JPH04506297A

JPH04506297A - ベクター媒介ゲノム挿入及びｂｃｇにおけるｄｎａの発現

Info

Publication number: JPH04506297A
Application number: JP2509244A
Authority: JP
Inventors: ヤング，リチヤード・エイ; アルドビーニ，アナ
Original assignee: ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ
Priority date: 1989-06-19
Filing date: 1990-06-18
Publication date: 1992-11-05
Also published as: EP0478664B1; WO1990015873A1; DE69034100T2; AU5848090A; DE69034100D1; EP0478664A1; CA2063414A1; ATE250133T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ベクター媒介ゲノム挿入及びＢＣＧにおけるＤＮＡの発現ミコバクテリアは、人間及び動物の主な病原菌である。例えば結核は一般に、人間においてミコバクテリウム　ラベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ、）　ｔｕｂｅｒｃｕｔｏｓｉｓ）により、及び牛においてミコバクテリウム　ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ、）　ｂｏｖｉｓ）（これは人間及び他の動物にうつり、結核を起こす）により起こる。結核は広範囲に残存しており、特に後進国において重要な公衆衛生の問題である。世界中に約−子方の結核の症例があり、年間の死亡数が三百万であると見積もられている。Ｊｏｉｎｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ！　Ｕｎｉｏｎ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　５ｔｕｄｙ　Ｇｒｏｕｐ、Ｔｕｂｅｒｃｌｅ、６３：１５７−１６９　（１９８２）。

Ｍ、レプラエ（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）により起こる癩病は、主に後進国で一子方の人々を苦しめている。Ｂｌｏｏｍ、Ｂ、Ｒ，及びＴ、Ｇｏｄａｌ、Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ。

５　：　６５７−６７９　（１９８４）、Ｍ、ラベルクロシス（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及びアビウムーイントラセルラースクロフラセウムのミコバクテリア（ＭＡｆＳ）、の群は、後天性免疫不全（ＡＩＤＳ）の患者の主な日和見病原菌となっている。Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　ｄｉａｌｉｔｙ　Ｗｅｅｋｌｙ　Ｒｅｐｏｒｔ、３４ニア７４（１９８６）。

Ｍ、シュードラベルクロシス（Ｍ、ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は、牛の主な病原菌である。

他方、Ｍ、ボビス（Ｍ２圭夕ｖｉＳ）の無発病力株であるＢａｃｉｌＩｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　（ＢＣＧ）は、世界で最も広く用いられた人間のワクチンであり、５０年以上の間、生ワクチンとして使用されてきた。それは過去３５年間に２４５０億の人々に投与され有害反応は非常に希であった（例えば６０／十億の死亡率の算定される）。

多（の研究において、ＢＣＧは結核に対する予防効果を持つということが見いだされてきた。しかし、例えば南インドにおける試みなどのいくつかの試みにおいて、肺結核の予防において有効でないことが見いだされた。Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　Ｔｒｉａｌ。

ミコバクテリアを生ワクチンのビヒクルとして使用することが提案されてきた。

多種の病原菌からの抗原をコードする遺伝子を組み替えミコバクテリア中で発現させることができ、ミコバクテリアのアジュバント性が外部からの抗原に対する免疫応答を刺激し、それが今度はこれらの病原菌に対する保護免疫を与える。ミコバクテリアはワクチンのビヒクルとしていくつかの利点を与え、それには人間において使用層が長く、その間合併症が非常に低く、屋外で安定であり、−回の投薬による使用が可能であったことが含まれる。このワクチンをビヒクル候補として発展させるためには、ミコバクテリア　ゲノムを扱えることが重要である。

理想的な分子遺伝系には、形質転換法、インビトロで扱えるベクター、選ぶことができる栄養物及び薬剤マーカー、ならびに外因性配列を用いて特定のゲノムＤＮＡ配列を置換することができる能力が含まれる。問題のタンパク質をコードする外因性ＤＮＡを、特定のゲノムＤＮＡ配列の代わりにミコバクテリアゲノム中に挿入し、コードするタンパク質を発現することができる組み換えミコバクテリウムを形成する方法は、非常に有用であろう。

発明の要約本発明は、調節されたプロモーター領域の制御下で問題のＤＮＡを発現する、培養可能な遺伝的組み換え（遺伝子工学による）ミコバクテリア；問題のＤＮＡ及び調節されたプロモーター領域をミコバクテリアゲノムに挿入するのに有用な組み込みベクター；問題のＤＮＡ及び調節されたプロモーター領域をミコバクテリアゲノムに安定して組み込む、ベクター媒介法：及び発現、あるいはＤＮＡを発現することができるそのような組み換えミコバクテリアであるワクチンビヒクルに関する。

発現カセットには、問題のＤＮＡ及び調節されたプロモーター領域が含まれ、二成分は互いに、組み換えミコバクテリア中における問題のＤＮＡの発現が調節されたプロモーター領域により制御される程度に近接している。一般に調節されたプロモーター領域はミコバクテリアのプロモーター領域であるが、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の１ａｃＺプロモーターなどの調節されたバクテリアプロモーターであることもできる。例えば、熱シヨツクタンパク質のプロモーター領域、又はストレスタンパク質のプロモーター領域（例えばｈｓｐ７０．ｈｓｐ６０）を、問題のＤＮＡに近接させて組み換えプラスミドベクター中に挿入し、遺伝子の翻訳をミコバクテリアプロモーター領域及びリポソーム結合部位により制御することができる。問題のＤＮＡは、それを処理するべきミコバクテリア以外の供給源からのものであり、問題のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の全体、又は一部である。問題のタンパク質又はポリペプチドは、例えばそれに対する免疫応答が望まれているタンパク質又はポリペプチド（問題の抗原）、診断的意味における酵素、リンフ才力イン、免疫強化剤、及び問題のリポータ−分子であることができる。

