RU2266132C2 - Вакцины рекомбинантных внутриклеточных патогенов и способы их применения - Google Patents
Вакцины рекомбинантных внутриклеточных патогенов и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2266132C2 RU2266132C2 RU2002130716/15A RU2002130716A RU2266132C2 RU 2266132 C2 RU2266132 C2 RU 2266132C2 RU 2002130716/15 A RU2002130716/15 A RU 2002130716/15A RU 2002130716 A RU2002130716 A RU 2002130716A RU 2266132 C2 RU2266132 C2 RU 2266132C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bcg
- tuberculosis
- recombinant
- kda
- protein
- Prior art date
Links
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims abstract description 90
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 90
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 42
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims abstract description 10
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims abstract description 4
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 149
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 91
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 74
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 25
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 25
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 22
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 12
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 26
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 88
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 53
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 36
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 25
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 23
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 23
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 20
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 description 17
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 13
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 13
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 10
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 10
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 10
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 9
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 8
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 8
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 8
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 8
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000589268 Legionella sp. Species 0.000 description 5
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 5
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 5
- 241000187488 Mycobacterium sp. Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 4
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 4
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 3
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 3
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 3
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 3
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 206010001935 American trypanosomiasis Diseases 0.000 description 2
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 2
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 2
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 2
- 241000186363 Mycobacterium kansasii Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003571 opsonizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 2
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000032484 Accidental exposure to product Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000024699 Chagas disease Diseases 0.000 description 1
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241001495184 Chlamydia sp. Species 0.000 description 1
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101710088334 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85B Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000605314 Ehrlichia Species 0.000 description 1
- 241000605310 Ehrlichia chaffeensis Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000589244 Fluoribacter bozemanae Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 241000228402 Histoplasma Species 0.000 description 1
- 201000002563 Histoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 206010020429 Human ehrlichiosis Diseases 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 241000589264 Legionella longbeachae Species 0.000 description 1
- 208000004023 Legionellosis Diseases 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 241001084338 Listeria sp. Species 0.000 description 1
- 206010024641 Listeriosis Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000187478 Mycobacterium chelonae Species 0.000 description 1
- 241000186365 Mycobacterium fortuitum Species 0.000 description 1
- 241000187492 Mycobacterium marinum Species 0.000 description 1
- 241000187490 Mycobacterium scrofulaceum Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037151 Psittacosis Diseases 0.000 description 1
- 206010037688 Q fever Diseases 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000606695 Rickettsia rickettsii Species 0.000 description 1
- 241000606714 Rickettsia sp. Species 0.000 description 1
- 241000606726 Rickettsia typhi Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 108700027479 Syntex adjuvant formulation Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 201000005485 Toxoplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 1
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 1
- 206010047505 Visceral leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- 231100000818 accidental exposure Toxicity 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- -1 alanylmuramyl Chemical group 0.000 description 1
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 1
- 210000003237 epithelioid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002389 essential drug Substances 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000011554 guinea pig model Methods 0.000 description 1
- 238000011597 hartley guinea pig Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N ketorolac tromethamine Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)C1CCN2C1=CC=C2C(=O)C1=CC=CC=C1 BWHLPLXXIDYSNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229940042470 lyme disease vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 201000003265 lymphadenitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 201000000901 ornithosis Diseases 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 229940075118 rickettsia rickettsii Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000528 statistical test Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960002109 tuberculosis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/02—Local antiseptics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается вакцины рекомбинантных внутриклеточных патогенов, а именно: вакцины, содержащей рекомбинантную бациллу Кальметта-Герена (БЦЖ), и способа профилактики заболеваний, вызванных внутриклеточным патогеном Mycobacterium tuberculosis. Сущность изобретения заключается в разработке вакцины, содержащей рекомбинантную БЦЖ, имеющую внехромосомную ДНК, содержащую ген, который кодирует главный внеклеточный белок Mycobacterium tuberculosis в 30 кДа, а также в разработке способа профилактики заболеваний, вызванных внутриклеточным патогеном Mycobacterium tuberculosis у млекопитающих посредством введения рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей рекомбинантные иммуногенные антигены. Преимущество изобретения заключается в повышении эффективности БЦЖ. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 табл., 5 ил.
Description
Область техники
Настоящее изобретение в целом относится к иммунотерапевтическим агентам и вакцинам внутриклеточных патогенных организмов, таких как бактерии, простейшие, вирусы и грибы. Более конкретно, в отличие от вакцин и иммунотерапевтических агентов предшествующего уровня техники, основанных на патогенных субъединицах, уничтожающих патогены и ослабляющих природные патогены, в настоящем изобретении применяются рекомбинантные ослабленные патогены или близкородственные виды, которые экспрессируют и секретируют иммуногенные детерминанты выбранного патогена, стимулируя эффективный иммунный ответ у млекопитающих-хозяев. Иммуностимуляторные вакцины и иммунотерапевтические агенты согласно изобретению являются производными рекомбинантных ослабленных патогенов или близкородственных видов, которые экспрессируют иммунологические детерминанты in situ.
Предпосылки к созданию изобретения
Давно известно, что микроорганизмы-паразиты обладают способностью инфицировать животных, в результате этого вызывая болезнь и часто смерть хозяина. Патогенные агенты веками были лидирующей причиной смерти и продолжают причинять большие страдания. Несмотря на то, что в течение последних ста лет наблюдаются существенные успехи в профилактике и лечении многих инфекционных заболеваний, сложные взаимодействия между паразитом и хозяином все еще ограничивают универсальную эффективность терапевтических мер. Трудности противостояния изощренным инвазивным механизмам, проявляемым многими патогенными организмами, доказываются возрождением различных заболеваний, таких как туберкулез, а также появлением многочисленных штаммов бактерий и вирусов, устойчивых к лекарствам.
Среди данных патогенных агентов существенного эпидемиологического значения внутриклеточные бактерии, как установлено, являются особенно трудно поддающимися в плане терапевтических или профилактических мероприятий. Внутриклеточные бактерии, включая род Mycobacterium и род Legionella, проводят весь или часть своего жизненного цикла в клетках инфицированного организма хозяина, а не внеклеточно. Во всем мире внутриклеточные бактерии каждый год являются причиной миллионов смертей и бесчисленных страданий. Туберкулез во всем мире является лидирующей причиной смерти от единственного агента, вызывающего болезнь, с 10 миллионами новых случаев и 2,9 миллионами смертей каждый год. Кроме того, внутриклеточные бактерии являются причиной миллионов случаев проказы. Другие истощающие заболевания, передаваемые внутриклеточными агентами, включают в себя подкожный и висцеральный лейшманиоз, американский трипаносомоз (болезнь Чагаса), листериоз, токсоплазмоз, гистоплазмоз, трахому, пситтакоз, Q-лихорадку и легионеллез. К настоящему времени относительно мало может быть сделано для профилактики истощающих инфекций у чувствительных к ним индивидуумов, контактирующих со многими из данных организмов, из-за невозможности эффективной защиты популяций от таких внутриклеточных патогенов, что ведет к заболеваемости и смертности человека и животных, причиной которых являются такие агенты, туберкулез представляет собой одно из наиболее важных заболеваний, с которым борется человечество.
Специалисты в данной области техники должны понимать, что последующий пример обсуждения M. tuberculosis является иллюстрацией указаний настоящего изобретения и никоим образом не должен рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения лечением от M. tuberculosis. Сходным образом представленные здесь указания никак не ограничиваются лечением туберкулезных инфекций. Наоборот, данное изобретение может быть использовано для успешного обеспечения безопасных и эффективных вакцин и иммунотерапевтических агентов любого патогенного агента с помощью применения рекомбинантных ослабленных патогенов или рекомбинантных невирулентных организмов для экспрессии и, что не менее важно, для высвобождения иммунологически значимых белков патогенного организма.
В настоящее время считается, что приблизительно одна треть всемирной популяции заражена M. tuberculosis, что ведет к миллионам случаев туберкулеза легких ежегодно. Более конкретно, туберкулез легких человека, вызываемый первично M. tuberculosis, является главной причиной смерти в развивающихся странах. Способный к выживанию внутри макрофагов и моноцитов, M. tuberculosis может вызывать хроническую внутриклеточную инфекцию. M. tuberculosis относительно успешно обходит обычные защитные системы организма-хозяина в результате того, что могут укрыться внутри клеток, которые в первую очередь отвечают за выявление чужеродных элементов и последующую активацию иммунной системы. Более того, многие из лидирующих химиотерапевтических агентов, применяемых для лечения туберкулеза, обладают относительно низкой активностью против внутриклеточных организмов по сравнению с внеклеточными формами. Такие одинаковые патогенные свойства ранее препятствовали развитию всесторонне эффективных иммунотерапевтических агентов или вакцин против туберкулезных инфекций.
Несмотря на то, что данное заболевание является особенно острой проблемой здравоохранения в развивающихся странах Латинской Америки, Африки и Азии, оно становится также более распространенной в экономически развитых странах. В Соединенных Штатах повышенным риском отмечены определенные популяции, особенно городские малоимущие, иммунодефицитные индивидуумы и иммигранты из областей с высокой степенью заболеваемости. Главным образом из-за эпидемии СПИДа, в последние годы число случаев туберкулеза выросло в экономически развитых странах, часто в форме M. tuberculosis, устойчивой ко многим лекарствам.
В последнее время устойчивость туберкулеза к одному или более лекарствам выявлена в 36 из 50 штатов Америки. В Нью-Йорке одна треть всех протестированных случаев была устойчива к одному или более основных лекарств. Хотя не обладающий устойчивостью туберкулез можно лечить с помощью длительного курса антибиотиков, перспективы в отношении устойчивых к лекарствам штаммам остаются открытыми. Больные, инфицированные штаммами, устойчивыми к двум или более основным антибиотикам, характеризуются приблизительно 50% смертностью. В соответствии с этим безопасные и эффективные вакцины таких вариантов M. tuberculosis крайне необходимы.
Первичное инфицирование M. tuberculosis почти всегда наступает в результате вдыхания аэрозольных частиц, так как патоген может оставаться жизнеспособным в течение недель или месяцев во влажной или сухой слюне. Хотя первичным очагом инфекции являются легкие, организм может также вызывать инфекцию практически в любом органе, включая, но не ограничиваясь ими, кости, селезенку, почку, оболочки мозга и кожу. В зависимости от вирулентности конкретного штамма и устойчивости хозяина, инфекция и соответствующее повреждение ткани может быть небольшим или обширным. В случае человека первоначальная инфекция контролируется у большинства индивидуумов, контактировавших с вирулентными штаммами бактерий. Развитие приобретенного иммунитета после первичного заражения снижает пролиферацию бактерий, что ведет к излечиванию повреждений и оставляет субъекта практически бессимптомным.
Когда M. tuberculosis не контролируется инфицированным субъектом, это часто ведет к обширной деструкции легочной ткани. У восприимчивых индивидуумов повреждения обычно образуются в легком, так как бациллы туберкулеза воспроизводятся в альвеолярных или легочных макрофагах. Как только организмы размножились, они могут распространяться через лимфатическую систему к дистальным лимфатическим узлам и - через кровеносную систему - к верхушкам легких, костному мозгу, почке и оболочкам, окружающим мозг. В первую очередь в результате клеточных ответов иммунной системы по типу гиперчувствительности возникают грануломатозные повреждения или туберкулы, пропорционально тяжести инфекции. Эти повреждения состоят из эпителиодных клеток, окруженных моноцитами, лимфоцитами и фибробластами. В большинстве случаев повреждение или туберкула со временем становится некротическим и подвергается казеозу (превращению поврежденных тканей в мягкую субстанцию, напоминающую сыр).
