CN1437479B - 重组胞内病原体疫苗和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供预防哺乳动物胞内病原体性疾病的疫苗和免疫治疗药，所述疫苗及免疫治疗药由已经转化表达相同或其它胞内病原体的重组免疫原性抗原的重组减毒胞内病原体构成。示例性的疫苗和免疫治疗药包括表达分枝杆菌和/或其它胞内病原体的主要胞外非融合蛋白的减毒重组分枝杆菌。已表明这些示例性的疫苗在哺乳动物体内产生令人惊奇的有效保护性免疫应答，超过了任何先前已知的抗分枝杆菌疫苗的保护性免疫应答。更准确地讲，提供表达结核分枝杆菌30kDa主要胞外非融合蛋白的重组BCG。另外，提供预防和治疗由胞内病原体引起的疾病的方法。所述胞内病原体性疾病的预防和治疗方法利用所述令人惊奇的有效疫苗和免疫治疗药。

Description

重组胞内病原体疫苗和使用方法
关于政府权利
本发明在美国政府支持下完成，由卫生与人类服务部(theDepartment of Health and Human Services)提供的资助号为AI31338。美国政府在本发明中享有一定的权利。
发明领域
本发明总的来讲涉及针对诸如细菌、原生动物、病毒和真菌的胞内致病生物的免疫治疗药和疫苗。更准确地讲，与基于病原体亚单位、灭活病原体和减毒天然病原体的现有技术疫苗和免疫治疗药不同，本发明使用表达并分泌刺激哺乳动物宿主有效免疫应答的所选病原体的免疫原性决定簇的重组减毒病原体或密切相关种。本发明的免疫刺激疫苗和免疫治疗药来源于原位表达免疫原性决定簇的重组减毒胞内病原体或密切相关种。
发明背景
长期以来，人们已经认识到寄生微生物具有感染动物的能力，从而引起疾病并常常导致宿主死亡。病原体历来都是导致死亡的主要原因，并且继续给人类造成巨大灾难。虽然过去几百年来，已经在许多感染性疾病的预防和治疗方面取得了显著的进步，但是复杂的宿主-寄生物相互作用仍限制治疗措施的广泛有效性。难以对付许多致病生物表现出的复杂侵入机制的证据是诸如结核病的众多疾病的死灰复燃以及出现细菌和病毒的众多抗药性菌株。
在主要流行病学关注的病原体中，已经证实胞内细菌是治疗性或预防性措施特别难对付的病原体。包括分枝杆菌属(Mycobacterium)和军团菌属(Legionella)在内的胞内细菌在受感染宿主生物的细胞内而不是在细胞外完成其全部或部分生活史。在全世界范围内，胞内细菌每年导致数百万人死亡，而患病者更不计其数。结核病是由一种病原体导致死亡的主要病因，全球每年有1000万新病例出现，并且导致290万人死亡。另外，胞内细菌引起数百万麻风病病例。其它由胞内病原体传播、衰弱型疾病包括皮肤和内脏利什曼病、美洲锥虫病(恰加斯病(Chagas disease))、李斯特菌病、弓形体病、组织胞浆菌病、沙眼、鹦鹉热、Q热和军团菌病。其时，几乎不能对接触这些生物中的许多生物的易感个体进行预防，以防止衰弱型感染。由于不能有效地保护群体免患这类胞内病原体感染，从而导致由这类病原体引起的人和动物病死率，结核病是现在人类面对的最重要疾病中的一种。
本领域技术人员会认识到，下文对结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的示例性讨论是说明本发明的内容，而决不是指本发明范围限于结核分枝杆菌治疗。同样，本文中的内容不以任何方式限于结核性感染的治疗。相反，本发明通过利用表达并同样重要地释放所述致病生物免疫学上重要的蛋白的重组减毒病原体或重组无毒力生物，可以用来有利地提供安全有效的针对任何病原体的疫苗和免疫治疗药。
据目前认为，大约世界人口的三分之一受到结核分枝杆菌感染，每年导致数百万肺结核病例。更准确地讲，主要由结核分枝杆菌引起的人类肺结核是发展中国家死亡的主要病因。能够在巨噬细胞和单核细胞内存活的结核分枝杆菌可以产生慢性胞内感染。结核分枝杆菌通过将其自身隐藏在主要负责检查外源因子并随后激活免疫系统的细胞内而在规避宿主生物的正常防御方面是相当成功的。此外，许多用来治疗结核病的第一线化疗药对与胞外生物相比的胞内生物的活性相对低。迄今为止，这些相同致病特征阻碍了开发针对结核性感染完全有效的免疫治疗药或疫苗。
虽然这种疾病在拉丁美洲、非洲和亚洲的发展中国家是特别严重的健康问题，但是这种疾病在第一世界也逐渐变得更加普遍。在美国，特殊人群、尤其是城区穷人、免疫受损个体和来自疾病高发区的移民的危险性增大。近几年来，主要由于AIDS流行，结核病发病率在发达国家通常以广谱抗药结核分枝杆菌形式增加。
最近，在美国50个州中的36个州已经报道结核病对一种或多种药物有抗性。在纽约市，所有已测病例中的三分之一对一种或多种主要药物有抗性。虽然非抗性结核病可以用抗生素的一个较长疗程来治愈，但是对于抗药性菌株的前景却不容乐观。感染抗两种或两种以上主要抗生素的菌株的患者的致死率约为50％。因此，非常需要针对这类结核分枝杆菌变种安全有效的疫苗。
结核分枝杆菌的初次感染几乎总是通过吸入气雾化颗粒而发生，因为所述病原体在湿痰或干痰中可以保持活力达数周或数月。虽然感染的主要部位位于肺部，但是所述生物也可以引起几乎任何器官(包括但不限于骨、脾、肾、脑脊膜和皮肤)的感染。根据具体菌株的毒力和宿主的抵抗力，所述感染和对所述组织的相应损害可以是局部或广泛的。就人类而言，初次感染在大多数接触所述细菌的毒性菌株的个体中受到控制。初次攻击后产生的获得性免疫减少细菌增殖，从而使得病变痊愈并且使受治疗者基本上无症状。
当结核分枝杆菌在受感染者中未得到控制时，它通常导致肺组织的广泛降解。在易感个体中，损害通常在肺部形成，因为所述结核杆菌在尘细胞或肺巨噬细胞内繁殖。正是由于所述生物繁殖，它们可以通过淋巴系统扩散到远处的淋巴结，并且通过血流扩散到肺尖、骨髓、肾和大脑周围的脑脊膜。主要因为细胞介导的超敏反应，所产生的特征性肉芽肿病变或结核结节与所述感染的严重程度成正比。这些病变包括接近单核细胞的上皮样细胞、淋巴细胞和成纤维细胞。在大多数情况下，病变或结核结节最终会坏死并经历干酪性坏死(受感染组织转变为柔软干酪样物质)。
尽管结核分枝杆菌是一种重要病原体，但是分枝杆菌属的其它种在包括人在内的动物中也引起疾病，显然包括在本发明的范围内。例如，牛分枝杆菌(M.bovis)与结核分枝杆菌密切相关，并且在诸如牛、猪、绵羊、马、狗和猫的驯养动物中引起结核性感染。此外，牛分枝杆菌可以通过肠道、通常由于摄入未消毒鲜奶而感染人。局部肠感染最终扩散到呼吸道，随后不久就出现典型的结核病症状。分枝杆菌属另一重要的致病载体是引起数百万古老疾病病例—麻风的麻风分枝杆菌(M.leprae)。在动物和人类中引起疾病的该属的其它种包括堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、鸟胞内分枝杆菌(M.aviumintracellulare)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、海分枝杆菌(M.marinum)、龟分枝杆菌(M.chelonei)和瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)。所述致病分枝杆菌种常常在其相应的DNA序列和相应的蛋白质序列方面表现出高度的同源性，并且有些种例如结核分枝杆菌和牛分枝杆菌高度相关。
为了显而易见的现实和道义原因，在承受这种痛苦的病人身上测定实验组合物功效的初步工作是不可行的。因此，在任何药物或疫苗的早期研发阶段，由于安全和成本原因，标准的方法是采用合适的动物模型。免疫原性表位通常在不同宿主物种中是有活性的，说明所进行的实验室动物模型能够取得成功。因而，在一种物种例如啮齿动物或豚鼠中的免疫原性决定簇一般在不同物种例如在人类中有免疫反应性。只有在合适动物模型进行足够开发后，才能在人类中进行临床试验，以进一步证明疫苗在人类中的安全和功效。
