JPH06508741A - ミコバクテリア発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ミコバクテリア発現ベクタ一 本発明はミコバクテリア中の外来ＤＮＡの発現、そのような発現に用いる新規な ベクターおよび組換え型ミコバクテリアワクチンに関する。

ミコバクテリアはヒトおよび動物の主要病原体である。例えば、結核症は、一般 に、ヒトの場合、ミコバクテリウム・チューバキュロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ（Ｍ、　）　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）により、およびウシの場合、 ミコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　（Ｍ、　）　ｂｏｖ ｉｓ）　（ヒトおよび他の動物に伝染可能であり、そのヒトなどにて結核症を引 き起こす）により引き起こされる。結核症は広範に残っており、特に発展途上国 においては、重大な国民の健康上の問題である。

エム・レブラエ（Ｍ、　１ｅｐｒａｅ）によって引き起こされるらい病は、１０ ００万以上のヒト、生として発展途上国におけるヒトを苦しめている。エム・チ ニーバキュロシス（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびアビウム−インタ ーセルラー−スクロフラセウムのミコバクテリア（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ　 ｏｆ　ｔｈｅ　ａｖｉｕｍ＝ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ　−ｓｃｒｏｆｕｌ ａｃｅｕｍ）　（ＭＡ　Ｉ　Ｓ　）群は後天性免疫不全疾患（ＡＩＤＳ）を患っ ている患者の主要日和見病原体である。エム・ソユードチューバキュロシス（Ｍ 。

ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）はウシの主要病原体である。

他方、エム・ボビス（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）の無毒化菌株であるカルメットーゲラ ン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）　（ＢＣＧ）が、 世界中で最モ広（用イラレテイるヒトワクチンであり、５０年以上の間、生ワク チンとして用いられている。過去３５年間にて、ＢＣＧは著しい副作用がほとん どなく（例えば、推定死亡率が６０人／１０億人）、２５億以上のヒトに投与さ れてきた。多くの研究にて、ＢＣＧが結核症に対して予防効果を有することが判 明した。しかしながら、近年、南インドにて肺結核症の予防に効果的でないこと がわかった。ミコバクテリウム・スメグマテイス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）は、ＢＣＧと抗原特性およびアジュバント特性を分ける 非病原性桿菌である。両者は共に、培養基中での増殖が適度に容易である。

Ｗ○９０１００５９４　（ホワイトヘッド・インスティチュート（Ｗｈｉｔｅｈ ｅａｄＩ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　）は、とりわけ、ワクチンビヒクルとしての使 用で、外来ＤＮＡを安定的にミコバクテリアに導入するのに用いることができる 、緩和シャトルプラスミドおよび細菌−ミコバクチリアシャトルプラスミドであ る組換え型ベクターを記載している。その外来ＤＮＡが、ついで、カナマイシン 耐性、クロラムフェニコール耐性および且１を発現するイー・コリ（Ｅ、　Ｃｏ １１）プロモーターまたはエム・レプラエ（Ｍ、　１ｅｐｒａｅ）　６５　ｋ　 Ｄ遺伝子プロモーターの調整下、ミコバクテリア中にて発現される。

つい最近、ミコバクテリア中ム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖ ｉｓ）　−Ｂ　ＣＧ　ｈｓｐ６０およびｈｓｐ７０遺伝子の調整配列を用い、Ｂ ＣＧ中にて外来抗原遺伝子の発現を操作しうることが報告されている（シ町ケイ ・ストパー（Ｃ，Ｋ、　Ｓｔｏｖｅｒ）ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）　− Ｂ　ＣＧ遺伝子の２４３１塩基対のＤＮＡ配列が報告されている（トーμ（Ｔｈ ｏｌｅ）ら、１９８７）。そのコード配列は５７６位で始まる。

今回、塩基５７６の先にある配列がミコバクテリア中にて外因性コードＤＮＡの 発現を調整するにおいて効果的であるプロモーターおよびリボゾーム結合部位を 含有することを見いだした。

本発明によれば、ミコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂ ｏｖｉｓ）　−ＢＣＧの６４ｋＤ蛋白質についてのプロモーターおよびリボゾー ム結合部位の調整下、外因性コードＤＮＡを含有するミコバクテリア発現ベクタ ーが得られる。