В то время как M. tuberculosis является существенным патогеном, другие виды рода Mycobacterium также вызывают заболевание у животных, включая человека, и, несомненно, входят в объем настоящего изобретения. Например, M. bovis является близко родственной M. tuberculosis и отвечает за туберкулезные инфекции у домашних животных, таких как крупный рогатый скот, свиньи, овцы, лошади, собаки и кошки. Далее, M. bovis может инфицировать человека через кишечный тракт обычно при употреблении сырого молока. Местная кишечная инфекция, в конечном счете, распространяется до дыхательных путей, и за этим через короткое время следуют классические симптомы туберкулеза. Другим важным патогенным вектором рода Mycobacterium является M. leprae, которая вызывает миллионы случаев старинного заболевания проказы. Другие виды данного рода, которые вызывают заболевание у животных и человека, включают в себя M. kansasii, M. avium intracellulare, M. fortuitum, M. marinum, M. chelonei и M. scrofulaceum. Патогенные виды микобактерий часто проявляют высокую степень гомологии в соответствующих им последовательностях ДНК и соответствующих ей последовательностях белка, и некоторые виды, такие как M. tuberculosis и M. bovis, являются близкородственными.
По очевидным практическим и этическим соображениям исходная работа на человеке для определения эффективности экспериментальных композиций в отношении таких бедствий является неосуществимой. В соответствии с этим, на ранних этапах разработки любого лекарства или вакцины стандартной процедурой является применение подходящих животных моделей по причинам безопасности и экономичности. Успех применения в качестве моделей лабораторных животных предполагается на основе того, что иммуногенные эпитопы часто активны у хозяев различных видов. Таким образом, иммуногенная детерминанта у одних видов, например, у грызунов или морской свинки, должна быть обычно иммунореактивной у других видов, таких как человек. Только после достаточной разработки подходящих животных моделей должны проводиться клинические испытания на человеке для дополнительной демонстрации безопасности и эффективности вакцины у человека.
В отношении альвеолярного или легочного инфицирования M. tuberculosis морская свинка в качестве модели во многих отношениях очень сходна с человеком по патологии заболевания. Соответственно, специалистам в данной области понятно, что уместно экстраполировать модель данного заболевания на морской свинке, на человеке и других животных. Как и люди, морские свинки восприимчивы к туберкулезному инфицированию низкими дозами патогена человека M. tuberculosis в виде аэрозоля. В отличие от человека, у которого первичная инфекция обычно контролируется, у морских свинок при инфицировании патогеном в виде аэрозоля закономерно развивается диссеминированное заболевание, что ускоряет последующий анализ. Далее, и морские свинки, и человек проявляют кожные реакции гиперчувствительности замедленного типа, характеризующиеся развитием твердого уплотнения из мононуклеарных клеток или ригидной зоны в коже на месте тестирования. Наконец, характерные повреждения в виде туберкул у человека и морских свинок имеют сходную морфологию, включая присутствие гигантских клеток Langhans. Так как морские свинки более восприимчивы к первичной инфекции и прогрессии данного заболевания, чем человек, любая защита, подтвержденная в экспериментах с применением данной животной модели, убедительно указывает на то, что такой же защитный иммунитет может быть выработан у человека или других менее восприимчивых животных. Соответственно, только с целью объяснения, но не ограничения, настоящее изобретение должно быть в первую очередь продемонстрировано в виде примера на морских свинках в качестве млекопитающего-хозяина. Специалисты в данной области техники должны понимать, что настоящее изобретение может быть применено на других млекопитающих-хозяевах, включая человека и домашних животных.
Любое животное или человек, инфицированные патогенным организмом, в частности внутриклеточным организмом, представляет собой трудную задачу для иммунной системы хозяина. Несмотря на то, что многие инфекционные агенты могут эффективно контролироваться в результате гуморального ответа и соответствующей продукции защитных антител, данные механизмы эффективны в первую очередь только против тех патогенов, которые находятся во внеклеточной жидкости организма. В частности, опсонизирующие антитела взаимодействуют с внеклеточными чужеродными агентами, тем самым делая их чувствительными к фагоцитозу и последующему внутриклеточному уничтожению. Для других патогенов это не характерно. Например, предшествующие исследования показали, что гуморальный иммунный ответ, видимо, не играет существенной защитной роли в отношении инфицирования внутриклеточными бактериями, такими как M. tuberculosis. Однако настоящее изобретение дает возможность генерировать благоприятный иммунный ответ на патоген-мишень, и по существу его эффективность не ограничивается любым специфическим компонентом вызванного иммунного ответа.
Более конкретно, опосредованная антителами защита, по-видимому, не предотвращает первичного инфицирования внутриклеточными патогенами и становится неэффективной как только бактерии изолируются внутри клеток хозяина. Как водорастворимые белки, антитела могут распространяться во внеклеточной жидкости и крови, но для них затруднена миграция через липидные мембраны клеток. Далее, продукция опсонизирующих антител против структур бактериальной поверхности может фактически помогать внутриклеточным патогенам входить в клетку хозяина. Соответственно, любое эффективное профилактическое мероприятие против внутриклеточных агентов, таких как Mycobacterium, должно включать сильный компонент ответа клеточного иммунитета, ведущий к быстрой пролиферации антигенспецифических лимфоцитов, которые активируют затронутые фагоциты или цитотоксически уничтожают их. Однако, как будет подробно обсуждаться ниже, индукция ответа клеточного иммунитета не равняется индукции защитного иммунитета. Хотя клеточный иммунитет может исходно требоваться для защитного иммунитета, получение вакцин в соответствии с указаниями настоящего изобретения требует исследований с контрольным заражением на животных.
Такой клеточно-опосредованный иммунный ответ обычно включает в себя две стадии. Первоначальная стадия, сигнализирующая об инфицировании клетки, осуществляется с помощью специальных молекул (молекул главного комплекса гистосовместимости, или МНС), которые доставляют части патогена к клеточной поверхности. Такие молекулы МНС связывают небольшие фрагменты бактериальных белков, которые подверглись деградации в инфицированной клетке, и представляют их на поверхности клетки. Их представление Т-клеткам стимулирует иммунную систему хозяина в отношении уничтожения инфицированной клетки хозяина или стимуляции клетки хозяина в плане уничтожения поселившихся в ней бактерий.
Попытки избавления от туберкулеза с применением вакцин были начаты в 1921 году после того, как Кальметт и Герен успешно ослабили вирулентный штамм M. bovis, применяя способ серийных пассажей. Полученная живая вакцина, разработанная в институте Пастера в Лилле, Франция, известна как вакцина бациллы Кальметта и Герена, или БЦЖ. Примерно восьмидесятью годами позже, уже в настоящее время, данная вакцина остается для применения только в виде профилактического лечения туберкулеза. Действительно, все вакцины БЦЖ, имеющиеся в настоящее время, происходят из первоначального штамма M. bovis, полученного Кальметтом и Гереном в институте Пастера.
Всемирная организация здравоохранения рассматривает вакцину БЦЖ как существенный фактор снижения туберкулеза в мире, особенно в развивающихся странах. Теоретически вакцина БЦЖ дает клеточный иммунитет против ослабленной микобактерии, которая иммунологически близка к M. tuberculosis. Полученный иммунный ответ должен предотвращать первичный туберкулез. Таким образом, если предотвращается первичный туберкулез, не могут наступить латентные инфекции и избегается повторная активация заболевания.
Однако контролируемые клинические испытания выявили значительные вариации в эффективности вакцины. Описанные степени эффективности варьировались между 0-80%. Испытания вакцины на детях английской школы показали, что степень защиты через десять лет после вакцинации превышала 78%. Однако при сходном испытании в Южной Индии БЦЖ оказалась неспособной защитить против подтвержденного на культуре первичного туберкулеза в первые пять лет после инокуляции. Недавний мета-анализ эффективности БЦЖ в отношении предотвращения туберкулеза установил, что в целом профилактическая эффективность составляла приблизительно 50% (Colditz, G.A., T.F.Brewer, C.S.Berkey, M.E.Wilson, E.Burdick, H.V.Fineberg, and F.Mosteller. 1994. JAMA 271:698-702).
Данное значительное несоответствие в описанных степенях эффективности остается досадной проблемой для работников здравоохранения и практических врачей, которые должны определить, когда и как применять вакцину БЦЖ. Вовлечено множество факторов, которые могут отвечать за данные наблюдаемые несоответствия в эффективности, включая различия в способах получения, схемах инокуляции и характеристиках популяций и окружающих условиях, в которых применялись вакцины. Последняя работа предполагает, что случайный контакт с микобактериями окружающей среды может вести к "природной вакцинации", которая мешает реципиенту вакцины выработать эффективный ответ к природным белкам БЦЖ.
Для того чтобы свести к минимуму вариации иммуногенности БЦЖ, производители вакцины поддерживают контрольные запасы первоначальных штаммов вакцин в лиофилизованном (высушенном при замораживании) состоянии. Каждый получаемый штамм, происходящий из них, в свою очередь, называют в честь места производства, компании или бактериального штамма, например: БЦЖ-Лондон, БЦЖ-Копенгаген, БЦЖ-Connaught или БЦЖ-Tice (продаваемая в мировом масштабе Organon Inc.). Пытаясь стандартизовать способы получения, в Соединенных Штатах центр биологического образования и исследования (CBER) федерального министерства по лекарствам и пищевым добавкам (FDA) регулирует получение вакцин. Отдел CREB FDA установил, что каждый лиофилизованный штамм БЦЖ, применяемый для вакцинации, должен обладать способностью индуцировать определенную туберкулиновую кожную тест-реакцию у морских свинок и человека. К сожалению не показано, что индуцированная туберкулиновая чувствительность коррелирует с защитным иммунитетом.
В настоящее время вакцины БЦЖ предлагают в виде лиофилизованных культур, которые регидрируют в стерильном разбавителе непосредственно перед введением. Вакцину БЦЖ дают при рождении, в младенчестве или раннем детстве в странах, которые практикуют вакцинацию БЦЖ, включая развивающиеся и промышленно развитые страны. Посещающие эндемические районы взрослые индивидуумы, которые могут контактировать с высокими дозами инфекционных микобактерий, могут получить БЦЖ в качестве профилактического доказательства того, что они не реагируют на кожный тест. Побочные реакции на вакцину являются редкими и обычно ограничиваются изъязвлениями кожи и лимфаденитом в районе места введения. Однако, несмотря на редкие побочные реакции, вакцина БЦЖ имеет беспримерную историю безопасности при введении более трех миллиардов доз во всемирном масштабе с 1930 года.