就结核分枝杆菌引起肺泡或肺部感染而言，豚鼠模型在许多方面非常类似于所述疾病的人体病理学。因此，本领域技术人员熟知可将这种疾病的豚鼠模型外推至人和其它动物。如同人类一样，豚鼠对低剂量的气雾化人类病原体结核分枝杆菌易感结核性感染。与其中初次感染通常受到控制的人类不同，当接触气雾化病原体后，豚鼠持续发生播散性疾病，因而有利于后续分析。此外，豚鼠和人均表现出特征为在皮肤试验部位发生致密单核细胞硬结或发硬区的皮肤迟发型超敏反应。最后，人和豚鼠的特征性结核结节病变表现出相似的形态学，包括朗格汉斯巨大细胞的存在。由于豚鼠比人对所述疾病的初次感染和进程更加敏感，所以在实验中利用这种动物模型所产生的任何保护强有力地表明可以在人或其它敏感性低的哺乳动物中产生相同保护性免疫。因此，仅仅为了解释而不是限制，本发明主要在豚鼠作为哺乳动物宿主的示例中加以说明。本领域技术人员将会认识到，可以用其它哺乳动物宿主(包括人和驯养动物)实施本发明。
任何感染致病生物、尤其是胞内生物的动物或人都难以有效刺激宿主免疫系统。尽管许多感染性病原体可以通过体液应答和相应产生的保护性抗体而得到有效控制，但是这些机制主要仅针对位于机体胞外液中的病原体有效。具体来说，调理抗体与胞外外来病原体结合，从而使得它们对吞噬作用易感，随后将其在细胞内杀伤。然而对于其它病原体情况不是这样。例如，先前的研究已经表明，体液免疫应答针对胞内细菌例如结核分枝杆菌的感染似乎不能起有效的保护作用。然而，本发明可以对所述靶病原体产生有益的体液应答，因此，本发明的有效性不限于刺激免疫应答的任何特定组分。
更准确地讲，抗体介导的防御似乎不阻止胞内病原体的初次感染，并且一旦将所述细菌隔绝在宿主细胞内就不起作用。由于水溶性蛋白—抗体可以穿过胞外液和血液，但是难以迁移跨过细胞的脂膜。此外，产生抗细菌表面结构的调理抗体可能实际上有助于胞内病原体进入宿主细胞。因此，任何针对胞内病原体例如分枝杆菌属的有效预防性措施应该包括导致抗原特异性淋巴细胞快速增殖的攻击性细胞介导的免疫应答组分，所述组分激活妥协的吞噬细胞或细胞毒性消除它们。然而，正如下文详细讨论，诱导细胞介导的免疫应答不等于诱导了保护性免疫。虽然细胞介导的免疫可能是保护性免疫的前提条件，但是依照本发明内容生产疫苗需要基于动物的攻击研究。
这种细胞介导的免疫应答一般包括两个步骤。第一步，通过特定分子(主要组织相容性分子或MHC分子)完成感染细胞的信号发送，将病原体的多个部分传递至细胞表面。这些MHC分子与在受感染细胞内已经降解的细菌蛋白的小片段结合，并将其呈递在细胞表面。它们呈递至T细胞刺激宿主免疫系统，以消除受感染宿主细胞或诱导宿主细胞根除在其中居留的任何细菌。
在卡尔默蒂(Calmette)和盖兰(Guérin)使用体外连续传代技术成功地弱化了牛分枝杆菌的毒力菌株之后，从1921年开始人们试图利用接种疫苗根除结核病。在法国里尔巴斯德研究所(the Institut Pasteur inLille，France)开发所得的活疫苗被称为卡介苗(the Bacille Calmette andGuérin)或BCG疫苗。八十多年以来，这种疫苗仍是结核病目前所使用的唯一预防性疗法。事实上，今天所使用的所有BCG疫苗都来源于巴斯德研究所的卡尔默蒂和盖兰研制的牛分枝杆菌的原始菌株。
世界卫生组织(the World Health Organization)认为BCG疫苗是全球、尤其是在发展中国家结核病降低的根本因素。理论上，BCG疫苗赋予针对免疫学上与结核分枝杆菌相关的减毒分枝杆菌细胞介导的免疫。所产生的免疫应答应该预防原发性结核病。因此，如果原发性结核病得到预防，则潜伏性感染就不可能发生，从而避免疾病复发。
然而，临床对照试验显示在疫苗功效方面有显著变化。报道的有效率在0-80％之间变动。在英国学龄儿童中进行的疫苗试验报道，接种疫苗后10年保护率超过78％。然而，在南印度的相似试验中，BCG在接种后前5年内不能保护培养物证实的原发性结核病。BCG在预防结核病方面的功效的最近总的分析(meta-analysis)估计，总体预防性功效大约为50％。(Colditz，G.A.T.F.Brewer，C.S.Berkey，M.E.Wilson，E.Burdick，H.V.Fineberg和F.Mosteller.1994.JAMA 271：698-702.)
在报道的效率方面的这种显著的差异对于健康官员和医师而言仍是一个令人不安的问题，所以健康官员和医师必须确定何时怎样使用BCG疫苗。已经暗示众多因素可能引起这些所观测到的功效差异，包括生产技术、接种途径和其中已使用疫苗的人口特征和环境方面的差异。最近的研究工作表明，偶然接触环境分枝杆菌可以产生“天然疫苗”，该疫苗防止疫苗受体建立对天然BCG蛋白的有效应答。
为了使BCG免疫原性变异减至最小，疫苗生产商以冻干(冷冻-干燥)状态保持原始疫苗菌株的原种。从其衍生的每种生产菌株进而在产地之后加上公司名或细菌菌株名，例如：BCG-London、BCG-Copenhagen、BCG-Connaught或BCG-Tice(Organon，Inc.全球销售)。美国致力于使生产技术标准化，联邦食品与药物管理局(the FederalFood and Drug Administration)(FDA)生物教育研究中心(CenterforBiologic Education and Research)(CBER)管理疫苗生产。FDA CBER机构规定，接种疫苗所用的每种冻干BCG菌株必须能够在豚鼠和人体内诱导特异性结核菌素皮肤试验反应。遗撼的是，已经显示诱导的结核菌素敏感性与保护性免疫无关。
目前，BCG疫苗作为冻干培养物提供，临用前再与无菌稀释剂水合。在实施BCG疫苗接种的国家，包括发展中国家和发达国家，BCG疫苗在出生时、婴儿期或儿童早期给予。可能已接触高剂量的感染性分枝杆菌的疫区成年游客可以预防性接受BCG，条件是他们皮肤试验无反应性。对所述疫苗有不利反应极其罕见，一般限于在注射部位附近的皮肤溃疡和淋巴结炎。然而，尽管有这些罕见的不利反应，但是从1930年起，全球已经给予的30亿剂以上的BCG疫苗具有空前的安全史。
自从研制出BCG以来，现在已经过去了八十多年，但仍没有可接受的疫苗代用品。最近，本发明人在由胞内病原体分泌的胞外蛋白的分离、鉴定和重组表达方面取得显著的进步。例如，本发明人的于1992年4月28日授予的美国专利第5,108,745号和几个待审的美国专利申请提供产生针对嗜肺军团菌(L.pneumophila)和结核分枝杆菌以及其它胞内病原体的保护性免疫的疫苗和方法。这些现有技术疫苗主要基于来源于由所述致病细菌胞外释放体外肉汤培养物并且由受感染宿主细胞体内的细菌释放到胞外的蛋白质性化合物的胞外产物。正如本文中所提供的，这些疫苗选择性地基于针对哺乳动物宿主体内靶病原体刺激强免疫应答的胞外产物或其类似物的鉴定。
从所选结核分枝杆菌胞外产物制备的疫苗目前最好作为人类预防性疗法使用。使用重组蛋白以及天然表达的蛋白质的蛋白质混合剂和单种蛋白制剂正在研究之中。这些正在研究的一个目的是通过优化免疫原(蛋白质)呈递使基础免疫应答最大化。迄今为止，已经制备100种以上的不同制剂，包括38种不同的蛋白组合，26种不同的佐剂，10种不同的蛋白浓度和若干种不同的给药方案。也将候选疫苗蛋白与包括牛血清白蛋白、军团菌主要分泌性蛋白质和破伤风类毒素在内的非结核分枝杆菌蛋白偶联。该一览表不包括本发明人用来将胞内病原体的胞外蛋呈递至宿主动物的方法；而是用来说明与疫苗优化相关的极端复杂性和固有变异性。然而，尽管有这些和其它活性，胞外蛋白、佐剂、载体蛋白、浓度或给药频率的组合没有导致在豚鼠体内诱导与BCG相当或优于BCG的保护性免疫应答。
最近，特别的关注集中于使用转化BCG菌株生产表达各种细胞相关抗原的疫苗。例如，C.K.Stover等已经报道使用表达布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的膜相关脂蛋白OspA的重组BCG(rBCG)生产的莱姆病(Lyme Disease)疫苗。同样，同一作者也生产出表达肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的肺炎球菌表面蛋白(PsPA)的rBCG疫苗。(Stover，C.K.，G.P.Bansal，S.Langerman和M.S.Hanson.1994.rBCG疫苗诱发的保护性免疫(Protective Immunity ElicitedbyrBCG Vaccines)。载于：Brown F.(编著)：Recombinant Vectors inVaccineDevelopment.Dev Biol Stand.Dasel，Karger，第82卷，163-170.)
