JPH07502646A

JPH07502646A - リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するｄｎａを含む細菌発現ベクター

Info

Publication number: JPH07502646A
Application number: JP5507931A
Authority: JP
Inventors: ストーヴァー，チャールズ，ケイ．
Original assignee: メディミューン，インコーポレーテッド
Priority date: 1991-10-21
Filing date: 1992-10-21
Publication date: 1995-03-23
Also published as: EP0625052A4; US5583038A; EP0625052A1; AU2911092A; AU681572B2; CA2121493A1; WO1993007897A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するＤＮＡを含む細菌発現ベクターこの出願は１９９１年１０月２１日に受理された出願番号７８０．２６１を部分継承するものである。

この発明は、細菌、例えばミコバクテリアなどにあるタンパク質を発現するための発現ベクターに関する。より詳細には、この発明は、タンパク質を発現する細菌に異種のタンパク質を発現し分泌する発現ベクターに関するものであり、ここでそのベクターは少なくとも異種タンパク質の脂質をアシル化および表面発現を達成するように設計されたりボタンバク質の分泌シグナルをコード化するＤＮＡを更に含む。

ある種のミコバクテリアは、ヒトおよび動物の主要な病原を表わす。例えば結核はヒト結核菌により一般にヒトに生じ、またウシ型結核菌により家畜に発生し、それはヒトおよび他の動物に媒介される。ライ菌はライ病の原因となる因子である。ヒト結核菌および鳥型・パテー打菌・スクロフラセウムミコバクテリアのグループ（ＭＡ　Ｉ　Ｓグループ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者の主要な日和見性病原を表わす。仮性結核菌は、家畜の主要な病原である。

一方、ウシ型結核菌の無発病性菌株であるカルメットーゲラン杆菌、すなわちＢＣＧはヒトワクヂンとして広く用いられ、とりわけ結核を防ぐ生ワクチンとして使用される。ＢＣＧは生まれると同時に一般に与えられる唯一の幼児用ワクチンであり、副作用の影響が非常に低く、個体に対し繰返して（例えば多重形態で）使用することができる。加えて、ワクチンに使用されるＢＣＧおよび他のミコバクテリア（例えば恥垢菌）は、現在量も良く知らせているものの中でもアジュバント性能を有しており、従って、抗原に非常に有効に反応するように受容体の免疫システムを刺戟する。

「ネイチャー」３２７巻・６１２２号、５３２〜５３５頁（１９８７，６，１１）Ｔジェイコブ他により、ＢＣＧが組換えワクチンの構築のために宿主として使用出来ることが提案された。言い換えれば、１個もしくはそれ以上の遺伝子を他の病原から導入することにより（この場合結核に対して）現存するワクチンをとり、その防護能力を高めることが提案された。

裸のＤＮＡが細菌細胞に導入される方法である形質転換は、ミコバクテリア内で首尾よく行われた。前記記載のシェイコブ他は、電気穿孔法によるミコバクテリアの形質転換につき記述している。電気穿孔法はプラスミドＤＮＡのμｇ当り１０’−１０’個の形質転換細胞を得ることが出来、カナマイシンなどのような抗生物質マーカー耐性の遺伝子を、そのプラスミドが運び、形質転換細胞゛に非形質転換細胞から選択出来ることをスナツパ−他、「全米科学アカデミ−紀要」８５巻、６９８７〜６９９１頁（１９８８，９）が示している。

ジエイコブ他（１９８７）およびスナツパ−他（１９８８）は、更に対象となる遺伝子をミコバクテリアに導入するために、プラスミドやバクテリオファージなどのようなりローニングビークルの使用について記述している。

クー他「全米科学アカデミ−紀要」８８巻、３１１１−３１１５頁、（１９９１，４）は、ミコバクテリア染色体への部位特異的組込みを行うために、ミコバクテリオファージセインテグラーゼおよびファージ付着部位をコード化するＤＮＡを使用するベクターについても記述している。

ストーヴアー他（［ネイチャーＪ３５１巻、４５６−４６０頁（１９９１，６，６））は、外部抗原を細胞形質的に組換えＢＣＧに発現するために、ミコバクテリアＨ３Ｐ６０および１（Ｓ　Ｐ　７０プロモーターを採用する組込み的染色体外ベクターについて記述している。ストーヴアー他はこれらのベクターで外部抗原を発現する組換えＢＣＧが、外部抗原に対し体液性および細胞性免疫反応を発生する免疫原として使用することができることを示した。

分子クローニングの標準道具（例えば制限酵素の使用等）とともに前記手法の組合せは、対象となる遺伝子のベクターへのクローニングおよびその遺伝子のミコバクテリアへの導入を可能にする。

この発明の一局面に従って、細菌内にタンパク質あるいはポリペプチドもしくはペプチドを発現する発現ベクターが提供される。発現ベクターは少なくともりボタンバク質の分泌シグナルをコード化する第１ＤＮＡ配列を含む。また望ましくは、発現ベクターは、タンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドを発現する細菌に対し異種のタンパク質あるいはその断片、もしはポリペプチドあるいはペプチドをコード化する第２ＤＮＡ配列を含み、ここでその細菌は、リポタンパク質あるいはりボタンバク質分節の融合タンパク質（分泌シグナルを含むこともある）、およびタンパク質あるいはポリペプチドもしくはペプチドを発現する細菌に異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドを発現する。

そのような発現ベクターは、生ワクチンを含むワクチンに使用出来るいろいろな細菌のいずれかに使用することが出来る。

特に一つの実施例において、細菌は必ずしもそれに限定されないがウシ型結核菌 −ＢＣＧ、恥垢菌、トリ型結核菌、チモテ菌、腐生菌（ミコバクテリウムフォルチュイッム）、ルフ菌。

仮性結核菌、ハバナ菌、スクロフラセウム菌、パテ−杆菌、メスウシ菌などのようなミコバクテリアである。

一つの実施例において、ミコバクテリアＢＣＧである。

この発明の範囲は何らかの理論的推論に限定されるべきではないが、リポタンパク質のシグナル配列は、そのタンパク質がキメラリポタンパク質として細菌の表面に発現されるように、発現された組換え融合タンパク質が変更されることを可能にする。例えば融合タンパク質は、融合タンパク質の脂質アシル化を可能にするシグナル配列部分にあるシグナルベブチターゼ■の加工、あるいは認識部位を含むことが出来る。このような融合タンパク質の脂質アシル化は、融合タンパク質に異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドの免疫原性を高めることが出来る。またシグナル配列は、細菌の表面で発現されかつ固定され、かくして異種のタンパク質あるいはポリペプチドにより受け入れやすくなり、それがタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドの免疫原性を増大することが出来る。更にその融合タンパク質は細菌の表面で発現されるので、融合タンパク質のそのような発現あるいは分泌は、細菌内で細胞形質的に発現されあるいは維持される場合に、致死的になり得る抗原の発現を可能にする。異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドは、それ自身がこれから後に検耐されるライム病ボレリア菌の０ｓｐＡ抗原などのりボタンバク質、あるいは例えばＨＩ　Ｖ抗原、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、およびマラリア抗原などのような非リポタンパク質である得ることも理解されねばならない。かくしてこの発明の発現ベクターは、細菌の表面に固定することの出来る非リポタンパク質の成分の遺伝子工学も可能にする。

か（して、発現ベクターは、キメラ表面リポタンパク質として（もともと非リポタンパク質としてコードされる）異種遺伝子あるいは遺伝子分節の発現を可能とする。これは外部遺伝子あるいは遺伝子分節を、それぞれリポタンパク質あるいはりボタンバク質シグナルペプチドをコード化する遺伝子あるいは遺伝子分節にコード化されるベクターに遺伝子融合することにより達成される。

一つの実施例において、第１　ＤＮＡ配列は、少なくともミコバクテリアリポタンパク質の分泌シグナルをコード化する。ミコバクテリアリポタンパク質は、一つの実施例において、ヒト結核菌リポタンパク質である。ヒト結核菌リポタンパク質は、ヒト結核菌１９キロダルトン抗原およびヒト結核菌３８キロダルトン抗原よりなるグループより選択することが出来る。

少なくとも分泌シグナルが、第１　ＤＮＡ配列によりコード化される他のりボタンバク質は、必ずしもそれに限定されないが、大腸菌のリポタンパク質、Ｓ、ｎ＋ａｒｃｅｓｃｅｎｓ、　Ｅ、ａｓｙｌｏｓｏｒａ。

Ｍ、　ｍｏｒｇａｎｉ　ｊおよびＩ’、ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ、大腸菌およびサルモネラ菌のＴｒａＴタンパク質、ｔｌ、　ｌｊｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓおよびＢ、ｃｃｒｃｕｓおよび黄色ブドウ球菌ベニシリナーゼ（ＰｅｎＰ）タンパク質、肺炎桿菌およびアエロゲネスクレブシエラ菌のプルラナーゼタンパク質；大腸菌リポタンパク質ｔｐｐ　２８．Ｐａ１、ＲｐｌＡ、ＲｐｌＢ、ＯｓｍＢ、Ｎ１ｐＢｉ５よびＯｒｌ　１７　；　Ｖ、ｈａｒｓｅｙｉのキトビオースタンパク質、Ｐｓｅｕｄｏｅｇｏｎａｓｓｏｌａｎａｃｅａｒｕ−のβ−１，４−エンドグルカナーゼタンパク質、インフルエンザ菌のＰａｌおよびＰｃｐタンパク質、緑膿菌のＯｐｒ　Ｉタンパク質、肺炎連鎖球菌のＭａｌＸおよびＡｍ１Ａタンパク質、梅毒トレポネーマの３４キロダルトン拡原およびＴｐｍＡタンパク質、ブタ関節炎菌のＰ３７タンパク質、および斑点熱リケツチアの１７キロダルトン抗原である。しかし、この発明の範囲は特定のりボタンバク質のいずれかの分泌シグナルあるいはりボタンバク質に限定されるものではないことも理解されねばならない。

一つの実施例において、第１　ＤＮＡ配列は更にリボタンノ＼り質のすべて、あるいはその一部をコード化するＤＮＡを含むことが出来る。かくしてそのような実施例において、細菌により発現される融合タンパク質は、リポタンパク質の分泌ジグづ一ル、リボクンバク質のすべであるいはその一部および異）重タンパク質あるいはポリペプチドもしくはペプチドの融合タンノ（り質である。

第１および第２ＤＮＡ配列は、適切なプロモーターの制御の下にある。一つの実施例において、これらの抗原の一つの分泌シグナルをコード化するＩ）　Ｎ　Ａが使用される場合には、このプロモーターはヒト結核菌の１９キロダルトン抗原プロモーターあるいは３８キロダルトンに抗原プロモーターであり得る。代替的には、このプロモーターは、ヒト結核菌の１９キロダルトンおよび３８キロダルトン以外のミコノ〈クチリアプロモーター、あるいはミコバクテリオファージプロモーターであることが出来る。

使用されるミコバクテリアおよびミコノくクチ１ノオフアージプロモーターは必ずしもそれに限定されなし１カベ、ＢＣＧＨＳ　Ｐ　６０および）ｌｓＰ７０プロモーターなどのミコノ＼クテノリアプロモーター、ヒト結核菌およびＢＣＧからのミフノ（クチンプロモーター、ミコバクテリア１４キロダＪレトンおよび１２キロダルトン抗原プロモーター、ヒト結核菌あるしＡ４まＢＣＧ力）らのミコバクテリアα−抗原プロモーター、　Ｍ　＋３　Ｐ　−７０プロモーター、ヒト結果菌あるいはＢＣＧからのミコバクテリア４５キロダルトン抗原プロモーター、スーパーオキサイドジスムターゼ・プロモーター、ミコバクテリアａｓｄプロモーターおよびＢｘｂｌ、Ｂｘｂ２．Ｂｘｂ３，１．．１．Ｌ５．Ｄ２９およびＴＭ４プロモーターなどのミコバクテリオファージプロモーターである。一つの実施例において、プロモーターは１（Ｓ　Ｐ　６０あるいは＋１　Ｓ　Ｐ　７０などのようなミコバクテリア熱ショックタンパク質プロモーターである。

前記記載のミコバクテリアプロモーターおよびミコバクテリオファージプロモーターを含む発現ベクターの例は、１９９１年１月１６日受理された出願番号６４２，０１７に詳細に記述されているが、これは現在放棄された出願番号５５２，８２８を継承したものである。出願番号６４２，０１７の内容は、ここで９照文献としてとり入れられている。

望ましい実施例において、ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳の開始を準備する転写開始部位、リボゾーム結合部位、および出発コドンはそれぞれミコバクテリア起点である。

ｍＲＮＡの翻訳を停止し、従って異種タンパク質の合成を終結させる停止コドン、および転写終結部位はミコバクテリア起点、あるいは他の細胞起点のものであり、もしくは本来合成されるものであり、あるいはその停止コドンおよび転写終結部位は異種タンパク質あるいはポリペプチドをコード化するものであり得る。

望ましくは、ミコバクテリアプロモーターはＢＣＧプロモーターであり、そのミコバクテリアはＢＣＧである。

第２ＤＮＡ配列によりコード化される異種タンパク質ある５ｓはポリペプチドは、必ずしもそれに限定されないが、抗原、抗腫瘍剤、酵素、リンフ才力イン、薬理剤、免疫強化剤、および診断情況において対象となるリポータ−分子である。

コード化される抗原は必ずしもそれに限定されないが、ライ菌抗原、ヒト結核菌抗原、リケッチャ抗原、クラジミア抗原、コクシェラ菌抗原、げっ歯頚マラリア病原虫スポロゾイトからのサーカムスボロゾイトタンパク質、などのマラリアスポロゾイトおよびメロシイトタンバク質ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、クロストリジウム抗原、リュージュマニア抗原、サルモネラ抗原、大腸菌抗原、リステリア菌抗原、ライム病ボレリア菌の０ｓｐＡおよび０ｓｐＢ抗原を含むボレリア菌抗原、フランジセラ菌抗原、エルシニア菌抗原、ミコバクテリウム、アワリカヌム抗原、パテ−杆菌抗原、トリ型結核菌抗原、トレポネーマ抗原、住血吸虫抗原、フィラリア抗原、百日咳抗原、ブドウ球菌抗原、ヘルペスウィルス抗原、インフルエンザおよびパラインフルエンザウィルス抗原、はしかウィルス抗原、ボルデテラ抗原、血友病抗原、肺炎連鎖球菌抗原のような化膿連鎖球菌および肺炎球菌のＭタンパク質を含む連鎖球菌抗原、流行性耳下腺炎ウィルス抗原、肝炎ウィルス抗原、赤痢菌抗原、ナイセリア抗原、狂犬病抗原、ポリオライリス抗原。