С разработки вакцины БЦЖ прошло восемьдесят лет, и сейчас сохраняется недостаточность в приемлемых альтернативных вакцинах. Недавно изобретатели настоящего изобретения добились существенного прогресса в выделении, характеристике и рекомбинантной экспрессии внеклеточных белков, секретируемых внутриклеточными патогенами. Например, изобретатели патента США №5108745, зарегистрированного 28 апреля 1992 г., и нескольких ожидающих решения патентных заявок США предлагают вакцины и способы получения защитного иммунитета против L. pneumophila и M. tuberculosis, а также других внутриклеточных патогенов. Указанные вакцины предшествующего уровня техники в широком смысле основаны на внеклеточных продуктах, исходно происходящих из белковых компонентов, секретируемых во внеклеточную среду бактериями, находящимися в инфицированных клетках хозяина in vivo. Вакцины, предлагаемые здесь, избирательно основаны на идентификации внеклеточных продуктов или их аналогов, которые стимулируют сильный иммунный ответ против патогена-мишени у млекопитающего-хозяина.
Вакцины, полученные из отобранных внеклеточных продуктов M. tuberculosis, в настоящее время оптимизируются для применения в качестве профилактической терапии человека. Исследуются коктейли белков и индивидуальные белковые препараты с применением как рекомбинантных, так и экспрессирующихся в природе белков. Одной целью текущих исследований является доведение до максимума основного иммунного ответа путем оптимизации презентации иммуногена (белка). К настоящему времени сделано более 100 различных препаратов, включая 38 различных сочетаний белков, 26 различных адъювантов, 10 различных концентраций белков и семь различных режимов дозировки. Белки-кандидаты на вакцину были также привязаны к белкам, не происходящим из M. tuberculosis, включая бычий сывороточный альбумин, главный секреторный белок Legionella sp. и столбнячный токсин. Данный перечень не включает в себя способы, применяемые авторами настоящего изобретения для презентации внеклеточных белков внутриклеточных патогенов животным-хозяевам; скорее он иллюстрирует огромную сложность и присущее им разнообразие, связанные с оптимизацией вакцины. Однако, несмотря на данную и другую активность, никакое сочетание внеклеточных белков, адъювантов, белков-носителей, концентраций или частоты введения доз, приводящее к защитному иммунному ответу у морских свинок, не сравнимо или не превышает БЦЖ.
Недавно существенное внимание было сфокусировано на применении трансформированных штаммов БЦЖ для получения вакцин, которые экспрессируют различные связанные с клетками антигены. Например, C.K.Stover, et al. описали вакцину против болезни Лайма с применением рекомбинантной БЦЖ (рБЦЖ), которая экспрессирует связанный с мембраной липопротеин OspA Borrelia burgdorferi. Сходным образом, тот же автор также получил вакцину рБЦЖ, экспрессирующую белок поверхности пневмококка (PsPA) Sreptococcus pneumoniae. (Stover, C.K., G.P.Bansal, S.Langerman, and M.S.Hanson. 1994. Protective Immunity Elicited by rBCG Vaccines. In: Brown F. (ed): Recombinant Vectors in Vaccine Development. Dev Biol Stand. Dasel, Karger, Vol.82, 163-170.)
Патент Соединенных Штатов номер (USPN) 5504005 ("патент 005") и USPN 5854055 ("патент 055"), оба выпущенные B.R.Bloom et al., раскрывают теоретические векторы рБЦЖ, экспрессирующие широкий диапазон гибридных белков, ассоциированных с клетками, из многих штаммов микроорганизмов. Теоретические векторы, описанные в данных патентах, являются или направленными к гибридным белкам, ассоциированным с клетками, в виде противопоставления внеклеточным негибридным белкам-антигенам, и/или рБЦЖ гипотетически экспрессирует гибридные белки из отдаленно родственных штаммов. Более того, гибридные белки, ассоциированные с рекомбинантными клетками, экспрессируемые в данных моделях, кодируются ДНК, которая интегрирована в геном хозяина и находится под контролем промоторов белков теплового шока. Следовательно, экспрессируемые антигены являются гибридными белками, и экспрессия ограничивается уровнями, приблизительно равными или меньшими, чем природные белки векторов.
Более того, ни в одном из патентов "005 и 055" не раскрыта животная модель тестирования безопасности, развития иммунного ответа или защитного иммунитета в животной системе, которая наиболее близко имитирует болезнь человека. Кроме того, в "005 и 055" раскрыты только теоретические векторы рБЦЖ, экспрессирующие гибридные белки M. tuberculosis, никакие действующие вакцины не разработаны. Те модели вакцин M. tuberculosis, которые раскрыты, направлены на связанные с клетками гибридные белки теплового шока, а не на внеклеточные негибридные белки.
В патенте Соединенных Штатов номер 5830475 ("патент 475") также раскрыты теоретические микобактериальные вакцины, применяемые для экспрессии гибридных белков. ДНК, кодирующая данные гибридные белки, находится во внехромосомных плазмидах под контролем промоторов микобактериального белка теплового шока и промоторов белков стресса. Раскрытые вакцины предназначены для индукции иммунного ответа у животных, не являющихся человеком, с целью продукции у них антител, и не показано предотвращения заболеваний, вызванных внутриклеточными патогенами у млекопитающих. Более того, "патент 475" не раскрывает рекомбинантные вакцинирующие агенты, которые используют специфичные для белка промоторы для экспрессии внеклеточных негибридных белков.
Изобретатели настоящего изобретения предполагают без ограничения, что главные внеклеточные негибридные белки внутриклеточных патогенов могут быть важными молекулами иммунной защиты. Во-первых, внеклеточные негибридные белки, благодаря свойству их секреции патогеном во внутриклеточную среду клетки хозяина, доступны для процессинга и презентации иммунной системе в виде фрагментов, связанных с молекулами МНС на поверхности клетки хозяина. Данные комплексы пептид-МНС служат для предупреждения иммунной системы о присутствии в клетке хозяина спрятанных другим способом инвазивных патогенов, давая возможность иммунной системе создать подходящий противомикробный ответ против инвазивного патогена. Во-вторых, эффективная иммунизация внеклеточными белками способна индуцировать популяцию иммунных клеток, которые узнают те же самые комплексы пептид-МНС через некоторое время в будущем, когда комплексы экспонируются на клетках хозяина, инвазированных относящимся к этому внутриклеточным патогеном. Иммунные клетки становятся, таким образом, способными направляться к инфицированным клеткам хозяина и либо активировать их цитокинами, в результате чего они становятся способными ограничить рост внутриклеточного патогена, либо лизировать их, лишая таким способом патоген внутриклеточной среды, в которой он размножается. В-третьих, среди внутриклеточных белков главные, т.е. те, которые продуцируются в наибольших количествах, должны представляться наиболее важными в качестве иммунозащитных молекул, так как они обычно должны обеспечивать самую обширную презентацию комплексов пептид-МНС иммунной системе.
Следовательно, остается потребность в рекомбинантных вакцинах внутриклеточных патогенов, которые экспрессируют главные внеклеточные негибридные белки внутриклеточных патогенов, являющиеся близкородственными вакцинирующему агенту. Более того, существует потребность в рекомбинантных вакцинах внутриклеточных патогенов, которые способны гиперэкспрессировать рекомбинантные внеклеточные негибридные белки благодаря нехромосомной ДНК, имеющей промоторы, отличные от промоторов генов белков теплового шока, или промоторы, отличные от промоторов генов белков стресса.
Конкретно, остается срочная необходимость получения вакцин внутриклеточных патогенов, которые обеспечивают реципиентов защитой от заболеваний, которая превосходит защиту реципиентов, создаваемую вакциной БЦЖ. Более того, существует срочная необходимость предоставления как промышленно развитым, так и развивающимся странам реального по цене иммунотерапевтического и профилактического лечения туберкулеза и борьбы с другими внутриклеточными патогенами.
Следовательно, целью настоящего изобретения является предоставление терапевтических и профилактических вакцин для лечения и профилактики заболевания, вызванного внутриклеточными патогенами.
Другой целью настоящего изобретения является предоставление вакцин для профилактики болезней, вызываемых внутриклеточными патогенами, с применением внутриклеточных патогенов, которые трансформированы для экспрессии главных рекомбинантных иммуногенных антигенов того же самого патогена, другого внутриклеточного патогена или их обоих.
Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление вакцин для лечения и профилактики микобактериальных заболеваний с применением рекомбинантной БЦЖ, которая экспрессирует внеклеточные белок(белки) патогенной микобактерии.
Другой целью настоящего изобретения является предоставление вакцин для лечения и/или профилактики туберкулеза с применением рекомбинантных штаммов БЦЖ, которые экспрессируют и секретируют один или более главных внеклеточных белков Mycobacterium tuberculosis.
Краткое изложение существа изобретения
Настоящее изобретение преследует описанные выше и другие цели путем предоставления нового класса вакцин и иммунотерапевтических агентов, а также способов лечения и профилактики заболеваний, вызываемых внутриклеточными патогенами, у млекопитающих. Исторически вакцины внутриклеточных патогенов и иммунотерапевтические агенты получали из самого внутриклеточного патогена или близкородственных видов. Данные старые модели вакцин состояли из целого микроорганизма или его субъединиц. Например, первая и к настоящему времени единственная пригодная вакцина Mycobacterium tuberculosis является ослабленной живой вакциной, полученной от близкородственного внутриклеточного патогена M. bovis. Недавно изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что специфические внеклеточные продукты внутриклеточных патогенов, которые секретируются в ростовые среды, могут быть использованы для вызова защитных иммунных ответов у млекопитающих либо в виде индивидуальных субъединиц, либо в виде сочетаний субъединиц. Однако данные вакцины субъединиц не обеспечивали преимуществ по сравнению с исходной ослабленной вакциной, полученной из M. bovis.
Настоящее изобретение подробно описывает вакцины и иммунотерапевтические агенты, состоящие из рекомбинантных ослабленных внутриклеточных патогенов (вакцинирующих агентов), которые трансформированы для экспрессии внеклеточного(ых) белка(белков) (рекомбинантных иммуногенных антигенов) другого или того же самого внутриклеточного патогена. В одном осуществлении вакцины настоящего изобретения сделаны с применением рекомбинантных штаммов бациллы Кальметта и Герена или БЦЖ. В данном осуществлении рекомбинантная БЦЖ экспрессирует главные внутриклеточные белки патогенных микобактерий, включая, но не ограничиваясь этим, M. tuberculosis, M. leprae и M. bovis, называя некоторые из них.
Главные внеклеточные белки, экспрессируемые рекомбинантной БЦЖ, включают в себя, не ограничиваясь ими, 12 кДа, 14 кДа, 16 кДа, 23 кДа, 23,5 кДа, 30 кДа, 32А кДа, 32В кДа, 45 кДа, 58 кДа, 71 кДа, 80 кДа и 110 кДа Mycobacterium sp. и соответствующих аналогов, гомологов и их субъединиц, включая рекомбинантные негибридные белки, гибридные белки и их производные. Специалисту в данной области понятно, что молекулярные массы, применяемые для идентификации главных внеклеточных белков Mycobacteria и других внутриклеточных патогенов, обозначены только приблизительно. Специалисты в области рекомбинантной технологии и молекулярной биологии должны понимать, что возможна коэкспрессия (котрансляция) данных белков с дополнительными аминокислотами, полипептидами и белками, так же, как можно экспрессировать данные белки в укороченных формах. Полученные модифицированные белки все еще рассматриваются как входящие в объем настоящего изобретения, обозначаются ли они как нативные, негибридные белки, слитые белки, гибридные белки или химерные белки. В целях настоящего изобретения гибридные (слитые) белки определены как включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, продукты двух или более кодирующих последовательностей от различных генов, которые совместно клонировались и которые после трансляции образуют единую полипептидную последовательность.