授予B.R.Bloom等的美国专利号(USPN)5,504,005(“005专利”)和USPN5,854,055(“055专利”)公开了表达来自多种微生物的各种各样的细胞相关融合蛋白的理论rBCG载体。在这些专利中介绍的理论载体针对与胞外非融合蛋白抗原不同的细胞相关融合蛋白，和/或假设所述rBCG表达得自远缘相关物种的融合蛋白。此外，在这些模型中表达的重组细胞相关融合蛋白在整合到宿主基因组并且在热激启动子控制下的DNA上编码。因此，所表达的抗原是融合蛋白，并且表达限制水平大约等于或低于所述载体的天然蛋白。
此外，‘005专利和‘055专利都没有公开在最竭力模仿人类疾病的动物系统中的动物模型安全试验、免疫应答发生或保护性免疫。另外，在‘005和‘055中只公开了表达结核分枝杆菌融合蛋白的理论rBCG载体，实际疫苗还不可能。已公开结核分枝杆菌的那些疫苗模型涉及细胞相关热激融合蛋白，而没有涉及胞外非融合蛋白。
美国专利号5,830,475(“475专利”)也公开了用来表达融合蛋白的理论分枝杆菌疫苗。编码这些融合蛋白的DNA位于在分枝杆菌热激蛋白启动子和应激蛋白启动子控制下的染色体外质粒上。所公开的疫苗用来在非人类动物模型中诱发免疫应答，以生产其抗体，但没有显示可预防哺乳动物的胞内病原体性疾病。此外，‘475专利没有公开使用蛋白质特异性启动子表达胞外非融合蛋白的重组接种疫苗病原体(vaccinating agent)。
本发明人非限制性地提出，胞内病原体的主要胞外非融合蛋白可能是重要的免疫保护性分子。首先，胞外非融合蛋白，由于它们被病原体释放到宿主细胞的胞内环境，可用来加工并呈递至免疫系统，作为片段与所述宿主细胞表面的MHC分子结合。这些肽-MHC复合物使免疫系统监视宿主细胞内存在的其它隐藏侵入物，使得所述免疫系统建立针对所述侵入物的合适抗微生物攻击。其次，当所述复合物在相关胞内病原体侵入的宿主细胞上呈现时，用胞外蛋白有效免疫能够诱导在将来某一时间识别相同肽-MHC复合物的免疫细胞群体。因此，所述免疫细胞能够靶向受感染宿主细胞，并且用细胞因子将其激活，从而能够使其限制胞内病原体生长，或将其裂解，从而使所述病原体在其繁殖的胞内环境不能生存。第三，在所述胞外蛋白中，所述主要蛋白，即最大量产生的那些胞外蛋白，将最主要作为免疫保护性分子，由于它们一般提供最丰富呈现所述免疫系统的肽-MHC复合物所致。
因此，仍需要表达与所述接种疫苗病原体密切相关的胞内病原体的主要胞外非融合蛋白的重组胞内病原体疫苗。此外，需要借助于具有非热激基因启动子或非应激蛋白基因启动子的染色体外DNA能够过量表达重组胞外非融合蛋白的重组胞内病原体疫苗。
具体地说，仍迫切需要生产提供免患疾病的受体保护优于BCG疫苗受体提供的保护的胞内病原体疫苗。此外，迫切需要提供在发达国家和发展中国家均具有成本效益的免疫治疗性和预防性治疗结核病和其它胞内病原体。
因此，本发明的一个目的是提供用以治疗和预防由胞内病原体引起的疾病的治疗性和预防性疫苗。
本发明的另一个目的是提供预防胞内病原体性疾病的疫苗，所述疫苗使用已经转化的胞内病原体来表达相同胞内病原体、另一种胞内病原体或它们两者的主要重组免疫原性抗原。
本发明的再一个目的是提供治疗和预防分枝杆菌疾病的疫苗，所述疫苗使用重组BCG表达致病分枝杆菌的胞外蛋白。
本发明的另一个目的是提供治疗和/或预防结核病的疫苗，所述疫苗使用重组BCG菌株表达并分泌结核分枝杆菌的一种或多种主要胞外蛋白。
发明概述
本发明通过提供治疗和预防哺乳动物胞内病原体性疾病的一类新疫苗和免疫治疗药和方法，从而达到上述目的和其它目的。传统上胞内病原体疫苗和免疫治疗药均是从胞内病原体本身或密切相关种来制备。这些老的疫苗模式由完整微生物或其亚单位构成。例如，对于结核分枝杆菌而言，过去和现在唯一可用的疫苗是从密切相关胞内病原体牛分枝杆菌制备的减毒活疫苗。最近，本发明人发现，胞内病原体分泌到生长培养基中的特异性胞外产物可以或者作为单个亚单位或者以亚单位组合用来诱发哺乳动物保护性免疫应答。然而，这些亚单位疫苗没有证明优于来源于牛分枝杆菌的原始减毒疫苗。
本发明详细介绍了由已经转化的重组减毒胞内病原体(接种疫苗病原体)组成的疫苗和免疫治疗药，所述接种疫苗病原体表达另一种或相同胞内病原体的胞外蛋白(重组免疫原性抗原)。在一个实施方案中，本发明疫苗利用卡介苗或BCG的重组菌株来制备。在该实施方案中，所述重组BCG表达包括但不限于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和牛分枝杆菌(仅举几个例子)的致病分枝杆菌的主要胞外蛋白。
由所述重组BCG表达的主要胞外蛋白包括但不限于分枝杆菌的12kDa、14kDa、16kDa、23kDa、23.5kDa、30kDa、32AkDa、32BkDa、45kDa、58kDa、71kDa、80kDa和110kDa和它们的相应类似物、同系物和亚基，包括重组非融合蛋白、融合蛋白和它们的衍生物。对本领域技术人员显而易见的是，用来鉴定分枝杆菌属和其它胞内病原体的主要胞外蛋白的分子量仅是指近似值。重组技术领域和分子生物学领域的技术人员将会认识到，正如其以截短形式表达这些蛋白是可行的一样，使这些蛋白与另外的氨基酸、多肽和蛋白一起共表达(共翻译)也是可行的。所产生的修饰蛋白，无论是称为天然蛋白、非融合蛋白、融合蛋白、杂种蛋白还是称为嵌合蛋白，都被认为在本发明的范围内。对于本发明而言，融合蛋白定义为包括但不限于来自已经克隆在一起的不同基因的两种或两种以上的编码序列、翻译后形成一种多肽序列的产物。
本发明也介绍了过量表达来自至少一种其它胞内病原体的非融合蛋白的重组减毒胞内病原体接种疫苗病原体。这通过利用表达至少一种重组免疫原性抗原基因的染色体外核酸并且该基因置于非热激基因启动子或非应激蛋白基因启动子、最好是蛋白质特异性启动子序列的控制下来完成。因此，当编码重组免疫原性抗原的基因稳定地整合到所述接种疫苗病原体的基因组DNA，提供具有以比可能的更大量表达的非融合、重组免疫原性抗原的疫苗。因而，提供比现有亚单位疫苗或减毒胞内病原体疫苗具有令人惊奇优越特异性和效价的胞内病原体疫苗。
