、混入しているウイルス、およびウイルス干渉、ならびに標準化に伴う困難が含まれる。同様に、殺傷された生物、または強度に抗原性の膜結合構造に対する従来の第２世代サブユニットワクチン（second generation subunit vaccine）のような非感染性ワクチンは、細胞内細菌の阻害に関して限定される。弱毒化ワクチンと同様、死菌は、最も効果的な防御的決定因子を阻害し得る無差別の応答を誘発する。さらに、死菌ワクチンは、なお、免疫系に対して、多数の潜在的に抗原性の構造を提示し、それによって、免疫系による毒性反応、またはオプソニン化の可能性を増加させる。膜結合構造を取り込む伝統的なサブユニットワクチンはまた、合成されたものも、精製されたものもいずれも、細胞内病原体が繁殖する食細胞中への細胞内病原体の侵入を促進する強いオプソニン効果を誘導し得る。細菌の含有率を増加させることによって、細胞内表面抗原に対する死菌ワクチンは、病原性因子の相対的な毒性を増加させ得る。したがって、強い抗原性の細菌表面成分に対する従来の弱毒化または死菌ワクチンは、細胞内病原体の場合に禁忌を示し得る。伝統的なワクチンの使用に関連した問題を回避するために、特定の細胞内病原体に対する防御免疫を刺激するために、細胞外タンパク質、またはそれらの免疫原性アナログを用いて開発が行われてきた。例えば、本発明者らの1992年４月28 日発行の米国特許番号5,108,745は、Legionella pneumophila、およびM．tuberc ulosis、およびその他の細胞内病原体に対する防御免疫を生じるワクチンおよび方法を開示する。これらの先行技術によるワクチンは、インビトロでは、病原性細菌によってブロス培養液中に細胞外に放出され、そしてインビボでは、感染した宿主細胞の中に細菌によって細胞外に放出される、タンパク質性化合物に本来由来する細胞外産物に広く基づいている。その中で開示されているように、これらのワクチンは、哺乳動物宿主の中で、標的病原体に対して強い免疫応答を刺激する細胞外産物、またはそのアナログの同定に選択的に基づいている。より詳細には、目的の病原体に対して免疫された哺乳動物において、強いリンパ球増殖応答、または皮膚性遅延型過敏性反応のいずれかを誘発する能力を決定することによって、これらの先行技術による候補となる細胞外タンパク質をスクリーニングした。この開示された方法、および関連するワクチンは、伝統的なワクチンの使用に固有の不利益の多くを回避するが、交差反応による矛盾する免疫応答結果および宿主の変化によって、効果的な免疫化剤を選択するのを複雑にし得る。したがって、分子的免疫原性は、効果的なワクチンの１つの指標であるが、他の要素が、それをインビボでの効果的な免疫応答の誘導における使用を複雑にし得る。より重要なのは、驚くべきことに、特にM．tuberculosisに関して、効果的な防御免疫を誘導するワクチンを同定するための従来の先行技術の方法は、厄介でありかつ潜在的に効果的でないことが発見されたことである。例えば、最も免疫原性のあるこれらの細胞外成分を同定することを目的とした、大量のM．tubercu losisの細胞外タンパク質のSDS-PAGE解析および続く従来のウエスタンブロット技術は、矛盾した結果を生じた。反復試験は、どの細胞外産物が最も強い免疫原性応答を生じ、そして先行技術の見解に一致し、それにより、最も効果的なワクチンとして機能するのかを同定できなかった。M．tuberculosisの細胞外産物の多くは、当技術分野において周知であり、既に同定され、そしていくつかの場合配列決定されている。さらに、任意の外来タンパク質と同様に、これらの公知の化合物が、免疫応答を誘導することを示し得る。しかし、当該分野において、これらの公知の化合物のいずれかが、伝統的に同定されたような防御免疫を誘導することを直接的に示すものは何もない。したがって、高度に特異的で、強い免疫原性の実施可能性に基づく伝統的なワクチンの考察および選択技術に頼らない、感染性の細菌性病原体に対する効果的な免疫応答の増加において、ワクチンまたは免疫治療剤、ならびにそれらを産生および使用するための方法を提供することが本発明の主な目的である。哺乳動物宿主において、M．tuberculosis、M．bovis、M．kansasii、M．avium -intracellulare、M．for tui tum、M．chelonei、M．marinum、M．scrofulaceu m、M．leprae、M．africanum、M．ulcerans、およびM．microtiを含む、細胞内病原体に対する獲得免疫性を付与するために、ワクチンまたは免疫治療剤を提供し、そしてそれらを使用するための方法を提供することが、本発明の別の目的である。死菌、または弱毒化ワクチンと比較して、弱い毒性を示す、容易に作製されたワクチンおよび免疫治療剤を提供することは、本発明のさらなる目的である。発明の要旨本発明は、ワクチンおよび/または免疫治療薬剤としての使用のための化合物、およびその産生方法および哺乳動物宿主において病原体による感染に対して防御的または治療的免疫応答を発生させるための使用の方法を提供することによって、上記および他の目的を達成する。広い局面において、本発明は、細胞外化合物を産生する感染ベクターに対する防御的または治療的免疫応答を誘導するための手段を提供する。本発明の化合物は病原性細菌に対して特に有効であるが、これらは、主として豊富な細胞外産物を産生する任意の病原体に対する防御的または治療的免疫応答を発生させるために使用され得る。本発明の目的のために、用語「主として豊富な(majorly abundant)」は、目的の病原体により最高量で放出される細胞外産物を同定する相対的な用語として理解されるべきである。例えば、種々の培養条件下で約0.5の光学密度まで増殖したM ．tuberculosisに関して、当業者は、10μg/Lまたはそれ以上のオーダーで、主として豊富な細胞外産物を取得すると予期するはずである。したがって、通常または熱ショック条件下で増殖したM．tuberculosisについて、細胞外産物の典型的には合計４mg/Lの合計産出量(output)のうち、１００前後の公知の細胞外産物の約１５〜２０(単独または組合せで)が、合計量の約９０％を構成する。これらは、本発明の範囲内であると企図される主として豊富な細胞外産物であり、そしてSDS/PAGEゲルにおいて見られる広いバンドとして容易に同定可能である。さらに、目的の細胞外産物は、アミノ酸配列決定によって、さらに特徴付けられ得そして識別され得る。残りの細胞外産物は少ない(minor)。当業者はまた、特定の主要な細胞外産物の相対的な量的豊富は、培養条件に依存して変化し得ることを理解する。しかし、ほとんどの場合、個々の主として豊富な細胞外産物の同定は、変わらない。したがって、本発明は、ウイルス、細菌、真菌、または原生動物の病原体による感染に対して、哺乳動物宿主を防御するために使用され得る。いくつかの場合、例えば、ウイルス感染では、主として豊富な細胞外産物は、感染された宿主細胞によって産生され得ることに留意すべきである。主として豊富な細胞外産物を放出するすべての微生物に対して活性であるが、本発明のワクチンおよび方法は、細胞内病原体(Mycobacterium属の多様な種および血清群を含む)に対する防御的免疫を発生させるに特に有効である。本発明のワクチンはまた、存在する疾患状熊の処置のための免疫治療薬剤として有効である。驚くべきことに、細菌病原体またはその免疫原性アナログにより細胞外に放出される最も豊富なもしくは主として豊富な産物での免疫は、投与された化合物の絶対的な免疫原性に拘わらず、有効な免疫応答を誘発し得ることが本発明者によって判明した。生物からのその放出およびしたがって抗原のプロセシングおよび提示に関与する宿主分子に対するその利用可能性のため、そして感染の間の組織におけるその天然に高い濃度のために、病原因子の主として豊富な細胞外産物は、プロセシングされ、そして他の細菌成分より頻繁に宿主の免疫系に提示される。細胞内病原体の場合、主として豊富な細胞外産物は、感染した宿主細胞の表面に提示された主要な免疫原性決定基であり、したがって周囲環境においてより大きな存在を示す。したがって、病原性生物の主として豊富な細胞外産物に対して獲得された免疫は、宿主の防御系が宿主細胞内部に隠れた病原体を速やかに検出し、そしてそれらを有効に阻害するのを可能にする。より詳細には、病原性細菌によって放出される主要なまたは主として豊富な産物は、その個々の免疫原性活性または特異性に拘わらず、食細胞および他の宿主免疫系機構によって、より優勢でないか膜に結合した病原体成分より大きな速度でプロセシングされるように見える。この免疫プロセシング(immunoprocessing) の不等は、病原性因子が正常な免疫活動から隠れた細胞内細菌である場合、特に有意義である。感染宿主の免疫系へのその豊富で連続的な提示により、細菌の最も優勢な細胞外産物またはその免疫原性アナログは、個々の分子の免疫原性特徴に全く拘わらず、活発な免疫応答を誘発する。主として豊富な細胞外産物は、標的病原体により周囲環境に放出されるタンパク質および他の分子実体(entity)の主要な構成要素である。現在の研究は、ある場合には、単一の主として豊富な細胞外産物が、微生物によって放出される産物の４０重量％までを含み得ることを示す。より頻繁には、個々の主として豊富な細胞外産物は、感染性病原体により放出される総産物の約０.５％〜約２５％の間を占める。さらに上位５または６つの主として豊富な細胞外産物は、微生物により放出される総質量の６０％〜７０％を含むことが判明し得る。もちろん、当業者は、放出される産物の絶対的または相対的量が変化し得るので、細胞外産物の相対的レベルが経時的に変動することを理解する。例えば、pH、酸化剤、容量オスモル濃度、熱およびその生物に対する他のストレス条件、生活環のステージ、再現状況、および周囲環境の組成は、放出される産物の組成および量を変化させ得る。さらに、細胞外産物の絶対的および相対的レベルは、種ごとに、そして１つの種の株間でさえ大きく異なり得る。細胞内病原体の場合、細胞外産物は、生細菌を含むマクロファージを検出し得、そして生細菌を含むマクロファージに対して抗菌効果を発揮し得る特異的な免疫リンパ球の集団に拡張されるようである。さらに、感染細胞の表面でのその反復提示により、主として豊富なまたは主要な細胞外産物は、有効な抗原性マーカーとして機能する。したがって、本発明の教示に従って、病原性細菌の主として豊富な細胞外産物またはその免疫原的に等価な決定基に関する、ワクチン接種および防御免疫の誘導は、後に標的病原体が感染する場合に、宿主免疫系が、強力な細胞媒介成分による迅速で効率的な免疫応答を備えるように促す。個々のスクリーニングされた病原体成分の高度に特異的な抗原性に基づく、ワクチンの産生および免疫応答の刺激に主に焦点を当ててきた従来の免疫研究活動 (activities)とは正反対に、本発明は、より優勢でない細胞外産物より低い免疫原的特異性を実際に示し得る化合物を用いて防御免疫を樹立または誘導するために、相対的に豊富な細菌性細胞外産物または(その免疫原的特異性よりむしろ)その免疫原性アナログを有利に利用する。この開示の目的のために、免疫原性アナログは、標的病原体により発現される少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物またはその任意のフラグメントと十分に類似し、標的病原体による後の感染の際に、ワクチン接種した哺乳動物宿主において防御免疫応答を刺激する能力を有する任意の分子または化合物である。要するに、本発明のワクチンは、特定の病原体により細胞外に放出される主として豊富な産物（または実質的に等価な免疫応答を刺激し得る分子アナログ）を選択し、そしてそれらを比較的純粋な形態で単離するか、またはその後、その産生を担うＤＮＡもしくはＲＮＡを配列決定して、その合成的産生もしくは内因性産生を可能にすることによって、同定されるかまたは産生される。次いで、標的病原体に対する所望の予防的免疫応答が、当該分野において周知の技術を用いて１またはそれ以上の単離された免疫反応性産物またはコード遺伝物質を処方し、そして標的病原体による感染の前に哺乳動物宿主を免疫することによって惹起され得る。本発明が、少なくとも１つ、２つまたは恐らくはいくつかの十分に規定された免疫原性決定基からなることが予期される。その結果、本発明は、比較的容易で迅速に開発され、試験され、そして投与され得る、一定の標準化されたワクチンを産生する。さらに、主として豊富な分泌性もしくは細胞外性の産物に対応する２，３の十分に規定された分子の使用は、従来のワクチンに関連する有害な副作用の危険を大いに減少させ、有効な免疫原性マーカーの閉塞の可能性を排除する。同様に、本発明は、弱毒化ワクチンでも死ワクチンでもないので、生産、精製、の間または投与の際の感染の危険は、効果的に排除される。このように、本発明のワクチンは、免疫無防備状態の個体（無症候性の結核患者およびHIVに感染した患者を含む）に安全に投与され得る。さらに、体液性免疫応答は、標的病原体によって放出される産物に排他的に指向するので、有害なオプソニン性免疫成分を産生する機会がほとんどない。したがって、本発明は、刺激された体液性応答が、抗体感受性領域からの標的病原体の排除を補助すること可能にする。本発明の別の有益な局面は、ワクチンが回収または産生され得、続いて精製および配列決定され得る容易さである。例えば、優勢に豊富な細胞外産物は、標的病原体(M tuberculosisまたはM．bovisを含む)の培養物から努力することなく得られ得る。所望の化合物は増殖の間に培地中に放出されるので、これらは、従来の技術を使用して、標的病原体の細菌内成分および膜結合成分から容易に分離され得る。より詳細には、本発明のワクチンの所望の免疫反応性構成要素は、遺伝子操作された生物から産生および精製され得る。この遺伝子操作された生物に、 M．tuberculosis、M．bovis、M leprae、または目的の他の任意の病原体の特定の細胞外産物を発現する遺伝子がクローニングされている。当該分野において公知のように、このような操作された生物は、より高いレベルの選択された細胞外産物または改変された免疫原性アナログを産生するように、改変され得る。あるいは、免疫防御的産物、その部分またはそのアナログは、当該分野において周知の技術を使用して、化学的に合成され得るか、またはそれをコードする裸の遺伝子を注入された宿主細胞において直接発現させ得る。どのような産生源が使用されようとも、優勢もしくは主として豊富な細胞外産物の免疫原性成分は、通常の生化学的手順(例えば、分画化、クロマトグラフィーまたは他の精製方法論)および従来の処方技術を使用して、分離され得、続いて送達可能なワクチンに処方され得るか、または直接導入された、それをコードする遺伝子構築物を含む宿主細胞において直接発現させ得る。例えば、本発明の例示的な実施態様において、標的病原体は、M．tuberculosi sであり、そしてM tuberculosisによりブロス培養物に細胞外に放出された主として豊富な産物は、他の細菌成分から分離され、そして哺乳動物宿主において免疫応答を誘発するために使用される。次いで、個々のタンパク質またはタンパク質群が、防御免疫を誘導するタンパク質を同定するために、動物ベースのチャレンジ(challenge)実験において利用されて、それらを本発明の教示に従うワクチンとしての使用に適切にする。より詳細には、細菌の増殖および回収後、その物理的豊富さのために、主要な細胞外産物が、遠心分離および濾過により細菌内成分および他の成分から分離される。所望であれば、次いで得られるバルクの濾液を、硫安沈殿を使用する分画化、続いて透析に供して、細胞外産物の混合物(通常、EPと称される)を得る。次いで、透析した画分中の可溶化細胞外産物は、当該分野で公知で下記により十分に記載するように、適切なクロマトグラフィー技術を使用して、実質的に均質まで精製される。これらの例示的な手順の結果、M．tuberculosisの、110キロダルトン(KD)〜12 KDの範囲の分子量を有する１４個の別個のタンパク質性の主要細胞外産物が産生される。精製後、個々の主として豊富な細胞外産物はそれぞれ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した場合、それぞれの分子量に対応する１つのバンドを示し、それにより、主として豊富な細胞外産物に対応する個々の産物または産物群が、本発明の教示に従うワクチンとしての使用のために同定および調製されることが可能になる。精製された主として豊富な細胞外産物は、当該分野において通常の技術を使用してそれぞれのアミノ酸配列の全てもしくは一部分を決定することによって、さらに特徴付けられ得、そして識別され得る。配列決定はまた、主として豊富な細胞外産物間の可能な構造的関係に関する情報を提供し得る。続いて、哺乳動物宿主系における免疫および獲得免疫の刺激は、これらの精製された細胞外産物の、経時的な一連の皮下または皮内注射を利用する本発明の教示により達成され得る。例えば、フロイント不完全アジュバント中の精製された主として豊富な細菌性細胞外産物の注射、続いて、約３週間後の同じアジュバントでの第二の注射が、後のビルレント病原体でのチャレンジの際に、防御応答を惹起するために使用され得る。本発明の範囲内および教示内の他の例示的な免疫プロトコルは、所定の期間にわたる、Syntex Adjuvant Formulation(SAF)中の精製された細胞外産物もしくはそのアナログの一連の３または４の注射を含み得る。一連の注射が一般により有効であると判明するが、選択された主として豊富な細胞外産物またはその免疫原性サブユニットもしくはそのアナログの単回投与は所望の免疫応答を付与し得、そして同様に本発明の範囲にあることが意図される。このような例示的なプロトコルは、当該分野において受け入れられた実験室モデル(例えば、モルモット)を使用して立証され得る。例えば、詳細に議論されるように、５つの主として豊富な細胞外産物(前述のようにM．tuberculosisから精製)と組合せでの数匹のモルモットの免疫は、コントロール動物の対応する偽免疫を伴って、SAFアジュバント中のその細菌産物３回の注射の免疫シリーズにより達成された。各タンパク質の例示的な投薬量は、100μｇ〜２μgの範囲であった。最後のワクチン接種後、すべての動物を、同時に感染性の潜在的に致死性用量のエアロゾル化M．tuberculosisに曝露し、そして長時間モニターした。コントロール動物は、M．tuberculosisの主として豊富な細胞外産物の組合せで免疫した動物と比較した場合、体重の有意な減少を示した。さらに、コントロール動物の半数が、観察期間の間に死亡したが、免疫動物は全く、結核のために死亡しなかった。本実験後に行った剖検により、非免疫コントロール動物は、防御された動物より有意に多いコロニー形成単位(CFU)ならびに肺および脾臓に対応する損傷を有した。精製された主として豊富な細胞外産物の１７のさらなる組合せが、試験された場合に免疫予防を提供し、このことにより、本発明の範囲および本発明の教示に従って処方され得る広範囲のワクチンが示された。しかし、本発明は、分泌性もしくは細胞外産物の組合せに限定されないことが強調されるべきである。例えば、いくつかの代わりの実験プロトコルは、本発明の教示に従って、単一の豊富な細胞外産物が哺乳動物の防御的免疫を誘導する能力を立証する。各実験において、モルモットを、本明細書に詳述されるクロマトグラフィープロトコルを使用してM．tuberculosis EPから精製した単一の主として豊富な細胞外産物で免疫した。１つの実施例において、30KDに対応する分子量を有する、精製された豊富な分泌性産物を含むアジュバント組成物を用いる複数の実験で、動物にワクチン接種した。本発明の別の実施例において、71KDに対応する分子量を有する、M．tuberculosisから単離された豊富な分泌性産物を含むアジュバント組成物を、異なるモルモットにワクチン接種した。それぞれの免疫後に、両方のセットの動物および適切なコントロールを、致死用量のエアロゾル化M．tuberculosisに曝露して、ワクチンの有効性を決定した。より詳細には、１つの実験において、６匹のモルモットに、SAF中の100μgの3 0KDタンパタ質を、６週間にわたって３回免疫した。コントロール動物に、対応する量の細胞外タンパク質(EP)のバルク調製物もしくは緩衝液を同時にワクチン接種した。最終のワクチン接種の３週間後、動物に、エアロゾル化した致死用量のM．tuberculosisを用いてチャレンジし、そして１４週間モニターした。30KD 免疫モルモット、およびバルクの細胞外調製物で免疫したモルモットは、それぞれ、６７％および５０％の生存率を有した(EPに対する、主として豊富な細胞外産物の予期し得ない優れた性能を示す)が、偽免疫動物は、わずかに１７％の生存率を示した。実験終了の際に、動物を屠殺し、生存可能な結核菌について検査した。もっともなことに、非免疫動物は、肺および脾臓において、顕著により高い濃度のM．tuberculosisを示した。 71KDタンパク質をワクチン接種した動物で同様な実験を行った。１つの実験において、６匹のモルモットに、100μgの精製71KDタンパク質を含むSAFアジュバント組成物を、３週間にわたって２回ワクチン接種した。他の動物を、ポジティブコントロールとしての使用のためには未精製の細胞外タンパク質もしくはEPのバルク調製物で、そしてネガティブコントロールとしての使用のためには緩衝液で同様に免疫した。致死用量のエアロゾル化結核菌への曝露後、モルモットの体重を６ヶ月間モニターした。再び、精製形態の豊富な細胞外産物で免疫した動物は、ビルレントなM．tuberculosisに関する防御免疫を発現した。その期間の終わりまでに、緩衝液を免疫した動物は、免疫した動物と比較した場合、体重の有意な損失を示した。さらに、ポジティブコントロールおよび71KD免疫動物は、それぞれ６３％および５０％の生存率を示したが、非免疫動物はすべて、観察期間の終わりまでに死亡した。ワクチンの処方は本発明にとって重要ではなく、投与を促進するために最適化され得ることに注意することが重要である。主として豊富な病原体の細胞外産物に由来する、精製された免疫原性決定基の溶液は、単独でもしくは組合せで、防御免疫応答を生じるように設計された任意の様式で投与され得る。精製タンパク質溶液は、単独で送達され得るか、または投与される前にアジュバントと処方され得る。