В настоящем изобретении также описываются вакцинирующие агенты рекомбинантных ослабленных внутриклеточных патогенов, которые гиперэкспрессируют негибридные белки по меньшей мере от одного другого внутриклеточного патогена. Это усовершенствуется применением внехромосомных нуклеиновых кислот для экспрессии по меньшей мере одного рекомбинантного гена иммуногенного антигена и помещения данного гена(ов) под контроль генных промоторов, отличных от белков теплового шока, или генных промоторов, отличных от белков стресса, предпочтительно последовательностей промотора, специфичных для белка. Соответственно, предлагаются вакцины, имеющие негибридные рекомбинантные иммуногенные антигены, экспрессируемые в количествах, больших, чем это возможно, когда гены, кодирующие рекомбинантные иммуногенные антигены, стабильно интегрированы в геномную ДНК вакцинирующего агента. В результате этого предлагаются вакцины внутриклеточных патогенов, имеющие неожиданно превосходящую специфичность и эффективность по сравнению с существующими вакцинами субъединиц или ослабленных патогенов.
Более того, настоящее изобретение описывает способы лечения и профилактики заболеваний млекопитающих, вызываемых внутриклеточными патогенами с применением вакцин настоящего изобретения. Частичное перечисление многих внутриклеточных патогенов, которые могут быть использованы в качестве ослабленных вакцинирующих агентов и/или источника рекомбинантных иммуногенных антигенов, включает в себя, не ограничиваясь ими, Mycobacterium bovis, M. tuberculosis, M. leprae, M. kansasii, M. avium, Mycobacterium sp., Legionella pneumophila, L. longbeachae, L. bozemanii, Legionella sp., Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, Rickettsia sp., Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia phagocytophyla geno group, Ehrlichia sp., Coxiella burnetii, Leishmania sp., Toxpolasma gondii, Trypanosoma crusi, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia sp., Listeria monocytogenes, Listeria sp. и Histoplasma sp. В одном осуществлении настоящего изобретения рекомбинантную БЦЖ, экспрессирующую 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis, вводят млекопитающим с применением внутрикожных инокуляций. Однако понятно, что вакцины согласно изобретению могут быть введены с применением любого способа, который будет вести к соответствующему иммунному ответу, включая, но не ограничиваясь этим, подкожный, внутримышечный, интраназальный, внутрибрюшинный, пероральный способ введения или же с помощью ингаляции. После соответствующего постинокуляционного периода млекопитающих нагружали аэрозолем инфекционных M. tuberculosis. Млекопитающие, получавшие вакцину согласно изобретению, были заметно менее подвержены заболеванию по сравнению с млекопитающими, получавшими только БЦЖ, только главный внутриклеточный белок или любые их сочетания.
Другие цели, особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны для специалистов после рассмотрения подробного описания предпочтительных иллюстративных осуществлений, взятых в сочетании с чертежами, которые вначале будут описаны в краткой форме.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 отображены окрашенные Кумасси синим гели, обозначенные 1A и 1B, иллюстрирующие секрецию рекомбинантного Mycobacterium tuberculosis 30 кДа трансформированными штаммами БЦЖ из фильтратов культур.
На фиг.2 графически представлены результаты двух экспериментов, обозначенных как 2A и 2B, предназначенных для сравнения результатов кожных тестов у морских свинок, инокулированных рекомбинантной вакциной БЦЖ, экспрессирующей главный внеклеточный белок 30 кДа M. tuberculosis, одной БЦЖ, одним рекомбинантным белком 30 кДа или пустой вакциной.
На фиг.3 графически отображено изменение массы морских свинок, обозначенных как 3A и 3B, после постиммунизационного контрольного заражения M. tuberculosis.
На фиг.4A графически представлены колониеобразующие единицы (CFU) инфекционного M. tuberculosis, обнаруженные в легких морских свинок после постиммунизационного заражения M. tuberculosis.
На фиг.4B графически представлены колониеобразующие единицы (CFU) инфекционного M. tuberculosis, обнаруженные в селезенке морских свинок после постиммунизационного заражения M. tuberculosis.
На фиг.5 графически изображена кожная реакция морских свинок в ответ на пустую вакцину, в ответ на одну только БЦЖ, и в ответ на БЦЖ, введенную вместе с 30 кДа M. tuberculosis.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение направлено в целом на вакцины и иммунотерапию для лечения и профилактики инфекций у человека и животных, вызванных внутриклеточными патогенами. Конкретно, настоящее изобретение направлено на оптимизацию представления антигена внутриклеточного патогена, дающую возможность получателю иммунотерапии и/или вакцины генерировать максимальный иммунный ответ на терапевтически или профилактически важные белки. Авторы настоящего изобретения при исследованиях и экспериментировании на протяжении многих лет неожиданно обнаружили, что успешное лечение и профилактика инфекций внутриклеточным патогеном с применением внеклеточных белков, полученных из внутриклеточного патогена, зависит от представления белка хозяину.
Представление антигена охватывает группу переменных параметров, которые определяют, каким образом реципиент обрабатывает антиген и отвечает на него. Данные параметры включают в себя, не ограничиваясь ими, адъюванты, концентрацию компонентов вакцины, молекулы-носители, гаптены, частоту и способ введения дозы. Авторы настоящего изобретения показали, что одинаковые антигены в разных сочетаниях обычно вызывают статистически значимые различия в ответах у генетически сходных хозяев. Например, были составлены два препарата вакцины внеклеточного белка 30 кДа M. tuberculosis с применением одних и тех же концентраций белка и адъюванта. Одной группе морских свинок вводили вакцину, содержащую лишь белок 30 кДа и адъювант, а второй группе морских свинок вводили ту же самую вакцину, что и первой группе, за исключением того, что во вторую вакцину добавляли ИЛ-12. При сравнении иммунных ответов в двух группах оказалось, что морские свинки, получавшие вакцину с ИЛ-12, реагировали статистически значимо более сильным иммунным ответом.
В настоящем изобретении описано объединение двух технологий, одна из которых известна на протяжении восьмидесяти лет, а вторая является продуктом 1990-х годов. Совместно они представляют собой совершенно новый и неожиданно эффективный подход к представлению внеклеточных белков внутриклеточных патогенов реципиентам и индукции у них необычайно мощных защитных иммунных ответов. Авторы настоящего изобретения опробовали более 100 различных способов представления антигена с применением внеклеточных белков Mycobacterium tuberculosis как типичного внутриклеточного патогена. Однако, несмотря на многие успехи, достигнутые авторами настоящего изобретения, ни в одном из случаев не удавалось индуцировать иммунный ответ, превышающий тот, который наблюдается при действии одной только вакцины БЦЖ.
В краткой формулировке, предназначенной исключительно в качестве общего примера, настоящее изобретение включает в себя вакцины внутриклеточных патогенов с применением ослабленных или невирулентных рекомбинантных внутриклеточных патогенов ("вакцинирующего агента"), которые экспрессируют и секретируют рекомбинантные иммуногенные антигены того же самого вида, других видов или обоих типов ("иммуноген(ы)"); вакцинирующий агент и иммуноген(ы) вместе обозначаются как "вакцины" согласно изобретению. Вакцины вводят одним или более путем/путями, включая, но не ограничиваясь этим, подкожное, внутримышечное, интраназальное, внутрибрюшинное, внутрикожное, пероральное или ингаляторное введение. Вакцинирующие агенты согласно изобретению продолжают существовать в реципиенте, экспрессируя и секретируя иммуноген(ы) in situ (статус).
Не связывая себя данной теорией, авторы настоящего изобретения предположили, что иммуногенные антигены умеренных патогенов, таких как Legionella sp., могут вызывать защитные иммунные ответы легче, чем сходные иммуногенные антигены более традиционных патогенов животных, таких как Mycobacterium sp. Возможно, давление отбора привело к появлению у патогенов, таких как Mycobacterium sp., совместно эволюционировавших со своими естественными хозяевами, механизмов ускользания от иммунной атаки, отсутствующих у случайных или умеренных патогенов. Следовательно, для индукции защитных иммунных ответов против патогенных Mycobacteria должны быть разработаны значительно более мощные вакцинирующие агенты и иммуногены по сравнению с теми, которые необходимы для индукции защитного иммунитета против патогенов, для которых человек не является первичным хозяином.
Авторы настоящего изобретения ранее показали, что внеклеточные белки из умеренного внутриклеточного патогена Legionella sp. обеспечивают животным значительную иммунную защиту при введении в очищенной форме или в виде смесей с применением полного или неполного адъюванта Фрейнда. (См. USPN 5108745, включенный здесь в качестве ссылки.) Однако попытки получить сходные защитные иммунные ответы с применением внеклеточных белков M. tuberculosis в сходных условиях были не столь успешными. Поэтому авторы настоящего изобретения предположили, что гиперэкспрессия внеклеточных негибридных белков может оказаться важным аспектом представления антигена и развития защитных иммунных ответов. Ясно, однако, что хотя гиперэкспрессия негибридных иммуногенных внеклеточных белков может служить важным фактором в индукции иммунной защиты, не следует думать, что они являются единственными иммуностимулирующими факторами вакцин, предлагаемых в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение идеально приспособлено для получения высокоэффективных иммунозащитных вакцин против множества внутриклеточных патогенов, включая, но не ограничиваясь этим, штаммы БЦЖ, гиперэкспрессирующие главные внеклеточные негибридные белки M. tuberculosis, M. bovis или M. leprae. Каждая вакцина согласно изобретению может экспрессировать по меньшей мере один иммуноген с разной молекулярной массой, специфичный для данного внутриклеточного патогена. Например, авторы настоящего изобретения ранее идентифицировали иммуногены M. tuberculosis, которые включают в себя, не ограничиваясь ими, главные внеклеточные белки 12 кДа, 14 кДа, 16 кДа, 23 кДа, 23,5 кДа, 30 кДа, 32A кДа, 32B кДа, 45 кДа, 58 кДа, 71 кДа, 80 кДа, 110 кДа и их соответствующие аналоги, гомологи и субъединицы, включая рекомбинантные негибридные белки, гибридные белки и их производные. (См. ожидающие решения патентные заявки Соединенных штатов с регистрационными номерами 08/156358, 09/157689, 09/175598, 09/226539 и 09/322116, полное содержание которых приведено здесь в качестве ссылки.) Для специалистов в данной области ясно, что молекулярные массы, применяемые для идентификации главных внеклеточных белков Mycobacteria и других внутриклеточных патогенов, используются лишь как приближения. Специалисты в области рекомбинантной технологии и молекулярной биологии должны понимать, что возможна коэкспрессия (котрансляция) данных белков с дополнительными аминокислотами, полипептидами и белками, так же, как возможна и экспрессия данных белков в укороченных формах. Полученные модифицированные белки все еще рассматриваются как входящие в объем настоящего изобретения, независимо от того, относятся ли они к природным, негибридным белкам, слитым белкам, гибридным белкам или химерным белкам. Для целей настоящего изобретения гибридные белки определяются как включающие в себя, но не ограничивающиеся этим, продукты двух или более кодирующих последовательностей различных генов, которые клонировали совместно и которые после трансляции образуют единую полипептидную последовательность.
