JP4868682B2 - 組換え細胞内病原体ワクチンおよび使用のための方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（政府に対する言及）
本発明は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって授与された助成金番号ＡＩ３１３３８の下で政府支援の下でなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に、細胞内病原体性生物（例えば、細菌、原生動物、ウイルスおよび真菌）に対する免疫治療剤およびワクチンに関する。より詳細には、病原性サブユニット、殺傷した病原体および弱毒化天然病原体に基づく先行技術のワクチンおよび免疫治療剤とは異なり、本発明は、哺乳動物宿主において有効な免疫応答を刺激する、選択された病原体の免疫原性決定基を発現および分泌する組換え弱毒化病原体または近縁種を使用する。本発明の免疫刺激ワクチンおよび免疫治療剤は、インサイチュで免疫原性決定基を発現する組換え弱毒化細胞内病原体または近縁種から誘導される。
【０００３】
（発明の背景）
寄生性微生物が、動物に感染してそれによって疾患およびしばしば宿主の死を引き起こす能力を保有することが長い間認識されている。病原性因子は、歴史を通じて主な死因であり、そして多くの苦しみを与え続けている。ここ数百年は、多くの感染性疾患の予防および処置において劇的な進歩が見られたが、複雑な宿主−寄生生物相互作用は、治療手段の汎用的有効性を依然として制限している。多くの病原体性生物によって示される洗練された侵襲機構に対抗することの困難性は、種々の疾患（例えば、結核）の再来、ならびに細菌およびウイルスの多数の薬物耐性株の出現によって証明されている。
【０００４】
主な疫学的関心がある病原性因子の中でも、細胞内細菌は治療手段または予防手段をものともせずに特に難治性であることが証明されている。細胞内細菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ属を含む）は、それらの生活環の全てまたは一部を、細胞外でではなく、感染した宿主生物の細胞内で完了する。世界中で、細胞内細菌は、各年の数百万人の死亡の原因であり、そして言うに言えない苦しみである。結核は、世界中での単一の疾患因子による死亡の主な原因であり、毎年１，０００万の新たな症例および２９０万の死亡が生じている。さらに、細胞内細菌は、数百万のライ病の症例の原因である。細胞内因子によって伝染される他の消耗性疾患としては、皮膚リーシュマニア症および内臓リーシュマニア症、アメリカトリパノソーマ症（シャーガス病）、リステリア症、トキソプラスマ症、ヒストプラスマ症、トラコーマ、オウム病、Ｑ熱およびレジオネラ症が挙げられる。この時点で、これらの生物の多くに暴露された感受性個体において消耗性感染を予防するために行われ得ることは比較的少ない。このような細胞内病原体から集団を有効に防御することができないこと、ならびに、このような因子によって引き起こされる、得られるヒトおよび動物の罹患率および死亡率に起因して、結核は、現在人類が立ち向かっている最も重要な疾患である。
【０００５】
当業者は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの以下の例示的な議論が、本発明の教示の例示であって、本発明の範囲をＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの処置に限定することをどのようにも意図しないことを認識する。同様に、本明細書中の教示は、結核感染の処置にはどのようにも限定されない。対照的に、本発明を用いて、病原性生物の免疫学的に重要なタンパク質を発現するために、そして同等に重要なことに、このタンパク質を遊離させるために組換え弱毒化病原体または組換え無毒性生物を用いることによって、任意の病原性因子に対する安全でかつ有効なワクチンおよび免疫治療剤を有利に提供し得る。
【０００６】
現在、世界中の人口の約３分の１がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染していて、毎年数百万の肺結核症例を生じていると考えられている。より詳細には、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって主に引き起こされるヒトの肺結核は、発展途上国における死亡の主な原因である。マクロファージおよび単球の内側で生存し得るので、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、慢性細胞内感染を生じ得る。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、外来要因の検出およびその後の免疫系活性化を主に担う細胞内にそれ自体潜伏することによって宿主生物の正常な防御を回避することが比較的好首尾である。さらに、結核を処置するために用いられる第一線の化学療法剤の多くは、細胞外形態と比較して細胞内生物に対して比較的低い活性を有する。これらの同じ病原性特性が、結核感染に対する充分に有効な免疫治療剤またはワクチンの開発をこれまで妨げてきた。
【０００７】
この疾患は、ラテンアメリカ、アフリカおよびアジアの発展途上国において特に急性な健康問題であるが、第一世界においてもより普及しつつある。米国では、特定の集団（特に、都市貧困者、免疫無防備状態の個体および高い疾患有病率の地域からの移民）は、危険性が増大している。ＡＩＤＳの流行に大部分は起因して、最近数年では、結核の発生数は、しばしば、多剤耐性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの形態で、先進国において増大している。
【０００８】
近年、１以上の薬物に対して耐性の結核が、合衆国の５０の州のうちの３６において報告された。Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ市では、試験した全ての症例の３分の１が、１以上の主な薬物に対して耐性であった。非耐性結核は、長いコースの抗生物質を用いて治療され得るが、薬物耐性株に関する見通しは暗い。２以上の主な抗生物質に対して耐性の株に感染した患者は、約５０％の致命率を有する。従って、このような種々のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する安全でかつ有効なワクチンがひどく必要とされている。
【０００９】
病原体は、湿性の痰および乾性の痰において数週間または数ヶ月にわたって生存力があるままであり得るので、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの最初の感染は、ほとんどいつも、エアゾールか粒子の吸入を通して生じる。最初の感染部位は肺の中であるが、この生物は、ほぼ任意の器官（骨、脾臓、腎臓、髄膜および皮膚を含むがこれらに限定されない）の感染を引き起こし得る。特定の株のビルレンスおよび宿主の耐性に依存して、感染および組織への対応する損傷は、小さいかまたは広範囲にわたるかもしれない。ヒトの場合、最初の感染は、この細菌のビルレント株に暴露された大部分の個体において制御される。最初のチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後の獲得免疫の発達は細菌増殖を減少させ、それによって、病巣が治癒するのを可能にし、そして被験体を大部分無症候性のままにする。
【００１０】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓが、感染した被験体によって制御されない場合、このことはしばしば、肺組織の広範な分解を生じる。感受性の個体では、結核菌は肺胞マクロファージまたは肺マクロファージ内で繁殖するので、病巣は通常、肺に形成される。この生物が増加するにつれて、これらは、リンパ系を通して遠位のリンパ節へと、および肺尖、骨髄、腎臓および脳を取り囲む髄膜への血流を通して広がり得る。主に、細胞媒介過敏感応答の結果として、特有の肉芽腫性病巣または結核結節は、感染の重篤度に比例して生成される。これらの病巣は、単球、リンパ球および線維芽細胞に接する類上皮細胞からなる。大部分の例では、病巣または結核結節は最終的に壊死となり、乾酪化を受ける（罹患組織の、柔らかい乾酪物質への変換）。
【００１１】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは重要な病原体であるが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の他種もまた、ヒトを含む動物において疾患を引き起こし、そして明らかに本発明の範囲内にある。例えば、Ｍ．ｂｏｖｉｓは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ近縁であり、そして家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌおよびネコ）における結核感染を担う。さらに、Ｍ．ｂｏｖｉｓは、代表的には生乳の摂取から、胃腸管を通してヒトに感染し得る。局所化された腸感染は最終的に気道に広がり、そしてすぐ後で、結核の古典的症候群が続く。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の別の重要な病原性ベクターは、数百万の症例の古代的疾患ライ病を引き起こすＭ．ｌｅｐｒａｅである。動物およびヒトにおいて疾患を引き起こすこの属の他の種としては、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ，Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ，Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ，Ｍ．ｃｈｅｌｏｎｅｉおよびＭ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍが挙げられる。病原性マイコバクテリア種は頻繁に、それらのそれぞれのＤＮＡならびに対応するタンパク質配列において高い程度の相同性を示し、そしていくつかの種（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓ）は高度に関連している。
【００１２】
明らかな実用的および道徳的理由から、このような苦痛に関する実験組成物の効力を決定するためのヒトにおける最初の研究は、実行不可能である。従って、任意の薬物またはワクチンの開発初期においては、安全性および費用の理由から、適切な動物モデルを用いることが標準的な手順である。実験動物モデルを実行することの成功は、免疫原性エピトープは、異なる宿主種において頻繁に活性であるという理解によって断定される。従って、１つの種（例えば、げっ歯類またはモルモット）における免疫原性決定基は一般に、異なる種（例えば、ヒト）において免疫反応性である。適切な動物モデルが十分に開発された後にのみ、ヒトにおける臨床試験が実行されて、ヒトにおけるワクチンの安全性および効力がさらに実証される。