あるいは、主として豊富な病原体の細胞外産物に由来する１またはそれ以上の免疫原性決定基の遺伝子をコードする遺伝物質は、真核生物プロモーターおよび /または分泌配列と連結され得、そして哺乳動物宿主に直接注射されて、免疫原性決定基の内因性発現および続く防御免疫を誘導し得る。本発明の他の目的、特徴、および利点は、最初に簡潔に記載される図面と共に、以下の本発明の好ましい例示的な実施態様の詳細な説明を考慮することにより、当業者に明らかである。図面の簡単な説明図１は、４つのクーマシーブルー染色ゲルの図(１ａ〜１dと呼ぶ)であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により同定されるように、M．tuberculosisの例示的な主として豊富な細胞外産物の精製を示す。図２は、M．tuberculosisの１４の例示的な主として豊富な細胞外産物(配列番号１〜１４)の５個のＮ末端アミノ酸、およびこれらの産物についての見かけの分子量を同定する表である。図３は、図２に示される５個のＮ末端アミノ酸によっては識別されなかった、 M．tuberculosisの３つの例示的な主として豊富な分泌性産物の拡張されたＮ末端アミノ酸配列(配列番号１５〜１７)の表である。図４は、エアロゾル化致死用量のM．tuberculosisへの曝露後における、M．tu berculosisの例示的な精製された主として豊富な30KD分泌性産物で免疫されたモルモットの、細胞外タンパク質の従来のバルク調製物で免疫されたポジティブコントロールおよび非免疫ネガティブコントロールとの生存率比較のグラフである。図５は、エアロゾル化致死用量のM．tuberculosisへの曝露後における、精製された主として豊富な71KD細胞外産物で免疫された動物の、M．tuberculosis由来の細胞外タンパク質の従来のバルク調製物で免疫されたポジティブコントロールおよび非免疫ネガティブコントロールとの平均モルモット体重の比較グラフである。図６は、エアロゾル化致死用量のM．tuberculosisへの曝露後における、M．tu berculosisの例示的な主として豊富な精製された71KD細胞外産物で免疫された図５のモルモットの、M．tuberculosis由来の細胞外タンパク質の従来のバルク調製物で免疫されたポジティブコントロールおよび非免疫ネガティブコントロールとの生存率の比較グラフである。図７は、第２の別の実験での、エアロゾル化致死用量のM．tuberculosisへの曝露後における、例示的な精製された主として豊富な71KD細胞外産物で免疫された動物と非免疫ネガティブコントロールとの平均モルモット体重の比較グラフである。図８ａおよびｂは、PPD+(M．tuberculosisによる感染を示す)およびPPD-ヒト被験体における、例示的な精製された主として豊富な71KD細胞外産物に対するリンパ球増殖応答の比較のグラフである。図８ａは、リンパ球のこの抗原とのインキュベーションの２日後に測定した値のグラフである。図８ｂは、インキュベーションの４日後に測定した値のグラフである。図９は、エアロゾル化致死用量のM．tuberculosisへの曝露後における、本発明の教示に従って産生された細胞外産物の組合せを含むワクチンで免疫された動物と、非免疫コントロールとの平均モルモット体重の比較グラフである。図１０は、エアロゾル化致死用量のM．tuberculosisへの曝露後における、本発明の教示に従って産生された細胞外産物の組合せを含む３つの異なる投薬量のワクチンで免疫された動物と、非免疫コントロールとの平均モルモット体重の比較グラフである。図１１は、エアロゾル化致死用量のM．tuberculosisへの曝露後における、本発明の教示に従って産生された細胞外産物の６つの異なる組合せを含むワクチンで免疫された動物と、非免疫コントロールとの平均モルモット体重の比較グラフである。図１２ａおよびｂは、M．tuberculosisの30KDタンパク質の免疫優性エピトープのマッピングを示すグラフである。図１２ａは、30KDタンパク質全配列をカバーする重複するペプチド(１５マー)に応答する、30KDタンパク質で免疫した２４匹のモルモットの割合を示す。図１２ｂは、１９匹の偽免疫モルモット群についての対応する１セットのデータを示す。ネイティブの30KDタンパク質、精製タンパク質誘導体(PPD)、およびコンカナバリンＡ(Con A)への各動物群の応答は、各グラフの右側に見られる。図１３は、M．tuberculosisの32A KDタンパク質の免疫優性エピトープのマッピングを示すグラフである。図１４は、組換え30KDタンパク質の発現に使用される構築物の模式図である。この模式図は、組換え30KDタンパク質の発現に使用されるpET22bベクターを示す。このベクターは、その自身のリーダー(30W-pET22b)またはプラスミドがコードするpel Bリーダー(30M-pET22b)に融合した成熟30KDタンパク質を発現する。使用される略語：Ori、ColE1タイプの複製起点；F1 ori、ファージF1の複製起点； Amp、アンピシリン耐性遺伝子；30W/M、全長(30W)または成熟(30M)の30KDタンパタ質；lacI、lacリプレッサー遺伝子；P_T7、ファージT7 RNAポリメラーゼ特異的プロモーター；NdeIおよびNcoI、ベクター/挿入連結部の制限酵素部位。図１５は、E．coli BL21(DE3)pLysSにおける全長および成熟30KDタンパク質の発現を確認する、電気泳動試験の結果およびウエスタンブロット分析を示す。図１６は、30KDタンパク質を発現するために使用した別の構築物系の模式図である。図１７は、M．smegmatisにおける、M．tuberculosisの30KDタンパク質の発現を確認する電気泳動試験の結果を示す。図１８は、M．smegmatisにおける、M．tuberculosisの30KDタンパク質の発現を確認するウエスタンブロット分析の結果を示す。図１９は、組換え32A KDタンパク質の発現に使用される構築物の模式図を提供する。この模式図は、組換え32A KDタンパク質の発現に使用されるpSMT3ベクターを示す。(Ａ)において、32A KDタンパク質の遺伝子を有するDNAフラグメントは、hsp60プロモーターとは反対の方向に配置されている。(Ｂ)において、32A K Dタンパク質の遺伝子を有するDNAフラグメントは、hsp60プロモーターと同じ方向に配置されている。図２０は、28℃(レーン３)および37℃(レーン２)での組換え成熟M．tuberculo sis 32A KD主要細胞外タンパク質の分泌を比較する、電気泳動試験の結果を示す。図２１は、種々の濃度の組換えヒトおよびマウスIL-12の存在下で、モルモットリンパ芽球の増殖の比較グラフである。図２２は、図２１のものとは異なるモルモットからの、種々の濃度の組換えヒトおよびマウスIL-12の存在下での、モルモットリンパ芽球の増殖の比較グラフである。図２３は、エアロゾル化致死用量のM．tuberculosisへの曝露後における、精製された32A KD、30KD、および16KDの細胞外タンパク質、MF59アジュバント、ならびにIL-12の組合せを含むワクチンで免疫された動物と、非免疫コントロールとの平均モルモット体重の増減の比較グラフである。図２４は、エアロゾル化致死用量のM．tuberculosisへの曝露後における、精製された32A KD、30KD、および16KDの細胞外タンパク質と、MF59アジュバントとの、IL-12との、ならびにMF59およびIL-12の混合物との組合せを含むワクチンで免疫された動物と、非免疫コントロールとの平均モルモット体重の増減の比較グラフである。例示的実施態様の詳細な説明本発明は、ワクチンおよび免疫治療剤のような、病原生物に対する化合物ならびにこれら化合物の産生方法および使用方法に関する。さらに詳細には、本発明は、病原生物により放出される主として豊富な細胞外産物、ワクチンもしくは免疫治療剤のような、それらの免疫原性アナログ、またはそれらをコードする関連遺伝物質の産生および使用、ならびに感染に対する哺乳動物宿主における防御免疫を誘発するための関連方法に関する。これらの化合物は、単純化の目的のために本願を通してワクチンと呼ぶ。本発明の教示の例示である例示的実施態様において、主として豊富なM.tuberc ulosisの細胞外産物が特徴付けられ、続いて精製された。この産物の個々の特異的分子免疫原性を決定せずに、モルモットが、精製形態の大いに優性である細胞外産物で免疫化された。さらに、例示的免疫化が、精製された細胞外産物を単独または組み合わせで用いて種々の用量および投与経路で行われた。当業者は、この上述のストラテジーが、本発明の方法を実行するために病原生物または細菌について利用され得ることを理解し、したがって本発明は、M.tuberculosisに対し関連するワクチンおよび方法には、特に制限されない。これらの例示的実施態様において、M.tuberculosisの主として豊富な細胞外産物が分離され、そしてカラムクロマトグラフィーを用いて精製された。細胞外産物の相対存在比の決定および精製は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて達成された。ワクチン成分の精製に続いて、モルモットが、主として豊富な細胞外産物を単独または組み合わせによりワクチン接種され、次いでM.tuberculosis でチャレンジされた。詳細に記載されるように、免疫化に続くこれらの細胞外産物に対して予想された測定可能な応答の発現に加え、本発明のワクチンは、これらの実験動物において、実質的に致死量のM.tuberculosisのエアロゾルに対して予期せぬ免疫効果を与えた。これらの例示的実施態様は、精製形態の細胞外産物を使用したが、当業者は本発明が、組み換え手段により産生される免疫原性アナログまたは当該分野に周知の技術を用いた化学合成の他の形態を使用して容易に実行され得ると理解する。さらに、免疫原性アナログ、ホモログまたは主として豊富な細胞外産物の選択部分が、本発明の範囲および教示内で天然に存在する主として豊富な産物の代わりに使用される。本発明のさらなる理解は、当業者に対して、ワクチンとしての主として豊富な細胞外産物（単独および組み合わせ）、同定、単離、産生およびの使用についての例示的なプロトコルを例示する以下の制限されない実施例から提供される。実施例１Micobacterium tuberculosis からのバルクの細胞外タンパク質（EP）の単離および産生 M．tuberculosis Erdman株（ATCC35801）は、アメリカンティッシューカルチャーコレクション（Rockvill,Md.）から得た。凍結乾燥された細菌を、Middlebr ook 7H9培養培地（Difco Laboratories,Detroit,Mich.）で再構成し、そしてMid dlebrook 7H11寒天上で維持した。7H11寒天は、Bacto Middlebrook 7H10寒天（D ifco）、OADC Enrichment Medium（Difco）、0.1%カゼイン酵素加水分解物（Sig ma）、およびCohn（Cohn,M.1,Am.Rev.Respir.Dis.98:295-296）により前記のようなグリセロールを用いて調製し、そしてこれを参考として本明細書中で援用する。オートクレーブによる滅菌に続き、この寒天を細菌用ペトリ皿（100×15mm ）に分与し、そして放冷する。次いで、M．tuberculosisを滅菌技術を用いてプレートし、そして37℃、5%CO₂ -95%空気、湿度100%下で増殖させる。7H11を7日間培養した後、プレートからコロニーを掻きとり、7H9ブロスに10⁸CFU/mlで懸濁し、そして1.8mlのNuncクライオチューブ（Roskilde,Denmark）中にアリコートにした。各１リットルブロスを、4.7gのBacto Middlebrook 7H9粉末と998mlの蒸留水および2mlのグリセロール（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo）で、混合物のpH値を6.75に合わせる前に、再水和し調製した。そして、ブロスを15分間121℃でオートクレーブした。次いで、アリコートした細胞を緩徐に凍結し、そして-70℃で保存した。この条件下で保存した細胞は、無期限に生存し、必要なときに使用した。バルクの細胞外タンパク質調製物（EP）を、上記のように作製したMiddlebroo k 7H9ブロス中で、M．tuberculosisを増殖させた培養物から得た。再構成に続いて、150mlのブロスのアリコートを15分間121℃でオートクレーブし、そして通気孔のあるCo-star225cm²組織培養フラスコに分与した。前段落に記述の-70℃で保存されたM．tuberculosis細胞を解凍し、7H11寒天プレートへの接種に使用した。７日間の培養後、プレートからコロニーを掻き取り、数mlの7H9ブロス中に懸濁し、そして単一の細胞懸濁液を形成するために水浴中で超音波処理した。M．t uberculosis細胞をPerkin-Elmer Juniorモデル35分光測定器（Norwalk,Conn）により決定された場合、0.05の初期吸光度で150mkの滅菌アリコート中に懸濁した。次いで、細胞を懸濁物が0.4〜0.5の吸光度を示すまで37℃、5%CO₂-95%空気下で、３週間インキュベートした。これらの培養物を後の7H9ブロスでの再度の培養のためのストック瓶として使用した。ストック瓶を水浴中で超音波処理し、単一の細胞懸濁液とした。次いで、M．tuberculosis細胞を7H9Mブロスで希釈して初期吸光度を0.05とし、懸濁液の吸光度が0.4〜0.5になるまで37℃で5%CO₂-95%空気中で2 1/2〜３週間インキュベートした。次いで、培養上清をデカントし、そして0.8μmおよび0.2μmの低タンパク質結合性フィルター（Gelman Science inc., Ann Arbor,Mich）に連続して通して、濾過滅菌した。次いで、濾液を10KDカットオフのOmega膜を有するFiltron Minisetteでおよそ35倍に濃縮し、そして４℃で保存した。バルクの細胞外タンパク質の調製物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）での分析により、複数バンドを伴うタンパク質組成物が示された。バルクの細胞外タンパク質混合物（EP）を、培養濾液を40 〜95%の硫酸アンモニウムカットを得ることにより調製した。実施例２Mycobacteruium tuberculosis の主として豊富な細胞外産物の精製実施例１の滅菌培養濾液に、10%〜95%濃度範囲の硫酸アンモニウム（grade I 、Sigma）を０℃で添加し、そして緩やかに撹拌してタンパク質を分画した。次いで、懸濁液をプラスチックボトルに移し、RC3B Sorvall Centrifuge上で3,000 rpmでスイングバケットローター中で遠心分離して、得られた沈殿をペレット化する。上清をデカントし、そして目的の産物に応じ、上清もしくはペレットをさらなる濾過に供した。目的の産物が上清に含まれていた場合、最初のカットの濃度を超える塩濃度に増加させることにより、２回目の硫酸アンモニウムカットを実施した。ある期間の緩やかな撹拌の後、次いで、所望の産物を沈殿させるためにその溶液を前記の方法のとおりに遠心分離した。そして、この第２の上清をさらなる精製に供した。遠心に続いて、沈殿したタンパク質を適切な冷緩衝液で再可溶化した。そして、6,000〜8,000分子量排除のSpectrapor透析膜（Spectrum Medical Industries, Los Angels,Califolnia）中で、徹底的に透析して塩を除いた。細胞外タンパク質濃度をビシンコニン酸（bicinchoninic acid）タンパク質アッセイ（Pierce C hemical Co.,Rockford,Illinois）により決定し、そして分画成分をSDS-PAGEを用いて決定した。次いで、分画をさらなる精製のためにクロマトグラフィーのカラムに適用した。直前に概説した一般的なスキームを用いて、実施例１の詳細な過程により得られたバルクの細胞外産物のタンパク質の濾液から14の産物を精製した。正確な硫酸アンモニウム沈殿の手順およびクロマトグフィーのプロトコルを、単離された各細胞外産物について以下に詳述する。Ａ．110kD細胞外産物１．上記に議論のように50〜100%硫酸アンモニウム沈殿物を得た。２．再可溶化した沈殿物を透析し、そして10%ソルビトール、10mMリン酸カリウム、pH7、5mMの２-メルカプトエタノールおよび0.2mM EDTAからなるカラム緩衝液で満たしたDEAE Sepharose CL-6BまたはQAE Sepharoseイオン交換カラムに適用し、そして塩化ナトリウムの勾配を用いて溶出した。110KDタンパク質を含む分画は、およそ550mMの塩で溶出し、そしてこれを採集した。３．採集した分画をPBS（リン酸緩衝食塩水）で満たしたS200 Sepharoseサイズ分画カラムに適用した。タンパク質は、均質な110KDのタンパク質として溶出した。Ｂ．80KD細胞外産物１．０〜25%硫酸アンモニウムカット（０℃で１時間）を捨て、そして25〜60%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を上記のように保持した。２．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、1M NaClを含有する25mM Tris pH8.7で満たし、25mM Tris pH8.7、10mM NaClで平衡化した。そして、タンパク質のサンプルを25mM Tris pH8.7、10mM NaClで透析し、そしてカラムに適用した。カラムを同じ緩衝液で一晩洗浄した。25mM Tris pH8.7中で１回目の10mM〜200mMのNaCl の塩勾配をカラムに通して行って他のタンパク質を溶出した。２回目の塩勾配（ 200〜300mM NaCl）をカラムに通して行い、そして80KDのタンパク質をおよそ275 mM NaClで溶出した。３．Q-Sepharose HPカラムにを25mM Tris pH8.7、1MのNaClで満たし、そして2 5mM Tris pH8.7、10mMのNaClで再平衡化した。タンパク質のサンプルを10mMのNa Clを含む25mM Tris pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用した。同じ緩衝液でカラムを一晩洗浄し、次いで、25mM Tris pH8.7で200〜300mMのNaClを用いて溶出した。４．80KDのタンパク質を含む分画を採集し、そして25mM Tris pH8.7、10mM NaCl に対して透析した。次いで、Speed-Vac濃縮器で１〜２mlまで濃縮した。タンパク質のサンプルをSuperdex 75カラムに適用し、そして、25mM Tris pH8.7、150m M NaClで溶出した。80KDタンパク質を均質なタンパク質として溶出した。Ｃ．71KD細胞外産物１．71KD産物を7H9ブロス中でpH7.4、０%CO₂で培養し、１週間あたり３時間の熱ショックを与えたこと以外は上記の議論の通りに40〜95%硫酸アンモニウム沈殿物を得た。沈殿物を初期緩衝液（20mM Hepes、2mM MgAc、25mM KCl、10mM(NH₄)₂ SO₄、0.8mM DL-ジチオスレイトール、pH-7.0）に対して透析した。２．再溶解した沈殿物を初期緩衝液で平衡化されたATP Agaroseカラムに適用した。溶出物を収集し、そしてATP Agaroseカラムに再適用した。71KDタンパク質をカラムに結合させた。３．続いて、ATP Agaroseカラムを最初に初期緩衝液で、次いで1M KCl、そして初期緩衝液で洗浄した。４．均質な71KDタンパク質を10mM ATPでカラムから溶出し、そしてリン酸緩衝液に対して透析した。Ｄ．58KD細胞外産物１．上記に議論したように25〜50%硫酸アンモニウム沈殿物を得た。２．再溶解した沈殿物を透析し、そしてDEAE Sepharose CL-6BまたはQAE-Sephar oseカラムに適用し、そしてNaClで溶出した。58KDのタンパク質を含む採集した分画は、およそ400mM NaClで溶出した。３．次いで、採集した分画をCL-6Bサイズ分画カラムに適用した。タンパク質を、およそ670,000〜700,000ダルトンで溶出した。４．溶出したタンパク質をチオプロピル-Sepharoseカラムに適用した。均質な58 KDタンパク質は、およそ250〜350mMの2-メルカプトエタノールで溶出した。溶出タンパク質をSDS-PAGEを用いてモニターし、そしてこれは図１Ａ、第２欄に示す単一のバンドを示した。Ｅ．45KD細胞外産物１．ａ．０〜25%硫酸アンモニウムカット（０℃で１時間）物を捨てた。ｂ．25〜60%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）物を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む2.5mM Tris pH8.7で満たし、そして25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用した。次いで、カラムを同じ緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．カラムを25mM Tris、pH8.7中で、塩勾配（10mM〜200mM）を用いて溶出した。45KDタンパク質は、およそ40mM NaClで溶出した。３．Q-Sepharose HP（Pharmacia）カラムを1M NaClを含む25mM Tris、pH8.7で満たし、そして25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で再平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用し、引き続き同じ緩衝液で洗浄した。 c.カラムを25mM Tris、pH8.7中で10〜150mMのNaClを用いて溶出した。４．ａ．45KD産物を含む分画を採集し、プールし、そしてSpeed Vac濃縮器で１m lまで濃縮する前に25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析した。ｂ．濃縮物を25mM Tris、150mM NaCl、pH8.7で平衡化したSuperdex 75カラムに適用した。産物を均質なタンパク質として溶出した。