Экспрессия антигенов, включая внеклеточные белки, обычно увеличивается, когда гены, кодирующие рекомбинантные негибридные белки, локализуются на одной или более плазмидах (внехромосомной ДНК) и находятся под их контролем, по сравнению с интегрированными в геном хозяина генами. Более того, экспрессия белка, направляемая промоторными последовательностями, специфичными для конкретного белка, обеспечивает повышенную экспрессию и улучшенные упаковку и процессинг негибридных белковых антигенов. Поэтому в настоящем изобретении предлагаются рекомбинантные внеклеточные негибридные белки, кодируемые на внехромосомной ДНК, которые контролируются промоторами, отличными от промоторов генов белков теплового шока, или промоторами генов стрессорных белков, предпочтительно промоторными последовательностями, специфичными для белка.
В настоящем изобретении предлагаются рекомбинантные ослабленные вакцинирующие агенты внутриклеточного патогена, такие как рБЦЖ, которые экспрессируют свои собственные эндогенные внеклеточные белки в дополнение к рекомбинантным внеклеточным негибридным белкам близкородственных и/или других внутриклеточных патогенов. Однако на протяжении 80 лет исследований было показано, что эндогенные внеклеточные белки сами по себе не обеспечивают полной защиты у всех реципиентов. Более того, как будет объяснено подробнее ниже, авторы настоящего изобретения показали также, что простое совместное введение внеклеточных белков M. tuberculosis и традиционной БЦЖ не дает вакцин, лучших, чем одна БЦЖ.
В одном осуществлении настоящего изобретения вакцина включает в себя рекомбинантный БЦЖ-вакцинирующий агент, экспрессирующий лишь один иммуноген, например, 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis. В другом осуществлении настоящего изобретения рекомбинантная БЦЖ может экспрессировать два или более иммуногенов, например, 23,5 кДа и 30 кДа главные внеклеточные белки M. tuberculosis. Данное последнее осуществление может быть особенно эффективным в качестве вакцины для профилактики заболеваний у млекопитающих. Авторы настоящего изобретения предложили неограничивающую теорию, согласно которой одновременная гиперэкспрессия главных внеклеточных белков M. tuberculosis рекомбинантной БЦЖ 23,5 кДа и 30 кДа может действовать синергично для усиления защитного иммунного ответа млекопитающего против внутриклеточных патогенов согласно изобретению. Данная теория частично основана на наблюдении, что БЦЖ дикого типа и рекомбинантная БЦЖ являются делеционными мутантами M. bovis, которая в естественных условиях не экспрессирует свой собственный главный внеклеточный белок 23,5 кДа.
Ради краткости, но не для ограничения, а в силу чрезвычайно сложного описания, которое бы получилось, настоящее изобретение будет более конкретно описано с применением рекомбинантной БЦЖ в качестве вакцинирующего агента и внеклеточных негибридных белков M. tuberculosis, особенно 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка, в качестве иллюстративного осуществления настоящего изобретения. Ясно, что любой рекомбинантный иммуногенный антиген может быть экспрессирован рекомбинантным ослабленным внутриклеточным патогеном и что вакцины настоящего изобретения не ограничены БЦЖ в качестве вакцинирующего агента и главными внеклеточными негибридными белками M. tuberculosis в качестве иммуногенов.
Для определения эффектов вариаций штаммов вакцинирующего агента, для приготовления различных осуществлений настоящего изобретения применяли два разных штамма БЦЖ: БЦЖ Tice и БЦЖ Connaught. M. bovis БЦЖ Tice дикого типа была получена от Organon, а M. bovis БЦЖ Connaught дикого типа была получена от Connaught Laboratories, Toronto, Canada. Штаммы содержали в среде 7H9 с pH 6,7 (Difco) при 37°С в 5% CO2-95% атмосферном воздухе в виде невстряхиваемых культур. Культуры сонифицировали один или два раза в неделю в течение 5 мин в водяной бане для сонификации для снижения агрегации бактерий.
Рекомбинантную БЦЖ TICE (рБЦЖ30 Tice), экспрессирующую 30 кДа главный внеклеточный негибридный белок M. tuberculosis, получали следующим образом. Плазмиду pMTB30, рекомбинантную конструкцию челночной E. coli/микобактерии плазмиды pSMT3, получали, как описано ранее авторами настоящего изобретения в публикации Harth, G., B.-Y. Lee and M.A. Horwitz. 1997. High-level heterologous expression and secretion in rapidly growing nonpathogenic mycobacteria of four major Micobacterium tuberculosis extracellular proteins considered to be leading vaccine candidates and drug targets. Infect. Immun. 65:2321-2328, полное содержание которой включено здесь в качестве ссылки.
Вкратце, плазмида pMTB30 была сконструирована для экспрессии M. tuberculosis Erdman 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка из его собственного промотора (или промотора гена любого белка, не являющего белком теплового шока или стрессорным белком) путем вставки крупного фрагмента рестрикции геномной ДНК, содержащего ген 30 кДа негибридного белка плюс протяженные фланкирующие последовательности ДНК, в плазмидный сайт мультиклонирования с применением способов, известных специалистам в области технологии рекомбинантной ДНК. Плазмиду сначала вводили в E coli DH5α для получения больших количеств рекомбинантной плазмиды. Рекомбинантный штамм E. coli, который был неспособен экспрессировать 30 кДа негибридный белок M. tuberculosis, выращивали в присутствии 250 мкг/мл гигромицина, и последовательность ДНК плазмидной вставки определяли полностью. Плазмиду вводили в M. smegmatis с помощью электропорации с применением 6,25 кВ/см, 25 мкФ и 1000 мОм в качестве условий, дающих наибольшее количество позитивных трансформантов. Авторы настоящего изобретения подтверждали присутствие рекомбинантной плазмиды ростом в присутствии 50 мкг/мл гигромицина и конститутивной экспрессией и экспортом рекомбинантного 30 кДа негибридного белка по результатам электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблоттинга с поливалентным высокоспецифичным иммуноглобулином кролика против 30 кДа негибридного белка с применением способов, известных специалистам в области технологии рекомбинантной ДНК. Кроме того, изобретатели подтвердили правильность экспрессии и процессинга рекомбинантного 30 кДа негибридного белка M. tuberculosis, который был неотличим от природного белка при секвенировании N-концевых аминокислот.
Рекомбинантную pSMT3 плазмиду pMTB30 далее вводили в M. bovis БЦЖ Tice с применением 6,25 кВ/см, 25 мкФ и 200 мОм в качестве оптимальных условий электропорации. Трансформанты инкубировали в среде 7H9 с добавкой 2% глюкозы в течение 4 час при 37°С в экологическом шейкере и затем распластывали на 7H11 агаре с 20 мкг/мл гигромицина. Концентрацию гигромицина постепенно увеличивали до 50 мкг/мл путем субкультивирования трансформантов на новой ростовой среде. Рекомбинантные БЦЖ Tice культуры поддерживали при тех же самых условиях, что и культуры дикого типа, за исключением того, что среда 7H9 содержала 50 мкг/мл гигромицина.
Экспрессию и экспорт рекомбинантного 30 кДа негибридного белка M. tuberculosis подтверждали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблоттинга с поливалентным высокоспецифичным иммуноглобулином кролика против 30 кДа негибридного белка. Обычно 1 из 10 трансформантов экспрессировал и экспортировал значительно большие количества рекомбинантного негибридного белка, чем другие трансформанты; были выбраны два таких трансформанта и был получен большой запас данных трансформантов и заморожен при -70°С в среде 7H9, содержащей 10% глицерин. Данные трансформанты были применены для изучения эффективности вакцины у морских свинок. На Фиг.1A показана экспрессия 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis рекомбинантной БЦЖ Tice на ДДС-Na-ПАГЭ гелях и иммуноблотах. Рекомбинантный штамм экспрессировал значительно больше 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis, чем дикий тип, как на окрашенных кумасси синим гелях, так и на иммуноблотах.
Затем сходным с описанным выше для рекомбинанта БЦЖ Tice (рБЦЖ30 Tice) образом с применением упомянутой плазмиды pMTB30 был получен рекомбинант штамма M. bovis БЦЖ Connaught (рБЦЖ30 Conn), экспрессирующий 30 кДа главный внеклеточный негибридный белок M. tuberculosis. Его поддерживали в среде, содержащей гигромицин в концентрации 50 мкг/мл при тех же условиях, которые были описаны для рекомбинанта штамма БЦЖ Tice. На Фиг.1b показана экспрессия 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis рекомбинантной БЦЖ Connaught на ДДС-Na-ПАГЭ гелях и иммуноблотах. Рекомбинантный штамм экспрессировал значительно больше 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis, чем дикий тип, как на окрашенных кумасси синим гелях, так и на иммуноблотах.
Стабильность плазмид рекомбинантных штаммов БЦЖ оценивали биохимически. Этот биохимический анализ показал, что в присутствии гигромицина обе культуры рекомбинантных штаммов БЦЖ сохраняют постоянный уровень экспрессии рекомбинантного негибридного белка на протяжении периода роста, равного 3 месяцам. В отсутствие гигромицина те же культуры проявляют лишь слабое снижение экспрессии негибридного белка (в расчете на клетку), что свидетельствует о том, что рекомбинантная плазмида стабильно сохраняется и лишь очень медленно утрачивается у бактерий, растущих в отсутствие давления селекции (Фиг.1A и Фиг.1B, дорожка 3).
Ясно, что с помощью способов, описанных выше, в сочетании со способами, известными специалистам в области технологии рекомбинантной ДНК, могут быть получены рекомбинантные штаммы БЦЖ, экспрессирующие 32(A) кДа главный внеклеточный негибридный белок M. tuberculosis, 16 кДа главный внеклеточный негибридный белок, 23,5 кДа главный внеклеточный негибридный белок и другие главные внеклеточные негибридные белки M. tuberculosis. Более того, сходные методологии могут быть применены для получения рекомбинантных штаммов БЦЖ, экспрессирующих главные внеклеточные негибридные белки M. leprae, включая, но не ограничиваясь этим, 30 кДа главный внеклеточный негибридный белок M. leprae, являющийся гомологом 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis (a.k.a. Antigen 85B), 32(A) кДа главный внеклеточный негибридный белок M. leprae, являющийся гомологом 32(A) кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis (a.k.a. Antigen 85A), и другие главные внеклеточные негибридные белки M. leprae. Кроме того, сходные методологии могут быть также применены для получения рекомбинантной БЦЖ M. bovis, экспрессирующей 30 кДа главный внеклеточный негибридный белок M. bovis, являющийся гомологом 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis (a.k.a. Antigen 85B), 32(A) кДа главный внеклеточный негибридный белок M. bovis, являющийся гомологом 32(A) кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis (a.k.a. Antigen 85A), и другие главные внеклеточные негибридные белки M. bovis.
После успешного получения вакцины, вакцины согласно изобретению тестируют на безопасность и эффективность с применением животной модели. В исследованиях использовали морских свинок, поскольку модель морских свинок является особенно релевантной к туберкулезу человека клинически, иммунологически и патологически. В отличие от мыши и крысы, но, как и у человека, у морской свинки выявлены a) чувствительность к низким дозам аэрозольного M. tuberculosis; b) сильная кожная DTH на туберкулин; и c) гигантские клетки Langhans и створаживание в легочных повреждениях. Однако в то время как лишь приблизительно у 10% иммунокомпетентных людей, инфицированных M. tuberculosis, развивается активное заболевание в течение всей их жизни (у половины - вскоре после экспозиции, а у половины - после латентного периода), у инфицированных морских свинок всегда быстро развивается активное заболевание. Хотя в данном отношении морские свинки отличаются от человека, постоянство, с которым у них развивается активное заболевание после инфекции M. tuberculosis, является благоприятным в испытаниях активности вакцины.