リフトバレー熱抗原、デング熱ウィルス抗原、はしかウィルス抗原、ロタウィルス抗原、ｇａｇ＋　ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質を含むヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）抗原、呼吸系合胞体ウィルス（Ｒ３Ｖ）抗原、蛇毒抗原、ヒト腫瘍抗原、およびコレラ菌抗原である。コードされる酵素は、それに限定されないが、ステロイド酵素である。

一つの実施例において、第２ＤＮＡ配列は、ＨＩＶタンパク質あるいはその断片もしは誘導体により誘発される細胞障害性Ｔリンフォカイトにより認識されるエピトープを含む少な（とも一つのタンパク質あるいはポリペプチドもしくはその断片あるいはその誘導体をコード化する。少なくとも１個のＤＮＡをコードすることが出来るＨＩＶタンパク質あるいはポリペプチドは、必ずしもそれに限定されないが、ＨＩＶ−Ｉ−ｇｐ１２０、ＨＩＶ−Ｉ−ｇｐ　４１．ＨＩＶ−１−ｇｐ　１６０、ＨＩＶ−Ｉ−ｐｏｌ、ＨＩＶ−Ｉ−ｎｅｆ、ＨＩＶ−１−ｔａｔ、ＨＩＶ−１−ｒｅｖ、ＨＩＶ−Ｉ−ｖｉｆ、ＨＩＶ−１−ｖｐｒ、ＨＩＶ−１− ｖｐｕ、ＨＩＶ−Ｉｇａｇ、ＨＩＶ−２−ｇｐ　１２０．＋ＩＩＶＡ−２−ｇｐ　１６０．ＨＩＶ−２−ｇｐ　４１．ＨＩＶ−２−ｇａｇ、ＨＩＶ−２−ｐｏｌ。

ＨＩＶ−２−ｎｅｆ、ＨＩＶ−２−ｔａｔ、ＨＩＶ−２−ｒｅｖ、ＨＩＶ−２− ｖｉ　ｆ、ＨＩＶ−２−ｖｐｒ、ＨＩＶ−２−ｖｐｕ、およびＨＩＶ−２−ｖｐｘである。

コードされる抗腫瘍剤は、必ずしもそれに限定されないが、インターフェロン− ａ、インターフェロン−β、あるいはインターフェロンγ、および腫瘍壊死因子、すなわちＴＮＦである。コードされるリンフ才力インは、必ずしもそれに限定されないが、インターロイキンｌから８までである。

異種タンパク質あるいはポリペプチドあるいはリポータ−分子あるいは選択的マーカーであり得ることも考えねばならない。

コードされるリポータ−分子は、必ずしもそれに限定されないが、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびカテコール脱水素酵素である。

コードされる他のペプチドあるいはタンパク質は、必ずしもそれに限定されないが、ストレスタンパク質をコード化するものであり、それは自己免疫疾患（例えばリウマチ様動脈炎）において免疫反応を呼び出しあるいは免疫寛容を誘発するために投与することが出来る。

コードされる選択的マーカーは必ずしもそれに限定されないが、βガラクトシダーゼマーカー、カナマイシン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカー、ネオマシイン耐性マーカー、およびヒグロマイシンｆｉｌ性マーカー、バクテリオファージ耐性マーカー、あるいはアミノ酸などのように栄養性成分の合成に含まれる酵素をコードする遺伝子である。

一つの実施例に従って、ベクターは更にミコバクテリア複製起、屯を含む。

も一つの実施例に従って、ベクターはプラスミドであることが出来る。プラスミドは非シャトルプラスミドであることが出来、あるいは大腸菌複製起点、バシラス複製起点、ブドウ球菌複製起点、ストレプトミセス複製起点、あるいは連鎖球菌複製起点などのような細菌複製起点を更に含むシャトルプラスミドであることが出来る。一つの実施例において、シャトルプラスミドは大腸菌複製起点を含む。

更にまたもう一つの実施例において、ベクターは多重クローニング部位を含むことが出来、また、異種タンパク質をコードする第２ＤＮＡ配列は多重クローニング部位に挿入される。

も一つの実施例において、発現ベクターは例えばテンペレートシャトルプラスミドあるいは細菌−ミコバクチリアシャトルプラスミドであることが出来る。これらの発現ベクターのそれぞれは、少なくともりボタンバク質の分泌シグナルをコード化する第１　ＤＮＡ配列およびタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドを発現するミコバクテリアに異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドをコード化する第２ＤＮＡ配列を、その中でＤＮＡ配列が発現されるミコバクテリアに安定して導入するために使用することが出来る。細菌内のプラスミドおよびミコバクテリア内のファージとして複製するシャトルプラスミドが採用される時には、少なくともりボタンバク質の分泌シグナルをコード化する第１　ＤＮＡ配列、およびタンパク質あるいはその断片、もしはくはポリペプチドあるいはペプチドを発現するミコバクテリアに異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドをコード化する第２ＤＮＡ配列を含むプラスミドのミコバクテリア染色体への組込みは、部位特異的組込みを通して生じる。ＤＮＡ配列は染色体ＤＮＡの一部として複製される。細菌−ミコバクチリアシャトルプラスミドが使用される場合には、ＤＮＡ配列はプラスミド内で染色体外に安定的に維持される。ＤＮＡ配列の発現は染色体外に（すなわちエピゾーム、遺伝子副体的に）生じる０例えばＤＮＡ配列はシャトルプラスミドにクローンされ、プラスミドは前記記載のようなミコバクテリアに導入され、そこでプラスミドはエピゾーム的に複製する。

そのようなシャトルプラスミドおよび細菌ミコバクテリアシャトルプラスミドの例は、１９８９年６月５日受理された出願番号３６１，９４４に詳細に記述されており、参考文献としてここに組み込まれている。

少なくともりボタンバク質の分泌シグナルをコード化する第１　ＤＮＡ配列および異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドをコード化する第２ＤＮＡ配列、また異種タンパク質あるいはポリペプチドの発現を制御するミコバクデリアプロモーターに加えて、−・っの実施例で発現ベクターは、ミコバクテリア染色体へのバクテリオファージ組込みをコード化するＤ　Ｎ　Ａ配列を更に含む、ミコバクテリア染色体へのバクテリオファージ組込みをコード化するＤＮＡ配列が誘導されるバクテリオファージは、必ずしもそれに限定されないが、Ｌ５．ＬＬ、Ｂｘｂｌ、およびＴＭ４ミコバクテリオファージ大腸閑のラムダファージ；コリネバクテリアの毒素ファージ；Ｍ線菌類およびノルカルディアＮｎｒｃａｒｄｉａファージ、ストレプトミセスのφＣａ＋Ｃａ− ジ：サルモネラの１）２２フアージである。望ましくは、ＤＮＡ配列はミコバクテリア染色体のミコバクチリオフ゛アージ組込みをコード化する。ミコバクテリア染色体へのバクテリオファージ組込みをコード化するＤＮＡ配列は、インテグラーゼをコード化するＩ）　Ｎ　Ａを含み、このインテグラーゼはベクターのミコバクテリア染色体への組込みを提供するタンパク質である。望ましくけ、ミコバクテリアのファージ組込みをコード化するＤＮＡ配列は、更にａｔｔＰ部位をコード化するＤＮＡを含む。

ａｔｔＰ部位をコード化するＤＮＡおよびインテグラーゼは、部位特異的組込みとして参照される組込み事象を提供する。ａｔｔＰ部位を含有するＤＮＡおよびインテグラーゼ遺伝子は、ミコバクテリア染色体の対応するａｔｔＢ部位への組込みを可能にする。

ａｔｔＰ部位をコード化する的確なりＮＡ配列は、異なったファージの間で変化することが出来るし、また、ａｔｔＢ部位をコード化する的確なりＮＡ配列は、異なったミコバクテリアの間で変化することができる。

ミコバクテリア染色体へのバクテリオファージ組込みをコード化するファージＤＮＡ部分であるＤＮＡの例は、１９９２年４月５日受理された出願番号８６９，３３０に更に詳細に記述されており、これは現在放棄された１９９０年７月１６日受理された出願番号５５３，９０７を部分的に継承するものである。出願番号８６９，３３０の内容は参考としてここに合体されている。

この発明のベクターは細菌、とりわけミコバクテリアを形質転換するために使用されることが出来、そのミコバクテリアは、必ずしもそれに限定されないが、ウシ型結核菌ＢＣＧ、恥垢菌、トリ型結核菌、ヂモテ菌、腐生菌、ルフ菌、仮性結核菌、ハバナ菌、スクロフラセウム閑、パテ−杆菌、雌つシ菌なとであり、特に、このようなベクターはＢＣＧを形質転換するため使用することができる。形質転換ミコバクテリアは、かくして異種タンパク質を発現し、それは前記記載の通り拡原であることが出来、それは免疫反応つまり治療剤を導入する。かくして形質転換ミコバクテリアはワクチン、およびもしくは治療剤などのような医薬品組成物の一部として使用することが出来、その組成物は形質転換ミコバクテリアおよび許容可能な医薬品キャリアを含む。許容可能な医薬品キャリアは、必ずしもそれに限定されないが、鉱油、ミョウバン、合成ポリマーなとである。ワクチンおよび治療剤のための賦形剤は従来の技術で周知であり、適切な賦形剤の選択はここに含まれる教訓から当業台の範囲内にあるものと見做される。適切な賦形剤の選択もまた、ワクチンあるいは治療剤が投与されるべき方法に依存している。

ワクチンあるいは治療剤は注射処方量の形態にすることが出来、筋肉、静脈、口腔、皮肉、あるいは皮下の投与により投与することが出来る。

ミコバクテリアは有効量で投与される。一般にはミコバクテリアは、処方当り約Ｉ×１０″′から約ｌＸｌ０”コロー二形成単位（ＣＦｔＪ’　Ｓ）の量で投与される。

ワクチンあるいは治療剤を投与する伯の手段はここでの教訓から当Ｍｅにとっては当然明白なことである。従って、この発明の範囲は特定のデリバリ形態に制限されるものではない。

前記記載のように、この発明の発現ベクターは、必ずしもそれに限定されないが、ライム病の原因因子となるライム病ボレリア閑の表面タンパク質あるいは抗原であるボレリア抗原をコード化するＤＮＡを含む。かくしてこの発明の一局面に従って、動物をライム病がら防護する一つの方法が提供され、これはライム病ボレリア菌に対する抗体を引き出すタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を含むＤＮＡで形質転換されたミコバクテリアを動物に投与することによりなる。ミコバクテリアは、動物をライム病から防護するのに有効な量で投与される。その量は前記記載の通りである。一つの実施例において、少なくとも１個のＤＮＡ配列は、ライム病ボレリア菌のタンパク質あるいはその断片もしくは誘導体をコード化する。少な（とも１個のＤＮＡ配列でコード化されるライム病ボレリア菌の表面タンパク質は、必ずしもそれに限定されないが、外部表面タンパク質Ａおよび外部表面タンパク質Ｂを含み、以下でそれぞれ０ｓｐＡおよび０ｓｐＢとして引用される。

形質転換ミコバクテリアは、前記記載のものを含む。一つの実施例において、ミコバクテリアはウシ型結核菌−ＢＣＧである。

望ましい実施例において、ライム病ボレリア菌に対する抗体を引き出すタンパク質あるいはポリペプチドをコードする少なくとも１個のＤＮＡ配列は、ミコバクテリア発現ベクターに含まれる。一つの実施例において、ミコバクテリア発現ベクターは前記記載のもののように少なくともりボタンバク質の分泌シグナルをコード化するＤＮＡ配列を含み、ここでこのミコバクテリアは（分泌シグナルを含むことが出来る）リポタンパク質あるいはりボタンバク質分節、およびライム病ボレリア菌に対する抗体を引き出すタンパク質あるいはポリペプチドのキメラ融合タンパク質を発現する。このような発現ベクターは、ライム病ボレリア菌に対する抗体を引き出すタンパク質あるいはポリペプチドがミコバクテリアの表面で発現され、それにより、タンパク質あるいはポリペプチドがより近づきやすくなるようにさせる。

もう一つの実施例において、ミコバクテリア発現ベクターは、ミコバクテリア排出タンパク質の全体あるいは一部をコードするＤＮＡ、ならびに、ライム病ボレリア菌に対する抗体を引き出すタンパク質あるいはポリペプチドをコードするＤＮＡを含むことが出来ることも考慮されねばならない、ミコバクテリアは、ライム病ボレリア菌に対する抗体を引き出すミコバクテリア排出タンパク質あるいはその部分およびタンパク質あるいはポリペプチドの融合タンパク質を発現する。

このような発現ベクターは、タンパク質あるいはポリペプチドがミコバクテリアから排出されることを可能にする。コードされるミコバクテリア排出タンパク質の例は、必ずしもそれに限定されないが、ウシ型結核菌およびＢＣＧのα抗原である。

ミコバクテリア発現ベクターは、一つの実施例において、前記記載のもののようなミコバクテリアプロモーターおよびミコバクテリオファージプロモーターよりなるグループから選択された１個のプロモーターを含むことが出来、およびもしくは同じく記載されているバクテリオファージのミコバクテリア染色体への組込みをコードするＤＮＡ配列を含むことが出来る。

もう一つの実施例において、ミコバクテリア発現ベクターは、同じく的記記載されている細菌複製起点を更に含む非シャトルプラスミドあるいはシャトルプラスミドなどのようなブラミドであることが出来る。

更に、ミコバクテリア発現ベクターは前記記載のテンペレートシャトルプラスミドあるいは細菌−ミコバクチリアシャトルプラスミドであることもある。

形質転換ミコバクテリアは動物をライム病から防護する組成物の一部として使用される。そのような組成物は、前記記載のもののような形質転換ミコバクテリア、および許容可能な医薬品キャリアを含む。

この発明は下記の実施例に関連し更に精しく記述されるが、この発明の範囲はそれにより限定されるものではない。

実−」［−泗−」よプラスミドｐＡＬ５０００は、腐生菌の複製起点を有し、ラビディ他ｒＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　Ｊ　３０巻、２２１−２２５頁（１９８５）および「遺伝子」７１巻、３１５−３２１（１９８８）に記載されているが、部分Ｓａｕ　３Ａ消化を受け、５キロベ一ス断片はゲル精製される。５キロベ一ス断片は次いでＢａｍＨＩ消化ｐｌＪ６６６　（大腸菌複製起点を有する大腸菌ベクターでネオマイシン・カナマイシン耐性をも有し、キーザー他が「遺伝子１６５巻、８３−９１頁（１９８８）に記述している）に結合されプラスミドｐＹＵＢ１２を形成する。プラスミドｐＹＵＢ　ｌ　２の形成の構成図。プラスミドｐＹＵＢ　１２形成の構成図は図１に示される。ｐＹＵＢ１２およびｐＩＪ６６６は次いで恥垢菌およびＢＣＧに形質転換された。ｐＹｔＪＢ１２１ｆ三質転換のみにより得られたネオマイシン耐性形質転換細胞は、［）ΔＬ　５０００が恥垢菌およびＢＣＧにあるｐ　Ｉ　、Ｊ　６６６に自律複製を与えたことを確認した。