【００１３】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる肺胞または肺の感染に関して、モルモットモデルは、多くの局面で、この疾患のヒトでの病理に極めて似る。従って、この疾患のモルモットモデルをヒトおよび他の動物に外挿することが適切であることが当業者によって充分に理解される。ヒトについてと同様に、モルモットは、低用量のエアゾール化ヒト病原体Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでの結核感染に感受性である。最初の感染が通常制御されるヒトとは異なり、モルモットは、エアゾール化病原体への暴露によって一貫して播種性疾患を発症し、その後の分析が容易になる。さらに、モルモットおよびヒトは両方とも、皮膚試験部位で、密な単核細胞硬化または硬い領域の発達によって特徴付けられる皮膚遅延型過敏感反応を提示する。最後に、ヒトおよびモルモットの特有の結核病巣は、ラングハンス巨細胞の存在を含めて、類似の形態を示す。モルモットは、この疾患の最初の感染および進行に対してヒトよりも感受性であるので、この動物モデルを用いる実験において付与される任意の防御は、同じ防御免疫が、ヒトおよび他のより感受性の低い哺乳動物において生じ得るという強力な指標を提供する。従って、説明の目的のためのみであって、限定の目的のためではなく、本発明は、哺乳動物宿主としてのモルモットの例示的な状況において主に実証される。当業者は、ヒトおよび家畜動物を含む他の哺乳動物宿主を用いて本発明が実施され得ることを理解する。
【００１４】
病原性生物（特に細胞内生物）に感染した任意の動物またはヒトは、宿主免疫系に対する困難なチャレンジを表す。多くの感染性因子が体液性応答および対応する防御抗体の生成によって有効に制御され得るが、これらの機構は主に、身体の細胞外液に存在する病原体に対してのみ有効である。特に、オプソニン作用性抗体は、細胞外外来因子に結合し、それによって、これらを食作用およびその後の細胞内殺傷に感受性にする。なお、これは、他の病原体には当てはまらない。例えば、以前の研究は、体液性免疫応答が、細胞内細菌（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染に対しては重要な防御の役割を果たさないようであることを示した。しかし、本発明は、標的病原体に対して有益な体液性応答を生じ得、そしてそのために、その有効性は、刺激免疫応答のどの特定の成分にも制限されない。
【００１５】
より詳細には、抗体媒介防御は、見たところでは、細胞内病原体の最初の感染を予防しないようであり、そして一旦細菌が宿主の細胞内に隔離されると無効である。水溶性タンパク質であるので、抗体は細胞外液および血液を浸透し得るが、細胞の脂質膜を横切って移動するには困難性を有する。さらに、細菌の表面構造に対するオプソニン作用性抗体の生成は、細胞内病原体が宿主細胞内に進入するのを実際に補助し得る。従って、細胞内因子（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に対する任意の有効な予防的手段は、攻撃的な細胞媒介免疫応答成分を取り込んで、無防備な食作用を活性化するかまたはこれらを細胞傷害的に除去する抗原特異的リンパ球の迅速な増殖をもたらすべきである。しかし、以下で詳細に考察するように、細胞媒介性免疫応答を誘導することは、防御免疫の誘導とは等価でない。細胞媒介性免疫は、防御免疫の必要条件であり得るが、本発明の教示によるワクチンの生成は、動物に基づくチャレンジ研究を必要とする。
【００１６】
この細胞媒介性免疫応答は一般に、２つの段階を含む。最初の段階（細胞が感染されたというシグナル伝達）は、病原体の断片を細胞の表面に送達する特別の分子（主要組織適合またはＭＨＣ分子）によって達成される。これらのＭＨＣ分子は、感染した細胞内で分解された細菌性タンパク質の小さなフラグメントに結合し、そしてこれらを細胞の表面に提示する。Ｔ細胞に対するこれらの提示は、宿主の免疫系を刺激して、感染した宿主細胞を除去するか、または宿主細胞がその中に存在するあらゆる細菌を根絶させるのを誘導する。
【００１７】
ワクチン接種を用いて結核を根絶させる試みが、ＣａｌｍｅｔｔｅおよびＧｕｅｒｉｎがインビトロでの連続継代技術を用いてＭ．ｂｏｖｉｓのビルレント株を好首尾に弱毒化した後に１９２１年に開始された。Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ ｉｎ Ｌｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅで開発された得られた生ワクチンは、カルメット−ゲラン桿菌またはＢＣＧワクチンとして公知である。ほぼ８０年後、このワクチンは、現在使用されている結核についての唯一の予防治療のままである。実際、今日入手可能な全てのＢＣＧワクチンは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＰａｓｔｅｕｒでＣａｌｍｅｔｔｅおよびＧｕｅｒｉｎによって開発されたＭ．ｂｏｖｉｓの元の株から誘導されている。
【００１８】
世界保健機関は、ＢＣＧワクチンが世界中の（特に発展途上国の）結核を減少させる際の必須の要因であると考えている。理論的には、ＢＣＧワクチンは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに免疫学的に関連した弱毒化マイコバクテリアに対する細胞媒介性免疫を付与する。得られる免疫応答は、一次結核を予防するはずである。従って、一次結核が予防された場合、潜伏感染は起き得ず、そして疾患の再活性化は回避される。
【００１９】
しかし、制御された臨床試験は、ワクチンの効力における重大な変動を示した。報告された効力の割合は、０％〜８０％の間で変動した。英国の学校の子供において行ったワクチン試験は、ワクチン接種の１０年後の防御率が７８％を超えることを報告した。しかし、南インドでの同様の試験では、ＢＣＧは、接種後の最初の５年において培養証明（ｃｕｌｔｕｒｅ−ｐｒｏｖｅｎ）一次結核に対して防御することができなかった。結核の予防におけるＢＣＧの効力の近年のメタ分析は、全体的な予防効力は約５０％であると見積もった（Ｃｏｌｄｉｔｚ，Ｇ．Ａ．Ｔ．Ｆ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ｃ．Ｓ．Ｂｅｒｋｅｙ，Ｍ．Ｅ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｂｕｒｄｉｃｋ，Ｈ．Ｖ．ＦｉｎｅｂｅｒｇおよびＦ．Ｍｏｓｔｅｌｌｅｒ．１９９４．ＪＡＭＡ ２７１：６９８−７０２）。
【００２０】
報告された効力の割合におけるこの顕著な不一致は、ＢＣＧワクチンをいつどのようにして使用するかを決定しなければならない防疫官および開業医を当惑させる問題のままである。製造技術、接種経路、ならびにワクチンが使用された集団および環境の特徴の差異を含めて、これらの観察された効力の不一致の原因であり得る多数の因子が暗示されている。近年の研究は、環境のマイコバクテリアとの偶発的接触が、ワクチンレシピエントが、ネイティブなＢＣＧタンパク質に対する有効な応答を開始するのを妨げる「自然ワクチン」をもたらし得ることを示唆する。
【００２１】
ＢＣＧ免疫原性のバリエーションを最小にするために、ワクチン製造は、元のワクチン株のマスターストックを凍結乾燥（フリーズドライ）状態で維持する。それらから誘導された各生成株は次いで、製造場所、会社または細菌株に因んで命名される（例えば、ＢＣＧ−Ｌｏｎｄｏｎ、ＢＣＧ−Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、ＢＣＧ−ＣｏｎｎａｕｇｈｔまたはＢＣＧ−Ｔｉｃｅ（Ｏｒｇａｎｏｎ，Ｉｎｃ．によって世界中に販売される）。米国における製造技術を標準化させる試みにおいて、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）のＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＢＥＲ）は、ワクチン製造を規制する。ＦＤＡのＣＢＥＲ部門は、ワクチン接種のために用いられる各凍結乾燥したＢＣＧ株が、特定されたツベルクリン皮膚試験反応をモルモットおよびヒトにおいて誘導し得なければならないことを特定した。不運なことに、誘導されるツベルクリン感受性は、防御免疫と相関することが示されていない。
【００２２】
現行のＢＣＧワクチンは、投与の直前に無菌の希釈剤で再水和される凍結乾燥培養物として提供されている。ＢＣＧワクチンは、発展途上国および先進国を含めて、ＢＣＧワクチン接種を実施する国においては、出生時、乳児期または早期小児期に与えられる。高用量の感染性マイコバクテリアに暴露されたかもしれない成人の、風土病地域への訪問者は、皮膚試験が非反応性である場合、ＢＣＧを予防として受け得る。このワクチンに対する有害な反応は稀であり、そして注射部位付近の皮膚の潰瘍形成およびリンパ節炎に一般に制限されている。しかし、これらの稀な有害な反応にもかかわらず、ＢＣＧワクチンは、１９３０年から世界中で投与された３０億用量について、またとない安全性の歴史を有する。
【００２３】
ＢＣＧが開発されてから、現在、８０年が経過し、そして受容可能なワクチン代替物が不足したままである。近年、本発明者らは、細胞内病原体によって分泌される細胞外タンパク質の単離、特徴付けおよび組換え発現においてかなりの進歩を行った。例えば、本発明者らの米国特許第５，１０８，７４５号（１９９２年４月２８日発行）およびいくつかの係属中の米国特許出願は、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａおよびＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓならびに他の細胞内病原体に対する防御免疫を生じるワクチンおよび方法を提供する。これらの先行技術のワクチンは、ブロス培養物中にインビトロで病原性細菌によって細胞外に放出され、そしてインビボで感染宿主細胞内の細菌によって細胞外に放出された、タンパク質様化合物にもともと由来する細胞外産物に広範に基づく。その中に提供されるように、これらのワクチンは、哺乳動物宿主中の標的病原体に対する強力な免疫応答を刺激する細胞外産物またはそれらのアナログの同定に選択的に基づく。
【００２４】