溶出タンパク質をSDS- PAGEを用いてモニターし、そしてこれは図１Ｂ、第２欄に示す単一のバンドを生じた。Ｆ．32KD細胞外産物（Ａ）１．１．ａ．０〜25%硫酸アンモニウムカット（０℃で１時間）物を捨てた。ｂ．25〜60%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む25mM Tris pH8.7で満たし、次いで25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用し、引き続きカラムを同じ緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．カラムを25mM Tris、pH8.7緩衝液で、塩勾配（10mM〜200mM）を用いて溶出した。32KDタンパク質は、およそ70mM NaClで溶出した。３．ａ．32KD産物を含む分画を採集し、プールし、そしてタンパク質のサンプルをSpeed Vac濃縮器で１mlまで濃縮する前に、25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析した。ｂ．濃縮物を25mM Tris、150mM NaCl、pH8.7で平衡化したSuperdex 75カラムに適用し、そしてこの緩衝液で溶出した。32KD産物は均質なタンパク質として溶出した。４．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む25mM Tris、pH8.7 で満たし、そして25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で再平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用し、引き続き同じ緩衝液で洗浄した。ｃ.カラムを100〜300mM NaClの勾配を用いて溶出した。32Ａと命名した、均質なタンパク質は、およそ120mM NaClで溶出し、そして図１Ｂ、第４欄に単一のバンドとして示される。Ｇ．32KD細胞外産物（Ｂ）１．ａ．０〜25%硫酸アンモニウムカット（０℃で１時間）を捨てた。ｂ．25〜60%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む25mM Tris pH8.7で満たし、次いで25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用し、引き続きカラムを同じ緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．25mM Tris、pH8.7中の10mM〜200mM NaClの予備的な塩勾配を行い、種々のタンパク質を溶出した。カラムの平衡化に続き、２回目の塩勾配（200〜3 00mM NaCl）を行った。32KDタンパク質はおよそ225mM NaClで溶出した。３．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む25mM Tris、pH8.7 で満たし、そして25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で再平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用し、引き続き同じ緩衝液で洗浄した。ｃ.カラムを同じ緩衝液で200〜300mMのNaCl勾配を用いて溶出した。４．ａ．32KD産物を含む分画を採集し、プールし、そしてタンパク質のサンプルをSpeed Vac濃縮器で１mlまで濃縮する前に、25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析した。ｂ．濃縮物を25mM Tris、150mM NaCl、pH8.7で平衡化したSuperdex 75カラムに適用し、そして同じ緩衝液で溶出した。32KD産物をプロトコルＨを用いて分離される32KDタンパク質と区別するために32Bと命名し、これは、均質なタンパク質として溶出し、図１Ｂ、第３欄において単一のバンドとして示される。Ｈ．30KD細胞外産物１．１．ａ．０〜25%硫酸アンモニウムカット（０℃で１時間）を捨てた。ｂ．25〜60%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む25mM Tris pH8.7で満たし、次いで25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用し、引き続き同じ緩衝液でカラムを一晩洗浄した。ｃ．カラムを25mM Tris、pH8.7中で、塩勾配（10mM〜200mM）を用いて溶出した。30KDタンパク質は、およそ140mM NaClで溶出した。３．ａ．30KD産物を含む分画を採集し、プールし、そしてタンパク質のサンプルを、Speed Vac濃縮器で１mlまで濃縮する前に、25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析した。ｂ．次いで、濃縮物を25mM Tris、150mM NaCl、pH8.7で平衡化したSuperdex 75カラムに適用し、そしてこの緩衝液で溶出した。30KD産物を均質なタンパク質として溶出し、そしてこれは図１Ｂ、第５欄において単一のバンドとして示される。Ｉ．24KD細胞外産物１．ａ．０〜25%硫酸アンモニウムカット（０℃で１時間）を捨てた。ｂ．25〜60%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む25mM Tris pH8.7で満たし、次いで25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用し、引き続きカラムを同じ緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．25mM Tris、pH8.7中で、10mM〜200mM NaClの予備的な塩勾配を行い、種々のタンパク質を溶出した。カラムの平衡化に続き、２回目の塩勾配（200〜300 mM NaCl）を行った。24KDはおよそ250mM NaClで溶出した。３．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を1M NaCl含有する25mM Tris、pH8 .7で満たし、そして25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で再平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用し、引き続き同じ緩衝液中で洗浄した。 c.カラムを同じ緩衝液中で200〜300mMのNaCl勾配を用いて溶出した。４．ａ．24KD産物を含む分画を採集し、プールし、そしてタンパク質のサンプルを、Speed Vac濃縮器で１mlまで濃縮する前に、25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7 に対して透析した。ｂ．次いで、濃縮物を25mM Tris、150mM NaCl、pH8.7で平衡化したSuperdex 75カラムに適用し、そして同じ緩衝液で溶出した。24KD産物は均質なタンパク質として溶出し、これは図１Ｂ、第７欄において単一のバンドとして示される。Ｊ．23.5KD細胞外産物１．ａ．０〜25%硫酸アンモニウムカット（０℃で１時間）を捨てた。ｂ．25〜60%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む25mM Tris pH8.7で満たし、次いで25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そして引き続き同じ緩衝液で一晩洗浄する前に、このカラムに適用した。ｃ．カラムを25mM Tris、pH8.7緩衝液中、塩勾配（200〜300mM NaCl）を用いて溶出した。23.5KDはおよそ80mM NaClで溶出した。３．ａ．Q-Sepharose HPカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む25mM Tris、pH8.7 で満たし、そして25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で再平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析し、そしてカラムに適用し、引き続き同じ緩衝液で洗浄した。 c.カラムを25mM Tris、pH8.7中で100〜300mMのNaClを用いて溶出した。ｄ．工程３ａ〜３ｃを反復した。４．ａ．23.5KD産物を含む分画を採集し、プールし、そしてタンパク質のサンプルを、Speed Vac濃縮器で１mlまで濃縮する前に、25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7 に対して透析した。ｂ．次いで、濃縮物を25mM Tris、150mM NaCl、pH8.7で平衡化したSupcrdex 75カラムに適用し、そして同じ緩衝液で溶出した。23.5KD産物を均質なタンパク質として溶出した。溶出タンパク質をSDS-PAGEを用いモニターし、そしてこれは、図１Ｂ、第６欄において示される単一のバンドを生じた。Ｋ．23KD細胞外産物１．１．ａ．０〜25%硫酸アンモニウムカット（０℃で１時間）および25〜60%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を捨てた。ｂ．60〜95%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む50mM BIS-Tris pH7.0 で満たし、次いで50mM Bis-Tris、100mM NaCl、pH7.0で平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを50mM Bis-Tris、pH7.0、100mM NaCl緩衝液に対して透析し、そして同じ緩衝液でカラムを一晩洗浄する前に、このカラムに適用した。ｃ．カラムを50mM Bis-Tris、pH7.0中で、100mM〜300mM NaClの直線的な勾配を用いて溶出した。ｄ．23KDタンパク質を含む分画を採集し、これはおよそ100〜150mM NaClで溶出した。３．ａ．タンパク質分画を、25mM Tris、pH8.7、10mM NaClに対して透析し、そしてSpeed-Vac濃縮器で１〜２mlまで濃縮した。ｂ．濃縮物を25mM Tris、150mM NaCl、pH8.7で平衡化したSuperdex 75カラムに適用した。産物を図１Ｂ、第８欄に示されるような均質なタンパク質として溶出した。１．23KD細胞外産物１．ａ．０〜25%硫酸アンモニウムカット（０℃で１時間）を捨てた。ｂ．25〜60%硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を保持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を1M NaClを含む2.5mM Tris pH8.7で満たし、次いで25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7で平衡化した。ｂ．タンパク質のサンプルを25mM Tris，10mM NaCl、pH8.7緩衝液に対して透析し、そしてカラムに適用し引き続き同じ緩衝液中で一晩洗浄した。ｃ．カラムを25mM Tris、pH8.7緩衝液中で塩勾配（10mM〜300mM）を用いて溶出した。16KDタンパク質は、およそ50mM NaClで溶出した。３．ａ．16KD産物を含む分画を採集し、プールし、そしてタンパク質のサンプルを、Speed Vac濃縮器で１mlまで濃縮する前に、25mM Tris、10mM NaCl、pH8.7に対して透析した。ｂ．次いで、濃縮物を25mM Tris、150mM NaCl、pH8.7で平衡化したSuperdex 75カラムに適用し、そして同じ緩衝液で溶出した。16KD産物を均質なタンパク質として溶出した。溶出タンパク質をSDS-PAGEを用いてモニターし、そしてこれは、図１Ｂ、第９欄に示される単一のバンドを生じた。Ｍ．14KD細胞外産物１．ａ．Ａ０〜25％硫酸アンモニウムカット(cut)（０℃で１時間）を捨てた。ｂ．25〜60％硫酸アンモニウムカット（０℃で一晩）を維持した。２．ａ．DEAE CL-6Bカラム（Pharmacia）を、1M NaClを含む25mM Tris、pH8.7で満たし、次いで10mM NaClを含む25mM Tris、pH8.7で平衡化さた。ｂ．タンパク質サンプルを25mM Tris、10mM NaCl pH8.7に対して透析し、そしてカラムに搭載し、続いて同じ緩衝液で一晩洗浄した。ｃ．カラムを、塩勾配（10mMから200mM）を有する25mM Tris、pH8.緩衝液で溶出させた。14KDのタンパク質は、約60mM NaClで溶出された。３．ａ．Q-SepharoseHPカラムを1M NaClを含む25mM Tris、pH8.7で満たし、そして25mM NaCl pH8.7で再平衡化させた。ｂ．タンパク質サンプルを25mM Tris.10mM NaCl pH8.7に対して透析し、そしてカラムに搭載し、続いて同じ緩衝液で洗浄した。ｃ．カラムを、10〜150mM NaClを含む25mM Tris pH8.7で溶出した。ｄ．工程３ａから３ｃ反復した。４．ａ．14KDの産物を含む画分を回収し、プールし、そして25mM Tris、10mM Na Cl pH8.7に対して透析し、その後このタンパク質サンプルをSpeed-Vac Concentr ator中1mlに濃縮した。ｂ．次いで濃縮物を、25mM Tris、150mM NaCl pH8.7で平衡化したSuperdex7 5カラムに搭載し、そしてこの緩衝液で溶出した。同種のタンパク質として14KD 産物が溶出した。溶出したタンパク質をSDS-PAGEを用いてモニターし、そして図１Ｃカラム２に示される単一バンドを得た。Ｎ．12KD細胞外産物１．０〜10％硫酸アンモニウム沈殿物を得た（４℃で一晩）２．再可溶化した沈殿物をS200 Sephacrylサイズ画分カラムに搭載し、12KD分子としてタンパク質を溶出した。３．タンパク質画分をDEAE-Separose CL-6BまたはQAE-Sepharoseイオン交換カラムに搭載し、NaCl勾配で先に述べたように溶出した。約300〜350mM NaClで溶出した約12KDの分子量を有する２つの同種のタンパク質を含む画分を、回収した。これらのタンパク質を12Aおよび12Bと標識し、図１Ｄカラム２に示される２重線 (doublet)として精製した。図１のSDS-PAGEプロファイル中に図示されるように、M.tuberculosisの主要なまたはきわめて豊富な細胞外タンパク質を、上の実施例2A〜2Nに詳述されるプロトコールの使用を通して均質にまで精製した。より詳細には、図１は、SDS-PAGE を用いて発色させた４つの例示的な12.5％アクリルアミドゲルを図示し、そして 1A、1B、1Cおよび1Dと標識した。ゲル1A〜1Cのレーン１中の標準は66、45、36、 29、24、20、および14KDの分子量を有するタンパク質を有する。ゲル1Dにおいて、レーン１の標準は、68、45、31、29、20および14KDの分子量を有するタンパク質を含む。それぞれ精製された細胞外産物を含むレーンは、個々のタンパク質の報告されている分子量で、本質的に１つのバンドを示す。ゲル1Dにおいて、12KD のタンパク質はレーン２において見える２重線として泳動されることに注目すべきである。配列分析は、この低い位置の方の12KD（すなわち、12B KDバンド）は、最初の３個のＮ末端アミノ酸を欠損している以外は、上部の12KD（すなわち12 A KD）のバンドと等価である。これらの個々の例示的なきわめて豊富な細胞外産物のさらなる分析を、図２に提供する。より詳細には図２は、これらの精製された細胞外産物から得られたＮ末端配列データの、表を用いた編集であり、単離された産物の大部分が事実異なっていることを示している（配列番号１〜14）。タンパク質32A、32Bおよび30は全て、同じ５個のＮ末端アミノ酸を有し、それゆえそれらを完全に特徴付け、そして区別するためにさらなる配列決定が必要であった。図３は、これらの３つの精製された分泌産物についての延長されたＮ末端アミノ酸配列決定を示す（配列番号15〜17）。16位（配列番号17）、31位（配列番号16）、および36位（配列番号16）の異なるアミノ酸は、これらの単離されたタンパク質がその分子量における類似性にもかかわらず、互い異なっていることを示す。タンパク質30、32A、および32Bに加えて、他のきわめて豊富な細胞外産物の延長されたＮ末端アミノ酸配列が１次構造データを提供し、そしてタンパク質間の可能な関係を明らかにするために決定された。配列決定は当該分野に周知の技術を用いて、実施例２に従って精製された細胞外産物において行われた。各個々の細胞外産物について決定された、完全なタンパク質の見かけの分子量によって同定され、そして天然に存在するアミノ酸についての標準１文字略語用いて表された種々の長さのＮ末端アミノ酸配列を、以下に示す。表記法の確立された法則と一致して、Ｎ末端配列は、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向へ記載される。決定されたアミノ酸の正体(identity)が確実でない場合、これらの位置には下線を付す。特定の位置のアミノ酸は未知または不明確である場合、配列中のその位置はダッシュ（−）によって表される。最後に、２つのアミノ酸がスラッシュによって分離されている場合、正しい構成成分がはっきりと同定されておらす、いずれか１つが配列中のその部分を占め得る。 DNA配列決定は、当該分野において周知の技術を用いて30、32A、16、58、23.5 および24KDのタンパク質に行われた。上流配列および下流配列を含む、これらの DNA配列、そして対応するアミノ酸は、完全なタンパク質の見かけの分子量として同定されそして標準的な略語および表記方法を用いて表されて、以下に示される。この配列データは、SDS-PAGEを用いて確かめられた物理的特性と組み合わせて、本発明のこれらの代表的なきわめて豊富な細胞外産物を特徴付け、そして区別することを可能にする。記載された分析物は、これらのタンパク質が、全ての利用可能な細胞外産物の、約60重量％を含む71KD、30KD、32AKD、23KDおよび16KD の産物を有して、M.tuberculosisの大部分の細胞外産物を構築することを示す。さらに、M.tuberculosisによって放出された総産物の25重量％までを、30KDのタンパク質が構成することを推測した。従って、本発明の実施において、有用な個々の例示的なきわめて豊富なM.tuberculosisの細胞外産物は、細胞外産物の総重量の約0.5％〜約25％のどこかの範囲であり得る。以前に議論されたように、従来のウエスタンブロット分析が、最も免疫原性的に特異的な細胞外産物を一貫して同定することが可能でないことに従って、本発明者らは、それらの豊富さならびに結果としての同定および単離の容易さに基づくきわめて豊富な細胞外産物の免疫原性を分析することにした。驚いたことに、これらのきわめて豊富な細胞外産物が予想外に有効な免疫応答を誘導することを見出し、このことにより本発明者らは、これらがワクチンとして機能し得ると結論付けることになった。この驚くべき発見は、上に議論した本発明の非制限的な機能的理論の開発を導いた。本発明の有効性を実証するために、さらなる実験が、個々のきわめて豊富な細胞外産物およびその組合せを、当該分野で認められている研究室モデルに防御免疫を誘導するための種々の例示的な用量で用いて行った。より詳細には、精製された個々のきわめて豊富な細胞外産物がモルモットに防御免疫を誘導するために用いられ、次いでこのモルモットはM.tuberculosisをチャレンジされた。これらのタンパク質が防御免疫を誘導し得ることを示す際に、５つの精製されたきわめて豊富な細胞外産物の組合せが、異なる投与経路を用いて同様に試験された。特に30KDの豊富な細胞外産物が、精製型の71KD細胞外産物と同様に認められている動物モデルに防御免疫を誘導するのに用いられた。個々の例示的なきわめて豊富な細胞外産物と同様に、５個のきわめて豊富な細胞外産物の組合せワクチンはまた、M.tuberculosisの致死用量でのチャレンジに対する防御を付与した。以下は、本発明のこれらの例示的なワクチンの種々の研究の結果である。特異的な病原性を有さない雄性Hartley系モルモット（Charles River Breedin g Labratories,North Wilmington,Massachusetts）を、M．tuberculosisを用いた免疫原投与およびエアロゾル投与を含む全ての実験に用いた。この動物はステンレススチールケージに２匹か３匹づつで収容され、標準モルモット試料および水を自由に摂取可能にした。動物施設に入れた後、それらの健康を確実にするために、各実験の開始前にモルモットを少なくとも１週間観察した。最初の実験を、個々のきわめて豊富な細胞外産物を用いて行った。この産物は、通常存在する総細胞外産物の３％〜25％の間を含むと考えられた。これらの実験は、きわめて豊富な細胞外産物が有効な免疫応答を誘発することを実証する。より詳細には、単離された30KDおよび71KDの細胞外産物が個々に細胞媒介免疫応答を産生し得ることを示した。この免疫応答は、以下のように、M．tuberculosi sの致死用量に対する曝露からモルモットを防御した。実施例３ 30KD で免疫化されたモルモットの細胞媒介免疫についての精製された30KDタンパク質皮膚試験測定可能な免疫応答が、精製型の豊富な細胞外産物によって誘導され得ることを示すために、皮膚過敏症アッセイを行った。実施例２に従って精製され、そしてM.tuberculosisの総細胞外産物の約25％を含むと考えられている、例示的なきわめて豊富なM.tuberculosisの30KD分泌型産物でモルモットを免疫化した。３つの独立した実験において、モルモットをSAFアジュバント中の実質的に精製された30KDのタンパク質100mgで、３週間間隔をあけて３回免疫化した。コントロール動物をSAF中の緩衝液で同様に注射した。最後の免疫化の３週間後、モルモットは皮膚過敏症アッセイにおいて例示的な30KDタンパク質をチャレンジされた。