此外，本发明介绍了使用本发明疫苗治疗和预防由胞内病原体引起的哺乳动物疾病的方法。可以用作减毒接种疫苗病原体和/或重组免疫原性抗原源的许多胞内病原体的部分一览表包括但不限于牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、鸟分枝杆菌(M.avium)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、长滩军团菌(L.longbeachae)、博兹曼氏军团菌(L.bozemanii)、军团菌(Legionella sp.)、立氏立克次氏体(Rickettsiarickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)、立克次氏体(Rickettsia sp.)、恰菲埃里希氏体(Ehrlichia chaffeensis)、嗜噬胞埃里希氏体geno组(Ehrlichia phagocytophila geno group)、埃里希氏体(Ehrlichia sp.)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、利什曼原虫(Leishmaniasp.)、鼠弓形体(Toxpolasma gondii)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、衣原体(Chlamydia sp.)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌(Listeria sp.)和组织胞浆菌(Histoplasma sp.)。在本发明的一个实施方案中，采用皮内接种，给予哺乳动物表达结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白的重组BCG。然而，不用说本发明疫苗可以采用产生合适免疫应答的任何方法给予，所述方法包括但不限于皮下、肌内、鼻腔、腹膜内、口服或吸入。在接种后适当时间，所述哺乳动物用感染性结核分枝杆菌气雾剂攻击。接受本发明疫苗的哺乳动物与接受单独的BCG、接受单独的主要胞外蛋白或其任何组合的哺乳动物相比明显不患病。
参考下文优选示例性实施方案的详细描述并结合附图简述，本发明的其它目的和特征和优势对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图简述
图1描绘了标以1a和1b的考马斯蓝染色凝胶，说明来自培养物滤液的BCG转化菌株分泌的结核分枝杆菌重组30kDa。
图2图示设计用以比较豚鼠皮肤试验结果的标以2a和2b的两组实验结果，所述豚鼠用表达结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白的重组BCG疫苗、用单独的BCG、用单独的重组30kDa蛋白或用假疫苗接种。
图3图示免疫后用结核分枝杆菌攻击后标以3a和3b的豚鼠体重变化。
图4a图示免疫后用结核分枝杆菌攻击后从豚鼠肺回收的感染性结核分枝杆菌的菌落形成单位(CFU)。
图4b图示免疫后用结核分枝杆菌攻击后从豚鼠脾回收的感染性结核分枝杆菌的菌落形成单位(CFU)。
图5图示豚鼠对假疫苗、单独的BCG和与结核分枝杆菌的重组30kDa一起给予的BCG的皮肤试验反应。
发明详述
本发明总的来讲涉及用于治疗和预防由胞内病原体引起的人和动物感染的疫苗和免疫治疗药。具体地说，本发明涉及使胞内病原体抗原呈递最优化，使得能够免疫治疗药和/或疫苗受体产生针对重要治疗蛋白和预防蛋白的最大免疫应答。本发明人通过多年的研究和实验已经令人惊奇地发现，使用来源于胞内病原体的胞外蛋白成功地治疗和预防胞内病原体感染是蛋白呈递至所述宿主的功能。
抗原呈递包括一组决定受体如何加工并对抗原应答的变量。这些变量可以包括但不限于佐剂、疫苗组分浓度、载体分子、半抗原、给药频率和给药途径。本发明人已经证明，不同组合的相同抗原将会导致在遗传上相似的宿主体内统计学显著性应答变异。例如，采用相同蛋白和佐剂浓度组合结核分枝杆菌30kDa胞外蛋白的两种疫苗制剂。一组豚鼠给予仅含有所述30kDa蛋白和佐剂的疫苗；第二组豚鼠给予如第一组一样的疫苗，只是将IL-12加入到第二种疫苗中。当比较两组的平均免疫应答时，接受所述疫苗加上IL-12的豚鼠证明统计学显著性优异免疫应答。
本发明介绍两种技术的联合，已知一种超过80年，另一种是二十世纪九十年代的产物。总之，它们代表将胞内病原体的胞外蛋白呈递至受体并且诱导针对其显著强的保护性免疫应答的一种全新令人惊奇的有效方法。本发明人使用结核分枝杆菌为示例性胞内病原体的胞外蛋白尝试100多种不同的抗原呈递方法。然而，尽管本发明人已获得了许多成功，但是没有诱导优于用单独的BCG疫苗观察到的免疫应答。
简而言之，并且仅计划作为一般性实例，本发明包括胞内病原体的疫苗，所述疫苗使用表达并分必相同物种、另一物种或两者的重组免疫原性抗原(“免疫原”)的减毒或无毒力重组胞内病原体(“接种疫苗病原体”)；所述接种疫苗病原体和免疫原统称为本发明的“疫苗”。所述疫苗采用一种或多种途径给予，包括但不限于皮下、肌内、鼻腔、腹膜内、皮内、口服或吸入。本发明的接种疫苗病原体在原位(状态)表达并分泌所述免疫原的受体内存活。
不希望受这种理论的束缚，本发明人已经提出，诸如军团菌的机会病原体的免疫原性抗原可以比更传统的动物病原体例如分枝杆菌的相似免疫原性抗原更容易地诱发保护性免疫应答。选择压力可以提供与其天然宿主共同进化的病原体例如分枝杆菌以偶然或机会病原体缺乏的免疫规避机制。因此，必须研制诱发针对致病分枝杆菌属的保护性免疫应答比需要诱发针对人类不是第一宿主的病原体的保护性免疫显著更强的接种疫苗病原体和免疫原。
本发明人先前已经证明，当使用完全或不完全弗氏佐剂以纯化形式或以混合剂给予时，得自机会胞内病原体军团菌的胞外蛋白给动物提供有效的免疫保护。(参见USPN5,108,745，该文献通过引用结合到本文中)。然而，试图在相似条件下使用结核分枝杆菌胞外蛋白获得相似的保护性免疫应答尚未成功。因此，本发明人提出，胞外非融合蛋白的过量表达可能是抗原呈递和发生保护性免疫应答的一个重要方面。然而，不用说尽管非融合免疫原性胞外蛋白的过量表达可能是诱发保护性免疫的一个重要因素，但不能认为这是本发明疫苗提供的唯一免疫刺激因素。