本発明の組み換えミコバクテリア製造法において、ζコバクチリアゲノム中のＤＮＡ配列と相同であるプラスミド−支持ＤＮＡ、、配列と相同ミコバクテリア配列の間に２ｆｉ相同組み換えが起こる。組み換えの結果、対応する非改質ミコバクテリアと非常に類似の組み換えミコバクテリアが製造される。組み換えミコバクテリアは、非改質ミコバクテリアに存在しない発現カセット（すなわち問題のＤＮＡ及び調節されたプロモーター領域）を含む。他の方法で製造した組み換えミコバクテリアと異なり、本発明のベクター−媒介法により製造した組み換えミコバクテリアは、問題のＤＮＡのもの以外はミコバクテリアに通常存在しないベクターＤＮＡ配列又は他の配列を含まない。

得られた組み換えミコバクテリア（例えば組み換えＢＣＧ、組み換えＭ、スメグマチス（Ｌと思ｅｇｍａ目５−））は、問題のＤＮＡを発現できるビヒクルとして特に有用である。そのようなビヒクルは、ポリペプチド又はタンパク質（あるいは１種類以上のポリペプチド又はタンパク質）、例えば問題の１種類又はそれ以上の病原菌に関する抗原などを発現する調節可能なワクチンビヒクルとして使用することができる。

組み換えミコバクテリアは又、免疫強化剤、酵素、薬剤及び抗腫瘍剤の発現のためのビヒクル：不妊ワクチンビヒクル製造において有用なポリペプチド又はタンパク質の発現のためのビヒクル；又は免疫応答を喚起するために、又は自己免疫疾患（例えば慢性関節リウマチ）における耐性を誘起するために投与することができるストレスタンパク質の発現のためのビヒクルとして使用することができる。組み換えミコバクテリアは、例えば成長阻害剤、又は腫瘍細胞の殺細胞剤（例えばインターフェロンα、β又はγ：インターロイキン１−７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α又はβ）であるタンパク質又はポリペプチドを発現することができ、ある種のヒトの癌（例えば膀胱癌、黒色Ｈ）の治療の新しい戦略の基礎となる。

問題の病原菌には、どのようなウィルス、微生物又は病気を起こす他の生物又は物質（例えば毒素又はトキソイド）も含まれる。本発明は、宿主に組み換えミコバクテリアを用いて予防接種し、宿主の保護免疫を引き出す方法にも関する。組み換えワクチンは、体液性抗体免疫、細胞免疫（ヘルパー及び細胞毒性免疫を含む）、及び／又は粘液あるいは分泌液免疫の形成に使用することができる。さらに本発明は培養可能な組み換えミコバクテリアにより発現した抗原、ワクチン又は診断剤としての使用に関する。

本発明のワクチンは現在入手できるワクチンより重要な利点を有する。

特にここに記載した組み換えミコバクテリアは、外因性又は追加のタンパク質なしでタンパク質生成物として問題のＤＮＡを発現する。これは、問題の遺伝子を組み換え型（融合タンパク質）で発現する、現在入手できるワクチンビヒクルと異なる。さらにミコバクテリアは現在知られている最高のアジュバント性を有し、従って他の抗原に対して非常に有効に応答するよう被接種者の免疫系を刺激する。これは、細胞媒介免疫を引き起こし、従って抵抗性に細胞媒介免疫が重要である場合に病原菌に対する免疫を与えるために特に有用であるので、非常に価値の高いワクチンの特徴である。第２にミコバクテリアは、エングラム又は免疫痕跡を刺激する。その結果、タンパク質抗原に対する感作痕跡を形成するために一回の接種を使用することができる。本発明のワクチンビヒクルを用いて、感染剤又は毒素を中和する二次抗体応答を刺激する長期継続Ｔセル記憶を備えることができる。これは、例えば破傷風及びジフテリア毒素、百日咳、マラリア、インフルエンザ、庖疹ウィルス及びヘビ毒に対して有用である。

ＢＣＧはワクチンビヒクルとして特に：１）現在誕生時に与えられる唯一の子供のワクチンである：２）結核に対するワクチンとして与えた場合、過去４０年間に有害反応の発生率が非常に低い：及び３）患者に繰り返し使用することができる（例えば多様な形態で）などの点で重要な利点を有する。

一般的なミコバクテリアと同様に、特にＢＣＧのさらに別の利点は、そのゲノムのサイズが大きいことである（長さが約３ｘ、１０’ｂｐ）。

ゲノムが大きいので、他の供給源から大量のＤＮＡを供給することができ、従ってマルチ−ワクチンビヒクル（すなわち１種類以上の病原菌に関する保護抗原をコードする問題のＤＮＡを担うワクチンビヒクル）の製造に使用することができる。