モルモットの背中の毛を剃り、そして0.1、１、および10mgの30KDのタンパク質の注射を皮内投与し、以下の表Ａに示されるように、24時間後に測定した、生じた紅斑（皮膚の発赤）および硬化の発症を伴った。データは、従来の方法を用いて決定されたように、グループについての測定値の平均±標準誤差（SE）という形で報告する。NDは、本発明のこの特定の局面が行われなかったことを示す。表Ａに示されるように、例示的な30KDの分泌された産物で免疫化されたモルモットは、著しい紅斑および硬化によって証拠づけられるように強い細胞媒介免疫応答を示した。対照的に、コントロール動物は最少の応答を示した。 30KDの分泌性産物の免疫反応性を確認し、そして感染性結核に対するその適用を示すために、非免疫モルモットをM.tuberculosisに感染させ、そして以下のようにこのタンパク質でチャレンジした：実施例４ M.tuberculosis に感染したモルモットの細胞媒介免疫応答についての精製した30KDのタンパク質の試験モルモットの感染に必要な実験で使用する細菌を得るため、最初にM.tubercul osisを7HII寒天上で培養し、そしてモルモットの肺を介して１回継代させてそれらが病原性であることを保証した。この目的のために、約５×10⁴細菌/mlを含む 7H9ブロス中の細菌の懸濁液10mlでのエアロゾルで、モルモットにチャレンジした。モルモットが病気になった後に、この動物を屠殺して顕著なM.tuberculosis 病変を含む肺を切除した。各肺をすりつぶし、そして7HII寒天上で７日間か10日間培養した。プレートから細菌をこすりとり、10％グリセロールを含む7H9ブロス中に希釈し、単一な細胞懸濁液を得るために水浴中で超音波処理し、そして約２×10⁷生存細胞/mlの濃度で-70℃でゆっくりと凍結した。凍結細胞の生存率は細胞懸濁液を解凍し、そして懸濁液の段階希釈を7HII寒天上で培養することによって測定した。チャレンジの直前に細菌細胞のバイアルを解凍し、そして7H9ブロス中の所望の濃度に希釈した。モルモットを、特別に設計したルーサイト（lucite）エアロゾルチャンバー中の生存M．tuberculosisのエアロゾルに曝露した。エアロゾルチャンバーは、14 ×13×24インチと測定され、そしてモルモットを導入または取り出すため２つの直径６インチの入り口を両側に含む。エアロゾルの注入口はチャンバーの天井の中心に位置する。バキュームポンプ（GastMfg.Co.、Benton Harbor、Michigan）は、ネブライザーベンチュリユニット（nebulizer-venturi unit）（MesInc.、B urbank、California）に空気を30lb/in²で送達し、そしてエアロゾルは桿菌の懸濁液10mlから作成される。0.2μm呼吸回路フィルターユニット（Pall Blomedica l Inc.、Fajardo、Puerto Rico）はチャンバーの一端に位置し、アセンブリの内側と外側の圧力を平衡化させる。安全性の考慮に起因して、エアロゾルチャレンジは完全に層流フード内に配置されたチャンバー内で行った。動物を、30分間(この時間の間に、ネブライザー中の桿菌の懸濁液が完全に使い果たされる)病原性エアロゾルに曝露した。各エアロゾルは、１mlあたり約5.0 ×10⁴細菌粒子を含む懸濁液10mlから作成された。以前の研究より、この濃度の細菌にモルモットを曝露することにより、非防御動物では一貫して感染を生じることが示されている。エアロゾル感染後、層流バイオハザード安全包囲（Airo C lean Engineering Inc.、Edgemont、Pennsylvania）内に含まれるステンレススチールケージ中にモルモットを収容し、そして病気の徴候について観察した。実験の間中、動物は、標準モルモット試料および水を自由に摂取可能であった。本実験において、感染したモルモットを屠殺して、そして脾臓リンパ球の増殖を、種々の濃度の30KDのタンパク質に応答して測定した。より詳細には、Briema nおよびHorwitz（J.Exp.Med.164.799-811）（これは本明細書中に参考として援用される）により記載されるように、脾臓リンパ球を得、そして精製した。リンパ球を、ペニシリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100mg/ml）、および10 ％ウシ胎仔血清（GIBCO）を含むRPMI 1640（GIBCO Laboratories、Grand Island 、New York）で最終濃度10⁷/mlに調製し、そしてマイクロテストウエル（96ウエル丸底組織培養プレート；Falcon Labware、Oxnard、California）中、総容量10 0mlで、種々の濃度の精製した30KD分泌産物とともに、２日間、37℃、５％CO₂-9 5％空気および100％湿度でインキュベートした。非感染動物をネガティブコントロールとして使用した。インキュベート期間の最後に、0.25mCiの[³Ｈ]チミジン（New England Nuclear、Boston、Massachusetts）を各ウエルに添加し、そして細胞をさらに２時間、37℃、５％CO₂-95％空気および100％湿度でインキュベートした。多サンプル自動細胞ハーベスター（Multi sample automated cell harv ester）（Skatron Inc.、Sterling、Virglnia）を用いて各ウエルを洗浄し、そして流出物をフィルターマット（Skatron）に通過させた。別々のマイクロテストウエルを示すフィルターマット部分を、シンチレーションバイアル中に配置し、そして２mlのEcoscint H液体シンチレーションカクテル（National Diagnosti c、Manville、New Jersey）を添加した。β粒子放出はβ線シンチレーションカウンター（Beckman InstrumentsInc.、Fullerton、California）中で測定した。感染モルモットおよび非感染モルモット由来の組織サンプルを、１および10mg /mlの単離された30KDの分泌タンパク質に対してアッセイした。次いでサンプルを、その[³Ｈ]チミジン取り込み能力についてモニターした。これらのアッセイの結果を表にし、そして以下の表Ｂに示した。データは、本開示の目的のため以下のように定義された刺激指数として報告している：抗原とインキュベートしたリンパ球の[³Ｈ]チミジン取り込みの平均値／抗原無しでインキュベートしたリンパ球の[³Ｈ]チミジン取り込みの平均値。表Ｂに示されるように、感染した動物の細胞は例示的な30KDのタンパク質に対して、このきわめて豊富な分泌産物への曝露に応答する、用量依存的な膵臓リンパ球増殖によって明らかにされるように、強い応答を示した。逆に、非感染コントロール動物はほとんどリンパ球増殖を示さなかった。従って、30KD分泌産物は、M.tuberculosisで感染した哺乳動物における細胞媒介免疫応答を明らかに誘導する。本発明のワクチンの防御的局面を例示するため、以下のようにモルモットを精製した30Kタンパク質で免疫化し、そしてM.tuberculosisに曝露した。実施例５ 30KD で免疫化したモルモットのエアロゾル化M.tuberculosisでのチャレンジ前のように、動物をSAF中の例示的な30KD分泌タンパク質100mgで、３週間の間隔で３回免疫化した。コントロールモルモットはSAF中の120mgのバルタEPで免疫化するか、または同じアジュバント中の緩衝液で偽免疫化した。最後の免疫化の３週間後、実施例４に記載するように、動物にエアロゾル化M.tuberculosisをチャレンジした。３つの群の動物についての生存率をモニターし、そして図４にグラフで示した。以下の表Ｃに示すように、絶対死亡率をチャレンジ14週間後に決定した。図４に示されるように、例示的な30KDのタンパク質で３回免疫化されたモルモットは、死亡から防御された。コントロールである偽免疫化したモルモットのたった17％のみが生存したのに対して、30KDのタンパク質で免疫化されたモルモットの約67％が生存した。また、免疫化した動物の体重維持もモニターし（データは示さず）、そしてさらに本発明により教示されるように、病原性細菌により作成されるきわめて豊富な細胞外産物を組み込んだワクチンの予防能力を図示した。免疫化した動物がその重量を保持する一方、偽免疫化した動物の高い死亡率のため、免疫化した動物とコントロール動物との間のグラフ的な比較は不可能であった。重量モニター研究の結果に従って、生存動物を屠殺し、そして各動物の右肺および脾臓を生存M.tuberculosisについてアッセイした。動物を２％amphyl溶液（ Natlonal Laboratories、Montvale、New Jersey）に浸し、そして肺および脾臓を無菌的に切除した。肺における巨視的な原発性表面病変の数を、視覚的な検査によって数えた。右肺および脾臓中のM.tuberculosisのコロニー形成単位（CFU ）を、各器官を10mlの7H9中で、乳鉢および乳棒ならびに90メッシュNorton Alun dum（Fisher）を用いてホモジナイズし、組織ホモジネートを7H9中で段階希釈して、そして0.1ml／液滴の液滴を使用することにより希釈物を２連の7HII寒天のプレート上で培養することによって決定した。全てのプレートをモジュラーインキュベーターチャンバー内で維持し、そして５％CO₂、95％空気、100％湿度で、37℃で12〜14日間インキュベートした。このプロトコールを用いてアッセイを行い、そしてカウントの結果を、コロニー形成単位（CFU）の平均値±標準誤差（SE）という形で、以下の表Dに提示した。表Ｄに示されるように、例示的な30KD分泌タンパク質での免疫化は、肺および脾臓内におけるM.tuberculosisの増殖を制限する。生存偽免疫化由来であるこのたった一匹のデータのみが比較アッセイに利用可能である一方、30KDで免疫化した４匹の生存動物が、偽免疫化動物よりもその肺において0.7のlog未満CFU、およびその脾臓において１log未満のCFUを有した。CFUカウントと死亡率との高い相関関係の実証に基づいて、CFU分析を行われ得る前に死亡した動物よりも、生存動物はその肺および脾臓においてより低いCFUを有するようである。免疫化した動物の肺および脾臓におけるこのCFUの減少は、本発明の範囲および実施可能性を再び結諭的に示す。 M.tuberculosis由来の別のきわめて豊富な細胞外産物である71KDの細胞外産物の免疫防御能力を、その単離された形態においてその免疫防御能力を示すために試験した。実施例６EP のバルク調製物で免疫化されたモルモットの精製71KDのタンパク質の皮膚試験動物において有効な免疫応答を引き起こす71KDのタンパク質の能力を示すため、皮膚過敏症アッセイにおいて、M.tuberculosis細胞外産物(EP)のバルク調製物で免疫化されたモルモット皮膚試験に、この単離されたきわめて豊富な細胞外産物を用いた。上記のように、バルクEPはM.tuberculosisによる感染に対する獲得性免疫を付与するが、本発明のワクチンよりもより少ない程度までである。モルモットを、実施例１に詳述されるように調製されるEPの120μgのバルク調製物で３週間の間隔で２回免疫化した。ワクチン接種を不完全フロイントアジュバンドにおいて調製し、偽免疫化された動物はEPの代わりに緩衝液を受けた。最後のワクチン注射の３週間後、各群からのモルモットを背中の毛を剃り、そして 0.1、1.0、および10μgの71KDのタンパク質で皮内注射で皮膚を試験した。コントロールとして10.0μgの緩衡液を用い、そして全ての注射は総容量0.1mlを用いて行った。24時間後、紅斑および硬化の直径を測定し、以下の表Ｅに示すような結果を有した。データは、従来の方法を用いて決定されるように、各群についての測定値の平均±標準誤差（SE）という形で報告する。免疫化された動物の反応は、緩衝液単独をチャレンジされたモルモットの応答のほぼ２倍であり、そして動物を免疫化するのに用いられたEPと同一のバルクEP を投与した動物に匹敵した（データは示さず）。精製された例示的な71KDのきわめて豊富な細胞外産物が引き出す細胞媒介免疫応答を誘発することをさらに確認するため、バルクEPで免疫化したモルモットを屠殺し、そして種々の濃度の71KDのタンパク質に応答して、脾臓リンパ球増殖を測定した。非免疫化動物をコントロールとして用いた。実施例４のプロトコルに従って、71KDのタンパク質の存在下および非存在下でリンパ球を２日間インキュベートし、次いでその[³Ｈ]チミジン取り込み能力についてアッセイした。データは実施例４のように算出された刺激指数の形で報告する。この71KDタンパク質チャレンジの結果は以下の表Ｆに示す。表Ｆに示されるように、リンパ球増殖アッセイについての刺激指数は皮膚過敏反応アッセイにおいて得られた結果に匹敵した。71KD試験サンプルおよびバルク EP試験サンプルの両方が、コントロールで得られた応答より２倍〜３倍の間の高い応答を示し、このことは単離された例示的な71KDのきわめて豊富な細胞外産物が、M.tuberculosis抽出物で免疫化された動物において、細胞媒介免疫応答を引き起こし得ることを示す。しかし、精製されたきわめて豊富なまたは主要な細胞外産物が、先行技術およびバルク組成物に付随する問題を含まず、そして合成的および商業的な産生に対してより容易に適応可能であり、本発明のワクチンを先行技術よりも優れたものにすることが、再び強調されるべきである。より詳細には、バルク調製物は現代の生体分子技術を通して大規模に容易に生産され得ない。これらの全ての細胞外産物を含む、精製されていないバルク調製物の商業的な産生はいずれも、莫大な量の標的病原物または密接に関連した種を培養する工程、そして得られた上清液を回収する工程を包含する。このような作成方法論は、標的病原物、毒性副産物、または他の寄生病原体による混入に、非常に影響される。さらに、このような調製物中の大多数の免疫原性決定因子は、免疫化集団の影響を受けやすいセグメントにおいて毒性免疫応答をさらにより引き起こしやすい。これらの精製されていないバルク調製物はまた、結核スクリーニングおよびコントロールに対して最近用いられている最も一般的な皮膚試験の使用を否定する。全く対照的に、本発明のワクチンは高収率の形質転換宿主を用いて比較的安全に大量生産され得る。同様に、本発明のワクチンは、バルク細胞外産物の広範な可変的な作成とは反対に、同一の、容易に規格化されるバッチで作成され得る。さらに、宿主免疫系に提示される免疫原性決定因子の数が比較的少ない場合、毒性反応および一般的なスクリーニング試験を無効にする機会を非常に減少させる。実施例７ 71KD 免疫化モルモットの精製された71KDのタンパク質皮膚試験単離された例示的な71KDのきわめて豊富な細胞外産物が、バルクEPで免疫化された動物において単細胞媒介免疫応答を産生することを実証したのに続いて、このきわめて豊富な産物の精製型が、71KDで免疫化された動物において、細胞媒介免疫応答を誘導し得ることを示した。モルモットを、SAF中の100μgの精製した71KDのタンパク質で、３週間の間隔で２回ワクチン化した。コントロール動物を、同一のスケジュールでＳＡＦ中の緩衝液で偽免疫化した。最後の免疫化の３週間後、両方のセットの動物に、１および10μgの単離された71KDのタンパク質を用いて皮内チャレンジした。得られた紅斑および硬化を、24時間後に測定し、結果を以下の表Ｇに示す。硬化および紅斑の程度は、免疫動物において、非免疫コントロール動物においてよりもずっと高かった。このことは、71KDタンパク質に対する強い細胞媒介免疫応答が、本発明のワクチン接種プロトコルにより開始されたことを実証する。本発明の教示に従ってこの豊富な細胞外産物が独力で有効な免疫応答を誘発する能力をさらに確証するために、リンパ球増殖アッセイを行った。表Ｇにおけるように免疫した動物を屠殺し、脾臓リンパ球増殖アッセイを実施例４において確立されたプロトコルを使用して行った。71KD免疫モルモット由来の組織サンプルおよびコントロールモルモット由来の組織サンプルを、0.1、１および10μg/ml の単離された71KDタンパク質でチャレンジし、それらが［³Ｈ］チミジンを取り込む能力をモニターした。刺激指数を以前に記載したように算定した。これらのアッセイの結果を以下の表Ｈに示す。皮膚過敏性アッセイと同様に、71KD免疫動物は、偽免疫コントロールよりも、精製71KDに対してよりずっと高い応答を示した。外来タンパク質で期待されたが、このような結果は、主として豊富な細胞外産物が細胞媒介免疫応答を誘発する能力を有することを明確に示している。単離された主として豊富な細胞外タンパク質が有効な細胞媒介免疫応答を誘発すると確立した後、このような応答が結核菌に対して交差反応性であることを確証するために、以下のように、さらなる実験を行った。実施例８ M ．tuberculosisに感染したモルモットの精製71KDタンパク質チャレンジ非免疫モルモットを、実施例４で報告したように、エアロゾル化M．tuberculo sisに感染させた。精製タンパク質誘導体(PPD-CT68；Connaught Laboratories L td.)を、感染動物が、M．tuberculosisの細胞媒介免疫応答を示すと実証していることを確実にするために、ポジティブコントロールとして使用した。結核曝露についてのマントゥー試験において広く使用されているが、PPDは、硫安分画によって一般に調製され、そして平均分子量約10KDを有する小タンパク質の混合物を含む。PPDに対する免疫応答は、実施例１で単離されたバルタEP画分により引き起こされた応答に実質的に類似する。感染３週間後、モルモットを0.1、１および10μgの例示的な精製された主として豊富な71KD細胞外タンパク質で皮内チャレンジした。コントロールとして使用した非感染動物を、単離されたタンパク質で同様にチャレンジした。紅斑および硬化の程度を24時間後に測定した。結果を以下の表Ｉに報告する。表Ｉに示されるように、強い免疫応答が、本発明の例示的な精製された主として豊富な71KD細胞外タンパク質でチャレンジした感染動物において存在する。これらの応答は、非感染動物よりも紅斑は３〜４倍大きな程度であり、硬化は10倍を超えて大きい。このことは、優勢な71KD細胞外タンパク質がM．tuberculosis 感染動物における強い細胞媒介免疫応答を誘発することを確証する。これらの結果をさらに強化するために、感染動物および非感染動物を屠殺し、実施例４のプロトコルに従ってリンパ球増殖アッセイに供した。両セットのモルモット由来の組織サンプルを、0.1、１および10μg/mlの単離された71KDタンパク質およびPPDに対してアッセイした。次いで、サンプルを、既に記載したように、それらが［³H］チミジンを取り込む能力をモニターした。これらのアッセイの結果を以下の表Ｊに示す。皮膚過敏性アッセイの結果と同様に、表Ｊは、刺激指数が、感染組織について非感染サンプルよりもよりずっと高かったことを示す。より詳細には、感染動物の平均ピーク刺激指数は、非感染コントロールに対するよりも、例示的な71KDタンパク質には２倍高く、PPDには３倍高かった。このことは、強い細胞媒介免疫応答がM．tuberculosisに感染した動物において、本発明の例示的な主として豊富な細胞外タンパク質ワクチンにより誘発されることを確証する。例示的な精製された71KDの主として豊富なタンパク質とM．tuberculosisとの間の交差反応性のこの実証後、有効免疫応答が、本発明により開示されたような主として豊富な細胞外産物のこれらの例示的な精製サンプルにより刺激され得ることを実証するために、さらなる実験を行った。実施例９エアロゾル化M．tuberculosisでの71KD免疫モルモットのチャレンジ例示的な主として豊富なまたは主要な細胞外タンパク質ワクチンの免疫防御能を実証するために、モルモットを、実施例２に従って精製された、例示的な主として豊富な71KDタンパク質100μgで、３週間あけて、２回免疫した。コントロール動物を、実施例１からの120μgのバルクEPまたは緩衝液で免疫した。全ての動物を、アジュバントSAFを用いて免疫した。最後の免疫化から３週間後、例示的な71KDタンパク質で免疫したモルモットを、細胞媒介免疫応答が発生したか否かを評価するために、10mgの材料で皮膚試験した。次いで、コントロール動物および71KD免疫モルモットを、実施例４において詳述したようにエアロゾル化M．tub erculosisに感染させた。感染後、動物をモニターし、６ヶ月間計量した。図５のグラフは、71KD免疫動物およびバルクEP免疫動物により示された相対的に正常な重量増加に対し、偽免疫群が受けた重量減少を対比している。データは、各群について平均重量±SEである。同じ動物に対する死亡曲線を図６のグラフに示す。本研究についての絶対死亡率を以下の表Ｋにおいて報告する。重量減少曲線および死亡率の両方とも、本発明の主として豊富な細胞外タンパタ質が、予防性免疫応答を付与することを明確に示している。これは、非免疫動物の100％がモニタリング期が終わる前に死亡したという事実によって強調される。実施例１０エアロゾル化M．tuberculosisでの71KD免疫モルモットのチャレンジ前実施例の結果を検証し、例示的な主要な細胞外タンパク質の投与が動物において防御免疫応答を付与し得ることを示すために、同様の実験を行った。この実験において、再度、モルモットを、SAF中で71KD細胞外タンパク質100mgで、３週間あけて、３回免疫した。コントロールモルモットを、SAF中緩衝液で偽免疫した。最後の免疫から３週間後、動物をエアロゾル化M．tuberculosisでチャレンジし、13週間、毎週、計量した。６匹のモルモット各群についての平均重量±SE を算定し、図７においてグラフ表示する。この曲線は、偽免疫動物がモニタリング期にわたって相当量の重量を減少し、一方、免疫動物は、かなり一貫した体重を維持したことを示す。体重の減少または「消耗」は、結核の伝統的な副作用の１つであるので、これらの結果は、免疫動物における結核菌の成長および増殖が本発明の例示的なワクチンによって阻害されたことを示している。単離された形態での豊富な細胞外産物でのワクチン接種により、防御免疫がモルモットにおいて発達したので、本発明のワクチンの種間免疫反応性を実証するために、およびモルモットモデルの有効性および利用性をさらに確証するために、実験を行った。