スナツパ−他（＋９８８．前記記載）によるショットガン突然変異誘発は、ｐＡＬ５０００プラスミドの半分だけがＢＣＧにプラスミド複製を行うのに必要であることを示した。この分節は多分ロージ五他「遺伝子Ｊ７１巻３１５−３２１頁（１９８８）により確認された読取り枠ＯＲＦ　ｌおよび０ＲＦ２を実施したであろうし、またミコバクテリア複製起点を多分実施した。ｐＹＵＢ　１２は、次いで１１　ｐ　ａ　ＩおよびＥｃｏＲＶで消化され、この領域を運ぶ２５８６塩基対すなわち分節ｐＡＬ５０００は除去され、ＰｖｕＴＩ消化ｐＶＵＢ８に結合された。プラスミドｐＹＵＢ８　（ｐＢ１１３２２誘導体）は大腸菌レブリフンおよびＫａｎ”　（ａｐｈ）遺伝子を含む。

２５８６塩基対断片のＰｖｕｌＩ消化ｐＹＵＢ８への結合は、図２に示されるようにｐＹＵ８５３の形成を生じる。ｐＹＵＢ５３の形質転換は、Ｍ、ｒｅｐと指定されたＥｃｏＲＶ−Ｈｐ　ａ　Ｉ断片が、ＢＣＧに自律複製することが出来るのを確認した。

プラスミドｐＹＢＵ５３は、次いで下記の制限部位を除去するためにＡａｔｌ、ＥｃｏＲＶ、およびＰｓｔｌで消化された。

ＡａしＩ　５７０３Ｅｃｏｎｌ　５７８３ＢａｍＨＩ　５７９１ＳａｌＩ　５７９７Ｐｓｔｌ　５８０３Ｐｓｔｌ　７２５２Ｓａｉｌ　７２５８ＢａｍＨＩ　７２６４ＥｃｏＲＩ　７２７３Ｃ１ａｌ　７２９８ＨｉｎｄＩＩＩ　７３０４．およびＥｃｏＲＶ　７４６０断片末端はＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで流され、ブラミスドｐＹＵＢ　１２５形成のため再結合されるが、その構築は図３で前もって操作で不活性化されていたｔｅｔ遺伝子の７９２塩基対は、完全Ｎａｒ　Ｉ消化、６４０７塩基対断片のゲル精製および大腸菌株ＨＢ　１０１の結合、再循環、形質転換、およびＫａｎ” 形質転換細胞の選択により除去された。生じるプラスミドｐＭＶ　１０１の構築は図４で構成図に示されており、除去される領域のマーキングを含むｐ、ＭＶｌｏｌ、およびこの後で示される突然変異のＤＮＡ配列は、図５で示される。

将来の操作を容易にするために、ａｐＨ遺伝子内のＨｉｎｄＩＩＩおよびＣ１ａＩ制限部位は、「遺伝子」７７巻５７−５９頁（１９８９）に記載されている方法に従って、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ１突然変異誘発により同時に突然変異：＾発された。ａｐｈｉｉｌ伝子内で変化した塩基は各制限部位内でコドンの第３の位置（ゆらぎ塩基）にあり、行われた塩基置換はコード化タンパク質のアミノ酸配列を変更しないように設計された。

プラスミドｐＭＶ　ｔ　ｏ　ｔとＣｌ　ａＭｕｔ−Ｋａｎ＋Ｉｌ　ｉ　ｎｄｎＭｕｔ；−ＫａｎプライマーおよびＩＩ　ｉ　ｎｄｌ”Ｍｕ　Ｌ−Ｋａｎ＋Ｂａｍ −Ｋａｎプライマーの別々のｐｃｎ反応が９４℃（１分）、５０℃（１分）および７２℃（１分）で２５サイクルで行われた。Ｐ　ＣＩプライマーは、下記の塩基配列を有していた。

ＣＩａＭｕｔ−ＫａｎＣＴＴ　ＧＴＡ　’ｒＧＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＣ（：１１ｉｎｄＲＭｕｔ−にａｎＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＴＡＴ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＴＣＣＡＧｔｌｉｎｄＦＩＡｕｔ、−にａｎＧＴＣＴＧＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＴＴＣＴＣＡ　ＣＣＧ　ＧＢａＩｌ−にａｎＣＧＴ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＴＣＣＡ（：Ａ　ＧＧＡ　ＣＧ生じたＰＣＲ製品はゲル精製され、混合され、プライマーなしの単−ｐｃｎ反応が９４℃（１分）、７２℃（１分）１０サイクルで行われた。ＣＩａＭｕｔ−ＫａｎプライマーおよびＢａｍ−Ｋａｎプライマーが追加され、ｐｃｉが９４℃（１分）、５０℃（１分）、および７２℃（２分）２０サイクルで再び行われた。生じたＰＣＲ製品（Ｋａｍ、ｍｕｔ）はＢａｍ１−ＩＩで消化され、ゲル精製された。プラスミドｐＭＶ１０１はＣ１ａ！で消化され、付着末端はフレノウ＋ｄｃ：ＴＰ＋ｄＧＴＰにより充填された。フレノウは熱不活性化され、更にＢａｍＨＩで消化された。５２３２の塩基対断片はゲル精製され、断片Ｋａｎ、ｍｕｔで混合され結合された。結合は大腸菌株ＨＢ　１０１に形質転換され、Ｋａｎ”コロニーはＣ１ａｌおよびＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　／ｌ′ｉ化に対する酊１性のあるプラスミドにふるまい分けられた。このようなプラスミドはｐＭＶ　１１０と名付けられ、図４で説明されている。

プラスミドｐＭＶ１１０は、プラスミドｐＭＶ１１０および１）ＭＶ１１２を作り出すため別の構造に切除された。一つの構造において、ｐＭＶ　ｌ　ｌ　ＯはＮａｒＩおよびＢａ１ｌで消化され、末端は充填され、５２９６塩基対断片はｐＭＶ　１１１を形成するために結合され再循工景された。もう一つの構築物において、ｐＭＶｌｌｏはＮｄｅ　Ｉおよび５ｐｌＩで消化され、末端が充填され、５７６３塩基対断片がｐＭＶ　］　１２を形成するだめに結合され、Ｍ　？Ａ　ｒ＝された。ｐＭＶ　１１１およびｐＭＶ１１２積築の構成図は図６に示される。これらの構築物は史に、ミコバクテリア複製に必要でないｐＡＬ５０００から誘導される余分の大腸菌ベクター配列を除去した。クローニングは大腸菌で行われた。プラスミドｐＭＶ１１１およびｐＭＶ１１２は恥垢閑に複製する能力を検定された。二つのプラスミドが恥垢菌に複製したので、各プラスミドの除去は組合せられｐＭＶ　Ｉ　１３を構築した（図６）。

ｐＭＶ　Ｉ　１３を構築するために、ｐＭＶ　ｌ　１　＋はＩ３ａｍｌｌＴおよびＥｃｏＲＩで消化され、１０７１塩基対断片が分離された。ｐＭＶ１１２はＢａｍ）ＩＩおよびＥｃｏｌｌＩで消化され、３５７０塩基対断片が分離され、次いでｐＭＶｌｌｌから肖られた１０７目話基対断片に結合され、ｐＭＶ　ｌ　１３を形成した。これらの構築物は、かくして、ミコバクテリア内の自律複製に必要なｐＡＬ５０００の領域を１９１０塩基対以下である史にミコバクテリアレプリコンの操作を容易にするために、Ｐ　ＣＩ”？突然変異誘発がｐΔＬ５０００のＯＲＦ　１として知られる読取り枠１こ位置１−るＳａｌ　Ｉ、ＥｃｏＲｌ、およびＢｇ１１１部位を除去するために前のように実施された。ＰＣＲ突然変化誘発は各制限部位内のゆらぎ塩基で実施され、塩基置換は、推定１−のコード化ｏ　ｎ　ｘ：　ｔタンパク質のアミノ酸配列を変化させないように設計された。

制限部位はミコバクテリア内の検定の際に一時に一つずつ除去された。恥垢菌の複製を変更しないで５ａｉｌおよびＥｃｏＲＩを除去することが可能であった。

一つの構築において、ｐ　ｃ　ｎ突然変化誘発は、Ｅｃ。

Ｍｕｔ−Ｍ、ｒｅｐおよびＢａｍ−Ｍ、ｒｅｐプライマーと共にｐＭＶＩＩ３のＥｃｏＲＩ　１０７１で実施され、Ｅｃｏｔｌｌ　１０７１部位を欠除するｐＭｖ　１１７を形成した。　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｍ　ｕ　ｔ　−Ｍ　、ｒ　ｅ　ｐプライマーは下記の配列を持ＴＣＣＧＴＧ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＧＴＧ　ＴＣＣにＧＧ　ＡまたＢａｍ−Ｍ、ｒｅｐは下記の配列を有する。

ＣＡＣＣＣＧ　ＴＣＣＴＧＴ　ＧＧＡ　Ｔ、ｃｃ　ＴＣＴ　八Ｃもう一つの構築において、ｐ　ｃ　ｒｔｔ然変異誘発はＳａｌＭｕｔ−Ｍ、ｒｅｐおよびＢａｍ −Ｍ、ｒｅｐプライマーを用いて５ａｉ１　１３８９部位で実施され、５ａｌＩ　１３８９部位を欠除するｐＭＶ１１９を形成した。ＳａｌＭｕｔ−Ｍ、ｒｅｐプライマーは下記の配列を有する。

ＴＧＧ　ＣＧＡ　Ｃ（：Ｇ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＧＴＣＡＧＧ　ＣＣＴ。

ｐＭＶ　Ｉ　１７は次いでＡ　ｐ　ａ　Ｉ−ＩおよびＢｇｌ、ＩＩで消化され、また３３６０塩基材断片が分離された。ｐＭＶ　ｌ　１９はＡｐａＬＩおよびＢｇｌ、ＩＩで消化され、また！２８１２８１塩基材断離され、ｐＭＶ１１７から分離された３３６０塩基材断片と結合してｐＭＶ１２３を形成した。ｐＭｖ　１１７゜ｐＭＶ１１９．およびｐＭＶ　ｌ　２３プラスミドの構築の構成図は図７で示される。１３　ｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ部位の除去はしかしｐ　ｃ　ｒｔ突突然変異誘発クンノウ充填よって、ミコバクテリア内でのプラスミド複製を除去し、がくしてＢｇｌ　Ｉ　Ｉ部位がミコバクテリアプラスミド復製に必要な配列に近接しているかもしくはその範囲内にあることを示唆している。

６、Ｍ■２００シリーズベクターの　築大腸菌およびミコバクテリアにあるプラスミド複製（Ｅ。

ｒｅｐおよびＭ、ｒｅｐ）および組換え体（Ｋａｎ”）に必要なすべての成分の操作を容易にするために、各成分のカセットは、将来のベクターに単純化されたアセンブリーとして、またユニーク制限部位および転写および翻訳ターミネータ −を含有する多重クローニング部位（ＭＣ３）を含めるように構築された。カセットは、すべての転写で無指向性であるプラスミドに指向性クローニングおよびアセンブリーを可能にするよう構築ａｐｈ　（Ｋａｎ”　）遺伝子を含むＤＮＡカセットが、Ｋａｎ”　およびＫａｎ”　プライマーを用いてｐｃｎにより構築された。Ｓｐｅ１部位がＰＣＲプライマーＫａｎ”　’の５′末端に付加され、下記の配列を持つＰＣＲプライマーの形成が行われた。

ＣＴＣＧＡＣＴＡＧ　ＴＧＡ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　Ｇ。

Ｂ　ａ　ｎ　ＨＩ　＋　Ｎ　ｈ　ｅ　１部位がプライマーＫａｎｒ″の５′末端に加えられ、下記の配列を持っＰＣＲプライマーの形成が行われた。

ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣＣＴＴ　ＡＧＣＴＡＧ　ＣＣＡ　ＣＴ　ＧＡ（：　ＧＴＣＧＧＧ　Ｇ。

ｐｃｎはｐＭＶ１２３の３３７５および４５８５塩基で実施され、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅ　１部位は３１５９塩基で付加され、またＳｐｅ１部位は４５８５塩基で付加された。

ＢａｍＨＩおよびＳｐ’ｅＩでの消化、およびそれに続く精製でＢａｍＨＩから５ｐｅｌまで進むａｐｈ遺伝子に向けて転写指向性を持っＢａｍＨＩおよび５ｐｅＩ付着末端で結合される＋　２２８／２４４３Ｋａｎ”カセットが生成された。

Ｅ、ｒｅ　、カセットｐＵｃ　ｌ　９のＣｏ１ＥＩレプリコンを含有するＤＮＡカセットが、Ｅ、ｒｅｐ／ＳｐｅおよびＥ、ｒｅｐ／ＭｌｕプライマーでＰＣＲにより構築された。Ｓｐｅ　１部位がＰＣＩプライマーＥ、ｒｅｐ／Ｓｐｅの５゛末端に付加され、Ｍｌｕ１部位はＰＣＲプライマーＥ、ｒｅｐ／Ｍｌｕの５′末端に付加された。生じたプライマーは下記の配列を持っていた。

Ｅ、ｒｅ　、　／Ｓ　ｅＣＣＡ　ＣＴＡ　ＧＴＴ　ＣＣＡ　ＣＴＧ　ＡＧＣＧＴＣＡＧＡ　ＣＣＣＥ、ｒｅ　ＭｌｕＧＡＣＡＡＣＧＣＧ　ＴＴＧ　ＣＧＣＴＣＧ　ＧＴＣＧＴＴ　ＣＧＧ　ＣＴＧＰＣＲはｐｕｃ　１９（７）塩基７１３および１５００で実施され、またＭ　ｌ　ｕ　１部位は塩基７１３に付加され、Ｓｐｅ１部位は塩基１５００に付加された。Ｍ　ｌ　ｕ　Ｉおよび５ｐｅＩによる消化、および続く精製により、５ｐｅＩがらＭ　ｌ　ｕ　Ｉまで続くＲＮＡ　ＩおよびＲＮＡ　ＩＩ複製プライマーに向けられる転写指向性を持っ５ｐｅＩおよびＭ　ｌ　ｕ　Ｉ付着末端で結合されるＥ、ｒｅｐカセットが生成された。

Ｍ、ｒｅ　カセットミコバクテリア内のプラスミド複製に必要な配列を含有するＤＮＡカセットがＭ、ｒ６ｐ／ＭｌｕおよびＭ、ｒｅｐ／ＢａｍプライマーでｐＭＶ１２３のＰＣＲにより構築された。