図の簡単な説明図１は標謙ターゲットミコバクテリア株の構築を示す略図である。

図２は標識ターゲットＢＣＧへの、問題のＤＮＡの挿入を示す略図である。

図３はミコバクテリアＰｙｒＦ遺伝子、及びフランキングＤＮＡ配列を含むベクターｐＹ６０１４の略図である。

図４は、ｐＹ６０１４のＰｙｒＦ部位で挿入したａｐｈ遺伝子（カナマイシン耐性をコードする）を含むベクターｐＹ６０１５の略図である。

図５は、ミツバクテリア遺伝子ＰｙｒＦ及びフランキングｐＹ６０１４のＤＮＡ配列を含み、数個の制限部位を除去したベクターｐＹ６０１６の略図である。

図６はｐＹ６０１６中のＰｙｒＦの一７０ｂｐ下流に挿入したｈｓｐ７０遺伝子を含むベクターｐＹ６０１７の略図である。

図７は、ｈｓｐ７０プロモーター及びｐＹ６０１７のｈｓｐ７（Ｅ−ド部位に挿入したＨＩＶｉｇａｇ、遺伝子を含むベクターｐＹ６０１８の略図である。

図８は、ｈｓｐ７０プロモーター及びｐＹ６０１７のｈｓｐ７Ｑ：ｒ−ド部位に挿入したＨＩＶ１ｐ旦工遺伝子を含むベクターｐＹ６０１９の略図である。

図９は、ｈｓｐ７０プロモーター及びｐＹ６０１７のｈｓｐ７０：＋−ド部位に挿入したＨＩＶ１ｅｎｖ遺伝子を含むベクターｐＹ６０２０の略図である。

図１０は、ｈｓｐ７Ｑプロモーター及びｐＹ６０１７のｈｓｐ７０コード部位に挿入した５ＩＶ１呈見（遺伝子を含むベクターｐＹ６０２１の略図である。

図１１は、ｈｓｐ７０プロモーター及びｐＹ６０１７のｈｓｐ７ｏ：ｙ−ド部位に挿入した５ＩＶ１且旦±遺伝子を含むベクターｐｙｅ　０２２の略図である。

図１２は、ｈｓｐ７０プロモーター及びｐＹ６０１７のｈｓｐ７Ｑ：＋−ド部位に挿入した５ＩＶｌｅｎｖ遺伝子を含むベクターｐＹ６０２３の略図である。

るために世界中で広く使用されている。

Ｍ、ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧは、細胞媒介免疫の誘発のための優れたアジュバント活性を有し、記憶（免疫）痕跡を刺激し、その使用に伴う死亡率が非常に低いので、タンパク賀抗原、酵素、リンフ才力イン及び免疫強化剤などの問題のタンパク質の発現のための組み換えビヒクルとして優れた候補である。

ここで本発明の方法を用いて、調節されたプロモーター領域の制御下で問題のＤＮＡを発現させる組み換えミコバクテリアを生成することができる。特に、熱シヨツクタンパク質（ｈｓｐ）７０又はｈｓｐ６０プロモーター領域などの調節されたプロモーター領域と組み合わせて、問題のＤＮＡを導入することができる。

得られる組み換えＢＣＧは、非改質ＢＣＧと非常に類似した性質を持つ。組み換えミコバクテリアは、非改質ＢＣＧに存在しない、問題のＤＮＡ及び調節されたプロモーター領域を含む。コードされたタンパク質又はポリペプチドを製造するための問題のＤＮＡの発現は、調節されたプロモーター領域の制御下にある。

組み換えミコバクテリアでは、問題のＤＮＡの発現が調節されたプロモーターの制御下にあり、従って制御可能な発現のビヒクルとして有用である。

特表千４−５０６２９７　（４）以下は、標識ミコバクテリアターゲット株の構築；標識ミコバクテリアターゲット株への問題のＤＮＡの導入に有用な組み込みベクターの構築；ゲノムＤＮＡに安定して組み込まれた問題のＤＮＡを持つ組み換えミコバクテリアの生成：及び得られた組み換えミコバクテリアの利用の説明である。以下は、ＢＣＧを用いて記載されているが、記載されてい図１は、標準的遺伝子工学法を用いてさらに操作するためのターゲットである標識ミコバクテリア（ＢＣＧ）ターゲット株の構築を示す略図カーをコードする遺伝子と置換されているミコバクテリアＤＮＡを含む組み換えプラスミドを使用した。ミコバクテリアゲノム中の配列と相同であるプラスミド−支持配列間で二重相同組み換え（図１において２個のＸにより示す）が起こる。二重相同組み換えが起こるために、ミコバクテリアゲノム中の配列と相同であるプラスミド−支持配列を選定可能なマーカーをコードする遺伝子の両側に置く。結果としてミコバクテリアゲノム中で、選定できるマーカーをコードする遺伝子（図１で示すａｐｈ）によるＰｙｒＦ遺伝子の置換が起こる。形質転換細胞（すなわちＰｙｒＦ遺伝子が選定可能なマーカーコード遺伝子により置換されているミコバクテリア）は、非改質ミコバクテリアに見られる表現型とは異なる表現型を示す。形質転換細胞はこれらの特性のいずれかに基づいて選ばれる。

得られた標識ミコバクテリアターゲット株は、周知の方法によりさらに操作するためのターゲットとして使用し、それにより問題のＤＮＡをミコバクテリアゲノムＤＮＡに組み込む。この目的のために、図２に示す組み込みベクターを使用する。組み込みベクターは、ターゲットミコバクテリアゲノム中のＤＮＡ配列と相同のＤＮＡ配列、ミコバクテリア起源の選定できるマーカーをコードするＤＮＡ、問題のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ　（問題のＤＮＡ）　、及び調節されたミコバクテリアプロモーター領域をコードするＤＮＡを含む。

組み込みベクター中に存在する残りの配列は、適当なプラスミドベクター（ｐＵＣ１９など）の配列である。本発明の組み込みベクターの構築を以下で詳細に説明する。組み込みベクターを標準的方法（例えばエレクトロポレーション）を用いて標識ミコバクテリアターゲット株に導入する。ターゲットミコバクテリアゲノム中の配列と相同であり、ミコバクテリア起源の選定できるマーカーをコードするＤＮＡの側面にならぶプラスミド−支持ミコバクテリア配列間で（片側で）、及び問題のＤＮＡとならぶプラスミド−支持ミコバクテリア配列間で（他側で）２重相同組み換え（図２で２個のＸにより示す）が起こる。結果として標識ターゲット株中で、選定できるマーカーをコードし、ミコバクテリア配列と相同なりＮＡとならぶ遺伝子（図２中ａｐｈ）が、ミコバクテリア起源の選定できるマーカーをコードするＤＮＡ、問題のＤＮＡ、及び調節されたミコバクテリアプロモーター領域をコードするＤＮＡに置換される。これを図２に略図として示す。