本发明理想适合于制备针对各种各样胞内病原体的高效免疫保护性疫苗，所述胞内病原体包括但不限于过量表达结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或麻风分枝杆菌的主要胞外非融合蛋白的BCG菌株。本发明的每种疫苗都可以表达至少一种对给定胞内病原体特异性的各种分子量的免疫原。例如，本发明先前已经鉴定包括但不限于以下蛋白的结核分枝杆菌免疫原：主要胞外蛋白12kDa、14kDa、16kDa、23kDa、23.5kDa、30kDa、32AkDa、32BkDa、45kDa、58kDa、71kDa、80kDa、110kDa和它们的相应类似物、同系物和亚基，包括重组非融合蛋白、融合蛋白和它们的衍生物。(参见待审的美国专利申请顺序号08/156,358、09/157,689、09/175,598、09/226,539和09/322,116，所述专利申请的全部内容通过引用结合到本文中)。对本领域技术人员显而易见的是，用来鉴定分枝杆菌属和其它胞内病原体的主要胞外蛋白的分子量仅是指近似值。重组技术领域和分子生物学领域的技术人员将会认识到，正如其可以截短形式表达这些蛋白是可行的一样，使这些蛋白与另外的氨基酸、多肽和蛋白一起共表达(共翻译)也是可行的。所产生的修饰蛋白，无论是称为天然蛋白、非融合蛋白、融合蛋白、杂种蛋白还是称为嵌合蛋白，都被认为在本发明的范围内。对于本发明而言，融合蛋白定义为包括但不限于来自已经克隆在一起的不同基因的两种或两种以上的编码序列、翻译后形成一种多肽序列的产物。
当编码重组非融合蛋白的基因位于一种或多种质粒(染色体外DNA)上并且在其控制下而不是整合到宿主基因组中，一般增强包括胞外蛋白的抗原表达。此外，对特定蛋白特异性的启动子序列驱动的蛋白表达提供增强的表达和改进的蛋白折叠和非融合蛋白抗原的加工。因此，本发明提供非热激基因启动子或非应激蛋白基因启动子、最好是蛋白质特异性启动子序列控制的染色体外DNA上编码的重组胞外非融合蛋白。
本发明提供除表达密切相关和/或其它胞内病原体的重组胞外非融合蛋白外，还表达其自身内源胞外蛋白的重组减毒胞内病原体接种疫苗病原体例如rBCG。然而，通过80年的研究已经证明，单独的BCG内源胞外蛋白没有给所有受体提供完全的保护作用。此外，正如会在下文更加详细地加以解释一样，本发明人也证明，仅与传统的BCG一起共同注射结核分枝杆菌胞外蛋白不产生优于单独的BCG的疫苗。
在本发明的一个实施方案中，所述疫苗包括仅表达一种免疫原、例如结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白的重组BCG接种疫苗病原体。在本发明的另一个实施方案中，所述重组BCG可以表达两种或两种以上的免疫原，例如结核分枝杆菌的23.5kDa和30kDa主要胞外蛋白。这后一实施方案作为预防哺乳动物疾病的疫苗可能特别有效。本发明人已提出的非限制性理论是，重组BCG同时过量表达的结核分枝杆菌的23.5kDa和30kDa主要胞外蛋白可以协同发挥作用，以提高针对本发明胞内病原体的哺乳动物保护性免疫应答。这种理论部分基于这样的观测：野生型BCG和重组BCG都是不天然表达其自身23.5kDa主要胞外蛋白的牛分枝杆菌缺失突变体。
为了简便起见，并且由于下文非常复杂的描述但不是用于限制本发明，作为本发明的一个示例性实施方案，使用重组BCG作为接种疫苗病原体和结核分枝杆菌胞外非融合蛋白、准确地说是30kDa主要胞外非融合蛋白更加具体地描述本发明。不用说任何重组减毒胞内病原体可以表达任何重组免疫原性抗原，本发明的疫苗不限于BCG作为所述接种疫苗病原体以及结核分枝杆菌的主要胞外非融合蛋白作为所述免疫原。
为了测定接种疫苗病原体菌株变异的作用，用两种不同的BCG菌株制备本发明的各种实施方案：BCG Tice和BCG Connaught。野生型牛分枝杆菌BCG Tice购自Organon，野生型牛分枝杆菌BCGConnaught得自Connaught Laboratories，Toronto，加拿大。所述菌株在7H9培养基pH6.7(Difco)中于37℃以5％CO2-95％空气大气压作为非振荡培养物保持。培养物每周一次或二次在超声处理水浴中超声处理5分钟，以减少细菌菌落团块。
表达结核分枝杆菌30kDa主要胞外非融合蛋白的重组BCG TICE(rBCG30Tice)如下制备。一种大肠杆菌/分枝杆菌穿梭质粒pSMT3的重组构建体质粒pMTB30如本发明人在以下文献中先前介绍的方法制备：Harth，G.，B.-Y.Lee和M.A.Horwitz.1997，在快速生长的非致病分枝杆菌中高水平异源表达并分泌的4种主要结核分枝杆菌胞外蛋白被认为是先导疫苗候选物和药物靶(High-levelheterologousexpression and secretion inrapidly growing nonpathogenic mycobacteriaof four major Mycobacterium tuberculos isextracellular proteinsconsidered to be leading vaccine candidates and drug targets).Infect.Immun.65：2321-2328，所述文献的全部内容通过引用结合到本文中。
简而言之，采用重组DNA技术领域的技术人员已知的方法，通过将一个含有所述30kDa非融合蛋白基因加上多种侧翼DNA序列的大基因组DNA限制性片段插入到质粒pMTB30的多克隆位点，对质粒pMTB30进行工程改造，使其用其自身启动子(或任何非热激和非应激蛋白基因启动子)表达结核分枝杆菌Erdman30kDa主要胞外非融合蛋白。首先将所述质粒导入大肠杆菌DH5α中，以获得大量的重组质粒。让不能表达结核分枝杆菌30kDa非融合蛋白的重组大肠杆菌菌株在250μg/ml潮霉素存在下生长，测定质粒中所插入DNA序列的完整性。采用6.25kV/cm、25μF和1000mΩ作为产生最大数目阳性转化体的条件，通过电穿孔，将所述质粒导入耻垢分枝杆菌(M.