Ｍｌｕ１部位がｐ　ｃ　ｉプライマーＭ、ｒｅｐ／Ｍｌｕの５′末端に付加された。Ｉ３ａｍ１１１部位はＩ）　Ｃ１１ブライマ−Ｍ／ｒ　ｅ　ｐ　／　Ｂ　ａ　ｍの５゛末端に付加された。生成するＰＣＩプライマーは下記の塩基配列を有していた。

Ｍ、ｒｅ　ＭｌｕＣＣＡ　ＴＡＣＧＣＧ　ＴＧＡ　ＧＣＣＣＡＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＧ性工り且■／上」ＣＡに　ＣＣＧ　ＴにＣＴＧＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣＴＣＴ　ＡＣＰＣＲはｐＭＶ　１２３の塩基１３４および２０８２で実施された。Ｍ　ｌ　ｕ　１部位が塩基２０８２に付加された。

ＢａｍＨＩおよびＭ　Ｉ　ＬＪ　＋での消化および続くゲル精製により、Ｍ　ｌ　ｕ　ＩからＢａｍＨＩまで続＜ｐＡＬ５０００　０ＲＦｌおよび０ｌＩＦ２遺伝子のための転写指向性を持つＭｌｕＩおよびＢａｍｔ（Ｉ付着末端により結合される１９３５塩基対ＤＮＡ力セントが生成した。

Ｋａｎ”　、Ｅ、ｒｅｐ、およびＭ、ｒｅｐのＰＣＲカセトが次いで等モル濃度で混合され、連結され、次いでＫａｎ”形質転換細胞の選択のために大腸菌株ＨＢ　１０１に形質転換された。コロニーは、Ｂａｍ＋ＩＩ＋Ｍｌｕｌ＋５ｐｅｌで消化の後すべての３個のカセットを保持するプラスミドの存在を確認するためふるい分けられ、ｐｌｖ’ｌＶ　２００と指定された。追加の制限部位であるＮｃｏ　Ｉは、ｐＭＶ　２００をＮｅｏ　Ｉでの消化によってＭ、ｒｅｐカセットから除去され、フレノウ充填され、連続および再循環された後、ｐＭＶ２０１が形成される結果となった。ｐＭＶ１２３およびｐＵＣ１９からのｐＭＶ２００、およびｐＭＶ２００から（７）ｐＭＶ２０１の形成ニツイての構成図は、図８で示される。プラスミドｐＭＶ　２００およびｐＭＶ２０１は恥垢菌およびＢＣＧに形質転換された。二つのプラスミドはＫａｎ”形質転換細胞を産出し、かくしてミコバクテリアに複製できる能力のあることを示した。

合成多重クローニング配列（ＭＣ３）（図９）は、次いでミコバクテリア内での外部遺伝子発現およびミコバクテリア染色体への組込みのための多様な分子クローニングおよび操作のために設計され合成された。図９で示される合成ＭＣ３は、ｐＭＶ２０１に対しユニークな１６個の制限部位を含み、３個の読取り枠のそれぞれに翻訳停止コドンを運ぶ領域、および大腸菌ｒｒｎＡＢリボゾームＲＮＡオペロンから誘導されるＴＩ翻訳ターミネータ−を含む。

ＭＣＳカセットを挿入するために、ｐＭＶ２０１がＮａｒＩおよびＮｈｅ　Ｉで消化され、生じた断片がゲル精製された。ＭＣ３はＨｉｎＰＩおよびＮｈｅ　Ｉで消化され、生じた断片がゲル精製された。２個の断片はｐＭＶ　２０４を産出するために次いで結合された。ｐＭＶ　２０４の構築の構成図は図１０で示される。

プラスミドｐＭＶ２０４は次いで更なる構築でＭ、ｒｅｐカセットの除去を容易にするように操作された。ｐＭＶ　２０４はＭｌｕＩで消化され、Ｍ　１　ｕ　Ｉ　−Ｎ　ｏ　ｔ　Ｉリンカ−は、ｐＭＶ　２０６を発生ずるためにＭ、ｒｅｐおよびＥ、ｒｅｐの間のＭｌｕＩ部位に挿入された。ｐＭＶ２０４からのｐＭＶ２０６の横築についての構成図は図１１で示され、ｐＭＶ２０６のＤＮＡ配列は図１２で示される。

７．８ＣＧ　Ｈ３Ｐ６０プロモーター　ダのＢＣＧ　１ｌｓＰ６０遺伝子の公開配列（ソール他、「感染および免疫」５５巻、１４６６−１４７５頁（１９８７゜６））および外界配列がＰＣＲによりＨ３Ｐ６０プロモ一ター断片の構築を可能にした。２５１塩基対ＩＩ　Ｓ　Ｐプロモーター断片（図１３、およびストーヴアー他による公開（１９９１））は、追加Ｘｂａ　ＩおよびＮｈｅ　Ｉ部位を含むプライマーでのＰＣＲにより増幅された。ＰＣＩＩ　Ｈ３Ｐ６０断片は次いでＸｂａ　ｒおよびＮｈｅ　Ｔで消化され、Ｘｂａｌ消化ｐＭＶ２０６と結合されてｐｌＩＢ２６（図１４）を形成する。

８．１９キロダルトンヒト上）タ　シグナル配ダをコード化するＤＮＡおよびＯｓ　Δ゛伝−ミコバクテリア、ベクターへの挿入１９キロダルトンヒト結核菌遺伝子の配列は、アシュブリッジ他「核酸研究ｊ１７巻、１２４９頁（１９８９）で与えられている。ヒト結核菌染色体ＤＮＡからの１９キロダルトン抗原遺伝子リボゾ一ム結合部位出発コドンおよびシグナル配列は、ヌクレオチドブライマーでＰＣＲにより増幅された。

ＰＣＲにより（１られた生成１５３塩基対断片は、追加Ｂｇｌｚ１５’）およびＢａｍ１ｌ　Ｉ　：　Ｅｃｏｌｌ　１部位（３′）を含む。この断片は、プロモーター配列の例外はあるが２７番目のコドンに至るまでの１９キロダルトン遺伝子の全５′領域を含有する。ＰＣＲ断片はＢｇｌ　Ｉ　ＴおよびＥ　ｃ　ｏ　Ｉｔ　Ｉで消化されｐ２６１９５を形成するためにＢ　ａ　ｍ　Ｉ−１１−Ｅ　ｃ　ｏ　Ｉｔ　Ｉ消化ｐＲＢ２６に結合される（図１６１゜０ｓｐＡ抗原をコードする遺伝子は、パーゲスローム他「分子微生物字、３巻、４号、４７９−４８６頁（１９８９）に記載されている。Ｎ末端１８コドン（分泌シグナルをコード化するもの）のみを除いて、０ｓｐＡ遺伝子配列は、７８０塩基対０ｓｐＡ断片を提供するために、追加Ｉ３ａｍＨＩ　（５′）およびＳａｌ　Ｅ　（３’　）部位でＰｃＲにより誘導された。

ｐ２６１９５はＢ　ａ　ｍ　Ｉ−（１および５ａｉｌで消化され、また７８０塩基対ＰＣＲ０ｓｐＡ断片は付着末端を生成するためのＢａｍ１ｌＴおよび５ａｉｌで消化され、またｐ２６＋９：：０ｓｐＡを形成するためにＢａｍｆｌＩｊ；よび５ａｉｌ消化２６１９５に結合された（図１７）。

夫−血一斑一１− １９キロダルトンヒト＋核　几７、のシグナル配列コードイす蚕１旦ｊニノ上ＪｂロアＤ＼Ａｅ遣皇」」１宸−扉り乙６λｌ二Δ導筈プラスミドｐＭＶ　２０６は実施例１で記載されるように横築された。１９キロダルｌ−ンヒト結核閑抗原遺伝子プロモーター、リボゾーム結合部位、出発コドン、および分泌シグナルはヌクレオチドブライマーでＰＣＲにより増幅された。

ｐ　ｃ　ｎ断片は追加ＸａｒおよびＢａｍＨ１部位を含む。図１８で示されるこの配列は２８６塩基材の長さであり、第２７番目のコドンまでの１９キロダルトン逍伝子の全公開５′領域を含む。

Ｐ　ＣＲ新島は次いでＸｂａｌおよびＢａｍｔ（Ｉで消化され１、）　＋　９１）　Ｓをｊ（ε成するためにＸ　ｂ　ａ　ＩおよびＬ３ａｍｌｌＩで消化され、ｐ　Ｉ　９１’　Ｓを形成するためにＸｂａ　ｒおよび＋３ａｍｌｌｒ消化ｐ　Ｍ　Ｖ　２０６に結合される。実施例１で記載されているように、７８０塩基対Ｏｓ　ｐ　Ａ　Ｐ　ＣＲカセットはＢａｍＨＩおよび５ａｌＩで消化され、ｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡを形成するためにＢ　ａ　ｍ　）（Ｉおよび５ａｌｌ消化ｐ１９Ｐｓに結合される。

上Ｎ１１および０ｓ）ＡＪＲ伝−を用いるミコバクテリア　ベニ二夏」ｊヒ１〜結核菌３８キロダルトン抗原の遺伝子配列は、アンダースン他「感染と免疫ｊ５７巻、８号　２４８１−２４８８頁（１９８９，８）で与えられる。ヒト結核菌染色体ＤＮＡより１１られ４５番目コドンまでの全５′配列を含む３８キロダルトン抗原プロモーター、リボゾーム結合部位、出発コドンおよび分泌ジグづルをコードするＩ）　Ｎ　Ａ配列は、ヌクレオチドブライマーでＰＣＲにより増幅された。生じるＰＣＲ断片は追加Ｘ　ｋ）ａ　ｒおよびＢａｍｌｌＩ部位を含む。Ｐ　Ｃｎ断片は２９７塩基対の長さで図２０に示されるように、Ｘｂａ　ＩおよびＢ　ａ　ｍ　ＨＩで消化され、ｐ　３８　Ｐ　Ｓを形成するためにＸｂａｌおよび１３ａｍｌｌｌ消化［）Ｍ　Ｖ　２０６に結合された（図２１）。

実施例１および２で示されるように、７８０塩基対ＯｓｐΔＩ）Ｃ１１カセツトは、＋３ａｍｌｌＩおよびＳ　ａ　ｌ　Ｆで消化され、ｐ３８ＰＳ：　：０ｓｐＡを形成するためにＢａｍＨＩおよび５ａｉｌ消化ｐ３８ＰＳに結合された。

実−１ｉｆｊｆ舛−」− Ｂ　ＣＧ　１１５　Ｐ　６０およびＯ３ＡＩ仁−にもとづｌｕカセットでのミコバクテリア−ベクターの　−策ｐＭＶ２０６は実施例１で前記記載されるように横築された。

ＢＣＧ　ｌ−１ｓＰ６０遺伝子の公開配列（トール他「感染と免疫」５５巻　＋４６６−１４７５頁（１９８７，６）ｌおよび外界配列は、Ｐ　Ｃ１１によって、発現制御配列（すなわちストーヴアー他（１９９１）で公開されたように）プロモーター、リボゾーム結合部位、および翻訳開始配列）を運ぶカセットの構築を可能にした。ＢＣＧ　ｔｌｓＰ６１カセット（図２２）は、Ｂ　ＣＧ　ＨＳ　Ｐ　６０出発コドンに対する３７５塩基５′をまた、出発コドンに対する１５１話基（５コドン）３′を含む。

ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーが次いで合成された。下記の配列を有するプライマーＸ　ｂ　ａ　−ＨＳ　Ｐ　６０、ＣＡＧ　ＡＴＣＴ＾Ｇ　Ａ（：Ｇ　ＧＴＧ　八ＣＣＡＣＡ　ＡＣＧ　ＣＧＣＣがカセットの３′末端のため合成された。このプライマーは、ＢＣＧ菌株パスツール染色体１）ＮＡからＰ　ＣＲによりカセットを増幅するために使用された。カセットの３゛末端でのＢａｍ１１１部位の追加は、Ｉｔ　Ｓ　Ｐ　６０遺伝子の最初の６個のコドンに対し、１個のコドン（Ａｓｐ）を追加する。

ｐＭＶ　２０６およびｐｃｎカセットＨ３Ｐ６１はそれぞれＸｂａ　ＩおよびＢａｍ１−１１で消化された。ＰＣ，＋１カセツトは次いでｐＭＶ２０６のＸｂａ　ＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に挿入され、更にプラスミドｐＭＶ２６１を形成するために結合された。このプラスミドの構築は構成図で図２３で示される。

前記記載の７８０塩基対０ｓｐＡ　ＰＣｎカセットはＤａｍＨＩおよび５ａｌｌで消化され、ｐ２６１　：　：　０ｓｐＡをバａ成するためにＢａｍＨＩおよび５ａｉｌ消化ｐＭＶ２６１に結合された。

支−１ＬＩＰ＋一旦一ストーヴアー他（１９９＋１で確認されたプロモーターおよび転写開始部位をコードするＤＮＡカセット、リボゾーム結合部位、およびＢＣＧ　ｌｌ５Ｐ６０遺伝子の出発つトンはＰＣＲによって構築された。このカセットは前記記載のＢＣＧＨ３Ｐ６１カセットのそれと同じであるが、例外はこのカセットカ咄発コドンに対する１５塩基（５コドン）３′を含まないことである。長さ２６７塩基対で図２４に示されるこのカセットは、追加ＸｂａｌおよびＮｃｏ　１部位、更にＮｃｏ　１部位に含まれる出発つトンを含む。このカセットは、構築の後でＸｂａｌおよびＮｃｏｌで消化された。

このカセットはｐＭＶ２５１を形成するためＸｂａＩおよびＮｅｏ　Ｉ消化ｐＭＶ２０６に置かれた（図２５）、（シグナル配列を含みパンゲスローム他（１９８９）により公開された）全長０ｓｐＡ遺伝子は、次いでＮｃｏｌ−３ａｌＩ制限断片としてＰＣＲにより誘導された。この断片は次いでＮｃｏ　Ｉおよび５ａｉｌで消化され、ｐ２５１　：　：０ｓｐＡを形成するためにＮｃｏ　Ｉおよび５ａｌＩ消化ｐＭＶ２５１に結合された。

丈−１Ｌ」引−ミニｐＲＢ２６は実施例１で記載されたように構築された。３８キロダルトン抗原遺伝子リボゾ一ム結合部位、出発コドン、および分泌シグナル配列がヒト結核菌染色体ＤＮＡから得られ、ヌクレオチドブライマーでＰＣＲにより増幅された。得られた断片は更に追加Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ　ＥｃｏＲＩ部位を含む。長さ２１０塩基対のｐｃｎ断片（図２６）は、ＢｇｌｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、ｐ２６３８Ｓを形成するためにＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化ｐＲＢ２６に結合される（図２７）、ｐ２６３８Ｓは次いでＢａｍＨＩおよび５ａｉｌで消化される。実施例１で記載される７８０塩基対０ｓｐＡＰＣＲ断片はＢａｍｔｌｌおよび５ａｌｌで消化され、ｐ２６３８：：０ｓｐＡを形成するためにＢａｍＨ，Ｉおよび５ａｉｌ消化ｐ２６３８Ｓに結合される。