実施例１１精製71KDタンパク質を用いるPPDポジティブヒトの細胞媒介免疫の試験例示的な71KDの主として豊富なタンパク質に対するヒト免疫応答の細胞媒介成分を評価するために、このタンパク質に対するPPDポジティブ個体およびPPDネガティブ個体由来の末梢血リンパ球の増殖を、上記実施例４で報告したような標準リンパ球増殖アッセイにおいて研究した。ポジティブPPD（すなわちツベルクリン）応答は、M．tuberculosisに対する以前の曝露の指標であるとして、当該分野において周知である。増殖応答および対応する［³H］チミジンの取り込みを２日目および４日目に測定した。これらの研究についてのデータを図８Ａおよび８Ｂに示す。図８Ａは、２日後の種々のレベルの71KDに対する応答を示し、一方、図８Ｂは、４日目での同じ応答を示す。図８Ａおよび８Ｂに示されるように、PPDポジティブ個体の平均ピーク刺激指数は、PPDネガティブ個体よりも、71KDタンパク質に対して２倍高く、PPDに対して３倍高かった。PPDポジティブ個体間では、例示的な71KDタンパク質に対するピーク刺激指数とPPDに対するピーク刺激指数との間には線形相関があった。このことは、強い細胞媒介応答が、M．tuberculosisに以前に曝露されたヒトにおいて、最も優勢なまたは主として豊富なM．tuberculosis細胞外産物によって刺激されることを実証する。このデータは、モルモットで見られた反応性プロフィールに相当し、感染に対し、他の哺乳動物被験体に対する本モルモットモデルの適用を確証する。従って、以前に検討した30KD例示タンパク質と同様に、主として豊富な71KD細胞外産物に対する強い免疫応答の発達は、71KD産物もまたヒトにおいて細胞媒介免疫を刺激するのに有効であるという事実によって明らかであるように、本発明の広範な範囲を実証する。再度、本発明は、M．tuberculosis細胞外産物、または例示的な71KDタンパク質の使用に制限されないことを強調すべきである。むしろ、本発明の教示は、実施例で実証されるように、任意の主として豊富な細胞外産物に適用可能である。主として豊富なM．tuberculosis細胞外産物の組み合わせが同様に防御免疫を提供するか否かを突き止めるために、さらなる研究を行った。一般に、これらの研究は、SAF中M．tuberculosisの５つの精製細胞外タンパク質の組み合わせを含む種々の投与量のワクチンで、３または４週間あけて、３回、皮内または皮下のいずれかで免疫したモルモットを使用した。免疫手順のために使用した最初のタンパク質組み合わせ（組み合わせＩと表記）は、実施例２に記載のプロトコルに従って精製した71KD、32A KD、30KD、23KD 、および16KDのタンパク質で構成されていた。この組み合わせは、M．tuberculo sis培養上清中に通常存在する総細胞外タンパク質の60％までを含むと考えられる。組み合わせＩにおける使用について選択されたこれらのタンパク質を、図２中のアスタリスクで同定する。100μg、20μg、または２μgの各タンパク質を含む組み合わせＩワクチンは、アジュバントSAFで皮内投与した。各タンパク質の2 0μgを含む組み合わせＩワクチンもまた、同様の実験において皮下投与した。ネガティブコントロールモルモットを、同じスケジュールで等容量のSAFおよび緩衝液で偽免疫し、一方、ポジティブコントロールをSAF中で実施例１からの120μ gのバルク細胞外タンパク質調製物を使用して免疫した。全ての注射容量を、緩衝液を使用して標準化した。実施例１２組み合わせＩワクチンでのチャレンジに対する組み合わせＩ免疫モルモットの応答主要な細胞外産物の組み合わせＩ混合物でワクチン接種した後に動物が測定可能な免疫応答を発達させたかを決定するために、皮膚過敏性アッセイを行った。モルモットの背中を剃り、1.0μgおよび10.0mgの、５つの精製細胞外タンパク質の同じ組み合わせで皮内注射した。10.0mgの緩衝液をコントロールとして使用し、全ての注射を0.1mlの総容量を使用して行った。皮膚試験部位での紅斑および硬化の直径を、注射24時間後に測定した。測定の結果を以下の表Ｌに示す。データを再度、従来の方法を用いて決定されるように、その群についての平均測定値±標準誤差（SE）によって報告する。ND は、実験のこの特定の局面が行われなかったことを示す。データは、組み合わせＩ細胞外タンパク質に対する強い細胞媒介免疫応答が、ワクチン接種動物によって生成されたことを実証する。免疫モルモットは、コントロール動物よりほぼ３倍大きい紅斑および硬化測定を示す。実施例１３エアロゾル化M．tuberculosisに対する組み合わせＩワクチンの免疫防御分析最後の免疫化から３週間後、先の過敏性アッセイのために使用したモルモットを、エアロゾル化M．tuberculosis、Erdman株でチャレンジし、10週間の間、毎週、計量した。このエアロゾルチャレンジは、実施例４のプロトコルを使用して行った。組み合わせＩの100μgの主要な細胞外産物で免疫した６匹の動物を、等しい大きさのポジティブコントロール群およびネガティブコントロール群と共に、エアロゾル化M．tuberculosisで同時にチャレンジした。ポジティブコントロールは、SAF中120μgのEPで３回免疫した観察期間が終わる前に死亡したモルモットを解剖し、全体の結核病巣の形跡について試験した。このような病巣は、研究の間に死亡した全ての動物において見出された。エアロゾルチャレンジ後の平均重量プロフィールにおける免疫動物とコントロール動物との間の差異を、反復測定の分散分析（ANOVA）により解析した。チャレンジ後の生存における免疫モルモットとコントロールモルモットとの間の差異を両側Fisher精度検定(two-tailed Fisher exact test)によって解析した。データは、６匹のモルモットの各群についての平均重量±標準誤差（SE）である。チャレンジ後の毎週の重量測定の結果を図９に示す。細胞外産物の組み合わせで免疫したモルモットに比較して、偽免疫動物は、総体重の15.9％を減少した。ポジティブコントロールの重量は、５つの精製細胞外タンパク質の組み合わせで免疫した動物の重量と類似した。体重を、チャレンジ直前に標準化した。組み合わせＩと偽免疫コントロールで免疫した動物間の差異は、反復測定ANOVAによってｐ＜0.0000001で非常に有意であった。死亡率をチャレンジ10週半後に決定した。３つの偽免疫動物の全てが、チャレンジ後10週と10週半の間で互いに３日以内に死亡した。本実験の死亡結果を以下の表Ｍに示す。重量モニタリング研究の結果後、生存動物を高炭酸ガスにより屠殺し、各動物の右肺および脾臓を実施例５のプロトコルを用いて生存M．tuberculosisについてアッセイした。計数の結果（実験の最後の週に死亡した３匹の動物を含む）を、以下の表Ｎに、平均コロニー形成単位(CFU)±標準誤差(SE)によって示す。精製タンパク質の組み合わせで免疫した動物の肺における結核菌の濃度と偽免疫動物の肺における結核菌の濃度とのlog差異は、1.4であった。一方、脾臓における結核菌のlog差異は、0.9であった。これを比較すると、解剖での全体の検査に対して、免疫動物は、偽免疫動物に比較して、結核に関係する肺を顕著に減少させた。実施例１のバルク細胞外調製物（EP）で免疫したポジティブコントロール動物は、精製細胞外タンパク質の組み合わせＩ混合物で免疫した動物よりも肺において0.7log多い結核菌、そして脾臓において0.5log多い結核菌を示した。実施例１４皮内および皮下送達による低用量での組み合わせＩワクチンの免疫防御分析実施例１３は、組み合わせＩタンパク質が、100μgの各タンパク質（30＋32A ＋16＋23＋71）で、４週間あけて、３回、皮内免疫した動物において、免疫防御を実証したが、より低い用量の組み合わせＩタンパク質（詳細には、20μgまたは２μgの各タンパク質）の免疫防御能を実証するために、代替の実験を行った。実施例１３におけるように、モルモット（１群当たり６匹の動物）を、SAF中で皮内で、３週間あけて、４回、組み合わせＩタンパク質（30＋32A＋16＋23＋7 1）で免疫した。動物は、免疫化毎に20μgの各タンパク質、または免疫化毎に２ μgの各タンパク質を受容した。コントロール動物を以前のプロトコルを用いて偽免疫した。３週間後、動物をエアロゾル化M．tuberculosisでチャレンジし、９週間、毎週重量を測定した。免疫動物は全て実験の終わりまで生存したが、一方、１匹の偽免疫動物は、実験が終わる前に死亡した。以下の結果が示すように、実施例１３の５倍低い用量、および50倍も低い用量さえ、エアロゾルM．tuber culosisから免疫動物を防御し、皮内および皮下経路の両方によるその送達は有効であった。 20μgの各組み合わせＩタンパク質で免疫したモルモットと比較して、偽免疫動物は、９週間の実験の間に総体重の12％を減少した（重量をチャレンジ直前に標準化した）。２μgの各組み合わせＩタンパク質で免疫したモルモットと比較して、偽免疫動物は、その標準化された総体重の11％を減少した。従って、低用量の組み合わせＩタンパク質で皮内免疫したモルモットは、M．tuberculosisでのエアロゾルチャレンジ後の体重減少に対して防御された。同様に、低用量の組み合わせＩタンパク質で皮内免疫したモルモットはまた、脾臓に対するM．tuberculosisの汎発と関連した巨脾腫に対して防御された。表Ｏに示されるように、20μgまたは２μgの各組み合わせＩタンパク質で免疫した動物がそれぞれ平均して4.6±1.2gおよび4.0±0.8g（平均±SE）の重量の脾臓を有したのに対し、偽免疫動物は、平均して9.6±1.8g（表1）、すなわち、２倍以上である重量の脾臓を有した。低用量の組み合わせＩタンパク質で皮内免疫したモルモットはまた、その脾臓においてより低いCFUのM．tuberculosisを有した。表Ｐに示すように、偽免疫動物に比較したとき、20μgまたは２μgの各組み合わせＩタンパク質で免疫したモルモットは、その脾臓においてそれぞれ平均して0.6および0.4log低いCFUを有した。さらに、組み合わせＩタンパク質で皮下免疫したモルモットもまた、重量減少、巨脾腫、および脾臓におけるM．tuberculosisの増殖に対して防御した。実施例１４に記載の同じ実験において、モルモットをまた、皮内ではなく皮下で、20 μgの組み合わせＩタンパク質で、３週間あけて４回、免疫した。これらの動物は、20μgの組み合わせＩタンパク質で皮内免疫した動物とほぼ同程度にチャレンジから防御された。実施例１５組み合わせＩおよび組み合わせIIでのチャレンジに対する組み合わせＩおよび組み合わせII免疫モルモットの応答主として豊富なM．tuberculosis細胞外産物の他の組み合わせが、同様に防御免疫を提供するか否かを突き止めるために、さらなる研究を行った。ある研究は、２つの組み合わせ−組み合わせＩ（71、32A、30、23、および16）および組み合わせII（32A、30、24、23、および16）を含むワクチンで免疫したモルモットを利用した。組み合わせIIは、M．tuberculosis上清に通常存在する総細胞外タンパク質の62％までを含むと考えられる。動物（１群当たり６匹）を、SAF中、組み合わせＩまたはII中の各タンパク質100μgで、３週間あけて、４回免疫した。ネガティブコントロール動物は、同じスケジュールにおいて等容量のSAFおよび緩衝液で偽免疫した。実施例１２におけるように、動物を、動物がワクチン接種後に測定可能な免疫応答を発達させたかどうかを決定するために、皮膚遅延型過敏性について試験した。組み合わせIIで免疫した動物は、組み合わせIIでの皮膚試験に応じて、16.8 ±1.3mm（平均±SE）紅斑および12.8±1.2mm硬化を有し、一方、偽免疫動物では、組み合わせIIに応じてほんの1.3±0.8mm紅斑および0.3±3mm硬化を有した。従って、組み合わせIIで免疫した動物は、コントロールよりも、12倍より大きい紅斑および40倍より大きい硬化を有した。比較のために、組み合わせＩで免疫した動物は、組み合わせＩでの皮膚試験に応じて、21.3±2.0mm紅斑および15.8±0.1 mm硬化を有したが、一方、偽免疫動物は、組み合わせＩに応じて、ほんの6.4±0 .8mm紅斑および2.6±0.7mm硬化を有した。従って、組み合わせＩで免疫した動物は、コントロールよりも、３倍より大きい紅斑および６倍より大きい硬化を有した。組み合わせIIタンパク質についてのコントロールからの差異は、組み合わせＩタンパク質についてのコントロールからの差異よりもずっと大きかった。同じ実験において、より低い用量の組み合わせIIタンパク質で免疫した動物（ 100μgに対して、20μgの各タンパク質）もまた、組み合わせIIに対して強い皮膚過敏性を生じさせた。それらは、組み合わせIIに応じて、21.0±2.0mm紅斑および15.3±0.9mm硬化を有し、一方、偽免疫動物ではほんの1.3±0.8mm紅斑および0.3±0.3mm硬化を有した（上述と同様）。従って、より低い用量の組み合わせ IIタンパク質で免疫した動物は、コントロールよりも、16倍より大きい紅斑および50倍より大きい硬化を有した。この差異は、より高い用量の組み合わせIIタンパク質で免疫した動物にとってよりもずっと大きかった。実施例１６エアロゾル化M．tuberculosisに対する組み合わせＩおよびIIワクチンの免疫防御分析最後の免疫化から３週間後、先の過敏性アッセイのために使用したモルモットを、実施例１３におけるように、エアロゾル化M．tuberculosis、Erdman株でチャレンジし、７週間、毎週、計量した。実施例１３におけるように、６匹の動物を各群に入れた。チャレンジ後の最初の７週間の間、偽免疫動物は、平均して19 .5ｇ減少した。対照的に、組み合わせII（100μg各タンパク質）で免疫した動物は、52.4ｇ増加し、より低い用量（20μg各タンパク質）で組み合わせIIで免疫した動物は、平均して67.2g増大した。対比のために、組み合わせＩで免疫した動物は68g増大した。従って、組み合わせII（100μg）で免疫したモルモットと比較して、偽免疫動物は、その総体重の11％を減少した。より低い用量（20μg ）で組み合わせIIで免疫したモルモットに比較して、偽免疫動物は、その総体重の14％を減少した。組み合わせＩで免疫した動物に比較して、偽免疫動物はまた、その総体重の14％を減少した。実施例１７同じワクチンまたはその成分のチャレンジに対する組合せIIIからXIIで免疫されたモルモットの応答さらなる実験を、M.tuberculosisのきわめて大量な細胞外産物の、効果的な種々の組合せを示すために実施した。これらの研究では、Hartleyタイプのモルモットを、実施例２のように、精製された２つ以上のきわめて大量な細胞外産物の組合せを含むワクチンにより皮内免疫した。この精製された細胞外産物を、SDS- PAGEにより決定されたこれらの見かけ上の分子量を使用して同定した。モルモットを、以下のきわめて大量な細胞外産物の組合せで免疫した。それぞれの組合せワクチンは、100mgのそれぞれ列挙されたタンパク質を含む。組合せワクチンを容量的に調整し、そしてアジュバントSAFで内皮に注射した。前述したように、モルモットを、３週間おきに４回免疫した。皮膚高感受性アッセイを、動物が組合せIII〜XIIのワクチン化後、計測可能な免疫応答を発達するかどうかを決定するために実施した。６匹からなる群のモルモットの背中を剃り、そして同じ組合せの精製した細胞外産物で免疫されるべきモルモットに皮内注射した。このチャレンジのために、この組合せの10mgの各タンパク質を注射した。全ての注射を0.1mlの全量を使用して実施した。偽免疫化コントロール（これはSAFのみで免疫される）もまた、III〜XIIの組合せで、再度それぞれの組合せの10mgの各タンパク質を使用して皮膚試験した。紅斑の直径および皮膚試験での硬化を実施例３に記載されるように、注射の24時間後に計測した。これらの計測の結果を、以下の表Qに示す。データを、伝統的方法を使用して決定した、群±標準誤差(SE)についての平均計測値を再び示す。結果は、強力な細胞媒介免疫応答が、それぞれの精製細胞外タンパク質の組合せに対して産生されたことを明確に示す。免疫されたモルモットは少なくとも２回紅斑を示し、そして通常ではコントロールの全ての組合せの３倍またはそれ以上であった。さらに、免疫されたモルモットは、コントロールの全ての組合せの少なくとも３倍の硬化を示した。実施例１８エアロゾル化M.tuberculosisに対する組合せIII〜XIIの免疫防御分析精製細胞外産物のこれらの例示的な組合せの予防有効性を示すために、組合せ III〜XIIで免疫したモルモットを実施例４のプロトコルを使用して最終免疫から３週間後にM.tuberculosisでチャレンジした。依然の結果と一致して、組合せIII〜XIIで免疫したモルモットは、チャレンジ後の死に対して全て防御されたことである。チャレンジ後の４週間後、組合せIV 〜XIIで免疫した群の０匹の動物、および組合せIIIで免疫した群の６匹の動物のうちの１匹（17％）と比較すると、偽免疫動物の６匹のうち２匹（33％）が死んだ。チャレンジ後10週間後では、組合せIXおよびXIIで免疫した群の動物の０匹の死および組合せIII、IV、V、VI、X、およびXIで免疫した群の動物の６匹中１匹の死(17％)、組合せVIIIで免疫した動物の５匹中１匹の死（20％）、および組合せVIIで免疫した動物の６匹中２匹の死(33％)と比較して、50％の偽免疫動物が死んだ。観察期間終了前に死んだモルモットを解剖し、そして結核障害全ての証明について試験した。研究を満了した動物全てについて障害を見出した。死亡率の研究のまとめに引き続いて、生存した動物を過炭酸症により屠殺し、そして各動物の脾臓を、実施例５のプロトコルを使用してM.tuberculosisについてアッセイした。この結果を、偽免疫動物由来の対数減少を伴うコロニー形成単位(CFU)に関して、以下の表Rに示す。CFU値の隣のアスタリスク（＊）は、各群の１匹の動物の脾臓の数がゼロであることを示す。算出の目的上、ゼロの数は、脾臓あたり10³CFUまたは3logとしてあつかった。組合せIII、IV、VI、VII、IX、X、XI、およびXIIは、平均で、脾臓において、偽免疫化コントロールよりも少なくとも0.5log少ないM.tuberculosisの少数のコロニー形成単位を有した。詳細には、組合せIVおよびVIIは特に効果的であることを示し、10個の粗雑な因子によりコロニー形成単位の平均数を減少させた。組合せVおよびVIIIで免疫した動物は、平均で、脾臓で、偽免疫化コントロールよりも0.3対数および0.1対数少ないコロニー形成単位(CFU)をそれぞれ有した。本発明の教示により免疫化された動物でのコロニー形成単位の劇的な減少は、本発明の免疫防御効果を再度示す。実施例１９組合せXIIIでのチャレンジに対する組合せXIIIの３つの異なる用量で免疫されたモルモットの応答本発明の効率および範囲をさらに規定するため、ならびに精製細胞外産物のさらなる組合せの有効性を示すために、モルモットを、別のワクチン接種用量を使用する前に免疫した。具体的には、３つのきわめて大量な細胞外産物の、50mg,1 00mgおよび200mgの別の組合せを組合せXIIIとして、そして30KD、32(A)KD、および16KDのタンパク質を含んで同定する。先行する実施例のように、動物の群を、 SAF中の組合せXIIIの別の用量を用いて皮内に３週間おきに４回免疫した。皮膚反応高感受性アッセイを、動物がワクチン接種後に計測可能な免疫応答性を発達させるか決定するために実施した。動物の背中を剃り、そして10.0mgのそれぞれの精製細胞外産物を含む組合せXIIIを用いて皮内注射した。全ての注射を全量0.1mlを使用して実施した。偽免疫化コントロールもまた同用量の組合せXII Iで皮膚試験した。皮膚試験部位の紅斑の直径および硬化を、注射の24時間後に計測した。結果を、伝統的方法を使用して決定した、群±標準誤差(SE)についての平均計測値について、以下の表Ｓに示す。再度、これらの結果は、組合せXIIIに対する強力な細胞媒介免疫応答が、３つの用量の組合せXIIIそれぞれで免疫された動物で産生されたことを明確に示す。この免疫化動物は、コントロールの３倍に対して約２倍の紅斑を示した。より顕著には、免疫化動物は、すべての場合で最小限の応答しか示さないコントロール動物に対して少なくとも35倍の硬化を示した。実施例２０エアロゾル化M.tuberculosisに対する３つの異なる用量の組合せXIIIの免疫防御分析種々の用量での本発明のワクチンの防御的免疫性局面をさらに示すために、先行の皮膚過敏性アッセイに使用した免疫化モルモット（１群あたり６匹）を、最終免疫の３週間後、エアロゾル化M.tuberculosisでチャレンジした。エアロゾルチャレンジを実施例４で詳細に記載されるプロトコルを使用して実施した。12の偽免疫化動物の１つのコントロール群を同時にチャレンジした。チャレンジ後の毎週の体重測定の結果を図10に図示し、そして３つの用量の組合せXIIIの各々で免疫したモルモットは体重減少から防御されたことを示す。より高用量の組合せXIII（100mgおよび200mg）で免疫された動物は、体重の正味の増加を実際に示し、そしてより低用量（50mg）で免疫された動物は、比較的少ない体重減少をそれぞれ示した。対照的に、偽免疫化動物はチャレンジ直後の週において全体重の約22％が減少し、そして観察終了の10週間に渡っての平均減少が 182gだった。以下の表Ｕは、チャレンジ後での平均体重で決定された免疫化動物およびコントロール動物についての体重変化のパーセントを示したものであり、チャレンジ開始での平均体重を引き、そしてその結果をチャレンジ開始での平均体重で割ったものである。同様に、防御のパーセントを、免疫化動物の増量または減量の平均パーセントからコントロールの減量の平均パーセントを引くことにより決定した。表Ｕは、偽免疫化動物が、免疫化動物と比較して、監視期間に渡ってかなりの量の体重を失った（18％〜29％）ことを示す。図10は、10週間の監視期間に渡って毎週でプロットした、各群の免疫化動物対偽免疫化動物の正味の体重減少の図式例を提供する。体重の損失として、または「消耗」は、結核の古典的な副作用であり、これらの結果は、免疫化動物による結核菌の成長および増殖が、本発明の３つの異なる用量の例示的な組合せワクチンにより阻害されることを示す。実施例２１組合せXIV〜XVIIIでのチャレンジに対する組合せXIV〜XVIIIの免疫防御分析本発明の範囲、およびその教示により処方され得る広範で効果的なワクチンをさらに示すために、５つのさらなる組合せワクチン（組合せXIV〜XVIII）をモルモットで試験した。