Инокуляты для иммунизации, приготовленные согласно указаниям настоящего изобретения, готовили из аликвот, взятых из логарифмически растущих культур БЦЖ дикого типа или рекомбинантных БЦЖ ("бактерии"). Каждую аликвоту бактерий осаждали центрифугированием при 3500 × g в течение 15 мин и затем промывали 1 × забуференным физиологическим раствором (1 × ЗФР, 50 мМ фосфат натрия pH 7, 150 мМ хлористый натрий). После этого инокуляты для иммунизации ресуспендировали до конечной концентрации 1 × 104 колониеобразующих единиц на мл в 1 × ЗФР при содержании 1000 жизнеспособных бактерий на 100 мкл.
Свободных от специфического патогена 250-300 г неродственных морских свинок линии Hartley от Charles River Breeding Laboratories в группах по 9 иммунизировали внутрикожно одним из следующих: 1) БЦЖ Connaught [103 колониеобразующих единиц (CFU)] лишь один раз (время 0 недель); 2) рБЦЖ30 Connaught (103 CFU) лишь один раз (время 0 недель); 3) очищенным рекомбинантным 30 кДа главным внеклеточным негибридным белком M. tuberculosis (r30), 100 мкг в 100 мкл адъювантного состава Syntex (SAF), три раза с интервалами в три недели (время 0, 3 и 6 недель); SAF составлен из Pluronic L121, сквалана и твина 80, а при первой иммунизации - аланилмурамилдипептида; и 4) одним SAF (100 мкл) (ложная иммунизация) три раза с интервалами в три недели (время 0, 3 и 6 недель). Дополнительную группу из 3 животных подвергали ложной иммунизации одним SAF (100 мкл) и использовали в качестве контроля для кожного теста. Эти и от трех до шести других ложноиммунизированных животных служили в качестве неинфицированных контролей в экспериментах с контрольным заражением.
Девять недель спустя после единственной иммунизации (группы БЦЖ и рБЦЖ30) или первой иммунизации (группа r30 и группа ложноиммунизированных для кожного теста) у морских свинок брили спину, и им вводили внутрикожно 10 мкг очищенного рекомбинантного 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis (r30) в 100 мкл забуференного физиологического раствора. Через 24 часа измеряли диаметр эритемы и отвердения. (Отдельную группу ложноиммунизированных животных из тех, которые использовались в исследованиях с контрольным заражением, применяли для кожного теста. Ложноиммунизированных животных, использованных в исследованиях с контрольным заражением, не применяли для кожного теста, чтобы исключить возможность, что сам кожный тест мог бы влиять на результат.)
Спустя девять недель после первой или единственной иммунизации и сразу после проведения кожного теста животных подвергали контрольному заражению с помощью аэрозоля, полученного из 10 мл суспензии одиночных клеток, содержащей 1 × 105 колониеобразующих единиц (CFU) M. tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis штамма Erdman (ATCC 35801) пассировали на неродственных морских свинках для сохранения вирулентности, культивировали на агаре 7H11, подвергали мягкой сонификации для получения суспензии одиночных клеток и замораживали при -70°C для применения в экспериментах с контрольным заражением животных. Доза аэрозольного контрольного заражения обеспечивала доставку ~ 40 живых бацилл в легкие каждого животного. Воздушный путь инфекции применяли потому, что он является естественным путем инфекции при легочном туберкулезе. Большую дозу применяли для того, чтобы индуцировать заметное клиническое заболевание у 100% контрольных животных в пределах относительно короткого промежутка времени (10 недель). После этого морских свинок помещали в отдельные клетки из нержавеющей стали, помещаемые в камеру биологической защиты с ламинарным потоком, и обеспечивали свободный доступ к стандартному лабораторному корму и воде. Животных обследовали на заболевание и взвешивали еженедельно в течение 10 недель и затем умерщвляли. У каждого животного извлекали правое легкое и селезенку и культивировали для определения CFU M. tuberculosis.
В каждом из двух экспериментов ложноиммунизированные животные и животные, иммунизированные БЦЖ дикого типа, показали слабую эритемию и отвердение или их отсутствие при тестировании с рекомбинантным 30 кДа главным внеклеточным негибридным белком M. tuberculosis (r30). Напротив, животные, иммунизированные r30 или рБЦЖ30, показывали заметную эритему и отвердение, которые были значительно больше, чем у ложноиммунизированных или иммунизированных БЦЖ дикого типа животных (таблица 1 и фиг.2).
В каждом из двух экспериментов у неинфицированного контроля после контрольного заражения прибавка в массе была нормальной, как и у животных, иммунизированных либо рБЦЖ30, либо БЦЖ дикого типа (фиг.3). Действительно, между данными тремя группами не было существенных различий в прибавке массы. Напротив, у ложноиммунизированных животных и, в меньшей мере, у животных, иммунизированных r30, наблюдалась сниженная прибавка массы на протяжении эксперимента (таблица 2 и фиг.3). Следовательно, после контрольного заражения M. tuberculosis и БЦЖ, и рБЦЖ30 полностью защищали животных от потери массы, являющейся главным физическим показателем туберкулеза у человека и признаком туберкулеза у морских свинок, служащего моделью данного хронического инфекционного заболевания.
В каждом из двух экспериментов в конце 10-недельного периода наблюдений морских свинок умерщвляли, и у каждого животного в асептических условиях извлекали правое легкое и селезенку и подвергали их анализу на CFU M. tuberculosis. Ложноиммунизированные животные имели наибольшую бактериальную нагрузку в легких и селезенке (таблица 3 и фиг.4A и фиг.4B). Животные, иммунизированные r30, содержали меньше организмов в легких и селезенке по сравнению с ложноиммунизированными животными; животные, иммунизированные БЦЖ, содержали меньше организмов по сравнению с животными, иммунизированными r30; и, что особенно примечательно, животные, иммунизированные рБЦЖ30, содержали меньше организмов по сравнению с животными, иммунизированными БЦЖ. Статистические тесты с применением двустороннего факторного анализа дисперсии при сравнении средних значений показали, что средние значения для четырех "обработанных" групп (ложная, r30, БЦЖ и рБЦЖ30) в эксперименте 1 не отличались статистически от средних значений для четырех обработанных групп в эксперименте 2 и что поэтому было возможно объединить результаты двух экспериментов. Объединенные данные показаны в таблице 4 и на фиг.3. Наиболее интересным и важным было то, что животные, иммунизированные рБЦЖ30, содержали на 0,5 log меньше организмов в легких и почти на 1 log меньше организмов в селезенке, чем животные, иммунизированные БЦЖ. При статистическом анализе с применением методов дисперсионного анализа для сравнения средних и критерия Таки-Фишера наименьшего значимого различия для оценки статистической значимости, среднее значение для каждой из четырех групп, как в легких, так и в селезенке, значительно отличалось от среднего значения в каждой из остальных (таблица 4). Различия между животными, иммунизированными рБЦЖ30 и БЦЖ, в легких были значимы при p=0,02, а в селезенке - при p=0,001. Параллельно с различиями в CFU в легких при макроскопическом обследовании легкие животных, иммунизированных рБЦЖ30, имели меньше повреждений, чем легкие животных, иммунизированных БЦЖ (20 ± 4% против 35 ± 5%, среднее ± SE).
Таким образом, введение рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей 30 кДа главный внеклеточный негибридный белок M. tuberculosis, индуцировало высокую степень защиты от аэрозольного контрольного заражения M. tuberculosis на высокочувствительной модели легочного туберкулеза у морских свинок. Напротив, как описано в нижеследующих примерах, введение того же самого микобактериального внеклеточного негибридного белка (рекомбинантного 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis) в адъюванте в сочетании с БЦЖ не индуцирует высокую степень защиты от аэрозольного контрольного заражения M. tuberculosis, так же, как и введение рекомбинантной M. smegmatis, экспрессирующей 30 кДа главный внеклеточный негибридный белок M. tuberculosis; так же, как и введение 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis в микросферах, которые имеют приблизительно тот же размер, что и БЦЖ, и которые, подобно БЦЖ, медленно высвобождают белки на протяжении 60-90 дней; так же, как и введение 30 кДа главного внеклеточного негибридного белка M. tuberculosis, инкапсулированного в липосомы.
Крайне удивительным аспектом данного изобретения является то, что штамм рБЦЖ30 индуцировал защиту эффективнее, чем БЦЖ дикого типа, даже несмотря на то, что дикий тип экспрессирует и секретирует эндогенный высокогомологичный 30 кДа главный внеклеточный белок (см. фиг.1). Ген, кодирующий белок 30 кДа из варианта штамма БЦЖ Connaught, не был секвенирован. Однако последовательность белка 30 кДа двух других вариантов штамма БЦЖ, определяемая на основе последовательности клонированного гена указанных вариантов штамма, отличается от белка M. tuberculosis лишь одной аминокислотой (БЦЖ Paris 1173 P2) или 5 аминокислотами, включая две дополнительные аминокислоты (БЦЖ Tokyo). (См. страницы 3041-3042 публикации Harth, G., B.-Y.Lee, J.Wang, D.L.Clemens, and M.A.Horwitz. 1996. Novel insights into genetics, biochemistry, and immunocytochemistry of the 30-kilodalton major extracellular protein of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 64:3038-3047, полное содержание которой здесь включено в качестве ссылки.) Следовательно, улучшенная защита рекомбинантного штамма, по-видимому, не обусловлена небольшим аминокислотным различием между рекомбинантным и эндогенным белками. Более вероятно, что она обусловлена повышенной экспрессией рекомбинантного негибридного белка по сравнению с эндогенным белком. Если это так, то повышенная экспрессия, полученная с применением большого количества копий плазмиды, была важным фактором в эффективности рекомбинантной вакцины.