１−胤一奥一ユエこの実施例はｐ３６３８　：　：０ｓｐＡの形成を記述する。

それはミコバクテリア染色体へのバタテリオファージ組込みをコードする配列、３８キロダルトンヒト結核菌抗原の分泌シグナルをコードするＤＮＡ、および０ｓｐＡ遺伝子を含む。

ｐＭＶ　２０６は、実施例１に前記記載された通り構築された。

ミコバクテリオファージＬ５　ａｔｔＰ部位、およびＬ５インテグラーゼ追伝子を含むプラスミドｐＭｌ＋９．１よ、ＢＣＧ発現ベクターにＬ５組込み配列を提供するものとして用いられた。ｐＭ１１９．４の構築およびその恥垢菌および１３ＣＧへの組込みは、下記のセクション（ｉ）から（ｖｉ）に記述される。

（ｉ）Ｋ　の１・　一部位ａｔｔＢ、ａしｔＬ、およびａｔｔＲΔ」凡人Ｎ皿９亘鷲標準の技術を利用して、ラムダＥＭＢＬ３ライブラリーカイｍｃ２６１（恥垢菌の一つの菌株であり、ミコノ〈クチ＋７オフアージＬ５のゲノムがそのなかに組込まれた恥垢菌染色体を含む菌株）から準備された染色体ＤＮＡを用いて溝築され。

ＢａｍＨｌで消化された。ファージＬ５は、ファージＬＬ（スナツパ−（１ｆｉ、１９８８）のそれと同じ制限部位を持つＤＮＡを含有するが、ただしＬ５は４２℃で複製出来るが、ファージＬｌはそのような成長が不能であることのみ異なる。このライブラリーは、次いでａｔｔＰ配列を運ぶものとしてこれまでに確認されてきたＬ５ゲノムかも分離された６、７キロベ一スＤＮＡ断片でプローブされた（スナツパ−他、１９８８）。正のクローンの１個がプラーク精製され、ＤＮＡが用意され、（ΔｔｔＬ配列を含む）１．１キロペ一ス５ａｌｌ断片がベクターｐＵｃＬ１９配列にサブクローンされた。この断片のＤＮＡ配列は、ショットガンアプローチおよびサンガー配列化を用いて決定された。ａｔｔＬ接合部位を分離配列化することにより、またこれを利用出来るＬ５のＤＮＡ配列と比較することによって、２個の配列が整列するがそこに、特異な不連続が存在する領域が決定された。この不連続はコア配列の一側面を表し、それはＡｔｔＰ、ａｔｔＢ、およびａｔｔＬにおいて同一である。組換え交差点を含む領域は、図２８で示される。

ａｔｔＬ　ＤＮＡ　（１，１キロベ一ス５ａｌＩ断片）が、ファージ組込みのない恥垢菌染色体を含も恥垢菌株ＢａｍＨＩ消化ｍｃ’　６　ＤＮＡのサザンプロットに対し、ハイブリット化のためのプローブとして使用された（ジエイコブ他。

１９８７、前記記ｌ！２）。恥垢菌のａｔｔＢ配列に対応して、約６．４キロベースの一つの帯が発見された。この同じａｔｔＬプローブが、　（イエシーヴア大学アルバート・アインシュタイン　カレッジ　オブ、メディスンのビル・ジェイコプ博大により提供された）ｍｃ２６のコスミド、ライブラリーをふるい分けるため利用され、数多くの正のコスミドクローンが確認された。ＤＮＡはこれらのクローンから用意され、ａｔｔＬプローブに対しハイブリット化する（ａｔ、ｔＢ部位を含有する）１．９キロベ一ス５ａｉｌ断片が、配列化および詳細分析のためにｐＵＣ１１９にサブクローンされた。コア配列を含有するＤＮＡ配列が決定され、図２８で示される。ａｔｔＰ。

ａ　ｔ　ｔ；　Ｂおよびａｔ　ｔ、Ｌで同一であるコア配列は４３塩基対の長さを持つ。

ｍｃ”６１ラムダＥ　Ｍ　Ｂ　Ｉ−３ライブラリーは、次いでａｔｔＢ部位を含む１．９キロベ一ス５ａｉｌ断片でプローブされた。正のプラークが確認され、ＤＮＡが用意され制限分析およびサザンプロットにより分析された。ラムダクローンは推定上のａ　ｔ、　ｔ　Ｒ部位を含む３．２キロベ一スＢａｍＨＩ断片を含むことが確認された。３．２キロベ一スＢａｍＨＩ断片は精製され、配列化および詳細分析のためにｐｕｃ　ｌ　１９にクロー前記方法と同時に、Ｌ　５のＤＮＡ配列のかなりの部分が決定され、いくつかの「コンティグｆｃｏｎｔ　ｉ　ｇｓ）ＪすなわちＤＮＡ配列島として表された。前記記載の６．７キロベースＢ　ａ　ｍ　＋−Ｉ　Ｉ断片の配列は（ａ）Ｌ５ＤＮＡのコンティグにあるＢａｍＨＩの位置分析によって、また（ｂ）Ｌ５の６．７キロベ一スＢａｍｔ１１断片を運ぶプラスミドｐＪＲ−１（図３３）のＢａｍＨＩ部位の周辺がらＤＮＡ配列の短い範囲を決定することによって決定された。

ＤＮＡ配列の一つの分節は、ファージＬ５の６．７キロベースＢ　ａ　ｍ　ＨＩ断片を表して位置を占めていた。他のファージの研究は、インテグラーゼ遺伝子がａｔｔＰ部位に近接してしばしば位置を占めていることを示している。かくして、Ｌ５５インテグラーゼｎｔ）遺伝子が、６．７ギロベ一スＢａｍＨＩ断片内か、ＤＮＡ配列のどちらかの側のいずれかに存在するものであるべきことが決定された。その領域にあるＤＮＡ配列は、それを６個のすべての読み取り枠に翻訳し、またこれらのアミノ酸配列をタンパク質に関連するインテグラーゼの系統群で探し、ＤＮＡ配列のコンピュータ支援分析を通じて分析された。図２９で示されたように、Ｌ５インテグラーゼおよび他のインテグラーゼの中でかなりよく保存された２個の領域および領域２で完全に保存された３個のアミノ酸残基が示されている（ヤジール他、ｒＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｊ　２０７巻、６９５−７１７頁（１９８９１，およびボイヤートーサルメロン他ｒＪ、ＥＭＢＯＪ　８巻、２４２５−２４３３頁（１９８９）参照のこと）。一つの領域が確認され、対応するＤＮＡ配列の分析は、約３３３個のアミノ酸を持つタンパク質をコード化することが出来る読み取り枠を示した。これらの観察は推定上のｉｎｔ遺伝子を確認した。

ｉｎｔ遺伝子の位置は、６．７キロベースＢ　ａ　ｍ　）−Ｉ　Ｉの範囲内にはなかった。しかし、それは遺伝子出発の上流１００塩基対以下の（６，７キロベ一スＢａｍＨＩ断片を定義する）Ｂ　ａ　ｍ　Ｉ−１１部位の一つに近接していた。ＢａｍＨＩ部位の分析はｉ　ｎ　を遺伝子が６．７キロベ一スＢａｍ１ｌＩ断片に近接して存在する１、９キロベースのＢａｍｔ（Ｉ断片内に存在することを示した。この１．９キロベ一スＢａｍＨＩ断片は、ｐＭＨｌを精製するためにＬ５ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化からの断片の精製およびｐｕｃ　ｌ　１９へのクローニングによりクローンされた（図３４）。

前記アブローヂの組合せから、Ｌ５のａｔｔＰ−ｉｎｔ領域の組織構成図が構築され（図３０）、ａｔ、ｔ、Ｐ−ｉｎｔ領域の遺伝子配列が図３１で５えれる。

（ｉ　ｉ）パμ涜■ ミコバクテリオファージ１．．５の６．７キロベ一スＢａｍ１（Ｉ断片は、前記記載の通りａｔｔＰ部位を含んでおり、ｐｔ、Ｊ　Ｃ１１９のＢａｍｔ１１部位にクローンされた（図３２）。これはアガロースゲル電気泳動により分離されたＬ５ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化から６．７キロベースＢ　ａ　ｍ　ｔ−Ｉ　Ｉ断片を精製し、ＢａｍＨＩ　ｃｕｔ　ｐＵｃ］１９と結合することで達成された。ｌ）　Ｎ　Ａは候補組換え体から用意され、制限酵素分析およびゲル電気泳動により特徴付けられた。組換え体ｐｔＪＣ１１９にクローンされたＬ５の６．７キロベ一スＢａｍＨＩ断片を含むことで確認された。このプラスミドはｐ　Ｊ　Ｒ− １と名付けられ、図３３で示される。

Ｌ５を配列決定するためのプロジェクトから得られた１）　Ｎ　Ａ配列データの分析は、前記記載の６．７キロベースのＢａｍＨＩ断片に隣接する１、９キロベ一スＢａｍＨＩ断片がインテグラーゼ遺伝子を含むことを示した。

ｐＵｃ１１９のＢａｍ１１１部位にクローンされるインテグラーゼをコード化するＩ）　Ｎ　Ａを含む１．９キロベ一スＢａｍＨＩ断片を含むプラスミドが構築された。１，９キロベ一ス断片は［，５ＤＮＡの１３ａｍｌｌｌ消化から精製されｐ、Ｕｃ１１９のＢａｍｔ（１部位にクローンされた。組換え体の構築は制限分析およびゲル電気泳動により決定された。このプラスミドはｐＭＨｌと名付けられ、その構造は図３４で図式的に示される。

ｐＪＲ−１は次いで、その間がＢ　ａ　ｍ　ＨＩ部位であるＥ　ｃ　ｏ　１１１および５ｎａＢＩ　（いずれもユニーククローニング部位）で消化によって脩飾された。Ｂａｍ８１部位を含むＥｃｏｎ　ｌ−３ｎａｒ３１断片は切除され、このプラスミドはｐ　Ｍ　Ｉ＋　２プラスミドを形成するためにｔＴｆ結合された。ｐＭｆ（２プラスミドはｐ　Ｊ　１１−１に含まれる２個のＢａｍＨＩ部位に対比されるＢａｍＨＴ部位を含有する。ｐＭＨ２の構築についての構成図は図３５で示される。

１．９キロベ一スＢａｍｔｌＩ断片は、インテグラーゼ遺伝子を含むが、それがｐ　Ｍ　＋−（１のＢａｍｔ（Ｉ消化から精製され、ＢａｍＨＩ消化ｐ　Ｍ　Ｈ２に結合された。組換え体は前記のように確認され、１．９キロベ一ス断片の配向が決定された。

ｐ　Ｍ　Ｈ４と名付けられたブラミスドはかくして構築され（図３６）、ここで５ｎａＢ　Ｉ部位（ａｔｔＰ上流）からＢａｍＨＩ部位（インテグラーゼ遺伝子の下流）に到るまでの領域がＬ５にあるものと同じであった。

ｐＭＨ４はＨｉｎｄＩＩＩ（ユニーク部位）で消化され、カナマイシン耐性を決定する遺伝子を含む（ナイジェル・ギントレー・ラボラトリ−のキース・ダービーシャーより提供された）ｐＫＤ４３かも精製された１キロベース）Ｉｉｎｄｌｌｌ断片に結合された。組換え体は確認され、前記の通り特徴付けられた。この組替え体はｐＭＨ５と名付けられる。ｐ　Ｍ　Ｈ５の構築についての構成図は図３７で示される。

（ｉｖ）　Ｍ１１５の恥　のａｔｔＢへの　”入みプラスミドｐＹＵＢ１２（ビル・ジエイコブ博士よりの贈与されたものであり、その形成の構成図は図１で示される）、ｐＭＤＯｌ（図３８）、およびｐ　Ｍ　Ｈ５は１０００倍レンジ以上のプラスミドＤＮＡの４沖の異なった濃度で、プラスミド複製を支援出来る菌株である恥垢菌株ｍｃ”１５５に電気穿孔された。セクション（ｉｖ）から（ｖｉ）まで、恥垢菌あるいはＢＣＧのすべての電気穿孔手順が下記のとおり実施された。

生体の培養はスナツパ−他（１９８８）に記載されているように、ミドルプルツク７１１９培地で成長し、遠心分離で収穫され、冷却された１０％クリセロールで３回洗浄され、細胞の約１００Ｘ１１度で再懸濁された。

１μｍのＤＮＡが氷で冷却されたクヴエット内の１００μｍの細胞に加えられ、バイオラット遺伝子パルサーでパルスが与えられ、１．２５Ｋｖ、２５ＬＬＦで単一パルスが与えられた。

ｌｕｌの肉汁が、抗生物質耐性マーカーの発現のために細胞に加えられ、１時間３７℃で保温された。細胞は次いで濃縮され、カナマイシン１５ｕｇ／ｍｌを含むミドルプルツクあるいはトリプシン大豆培地でプレート培養された。コロニーは３−５日間３７℃で保温された後に観察された。

ｐＹＵＢ　ｌ　２．ｐＭＤｏ　１．およびｐＭ）＋５のそれぞれが、カナマイシン耐性を有している。プラスミドｐＹＵＢ　１２はＤＮＡ複製起点を保持し、一方ｐＭＤｏ　１はミコバクテリア複製起点を欠除している。プラスミドｐ　Ｍ　Ｈ５はミコバクテリア複製起点を保持しないが、ａｔｔＰ部位およびインテグラーゼ遺伝子を含有するファージＬ５の２キロベース領域を保持している（図３１）。数多（の形質転換細胞がＤＮＡ濃度に従って線形であった。ブラミスドｐＹＵＢ１２は、ｍｃ”　１５５内で数多くの形質転換細胞（ＤＮＡｕｇ当たり２ｘｔｏ’）を与え、一方、ｐＭＨ５は、ＤＮＡｕｇ当り６Ｘ１０’個の形質転換細胞を与えるがｐＭＤＯｌは形質転換細胞を与えない。

前記の実験は、プラスミドｐＹＵＢ　１２．ｐＭＤｏ　ｌ　、およびｐＭＨ５をプラスミド複製を支援しない恥垢菌ｍｃ”　６に電気穿孔させ繰返された。ｐＹＵＢ　１２あるいはｐＭＤｏ　１からｍｃ”　６内に形質転換細胞は得られなかったが、一方ｐ　Ｍ　Ｈ５ハＤ　Ｎ　Ａ　Ｌｌ　ｇ当りｍｃ”６内に約１０’個のカナマイシン耐性形質転換細胞を生じ、かくしてｐＭＨ５のｍｃ”　６染色体への組込みを示すものとなった。