SDS-PAGEを使用して決定された精製細胞外産物の見かけ上の分子量により同定された、それぞれの組合せワクチンの組成物を以下に示す。新たな組合せワクチンおよび適切なコントロールに加えて、組合せＩもまたこの実験のシリーズにおいて使用した。モルモットを、組合せXIVまたはXVの50mg の各タンパク質、および組合せI、XVI、XVIIおよびXVIIIの100mgの各タンパク質（全てSAFアジュバント内）で皮内免疫した。この動物を、各注射を３週間おきに、全部で４回免疫した。皮膚過敏性アッセイを、動物が、前記で議論したプロトコルを使用したワクチン接種後の計測可能な免疫応答性を発達させるかどうかを決定するために実施した。モルモットの背中を剃り、そして免疫化されるモルモットに、精製細胞外産物の同じ組合せを皮内注射した。それぞれのチャレンジについて、10mgのそれぞれのタンパク質を含む適切な組合せワクチンを注射した。全ての注射を、0.1ml の全量を使用して実施した。偽免疫化コントロールをまた、同用量のそれぞれの組合せで皮膚試験した。皮膚試験部位の紅斑の直径および硬化を注射の24時間後に計測した。これらの計測の結果を以下の表Ｖに示し、伝統的な方法を使用して決定されるように群±標準誤差(SE)についての平均計測値を報告する。これらの結果は、組合せXIV〜XVIIIに対して、および以前のように組み合わせ Iに対して、強力な細胞媒介免疫応答を産生したことを示す。免疫化動物はコントロールの２倍の紅斑を示した。さらにより顕著に、免疫化動物は、すべての場合で最小限の応答しか示さない偽免疫化動物よりも少なくとも10倍の硬化を示した。実施例２２エアロゾル化M.tuberculosisに対する組合せXIV〜XVIIIおよび組合せIの免疫防御分析実施例21の組合せワクチンの免疫反応性を明らかにするため、そして感染性結核に対するこれらの適用性を示すために、先行の皮膚過敏性アッセイをに使用した免疫化モルモットを、最終免疫の３週間後にエアロゾル化M．tuberculosisでチャレンジし、そして実施例４のプロトコルを使用して監視した。12の偽免疫化動物の１つのコントロール群（実施例20で使用されるものと同じ）を同様にチャレンジした。これらのチャレンジの結果を図11に図式的に示し、そして以下の表Ｗに直接的に示す。パーセント重量変化を、チャレンジ後での平均体重を取り、チャレンジ開始時の平均体重を引き、そしてその結果をチャレンジ開始時の平均体重で割ることにより決定した。同様に、防御のパーセントを、免疫化動物の体重の増加または減少の平均パーセントから、コントロールの体重の平均パーセントを引くことにより決定した。表Ｗに示されるように、それぞれの組合せワクチンで免疫されたモルモットは、体重減少から防御された。偽免疫化動物は、全体の合わせた体重の約22％を失った。対象的に、組合せワクチンの予防効果は、テスト群の１つについて体重の増加を実際に生じ、そして他では体重損失の量が減少した。特に、組合せXIVで免疫した動物は３％の体重の増加を示し、一方、他の組合せで免疫した動物は合わせた組合せた全体重の４％〜15％のみの損失であった。これらの結果を図11に示す。これはエアロゾルチャレンジ後のそれぞれの動物の群の正味の体重の増加または減少を決定するために、１週間の体重をプロットしたものである。図11に示される免疫化動物と偽免疫化コントロールとの間の正味の体重減少の統計学的な有意差は、本発明のワクチンの組合せによって産生される免疫予防応答をさらに提供する。実施例２３３つの異なるアジュバントで免疫されたモルモットの細胞媒介免疫本発明のワクチン処方物の広範な適用性および汎用性をさらに示すために、異なるアジュバントを使用して免疫原性研究を行なった。特に、３つの異なる免疫原、精製された30KDのタンパク質、組合せI（30、32A、16、23、71）、および組合せXIII(30、32A、16)を、３つの異なるアジュバント、Syntex Adjuvant Formu lation I(SAF)、不完全フロイントアジュバント(IFA)およびモノホスホリル脂質Ａ含有アジュバント(MPL)を使用してそれぞれ調製した。このようなアジュバントは、免疫原とともに投与する場合、生物の免疫応答を増強させることが公知である。モルモットを、それぞれ３つの異なるアジュバント処方物の組合せIおよびXII Iおよび約100mgの精製30KDタンパク質を含む、100mgのそれぞれのタンパク質で皮内免疫した。このモルモットを３週間おきに全３回の注射によりそれぞれの処方物で免疫した。免疫化後、皮膚過敏性アッセイを、モルモットが計測可能な免疫応答を発達させたかどうか決定するために実施した。モルモットの背中を剃り、免疫化されるモルモットに同じ免疫原を皮内注射した。チャレンジについては、組合せIおよびXIIIまたは10mgの精製30KDタンパク質を全容量100mlで注射した。偽免疫動物を、３つのアジュバントのうちの１つでワクチン接種し、同じアジュバントを含むそれぞれの免疫原処方物で皮膚試験した。皮膚試験部位の紅斑の直径および硬化を注射の24時間後に計測した。これらの計測結果を、以下の表Xに示した。先に議論したデータを、適用される統計学的技術を使用して決定されたように、群±標準誤差(SE)についての平均計測値について報告する。表Ｘで示されるデータに示されるように、本発明の組合せワクチンおよび精製細胞外産物は、異なるアジュバントで処方される場合、場合の強力な細胞媒介免疫原性応答を提供する。さらに、同じ免疫原について提供された３つのアジュバントの各々は、それぞれの期待された免疫原に応答する。一般には、硬化が、コントロール動物で計測されたものの約4〜6倍ほど大きいと同時に、免疫化したモルモットは、偽免疫化モルモットの約7〜10倍の直径の紅斑を示す。本発明の、異なるアジュバントの組合せにおける強力な免疫原性応答を刺激する能力は、ワクチンの最適化を促進する。つまり、本明細書の教示に従う効果的なワクチン処方物を産生するために使用されるアジュバントは、二次的な基準（例えば、安定性、副作用の欠失、保存の費用および容易さ）の考慮において広範に基づいて選択され得る。これらおよび他の基準（免疫応答の刺激には直接的には関連しない）は、相対的に原始の条件下での広範な使用についてのワクチン処方物を開発する場合、とりわけ重要である。実施例２４組合せXIX〜XXVIIIでのチャレンジに対する組合せXIX〜XXVIIIの免疫防御分析広範な範囲の本発明は、10個のさらなる組合せワクチン、組合せXIX〜XXVIII を使用して免疫応答の産生を通じてさらに示した。新しい組合せワクチンおよび適切なコントロールに加えて、組合せIVおよびXIIIもまたモルモットでの免疫応答を刺激するためのポジティブコントロールとして使用した。SDS-PAGEを使用して決定された精製細胞外産物の見かけの分子量により同定された、それぞれの組合せワクチンの組成物を以下に与える。モルモットを、３週間間隔の注射で、合計４回免疫した。動物を免疫するために使用されたそれぞれの組合せワクチンは、SAFアジュバント中100mgの各タンパク質からなり、0.1mlの全容量を提供した。実施例３で議論されるプロトコルを使用して、動物が、選択された組合せワクチンのワクチン接種後に発達した計測可能な免疫応答を有するかどうか決定するために、皮膚過敏性アッセイを実施した。モルモットを背中剃り、そして免疫に使用された精製細胞外産物の同じ組合せを皮内注射した。動物をチャレンジするために、10mgの各タンパク質から成るタンパク質の組合せを使用した。偽免疫化コントロールもまたそれぞれの組合せの同じ用量で皮膚試験した。実施例３のように、皮膚試験部位の紅斑の直径および硬化を注射の24時間後に計測した。これらの計測結果を、以下の表Ｙに示した。動物の群±標準誤差についての平均計測値について報告する。表Ｙに示す結果は、強力な細胞媒介免疫応答が、同じ免疫原でチャレンジした場合に、組合せXIX〜XXVIIIで生じたことを明快に示す。先のように、強力な細胞媒介免疫応答はまた、組合せIVおよびXIIIにより誘発された。免疫したモルモットにより示された紅斑は、対応する偽免疫コントロール動物において誘発された反応の少なくとも2倍であり、そして一般に４倍以上で誘発された。同様に、免疫された動物により示された硬化は、非免疫コントロールにおける硬化の少なくとも２倍であり、そして一般に３〜４倍大きかった。本発明の教示に従って免疫された動物において生じた、実質的にさらに強い免疫応答は、本発明の組合せワクチンの免疫防御実施可能性を再度例示する。当業者はまた、本発明のワクチンおよび方法のさらなる利点を認識する。例えば、高度に精製された分子種の個々の化合物または選択された組合せは、細菌全体またはその成分ではなく、本ワクチンに用いられるので、本発明のワクチンは、先行技術の弱毒化細菌ワクチンまたは殺傷細菌ワクチンと比較した場合に毒性応答を誘発する可能性が相当に少ない。さらに、本発明の分子ワクチンは、免疫無防備状態の個体の生命を脅かさない。実際、本発明の組成物は、治療的に用いられて、感染個体における病原因子に対して指向された免疫応答を刺激し得る。主として豊富な細胞外産物またはそれらの免疫原性アナログの選択的使用はまた、細胞内細菌の病因を増加させ得るオプソニン作用性（opsonizing）体液応答の発達を予防する。本発明により生じる防御免疫は、未結合のタンパク質に対するので、任意のオプソニン応答は、寄生細菌の促進される封入ではなく、単に主として豊富な細胞外産物の食作用および破壊を生じる。さらに、精製された細胞外産物の選択的使用は、免疫原性因子の宿主認識に基づく、広範に使用されるスクリーニング技術および制御技術の使用を排除する応答を生じる可能性を低減させる。先行技術のワクチンとは異なり、スクリーニング試験は、病原体により発現されるが本発明に従って作製されるワクチンに含まれない免疫反応性分子を用いて依然として行われ得る。このような免疫原性決定基の使用は、適切な測定が行われるのを可能にする標的病原体に暴露された個体において応答を誘発するのみである。本発明の別の利点は、先行技術のワクチンの弱毒細菌および細菌成分とは対照的に、精製された細胞外産物が、容易に多量に入手され、そして当該分野で周知の技術を用いて直ちに単離されることである。本発明の免疫反応性産物は、目的のほとんどの生物について、周囲の培地中へと自然に細胞外放出されるので、細胞内夾雑物および細胞破片の除去は、単純化される。さらに、ほとんどの顕著なまたはきわめて豊富な細胞外産物またはその免疫原性アナログは、所望の免疫応答を刺激するために用いられるので、採取可能な産物の発現レベルまたは培養濃度は、一般に、ほとんどの生成系において上昇する。従って、どのような形態の産物が用いられたとしても、所望の産物の大規模単離が、クロマトグラフィーまたは限外濾過のような日常的な生化学的手順により容易に達成される。本発明において用いられる免疫原性決定基のこれらの固有の属性および分子的特徴は、大規模で使用するための一貫した、標準化された、高品質の組成物の生成を大いに促進する。あるいは、標的病原の最も顕著な、または主として豊富な細胞外産物の免疫原性特性に基づく精製された分子化合物の使用はまた、本発明の免疫活性ワクチン成分の大規模合成生成を比較的容易にする。例えば、目的の細胞外産物またはその免疫原性アナログは、組換えDNA技術を用いて非病原性宿主細菌にクローン化され得、そして安全に採取され得る。当該分野で周知の分子クローン化技術は、 Escherichia coliのような宿主細菌における挿入のために選択された高発現ベクターにおいて、目的の細胞外産物、それらのホモログまたは任意のそのセグメントに対応するDNAを単離および発現するために用いられ得る。例示的な技術は、以下の文献に見出され得る：本発明は、宿主細胞を用いて、M．tuberculosis 110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KDタンパク質、45KDタンパタ質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパタ質、23.5KDタンパク質、23 KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群から選択される主として豊富な細胞外産物を生成するためのプロセスを含む。本発明の細胞外タンパク質を発現するための実際に実証された好ましい方法の例は、以下の通りである：実施例25 組換え30KDタンパク質の発現成熟30KDタンパク質の発現のために、成熟タンパク質の開始フェニルアラニンが、pET22b（Novagen，Madison，WI）におけるpelBリーダー配列のNcoI部位またはカルボキシ末端に人工的に挿入されたグリシン残基に融合されるように、30 KDタンパク質をコードする遺伝子を操作した（図14を参照のこと）。このストラテジーは、成熟30KDタンパタ質が容易に放出され、そして４時間にわたって比較的豊富な組換え30KDタンパク質の発現を導き得る融合分子を提供した。その後、組換えタンパク質の発現は、プラトーに達した。組換え分子の発現は、細菌の培養に深刻な有害な効果を発揮せずに８時間まで継続した。１リットルのE．coli からの代表的な収量は、総細胞タンパク質のほぼ25％に達する、約50mgであった。全長または短縮型で組換え30KDタンパク質の発現を達成するために、pET22bにおける構築物を、1mMイソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）での誘導の際に、E.coli BL21(DE3)pLysSにおいて発現させた。誘導された培養物のサンプルを、１時間の間隔で8時間まで採取し、そして培養上清および細胞ペレットのアリコートを、12.5％変性ポリアクリルアミドゲルに流し、そしてクーマシーブリリアントブルーＲで染色した。組換えタンパク質を、全てのクロマトグラフィー工程が緩衝液に対する8M尿素の添加を含むこと以外は、Horwitz，M.A.，L ee，B.-W.E.,Dillon，B.J.,およびHarth,G.(1995)Protective immmunity agains t tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis．Proc Natl Acad Sci USA 92:1530-1534に記載されるように精製した。精製された組換えタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水に対して透析し、そして可溶性のままであった。成熟30KDタンパク質を、それ自体のリーダーペプチドまたはプラスミドにコードされるpelBリーダーペプチドのいずれかとともにpET22bベクターにおいて発現させた。細胞ペレットの電気泳動の結果を、図15に示す。レーンＡおよびＢは、 pelBリーダーDNA配列に融合された成熟30KDタンパク質遺伝子を有するpET22bベクター(A)および全長30KDタンパク質遺伝子を有するpET22bベクター(B)を保有する細菌のIPTG誘導の際のクーマシー染色したタンパク質抽出物を示す。レーンC は、参照としてM.tuberculosis培養濾液から単離された成熟30KDタンパク質を示す。レーンＤ、Ｅ、およびＦは、抗30/32A-BKD複合体特異的抗体でプローブしたＡ、Ｂ、およびＣと同じタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。レーンＧ（pET22bベクター単独を保有するE.coli培養物からのタンパク質抽出物）を、同じ抗体でプローブした。全長30KDタンパク質および成熟30KDタンパク質の位置は、それぞれ、30Wおよび30Mとマークし、そしてこれらの組換えタンパク質を、それらの最初の５または７個のＮ末端アミノ酸により、さらに同定した。左の数字は、KDでの分子量スタンダードを言及する。実施例26 Mycobacterium smegmatisおよびMycobacterium vaccaeにおいてプラスミドpSMT3 を用いる、可溶性のプロセシングされた細胞外M.tuberculosisの 30KD主要分泌タンパク質の発現本実施例は、ミコバクテリウム属におけるM.tuberculosisの30KD主要分泌タンパク質の発現および分泌を実証することに関する。本発明者らは、pSMT3プラスミド（Douglas B.Young博士，Dept．Medical Microbiology，St．Mary's Hospit al Medical School，Norfolk Place，London，W2 IPG，United Kingdom，E.coli （col El ori）およびミコバクテリウム（Mycobacterium fortuitumプラスミドp AL5000 ori）の両方の複製起点、ハイグロマイシン耐性マーカー、hsp60プロモーター（Mycobacterium bovis BCG熱ショックタンパク質プロモーター配列）、ならびにhsp60プロモーターの下流のマルチクローニング部位を有する5.7kb（キロ塩基対）のプラスミド）を用いた。発現系を、図16に模式的に示す。挿入物は、30KDタンパク質の配列を含むM.tuberculosis Erdman株からの4.7kb HindIII-BamHIゲノムDNAフラグメントからなっていた。挿入物を、E.coli DH5a のpSMT3中にクローン化し、そして組換えプラスミドDNAを、6250V/cmおよび25mF aradの設定のエレクトロポレーションにより、M.smegmatis 1-2cおよびM.vaccae R877R（National Collection of Type Cultures(NCTC)11659）に形質転換した。M.smegmatis 1-2cは、M.smegmatis mc²6の治癒単離株（cured isolate）であり、これは、Zhang，Y.，Lathigra，R.,Grabe，T.,Catty，D.,およびYoung，D., 1991，Molecular Microbiology 5(2):381-391に記載される手順によりM.smegmat is mc²6から調製されたATCC 607（アメリカンタイプカルチャーコレクション）の単細胞単離株である。M.smegmatis mc²6を、Jacobs，W.R.,Tuckman，M.，およびBloom，B.R.，1987，Nature，327:532-535に記載される手順によりATCC 60 7から単離した。1mgの組換えプラスミドDNAおよび約4×10⁹CFUのミコバクテリアを用いて、本方法は、100〜200個のハイグロマイシン耐性の形質転換体を生じた。形質転換体は、ブロス培養において安定であり、そしてM.tuberculosisの30KD タンパク質を構成的に発現し、１リットルの培養物あたり約10mgのプロセシングされたタンパク質を生じた。最も重要なことに、タンパク質は可溶性であり、発現されたタンパク質の約90％は、培養上清中に分泌された（図17を参照のこと）。図17に示す電気泳動の結果は、以下の通りに得られた。M.tuberculosisの30KD 遺伝子を有するpSMT3構築物を含む５個の組換えM.smegmatisクローンの各々からの上清液を、SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析（５個の最も右側のレーン）に供した。主要タンパク質（図17中の矢印）は、組換え成熟M.tuberculosisの30KD主要分泌タンパク質である。最も左側のレーンは、分子量スタンダード（66、45、36、29、24、20、14KD）を示す。組換えタンパク質は、29KDマーカーのすぐ上を移動する。ウェスタンブロット分析を用いて、培養上清中の主要細胞外タンパタ質が、組換え成熟M.tuberculosis 30KD主要分泌タンパク質であることを確認した。結果を図18に示す。図18では、図17の最も右側の４つのレーンに示すタンパク質を、 SDS-PAGEに供し、そしてニトロセルロース上にブロッティングした（最も右側の４つのレーン）。ブロットを、M.tuberculosis 30/32KDタンパク質複合体に特異的なウサギポリクローナル抗体でプローブした。組換えM.tuberculosis 30KDタンパク質のみが染色された（矢印）。左のレーンは、予め染色した分子量マーカー（106、80、49.5、32.5、27.5、および18.5KD）を含む。組換えタンパク質は、32.5KDの質量スタンダードと27.5KDの質量スタンダードとの間で移動する。さらに、最初の６個のＮ末端アミノ酸のＮ末端配列分析は、FSRPGLを生じ、Ｎ末端配列が成熟M.tuberculosis 30KDタンパク質のＮ末端配列と同一であることを確認した。 pET20（Novagen，Madison，WI）における２つの構築物（一方は成熟30KDタンパク質について、そして他方は32A KDタンパク質について）は、いずれのタンパク質の発現もE.coliにおいて生じることができなかった。pKK233の単離は、Aman n，E.およびBrosius,J.(1985)Gene 40:183-190に記載される。pTrc99A(Pharmaci a Biotech，Sweden)を、pKK233ベクターの代わりに用い得る。pKK233における3 つの異なる構築物（１つは全長30KDタンパク質について、１つは全長32KDタンパク質について、そして１つは成熟30KDタンパク質について）は、いずれのタンパク質の発現もE.coliにおいて生じることができなかった。成熟30KDについてのpRSET-Aにおける１つの構築物は、E.coliにおいて融合タンパク質を生じたが、この融合タンパク質を含まない30KDタンパク質は、エンテロキナーゼを用いて切断され得なかった。同様に、pTrx-Fusにおける２つの構築物（一方は、成熟30KDタンパク質について、そして一方は成熟32KDタンパク質について）は、E.coliにおいて融合タンパク質を生じ、そしてそこから、M.tuberc ulosisタンパク質はエンテロキナーゼを用いて効率的に切断され得なかった。種々の発現系の適合性のまとめを、表Ｚに示す。全ての挿入物は、32A KDタンパク質についてである。表Ｚから見られ得るように、全ての構築物がタンパク質発現を生じたわけではなかった。構造遺伝子の前のリーダー配列が、発現のために要求された。従って、成熟30KDタンパク質遺伝子を含有する１つのpET22b構築物、および成熟32A KD タンパク質遺伝子を含有する１つの構築物は、いずれのタンパク質も発現することができなかった。