わかる通り、二重相同組み換えにより２種類の表現型特性を有する組み換えミコバクテリアが生じ、これは問題のＤＮＡと調節されたブロモ−クー領域を含む細胞の同定及び選定に有用である。

問題のＤＮＡはいずれの起源であることもでき、問題のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子全体であることも、その一部であることもできる。ここで使用する問題のポリペプチドという言葉は、発現するべきタンパク質の全体又は一部を含む。そのような問題のＤＮＡは遺伝的組み換えミコバクテリアにおいて発現させる。問題のＤＮＡは、標識ミコバクテリアターゲット株中に発現カセットの成分として導入し、そのカセットは調節されたプロモーター領域も含む。

例えば図２に示す通り組み換えＢＣＧは、問題のＤＮＡ及び調節されたプロモーター領域が存在するという点でのみ非改質ＢＣ６と異なる。ミコバクテリアゲノムＤＮＡは変更され（ａｐｈ遺伝子とフランキング配列を用いた、Ｐ７ｒＦ遺伝子のフランキング遺伝子の置換により）、その後ＰｙｒＦ遺伝子とフランキング遺伝子の同等物が発現カセットと共に組み込まれるように“再構築”される。“ 真の”変更はミコバクテリアゲノム中への問題のＤＮＡ及び調節されたプロモーター領域の挿入である。

発現カセットに存在する調節されたプロモーター領域は、ミコバクテリア中で機能するどのような調節されたプロモーター領域であることもできる。調節されたプロモーター領域には、転写プロモーター及び転写開始部位を含み、リポソーム結合部位も含む。一般にプロモーター領域はミコバクテリア起源である。しかし大腸菌（Ｅ、ｃｏｔ　１）１ａｃＺプロモーターなどの調節されたバクテリアプロモーターも使用することができる。本発明の具体化においては、調節されたプロモーター領域は、ミコバクテリア起源による熱シヨツクプロモーター領域（ｈｓｐＬ例えばＢＣＧ　ｈｓｐ７０又はｈｓｐ６０である。このような調節されたプロモーター領域を使用することにより、特にワクチンビヒクルである発現ビヒクルにおいて組み換えミコバクテリアに重要な利点が与えられる。高熱又は細菌感染などで患者が圧迫を受けている場合は、ｈｓｐプロモータ・−が現れてタンパク質生成が強化される。本発明においては、問題のＤＮＡの発現が調節されたプロモーター領域の制御下にあり、それが現れて正常より高い量の問題のＤＮＡを発現させるので特に有効である。

現在まで、それに対する免疫応答が望まれているポリペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡが、ゲノムＤＮＡ中の選ばれた部位に選ばれた方向で安定して組み込まれている組み換えミコバクテリア発現ビヒクルを製造することはできなかった。さらに本発明の方法により、ミコバクテリアゲノム中に安定して組み込まれた問題のＤＮＡの発現は、調節されたミコバクテリアプロモーター領域により制御されている。例えばミコバクテリアプロモータ・−及びリポソーム結合部位、例えば熱シボツクタンパク質プロモーター領域（例えばｈｓｐ７０．ｈｓｐ６０）は、問題のＤＮＡの発現を制御する、調節できる発現信号となる。図６に示す通り発現カセットは、二重相同組み換えに必要なミコバクテリア配列（ＰｙｒＦ遺伝子）の回りの配列中にポリリンカーを含むことができる。

その結果、問題のＤＮＡをミコバクテリアゲノム中に挿入することができ、ミコバクテリア発現信号が問題のタンパク質又はポリペプチドの生成量を制御する。

ＰｙｒＦ−発現カセット−問題のＤＮＡの組み合わせが安定して組み込まれるミコバクテリア細胞の選定は、前記の通りに行うことができる。

ここで、本発明の方法及び組み込みベクターを用いて問題のＤＮＡを、培養できるミコバクテリア中に組み込み、問題のＤＮＡの発現を調節することが可能である。それに対する免疫応答がめられているポリペプチド又はタンパク質をコードする、組み込みベクター中に存在するＤＮＡは、自然に存在するＤＮＡの単離により（例えば病原体又は毒素製造生物から）；周知の遺伝子工学法を用いた問題のＤＮＡ配列のクローニング及び増幅により（例えばＭａｎ　ｉａ　ｔ　ｉ　ｓ、　Ｔ、等、Ｍｏ１ｅｃｕＪａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａＪ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、（１９８２）参照）：又は機械的あるいは化学的合成により（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）　）得ることができる。

上記の及び以下の節に示すベクターは、１種類かそれ以上の問題の病原菌に関する１種類かそれ以上の抗原をコードする問題のＤＮＡを持っミコバクテリアを遺伝子工学により生成するのに使用することができる。

又、人間の精ｍ刺激ホルモン（ＨＧＨ）フラグメントなどの適したタンパク質をコードするＤＮＡをミコバクテリアに組み込むことにより、不妊“ワクチン”の製造に使用することができる。

その結果、例えば癩病、結核、マラリア、ジフテリア、破傷風、リーシュマニア、サルモネラ、シストミアシス、麻疹、流行性耳下腺炎、庖疹及びインフルエンザに対して患者を免疫するのに使用することができる組み換えミコバクテリアワクチンを製造することができる。１種類かそれ以上の病気の原因となる病原菌のための１種類かそれ以上の保護抗原をコードする遺伝子をミコバクテリアゲノム中に組み込むことができる。Ｔ−セル記憶又はエフェクター機能を必要とする病原菌の抗原をコードする遺伝子を組み込む能力は特に価値がある。宿主に得られた組み換えミコバクテリアワクチンを投与することにより、宿主の免疫系が刺激され、保護免疫応答が形成される。