６個の独立ｐＭＨ５形質転換細胞（ｍｃ”１５５が４個、ｍｃ”　６が２個）からのＤＮＡが用意された。これらのＤＮＡは（ｍｃ２１５５自身、およびプラスミドｐＹｔＪＢ　ｌ　２を運ぶｍｃ”１５５の双方からのＤＮＡとともに）制限酵素で消化され、前記記載の恥垢菌１．９キロベースａｔｔＢプローブを用いてサザンプロットおよびハイブリッド形成で分析された。図３９で示されるように、６個の形質転換細胞すべてがａｔｔＢ部位に組込まれ、異なった移動度を持つ新しい２個のＤＮＡ断片が生産された。もしｐ　Ｍ　Ｈ５がａｔｔＢ部位に組込まれなかったら、ｍｃ”１５５対照内にあるａｔｔＢ部位に対応して単−帯が得られることが期待されたであろう。

（ｖ）　ＭＩＩ９．２および　ＭＢ２．４のｐＬＩＣ１１９はＨｉｎｄＩＩＩで消化され、またカナマイシン耐性遺伝子を含みｐＫＤ４３で精製される１キロベースＨ３ｎｄｌＩＩは、９ＭＨ８を形成するためにＨｉｎｄｌｌＩ消化ｐＵｃ１１９に結合された（図４０）。２キロベ一ス５ａｌＩ断片（塩基対３２２６−５３１０）は５ａｌＩ消化ｐＭＨ５からのａｔｔＰおよびインテグラーゼ遺伝子を運ぶが、これは精製され、プラスミドｐＭＨ９，２およびｐＭＨ９，４を形成するために５ａｌＩ消化ｐ　ＨＭ　８のベクター・バックボーンに関連して双方向に挿入された（図４１および図４２）。

電気穿孔の結果として、プラスミドｐＹｔＪＢ　１２．’ｐＭＨ９，２あるいはｐＭＨ９，４を運ぶ恥垢菌株ｍｃ”１５５細胞、もしくは前記記載の電気穿孔の結果としてプラスミドｐＭＨ５を運ぶ株菌ｍｃ”　６は、カナマイシンと共に肉汁内で飽和成長した。培養は次いでｌ：１００に希釈されカナマイシンなしの肉汁で飽和成長した。約２０世代の細菌成長に対応し、更に２種のサイクルの希釈と成長が行われた。培養は平板からとり出され非選択平板に単一コロニーにされ、約１００個のコロニーが非選択平板および選択平板両方の上にパッチ・プレートされた。カナマイシン感受性であり、従って、プラスミドを失った細胞の割合に対応するコロニーの％が下記表１で与損耗％ｐＹＵＢ　ｌ　２　（ｍｃ”　１５５）　３５ｐＭＨＢ５　（ｍｃ”　６）　ｌ　７ｐＭＨＢ９．２　（ｍｃ”　１５５）　３ｐＭＨＢ９．４　（ｍｃ”　１５５）　０（ｖｉ）　ＭＢ２．４によ　ＢＣＧの七　−前記記載の恥垢菌のａｔｔＢ部位を含む１．９キロベ一ス５ａｉｌ断片は、ｐＬＩＣ１１９にクローンされ、生じたプラスミドはｐＭＨ−１２と名付けられた（図４３）。

（ｐＭＨ−１２から分離された）ａｔｔＢを含むゲル精製５ａｌＩ　１．９キロベ一ス恥垢菌断片が、ＢＣＧサブ菌株パスツールを含むＢａｍＨＩ消化ミコバクテリアＤＮＡのサザン転移をプローブするために使用され１図４４で示される。

これは恥垢菌ａｔｔＢプローブに対し協力にハイブリット形成する１個のＢＣＧのＢａｍＨＩ断片および微弱にハイブリット形成する３個の断片があることを示していた。もつとも強力なハイブリッド形成帯は最速移動帯（約１．９キロベース）である。

前記の同一プローブが（ビル・ジエイコブ博士の提供による）ＢＣＧコスミドライブラリーをプローブするのに用いられ、正のクローンが確認された。ＤＮＡはいくつかの正のクローンから用意され、制限分析およびサザンブロツティングにより分析された。（サザンブロッテインクにある最強のハイブリット形成帯に対応する）１．９キロベ一スＢａｍＨＩ断片が確認され、コスミドＤＮＡからゲル精製され、ｐＵｃ１１９にクローンされさた。生じたプラスミドはｐＭＨ−１５と名付けられた（図４５）。

プラスミドｐＭＨ−５および９Ｍ８９．４は、ＢＣＧパスツールに電気穿孔された。ｐＭＨ９，４は高収率（ＤＮＡｕｇ当り約１０’個の形質転換細胞）でＢＣＧを形質転換し、一方ｐＭＨ−５は低収率（ＤＮＡｕｇ当り１−１０個の形質転換細胞）でＢＣＧを形質転換することが観察された。ＤＮＡはＢＣＧ形質転換細胞から用意され、ＢａｍＨＩ制限分析およびサザンプロット分析により分析され、ｐＭＨ−１５からの１．９キロベ一スＢａｍＨＩ　ＢＣＧ　ａｔｔＢ断片ゲル精製でプローブされた。これらのデータは図４１で示されており、ｐ　Ｍ　Ｈ５およびｐＭＨ９，４双方の組込みはＢＣＧ　ａｔｔＢ部位（すなわちＢＣＧ内の強力交差パイブリット形成断片）に特異的であることとを示している。これは形質転換細胞から１．９キロベ一スＢａｍ１ｌＩ断片が損耗し、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ結合断片を表わす２個の新しい帯が出現することにより説明される。図４６は１個のみのｐＭＨ５／ＢＣＧ形質転換細胞を示しており、一方１分析された４個のすべてが（最大のものである）帯のｔＨが期待されたものより小さく　（また、形質転換細胞のそれぞれが異なっており）、ｐＭＨ−５の形質転換効率がＢＣＧでは低いものであることを示している。対照的に４個の９Ｍ８９．４形質転換細胞はお互いに同一であり（図４６）、また予想されたサイズのａｔｔｌｌおよびａｔｔＬ結合断片を生じる。

プラスミドｐＭＶ２０６はミコバクテリアレプリコンを除去するためにＮ　Ｏｔ、　Ｔで消化された。生じた２２ｏ９塩基対断片は、ａｐｈ（Ｋａｎ″）遺伝子、大腸菌レプリコンおよび多重クローニング部位を含むが、それは結合されｐＭＶ　２０５を形成するために再循環されるが、この構築は図１１で構成図として示される。

ＸｂａＴ−Ａｔｔ／Ｉｎｊ、およびＮｈｅ　Ｉ−Ａｔｔ／Ｉ　ｎｔプライマーでのｐ　ｃ　ｎは、次いでａｔ、ｔ、Ｐ部位および１，５インチクラーゼ遺伝子を含有する＄）Ｍ１１９．４から５ａｌＩ断片上で行われた。生じたカセットは次いでＸｂａ　＋およびＮｈｅ　１で消化され、１７８９塩基材断片はゲル精製された。ｐＭＶ２０５は次いでＮｈｅ　Ｉで消化され、生じた断片は９Ｍ８９．４から得られた１９８９塩基対断片に結合されｐＭ■３０６を形成した。ｐ、ＭＶ３０６の構築についての構成図は図４７で示される。

（実施例６からの）ｐ２６３８　：　：　０ｓｐＡおよびｐＭＶ３０６はそれぞれＸｂａ　ＩおよびＳ　ａ　ｌ　Ｉで消化された。

ｐ２６３８　：　：　０ｓｐＡのＸｂａｌ−３ａｌ　Ｉ断片は、ＨＳ　Ｐ６０フロモーター、３８キロダルトン分泌シグナル配列、および０ｓｐＡ抗原配列を含有するが、それはＸｂａＩおよび５ａｌＩ消化ｐＭＶ３０６に結合され、ｐ３６３８　：　：Ｏｓｐ八を形成した。

実施例８゜ｐ　ＩＩ　Ｂ　２６は実施例１で記述されたようにＩ＃Ｉ築された。ヒト結核菌あるいはＢＣＧの３２ギロダルトンα抗原遺伝子（松尾他、ｒ、Ｌ　Ｂａｃｔ、ｃｒｉｏｌ、　Ｊ　１７０巻、９号、３８４７−３８１５４頁（１９８８，９）、ボッレマンズ他、「感染および免疫１５７巻　１０号、３＋２３−３１３０頁（１９８９，１０））がＢ　ＣＧ染色体ＤＮＡより得られ、追加ＢｇｌｌＩ−Ｂａｍｔ（Ｉ：Ｅｃｏｔｌｒ部位を含むプライマーを用いてＰＣＨにより増幅さｔ］た。長さ４２０塩基材のＰ　ＣＲ断片（図４８）は、ｒ３ｇｌ　Ｉ　ＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、全α抗原遺伝子を含（１するｐ　Ａ　Ｂ　２６１を形成するために１３ａｍｌ１１およびＥ　ｃ　ｏ　Ｉｔ　Ｉに結合された（図４９）。ｐＡ３２６１は次いでＢａｍｔ（Ｉおよび５ａｌＩで消化され、実施例１に記述された７８０塩基材Ｐ　ＣＩＩ　Ｏｓ　ｐ　ＡカセットもまたＢａｍ１（ＩおよびＳ　ａ　Ｉ　Ｉで消化され、ｐＡＢ２６１　：　：０ｓｐＡを形成するたぬにＢ　ａ　ｍ　ｔ−ｉ　Ｉおよび５ａｉｌ消化ｐＡＢ２６１に結合されｌこ。

実施例９ニプラスミドｐＭＶ　２０６は実施例１に記載の通りｔ＃Ｉ築された。

Ｂ　ＣＧ　ＨＳ　Ｐ　７０遺伝子の５′領域の部分配列（これはＢ　ＣＧ　ＨＳ　Ｐ　７０熱シヨツクタンパク質をコード化し、７０キロダルトン抗原として知られており、ロンドン、メディカルリサーチ力ウンシイルのラジュ・ラシクラ博士より大手したもの）が、プロモーター配列を運ぶカセットの構築を可能にした。ＨＳ　Ｐ　７０プロモーターはＸｂａｌおよびＮｈｅ　Ｉ部位を含むプライマーでＰＣＲにより増幅された。長さ１．２１塩基材のＨＳ　Ｐ　７０プロモ一ターＰＣＩ断片（図５０）は、Ｘｂａ　ＩおよびＮｈｅ　Ｉで消化され、ｐＲＢ２７を形成するためにＸｂａＩ消化ｐＭＶ　２０６に結合された（図５１）、ＢＣＧの３２キロダルトンα抗原遺伝子は、実施例８に記述されるようにＢＣＧ染色体ＤＮＡから得られ、追加Ｉ３　ｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　：　ＥＣＯＲＩ部位を含むプライマーを使用してＰＣＲにより増幅された。ＰＣＲ断片はＢｇｌｌｌおよびＥ　ｃ　ｏ　ＲＩで消化され、全α抗原遺伝子を含むｐＡＢ２７１を形成するために、Ｂａｍｔ（ＩおよびＥｃｏＲＩ消化ｐ　ＲＢ　２７に結合された（図５２）ａｐΔＢ　２７１は次いでＢａｍ１１１および５ｕｌＴで消化され、実施例１でここに記述された７８０塩基対ＰＣＲ０ｓｐＡカセツトもまたＢ　ａ　ｍ　＋（Ｉおよび５ａｌＩで消化され、ｐＡＭ２７１　：　：　Ｏｓ　ｐＡを形成するためにＢａｍＨＴおよびＳａｌ消化ｐＡＢ２７１に結合された。

丈−考し」町−１旦・ベクターｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡ、ｐ３８ＰＳ：　：０ｓｐＡ、ｐＭＶ２６１　：　：０ｓｐＡ、およびｐＭＶ２５１　：　：０ｓｐＡはＢＣＧに形質転換された。形質転換ＢＣＧ細胞は培養され、細胞は次いで培養から沈殿した。細胞は次いで食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で懸濁され、細胞懸濁液は等密度に正常化された。細胞は音波処理で破砕され、細胞外波は沈殿し、上澄み（細胞質ゾル富化分画）は保全された。細胞外被はＰＢＳで再懸濁され、ＩＩはトリトンＸ−１１４を２％（容積／容積）まで加えることによって可溶化された。不溶材質（細胞壁富化分画）は沈殿し、上澄み（膜富化分画）は除去された。トリトンＸ−１１４が細胞質ゾル富化分画に加えられた。トリトンＸ−１１４溶液を３７℃で短い間暖めた後、短い遠心分離を行うことで、水と洗浄剤の位相で達成された。これら２個の位相は３回バック抽出され、代表的な試料にあるタンパク質はアセトンの添加により沈殿した。各培養上澄みの一部は、限外濾過装置（セントリコン −３０，アミコン社）により濃縮され、ニトロセルロースに形質移入され、抗０ｓｐＡモノクローン抗体（Ｍ　ａ　ｂ　）　Ｈ５３３２でウェスタンプロットされた（ハウ他、「感染および免疫」５４巻、１号、２０７−２３２頁（１９８６，１０）。フィルター拘束抗体は強化ケミルミネセンスシステム（アマージャム社）を用いて視覚化された。図５３で示されるように、レーンｌは分子量標準（レインボーマーカー、アマージャム社）である。レーン２は全細胞音波破砕分画である。レーン３はトリトンＸ−１１４不溶性材質である。レーン４は水相膜分画である。レーン５は洗浄剤相膿分画である。レーン６は、水相細胞ゾル分画である。またレーン８は濃縮培養培地である。

図５３から見ることが出来るように１発現ベクターｐ１９ＰＳ：：０ｓｐＡおよびｐ３８Ｓ　：　：から発現された組換え０ｓｐＡ融合タンパク質は、　ｇｉ分画からのトリトンＸ−１１９相に主として偏在していることが見出され、かくして、これら組換え０ｓｐＡタンパク質がミコバクテリア１９キロダルトンおよび３８キロダルトン分泌シグナルに融合し、それはＮ末端システィンで、脂肪酸アシル化により分泌および翻訳後処理に向けられたことが示唆された。ｐＭＶ２５１　：　：　０ｓｐＡにより未変性リポタンパク質シグナルペプチドで発現された０ｓｐＡは洗浄剤可溶ＢＣＧ膜分画に偏在することが見出された。もっとも追加０ｓｐＡはＢＣＧｍ胞形質水性分画にも見出された。か（して、０ｓｐＡシグナルは、１９キロダルトンおよび３８キロダルトンシグナル配列であったようには、ＢＣＧ内では、効率的には処理されなかったことが示唆された。０ｓｐＡがリポタンパク質シグナルに融合しないｐＭＶ２６１　：　：０ｓｐＡにより発現された組換え０ｓｐＡは、水性細胞形質分画にのみ偏在していた。