選択されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞外産物から調製されたワクチンは、ヒトの予防治療としての使用のために現在最適化されている。組換え体タンパク質および天然で発現されるタンパク質の両方を用いたタンパク質カクテルおよび個々のタンパク質調製物が研究されている。これらの進行中の研究の１つの目的は、最適な免疫原（タンパク質）の提示を通してベースの免疫応答を最大にすることである。今日までに、３８の異なるタンパク質組合せ、２６の異なるアジュバント、１０の異なるタンパク質濃度および７の異なる投薬レジメンを含む、１００を超える種々の調製物が作製されている。候補ワクチンタンパク質はまた、非Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質（ウシ血清アルブミン、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．主要分泌タンパク質および破傷風トキソイドを含む）にカップリングされている。このリストは、本発明者らが細胞内病原体の細胞外タンパク質を宿主動物に対して提示するために用いた方法を含んでいない；むしろ、これは、ワクチンの最適化に関連した膨大な複雑さおよび固有の変動性を例示する。しかし、これらおよび他の活性にもかかわらず、細胞外タンパク質、アジュバント、キャリアタンパク質、濃度または投与頻度のどの組合せも、モルモットにおいて、ＢＣＧに匹敵するかまたはＢＣＧに勝る防御免疫応答の誘導をもたらさなかった。
【００２５】
近年、形質転換したＢＣＧ株を用いて、種々の細胞関連抗原を発現するワクチンを生成することに重大な関心が向けられている。例えば、Ｃ．Ｋ．Ｓｔｏｖｅｒらは、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの膜結合性リポタンパク質ＯｓｐＡを発現する組換えＢＣＧ（ｒＢＣＧ）を用いたライム病ワクチンを報告した。同様に、同じ著者はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの肺炎球菌の表面タンパク質（ＰｓＰＡ）を発現するｒＢＣＧワクチンを生成した（Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．、Ｇ．Ｐ．Ｂａｎｓａｌ，Ｓ．Ｌａｎｇｅｒｍａｎ，およびＭ．Ｓ．Ｈａｎｓｏｎ．１９９４．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ｒＢＣＧ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．、Ｂｒｏｗｎ Ｆ．（編）：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．Ｄａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，第８２巻，１６３−１７０）。
【００２６】
両方ともＢ．Ｒ．Ｂｌｏｏｍらに対して発行された米国特許番号（ＵＳＰＮ）第５，５０４，００５号（「’００５号」特許）およびＵＳＰＮ第５，８５４，０５５号（「’０５５号特許」）は、多数の種の微生物由来の広範囲の細胞結合融合タンパク質を発現する理論的ｒＢＣＧベクターを開示する。これらの特許において記載されたこの理論的ベクターは、細胞外非融合タンパク質抗原とは対照的に、細胞結合融合タンパク質に関するか、および／またはｒＢＣＧが遠縁種由来の融合タンパク質を仮定的に発現するかのいずれかである。さらに、これらのモデルにおいて発現された組換え細胞結合融合タンパク質は、宿主ゲノムに組み込まれて熱ショックプロモーターの制御下にあるＤＮＡにコードされる。その結果、発現される抗原は、融合タンパク質であり、そして発現は、ベクターのネイティブタンパク質とほぼ同等以下のレベルに制限される。
【００２７】
さらに、’００５特許も’０５５特許も、動物モデルの安全性試験、ヒト疾患を密接に真似た動物系における免疫応答の発達または防御免疫を開示していない。さらに、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ融合タンパク質を発現する理論的ｒＢＣＧベクターのみが、’００５および’０５５に開示され、実際のワクチンは実行可能にされていない。開示されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓについてのワクチンモデルは、細胞外非融合タンパク質ではなく、細胞結合熱ショック融合タンパク質に関する。
【００２８】
米国特許第５，８３０，４７５号（「’４７５号特許」）もまた、融合タンパク質を発現するために用いられた理論的マイコバクテリアワクチンを開示する。これらの融合タンパク質をコードするＤＮＡは、染色体外プラスミドに、マイコバクテリアの熱ショックタンパク質プロモーターおよびストレスタンパク質プロモーターの制御下で存在する。開示されるワクチンは、そのワクチンに対する抗体を生成する目的で非ヒト動物において免疫応答を惹起することが意図され、哺乳動物における細胞内病原体疾患を予防することを示さない。さらに、’４７５号特許は、細胞外非融合タンパク質を発現するためにタンパク質特異的プロモーターを使用する組換えワクチン接種因子を開示しない。
【００２９】
本発明者らは、細胞内病原体の主要細胞外非融合タンパク質が重要な免疫防御分子であり得ることを、限定しないが、提案する。第一に、細胞外非融合タンパク質は、病原体による、宿主細胞の細胞内環境への細胞外非融合タンパク質の放出によって、プロセシングおよび宿主細胞表面上のＭＨＣ分子に結合したフラグメントとしての免疫系への提示のために利用可能である。これらのペプチド−ＭＨＣ複合体は、他の場合には隠れてしまう侵入者の宿主細胞内での存在に対して免疫系を警告するのに役立ち、免疫系が侵入者に対して適切な抗微生物攻撃を開始するのを可能にする。第二に、細胞外タンパク質での有効な免疫は、将来のある時点で、関連した細胞内病原体によって侵入された宿主細胞上にペプチド−ＭＨＣ複合体が提示された場合に、同じペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する免疫細胞集団を誘導し得る。従って、免疫細胞は、感染した宿主細胞を標的化し得、そしてこれらの細胞をサイトカインで活性化してそれによってこれらが細胞内病原体の増殖を制限し得るか、または、これらの細胞を溶解してそれによって病原体が繁殖する細胞内環境から病原体を拒絶し得るかのいずれかである。第三に、細胞外タンパク質の中でも、主な細胞外タンパク質（すなわち、最も豊富に生成される細胞外タンパク質）は、免疫防御分子として最も優勢に現れる。なぜなら、これらは一般的に、免疫系に対するペプチド−ＭＨＣ複合体の最も豊富な提示を提供するからである。
【００３０】
それゆえ、ワクチン接種因子に対して近縁である細胞内病原体の主要細胞外非融合タンパク質を発現する組換え細胞内病原体ワクチンについての必要性が残っている。さらに、非熱ショック遺伝子プロモーターまたは非ストレスタンパク質遺伝子プロモーターを有する染色体外ＤＮＡによって組換え細胞外非融合タンパク質を過剰発現し得る組換え細胞内病原体ワクチンについての必要性が存在する。
【００３１】
特に、ＢＣＧワクチンレシピエントに与えられる防御よりも優れている、疾患からのレシピエントの防御を提供する細胞内病原体ワクチンを生成する緊急の必要性が残っている。さらに、先進国および発展途上国の両方に、結核および他の細胞内病原体についての、コスト効率の高い、免疫治療的および予防的な処置を提供する緊急の必要性が存在する。
【００３２】
それゆえ、本発明の目的は、細胞内病原体によって引き起こされる疾患の処置および予防のための治療的および予防的なワクチンを提供することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、同じ細胞内病原体、別の細胞内病原体、または両方の主要組換え免疫原性抗原を発現するように形質転換された細胞内病原体を用いて、細胞内病原体疾患を予防するためのワクチンを提供することである。
【００３４】
本発明のなお別の目的は、病原性マイコバクテリウムの細胞外タンパク質を発現する組換えＢＣＧを用いて、マイコバクテリア疾患の処置および予防のためのワクチンを提供することである。
【００３５】
本発明の別の目的は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの１以上の主要細胞外タンパク質を発現および分泌するＢＣＧの組換え株を用いて、結核の処置および／または予防のためのワクチンを提供することである。
【００３６】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物における細胞内病原体疾患を処置および予防するための新たなクラスのワクチンおよび免疫治療剤および方法を提供することによって、上記の目的および他の目的を達成する。歴史的に、細胞内病原体ワクチンおよび免疫治療剤は、細胞内病原体自体または近縁種から調製されてきた。これらの古いワクチンモデルは、微生物全体またはそのサブユニットから構成された。例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓについての最初の、そして現在唯一利用可能なワクチンは、近縁の細胞内病原体Ｍ．ｂｏｖｉｓから作製された弱毒化生ワクチンである。近年、本発明者らは、増殖培地中に分泌される細胞内病原体の特定の細胞外産物を個々のサブユニットとして、またはサブユニットの組合せのいずれかにおいて用いて、哺乳動物における防御免疫応答を惹起（ｉｌｌｉｃｉｔ）し得ることを発見した。しかし、これらのサブユニットワクチンは、Ｍ．ｂｏｖｉｓから誘導された元の弱毒化ワクチンよりも優れているとは証明されていない。
【００３７】
本発明は、別のまたは同じ細胞内病原体の細胞外タンパク質（組換え免疫原性抗原）を発現するように形質転換された組換え弱毒化細胞内病原体（ワクチン接種因子）を含む、ワクチンおよび免疫治療剤を詳述する。１つの実施形態では、本発明のワクチンは、カルメット−ゲラン桿菌、すなわちＢＣＧの組換え株を用いて作製される。この実施形態では、組換えＢＣＧは、いくつか名前を挙げると、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅおよびＭ．ｂｏｖｉｓが挙げられるがこれらに限定されない病原性マイコバクテリアの主要細胞外タンパク質を発現する。
【００３８】
組換えＢＣＧによって発現される主要細胞外タンパク質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１２ｋＤａ、１４ｋＤａ、１６ｋＤａ、２３ｋＤａ、２３．５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３２ＡｋＤａ、３２ＢｋＤａ、４５ｋＤａ、５８ｋＤａ、７１ｋＤａ、８０ｋＤａおよび１１０ｋＤａのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログおよびサブユニット（それらの組換え非融合タンパク質、融合タンパク質および誘導体を含む）。マイコバクテリアおよび他の細胞内病原体の主要細胞外タンパク質を同定するために用いられた分子量は、概算であることしか意図されないことは当業者には明らかである。組換え技術および分子生物学の当業者は、これらのタンパク質を短縮形態で発現することもまた可能であるので、これらのタンパク質を、さらなるアミノ酸、ポリペプチドおよびタンパク質と同時発現（同時翻訳）することが可能であることを理解する。得られる改変タンパク質は、ネイティブ、非融合タンパク質、融合タンパク質、ハイブリッドタンパク質またはキメラタンパク質と呼ばれたとしても、依然として本発明の範囲内であると考えられる。本発明の目的のために、融合タンパク質は、一緒にクローニングされて、翻訳後に単一のポリペプチド配列を形成する、異なる遺伝子由来の２以上のコード配列の産物を含むがこれらに限定されないと定義される。