該発現ベクターは、ミコバクテリアベクターを切断して無傷のミコバクテリアレ プリコンを有する直鎖状ＤＮＡ切片を得、該直鎖状切片と、該直鎖状切片と−。

緒になってエム・ボビス（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）　−Ｂ　ＣＧの６４ｋＤ蛋白質に ついてのプロモーターとＲＢＳおよびコードＤＮＡについてのＤＮＡ配列を完成 する１個以上のＤＮＡ分子とを連結することにより、本発明に従って製造するこ とができる。

本発明のさらなる態様において、ミコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）　−Ｂ　ＣＧの６４ｋＤ蛋白質についてのプロモーター およびリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）の調整下、外因性コードＤＮＡを発現する 組換え型ミコバクテリウムが得られる。

好ましい具体例において、６４ｋＤプロモーターおよびＲＢＳは、ミコバクテリ ウム・ボビス（ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕＩｌｂｏｖｉｓ）　−Ｂ　ＣＧ　６４ 　ｋ　Ｄ遺伝子の断片１１５−５７５またはその機能的誘導体からなる。

さらなる態様において、本発明は、６４ｋＤコ一ド配列の不在下のミコバクテリ ウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）　−Ｂ　ＣＧ　６４ 　ｋ　Ｄ遺伝子の断片１１５−５７５またはその機能的誘導体、およびミコバク テリア中にて外因性コードＤＮＡを発現するための断片または誘導体の使用を提 供する。

機能的誘導体は、機能的プロモーターおよびＲＢＳ活性を保持する１１５−５７ ５断片の変異体または切形体とすることができる。

断片を末端欠失によりプローブし、機能的プロモーターおよびＲＢＳについての 最小限の構造要件を決定することは、日常の来事項であると認識されるであろう 。

都合のよい制限部位を導入するため、１１５−５７５領域を変異することも意図 されるものである。かくして、例えば、５７５でのＡをＣで置き換えることによ り、ＮＣ０１部位を翻訳開始部位で導入することができる。

断片は、常套手段、例えば、すべてのまたは一部の断片を６４ｋＤ遺伝子の関連 部分を含有するベクターから削り取り、要すれば、合成オリゴヌクレオチドリン カーで削り取った断片を連結し、必要な配列を生成することにより、または全オ リゴヌクレオチド合成により製造することができる。

本発明のミコバクテリア発現ベクターの例は、ミコバクテリアプラスミドまたは ファージ、または操作を補助するに、イー・コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１）　、ストレ プトミセス、桿菌または酵母のような池の微生物中にて複製可能な直鎖状プラス ミドまたはファージに融合されたｌ［Ｍ状ミコバクテリアプラスミドまたはファ ージからなるシャトルベクターを包含する。シャトルベクターの原理および構造 はｗｏ９０１００５９４に記載されている。

本発明の組換え型ミコバクテリウムは、ミコバクテリウムを本発明のミコバクテ リア発現ベクターで形質転換することにより製造することができる。本発明の発 現ベクターの性質に依存して、外因性コードＤＮＡがプラスミドとして染色体外 的に、または部位特異的組み込みを介してミコバクテリアゲノムの範囲内に維持 され得ることが認識されるであろう。

シャトルベクターを生成するか、またはそのミコバクテリア宿主を溶原化するこ ムでの重複感染および組み込みに対する耐性を付与する。

また、シャトルブラスミドベクターを用い、外因性コードＤＮＡをミコバクテリ ア中に導入し、そこで該ＤＮＡを染色体外的に発現させることができる。例えリ コンから構築することができる。

また、該外因性コードＤＮＡを、エム・ポビ７．　（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）　−Ｂ 　ＣＧの６４ｋＤプロモーターとＲＢＳの調製下、ミコバクテリア発現ベクター を用いないが、Ｗ０９０１００５９１：記載のイー・コ’）（Ｅ、ｃｏｌｉ）ｐ Ｕｃ１９ベクター（Ｄような適当なベクターを用い、相同組換え法、部位特異的 組換え法または非相同組換え法によりミコバクテリアゲノム中に導入することが できる。