Таблица 1 | ||
Кожная гиперчувствительность замедленного типа в ответ на 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis | ||
Эритема (Средний диаметр±SE) (мм) |
Отвердение (Средний диаметр±SE) (мм) |
|
Эксперимент 1 | ||
Ложноиммунизированные | 0,0±0,0 | 1,0±0,0 |
R30 | 15,0±1,2 | 4,2±0,3 |
БЦЖ | 0,8±0,8 | 1,7±0,2 |
РБЦЖ30 | 19,8±2,2 | 3,1±0,2 |
Эксперимент 2 | ||
Ложноиммунизированные | 0,0±0,0 | 1,0±0,0 |
R30 | 15,3±0,9 | 5,2±0,7 |
БЦЖ | 3,0±1,5 | 1,0±0,0 |
РБЦЖ30 | 16,5±0,9 | 2,7±0,4 |
Таблица 2 | |||
Чистая прибавка массы после аэрозольного контрольного заражения вирулентным штаммом Erdman M. tuberculosis | |||
Неделя 0 (средняя масса ±SE) (г) |
Неделя 10 (средняя масса ±SE) (г) |
Чистый прирост массы (г) Недели 0-10 (среднее±SE) |
|
Эксперимент 1 | |||
Ложноиммунизированные | 763,1±17,1 | 805,4±27,8 | 42,3±28,2 |
R30 | 793,8±21,6 | 906,3±44,6 | 112,6±32,0 |
БЦЖ | 763,8±28,7 | 956,3±45,4 | 192,5±23,7 |
РБЦЖ30 | 767,8±17,6 | 947,7±31,3 | 179,9±25,1 |
Эксперимент 2 | |||
Ложноиммунизированные | 839,1±21,7 | 857,6±32,4 | 18,5±30,9 |
R30 | 801,9±36,3 | 888,6±39,7 | 86,7±28,3 |
БЦЖ | 796,6±29,8 | 963,6±19,8 | 167,0±23,3 |
РБЦЖ30 | 785,7±17,7 | 958,7±27,7 | 173,0±24,9 |
Таблица 3 | |||
Колониеобразующие единицы (CFU) M. tuberculosis в легких и селезенке животных, подвергнутых контрольному заражению аэрозолем штамма Erdman M. tuberculosis Объединенные эксперименты 1 и 2 |
|||
n | CFU легких Log10 (среднее±SE) |
CFU селезенки Log10 (среднее±SE) |
|
Ложноиммунизированные | 18 | 6,47±0,17 | 6,27±0,19 |
R30 | 18 | 6,02±0,14 | 5,73±0,14 |
БЦЖ | 17 | 5,00±0,13 | 4,57±0,17 |
РБЦЖ30 | 18 | 4,53±0,14 | 3,65±0,25 |
Таблица 4 | |
Резюме статистического анализа (ANOVA) CFU в легких и селезенке Объединенные эксперименты 1 и 2 |
|
Легкие | |
Ложно против r30 | P=0,03 |
R30 против БЦЖ | P=0,0001 |
БЦЖ против рБЦЖ30 | P=0,02 |
Селезенка | |
Ложно против r30 | P=0,05 |
R30 против БЦЖ | P=0,0001 |
БЦЖ против рБЦЖ30 | P=0,001 |
Таблица 5 | |||
Колониеобразующие единицы (CFU) M. tuberculosis в легких и селезенке животных, подвергнутых контрольному заражению аэрозолем с штаммом Erdman M. tuberculosis: Животных иммунизировали БЦЖ или БЦЖ плюс рекомбинантный 30 кДа белок M. tuberculosis в адъюванте или подвергали ложной иммунизации |
|||
n | CFU легких Log10 (среднее±SE) |
CFU селезенки Log10 (среднее±SE) |
|
Ложноиммунизированные | 17 | 6,40±0,18 | 5,65±0,20 |
БЦЖ | 8 | 4,70±0,13 | 2,91±0,35 |
БЦЖ+r30 | 9 | 5,30±0,23 | 3,34±0,37 |
Таблица 6 | |||
Колониеобразующие единицы (CFU) M. tuberculosis в легких и селезенке животных, подвергнутых контрольному заражению аэрозолем с штаммом Erdman M. tuberculosis: Животных иммунизировали живой рекомбинантной M. smegmatis, экспрессирующей 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis (rM. smegmatis 30) |
|||
n | CFU легких Log10 (среднее±SE) |
CFU селезенки Log10 (среднее±SE) |
|
Ложноиммунизированные | 9 | 6,63±0,27 | 6,34±0,29 |
БЦЖ | 8 | 4,61±0,14 | 4,31±0,27 |
M. smegmatis контроль | 9 | 5,92±0,31 | 5,29±0,34 |
rM. smegmatis30 | 9 | 5,48±0,26 | 5,55±0,28 |
Таблица 7 | |||
Колониеобразующие единицы (CFU) M. tuberculosis в легких и селезенке животных, подвергнутых контрольному заражению аэрозолем со штаммом Erdman M. tuberculosis: Животных иммунизировали микросферами, имеющими приблизительно тот же размер, что и БЦЖ, и, подобно БЦЖ, медленно высвобождающими 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis (r30) Животных иммунизировали липосомами, содержащими 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis (r30) |
|||
n | CFU легких Log10 (среднее±SE) |
CFU селезенки Log10 (среднее±SE) |
|
Ложноиммунизированные | 9 | 6,31±0,19 | 6,20±0,26 |
БЦЖ | 9 | 5,35±0,14 | 4,81±0,21 |
РБЦЖ30 | 9 | 4,48±0,14 | 3,73±0,33 |
Контрольные микросферы | 9 | 6,67±0,29 | 5,94±0,32 |
Микросферы с r30 (10 мг × 1) | 6 | 6,10±0,32 | 5,93±0,41 |
Микросферы с r30 (3,3 мг × 3) | 9 | 6,42±0,17 | 6,04±0,28 |
Контрольные липосомы | 9 | 6,24±0,23 | 6,41±0,21 |
Липосомы с r30 | 9 | 5,77±0,18 | 5,63±0,16 |
Следующие примеры служат для иллюстрации нового аспекта настоящего изобретения. Каждый пример иллюстрирует средства доставки иммуногенов согласно изобретению с помощью способов, близких к вакцине согласно изобретению, но отличных от нее. В частности, Пример 1 показывает, что когда иммуногены согласно изобретению вводят вместе с БЦЖ, но не экспрессируются in vivo посредством БЦЖ, высокая степень защитного иммунитета не достигается.
Пример 2 показывает, что экспрессия иммуногенов согласно изобретению in vivo с применением Mycobacterium sp., близкородственной БЦЖ, но не способной к репликации у млекопитающих-хозяев, не обеспечивает индукции значительного уровня защиты от контрольного заражения M. tuberculosis. Примеры 3 и 4 показывают, что медленное высвобождение иммуногенов согласно изобретению синтетическими микроносителями вакцины также не способно обеспечить индукцию значительного уровня защиты от контрольного заражения M. tuberculosis.
Таким образом, следующие примеры служат для того, чтобы подчеркнуть совершенно неожиданное и замечательное достижение, которое вакцины внутриклеточного патогена согласно изобретению вносят в область иммунологии инфекционных заболеваний.
Примеры
Пример 1
Иммунизация морских свинок БЦЖ плюс рекомбинантным 30 кДа главным внеклеточным белком M. tuberculosis (r30) не вызывает высокой степени защиты от контрольного заражения M. tuberculosis.
Ранее заявители иммунизировали морских свинок БЦЖ плюс r30 в эффективном адъюванте (SAF, Syntex Adjuvant Formulation). Белок r30 (100 мкг на иммунизацию) вводили внутрикожно три раза. Это вызывало сильный ответ кожной гиперчувствительности замедленного типа (C-DTH) на r30 (фиг.5). Действительно, ответ C-DTH был сопоставим с таковым, индуцированным рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей r30. Тем не менее, одновременная иммунизация БЦЖ и r30 не вызывала высокой степени защиты от контрольного заражения M. tuberculosis (таблица 5). У животных, иммунизированных одновременно БЦЖ и r30, уровень CFU в легких и селезенке был не ниже, чем у животных, иммунизированных одной только БЦЖ. Данный результат является прямо противоположным результату, описанному выше, когда животные, иммунизированные рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей r30, проявляли высокую степень защиты при контрольном заражении M. tuberculosis.
Пример 2
Иммунизация морских свинок живой рекомбинантной M. smegmatis, экспрессирующей 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis (r30) в форме, неотличимой от природной формы, не вызывает высокой степени защиты от контрольного заражения M. tuberculosis.
В тех же самых экспериментах, в которых авторы изобретения иммунизировали животных БЦЖ, они иммунизировали морских свинок живой рекомбинантной M. smegmatis, экспрессирующей 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis (r30) в форме, неотличимой от природной формы. Экспрессия и секреция 30 кДа главного внеклеточного белка M. tuberculosis (r30) M. smegmatis была такой же или более высокой по сравнений с рекомбинантным штаммом БЦЖ, экспрессирующим и секретирующим 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis. Более того, доза рекомбинантной M. smegmatis, 109 бактерий, была очень высокой, в миллион раз превышающей дозу рекомбинантной БЦЖ (103 бактерий), более чем достаточной для компенсации плохого размножения M. smegmatis у животного-хозяина. Для дополнительной компенсации рекомбинантную M. smegmatis вводили трижды внутрикожно, тогда как рекомбинантную БЦЖ вводили лишь однократно внутрикожно. Иммунизация рекомбинантной M. smegmatis, экспрессирующей белок r30, вызывала сильный ответ кожной гиперчувствительности замедленного типа (C-DTH) на r30. Действительно, ответ C-DTH был сопоставимым или более сильным по сравнению с индуцированным рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей r30. Тем не менее, живая рекомбинантная M. smegmatis, экспрессирующая 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis, не вызывала высокой степени защиты от контрольного заражения M. tuberculosis (таблица 6). Животные, иммунизированные живой рекомбинантной M. smegmatis, экспрессирующей 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis, не имели более низкого уровня CFU в легких и селезенке по сравнению с животными, иммунизированными одной только БЦЖ. Данный результат является прямо противоположным результату, описанному выше, когда животные, иммунизированные рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей r30, проявляли высокую степень защиты при контрольном заражении M. tuberculosis.
Пример 3
Иммунизация морских свинок микросферами, имеющими приблизительно тот же самый размер, что и БЦЖ, и, подобно БЦЖ, медленно высвобождающими 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis (r30) на протяжении 60-90 дней, не вызывает высокой степени защиты от контрольного заражения M. tuberculosis.
В тех же самых экспериментах, в которых заявители иммунизировали животных рБЦЖ30 и БЦЖ, заявители иммунизировали морских свинок микросферами, имеющими приблизительно тот же самый размер, что и БЦЖ, и, подобно БЦЖ, медленно высвобождающими 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis (r30) на протяжении 60-90 дней. Одну группу животных иммунизировали однократно микросферами, содержащими 10 мг r30. Другую группу животных иммунизировали троекратно микросферами, содержащими 3,3 мг r30. По расчетам, данное количество значительно превышало количество белка r30, экспрессируемого рекомбинантным штаммом БЦЖ. Иммунизация микросферами при любом режиме вызывала сильный ответ кожной гиперчувствительности замедленного типа (C-DTH) на r30. Действительно, ответ C-DTH был сопоставим с таковым, индуцированным рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей r30. Тем не менее, иммунизация микросферами, имеющими приблизительно тот же размер, что и БЦЖ, и, подобно БЦЖ, медленно высвобождающими 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis, не вызывала высокой степени защиты от контрольного заражения M. tuberculosis (таблица 7). У животных, иммунизированных микросферами, уровень CFU в легких и селезенке был не ниже, чем у животных, иммунизированных одной только БЦЖ. Данный результат является прямо противоположным результату, описанному выше, когда животные, иммунизированные рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей r30, проявляли высокую степень защиты при контрольном заражении M. tuberculosis.
Пример 4
Иммунизация морских свинок липосомами, содержащими 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis, не вызывает высокой степени защиты от контрольного заражения M. tuberculosis.