【００３９】
本発明はまた、非融合タンパク質を少なくとも１つの他の細胞内病原体から過剰発現する組換え弱毒化細胞内病原体ワクチン接種因子を記載する。これは、少なくとも１つの組換え免疫原性抗原遺伝子を発現する染色体外核酸を用い、そしてこの遺伝子を非熱ショック遺伝子プロモーターまたは非ストレスタンパク質遺伝子プロモーター（好ましくはタンパク質特異的プロモーター配列）の制御下におくことによって達成される。その結果、組換え免疫原性抗原をコードする遺伝子をワクチン接種因子のゲノムＤＮＡ中に安定に組み込む場合に可能であるよりも多量に発現される、非融合性組換え免疫原性抗原を有するワクチンが提供される。その結果、既存のサブユニットワクチンまたは弱毒化細胞内病原体ワクチンよりも驚くほど優れた特異性および効力を有する細胞内病原体ワクチンが提供される。
【００４０】
さらに、本発明は、細胞内病原体によって引き起こされる哺乳動物疾患を、本発明のワクチンを用いることによって処置および予防する方法を記載する。弱毒化ワクチン接種因子および／または組換え免疫原性抗原の供給源として用いられ得る多くの細胞内病原体の部分的なリストとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌ．ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅ、Ｌ．ｂｏｚｅｍａｎｉｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐ．、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌａ ｇｅｎｏ群、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐ．、Ｔｏｘｐｏｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐ．、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐ．およびＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｓｐ。本発明の１つの実施形態では、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３０ｋＤａの主要細胞外タンパク質を発現する組換えＢＣＧは、皮内接種を用いて哺乳動物に投与される。しかし、本発明のワクチンは、適切な免疫応答をもたらす任意のアプローチ（皮下、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、経口的または吸入を含むがこれらに限定されない）を用いて投与され得ることが理解される。適切な接種後期間の後、哺乳動物は、感染性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓエアゾールを用いてチャレンジされる。本発明のワクチンを受けた哺乳動物は、ＢＣＧ単独、主要細胞外タンパク質単独、またはそれらの任意の組合せを受けた哺乳動物と比較して驚くほど疾患がなかった。
【００４１】
本発明の他の目的および特徴および利点は、最初に簡単に記載された図面とともに、本発明の好ましい例示的な実施形態の以下の詳細な説明を考慮すれば、当業者に明らかである。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般的に、細胞内病原体によって引き起こされるヒトおよび動物における感染を処置および予防するためのワクチンおよび免疫治療剤に関する。特に、本発明は、細胞内病原体抗原提示を最適化して、免疫治療レシピエントおよび／またはワクチンレシピエントが、重要な治療的および予防的なタンパク質に対する最大の免疫応答を生じることを可能にすることに関する。本発明者らは、何年にもわたる研究および実験を通して、細胞内病原体から誘導された細胞外タンパク質を用いた細胞内病原体感染の好首尾の治療および予防が、宿主に対するタンパク質提示の機能であることを驚くべきことに見出した。
【００４３】
抗原提示は、どのようにしてレシピエントが抗原をプロセシングし、そして抗原に応答するかを決定する一群の変動要因を含む。これらの変動要因としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：アジュバント、ワクチン成分濃度、キャリア分子、ハプテン、投与頻度および投与経路。本発明者らは、異なって配合された同一の抗原が、遺伝的に類似の宿主において統計的に有意な応答の変動をもたらすことを実証した。例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３０ｋＤａの細胞外タンパク質の２つのワクチン調製物を、同じタンパク質濃度およびアジュバント濃度を用いて配合した。一つの群のモルモットには、３０ｋＤａタンパク質およびアジュバントのみを含むワクチンを投与した；２番目のモルモット群には、２番目のワクチンにＩＬ−１２を添加したこと以外は第１のワクチンと同じワクチンを投与した。両方の群の平均免疫応答が匹敵するものとなったとき、ワクチン＋ＩＬ−１２を受けたモルモットは、統計的に有意に優れた免疫応答を実証した。
【００４４】
本発明は、一方が８０年間にわたって公知であり、そして他方が１９９０年代の産物である、２つの技術の結合を記載する。一緒になると、これらは、細胞内病原体の細胞外タンパク質をレシピエントに提示して、そのタンパク質に対する顕著に強い防御免疫応答を誘導するための、全く新しくかつ驚くほど有効なアプローチを提示する。本発明者らは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの細胞外タンパク質を例示的な細胞内病原体として用いて、１００を超える異なる抗原提示方法を試みた。しかし、本発明者らによって認識された多くの成功にもかかわらず、いずれも、ＢＣＧワクチンを単独で用いて見られるよりも優れた免疫応答を誘導しなかった。
【００４５】
手短に述べると、そして一般的な例示のみを意図すると、本発明は、同じ種、別の種、またはその両方の組換え免疫原性抗原（「免疫原」）を発現および分泌する弱毒化（すなわち、無毒性の）組換え細胞内病原体（「ワクチン接種因子」）を用いた、細胞内病原体に対するワクチンを含む；ワクチン接種因子および免疫原は、集合的に、本発明の「ワクチン」といわれる。ワクチンは、皮下、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、経口的または吸入を含むがこれらに限定されない１以上の経路を用いて投与される。本発明のワクチン接種因子は、免疫原をインサイチュ（状態）で発現および分泌するレシピエント中で生存する。
【００４６】
この理論に束縛されることは望まないが、本発明者らは、日和見病原体（例えば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．）の免疫原性抗原が、より伝統的な動物病原体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）の同様の免疫原性抗原よりもずっと容易に、防御免疫応答を惹起（ｉｌｌｉｃｉｔ）し得ることを提案した。淘汰圧は、それらの天然の宿主と同時に進化した病原体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）に、偶発的（すなわち、日和見的）病原体が欠いている免疫回避機構を与え得る。その結果、病原性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｉａに対する防御免疫応答を惹起するためには、ヒトが主な宿主ではない病原体に対する防御免疫を惹起するために必要とされるよりも有意により強力なワクチン接種因子および免疫原が開発されなければならない。
【００４７】
本発明者らは、日和見細胞内病原体Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．由来の細胞外タンパク質が、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントまたは不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントのいずれかを用いて精製形態で、またはカクテルで投与した場合に、有意な免疫防御を動物に与えることを以前に実証した（本明細書中に参考として援用されるＵＳＰＮ ５，１０８，７４５を参照のこと）。しかし、類似の条件下でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞外タンパク質を用いて類似の防御免疫応答を得る試みは、好首尾ではなかった。その結果、本発明者らは、細胞外非融合タンパク質の過剰発現が抗原提示および防御免疫応答の発生の重要な局面であり得ることを提案した。しかし、非融合免疫原性細胞外タンパク質の過剰発現は、防御免疫を惹起する際の１つの重要な因子であり得ることが理解されているが、本発明のワクチンが提供する唯一の免疫刺激因子であるとは考えられていない。
【００４８】
本発明は、種々の細胞内病原体（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ またはＭ．ｌｅｐｒａｅの主要細胞外非融合タンパク質を過剰発現するＢＣＧ株を含むがこれに限定されない）に対する非常に有効な免疫防御ワクチンを調製するために理想的に適している。本発明の各ワクチンは、所定の細胞内病原体に特異的な種々の分子量の少なくとも１つの免疫原を発現し得る。例えば、本発明者らは、以下を含み得るがこれらに限定されないＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫原を以前に同定した：主要細胞外タンパク質１２ｋＤａ、１４ｋＤａ、１６ｋＤａ、２３ｋＤａ、２３．５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３２ＡｋＤａ、３２ＢｋＤａ、４５ｋＤａ、５８ｋＤａ、７１ｋＤａ、８０ｋＤａ、１１０ｋＤａ、ならびにそれらのそれぞれのアナログ、ホモログおよびサブユニット（それらの組換え非融合タンパク質、融合タンパク質および誘導体を含む）（係属中の米国特許出願第０８／１５６，３５８号、同第０９／１５７，６８９号、同第０９／１７５，５９８号、同第０９／２２６，５３９および０９／３２２，１１６号（これらの内容全体は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａおよび他の細胞内病原体の主要細胞外タンパク質を同定するために用いられた分子量は、概算であることしか意図されないことは当業者に明らかである。組換え技術および分子生物学の当業者は、これらのタンパク質を短縮形態で発現することもまた可能であるので、これらのタンパク質を、さらなるアミノ酸、ポリペプチドおよびタンパク質と同時発現（同時翻訳）することが可能であることを理解する。得られる改変タンパク質は、ネイティブ、非融合タンパク質、融合タンパク質、ハイブリッドタンパク質またはキメラタンパク質と呼ばれたとしても、依然として本発明の範囲内であると考えられる。本発明の目的のために、融合タンパク質は、一緒にクローニングされて、翻訳後に単一のポリペプチド配列を形成する、異なる遺伝子由来の２以上のコード配列の産物を含むがこれらに限定されないと定義される。