30KDおよび32A KDのM.tuberculosisタンパク質のpET22bにおける好結果の発現は、タンパク質のそれぞれのリーダー配列を構造遺伝子の前に付加することにより得られた。両方のタンパク質について、このことは、全長タンパク質およびプロセシングされたタンパク質の両方の発現を生じた。これらの構築物は、E.coliにおいて比較的安定であった。すなわち、これらは、２または３回の継代培養後に、組換えタンパク質を発現したが、さらなる継代培養後には発現しなかった。 30KDおよび32KDのM.tuberculosisタンパク質のpET22bにおける好結果の発現はまた、E.coli由来のpelBリーダー配列を各々のタンパク質の構造遺伝子の前に付加することにより得られた。これらの構築物における発現レベルは、30KDまたは 32A KDのタンパク質のそれぞれのリーダー配列を利用する構築物における発現レベルによりもさらに高かった。しかし、pelB構築物の欠点は、その不安定性であった。これらの構築物は、任意の組換えタンパク質を発現する能力を、１回の継代培養の後に喪失した。以前に、M．tuberculosisの32AKDタンパク質の発現および分泌は、Mycobacter ium smegmatisおよびMycobacterium vaccaeにおいて、EcoRV制限部位により隣接し、そして全長32Aタンパク質遺伝子をコードする約4.5kbのDNAフラグメントを含有する、pSMT3に基づく発現構築物を用いて達成されていた。しかし、M.tuber culosisの30KD主要細胞外タンパク質およびM.tuberculosisの16KD主要細胞外タンパク質の場合とは対照的に、これらの構築物の使用は、M.tuberculosisの32A KDのタンパク質の細胞内蓄積を生じ、そしてM．tuberculosisの32A KDのタンパク質の高レベルの分泌を生じなかった。本発明は、全長32A KD主要細胞外タンパク質をコードするDNAフラグメントを含有する、Mycobacterium smegmatisの組換え株を、37℃ではなく28℃（これらの細菌を培養するには普通の温度）で培養することにより機能する。28℃で培養する場合、組換えミコバクテリアは、豊富な32A KDタンパク質を発現および分泌する。次いで、分泌されたタンパク質は、従来の精製技術により培養上清液から精製され得る。本発明の前には、少量の組換えM.tuberculosis 32A KDタンパク質しか、このタンパク質を発現する組換えミコバクテリアから得られ得なかった。本発明は、豊富な組換え32Aタンパク質が、32A KDタンパクを培養培地に分泌する組換えミコバクテリアの培養濾液から得られるのを可能にする。従って、組換え32A KDタンパク質の費用に対し最も効率の良い生産が可能になる。実施例27 EcoRV制限部位により隣接し、そして全長32A KDタンパク質をコードする約4.5 kbのDNAフラグメントを含むpSMT3に基づく発現構築物を用いて、M.tuberculosis 32A KD主要細胞外タンパク質由来の遺伝子を、Mycobacterium smegmatisにクローン化した（図19における構築物Ａ）。組換えM.smegmatisを、2％グルコースを含有する7H9培地において37℃および28℃にて培養した。次いで、各生物の培養濾液を採取し、そしてSDS-PAGE分析に供した。全長32A KDタンパク質遺伝子を有するpSMT3ベクターを含有するM.smegmatisを37℃にて培養した場合、32A KDタンパク質は、培養濾液中に実質的に全く存在しなかった（図20のレーン２）。しかし、同じM.smegmatis株を28℃にて培養した場合、多量の32A KDタンパク質が培養濾液中に分泌され、そして存在した（レーン３、矢尻）。レーン１は、分子量スタンダード（分子量×10^-3が、スタンダードの左側に示される）を示す。レーン２は、37℃にて培養された、全長M.tuberculosis 32A KDタンパク質遺伝子のp SMT3ベクターを含有するM.smegmatisからの濾液を示す。レーン３は、28℃にて培養された、全長M.tuberculosis 32A KDタンパク質遺伝子のpSMT3ベクターを含有するM.smegmatisからの濾液を示す。構築物Ｂ、Ｄ、Ｅ、およびＧを含有するM.smegmatisもまた、28℃にて培養された場合、多量の組換えM.tuberculosis 32A KDタンパク質を発現および分泌した。 28℃にてMycobacterium smegmatisにより発現および分泌された組換えMycobac terium tuberculosis 32A KDタンパク質のＮ末端アミノ酸分析により、以下の配列が得られた：１６ＦＳＲＰＧＬＰ。全長M.tuberuculosis 32A KDタンパク質遺伝子を含有する２つの組換えM.smeg malis株（構築物ＡおよびＤ）を、28℃にて培養した。各生物の培養濾液を得、そしてアリコートを、変性SDS-PAGE分析に供した。タンパク質をポリフッ化ビニリデン(polyvinylidine fluorlde)(PVDF)膜に移し、そして32KDで移動するクーマシーブルーＲ染色したバンドを切り出し、そして自動アミノ酸配列決定に供した。上記に示した配列は、従来の一文字コードである。構築物ＡまたはＤのいずれかを含有するM.smegmatisにより分泌された組換えタンパク質のＮ末端配列は、天然のM.tuberculosis 32A KDタンパク質と同一であり、M.smegmatisにおける組換えM.tuberculosis 32A KDタンパク質が、M.tube rculosisにおける天然のM.tuberculosis 32A KDと同様にプロセシングされることを確認した。同様に、細胞外タンパク質、それらのアナログ、ホモログ、または免疫反応性タンパク質サブユニットを、通常の実験室技術および自動シークエンサー技術を用いて比較的純粋な形態で大規模で化学合成し得る。この態様の生成は、細胞外産物の抗原性決定基に相当するペプチドサブユニットまたは低分子量アナログを構築するのに特に魅力的である。より小さなタンパク質サブユニットの生成の例示的な技術は、当該分野において周知であり、そして以下の文献において見出され得る：他の免疫原性技術（例えば、ペプチド、ヌクレオチド、または他の分子（例えば、模倣物）を用いる抗イディオタイピングまたは指定された分子進化）もまた、有効な、所望の予防応答を生じ得る免疫反応性化合物を生成するために用いられ得る。本発明の実施に有用な核酸分子は、例えは、以下を含む種々のベクターから発現され得る：ウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第5,288,641号）、レトロウイルス（例えば、代表的な発現ベクターは、1995年10月20日に出願された、同時係属中の出願第08/545,926号（この開示は本明細書中に参考として援用される）に開示される。核酸分子（またはベクター、すなわち、目的の配列の発現を検出し得る集合体）は、広範な種々のメカニズム(例えば、トランスフェクション、例えば、殺傷したアデノウイルスに連結されたDNAを含む（Michaelら、J．Biol．Chem．268（ 10:6866-6869，1993;およびCurielら、Hum．Gene Ther．3(2):147-154，1992）、サイトフェククチン=媒介性導入（DMRIE-DOPE，Vical，Callf.）、直接DNA注入（Acsadiら、Nature 352:815-818，1991）；DNAリガンド（Wuら、J．of Biol ．Chem．264:16985-16987，1989）；リポフェクチン（Felgnerら、Proc．Natl． Acad．Sci，USA 84:7413-7417，1989）；リポソーム（Pickeringら、Clrc．89(1 ):13-21，1994；およびWangら、PNAS 84:7851-7855，1987）；マイクロインジェクタイルボンバードメント（Williamsら、PNAS 88:2726-2730，1911）；ならびに酵素自体をコードする核酸の、単独（Vileおよびhart，Cancer Res．53:3860- 3864，1993）またはPEG核酸複合体（WO 93/18759;WO 93/04701;WO 93/07283、およびWO 93/07282もまた参照のこと）を含む）を利用しての直接送達)によって宿主細胞に導入され得る。さらなる代替として、１つ以上の細胞外産物、類似体、アナログ、または本発明のサブユニットの発現を誘導し得る、DNAまたは１つ以上の遺伝子をコードする他の遺伝的物質は、いわゆる「裸のDNA」技術を利用して哺乳動物宿主に直接注入され得る。インビボ導入の後、および宿主細胞による遺伝子構築物の取り込みの結果、宿主は１つ以上のコードされた免疫反応産物の内因的産生を始め、続いてのチャレンジに対する有効な免疫応答を生じる。当業者が理解するように、遺伝子構築物の、真核生物プロモーター配列および／または分泌シグナルへの結合は、コードされた免疫反応産物の発現および続く分泌を容易にし得る。裸の_D NAのワクチンとしての利用についての例示的な技術は、国際特許第WO9421797 A 号（Merck & Co．Inc.およびViCal Inc.）、国際特許出願第WO 9011092号（ViCa l Inc.）、およびRobinson，Protection Against a Lethal Influenza Virus Ch allenge by Immunization with a Hemagglutinin-ExpressingPlasmid DNA，11 V accine 9（1993）、ならびにUlmerら、Heterologous Protection Against Influ enza by Injection of DNA Encoding a Viral Protein，259 Science(1993)に見出され、本明細書中に参考として援用される。あるいは、強力な免疫原性タンパク質テールの融合についての技術は、Taoら、Idiotype/Granulocyte-MacropageColony-Stimulating Factor Fusion Protein a s a Vaccine for B-Coe Lymphoma，362 Nature(1993)、およびＴ細胞エピトープマッピングについては、Goodら、HumanT-Cell Recognition of the Circums porooite Protein of Plasmodiumfalciparum：Immunodominant T-Cell Domains Map to the Polymorphic Regions of the Molecule，85 Proc．Natl．Acad．Sci ．USA(1988)、およびGaoら、Identification and Chara Cterization of T Help e r Epitopes in the Nucleoprotein of Influenza A Vitus，143 The Journal of Immunology No.9(1989)に開示されている。多くの細菌属が相同性を示すので、上記の例は、例示の目的で提供され、そして本発明の範囲および内容を制限すること、または本発明を、Mycobacterium族、または特定の種もしくはその血清型、または結核のみに対するワクチンに制限することは意図されない。微生物のDNAおよび対応するタンパク質における種間の相同性の罹患率は、本発明のワクチンが交差反応性免疫を誘導することを可能にすることもまた強調されるべきである。主として豊富な細胞外産物の免疫優勢性ピトープが、選択された属の他の血清型および種でのチャレンジに対する交差防御的免疫を提供するので、当業者は、１つの種に指向されるワクチンを、別の種の細胞外産物または免疫原性アナログを使用して開発し得ることを理解する。例えば、M．bovisは、M．tuberculosisと90％と100％との間の相同性であり、そして免疫応答の刺激に関して高度に交差反応性である。従って、M．bovisまたは他のMycobacteriumの豊富な細胞外産物に基づくワクチンは、M．tuberculosis による感染に対する種々の程度の防御を提供し得、その逆もあり得る。従って、適度に主として豊富な細胞外産物の高度に相同な免疫原性決定因子を使用して、同じ属のいくつかの細菌種に対する免疫予防的応答を提供することは、本発明の範囲内であることが意図される。本発明の実施のために選択された免疫原性決定因子が多くの異なる形態で使用され、有効的な防御または免疫原性免疫応答を惹起し得ることもまた強調されるべきである。従って、宿主免疫系に対する、選択された主として豊富な細胞外産物の１つ以上の免疫原性決定因子の提示の態様は重要ではなく、そして、産生または投与を容易にするように変更され得る。例えば、本発明のワクチンは、細胞外産物全体または任意のその免疫刺激画分（上記のような、ペプチド、タンパク質、サブユニット、免疫原性アナログ、および相同体を含む）を使用して処方され得る。本発明の技術に従って、M．tuberculosisの主として豊富な細胞外産物の有効なタンパク質サブユニットが、遺伝的に多様な咄乳動物種の集団で同定され得る。得られる同定された免疫優性Ｔ細胞エピトープは、ヒトおよびウシを含む他の哺乳動物によって認識されるはずである。これらの免疫優性Ｔ細胞エピトープは、従って、ワクチンならびに免疫診断試薬に有用である。M．tuberculosisの30KD の主要な分泌タンパク質の免疫優性Ｔ細胞エピトープのを同定する例示的な研究を、以下のように行った。実施例28 30KD タンパク質の免疫優性エピトープマッピング全体のネイティブ30KDタンパク質を含みそして10アミノ酸重複する、55の合成ペプチド（15マー）を、M．tuberculosis 55の30KD主要分泌タンパク質の免疫優性Ｔ細胞エピトープを同定するために、膵臓リンパ球増殖アッセイに使用した。利用される各15マーの合成ペプチドの配列を、図12aおよびｂの抗原ペプチド配列番号に対応する同定番号(１〜55)ならびにアミノ酸残基の同定および各配列の相対位置と関連して以下に示す。脾臓リンパ球を、SAFにおいて乳化された精製30KDタンパク質で３〜４回皮下で免疫化された、非近交系雄性Hartley系モルモット（Charles River Breeding Laboratories）から得た（AllisonおよびByars 1986）。コントロール動物は、S AFのリン酸緩衝化生理食塩水を受けた。細胞媒介免疫応答を、上記のような皮膚試験によって評価した。リンパ球を96ウェル組織培養プレート（Falcon Labware ）に播種し、そして20mg ml^-1の合成15マーペプチド、20mg ml^-1の精製30KDタンパク質、20mg ml^-1の精製タンパク質誘導体[（PPD）;Connaught Laboratories L TD]、または10mg ml^-1のコンカナバリンＡとともに、２日間、10UのポリオミキシンＢの存在下で、３連でインキュベートした。続いて、細胞を、１mCi[³H]チミジン（New England Nuclear）で16時間標識し、次いで、収集した（BreimanおよびHorwitzl 1987）。ポジティブ増殖性応答を以下のように規定した：(抗原の dpm)-(培地のdpm)³1 500および(抗原のdpm)/(培地のdpm)³1.2。精製M．tubercul osis 30KDタンパク質で免疫化された25％より多いモルモットによって認識される免疫優性エピトープを、以下の表AAに示し、そして図12aおよび12bに図示的に例示する。表AAに示される結果は、M．tuberculosisの30KD主要分泌タンパク質の免疫優性Ｔ細胞エピトープを同定する。当業者は、以前の研究者が、M．tuberculosis タンパク質に高度に関連するM．bovisの30KDタンパク質を研究したことを理解する。しかし、これらの以前のM．bovisタンパク質の研究は、実際の患者（BCGワクチン接種者、結核患者、またはPPDポジティブ個体）を研究した先行技術における以前の研究と顕著に異なる。このような個体におけるこのタンパク質の応答はしばしば弱いために、先行技術エピトープマッピング研究は困難であり、そして精度に問題があった。対照的に、実施例25の研究は、精製タンパク質で免疫化された非近交系のモルモットを利用し、それによってこの単一タンパク質における免疫系に焦点を当て、そして非常に強力な細胞媒介免疫応答を産生した。さらに、これらのモルモットを、免疫化の数週間以内に、Ｔ細胞応答性のピークで研究した。以前に、M．tuberculosis 32A KDタンパク質のエピトープの同定を目的とした２つのタイプの研究を行った。第一のタイプは、a)ツベルクリン（PPD）ポジティブであるヒト；BCGでのワクチン化の結果としての部分；b)レプロミンポジティブのヒト；c)TBを有すヒト；またはd)ライ病を有するヒトの（タンパク質の全体の配列に重複した）ペプチドに対するＴ細胞応答を試験した。（P．Launols， R．Deleys，M.N．Niang，A．Drowart，M．Adrien，P．Deirckx，J．-L．Cartel ，J．-L．Sarthou，J．-P．van Vooren,およびK．Huygen，1994、「T-Cell epit ope mapping of the major secreted mycobacterial antigen AG85A in tubercu losis and leprosy」，Infect．and Immun，62:3679-3687。）これらの人々におけるこのタンパク質への応答はしばしば弱く、正確にエピトープをマップすることを困難にしている。これらの困難を克服するために、非近交系モルモットを精製タンパク質で免疫化し、この単一のタンパク質における免疫系に焦点を当て、そして非常に強力な細胞媒介免疫応答を産生した。この応答を、Ｔ細胞応答性のピーク（すなわち、免疫化後の数週間以内）で研究した。第二のタイプの以前の研究は、BCGで感染した近交系マウスのペプチドに対するＴ細胞応答を試験した。(K．Huygen，E．Lozes，B．Gilles，A．Drowart，K． Palfliet，F．Jurion，I．Roland，M．Art，M．DuFaux．J．Nyavenda，J．De B ruyn，J．-P．van Vooren,およびR．Deleys，1994、「Mapping of THl helper T- cell epitopes on major secreted mycobacterial antigen 85A in mice infect ed with live Mycobacteriumbovis BCG」，Infect．and Immun．，62:363-370。）このような研究は、ヒトに見出される複数のMHC型の種々の応答を予測する結果を生じないようである。予測結果を得るために、本発明に従って、広範な種々のHLA型を有する多数の非近交系モルモットを研究した。その結果、25％以上のモルモットによって認識される32A KDタンパク質のエピトープは強力な免疫優性であり、そして複数のHL A型によって認識される。それゆえ、それは一般に、ヒト、ウシ、および他の咄乳動物を含む他の種のHLA分子によって認識されるようである。このような研究は、ヒトおよび他の哺乳動物によって認識される免疫優性エピトープを高度に予測するはずである。さらに、上記のマウス研究は、BCG感染動物の応答に依存する。このような動物は、a)M．tuberculosis感染動物を示さず、およびb)特定のタンパク質-この場合32A KDタンパク質-に対して活性の疾患を有さない動物ほど強く応答しない動物であり得る。実施例29 32A KD タンパク質の免疫優性エピトープマッピング実施例28の手順を、ネイティブ32A KDタンパク質の全体にわたる57合成ペプチド（15マー）を使用したことを除いて、繰り返した。標的された各15マーの配列を表ABに示す。以下の表に示されるように、技術的理由のために、合成ペプチド番号1A、5A、 15A、26A、29A、43A、および56Aは、対応する標的15マーとわずかに異なる。精製M．tuberculosis 32A KDタンパク質で免疫化された、25％より多くのモルモットによって認識されるM．tuberculosisの32A KD主要分泌タンパク質の免疫優性Ｔ細胞エピトープを、以下の表ADに示し、そして図13に図示的に例示する。本発明の技術により、上で同定された１つ以上の免疫優性エピトープを、結核に対するワクチンに組込み得る。例えば、個々の免疫優性エピトープを合成し得、そして個々に使用するか、または複数の抗原ペプチド系と組合わせて使用し得る。あるいは、２つ以上の免疫優性エピトープを互いに化学的に連結し得る。互いに連結されるか、または別々のいずれかのペプチドを、適切なアジュバントと合わせ、そしてヒトまたは他の哺乳動物についてのサブユニットワクチンにおいて使用し得る。さらに、免疫優性エピトープを、新しい皮膚試験のような新しい免疫診断試薬において使用し得る。選択された免疫原性決定因子の活性を増強するために本発明において使用される特定の例示的なアジュバントは、SAF、Monophosphoryl Lopid A（MPL）を含むアジュバント、フロイントの不完全アジュバント、殺傷細菌含有フロイントの完全アジュバント、γインターフェロン（Radfordら、American Society of Hepat ology 2008-2015，1991;Watanabeら、PNAS 86:9456-9460,1989;Gansbacherら、C ancer Research 50:7820-7825，1990:Maioら、Can，Immunol．Immunother，30:3 4-42，1989;米国特許第4,762,791号および第4,727,138号）、IL-12、IL-15（Gra bsteinら、Science 264:965-968，1994）、MF59、MF 59＋MTP、mf 59+IL-12、MF 59＋TDM（トレハロースジミコレート（dimycolate））、QS-21、QS-21＋IL-12 、IL-2（アメリカンタイプカルチャーコレクション第39405号、第39452号、および第39516号；米国特許第4,518,584号もまた参照のこと）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ddA）、ddA＋デキストラン、ミョウバン、Quil A、ISCOMS、（免疫刺激性複合体）、リポソーム、脂質キャリア、タンパク質キャリア、およびマイクロカプセル化技術である。