図２に示す本発明の方法の重要な利点は、問題のＤＮＡの組み込みが、ゲノム中へのプラスミドＤＮＡの汚染組み込みなしに起こることである。

すなわち真の効果は、問題のＤＮＡを除いてミコバクテリアに通常存在しない配列（すなわちプラスミド配列）は組み換えミコバクテリア細胞に存在しないことである。

本発明の組み込みベクター及び方法の利用の概観及び利点本発明の組み込みベクターの利用法及び利点は数多い。発現又はワクチンビヒクルの構築における組み込みベクターの利用など、そのいくつかを下記に記載する。本発明の結果として、問題のＤＮＡはミコバクテリアゲノム中に組み込まれ、ＤＮＡの発現はミコバクテリアプロモーターを用いて制御される。ここで、病気の病原性の問題を理解する新規遺伝的方法が得られる。毒性及び病原性に必要な特定の遺伝的機能を同定する目的で、組み込みベクターを用いて相同組み換えにより病原性ミコバクテリアの遺伝子に挿入的に突然変異を起こし、標識することができる。例えばこのベクター及びミコバクテリア（例えばＹ工Σ７ｔ　ｉ　ｓ、　Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５−ＢＣＧ）を用いてＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ１互又はＭ、１ａｐｒａｅの毒性遺伝子を同定し、診断（診断試験）を発展させることができる。これらの遺伝子を特異的に欠失させる又は置換することにより、現在のＭ、ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧワクチンより結核に対してより特異的で有効な希釈ワクチンを開発することができる。別の場合、耐性のある患者からのＴセルにより認識される抗原を研究することにより結核及び癩病に特異的な保護抗原が同定されるので、現在存在するＭ、ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧワクチン中にそれを導入して発現することが可能である。

組み換えミコバクテリアの利用の概観及び利点本発明の方法は、ミコバクテリアに挿入された問題のＤＮＡによりコードされるタンパク質又はポリペプチドの発現のための、遺伝的組み換えミコバクテリアビヒクルの構築に有用である。そのような遺伝的組み換えミコバクテリアは多くの用途を持つ。

本発明のビヒクルは、例えば問題のＤＮＡによりコードされる病原菌抗原に対する免疫を誘発するワクチンとして使用することができる。病原菌は、いずれかのウィルス、微生物、又は病気の原因となる他の生物あるいは物質（例えば毒素）である。癩病に対する免疫に有用なワクチンビヒクルを作ることができる。ＢＣＧなどのミコバクテリアの非常なアジュバント活性のために、そのようなワクチンは細胞−媒介免疫、特に長期性又は持続性の免疫の形成に有効であろう。癩病の寄生虫Ｍ、１旦旦工見且のタンパク質抗原をコードする遺伝子は、Ｙｏｕｎｇにより単離され、１９８６年７月３１日に受理された同時係属Ｕ、Ｓ、特許出願番号９８２，０９５に詳細に記載されており、それをここに参照として挿入する。特に５種類の免疫原性タンパク質抗原（すなわち分子量が６５ｋＤ、３６ｋＤ、２８ｋＤ、１８ｋＤ及び１２ｋＤの抗原）をコードする遺伝子を単離した。さらに６５ｋＤの抗原のための遺伝子によりコードされる６種類のアビトープを同定した。これらのアビトープの少な（とも１種類は、Ｍ、１ｅｐｒａｅに独特であることが示され：他のアビトープは他のミコバクテリアの６５ｋＤタン／くり實と共通であることが示された。

本発明の組み込みベクターを使用し、上記及び以下の実施例に記載の方法を用いてＢＣＧゲノム中にＭ、１ｅｐｒａｅタン１＜り質抗原をコードする１種類かそれ以上の遺伝子を組み込むことが可能である。ＨＴＶｌ及び５ｒｖｉ　呈豆工、且旦工及び見立Ｖタンノくり質をコードする遺伝子を、上記の方法を用いて標識ターゲ・ットＭ、ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧｉこ導入するプラミドベクターにクローニングする。この方法で、１種類かそれ以上のＨＩＶＩ又は５ＩＶＩの保護抗原を含み、寛容原性決定基を持たず、細胞−媒介免疫を誘発するための優れたアジュノくントを有する点で理想的に近いワクチンを構築することができる。

同様の方法で、本発明の組み込みベクター及び方法を用いて、結核に対する特異的保護を与えるワクチンを構築することができる。ラベルフルバシラス　Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの免疫原性タンパク質抗原をコードする遺伝子が単離され、１９８７年２月２日に受理された（現在放棄）Ｒｏｂｅｒｔ　Ｎ、Ｈｕｓｓｏｎ及びＲｉｃｈａｒｄ　Ａ、Ｙｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｕｓｅｓ　Ｔｈｅｒｅｆｏｒ”という題の同時係属Ｕ、　Ｓ、特許出願番号０７１０１０．００７、及びＲｏｂｅｒｔ　Ｎ。

Ｈｕｓｓｏｎ、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ａ、Ｙｏｕｎｇ及びＴｈｏｍａｓ　Ｍ。

５ｈｉｎｎｉｃｋによるＧｅｎｅｓ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｕｓｅｓ　Ｔｈｅｒｅｆｏｒ／／という題の一部継続出願番号０７／１５４，３３１　（１９８８年２月１０かにＥｘｐｒｅｓｓ　Ｍａｉｌ法により受理）に記載されており、ここに参照としてそれを挿入する。

この場合、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの免疫原性タンパク質抗原をコードする遺伝子を上記の要領で組み込みベクターを用いて標識ターゲラ１−ＢＣＧに組み込む。それぞれタンパク質抗原をコードする１種類以上（ＤＭ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ遺伝子をＢＣＧゲノムに組み込む二ともできる。例えば分子量が１２ｋＤ、１４ｋＤ、１９ｋＤ、６５ｋＤ及び７１ｋＤの免疫原性Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原をコードする遺伝子、又はこれらの遺伝子の２個又はそれ以上の組み合わせを、熱ショックタンパク質プロモーター領域又はストレスタンパク質プロモーター領域などの調節されたミコバクテリアプロモーターの領域の制御下で組み込みベクターに挿入し、標識ターゲットＢＣＧのゲノムＤＮＡに安定して組み込み、発現することができる。その結果、結核に対する免疫化に特異的であり、バシラスに対する持続性免疫を誘発するワクチンを得る。