【００４９】
抗原発現（細胞外タンパク質を含む）は、組換え非融合タンパク質をコードする遺伝子が、宿主のゲノムに組み込まれるのではなく、１以上のプラスミド（染色体外ＤＮＡ）上で、かつその制御下に置かれた場合に一般的に増強される。さらに、特定のタンパク質に特異的なプロモーター配列によって駆動されるタンパク質発現は、発現の増強、ならびに非融合タンパク質抗原のタンパク質折り畳みおよびプロセシングの改善を提供する。それゆえ、本発明は、非熱ショック遺伝子プロモーターまたは非ストレスタンパク質遺伝子プロモーター（好ましくはタンパク質特異的プロモーター配列）によって制御される、染色体外ＤＮＡ上にコードされた組換え細胞外非融合タンパク質を提供する。
【００５０】
本発明は、近縁および／または他の細胞内病原体の組換え細胞外非融合タンパク質に加えて、それら自体の内因性細胞外タンパク質を発現する、組換え弱毒化細胞内病原体ワクチン接種因子（例えば、ｒＢＣＧ）を提供する。しかし、８０年間の研究を通して、ＢＣＧの内因性細胞外タンパク質は単独では、全てのレシピエントにおいて完全な防御を提供するわけではないことが実証されている。さらに、以下でより詳細に説明されるように、本発明者らはまた、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞外タンパク質を伝統的なＢＣＧと単に同時に注射することが、ＢＣＧ単独よりも優れたワクチンをもたらさないことを実証した。
【００５１】
本発明の１つの実施形態では、ワクチンは、ほんの１つの免疫原（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質）を発現する組換えＢＣＧワクチン接種因子を含む。本発明の別の実施形態では、組換えＢＣＧは、２以上の免疫原（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの２３．５ｋＤａの主要細胞外タンパク質および３０ｋＤａの主要細胞外タンパク質）を発現し得る。この後者の実施形態は、哺乳動物における疾患を予防するためのワクチンとして特に有効であり得る。本発明者らは、組換えＢＣＧによるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの２３．５ｋＤａの主要細胞外タンパク質および３０ｋＤａの主要細胞外タンパク質の同時の過剰発現が、本発明の細胞内病原体に対する哺乳動物の防御免疫応答を高めるために相乗的に作用し得るという非限定的な理論を提案した。この理論は、野生型および組換えのＢＣＧが、それら自体の２３．５ｋＤａの主要細胞外タンパク質を天然で発現しない、Ｍ．ｂｏｖｉｓの欠失変異体であるという観察に部分的に基づく。
【００５２】
簡略さのため、およびその後の非常に複雑な説明に起因して、しかし、限定であることは意図しないで、本発明は、ワクチン接種因子としての組換えＢＣＧおよび本発明の例示的な実施形態としてのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞外非融合タンパク質（具体的に、３０ｋＤａの主要細胞外非融合タンパク質）を用いて、より詳細に記載される。任意の組換え免疫原性抗原が、任意の組換え弱毒化細胞内病原体によって発現され得ること、および本発明のワクチンは、ワクチン接種因子としてのＢＣＧおよび免疫原としてのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの主要細胞外非融合タンパク質に限定されないことが理解される。
【００５３】
ワクチン接種因子株のバリエーションの効果を決定するために、２つの異なるＢＣＧ株（ＢＣＧ ＴｉｃｅおよびＢＣＧ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ）を用いて、本発明の種々の実施形態を調製した。野生型Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ＴｉｃｅをＯｒｇａｎｏｎから購入し、そして野生型Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ＣｏｎｎａｕｇｈｔをＣｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａから入手した。これらの株を、７Ｈ９培地（ｐＨ６．７）（Ｄｉｆｃｏ）中で、３７℃で、５％ ＣＯ_２−９５％空気雰囲気下で非浸盪培養物として維持した。培養物を、１週間に１回または２回、５分間、超音波処理水浴中で超音波処理して、細菌集塊を減らした。
【００５４】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３０ｋＤａの主要細胞外非融合タンパク質を発現する組換えＢＣＧ ＴＩＣＥ（ｒＢＣＧ３０ Ｔｉｃｅ）を、以下の通りに調製した。プラスミドｐＭＴＢ３０（Ｅ．ｃｏｌｉ／マイコバクテリアシャトルプラスミドｐＳＭＴ３の組換え構築物）を、Ｈａｒｔｈ，Ｇ．、Ｂ．−Ｙ．ＬｅｅおよびＭ．Ａ．Ｈｏｒｗｉｔｚ．１９９７．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｐｉｄｌｙ ｇｒｏｗｉｎｇ ｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｏｆ ｆｏｕｒ ｍａｊｏｒ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｏ ｂｅ ｌｅａｄｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２３２１−２３２８（この内容全体は、本明細書中に参考として援用される）において本発明者らによって以前に記載されたように調製した。
【００５５】
手短に述べると、プラスミドｐＭＴＢ３０を操作し、組換えＤＮＡ技術の当業者に公知の方法を用いて、３０ｋＤａの非融合タンパク質遺伝子および広範囲の隣接ＤＮＡ配列を含む大きなゲノムＤＮＡ制限フラグメントを、プラスミドのマルチクローニング部位に挿入することによって、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｅｒｄｍａｎ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質をそれ自体のプロモーター（または任意の非熱ショックタンパク質遺伝子プロモーターおよび非ストレスタンパク質遺伝子プロモーター）から発現するようにした。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに最初に導入して、多量の組換えプラスミドを得た。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３０ｋＤａの非融合タンパク質を発現することができない組換えＥ．ｃｏｌｉ株を、２５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下で増殖させ、そしてこのプラスミド挿入物のＤＮＡ配列を、その全体で決定した。プラスミドを、６．２５ｋＶ／ｃｍ、２５μＦおよび１０００ｍΩを最大数の陽性形質転換体を生じる条件として用いるエレクトロポレーションによってＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに導入した。本発明者らは、組換えＤＮＡ技術の当業者に公知の方法を用いて、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンの存在下での増殖、ならびにポリアクリルアミドゲル電気泳動および多価の非常に特異的なウサギ抗３０ｋＤａ非融合タンパク質免疫グロブリンを用いた免疫ブロッティングによる組換え３０ｋＤａ非融合タンパク質の構成的発現および搬出によって、組換えプラスミドの存在を確認した。さらに、本発明者らは、組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ非融合タンパク質の適切な発現およびプロセシングを確認した。このタンパク質は、Ｎ末端アミノ酸配列決定によって、そのネイティブな対応物と区別不可能であった。
【００５６】
組換えｐＳＭＴ３ プラスミドｐＭＴＢ３０を続いて、６．２５ｋＶ／ｃｍ、２５μＦおよび２００ｍΩを最適なエレクトロポレーション条件として用いて、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ Ｔｉｃｅ中に導入した。形質転換体を、４時間にわたって、３７℃で、環境シェーカーにおいて、２％グルコースを補充した７Ｈ９培地中でインキュベートし、そして続いて、２０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む７Ｈ１１寒天にプレーティングした。形質転換体を新たな増殖培地に継代培養するにつれて、ハイグロマイシンの濃度を５０μｇ／ｍｌになるまで徐々に上昇させた。組換えＢＣＧ Ｔｉｃｅ培養物を、７Ｈ９培地が５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含んだこと以外は野生型と同じ条件下で維持した。
【００５７】
組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ非融合タンパク質の発現および搬送を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および多価の非常に特異的なウサギ抗３０ｋＤａ非融合タンパク質免疫グロブリンを用いた免疫ブロッティングによって確認した。代表的には、１０個のうちの１個の形質転換体は、他の形質転換体よりも有意に多い量の組換え非融合タンパク質を発現および搬送した；２つのこのような形質転換体が選択され、そしてこれらの形質転換体の大きなストックを調製し、そして１０％グリセロールを含有する７Ｈ９培地中で−７０℃で凍結した。これらの形質転換体は、モルモットにおけるワクチンの効力研究のために用いられた。図１ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび免疫ブロットでの組換えＢＣＧ ＴｉｃｅによるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質の発現を示す。組換え株は、クーマシーブルー染色ゲルおよび免疫ブロットの両方において、野生型よりもずっと多くのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質を発現した。