本発明に有用であり得るさらなるアジュバントは、油中水エマルジョン、無機物塩（例えば、ミョウバン）、核酸、ブロックポリマー界面活性剤、および微生物細胞壁（ペプチド糖脂質）である。本発明の範囲内に限定されないが、アジュバントが、細胞性かつサイトカイン構築物を含む、注入および／または注入部位での環境の調節の部位からの抗原の徐放を可能にすることによって、免疫応答を拡大し得ることが理解される。特に好ましいのは、単独または別のアジュバントとの組合せのいずれかでのIL -12である。IL-12単独の存在下、またはIL-12＋別のアジュバント（例えば、MF5 9）の存在下での、精製主要M．tuberculosis細胞外タンパク質でのモルモットの免疫化は、IL-12なしで得られる防御的な免疫を超える防御的な免疫を増強することが見出されている。防御的な免疫を誘導するためのワクチンの能力を増大することによって、IL-12は、より効果的なワクチンを与える。マウスIL-12がマウスリンパ芽球およびヒトリンパ芽球の両方を刺激すること、およびヒトIL-12がヒトリンパ芽球を刺激することが公知であったが、マウスI L-12またはヒトIL-12のいずれかがモルモットリンパ芽球を刺激することは公知ではなかった。マウスIL-12またはヒトIL-12がモルモットリンパ芽球を刺激するか否かを決定するために、「Lymphoblasts Proliferation Assay for IL-12 Act ivity」Alternate Protocolと題された、Current Protocols in Immunology，19 93， Cytokines and their Recepters（6.16.3頁〜6.16.5頁）に記載されるプロトコルを使用して、IL-12活性をアッセイした。実施例30 脾臓細胞を雄性Hatley系モルモットから単離し、20mlの補充培地を含み、8μg /ml（補充培地で１：１に希釈）の濃度でのPHAとともに、10⁷細胞/75cm²培養フラスコの濃度で、３日間インキュベートし、そして50IU/mlの濃度のIL-12とともに１日間インキュベートした。リンパ芽球を洗浄し、カウントし、96ウェル平底マイクロタイタープレートに２×10⁴リンパ芽球／ウェルの細胞密度で分配し、そして24時間０〜５μg/mlのIL-12（R & D Systems，Minneapolis，MN）とともにインキュベートした。³H-チミジン（0.25μCi）を、さらに18時間、各ウェルに添加し、次いで細胞を採集し、そして取り込まれた³H-チミジンについてアッセイした。牌臓細胞を用いて異なる非近交系モルモットから得られた２つの個々の実験を、図21および図22に示す。データは、６連ウェルについて、平均DPM±S.D.である。各実験において、マウスおよびヒトの両方のIL-12は、用量依存性様式でモルモットのリンパ芽球の増殖を強く刺激した。 IL-12が、精製M．tuberculosis 30、32A、および16KDの主要細胞外タンパク質から成るワクチンの効率を増強するか否かを決定するために、モルモットをIL-1 2の存在下または非存在下でワクチンで免疫化し、そしてエアロゾールにより毒性M．tuberculosisでチャレンジした。IL-12は、ワクチンの、チャレンジされた動物の肺における減量およびM．tuberculosisの増殖に対して、動物を防御する能力を増強することが見出された。実施例31 モルモット（１群当たり６匹）を、アジュバント（MF 59）および組換えマウスIL-12（R & D Systems（Minneapolis，MN）から購入）の存在下で、100μgの精製M．tuberculosis 30、32A、および16KDの主要細胞外タンパク質で皮下により３回免疫化した。コントロール動物（１群当たり６匹）を、アジュバントおよびIL-12のみで偽免疫化した。次いで動物を、毒性M．tuberculosis Erdman株のエアロゾルでチャレンジし、そしてその後、屠殺までの10週間毎週計量した。偽免疫化動物は、アジュバント＋IL-12の存在下でタンパク質で免疫化した動物よりも大きな減量を示した。結果を図23に示す。実施例32 モルモット（１群当たり６匹）を、アジュバント（MF 59）単独、IL-12単独、またはアジュバント＋IL-12の存在下で、100μgの精製M．tuberculosis 30、32A 、および16KDの主要細胞外タンパク質で皮下により３回免疫化したか、またはアジュバント単独もしくはアジュバント＋IL-12で偽免疫化した。IL-12をR & D Sy stemsから購入した。次いで、動物を、毒性M．tuberculosis Erdman株でチャレンジし、そしてその後、屠殺までの10週間毎週計量した。図24は、チャレンジの日の体重からの各群の平均の正味の増量または減量を示す。タンパク質で免疫化した動物は、偽免疫化コントロールの両群よりも少ない減量を示した。IL-12の存在下でアジュバントで免疫化した動物の偽免疫化動物は、アジュバントのみで免疫化した動物よりも減量が少なかった。アジュバント＋IL-12の存在下でタンパク質で免疫化した動物のタンパク質免疫化動物は、IL-12単独またはアジュバント単独のいずれかの存在下でタンパク質で免疫化した動物よりも、実験の経過にわたって少ない減量を示した。従って、チャレンジ後の４から10週間、疾患の重篤期間の間、アジュバントおよびIL-12の両方の存在下でタンパク質で免疫化した動物は、５、６、７、および10週目で最小量の減量を示し、そして４および８週目で二番目に少ない減量を示した。実施例33 動物を、100μgのM．tuberculosis 30、32A、および16KDの主要細胞外タンパク質でMF 59またはMF 59+IL-12の存在下、皮下で３回免疫化したか、あるいは、 MF59単独、IL-12単独、またはMF59+IL-12で偽免疫化した。動物をエアロゾルによって毒性M．tuberculosisでチャレンジし、10週間観察し、そして屠殺した。右の肺を取り出し、そして7H11寒天プレート上でM．tuberculosisについて培養した。表AEに示すデータは、右の肺当たりの平均CFUである。タンパク質で免疫化下動物は、タンパク質なしであるが同じアジュバント調製物で偽免疫化した動物よりも少ないCFUを有した。従って、タンパク質＋MF 59（ C）で免疫化した動物は、MF 59単独（A）で免疫化した動物よりも肺において0.7 log少ないCFUを有し；そしてMF 59+IL-12（E）を有するタンパク質で免疫化した動物は、MF 59+IL-12単独（B）で免疫化した動物よりも肺において0.4log少ない CFU、およびMF 59単独で免疫化した動物よりも肺において1.1log少ないCFUを有した。 IL-12の存在下でタンパク質で免疫化した動物は、IL-12の非存在下でタンパク質で免疫化した動物よりも少ないCFUを有した。従って、MF 59+IL-12（E）においてタンパク質で免疫化した動物は、MF 59単独の存在下でタンパク質で免疫化した動物よりも肺において0.4log少ないCFUを有した。実施例34 モルモットを、および100μgの精製M．tuberculosis 30、32A、および16KDの主要細胞外タンパク質で、アジュバント（MF 59）単独（９匹の動物）の存在下、またはアジュバント（MF 59）＋組換えマウスIL-12(R & B Systems（Minneapo li s，MN）から購入)（９匹の動物）の存在下、皮下で３回免疫化した。コントロール動物を種々のアジュバント単独で偽免疫化した（17匹の動物）。次いで動物を、エアロゾルの毒性M．tuberculosis Erdman株でチャレンジし、そしてその後、屠殺までの10週間毎週計量した。偽免疫化動物は、アジュバント単独またはアジュバント＋IL-12のいずれかの存在下で、タンパク質で免疫化した動物よりも大きな減量を示した。タンパク質で免疫化した動物の、アジュバント単独の存在下でタンパク質で免疫化した動物は、アジュバント＋IL-12の存在下でタンパク質で免疫化した動物よりも減量した。さらに、偽免疫化した動物は、実験の経過の間に高い死亡率を有した-偽免疫化動物の24％が死亡対タンパク質で免疫化した動物の６％のみが死亡。タンパク質で免疫化した動物の、アジュバント単独の存在下でタンパク質で免疫化した動物は、アジュバント＋IL-12（0％）の存在下でタンパク質で免疫化した動物よりも高い死亡率（11％）を有した。結果を図25に示す。当業者は、ペプチドをコードするDNAが合成され得、そして個々にまたは集合的にペプチド発現に使用され得るか、あるいはヒトまたは他の哺乳動物に直接注入されるDNAワクチンと組合せ得ることもまた理解する。免疫原性エピトープ（または、それをコードするDNA）のみから成る構築物は、分子の防御部位における免疫応答に焦点を当てる。関係のないまたは免疫抑制エピトープを避けることによって、このような構築物は、より強いおよびより防御的な免疫応答を誘導し得る。主要アジュバント細胞外産物のより小さいタンパク質サブユニット、その分子アナログ、それをコードする遺伝子、および予測されるその組合せは、免疫診断試薬としてそれらが効果的な免疫予防法の機能を刺激する限り、本発明の範囲内である。さらに、公知の分子組換え技術により改変された融合タンパク質または細胞外産物のような組み換えた産物は、本発明の技術により全体的に適合可能である。さらに、選択された免疫活性決定因子またはペプチドの免疫学的に産生されたアナログ、および指向された発生を使用して誘導された核酸もまた、本発明の範囲内である。さらに、選択された免疫活性決定因子は、ヒトまたは他の種の特定のMHC分子よりも密接に結合するように改変され得るか、または抗原提示細胞によってより効率的に存在し得る。さらに、選択された免疫活性決定因子は、ワクチン化された宿主における分解に耐性であるように改変され得る。同様に、宿主免疫系に対する免疫原性因子の処方物かつ提示物は、タンパク質またはアジュバントにおけるそのアナログの溶液に限定されない。例えば、適切な細胞内タンパク質由来の免疫原性決定因子は、M．tuberculosis、Mycobacteri aの異なった種、非病原性かつ組換え技術を使用して改変された、細菌、ファージ、マイコプラズマ、またはウイルスの異なった種によって発現され得る。このような場合、生きた生物全体が処方され得、そして所望の応答を刺激するために使用され得る。逆に、対立する環境における大規模なワクチンプログラムは、アジュバントまたは添加物を複雑にすることのない、非常に安定した処方を必要とし得る。さらに、ワクチン処方物は、または凍結乾燥、経口投与、またはカプセル化のような苛酷な条件に供される場合、活性成分の安定性または免疫活性を促進するように指向され得る。あるいは、本発明は、この産物の意図される使用に依存する本ワクチンを含む免疫原性決定因子の異なった巨大な処方物を含む。当業者は、ワクチン用量が、日常の実験を利用して、各病原および宿主について決定されるべきであることを理解する。現在、最も低い実際の用量が0.1μgから2.0μg、20.0μg、100μgの用量の範囲であり、そして適切な系についてはさらに１mgが最適であり得ることを理解する。適切な用量は、任意の従来の免疫化技術および当該分野で公知の配列を使用して投与され得る。当業者は、本発明が、精神またはその中心的特性から離れることなく他の特定の形態であり得ることをさらに理解する。本発明の上記の記載がその例示的に実施態様のみが開示されることにおいて、本発明の範囲内である場合、他の変更が含まれることが理解される。従って、本発明は、本明細書中に詳細に記載される特定の実施態様に制限されない。むしろ、参考文献は、本発明の範囲および内容に示されるように添付の請求の範囲に対して作成されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/569 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リー，バイ−ユアメリカ合衆国カリフォルニア 90064, ロサンゼルス，サウスセプルベーダ 2901，アパートメント 230

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物宿主において、Mycobacterium属由来の感染性病原体に対して有効な免疫応答を促進することに使用するためのワクチン接種薬剤であって、 M．tuberculosisの110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32AKDタンパク質、32BKDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、 14KDタンパク質、12KDタンパク質、およびこれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物の少なくとも一部分；および。 IL-12およびMF59からなる群より選択されるアジュバントを含む、ワクチン接種薬剤。２．前記少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物が、M．tuberculosis 32A KDタンパク質である、請求項１に記載のワクチン接種薬剤。３．前記少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物が、M．tuberculosis 32A KDタンパク質、30KDタンパク質、および16KDタンパク質の混合物である、請求項１に記載のワクチン接種薬剤。４．前記アジュバントがIL-12である、請求項１に記載のワクチン接種薬剤。５．前記アジュバントが、IL-12とMF59との混合物である、請求項１に記載のワクチン接種薬剤。６．Mycobacterium属の感染性病原体に対して哺乳動物宿主を免疫する方法であって、 M．tuberculosisの110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、およびこれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物の少なくとも一部分と、IL-12およびMF59からなる群より選択されるアジュバントとを含むワクチン接種薬剤を提供する工程；および該ワクチン接種薬剤を該哺乳動物宿主に導入して、該感染性病原体による後の感染に対して有効な免疫応答を誘導する工程、を包含する、方法。７．前記少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物が、M．tuberculosis 32A KDタンパク質である、請求項６に記載の方法。８．前記少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物が、M．tuberculosis 32A KDタンパク質、30KDタンパク質、および16KDタンパク質の混合物である、請求項６に記載の方法。９．前記アジュバントがIL-12である、請求項６に記載の方法。１０．前記アジュバントが、IL-12とMF59との混合物である、請求項６に記載の方法。１１．哺乳動物宿主において、Mycobacterium属由来の感染性病原体に対して有効な免疫応答を促進することに使用するためのワクチン接種薬剤であって、 M．tuberculosisの110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、およびこれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープを含む、ワクチン接種薬剤。１２．前記少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物が、M．tuberculosis 32 A KDタンパク質である、請求項１１に記載のワクチン接種薬剤。１３．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、以下のアミノ酸配列を有するM．tuberculosis 32A KDタンパク質サブユニット、およびそれらのそれぞれのアナログ、ホモログおよびサブユニットであって、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、および逆転を含む、アナログ、ホモログおよびサブユニットからなる群より選択される、請求項１２に記載のワクチン接種薬剤：１４．哺乳動物宿主において、Mycobacterium属由来の感染性病原体を同定する検出可能な免疫応答を促進することに使用するための免疫診断薬剤であって、 M．tuberculosisの110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、およびこれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープを含む、免疫診断薬剤。１５．前記少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物が、M．tuberculosis 32 A KDタンパク質である、請求項１４に記載の免疫診断薬剤。１６．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、以下のアミノ酸配列を有するM．tuberculosis 32A KDタンパク質サブユニット、およびそれらのそれぞれのアナログ、ホモログおよびサブユニットであって、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、および逆転を含む、アナログ、ホモログおよびサブユニットからなる群より選択される、請求項１５に記載の免疫診断薬剤：１７．Mycobacterium属の感染性病原体に対して哺乳動物宿主を免疫する方法であって、 M．tuberculosisの110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、およびこれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープを提供する工程；および該少なくとも１つの免疫優性エピトープを該哺乳動物宿主に導入して、該感染性病原体による後の感染に対して有効な免疫応答を誘導する工程、を包含する、方法。１８．前記少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物が、M．tuberculosis 32 A KDタンパク質である、請求項１７に記載の方法。１９．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、以下のアミノ酸配列を有するM．tuberculosis 32A KDタンパク質サブユニット、およびそれらのそれぞれのアナログ、ホモログおよびサブユニットであって、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、および逆転を含む、アナログ、ホモログおよびサブユニットからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法：２０．哺乳動物において、Mycobacterium属の病原体に対する免疫応答の存在を検出する方法であって、 M．tuberculosisの110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、58KD タンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KDタンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、およびこれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物の少なくとも１つの免疫優性エピトープを提供する工程；該少なくとも１つの免疫優性エピトープを該哺乳動物宿主に投与する工程；および得られる免疫応答を測定する工程、を包含する、方法。２１．前記少なくとも１つの主として豊富な細胞外産物が、M．tuberculosis 32 A KDタンパク質である、請求項２０に記載の方法。２２．前記少なくとも１つの免疫優性エピトープが、以下のアミノ酸配列を有するM．tuberculosis 32A KDタンパク質サブユニット、およびそれらのそれぞれのアナログ、ホモログおよびサブユニットであって、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、および逆転を含む、アナログ、ホモログおよびサブユニットからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法：２３．M．tuberculosisの110KDタンパク質、80KDタンパク質、71KDタンパク質、 58KDタンパク質、45KDタンパク質、32A KDタンパク質、32B KDタンパク質、30KD タンパク質、24KDタンパク質、23.5KDタンパク質、23KDタンパク質、16KDタンパク質、14KDタンパク質、12KDタンパク質、およびこれらのそれぞれのアナログ、ホモログ、およびサブユニットからなる群より選択される主として豊富な細胞外産物を産生するためのプロセスであって、宿主細胞をベクターで形質転換して、形質転換細胞を形成する工程であって、該ベクターが、該主として豊富な細胞外産物のうちの１つをコードする核酸分子を含む、工程；および該形質転換細胞を培養し、それにより該主として豊富な細胞外産物を産生する工程を包含する、プロセス。２４．前記核酸分子が、32A KD M．tuberculosisタンパク質をコードする、請求項２３に記載のプロセス。２５．前記形質転換細胞の培養により産生された前記主として豊富な細胞外産物を回収する追加工程を含む、請求項２４に記載のプロセス。２６．前記ベクターがpSMT3を含む、請求項２４に記載のプロセス。２７．前記宿主細胞がM．smegmatisまたはM．vaccaeである、請求項２４に記載のプロセス。２８．前記形質転換細胞が、２８℃の温度にて培養される、請求項２４に記載のプロセス。