マラリア　スボロゾイテス、マラリア　メロゾイテス、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、リーシュマニア、サルモネラ、ミコバクテリウム　アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、ミコバクテリウム　イントラセルラエ（Ｙヱ旦旦ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、ミコバクテリウム　アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）、）レボネーマ、百日咳、庖疹ウィルス、麻疹ウィルス、流行性耳下腺炎、シゲラ、ナイセリア、ポルレリア、狂犬病、ポリオウィルス、ＨＩＶ−１、猿免疫不全ウィルス、ヘビ毒、昆虫毒又はビブリオコレラからのタンパク質抗原を発現するワクチンビヒクルも同様の方法で製造することができる。

本発明の方法を用いて多目的又は多機能ワクチン（すなわち１種類以上の遺伝子を含み、それぞれの遺伝子が異なる病原菌又は毒素のためのタンパク質抗原をコードする問題のＤＮＡを含み、発現する１種類のワクチン）を構築することもできる。例えば上記の組み込みベクターを用いて、Ｍ、１ｅｐｒａｅのためのタンパク質抗原をコードする遺伝子、Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのためのタンパク質抗原をコードする遺伝子、リーシュマニアのためのタンパク質抗原をコードする遺伝子、及びマラリアのためのタンパク質抗原をコードする遺伝子をＢＣＧゲノム中に組み込むことができる。この多価ワクチンを投与すると、各抗原への免疫応答を刺激し、癩病、結核、リーシュマニア及びマラリアに対する長期保護を与える。

組み換えミコバクテリアは、不妊“ワクチン”ビヒクルとして使用することもできる。例えば人間の精腺刺激ホルモン（ＨＧＨ）フラグメントなどのタンパク質をコードするＤＮＡを含むミコバクテリアは、不妊ワクチンとして使用することができ、受胎調節剤として投与することができる。本発明のワクチンビヒクルは、膀胱癌又は黒色腫などの人間の癌の治療に（例えば成長１ＪＷＪ剤又は殺細胞生成物を発現する事により）使用することができる。この意味では、インターフェロンα、β及び／又はγ、１種類かそれ以上のインターロイキン（インターロイキン１−７）及び／又はＴＮＦα又はβを含み、発現する組み換えミコバクテリアが特に有用である。他の用途として、組み換えミコバクテリアは、保護免疫応答を引き出す目的（例えば連続的又は長期間感染に対して）、あるいは自己免疫疾患（例えば慢性関節リウマチ）における耐性を誘起する目的でストレスタンパク質を発現するのに使用することができる。

１９８８年６月１５日に受理されたＲｉｃｈａｒｄ　Ａ、Ｙｏｕｎｇ及びＤｏｕｇｌａｓ　Ｙｏｕｎｇによる５ｔｒｅｓｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄ　Ｕｓｅｓ　Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅという題の同時係属出願番号２０７．２９８に記載されているようなストレスタンパク質をこの目的に使用するごとができる。ミコバクテリアのゲノムは大きいので（例えばＢＣＧゲノムは長さが約３　ｘ　１０’ｂ　ｐである）、問題のＤＮＡを大量に担うことができ、従って多目的ビヒクルとして働く。

本発明の組み換えミコバクテリアは、ステロイド合成に含まれるような問題のポリペプチドの製造に使用することができる。この場合、そのような遺伝子の全体又は一部を、上記のように発現が制御されているミコバクテリア宿主中に組み込む。このようにして組み換えミコバクテリアは、ステロイドを合成することができるタンパク質の製造の有用な道具となる。

タンパク質又はポリペプチドの発現のための組み換えミコバクテリアのいずれの利用においても、組み込みベクター中に信号配列をコードするＤＮＡを含むことができ、従フて発現したタンパク質又はポリペプチドを細胞質中で作り、その後細胞壁で分泌することができる。例えばミコバクテリア中で分泌されるα抗原からの信号配列を使用することができる。他の場合、β−ガラクトシダーゼ、アガラーゼ又はαアミラーゼのための信号配列を使用することもできる。

ここで本発明を以下の実施例により説明するが、いかようにも制限するものと考えてはならない。

実施例１　竺工見止ｖ　ｉ　ｓ　−Ｂ　ＣＧへのＫａｎ遺伝子の導入のための揖み換えプラスミド及び標識ターゲットＢＣＧの構築組み換えプラスミドの調製にＤ　Ｈ５αバクテリア株を使用した。（Ｂａｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）ｏＭ。

ｂｎｖｉｓ−ＢＣＧ　（Ｍｏｒｅａｕ）ゲノムＤＮＡは標準的方法で調製した。

ｐＹ６０１３からクローニングしたＳａｃ　１部分的−ＥｃｏＲＩ４５１０ｂｐフラグメントをＳａｃ　１及びＥｃｏＲＩを用いて消化したｐＵＣ１９ＤＮＡに挿入することにより、出発ベクターｐＹ５０１４を製造した。（図３を参照）。

Ｙ３３３０からの５６１０ｂｐＥｃｏＲＴフラグメントをＥｅｏＲＩ消化ｐＧＥＭ−７２ｆ”（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に挿入することによりｐＹ６０１１プラスミドを得た。Ｙ３３３０は、ＢＣＧ　ＰｙｒＦ遺伝子のフラグメントを用いてライブラリをスクリーニングすることにより得た、ＢＣＧ　ＤＮＡの λｇｙｌｌからのλｇｔ１１クローンである。ｐＹ６０１４は、ミコバクテリアＰｙｒＦ遺伝子、及びＰｙｒＦ遺伝子の両側に１．４−１．６ｋｂのフランキングミコバクテリアＤＮＡを含む。