【００５８】
次に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質を発現する組換えＭ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ株（ｒＢＣＧ３０ Ｃｏｎｎ）を、上記のｐＭＴＢ３０プラスミドを用いて、組換えＢＣＧ Ｔｉｃｅ（ｒＢＣＧ３０ Ｔｉｃｅ）について記載されたのと同様に調製した。これを、組換えＢＣＧ Ｔｉｃｅ株について記載されたのと同じ条件下で、ハイグロマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含む培地において維持した。図１ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび免疫ブロットにおける、組換えＢＣＧ ＣｏｎｎａｕｇｈｔによるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質の発現を示す。この組換え株は、クーマシーブルー染色ゲルおよび免疫ブロットの両方において、野生型よりもずっと多くの量のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ ｋＤａ 主要細胞外非融合タンパク質を発現した。
【００５９】
ＢＣＧの組換え株のプラスミド安定性を、生化学的に評価した。この生化学的分析は、ハイグロマイシンの存在下では、組換えＢＣＧ株のブロス培養物が、定常レベルの組換え非融合タンパク質発現を３ヶ月の増殖期間にわたって維持することを実証した。ハイグロマイシンの非存在下では、同じ培養物は、（細胞あたりを基準として）非融合タンパク質発現のわずかな減少のみを示し、このことは、組換えプラスミドが安定に維持され、そして淘汰圧なしで増殖した細菌において非常に徐々に失われることを示す（図１ａおよび図１ｂ、レーン３）。
【００６０】
組換えＤＮＡ技術の当業者に公知の方法とともに上記の方法を用いて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３２（Ａ）ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質、１６ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質、２３．５ｋＤａ 主要細胞外非融合タンパク質および他のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ主要細胞外非融合タンパク質を発現する組換えＢＣＧ株が調製され得ることが理解される。さらに、同様の方法論を用いて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質のＭ．ｌｅｐｒａｅ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質ホモログ（抗原８５Ｂとしても公知）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３２（Ａ）ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質のＭ．ｌｅｐｒａｅ ３２（Ａ）ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質ホモログ（抗原８５Ａとしても公知）、および他のＭ．ｌｅｐｒａｅ主要細胞外非融合タンパク質を含むがこれらに限定されない、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ主要細胞外非融合タンパク質を発現する組換えＢＣＧ株を調製し得る。さらに、同様の方法論をまた用いて、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質のＭ．ｂｏｖｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質ホモログ（抗原８５Ｂとしても公知）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３２（Ａ）ｋＤａ主要細胞外タンパク質のＭ．ｂｏｖｉｓ ３２（Ａ）ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質ホモログ（抗原８５Ａとしても公知）および他のＭ．ｂｏｖｉｓ主要細胞外タンパク質を発現する組換えＭ．ｂｏｖｉｓ ＢＣＧを調製得る。
【００６１】
好首尾のワクチン生成後、本発明のワクチンを、動物モデルを用いて安全性および効力について試験する。この研究は、モルモットを利用した。なぜなら、モルモットモデルは、臨床的に、免疫学的におよび病理学的に、ヒトの結核に特に関連するからである。マウスおよびラットとは対照的に、しかし、ヒトと同様に、モルモットは、ａ）低用量のエアゾール化Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感受性である；ｂ）ツベルクリンに対する強い皮膚ＤＴＨを示す；そしてｃ）Ｌａｎｇｈａｎｓ巨細胞および乾酪を肺の病巣において提示する。しかし、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに感染した約１０％の免疫能力のあるヒトのみが、その生涯にわたって活性な疾患を発症する（半分は暴露後早期に、そして半分は潜伏期間の後に）のに対して、感染したモルモットは常に、早期に活性な疾患を発症する。モルモットはこのことに関してヒトとは異なるが、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染後に活性な疾患を発症するという一貫性は、ワクチン効力の試験において有利である。
【００６２】
本発明の教示に従って行った免疫接種材料を、対数増殖している野生型または組換えのＢＣＧ培養物（「細菌」）から取り出したアリコートから調製した。細菌の各アリコートを、３，５００×ｇでの１５分間の遠心分離によってペレット形成させ、次いで、１×リン酸緩衝化生理食塩水（１×ＰＢＳ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄した。次いで、免疫接種材料を、１×ＰＢＳ中１リットルあたり１×１０^４のコロニー形成単位の最終濃度になるように再懸濁し、そして１００μｌあたり１，０００の生存細菌を含んでいた。
【００６３】
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの、特定の病原体を含まない２５０ｇ〜３００ｇの異系交配雄性Ｈａｒｔｌｅｙ系統モルモットモルモット（９匹ずつの群）に、以下のうちの１つを皮内免疫した：１）ＢＣＧ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ［１０^３コロニー形成単位（ＣＦＵ）］１回のみ（時間０週間）；２）ｒＢＣＧ３０ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ（１０^３ ＣＦＵ）１回のみ（時間０週間）；３）精製した組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質（ｒ３０）、１００μｌ Ｓｙｎｔｅｘアジュバント処方物（ＳＡＦ）中１００μｇ、３週間の間隔をあけて３回（時間０週間、３週間および６週間）；ＳＡＦは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、スクアレンおよびＴｗｅｅｎ ８０からなっており、そして最初の免疫では、アラニルムラミルジペプチド；および４）ＳＡＦのみ（１００μｌ）（偽免疫）、３週間の間隔をあけて３回（時間０週間、３週間および６週間）。さらなる群の３匹の動物を、ＳＡＦのみ（１００μｌ）で偽免疫し、そして皮膚試験コントロールとして用いた。これらおよび３〜６匹の他の偽免疫動物を、チャレンジ実験において非感染コントロールとして役立てた。
【００６４】
唯一の免疫（ＢＣＧ群およびｒＢＣＧ３０群）または最初の免疫（ｒ３０群および偽免疫皮膚試験群）の９週間後、モルモットの背中を剃り、そして１００μｌリン酸緩衝化生理食塩水中の１０μｇの精製組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質（ｒ３０）を皮内注射した。２４時間後、紅斑および硬化の直径を測定した（チャレンジ研究において用いた群とは別々の群の偽免疫動物を皮膚試験のために用いた。チャレンジ研究において用いた偽免疫動物は、皮膚試験自体が結果に影響を与え得る可能性を除去するために皮膚試験しなかった）。
【００６５】
最初または唯一の免疫の９週間後、および皮膚試験の直後、動物に、１×１０^５コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む１０ｍｌ単細胞懸濁物から生成されたエアゾールをチャレンジした。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｅｒｄｍａｎ株（ＡＴＣＣ ３５８０１）を、異系交配モルモットを通して毒性を維持し、７Ｈ１１寒天で培養し、穏やかな超音波処理に供して、単細胞懸濁物を得て、そして動物におけるチャレンジ実験における使用のために−７０℃で凍結させた。チャレンジエアゾール用量は、約４０個の生桿菌を各動物の肺に送達した。空気伝播感染経路は、肺結核についての自然の感染経路であるので、空気伝播染経路を用いた。比較的短い時間枠（１０週間）において１００％のコントロール動物において測定可能な臨床的病気を誘導するために、大きな用量を用いた。その後、モルモットを、層流生物災害安全封じ込め内に含まれたステンレス鋼のケージにおいて個々に飼育し、標準的な実験餌および水に自由に接近させた。動物を病気について観察し、そして１０週間にわたって毎週計量し、次いで安楽死させた。各動物の右肺および脾臓を取り出し、そしてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＣＦＵについて培養した。
【００６６】
２つの実験の各々において、偽免疫動物および野生型ＢＣＧで免疫した動物は、３０ｋＤａの組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ主要細胞外非融合タンパク質（ｒ３０）を用いて試験した際に紅斑および硬化をほとんどまたは全く示さなかった。対照的に、ｒ３０またはｒＢＣＧ３０で免疫した動物は、偽免疫動物または野生型ＢＣＧ免疫動物においてよりも有意に高い、顕著な紅斑および硬化を示した（表１および図２）。
【００６７】