−１１，’ ＢＣＧ細胞はｐＡＢ２６１　：　：０ｓｐＡ、ｐＡＢ２７１　：　：０ｓｐＡ、あるいはｐＭＶ２６１　：　：０ｓｐＡで形質転換され、培養された。ＢＣＧ培養上澄みの部分が培地の一成分であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からアフィーゲル・ブルー（バイオラット社）による吸着により除去された。培養から得たＢＣＧ細胞ペレットがＰＢＳで懸濁され音波破砕された。吸着あるいは未吸着上澄みは（セントリコン３０で）濃縮され、次いで溶解細胞として培養量ベースで同じ相対濃度に希釈された。試料は５ＤＳ−ＰＡＧＥとして使用され、続いて抗０ｓｐＡ　（Ｍａｄ　８５３３２）、抗Ｈｓｐ７０（ＭａｄＩＴ−４１，ＷＨＯミコバクテリア・モノクローナル抗体バンク）、あるいは抗Ｈｓｐ６０　（Ｍａｄ　ＩＴ−Ｂ、ＷＨＯミコバクテリア・モノクローナル抗体バンク）などで免疫プロット法処理された。図５４で示されるように、レーンＭ、Ｗ。

Ｓｔｄ、は分子量標準であり、レーンＷは全細胞ライゼートであり、レーンＳは培養上澄み（未吸着）であり、またレーンＡは吸着上澄みである。図５４で示されるように、分泌シグナルなしで完全α抗体遺伝子に対する０ｓｐＡ遺伝子の融合は、高水準の発現を生じたし、また生じた組換えα抗原０ｓｐＡ融合タンパク質は培養培地にＦＩＬ出されることが発見された。上澄み内で細胞形質タンパク質（ｔｌ　ｓ　ｐ　６０およびＨｓ　ｐ　７０　）の検出可能な量が見出せないことは、細胞溶解が最小であり、また、組換えα抗原：：０ｓｐＡ融合タンパク質が特に分泌されることに目標をおき、自己溶解のために培養上澄みには単に見出せない、ということも示していた。

実施　１２゜ｌ３ＣＧ生体（パスツール菌株）は下記のベクターの１個で形質転換された。

ｐＭＶ２６１　：　：ＯｓｐＡｐＭＶ２５１　：　：０ｓｐＡＰ２６１９　：　：　０ｓｐＡＰ１９ＰＳ：　：０ｓｐＡｐ３８ＰＳ：　：０ｓｐＡＰ３６３８：　：０ｓｐＡｐＡＢ２６１　：　：０ｓｐＡ頁の対象として、ｐＭＶ２６１／Ｌ２が生体の対象グループを形質転換するために使用された。ｐＭＶ２６１／Ｌ２は（βガラクトシダーゼをコード化する）大腸菌１　ａｃＺ遺伝子をＢａｍＨＩ消化ｐＭＶ２６１に運ぶＢａｍ１１！制限断片をクローニングすることにより構築された。

形質転換ＢＣＧコロニーは、カナマイシン耐性に対する選択によって分離され、詳細分析に対する液体培地培養に拡張された。培１ｍ等量を表す組換えＢＣＧ試料が５ＤＳ−ＰＡＧＥにより処理され、ニトロセルロースに転移され、抗ＯｓｐＡＭ　ａ　ｂ　Ｈ５３３２でウェスタンプロットされた。採用された正の対象は、ライム病ボレリア菌株Ｂ３１の処理試料、および濃度５００μｇ／ｍ＋、１１００ｕ／ｍ１．および２０　ｕ　ｇ／ｍｌの０ｓｐＡ抗原の試料であった。フィルター拘束抗原が強化ケミルミネセンスシステム（アマージャム社）で視覚化され、た。図５５で示されるように、０ｓｐＡは０ｓｐＡ遺伝子を含むベクターでＢＣＧ形質転換されることにより発現された。更に図５５は、ｐ２６１９：　：０８ｐＡ、ｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡ、ｐ３８ＰＳ　：　：　０ｓｐＡ、あるいはｐ３６３８　：　：０ｓｐＡでＢ　ＣＧ形質転換されることにより、０ｓｐＡおよびミコバクテリア分泌シグナルの融合タンパク質の発現を示した。

：　１３゜ＢＣＧ生体はｐＭＶ２６１　：　：０ｓｐＡで形質転換され、形質転換生体は培養された。５個のマウスがそれぞれの菌株を表わしている２４個の異なったマウス菌株が、腹腔内でｐＭＶ２６１　：　：０ｓｐＡ　（４２％のポスト凍結力価）によりＢＣＧ形質転換の１Ｘ１０’ｃＦＵの単一処方量で免疫化された。マウスは１６週間各４週間毎に放血された。ウェルの」二にコートされたライム病ボレリア菌全細胞およびＢ　ＣＧライゼートに関し、血清がエリザで分析された。

この反応はペルオキシダーゼ接合抗マウス免疫グロブリンおよび基質で展開した。カラー展開は４０５ｎｍでの吸収として読みとられた。正の血清は、上記予備放血血清の平均値以上の３標準偏差で光学濃度（０，Ｄ）の値を有していた。１７週間の後、マウスは、ｐＭＶ２６１　：　：　０ｓｐＡで形質転換されたＢＣＧｌｘｌＯ”ＣＦＵの腹腔内ブースター注射が行われた。

図５６および５７で示されるように、下記の菌株：ＡＫＲ／ＪＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　Ｂ　ｙ　ＪＢ　１０．　ＢＲ／５ｇＳｎ、ＪＤ４　５ｗ１ｓｓ　Ｗｅｈｓｔｅｒは一次免疫の後で免疫反応を示しました下記の菌種Ｂ　１０　、　Ｂ　Ｒ／　Ｓ　ｇ　Ｓ　ｎ　ＪＤ４　５ｗ１ｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒはライム病ボレリア菌に対し、著しく高い水準で反応した。

′３３置１４゜ｐＭＶ２６１　：　：０ｓｐＡ、ｐＡＢ２６１　：　：０ｓｐＡ。

ｐ１９Ｐｓ：　：Ｏｓ［）ＡあるいはｐＭＶ２５１　二：０ｓｐＡ。

プラス弁組換えｒ３　ＣＧパスツール生体のいずれかでバ５質転換したＢＣＧ生体は、０１１記記載のベクターにある０ｓｐＡ遺伝子の発現が組換え０ｓｐＡタンパク質の輸出および脂質アシル化に帰着したかどうかを決定するために、細胞分画およびトリトンＸ−１１４洗浄剤相分配分析を受けた（ボーティア他ｒ、Ｊ、　Ｂ１１ｏ、　Ｃｈｃｍ、ｊ　２５６巻、１６０４頁（＋９８１）。

ラドルフ他　「感染および免疫」５６巻、４９ｏ頁（＋　９８８））。

組換えＢＣＧ細胞はＢ　ＣＧ　ｒ？＝養から沈殿し、食塩加すン酸緩南液ＣＰＢＳで懸濁され、細胞懸濁液は等密度に調節された。

細胞は音波処理で破砕され、膜はトリトンＸ−１１４の２％（容積／容積）での追加で４℃で可消化された。不溶材質（細胞壁富化分画）は遠心分離され、−１二澄みは洗浄剤用分配を受けた。トリトンＸ−１１４溶液を短く加熱（３７℃）した後、短い遠心分離により水および洗浄剤の位相の分離が行われた。この２ｆ４の位相は３回バック抽出され、代表的な材料にあるタンパク質はアセトンの追加で沈殿した。各培養上澄みの一部は、■前濾過により濃縮された。５倍濃縮培養等量を表わす試料は５ＤＳ−ＰＡＧＥで処理され、ニトロセルロースに転移され抗０ｓｐＡ　ＭＡｔ）　１１５３３２でプロットされた（図５８）。

弁組換え［３ＣＧから（！）られるｉｎ似の分画は、未変性融合パートナ−（タンパク質）の細胞イー７置を決定するために、Ｂ　ＣＧあるいはヒト結核菌＋− １ｓ　ｐ　６０タンパク質（ＴＴ１３）、　α抗原（ＨＹＴ２７）、あるいはヒト結株菌１９キロダルトン抗原（ＨＹＴ６）に特異的な適切なモノクローナル抗体でブロンＩ・された。図５８で示されるように、レーンＷは全細胞音波処理分画である。レーンＩはトリトンＸ−１１４不溶解細胞壁富化分画である。レーンＡは細胞ゾル富化水性分画である。レーンｒ）は洗浄開用（膜富化）分画であり、またレーンＭは５倍濃縮培養培地分画である。

図５８で示されるように、ｐＭＶ２６１　：　：０８ｐＡによりコード化された０ｓｐＡ遺伝子製品は水性細胞ゾル分画（レーンＡ）で過剰に見出され、ｌｌ５Ｐ６０の専用細胞形質位置と相関していた。ｐＡＢ２６１　：　：０ｓｐＡおよび未変性α抗原により発現されるα抗原０ｓｐＡ遺伝子製品は、不溶解細胞壁富化分画（レーンＩ）、水性細胞ゾル分画（レーンＡ）、および培養培地分画（レーンＭ）に見出されたが、洗浄剤可溶リポタンパク質富可分画（レーンＩ））には仔在しなかった。α抗原が組換えＢ　ＣＧ培養培地に存在することは、１１３　Ｐ　６０が培養培地に見出されなかったので組換えＢ　ＣＧ自己融解によるものではなかった。未変性Ｂ　ＣＧの抗原に比べて、ｐＡＢ２６１　：　：０ｓｐＡにより発現される融合タンパク質のかなり小さな分画が培地に分泌され、−万人部分のものは細胞壁富化不溶解分画で見出された。これはα抗原に対する融合が細胞壁に対し直接の外部抗原になり得ることを示した。０ｓｐＡシグナルベブヂドに対するヒ１−結核菌１９キロダルトン抗原シグナルペプチドの置換は、殆どオペで洗浄剤可溶分画に位置するキメラＯｓ　ｐ　Ａタンパク質の発現を生じた。この発見は、ヒト結核菌１９キロダル［−ン抗原シダジルベブヂドのＯＳ　Ｉ）　Ａへの融合が直接の効果的な発現であり、０ｓｐＡタンパク質のＢＣＧの膿への輸出シこなることを示した。この結果は、ｐＭＶ２５１　：　：ＱｓｐＡで形質転換される生体により発現される製品と対照的である。ここでは大部分の０ｓｐＡが水性分画で見出され、これが未変性ボレリア菌シグナルペプチドの処理にこれまで効果実施例１４の組換えＢＣＧ生体は、組換え０ｓｐＡ遺伝子製品が抗０ｓｐＡ抗体に対する組換えＢＣＧの表面に接近できるかどうかを決めるために、流動計算法（ｆｌｏｗ　ｃｙＬｏａ＋ｅｔｒｙ　ｏｒｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙｌ　で分析された。

アルブミン・デキストラーゼ錯体および０．０５％トウイーン８０で補足されたデュボス液体培地で成長した約２Ｘ１０’組換えＢＣＧ生体で遠心分離で収穫された。ペレット化化された組換えＢＣＧ生体は、０．０５％トウイーン８０　（ＰＢＳ−Ｔ２Ｏ）を含イイする食塩加リン酸緩衝液（ｐｌ−１７，４）の１０ｍ１で洗浄され、２％のバラフォルムアルデヒドで１０分間固定された。固定組換えＢＣＧ生体はペレット化され、５ｍｌのＰＢＳ−７８０で２回洗浄され、次いで１ｍｌのＰ　［３Ｓ　−１’　８０内でＭ懸濁された。０ｓｐＡ　（ＢＣＧ吸着）に特異的な多クローン性ラビット血清が最終希釈が１：２００になるように固定組換えＢＣＧ細胞に加えられ、室温で３０分間および氷上で３０分間保温された。この懸濁液は次いで遠心分離され、０．５ｍｌのＰＢＳ−Ｔ２Ｏで２回洗浄され、１ｍｌのＰＢＳ−７８０で再懸濁された。ヤギ抗うビットＦＩＴＣ接合二次抗体が最終希釈１．５０になるように加えられ、３０分間水上で保温された。組換えＢＣＧ二次抗体懸濁液は遠心分離でペレット化され１ｍｌのＩ）　Ｂ　Ｓ　−Ｔ８０で２回洗浄され、２ｍｌのＰＢＳ−７８０で再懸濁された。標識組換えＢＣＧは塊状細胞を分散させるために軽く音波処理され、希釈液はＦＡＣＳスキャン（ベクトン・ディキンソン社）で流動血球計算法で分析された。指定されたプラスミドを含有し、指定されたキメラ０ｓｐＡ遺伝子製品を発現する組換えＢＣＧは弁組換えＢＣＧと比較される（図５９）。

図５９で示されるように、プラスミドｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡ、ｐＭＶ２５１　：　：ＱｓｐＡ、およびｐΔＢ２６１　：　：０ｓｐＡから０ｓｐＡを発現する組換えＢＣＧ生体はすべて、プラスミドｐＭＶ２６１　：　：　０ｓｐＡから０ｓｐＡを発現する弁組換えＢＣＧあるいは組換えＢＣＧと比較した時に、表面蛍光の増加を示していた。ｐＭＶ２５１　：　：０ｓｐＡで形質転換される生体からの０ｓｐＡの発現により示される相対表面蛍光は、ｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡで形質転換される生体で観察されたものより少なかったし、また、実施例１４での分画分析と合致した。ｐＡＢ２６１　：　：０ｓｐＡから０ｓｐＡを発現する組換えＢＣＧもまた表面蛍光を提示し、かくしてトリトン不溶解分画（実施例１４）で見出されたα抗原０ｓｐＡ融合タンパク質は細胞壁に連合しており、不溶解包含体から誘導されたものではなかったことも確認した。従って、ヒト結核菌１９キロダルトン抗原シグナル配列に対する融合によって模連合リポタンパク質して、あるいはα抗原に対する融合によって分泌および細胞壁連合タンパク質として、ｒＪ　ＣＧの表面に０ｓｐＡを輸出することが可能となった。