カナマイシン耐性をコードするａｐｈ遺伝子をｐＹ６００５から得、標準的方法でｐＹ６０１４組み換えプラスミドに挿入してＰｙｒＦコード配列を置換した。

（ｐＹ６００５　：Ｔｉ２Ｏ３から誘導した（Ｋａｎ’）カナマイシン抵抗性カートリッジを、ポリリンカー中のＳａｃ　１部位をｐＵｃｌで置換したｐＵＣ４の誘導体であるｐＵＣ４５ａｃＩに挿入した）。ａｐｈ遺伝子をｐＹ６０１４からのＨｉｎｃＩＩ６．１ｋｂ７ラグメントにクローニングし、ＢａｍＨＩをｐＹ６００５からのフラグメントに充填した。これにより、標識ターゲットＢＣＧ株の製造に使用する組み換えプラスミドｐＹ６０１５を得る。（図４を参照）。

Ｋａｎ遺伝子を含む標識ターゲラ１−ＢＣＧの単離図１に図示するように、標識ターゲットＢＣＧ株を、上記の組み換えプラスミドｐＹ６０１５を用いてＢＣＧを形質転換することにより製造する。この方法は以下の要領で行う：　ＢＣＧ細胞を、光学密度（ＯＤ）が０．５の浮遊培養中で成長させ、エレクトロポレーション緩衝液ＰＳＢ（ホスフェートスクロース緩衝液）中で５０倍に濃縮し、クルベットに移した。ｌ０ｇｇのプラスミドＤＮＡの添加後、６．２５０Ｖ／ｃｒｎ及び２５μＦの電気信号を１回与え、細胞を］、Ｑｍｌの培地中に懸濁し、３７ ℃にて２時間成長させてプレート化した。

２０μｇ／ｍｌの力＋マイシン及び１ｍｇ／ｍｌのＦＯＡを含むＭｆｃｌｄｌｅｂｒｏｏｋ　７Ｈ１０寒天プレート上で形質転換をプレート化することにより標識ターゲットＢＣＧを単離した。

実施例２　標識ターゲットＭ、ｂｏｖｉｓ−ＢＣＧへの問題のＤＮＡの導入のための組み込みベクターの構築標識ターゲットＢＣＧ　（実施例１にて製造）を形質転換することができ、ミコバクテリアＰｙｒＦ遺伝子、相同組み換えに必要なフランキングミコバクデリアＰｙｒＦ配列と相同であるＤＮＡ配列、ミコバクテリアｈｓｐ７Ｑプロモーター及び問題のＤＮＡ　（すなわちＨｌｖｌ又は５ＩＶＩ　ｇａｇ、ｐｏｌ工又はｅｎヱ遺伝子）を含む組み込みベクターを作った。この方法を以下に記載し、及び図２に図示する。

ミコバクテリアＰｙｒＦ遺伝子及びフランキングＤＮＡ配列を含む、実施例１に記載した組み換えベクターｐＹ６０１４をＫｐｎＩ及びＨｉｒ＋ｄｌｒｌを用いて消化し、プラントエンド及び自己連結させベクターｐ’／６０１６を形成した（図５参照）。これは標準的方法に従って行った。これにより、最初のポリリンカーＤＮＡ配列中に位置していたｐＹ６０１４中の数個の制限部位が除去された。

フラグメントに充填したｈｓｐ７０　Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＥｃｏＲＩ −Ｈｉｎｄｌｌｌｌ、８ｋｂをＹ３３３４　（７０ｋＤａ抗原に対する抗体を持つＮユ１旦上ｌ出：ｕｌｏｓｊｓＤＮＡの２ｇ　ｉ　ｌ　ｌライブラリのスクリーニングにより得たλｇｔｌｌクローンＹ３１１　］からのＥｃｏＲＩ−Ｋｐｍ１．８Ｋｂフラグメントを含むＭゴ３　ｍｐ１８ファージ）から得、標準的方法を用いてｐＹ６０１６のＨｐａ１部位（ＰｙｒＦの１０６ｂｐ下流）にクローニングした。

図６に示す通り、これによりｈｓｐ７０プロモーター及び部分的コ・−ド配列、ならびに実施例１で生成したｔｓｍターゲットＢＣＧとの二重相同組み換えに必要なミコバクテリア（ＢＣＧ）フランキング配り、発含む組み換えプラスミドｐＹ６０１７を得る。このベクター（ｐＹ６０ｉ７）を用いて、ＨｌＶｉ　ｌ１ｇ、旦ｏ−１又はｅｎヱ遺伝子、あるいは５ｆＶｉ　及旦差、−に９Ｊ−又は且ユヱ遺伝子をコードするＤＮ、Ａを持つ６種類の組み込みベクターを生成した。これらのベクターはそれぞれ、ｈｓｐ７０コード領域を問題のＤＮＡで置換する以下の方法で生成した。

ｐＹ６０ｉ７中への問題のＤＮＡの挿入ｈｓｐ７０挿入物中のＮ　ｅ　ｏ　Ｉ部位はｈｓｐ７０遺伝了のＡＴＧにある。問題の遺伝子をコードするＤＮＡを、問題の遺伝子を鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてこのベクター（ｐＹ６０］、７）中にクローニングする。反応に用いた２種類のオリゴヌクレオチドはその二末端に簡単な制限部位（この場合は遺伝子の５′末端にオリゴヌクレオチドのためのＮｃｏｒ、及び遺伝子の３゛末端にオリゴヌクレオチドのためのポリリンカ〜の部位のひとつ）を含む。ＰＣＲ生成物をオリゴヌクレオチドのために選んだ２種類の酵素を用いて消化し、ゲル精製した。ベクターを切断し、ポリリンカーの酵素（ＫｐｎＴ、ＸｂａＩ）のひとつを用いて完結し、ＮｃｏＩを用いて部分的に消化した。Ｎｅ。