smegmatis)中。本发明人通过在50μg/ml潮霉素存在下生长证实所述重组质粒的存在，并且采用重组DNA技术领域的技术人员已知的方法，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和用多价高特异性兔抗30kDa非融合蛋白免疫球蛋白的免疫印迹法，证实重组30kDa非融合蛋白的组成型表达和输出。另外，本发明人证实重组结核分枝杆菌30kDa非融合蛋白的正确表达和加工，通过N端氨基酸测序不能将其与其天然对应物区分开来。
随后采用6.25kV/cm、25μF和200mΩ作为最佳电穿孔条件，将重组pSMT3质粒pMTB30导入牛分枝杆菌BCG Tice中。让转化体在补充2％葡萄糖的7H9培养基中在环境摇瓶机上于37℃培养4小时，随后接种到含有20μg/ml潮霉素的7H11琼脂上。随着将所述转化体传代至新的生长培养基中，所以将潮霉素浓度逐渐增加至50μg/ml。重组BCG Tice培养物在相同条件下作为野生型保持，只是所述7H9培养基含有50μg/ml潮霉素。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和用多价高特异性兔抗30kDa非融合蛋白免疫球蛋白的免疫印迹法，证实重组结核分枝杆菌30kDa非融合蛋白的表达和输出。通常，10个转化体中有1个转化体比其它转化体表达并有效输出更大量的重组非融合蛋白；选择2个这样的转化体，制备这些转化体的大的原种，将其在含有10％甘油的7H9培养基中于-70℃冷冻。用这些转化体在豚鼠中进行疫苗功效研究。图1a显示SDS-PAGE凝胶和免疫印迹上重组BCG Tice表达的结核分枝杆菌30kDa主要胞外非融合蛋白。在考马斯蓝染色的凝胶和免疫印迹上，所述重组菌株比所述野生型菌株表达的结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白多得多。
接下来，采用前述pMTB30质粒，与上述重组BCG Tice(rBCGTice)相似的制备方法，制备表达结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白的重组牛分枝杆菌BCG Connaught菌株(rBCG30Conn)。将其在与所述重组BCG Tice菌株相同的条件下，在含有浓度50μg/ml潮霉素的培养基中保持。图1b显示SDS-PAGE凝胶和免疫印迹上重组BCG Connaught表达的结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白。在考马斯蓝染色的凝胶和免疫印迹上，所述重组菌株比所述野生型菌株表达的结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白多得多。
用生物化学方法评价重组BCG菌株的质粒稳定性。所述生物化学分析证明在潮霉素存在下，重组BCG菌株的肉汤培养物在3个月生长期内仍保持稳定水平的重组非融合蛋白表达。在无潮霉素时，相同培养物仅显示略微减少的非融合蛋白表达(以每个细胞为准)，表明所述重组质粒稳定地保持，并且仅在无选择压力生长的细菌中非常缓慢地丢失(图1a和图1b，泳道3)。
不用说采用上述方法结合重组DNA技术领域的技术人员已知的方法，可以制备表达结核分枝杆菌32(A)kDa主要胞外非融合蛋白、16kDa主要胞外非融合蛋白、23.5 kDa主要胞外非融合蛋白和其它结核分枝杆菌主要胞外非融合蛋白的重组BCG菌株。此外，可以用相似的方法制备表达包括但不限于以下蛋白的麻风分枝杆菌主要胞外非融合蛋白的重组BCG菌株：结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白的麻风分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白同系物(a.k.a.抗原85B)、结核分枝杆菌32(A)kDa主要胞外非融合蛋白的麻风分枝杆菌32(A)kDa主要胞外非融合蛋白同系物(a.k.a.抗原85A)和其它麻风分枝杆菌主要胞外非融合蛋白。另外，也可以用相似的方法制备表达以下蛋白的重组牛分枝杆菌BCG：结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白的牛分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白同系物(a.k.a.抗原85B)、结核分枝杆菌32(A)kDa主要胞外蛋白的牛分枝杆菌32(A)kDa主要胞外非融合蛋白同系物(a.k.a.抗原85A)和其它牛分枝杆菌主要胞外蛋白。
在成功的疫苗生产后，采用动物模型测试本发明疫苗的安全和功效。所述研究利用豚鼠是因为豚鼠模型在临床、免疫学和病理学上与人类结核病尤其相关。与小鼠和大鼠不一样，但与人类一样，豚鼠a)对低剂量的气雾剂化结核分枝杆菌敏感；b)对结核菌素表现出强皮肤DTH；和c)出现朗格汉斯巨大细胞和肺病变的干酪性坏死。然而，仅约10％感染结核分枝杆菌的免疫应答病人在其有生之年发生活动性疾病(一半是接触后早期，一半是潜伏期后)，而受感染豚鼠总是发生早期活动性疾病。虽然豚鼠与人类在这一方面不同，但是它们在感染结核分枝杆菌后发生活动性疾病的一致性在疫苗功效试验中是有利的。
依照本发明的内容制备的免疫接种物可从对数生长的野生型或重组BCG培养物(“细菌”)中取出的等份样品制备。每等份的细菌通过以3,500xg离心15分钟沉淀，然后用1x磷酸缓冲盐溶液(1xPBS，50mM磷酸钠pH7,150mM氯化钠)洗涤。然后将所述免疫接种物重悬浮于1xPBS中，至终浓度1x104菌落形成单位/ml，并且每100μl含有1,000个活细菌。
无特定病原体的250-300g远交雄性Hartley品系豚鼠(得自Charles River Breeding Laboratories)，以9只为一组，用以下疫苗中的一种进行皮内免疫：1)BCG Connaught[103菌落形成单位(CFU)]，仅1次(时间，第0周)；2)rBCG30 Connaught(103CFU)，仅1次(时间，第0周)；3)纯化重组结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白(r30)100 μg的100 μl Syntex佐剂制剂(SAF)，3次，间隔3周(时间，第0周、第3周和第6周)；SAF由Pluronic L121、角鲨烷和吐温80组成，在第一次免疫中，加入丙氨酰胞壁酰二肽；和4)仅SAF(100μl)(假免疫)，3次，间隔3周(时间，第0周、第3周和第6周)。3只动物为一组的另外一组用单独的SAF(100μl)进行假免疫，用作皮肤试验对照。在攻击实验中，这些假免疫动物和3-6个其它假免疫动物用作未感染对照。
在仅1次免疫(BCG组和rBCG30组)或初次免疫(r30组和假免疫的皮肤试验组)后9周，剃掉豚鼠背上的毛，然后皮内注射10μg纯化重组结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白(r30)的100μl磷酸缓冲盐溶液。24小时后，测量红斑和硬结的直径。(对于皮肤试验，使用不同组的在攻击研究中使用的动物中的假免疫动物。在攻击研究中使用的假免疫动物不进行皮肤试验，以消除皮肤试验本身对结果影响的可能性)。
在初次或仅1次免疫后9周并且恰好在皮肤试验之后，动物用从10ml含有1x105菌落形成单位(CFU)的结核分枝杆菌的单细胞悬浮液制备的气雾剂攻击。结核分枝杆菌Erdman菌株(ATCC35801)通过远交豚鼠传代来保持毒力，在7H11琼脂上培养，经历温和超声处理，以获得单细胞悬浮液，用于动物攻击实验之前于-70℃冷冻。所述攻击气雾剂剂量给予每只动物肺约40个活杆菌。采用感染的空气传播途径是因为这是肺结核感染的天然途径。使用大剂量，以便在100％对照动物中在相对短的时间(10周)内诱发可测量的临床疾病。此后，将豚鼠在装有层流生物危害安全限内区的不锈钢笼单个关养，让其自由得到标准实验室饲料和水。每周观测动物的疾病状况并称重，连续进行10周，然后将其安乐死。取出每只动物的右肺和脾，并培养计数结核分枝杆菌的CFU。
在两个实验的每个实验中，假免疫动物和用野生型BCG免疫的动物在用重组30 kDa结核分枝杆菌主要胞外非融合蛋白(r30)测试时都几乎没有或没有表现出红斑和硬结。相反，用r30或rBCG30免疫的动物都表现出明显的红斑和硬结，显著高于假免疫动物或野生型BCG免疫的动物(表1和图2)。
在两个实验的每个实验中，未感染的对照增重通常在攻击后，与用rBCG30或野生型BCG免疫的动物一样(图3)。事实上，在这三组动物中在增重方面没有显著性差异。相反，假免疫动物和程度较低的r30免疫的动物在实验过程中都表现出增重减少(表2和图3)。因此，用结核分枝杆菌攻击后，BCG和rBCG30保护的动物全部没有体重减轻，体重减轻是结核病在患有这种慢性感染性疾病的病人的主要体征以及结核病在患有这种慢性感染性疾病的豚鼠模型的标志。