ＬＪｉ例１６゜Ｃ３Ｈ／Ｈｅ、ＢΔＬＢ／Ｃ１およびスイス、ウェブスターマウスは、ｐＭＶ２６１　：　：０ｓｐＡ、ｐＭＶ２５１　：　：０ｓｐＡ、ｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡ、ｐＡＢ２６１　：　：０ｓｐＡ、で形質転換されたＢＣＧ、あるいは弁組換えＢＣＧパスツール０１０″コロニー形成ユニット（ＣＦ［Ｊ’ｓ）で免疫化された。マウスは同一が力量で１６週間ブースターを与えられた。図６０で示されるように、ｐＭＶ２５１　：　：０ｓｐＡあるいはｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡで形質転換されたＢＣＧで免疫化される３個のマウス菌株すべてが、全ボレリア生体あるいは精製０ｓｐＡに対するエリザで測定されたように、−次元免疫化の後４ないし８週間で強い０ｓｐＡ特異的特異反抗を示した。

とりわけめざましかったことは、低い反応体であるスイス。

ウェブスター菌株において、ｐＭＶ２５１・：０ｓｐＡ、あるいはｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡのいずれかで形質転換されたＢＣＧ主体の単一処方量により誘発される抗０ｓｐＡ反応であった。ｐＭＶ２６１・：０ｓｐＡあるいはｐＡＢ２６１　：　：０ｓｐＡで形質転換されたＢＣＧで免疫化されたマウスの同一菌株は、ブースターの後でさえも抗０ｓｐＡ反応を示さなかつた。ＢＡＬＢ／ＣおよびＣ３Ｈ／Ｈｅマウスで１：１０＠、およびスイス、ウェブスター・マウスにおいて１：１０’を上まわる最高の高０ｓｐＡ抗体力価は、ｐＭＶ２５１　：　：０ｓｐＡあるいはｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡで形質転換したＢＣＧでブースターをかけることにより誘発され、これらの反応はｐＭｖ２６１　：　：０ｓｐＡあるいはｐＡＢ２６１　：　：Ｑ３ｐＡで形質転換されたＢＣＧで誘発された反応よりも１００倍から１０００倍高かった。

１７゜実施例１６の免疫化されたＣ３Ｈ／ＨｅおよびＢＡＬＢ／Ｃマウスから得た免疫血清が、２個の独立した実験でライム病ボレリア菌の非病原体Ｂ３１ラボラトリー菌株の成長を阻害する能力を分析された（サジエン他、ｒＪ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　ＤｉｓｅａｓｅｓＪ　（１９９２出版））。免疫血清のそれぞれについての成長阻害力価は下記の表■で示される。

表Ｉ前記結果は、ｐＭＶ２５１　：　＋０ｓｐａあるいはｐ１９Ｐｓ：・０ｓｐＡで形質転換されたＢＣＧで免疫化されたマウスより得られた抗血清が、強い成長阻害力価を示し、一方ｐＭＶ２６１　：　：０ｓｐＡで形質転換されたＢＣＧで免疫化されたマウスより得られた血清が、低いあるいは検知不能の成長阻害力価であることを示した。

前記記載のＢＣＧ生体で免疫化したＣ　３１−１　／　ＨｅおよびＢＡＬＢ／Ｃマウスは、ついで１０６ライム病ボレリア菌株Ｓｈ２生体で腹腔内（ＩＰ）に、あるいは１０４生体で皮肉（ＩＩ））１２のいずれかで抗原投与された。ライム病ボレリア菌生体は、１０６形質転換Ｔ３ＣＧ生体のブースター免疫の後５週間投与された。マウスはライム病ボレリア菌抗原投与の１４日で犠牲となり、プラズマおよび膀胱組織はＢＳＫＩＩ培地で培養された（シコワンタ、ｒＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｊ　２０巻。

１５５頁（１，９８４））。培養は１４日間通じて位相差顕微鏡で、スピロヘータの存在をモニターされた。いずれか１個のプラズマあるいは組織培養の２０＠のハイパワー分野当り１個もしくはそれ以上のスピロヘータが存在する時には、感染として記録された。ＩＰおよびＩＤ抗原投与で正の感染を示す抗原投与マウスの分画は下記の表ＩＩで示される。

上記結果は、すべての対照マウスが感染し、一方、ｐＭ■２５１　：　：０ｓｐＡあるいはｐ１９Ｐｓ：　：０ｓｐＡで形質転換されたＢ　ＣＧで免疫化されたマウスは感染から保護されたことを示している。

しかし、この発明の範囲は前記記載の特異な実施例に限定されるものでないことは理解されねばならない。この発明は特に記載されたちの意外にも実施することができ、しかも添付の請求の範囲内にあることが可能である。

１４１日ａｍＨＩ・ＧＣｒＡＧＣＴＣｒＡＴＡｆＹχｍ’ｒｃ＋シ該人’ＩＴｒＣＴＡＴＧＱｘ論Ｏ ■Ｉπ−＝Ｆ℃６ＡＧＣ１に’Ａ１　′ＧｒＡＱＣＣｒ、Ｑ”、ＣＣＡ　Ｏ：バｘ；ＡＣ［７ｒＡＧＡｎＣＣＣＡＧＣＡｆｌλ”Ｃ＾ＣＧＣＣＴＡ　ＣＴＡＣＣＡＣＸ’ｐＡＧＧＧＡ＾ＴＧＡＡ丁ＣＡ　ＣｃｃＡＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧ、ｕＣＧＩＴａＡ　ＧＣＧＡＣバχコ℃Ｃ↑ｙ〕ｕユＡＯＴバムＴＣ人ＴＣ人ＧＴ人Ａｃｔズ工「＾］Ｘゴ℃＾ＣｉＡπで　、　πＸｆＴ＾ＴＣＣＡＣＴＣＡＡｃＣ′ ｒｃＣ；ＡＡ　Ａｃｉχλπテ＾ＧンＡＣＣＡＣＡＣｒｐＡＡＡＡＣＧＡＧＡω ＵχｎニαＡＴＣｆｃｃＡＣＣＡＣＡＡαスσＡ先αη＾ＺＣＣ１＆”２２−仔鞭Ｓ撰嬉）λ郊ル升ｉ蕨）Ｋ汁４必嶌愚°敲’Ｃ−１４−ＦＩＧ、５ｂ σにπχ詠１ワ肩ロ跣απαスα斌Ｑシαメき幻ｒ°彎＋＋００′″０◆９１０１１０−°中°９−０゛　°°◆００００°°００６◆°°０°０°°°。

αχ刀ＣａｔコムＣにｐαχ℃α−λ　Ｃαπバ℃αゴα詰ππ＾α℃α℃αて一１αγｎｎαｎ）了ｔけπりＮ弊ＩＩｎ部用」こ）９つ９　９１ヨｍ：Ｊ町石θ日ｆｌｒｌ　＋　７１１＾１ＦＩＧ　＋２α ＦＩＧ　＋２ｂ π℃ａηゴαＩ献πスｎ≧ＴＡＡコーＣｒＣＡＡ　ＧＡＯＡＡ　ＣＧＴＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡ！Ａα℃Ｃ罠ＣＡＴＡＧＴｒＡＣＣＧＧＡＴ＾Ａ疋ｘンフＧ（＾（χｘスアＴＣＣ（×ンコｒＧ人ＡｆｆＦＩＧ、＋２Ｅ３ｂ −会一−−−−−◆―・畢・・脅−−−◆−−＋＋＋曽−・◆・−一彎轡・−φ 拳・−−−−−−−−４３７ゎＡαπ＾αゴαＩπん虹工蹟↑＾ＣＩウー℃Ｏズぞ■■ｏχテ・巳ｃｌＪ５２３４１峠范　諌■よ ■　−−〜〜ＦＩｏ、２５ＦＩＧ、３１１：）ＦＩＣｌ、３１Ａα ＧＡ　Ｏズ刀℃０ンηて０ＡＡ　Ｇαｎ℃Ｃ■刀℃＾　Ｃσ■Ｘχ℃ＣＡＣαスＴ■℃ロ℃σ■込αメαハ０χメαカＱμα℃０：υ■℃晶σ■℃ＧＬｎｔ　Ａ　Ｆ　Ｌ　Ｖ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｑ　Ｇ　Ｎ　Ｒ！、Ｓ　Ｋ　Ｓ　ＡＬＩＩＩＡＭ）ＣＹＱＭＡ　５ＲＡ　ＲＤＥ　ＡＩＡ　Ｌα”Ｘ：ＡＡＣ，Ｃ：、ＡＣＡＣＴＹＪ、σＴＣＣＴＡＡＡＧＡαχＫ”　ｒ　ＧＴＡα℃ＧＡＡｒ’ｖｕｌｒ＋１ｃＧｃＡＣＣＡ（”、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＱ（／ｍＡ（”ＰＣ人ｒｃＱ”、ＣＣＡ　ＧＣＴＧ人Ｏスコ℃ＧＲχ１℃６ＣαＸτ℃ＣＧ肩℃Ｃ■工「ＡＡＯズχ：ＡＡαχＸｎσｘＳＡ（７ｒＴ”−ＡＡＴＡＣＡ（＃χｎＦＩＧ、３１Ａｂ α７ＴｒＣＡＣＣＡＡＧＴＣαゴｅμ　ＧＡ　σｒｌｒＳ＾１丁ＮｄｒＪ５１４ｓ３Ｘｍｎ　ｒ４６５８　４０４　Ｄｒｃ　ｌｌｌｆｆ１ｓｌ”ｎｌ　３４１ＯＮｐ ”ｖ工３０８８５ｓ＋Ｘτ３２５９はヒ部”ＬＳＤＮＡＸ　ｈ１ｈエフロ０８　４０４Ｃ）ｒｃｓ−丁５ｐＩＴ　４６００　３８’＋９Ｂｃ＞ｒ−ｎＨＩ巳５ｕ３６エ４３２４　ｌｌ芙影齢　＝Ｌ’）ＤＮＡ４０４　Ｄｒ”ｗ　ｍＰ５ｔＹ５７４９　ＡＵｒＴｌ　４ｇ＋９Ｓｏ−１１５３１０ＦＩＧ３９ＦＩＧ、４Ｂ仁ｃｏＲ１？−１ｉｍＤＩＩｌｒＦＩＧ、４５ＦＩＧ、４６、Ｂｅ１ｌ　４４７６ＦＩｏ、５３ｐＭＶ２６１　：’、０５ｐＡ　ｂｗ　−ｗ　ｐＭＶ２５１：：ｏｓ、ｏＡ”ｐ１９ｐｓ：：ｏＳｐＡΔ ｐ３８ｐｓ：：０ｓｐＡΔ ３８Ｋ　Ｐｒｏｍ、＋　ＲＢＳＬ山ｕ　にＯｔｙ　’Ｏ’０（０’　５ｏ１）　＋財１ｊ膏・淋フロントページの続き／／ＣＣ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：３２）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．タンパク質あるいはポリペプチドもしくはペプチドを最近に発現する一つの発現ベクターであって、少なくともリボタンパク質の分泌シグナルをコード化する第１ＤＮＡ配列、および細菌に異種のタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドをコード化する第２ＤＮＡ配列よりなる発現ベクターであり、ここでこの細菌はタンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドを発現し、前記細菌は、タンパク質あるいはポリペプチドもしくはペプチドを発現する細菌に異種のリボタンパク質あるいはリボタンパク質分節および前記タンパク質あるいはその断片、もしくはポリペプチドあるいはペプチドの融合タンパク質を発現する。
２．細菌がミコバクテリアである請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
３．前記第１ＤＮＡ配列が少なくともミコバクテリアリボタンパク質の分泌シグナルをコード化する請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
４．前記ミコバクテリアリボタンパク質がヒト結核菌リボタンパク質である請求の範囲第３項記載の発現ベクター。
５．前記ヒト結核菌リボタンパク質が１９キロダルトンおよび３８キロダルトン抗原よりなるグループから選択される請求の範囲第４項記載の発現ベクター。
６．前記ベクターが更にミコバクテリア複製起点を含も請求の範囲第２項記載の発現ベクター。
７．前記ベクターが更にミコバクテリア染色体へのミコバクテリオファージ組込みをコード化するＤＮＡ配列を含む請求の範囲第２項記載の発現ベクター。
８．請求の範囲第１項記載のベクターであって、ここでタンパク質あるいはその断片もしくはポリペプチドを発現する細菌に異種の前記タンパク質あるいはその断片もしくはポリペプチドあるいはペプチドが肺炎連鎖球菌のＰｓｐＡ抗原あるいはその断片もしくは誘導体であるベクター。
９．請求の範囲第２項のベクターで形質転換される一つのミコバクテリア。
１０．．ミコバクテリアがＢＣＧである請求の範囲第９項記載の形質転換ミコバクテリア。
１１．一つの医薬品組成物であって請求の範囲第９項記載のミコバクテリア、および許容できる医薬品キャリアよりなる組成物。
１２．前記ベクターがプラスミドである請求の範囲第１項記載の発現ベクター。
１３．ベクターがシャトルプラスミドであり、更に細菌複製起点を含む請求の範囲第１２項記載のベクター。
１４．ライム病から動物を防護する一つの方法であって、ライム病ポレリア菌に対する抗体を誘発するタンパク質あるいはポリペプチドをコード化する少なくとも１個のＤＮＡ配列を含むＤＮＡで形質転換されたミコバクテリアを動物に投与し、前記ミコバクテリアは、動物をライム病から防護するのに有効な量で投与されることよりなる一つの方法。
１５．前記少なくとも１護のＤＮＡ配列がライム病ポレリア菌あるいはその断片もしくは誘導体の表面タンパク質をコード化する請求の範囲第１４項記載の方法。
１６．前記ライム病ポレリア菌の表面タンパク質が外部表面タンパク質Ａおよび外部表面タンパク質Ｂよりなるグループから選択される請求の範囲第１５項記載の方法。
１７．前記ミコバクテリアがウシ型結核菌−ＢＣＧ種である請求の範囲第１４項記載の方法。
１８．動物をライム病から防護する一つの組成物であって、タンパク質あるいはポリペプチドをコード化する少なくとも一つのＤＮＡ配列を含み、ライム病ポレリア菌に対し抗体を誘発するＤＮＡ配列を含むＤＮＡで形質転換されたミコバクテリア、および前記ミコバクテリアが動物をライム病から防護するための有効な量で存在する許容可能な医薬品キャリアよりなる一つの組成物。
１９．請求の範囲第１８項記載の組成物であって、前記少なくとも１個のＤＮＡ配列がライム病ポレリア菌の表面タンパク質あるいはその断片もしくは誘導体をコード化する組成物。
２０．請求の範囲第１９項記載の組成物であって、前記ライム病ポレリア菌の表面タンパク質で外部表面タンパク質Ａおよび外部表面タンパク質Ｂからなるグループより選択される組成物。
２１．前記ミコバクテリアがウシ型結核菌−ＢＣＧ種のものである請求の範囲第１８項記載の組成物。
２２．少なくともリボタンパク質の分泌シグナルをコード化するＤＮＡ配列を含む細菌にタンパク質あるいはポリペプチドを発現する一つの発現ベクター。