Ｉが問題の遺伝子中に存在すると、Ｎｃｏ１部位はＫｐｎＩ又はＸｂａＩ酵素による消化の前にブランＩ・される。ＰＣＲ生成物は５′末端にて充填され、３° 末端酵素を用いて切断する。

以下の組み換えプラスミドベクターを製造した：ｐＹ６０１８：　ＨｉＶｌ　呈見工遺伝子を、ＰＣＲを用いて１５００ｂｐＮｃｏ　Ｉ−Ｘｂａ　ｌフラグメントとして合成し、ＮｅｏＩ部分的−Ｘｂａｌ消化Ｉ）Ｙ６０１７にクローニングした（図７を参照）。

ｐＹ６０１９：　ＨｉＶ：ｆ−ｐｏｌ遺伝子を、ＰＣＲを用イｒ　２　’７２０ｂｐＮｅｏＸ−Ｘｂａ　ｌフラグメントとしで合成し、ＮｃｏＸ部分的−ＸｂａＪ消化ｐＹ６０１７に挿入した（図８を参照）。

ｐＹ６０２０：　ＨｉＶｌ　ｅｎｖ遺伝子を、ＰＣＲを用いて２５７０ｂｐＮｅｏ　Ｉ−Ｘｂａ　ｌフラグメントとＬｒ合成し、ＮｃｏＩ部分的−Ｘｂａｌ消化ｐＹ６０１７に挿入した（図９を参照）。

ｐＹ６０２１：　５ＩＶＩ　ｇａｇ遺伝子を、ｌ）　ＣＲを用いて１５２０ｂｐプラント−Ｋｐｎｌフラグメントとして合成し、Ｎｃｏ１部分的−充填Ｋｐｎｌ消化ｐＹ６０１７に挿入した（図１０参照）。

ｂｐｓｍａｌフラグメントとして合成し、Ｎｃｏ１部分的−Ｘｂａｌ消化及び充填ｐＹ６０１７に挿入した（図１１参照）。

ｐＹ６０２３：　５ＩＶＩ　見ユヱ遺伝子を、ＰＣＲを用し）て２７５０ｂｐＳｍａ　１−Ｘｂａ　ｌフラグメントとして合成し、Ｎｃｏ１部分的充填及びＸｂａｌ消化ｐＹ６０１７に挿入した（図１２参照）。

ψ　６　ｇＥｌ（０＝＝に８・　マ　ψト国際調査報告ＩＩＩ＋−一一＾−−馴崗　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０３４５１国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．問題のＤＮＡ、及びその問題のＤＮＡの発現を制御する調節されたミコバクテリアプロモーターを含む組み換えミコバクテリウム。２．第１項に記載の組み換えミコバクテリウムにおいて、問題のＤＮＡが：抗原、酵素、リンフォカイン、免疫強化剤及びリポーター分子から成る群より選んだ問題のタンパク質又はポリペプチドをコードし；調節されたプロモーター領域がミコバクテリアプロモーター領域であることを特徴とする組み換えミコバクテリア。３．前出項のいずれかに記載の組み換えミコバクテリアにおいて、ＤＮＡ及びプロモーター領域がミコバクテリアのゲノムＤＮＡ中に組み込まれていることを特徴とする組み換えミコバクテリア。４．前出項のいずれかに記載の組み換えミコバクテリアにおいて、調節されたミコバクテリアプロモーターが熱ショックタンパク質プロモーター領域であることを特徴とする組み換えミコバクテリア。５．前出項のいずれかに記載の組み換えミコバクテリアにおいて、問題のＤＮＡが：ａ）以下から選んだ抗原：１．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ抗原；２．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原；３．マラリアスポロゾイテス；４．マラリアメロゾイテス；５．ジフテリアトキソイド；６．破傷風トキソイド：７．リーシュマニア抗原；８．サルモネラ抗原；９．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ抗原；１０．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｉａｒｅ抗原：１１．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ抗原；１２．トレポネーマ抗原：１３．百日咳抗原；１４．疱疹抗原；１５．麻疹抗原；１６．流行性耳下腺炎抗原；１７．シゲラ抗原：１８．ナイセリア抗原；１９．ボレリア抗原；２０．狂犬病抗原；２１．ポリオウイルス抗原：２２．ヒト免疫不全ウィルス抗原：２３．ヘビ毒抗原；２４．昆虫毒抗原；２５．ビブリオコレラ；ｂ）ステロイド酵素：ｃ）インターロイキン１から７；ｄ）腫瘍壊死因子α及びβ：ｅ）インターフェロンα，β及びγ：ならびにｆ）ルシフェラーゼ：β−ガラクトシダーゼ：βグルクロニダーゼ及びカテコールデヒドロゲナーゼから成る群より選んだりボーター分子から成る群より選んだ少なくとも１種類のタンパク質抗原をコードすることを特徴とする組み換えミコバクテリア。６．前出項のいずれかに記載の組み換えミコバクテリアにおいて、ミコバクテリアがＢＣＧであることを特徴とする組み換えミコバクテリア。７．第１−６項のいずれかに記載の組み換えミコバクテリアの製造法において、問題のＤＮＡ及び調節されたプロモーター領域を含むベクターを用いてミコバクテリアを形質転換することから成る方法。８．第７項に記載の方法において、ベクターがさらにミコバクテリアのゲノム中のＤＭＡ配列と相同であるＤＮＡ配列を含み、それによって問題のＤＮＡ及び調節されたプロモーター領域を染色体に組み込むことを特徴とする方法。９．第１−６項のいずれかに記載の組み換えミコバクテリア、及び適したキャリヤーを含むワクチン。１０．哺乳類宿主を１種類かそれ以上の病原菌に対して免疫する方法において、該宿主に第９項に記載のワクチンを投与することから成る方法。