２つの実験の各々において、感染していないコントロールは、ｒＢＣＧ３０または野生型ＢＣＧのいずれかで免疫した動物と同様に、チャレンジ後に体重が正常に増えた（図３）。実際、３つの群の間で体重増加において有意差は存在しなかった。対照的に、偽免疫動物において、そしてｒ３０免疫動物においてはより低い程度で、実験の経過の間、体重増加の減少を示した（表２および図３）。それゆえ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓをチャレンジした後、ＢＣＧおよびｒＢＣＧ３０の両方は、動物を、体重減少から完全に保護した。体重減少は、ヒトにおける結核の主な身体的徴候であり、そしてこの慢性感染疾患のモルモットモデルにおける結核の顕著な特徴である。
【００６８】
２つの実験の各々において、１０週間の観察期間の終わりに、モルモットを安楽死させ、そして各動物の右肺および脾臓を無菌的に取り出し、そしてＭ．ｔｕｂｅｒｃｌｔｌｏｓｉｓのＣＦＵについてアッセイした。偽免疫動物は、肺および脾臓において最大の細菌負荷を有した（表３および図４ａおよび図４ｂ）。ｒ３０で免疫した動物は、肺および脾臓において、偽免疫動物よりも少ない生物を有した；ＢＣＧ免疫動物は、ｒ３０免疫動物よりも少ない生物を有した；そして、顕著なことに、ｒＢＣＧ３０免疫動物は、ＢＣＧ免疫動物よりも少ない生物を有した。２元要因配置分散分析法を用いて平均を比較する統計学的試験は、実験１における４つの「処置」群（偽、ｒ３０、ＢＣＧおよびｒＢＣＧ３０）の平均が、実験２における４つの処置群と統計的に有意差がないこと、それゆえ、２つの実験におけるデータを合わせることが適切であることを実証した。合わせたデータを表４および図３に示す。このうちで大きな興味および重要性があるのは、ｒＢＣＧ３０免疫動物が、ＢＣＧ免疫動物よりも、肺において０．５ ｌｏｇ少ない生物を、そして脾臓においてほぼ１ ｌｏｇ少ない生物を有したことである。平均を比較するために分散分析法を用い、統計学的有意性を評価するためにＴｕｋｅｙ−Ｆｉｓｈｅｒ最少有意差（ＬＳＤ）基準を用いる統計分析において、肺および脾臓の両方における４つの各々の群の平均は、他の各々の群の平均とは有意に異なっていた（表４）。ｒＢＣＧ３０免疫動物とＢＣＧ免疫動物との差は、肺においてｐ＝０．０２で有意であり、そして脾臓においてｐ＝０．００１で有意であった。肺におけるＣＦＵの差を全体的な検査に対応させると、ｒＢＣＧ３０免疫動物の肺は、ＢＣＧ免疫動物よりも肺の破壊が少なかった（２０±４％対３５±５％の平均±ＳＥ）。
【００６９】
従って、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｌｔｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質を発現する組換えＢＣＧの投与は、高度に感受性の肺結核モルモットモデルにおいてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのエアゾールチャレンジに対する高レベルの防御を誘導した。対照的に、以下の実施例に記載するように、ＢＣＧと組み合わせたアジュバント中での同じマイコバクテリア細胞外非融合タンパク質（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ組換え３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質）の投与は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのエアゾールチャレンジに対して高レベルの生成を誘導せず；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質を発現する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの投与もこれを誘導せず；ＢＣＧとほぼ同じサイズでかつＢＣＧ同様に６０日間〜９０日間かけてタンパク質を徐放するミクロスフェア中でのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質の投与もこれを誘導せず；リポソーム中に封入されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外非融合タンパク質の投与もこれを誘導しなかった。
【００７０】
本発明の非常に驚くべき局面は、野生型は内因性の非常に類似の３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を発現および分泌するとはいえ、ｒＢＣＧ３０株が野生型ＢＣＧよりも優れた防御を誘導したことである（図１を参照のこと）。ＢＣＧ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ亜株由来の３０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子は、配列決定されていない。しかし、これらの亜株のクローニングされた遺伝子の配列から演繹されたＢＣＧの２つの他の亜株の３０ｋＤａタンパク質の配列は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質とは１アミノ酸のみによって（ＢＣＧ Ｐａｒｉｓ １１７３ Ｐ２）または２つのさらなるアミノ酸を含めて５アミノ酸によって異なる（ＢＣＧ Ｔｏｋｙｏ）（Ｈａｒｔｈ，Ｇ．、Ｂ．−Ｙ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｌ．Ｃｌｅｍｅｎｓ，およびＭ．Ａ．Ｈｏｒｗｉｔｚ．１９９６．Ｎｏｖｅｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ３０−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｍａｊｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：３０３８−３０４７（この内容全体は、本明細書中に参考として援用される）の３０４１−３０４２頁を参照のこと）。それゆえ、組換え株の改善された防御は、組換えタンパク質と内因性タンパク質との間の小さなアミノ酸の相違に起因しないようである。よりありそうなのは、これは、組換え非融合タンパク質の、内因性タンパク質と比較して増強された発現に起因することである。そうである場合、多コピー数のプラスミドを用いることによって得られる豊富な発現は、組換えワクチンの成功において重要な要因であるようであった。
【００７１】
【表１】

【００７２】
【表２】

【００７３】
【表３】

【００７４】
【表４】

【００７５】
【表５】

【００７６】
【表６】

【００７７】
【表７】

以下の実施例は、本発明の新規局面を例示するために役立つ。各実施例は、本発明のワクチンと密接に関連するが本発明のワクチンとは異なる技術を用いて本発明の免疫原を送達する手段を例示する。詳細には、実施例１は、本発明の免疫原をＢＣＧとともに投与したが、ＢＣＧによってインビボで発現されない場合には高レベルの防御免疫が達成されないことを実証する。
【００７８】
実施例２は、ＢＣＧと密接に関連するが哺乳動物宿主中で複製できないＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．を用いた本発明の免疫原のインビボ発現が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジに対する有意なレベルの防御を誘導することができないことを実証する。実施例３および実施例４は、全身性ワクチンミクロキャリアによる本発明の免疫原の徐放もまた、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジに対して有意なレベルの防御を誘導できないことを実証する。
【００７９】
それゆえ、以下の実施例は、本発明の細胞内病原体ワクチンが感染性疾患の免疫の分野において提示する、全く驚くべきでかつ顕著な進歩を強調するために役立つ。
【００８０】
（実施例）
（実施例１：ＢＣＧ＋組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質（ｒ３０）でのモルモットの免疫は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジに対して高レベルの防御を誘導しない）
本発明者らは予め、強力なアジュバント（ＳＡＦ，Ｓｙｎｔｅｘ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）中のＢＣＧ＋ｒ３０でモルモットを免疫した。ｒ３０タンパク質（１免疫あたり１００μｇ）を、３回皮内投与した。このことは、ｒ３０に対して強固な皮膚遅延型過敏症（Ｃ−ＤＴＨ）応答を誘導した（図５）。実際、Ｃ−ＤＴＨ応答は、ｒ３０を発現する組換えＢＣＧによって誘導される応答に匹敵した。それにもかかわらず、ＢＣＧおよびｒ３０の両方での免疫は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジに対する高レベルの防御を誘導しなかった（表５）。ＢＣＧおよびｒ３０の両方で免疫した動物は、肺および脾臓において、ＢＣＧ単独で免疫した動物よりも低いレベルのＣＦＵを有さなかった。この結果は、ｒ３０を発現する組換えＢＣＧで免疫した動物が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでチャレンジした場合に高いレベルの防御を示した、上記の結果とは反対である。
【００８１】
（実施例２：ネイティブな形態と区別できない形態でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質（ｒ３０）を発現する生組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓでのモルモットの免疫は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ でのチャレンジに対して高レベルの防御を誘導しない）