在两个实验的每个实验中，在第10周观察期结束时，将豚鼠安乐死，无菌取出每只动物的右肺和脾，并测定结核分枝杆菌的CFU。假免疫动物肺和脾中的细菌负荷最高(表3和图4a和图4b)。用r30免疫的动物比假免疫动物肺和脾中的细菌少；BCG-免疫的动物比r30-免疫动物中的细菌少；值得注意的是，rBCG30-免疫的动物比BCG-免疫动物中的细菌少。运用双向阶乘方差分析方法的统计学检验，比较平均值，表明实验1中的4个“处理”组(假的、r30、BCG和rBCG30)的平均值与实验2中的4个“处理”组的平均值没有显著性差异，因此，适宜将这两个实验的数据综合。综合数据示于表4和图3。最感兴趣且最重要的是，rBCG30-免疫动物比BCG-免疫动物的肺中的细菌低0.5 log，而比脾中的细菌低1 log。进行统计学分析，运用方差分析方法比较平均值，用Tukey-Fisher最小显著差别(LSD)标准评价统计学显著性，在肺和脾两者的4个组中的每个组的平均值与其它组的每个组的平均值显著不同(表4)。rBCG30免疫的动物和BCG免疫的动物之间在肺中的差异是显著的，p＝0.02；在脾中的差异也是显著的，p＝0.001。rBCG30免疫动物的肺CFU、总体检查、肺的差异是平行的，比BCG免疫动物的肺破坏小(20±4％相对于35±5％平均值±SE)。
因此，在肺结核高度敏感的豚鼠模型中，给予表达结核分枝杆菌30kDa主要胞外非融合蛋白的重组BCG，诱导针对用结核分枝杆菌气雾剂攻击的高水平保护。相反，如下文实施例所述，给予相同分枝杆菌胞外非融合蛋白(结核分枝杆菌重组30 kDa主要胞外非融合蛋白)的佐剂与BCG联合不诱导针对用结核分枝杆菌气雾剂攻击的高水平保护；给予表达结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌也不诱导高水平保护；给予含结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白的微球(其大小基本与BCG相同并且同BCG一样在60-90天内缓慢释放所述蛋白)也不诱导高水平保护；给予在脂质体中包囊的结核分枝杆菌30 kDa主要胞外非融合蛋白也不诱导高水平保护。
本发明的一个非常令人惊奇的方面是rBCG30菌株诱导的保护优于野生型BCG，即使所述野生型表达并分泌内源高度同源的30 kDa主要胞外蛋白。(参见图1)。未对得自亚株BCG Connaught的30 kDa蛋白编码基因测序。然而，从这些亚株的克隆基因序列推导的BCG的两个其它亚株的30 kDa蛋白序列，与结核分枝杆菌蛋白的不同仅为1个氨基酸(BCG Paris 1173 P2)或5个氨基酸(包括2个另外的氨基酸)(BCG Tokyo)。(参见Harth，G.，B.-Y.Lee，J.Wang，D.L.Clemens和M.A.Horwitz.第3041-3042页，1996，对结核分枝杆菌30千道尔顿主要胞外蛋白的遗传学、生物化学和免疫细胞化学的新认识(Novelinsights into the genetics，biochemistry，and immunocytochemistry of the30-kilodalton major extracellular protein of Mycobacterium tuberculosis.)Infect.Immun.64：3038-3047，所述文献的全部内容通过引用结合到本文中)。因此，所述重组菌株的保护增强未必是由于所述重组蛋白和内源蛋白之间的少数氨基酸差异产生的。更可能的是，它是由于所述重组非融合蛋白与所述内源蛋白相比的表达增强产生的。如果是这样的话，则利用高拷贝数质粒所获得的大量表达可能是所述重组疫苗成功的重要因素。
表1
结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白的皮肤迟发型超敏反应
 
红斑(平均直径±SE)(mm) 硬结(平均直径±SE)(mm)
实验1
假免疫 0.0±0.0 1.0±0.0
r30 15.0±1.2 4.2±0.3
BCG 0.8±0.8 1.7±0.2
rBCG30 19.8±2.2 3.1±0.2
实验2
假免疫 0.0±0.0 1.0±0.0
r30 15.3±0.9 5.2±0.7
BCG 3.0±1.5 1.0±0.0
rBCG30 16.5±0.9 2.7±0.4
表2
用含毒性结核分枝杆菌Erdman菌株的气雾剂攻击后的净增重
 
第0周(平均体重±SE)(g) 第10周(平均体重±SE)(g) 净增重(g)第0周-第10周(平均值±SE)
实验2
假免疫 763.1±17.1 805.4±27.8 42.3±28.2
r30 793.8±21.6 906.3±44.6 112.6±32.0
BCG 763.8±28.7 956.3±45.4 192.5±23.7
rBCG30 767.8±17.6 947.7±31.3 179.9±25.1
实验2
假免疫 839.1±21.7 857.6±32.4 18.5±30.9
r30 801.9±36.3 888.6±39.7 86.7±28.3
BCG 796.6±29.8 963.6±19.8 167.0±23.3
rBCG30 785.7±17.7 958.7±27.7 173.0±24.9
表3
d在被含有结核分枝杆菌Erdman菌株的气雾剂攻击的动物肺和脾的结核分枝杆菌菌落形成单位(CFU)
综合实验1和实验2
 
n 肺CFU Log10(平均值±SE) 脾CFU Log10(平均值±SE)
假免疫 18 6.47±0.17 6.27±0.19
r30 18 6.02±0.14 5.73±0.14
BCG 17 5.00±0.13 4.57±0.17
rBCG30 18 4.53±0.14 3.65±0.25
表4
统计学分析(ANOVA)总结
肺和脾CFU
综合实验1和实验2
肺
假免疫与r30         p＝0.03
r30与BCG            p＝0.0001
BCG与rBCG30         p＝0.02
脾
假免疫与r30         p＝0.05
r30与BCG            p＝0.0001
BCG与rBCG30         p＝0.001
表5
在被含有结核分枝杆菌Erdman菌株的气雾剂攻击的动物肺和脾的结核分枝杆菌菌落形成单位(CFU)：
用BCG或用BCG加上重组结核分枝杆菌30kDa蛋白的佐剂免疫的动物或假免疫的动物
 
n 肺CFU Log10(平均值±SE) 脾CFU Log10(平均值±SE)
假免疫 17 6.40±0.18 5.65±0.20
BCG 8 4.70±0.13 2.91±0.35
BCG+r30 9 5.30±0.23 3.34±0.37
表6
在被含有结核分枝杆菌Erdman菌株的气雾剂攻击的动物肺和脾的结核分枝杆菌菌落形成单位(CFU)：
用表达结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白(耻垢分枝杆菌r30)的活重组耻垢分枝杆菌免疫的动物
 
n 肺CFU Log10(平均值±SE) 脾CFU Log10(平均值±SE)
假免疫 9 6.63±0.27 6.34±0.29
BCG 8 4.61±0.14 4.31±0.27
耻垢分枝杆菌对照 9 5.92±0.31 5.29±0.34
耻垢分枝杆菌r30 9 5.48±0.26 5.55±0.28
表7
在被含有结核分枝杆菌Erdman菌株的气雾剂攻击的动物肺和脾的结核分枝杆菌菌落形成单位(CFU)：
用大小基本与BCG相同并且同BCG一样缓慢释放结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白(r30)的微球免疫的动物
用含有结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白(r30)的脂质体免疫的动物
 
n 肺CFU Log10(平均值±SE) 脾CFU Log10(平均值±SE)
假免疫 9 6.31±0.19 6.20±0.26
BCG 9 5.35±0.14 4.81±0.21
rBCG30 9 4.48±0.14 3.73±0.33
对照微球 9 6.67±0.29 5.94±0.32
含r30的微球(10mg x1) 6 6.10±032 5.93±0.41
含r30的微球(3.3mg x3) 9 6.42±0.17 6.04±0.28
对照脂质体 9 6.24±0.23 6.41±0.21
含r30的脂质体 9 5.77±0.18 5.63±0.16
下述实施例用以说明本发明新的方面。每个实施例说明采用与本发明疫苗密切相关但不相同的技术传递本发明免疫原的方式。准确地说，实施例1证明当给予本发明的免疫原，但BCG不在体内表达时，则达不到高水平的保护性免疫。
实施例2证明采用与BCG密切相关、但不能在哺乳动物宿主体内复制的分枝杆菌，本发明免疫原的体内表达不能诱导针对用结核分枝杆菌攻击的显著水平保护。实施例3和实施例4证明通过合成疫苗微载体缓慢释放本发明的免疫原，也不能诱导针对用结核分枝杆菌攻击的显著水平的保护。
因此，下述实施例用以强调本发明的胞内病原体疫苗代表感染性疾病免疫学领域的完全出乎意料的显著进步。
实施例
实施例1
用BCG加上重组结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白(r30)免疫 豚鼠不能诱导针对用结核分枝杆菌攻击的高水平保护