В том же самом эксперименте, что и в примере 3, авторы изобретения иммунизировали морских свинок липосомами, содержащими 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis. Животных иммунизировали троекратно липосомами, содержащими 50 мкг r30. Это вызывало умеренно сильный ответ кожной гиперчувствительности замедленного типа (C-DTH) на r30. Ответ C-DTH был выше такового, индуцированного БЦЖ и контрольными липосомами, но ниже индуцированного рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей r30. Тем не менее, иммунизация липосомами, содержащими 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis, не вызывала высокой степени защиты от контрольного заражения M. tuberculosis (таблица 7). Животные, иммунизированные липосомами, содержащими 30 кДа главный внеклеточный белок M. tuberculosis, не имели более низкого уровня CFU в легких и селезенке по сравнению с животными, иммунизированными одной только БЦЖ. Данный результат является прямо противоположным результату, описанному выше, когда животные, иммунизированные рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей r30, проявляли высокую степень защиты при контрольном заражении M. tuberculosis.
Вакцины согласно изобретению представляют собой совершенно новый подход к терапии и профилактике внутриклеточных патогенов. С помощью хорошо спланированных экспериментов и тщательного анализа авторы настоящего изобретения четко продемонстрировали, что защитный иммунитет достигается лишь тогда, когда точно выбранный внутриклеточный патоген или близкородственные ему виды трансформированы для экспрессии рекомбинантных внеклеточных белков того же самого или других внутриклеточных патогенов, в соответствии с указаниями настоящего изобретения.
Настоящее изобретение может быть также применено для получения профилактических и терапевтических эффектов в борьбе одновременно против множества внутриклеточных патогенов. Например, может быть сконструирован рекомбинантный умеренный внутриклеточный вакцинирующий агент типа M. bovis для экспрессии иммунозащитных иммуногенов одновременно против M. tuberculosis и Legionella sp. Соответственно, могла бы быть достигнута высокая эффективность целевых вакцин. Неограничивающие примеры рекомбинантной БЦЖ, экспрессирующей главные внеклеточные белки M. tuberculosis, не только являются полностью готовым осуществлением настоящего изобретения, но и представляют собой значительное достижение в медицине для человека в целом.
Таким образом, очевидно, что, хотя было показано и описано предпочтительное осуществление изобретения, могут быть внесены различные модификации и изменения в рамках истинной сути и объема данного изобретения.
Claims (6)
1. Способ профилактики заболеваний, вызванных внутриклеточным патогеном Mycobacterium tuberculosis, у млекопитающих, включающий в себя введение млекопитающему-хозяину рекомбинантной бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ), которая экспрессирует рекомбинантные иммуногенные антигены внутриклеточного патогена.
2. Способ профилактики заболеваний, вызванных внутриклеточным патогеном, у млекопитающих по п.1, где указанные рекомбинантные иммуногенные антигены представляют собой главные внеклеточные белки.
3. Вакцина, которая содержит рекомбинантную БЦЖ, имеющую внехромосомную ДНК, содержащую ген, который кодирует главный внеклеточный белок Mycobacteria tuberculosis в 30 кДа, где указанный главный внеклеточный белок Mycobacteria tuberculosis в 30 кДа экспрессируется и секретируется в повышенных количествах, так что у животного индуцируется иммунный ответ.
4. Вакцина по п.3, где указанный ген находится под контролем промотора, который не является промотором генов белков теплового шока или промотором генов стрессорных белков.
5. Вакцина по п.3, где указанный главный внеклеточный белок не является слитым белком.
6. Вакцина, которая содержит рекомбинантную БЦЖ, имеющую внехромосомную ДНК, содержащую ген, который кодирует главный внеклеточный не-слитый белок Mycobacteria tuberculosis в 30 кДа под контролем промотора, где указанный промотор не является промотором белков теплового шока или стрессорных белков и где указанный главный внеклеточный не-слитый белок в 30 кДа экспрессируется и секретируется в повышенных количествах, так что у животного индуцируется иммунный ответ.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/550,468 US6471967B1 (en) | 2000-04-17 | 2000-04-17 | Recombinant intracellular pathogen vaccines and methods for use |
US09/550,468 | 2000-04-17 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2002130716A RU2002130716A (ru) | 2004-03-27 |
RU2266132C2 true RU2266132C2 (ru) | 2005-12-20 |
Family
ID=24197308
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002130716/15A RU2266132C2 (ru) | 2000-04-17 | 2001-04-16 | Вакцины рекомбинантных внутриклеточных патогенов и способы их применения |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6471967B1 (ru) |
EP (1) | EP1274453B1 (ru) |
JP (1) | JP4868682B2 (ru) |
CN (1) | CN1437479B (ru) |
AT (1) | ATE404218T1 (ru) |
AU (1) | AU5355801A (ru) |
CA (1) | CA2406225C (ru) |
DE (1) | DE60135318D1 (ru) |
ES (1) | ES2315281T3 (ru) |
RU (1) | RU2266132C2 (ru) |
WO (1) | WO2001078774A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200209304B (ru) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7300660B2 (en) * | 1993-11-23 | 2007-11-27 | The Regents Of The University Of California | Abundant extracellular products and methods for their production and use |
US6924118B2 (en) * | 2000-04-17 | 2005-08-02 | The Regents Of The University Of California | Recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods for use |
AU2003218838A1 (en) * | 2002-04-16 | 2003-11-03 | Jun Liu | Tuberculosis vaccines including recombinant bcg strains expressing alanine dehydrogenase, serine dehydratase and/or glutamine synthetase |
WO2005037222A2 (en) * | 2003-10-16 | 2005-04-28 | The Regents Of The University Of California | Recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods for use |
WO2007121194A1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-25 | The Regents Of The University Of California | Immunostimulatory recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods of use |
US8383132B2 (en) * | 2003-10-16 | 2013-02-26 | The Regents Of The University Of California | Immunostimulatory recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods of use |
WO2007058663A2 (en) * | 2004-12-01 | 2007-05-24 | Aeras Global Tb Vaccine Foundation | Recombinant bcg strains with enhanced ability to escape the endosome |
GB0709373D0 (en) * | 2007-05-16 | 2007-06-27 | Thrombosis Res Inst | BCG-based anti-atheroma vaccine |
US8647641B2 (en) * | 2008-10-20 | 2014-02-11 | University Of Zurich | Mycobacterium tuberculosis vaccine |
US20130101614A1 (en) * | 2010-06-15 | 2013-04-25 | The Regents Of The University Of California | Novel live recombinant booster vaccine against tuberculosis |
SG191332A1 (en) * | 2010-12-21 | 2013-07-31 | Max Planck Gesellschaft | Recombinant mycobacterium as a vaccine |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5807723A (en) | 1987-03-02 | 1998-09-15 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Homologously recombinant slow growing mycobacteria and uses therefor |
EP0347425B1 (en) | 1987-03-02 | 1995-12-27 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Recombinant mycobacterial vaccine |
US5591632A (en) | 1987-03-02 | 1997-01-07 | Beth Israel Hospital | Recombinant BCG |
US5504005A (en) | 1987-03-02 | 1996-04-02 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Recombinant mycobacterial vaccine |
JP2903414B2 (ja) | 1989-05-31 | 1999-06-07 | 味の素株式会社 | 抗酸菌分泌発現ベクター及び抗酸菌 |
JPH07502646A (ja) | 1991-10-21 | 1995-03-23 | メディミューン,インコーポレーテッド | リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するdnaを含む細菌発現ベクター |
US5736367A (en) | 1992-03-31 | 1998-04-07 | Medimmune, Inc. | Vectors and prokaryotes which autocatalytically delete antibiotic resistance |
US5679515A (en) | 1994-10-03 | 1997-10-21 | Pathogenesis Corporation | Mycobacterial reporter strains and uses thereof |
US5700683A (en) | 1995-02-17 | 1997-12-23 | Pathogenesis Corporation | Virulence-attenuating genetic deletions deleted from mycobacterium BCG |
US5869057A (en) | 1995-06-07 | 1999-02-09 | Rock; Edwin P. | Recombinant vaccines to break self-tolerance |
-
2000
- 2000-04-17 US US09/550,468 patent/US6471967B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-04-16 CN CN018110045A patent/CN1437479B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-16 AT AT01927074T patent/ATE404218T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-04-16 DE DE60135318T patent/DE60135318D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-16 RU RU2002130716/15A patent/RU2266132C2/ru active
- 2001-04-16 WO PCT/US2001/012380 patent/WO2001078774A2/en active Application Filing
- 2001-04-16 EP EP01927074A patent/EP1274453B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-16 CA CA2406225A patent/CA2406225C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-04-16 AU AU5355801A patent/AU5355801A/xx not_active Withdrawn
- 2001-04-16 ES ES01927074T patent/ES2315281T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-16 JP JP2001576073A patent/JP4868682B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-11-15 ZA ZA200209304A patent/ZA200209304B/en unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HARTH GUNTER et al., High-lebel heterologous expression and secretion in rapidly growing nonpathogenic mycobacteria of our major Mycobacterium tuberculosis extracellular proteins considered to be leading vaccine candidates and drug targets, Infection and Immunity, 1997, v.65, pp.2321-2328. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE60135318D1 (de) | 2008-09-25 |
JP4868682B2 (ja) | 2012-02-01 |
WO2001078774A2 (en) | 2001-10-25 |
RU2002130716A (ru) | 2004-03-27 |
ZA200209304B (en) | 2004-08-13 |
CN1437479B (zh) | 2012-12-05 |
AU5355801A (en) | 2001-10-30 |
EP1274453A2 (en) | 2003-01-15 |
JP2004507453A (ja) | 2004-03-11 |
US6471967B1 (en) | 2002-10-29 |
ES2315281T3 (es) | 2009-04-01 |
ATE404218T1 (de) | 2008-08-15 |
EP1274453B1 (en) | 2008-08-13 |
CN1437479A (zh) | 2003-08-20 |
WO2001078774A3 (en) | 2002-03-28 |
CA2406225A1 (en) | 2001-10-25 |
CA2406225C (en) | 2012-06-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Goodwin et al. | Brucellosis vaccines for livestock | |
US10010595B2 (en) | Live recombinant booster vaccine against tuberculosis | |
Chambers et al. | Vaccination of mice and cattle with plasmid DNA encoding the Mycobacterium bovis antigen MPB83 | |
RU2266132C2 (ru) | Вакцины рекомбинантных внутриклеточных патогенов и способы их применения | |
Buddle | Vaccination of cattle against Mycobacterium bovis | |
ZA200502596B (en) | Recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods for use | |
Villarreal et al. | Proliferative and T-cell specific interleukin (IL-2/IL-4) production responses in spleen cells from mice vaccinated with aroA live attenuated Salmonella vaccines | |
JP2006501304A5 (ru) | ||
US8287879B2 (en) | Immunostimulatory recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods of use | |
AU2001253558B2 (en) | Recombinant intracellular pathogen vaccines and methods for use | |
Dhiman et al. | Immunoprophylactic properties of 71-kDa cell wall-associated protein antigen of Mycobacterium tuberculosis H 37 Ra | |
US8163294B2 (en) | Growth regulatable recombinant BCG compositions | |
US8383132B2 (en) | Immunostimulatory recombinant intracellular pathogen immunogenic compositions and methods of use | |
US20030124135A1 (en) | Recombinant intracellular pathogen vaccines and methods for use | |
AU2001253558A1 (en) | Recombinant intracellular pathogen vaccines and methods for use | |
KR20230173517A (ko) | 면역활성 부위 융합 단백질을 포함하는 결핵 백신 조성물 | |
Surendran | Unraveling the host innate immune response to a respiratory model of Brucella abortus |