本発明者らがＢＣＧで動物を免疫した同じ実験のうちの１つで、本発明者らは、モルモットを、ネイティブな形態と区別できない形態でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質（ｒ３０）を発現する生組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓで免疫した。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓによるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質（ｒ３０）の発現および分泌は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を発現および分泌する組換えＢＣＧ株の発現および分泌に等しいかまたはそれより大きかった。さらに、動物宿主におけるＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの乏しい増殖を補償してあまりあるようにするために、組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの用量（１０^９細菌）は非常に高く、組換えＢＣＧ（１０^３細菌）の用量の百万倍であった。さらにより補償するために、組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓを皮内に３回投与し、一方、組換えＢＣＧを１回だけ皮内に投与した。ｒ３０タンパク質を発現する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓでの免疫は、ｒ３０に対して強力な皮膚遅延型過敏症（Ｃ−ＤＴＨ）応答を誘導した。実際、Ｃ−ＤＴＨ応答は、ｒ３０を発現する組換えＢＣＧによって誘導される応答に匹敵したかまたはそれよりも大きかった。それにもかかわらず、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を発現する生組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジに対して高レベルの防御を誘導しなかった（表６）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を発現する生組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓで免疫した動物は、肺および脾臓において、ＢＣＧ単独で免疫した動物よりも低いレベルのＣＦＵを有さなかった。この結果は、ｒ３０を発現する組換えＢＣＧで免疫した動物が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでチャレンジした場合に高レベルの防御を示した、上記の結果とは反対である。
【００８２】
（実施例３：ＢＣＧとほぼ同じ大きさであり、ＢＣＧと同様に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質（ｒ３０）を６０日間〜９０日間かけて徐放するミクロスフェアでのモルモットの免疫は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジに対する高レベルの防御を誘導しない）
本発明者らがｒＢＣＧ３０およびＢＣＧで動物を免疫した同じ実験のうちの１つにおいて、本発明者らは、ＢＣＧとほぼ同じ大きさであり、ＢＣＧと同様に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質（ｒ３０）を６０日間〜９０日間かけて徐放するミクロスフェアでモルモットを免疫した。１セットの動物を、１０ｍｇのｒ３０を含むミクロスフェアで１回免疫した。別のセットの動物を、３．３ｍｇのｒ３０を含むミクロスフェアで３回免疫した。この量は、組換えＢＣＧ株によって発現されるｒ３０タンパク質の量を大きく超えるように算出された。いずれかのレジメンのミクロスフェアでの免疫は、ｒ３０に対して強固な皮膚遅延型過敏症（Ｃ−ＤＴＨ）応答を誘導した。実際、Ｃ−ＤＴＨ応答は、ｒ３０を発現する組換えＢＣＧによって誘導される応答に匹敵した。それにもかかわらず、ＢＣＧとほぼ同じ大きさであり、ＢＣＧと同様に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を徐放するミクロスフェアでの免疫は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジに対する高レベルの防御を誘導しなかった（表７）。このミクロスフェアで免疫した動物は、肺および脾臓において、ＢＣＧ単独で免疫した動物よりも低いレベルのＣＦＵを有さなかった。この結果は、ｒ３０を発現する組換えＢＣＧで免疫した動物が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジの場合に高レベルの防御を示した、上記の結果とは反対である。
【００８３】
（実施例４：Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を含むリポソームでのモルモットの免疫は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジに対する高レベルの防御を誘導しない）
実施例３と同じ実験において、本発明者らは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を含むリポソームでモルモットを免疫した。この動物を、５０μｇのｒ３０を含むリポソームで３回免疫した。このことは、ｒ３０に対する、中程度に強い皮膚遅延型過敏症（Ｃ−ＤＴＨ）応答を誘導した。Ｃ−ＤＴＨ応答は、ＢＣＧおよびコントロールのリポソームによって誘導される応答よりも大きかったが、ｒ３０を発現する組換えＢＣＧによって誘導される応答よりも小さかった。それにもかかわらず、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を含むリポソームでの免疫は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでのチャレンジに対する高いレベルの防御を誘導しなかった（表７）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を含むリポソームで免疫された動物は、肺および脾臓において、ＢＣＧ単独で免疫された動物よりも低いレベルのＣＦＵを有さなかった。この結果は、ｒ３０を発現する組換えＢＣＧで免疫された動物が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでチャレンジされた場合に高レベルの防御を示した、上記の結果と反対である。
【００８４】
本発明のワクチンは、細胞内病原体の治療的および予防的な処置に対する全く新たなアプローチを表す。充分に設計された一連の実験および考え深い分析を通して本発明者らは、正確に選択された細胞内病原体または近縁種を、本発明の教示に従って同じまたは異なる細胞内病原体の組換え細胞外タンパク質を発現するように形質転換した場合にのみ、防御免疫が達成されることを徹底的に実証した。
【００８５】
本発明をまた用いて、複数の細胞内病原体に対して同時に予防的および治療的な利益を提供し得る。例えば、Ｍ．ｂｏｖｉｓのような組換え弱毒化細胞内ワクチン接種因子は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐ．に対する免疫防御免疫原を同時に発現するように設計され得る。その結果、ワクチンを送達することにおける大きな効率が達成され得る。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの主要細胞外タンパク質を発現する組換えＢＣＧの非限定的な例は、本発明の充分に実行可能な実施形態として役立つのみならず、全体として、医学および人類に対する有意な進歩をも表す。
【００８６】
それゆえ、本発明の好ましい実施形態を示し、そして記載してきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の改変および変更が行われ得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、培養濾液からの、ＢＣＧの形質転換された株によるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ組換え３０ｋＤａの分泌を図示する、１ａおよび１ｂと標記したクーマシーブルー染色ゲルを示す。
【図２Ａ】 図２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を発現する組換えＢＣＧワクチン、ＢＣＧ単独、組換え３０ｋＤａタンパク質単独、または偽ワクチンが接種されたモルモットの皮膚試験の結果を比較するために設計された、２ａと標記した実験からの結果をグラフとして示す。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質を発現する組換えＢＣＧワクチン、ＢＣＧ単独、組換え３０ｋＤａタンパク質単独、または偽ワクチンが接種されたモルモットの皮膚試験の結果を比較するために設計された、２ｂと標記した実験からの結果をグラフとして示す。
【図３Ａ】 図３Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでの免疫チャレンジ後の、３ａと標記した、モルモットにおける体重変化をグラフとして示す。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでの免疫チャレンジ後の、３ｂと標記した、モルモットにおける体重変化をグラフとして示す。
【図４Ａ】 図４ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでの免疫チャレンジ後にモルモットの肺から回収された感染性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのコロニー形成単位（ＣＦＵ）をグラフとして示す。
【図４Ｂ】 図４ｂは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓでの免疫チャレンジ後にモルモットの脾臓から回収された感染性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのコロニー形成単位（ＣＦＵ）をグラフとして示す。
【図５】 図５は、偽ワクチン、ＢＣＧ単独および３０ｋＤａの組換えＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓとともに投与されたＢＣＧに対するモルモットの皮膚試験応答をグラフとして示す。

Claims (5)

1. 免疫原性組成物であって、該組成物は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質をコードする遺伝子を含む染色体外核酸配列を有する組換えカルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）細菌を含み、ここで、該Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの３０ｋＤａ主要細胞外タンパク質が発現され、そして、該染色体外核酸配列が、非熱ショック遺伝子プロモーターまたは非ストレスタンパク質遺伝子プロモーターの制御下にある、免疫原性組成物。
2. 前記主要細胞外タンパク質が非融合タンパク質である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
3. 医薬として使用するための請求項１〜２のいずれかに記載の免疫原性組成物であって、該医薬がワクチンである、免疫原性組成物。
4. 動物において免疫応答を誘導するための医薬の製造のための、請求項１〜２のいずれかに記載の免疫原性組成物の使用。
5. 動物において免疫応答を誘導するための、請求項１〜２のいずれかに記載の免疫原性組成物。

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