我们以前用BCG加上r30的高效佐剂(SAF，Syntex佐剂制剂)免疫豚鼠。皮内给予r30蛋白(每次免疫100μg)3次。这诱导对r30的强皮肤迟发型过敏(C-DTH)反应(图5)。事实上，C-DTH反应相当于表达r30的重组BCG诱导的反应。尽管如此，用BCG和r30两者免疫不诱导针对用结核分枝杆菌攻击的高水平保护(表5)。用BCG和r30两者免疫的动物肺和脾的CFU水平不比用单独的BCG免疫的动物低。这个结果正好与上述结果相反，在上述结果中用表达r30的重组BCG免疫的动物当用结核分枝杆菌攻击时表现出高水平保护。
实施例2
用以不能与天然形式区别的形式表达结核分枝杆菌30 kDa主要 胞外蛋白(r30)的活重组耻垢分枝杆菌免疫豚鼠不能诱导针对用结核 分枝杆菌攻击的高水平保护
在一个与我们用BCG免疫动物的实验相同的实验中，我们用以不可与天然形式区别的形式表达结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白(r30)的活重组耻垢分枝杆菌免疫豚鼠。耻垢分枝杆菌表达并分泌结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白(r30)等于或高于重组BCG菌株表达并分泌结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白(r30)的水平。此外，重组耻垢分枝杆菌的剂量(109细菌)是非常高的，高于重组BCG的剂量(103细菌)100万倍，超过补偿动物宿主体内繁殖差的耻垢分枝杆菌。为了进一步补偿，皮内给予重组耻垢分枝杆菌3次，而仅皮内给予重组BCG 1次。用表达r30蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫诱导对r30的强皮肤迟发型过敏(C-DTH)反应。事实上，C-DTH反应相当于或高于表达r30的重组BCG诱导的反应。然而，表达结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白的活重组耻垢分枝杆菌不诱导针对用结核分枝杆菌攻击的高水平保护(表6)。用表达结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白的活重组耻垢分枝杆菌免疫的动物肺和脾中的CFU水平并没有比用单独的BCG免疫的动物低。这个结果正好与上述结果相反，在上述结果中用表达r30的重组BCG免疫的动物当用结核分枝杆菌攻击时表现出高水平保护。
实施例3
用大小基本与BCG相同并且同BCG一样在60-90天内缓慢释 放结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白(r30)的微球免疫豚鼠不能诱导 针对用结核分枝杆菌攻击的高水平保护
在一个与我们用rBCG30和BCG免疫动物的实验相同的实验中，我们用大小基本与BCG相同并且同BCG一样在60-90天内缓慢释放结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白(r30)的微球免疫豚鼠。一组动物用含有10mgr30的微球免疫1次。另一组动物用含有3.3mgr30的微球免疫3次。计算这一用量大大超过重组BCG菌株表达的r30蛋白的量。用微球方案免疫诱导对r30的强皮肤迟发型过敏(C-DTH)反应。事实上，C-DTH反应相当于表达r30的重组BCG诱导的反应。尽管如此，用大小基本与BCG相同并且同BCG一样缓慢释放结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白的微球免疫不诱导针对用结核分枝杆菌攻击的高水平保护(表7)。用微球免疫的动物肺和脾中的CFU水平并没有比用单独的BCG免疫的动物低。这个结果正好与上述结果相反，在上述结果中用表达r30的重组BCG免疫的动物当用结核分枝杆菌攻击时表现出高水平保护。
实施例4
用含有结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白的脂质体免疫豚鼠不 能诱导针对用结核分枝杆菌攻击的高水平保护
在与实施例3相同的实验中，我们用含有结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白的脂质体免疫豚鼠。所述动物用含有50 μg r30的脂质体免疫3次。这诱导对r30中等强度的皮肤迟发型过敏(C-DTH)反应。所述C-DTH反应高于BCG和对照脂质体诱导的反应，但是低于表达r30的重组BCG诱导的反应。尽管如此，用含有结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白的脂质体免疫不诱导针对用结核分枝杆菌攻击的高水平保护(表7)。用含有结核分枝杆菌30 kDa主要胞外蛋白的脂质体免疫的动物肺和脾中的CFU水平并没有比用单独的BCG免疫的动物低。这个结果正好与上述结果相反，在上述结果中用表达r30的重组BCG免疫的动物当用结核分枝杆菌攻击时表现出高水平保护。
本发明的疫苗代表一种治疗性和预防性治疗胞内病原体的全新方法。通过一系列精心设计的实验和有创见的分析，本发明人充分证明，按照本发明的内容，保护性免疫仅当将准确选定的胞内病原体或密切相关种进行转化，以表达相同或不同的胞内病原体的重组胞外蛋白时才得以实现。
本发明也可以用来提供同时针对多种胞内病原体的预防性和治疗性益处。例如，可以设计重组减毒胞内接种疫苗病原体如牛分枝杆菌使其表达同时针对结核分枝杆菌和军团菌的免疫保护性免疫原。因此，可以达到高效率地传递疫苗。表达结核分枝杆菌主要胞外蛋白的重组BCG的非限制性实施例不仅用作本发明的通用实施方案，而且代表对医学和全人类的显著进步。
因此，显然尽管已经说明并描述了本发明的优选实施方案，但在不偏离本发明的真正精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种修改和变化。

Claims (12)

1.用于预防哺乳动物疾病的疫苗，所述疫苗包含重组卡介苗(BCG)，所述重组卡介苗具有至少一个染色体外核酸序列，所述核酸序列包含编码结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白的基因，其中所述疫苗在所述哺乳动物中诱导保护性免疫应答。
2.权利要求1的用于预防哺乳动物疾病的疫苗，其中所述重组BCG还表达另一种密切相关胞内病原体的至少一种重组免疫原性分支杆菌抗原和第三种胞内病原体的至少一种重组免疫原性抗原。
3.从至少一个染色体外核酸序列表达结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白的重组卡介苗(BCG)在制备预防哺乳动物分支杆菌病原体性疾病的药物中的用途。
4.权利要求3的用途，其中重组BCG还表达其它胞内病原体的重组免疫原性抗原。
5.权利要求4的用途，其中所述重组免疫原性抗原是主要胞外蛋白抗原。
6.权利要求4的用途，其中所述其它分支杆菌病原体是选自如下的密切相关的胞内病原体：牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、鸟分枝杆菌(M.avium)和分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)。
7.权利要求3的用途，其中重组BCG表达两种密切相关的胞内病原体的重组免疫原性抗原，所述胞内病原体选自如下：牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、鸟分枝杆菌(M.avium)和分枝杆菌(Mycobacterium sp.)。
8.权利要求1的用于预防哺乳动物疾病的疫苗，其中所述疫苗预防哺乳动物中至少一种分支杆菌病原体性感染，以及含有活重组卡介苗(BCG)，所述活重组BCG表达结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白，所述结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白在掺入到质粒中并且在选自非热激基因启动子和非应激蛋白基因启动子的基因启动子控制下的DNA上编码。
9.权利要求1的用于预防哺乳动物疾病的疫苗，其中所述疫苗预防哺乳动物中至少一种分支杆菌病原体性感染，以及包含：表达结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白的活重组卡介苗(BCG)，所述结核分枝杆菌30kDa主要胞外蛋白在掺入到质粒中并且在选自非热激基因启动子和非应激蛋白基因启动子的基因启动子控制下的DNA上编码。
10.权利要求9的用于预防哺乳动物至少一种分支杆菌病原体性感染的疫苗，其中所述基因启动子是所述重组免疫原性分支杆菌抗原特异性启动子。
11.权利要求1的用于预防哺乳动物至少一种分支杆菌病原体性感染的疫苗，其中所述结核分支杆菌30kDa主要胞外蛋白是非融合蛋白。
12.权利要求1的用于预防哺乳动物疾病的疫苗，所述疫苗预防哺乳动物结核分枝杆菌感染，以及包含：同时表达结核分枝杆菌的重组23.5kDa主要胞外蛋白和重组30kDa主要胞外蛋白的重组BCG。
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