本発明において有用なミコバクテリオファージは、Ｌｌ、ＴＭ４およびＤ２９を 包含する。

また、０ＲＦ３−ＯＲＦ４　（ヌクレオチド塩基１５４１−３９０８ンの領域に ける外因性コードＤＮＡおよび機能的なミコバクテリアのプロモーターとＲＢＳ の挿入により、エム・フォーチュイタム（Ｍ、　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）プラスミ ドｐＡＬ５０００（ラウザー（Ｒａｕｚｉｅｒ）ら）をミコバクテリア発現ベク ターとして用いうろことが判明した。

したがって、本発明のさらなる態様において、その０ＲＦ３−○ＲＦ４領域にて 挿入された外因性コードＤＮＡおよび機能的なミコバクテリアのプロモーターと ＲＢＳを含有するｐＡＬ５０００またはその複製可能な誘導体からなるミコバク テリア発現ベクター、および該ベクターで形質転換された組換え型ミコバクテリ ウムが得られる。

ｐＡＬ５０００由来の本発明のベクターは、０ＲＦ３−ＯＲＦ４の領域にてｐＡ Ｌ５０００またはその誘導体を切断し、得られた直鎖状ＤＮＡ切片を、該直鎮状 切片と一緒になってプロモーターとＲＢＳおよびコードＤＮＡについてのＤＮＡ 配列を完成する１個以上のＤＮＡ分子と連結することにより、本発明に従って製 造することができる。

組換え型ミコバクテリウムは、ミコバクテリウムをｐＡＬ５０００由来の本発明 のベクターで形質転換させることにより製造することができる。

好ましい具体例において、機能的なミコバクテリアのプロモーターおよびＲＢＳ は、エム・ポビ；２．　（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）　−Ｂ　ＣＧの６４ｋＤ蛋白質に ついてのプロモーターおよびＲＢＳである。

プロモーター、ＲＢＳおよびコードＤＮＡを挿入するのに都合のよい部位は、ｐ ＡＬ５０００の制限部位であるＥｃｏＲＶとＡｐａＩの間である。

ｐＡＬ５０００の適当な複製可能な誘導体は、ｐＡＬ５０００を直鎖状とし、操 作を補助するためのイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のような別の微生物にて複製可 能なｌｌｉ鎖状のプラスミドまたはファージに融合されているシャトルベクター を包含する。

本発明の方法によって形質転換することができる適当なミコバクテリアは、エム ・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）　、−ｒ−ム・ボビス−Ｂ　Ｃ Ｇ　（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ　−ＢＣＧ）、エム・アビウム（Ｍ、ａｖｉｕｍ）　、 ｘム−７レイ（Ｍ、ｐｈｌｅｉ）　、エム・フオーチュイタム（Ｍ、ｆｏｒｔｕ ｊｔｕｍ）　、エム・ルフー（Ｍ、　１ｕｆｕ）　、エム・パーチューバキ、ｏ シス（Ｍ、　ｐａｒｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）　、エム＋ハバナ（Ｍ、ｈａｂ ａｎａ）　、ｘム・スクロフラセウム（Ｍ、　ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）およ びエム・インターセルラー（Ｍ。

１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）を包含する。

低増殖性ミコバクテリア（例えば、エム・ボビス（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）　−Ｂ　 ＣＧおよびエム・チューバキュロシス（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）をワ クチンビヒクルとして用いる場合、エム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａ ｔｉｓ）　（すなわち、その中に問題の抗原または抗原類をコードするＤＮＡを 導入した）を介し、その後、エム・ボビス（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）　−Ｂ　ＣＧに 至ることが特に有用である。

ベクターを、培養可能なミコバクテリアム、例えば、エム・ボビス（Ｍ、　ｂｏ ｖｉｓ）−ＢＣＧまたはエム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）中 に効果的に導入するにはいくつかの有用な方法がある。プラスミドベクターの場 合、ミコバクテリウム中に効果的に導入するのに、プロトプラスト融合を用いる ことができる。この場合、クローン化したプラスミドを有するイー・コリ（Ｅ、 ｃｏｌｉ）またはストレプトミセスを、公知技法を用い、ミコバクテリアのスフ ェロプラストと融合する。

別法として、プラスミドＤＮＡを含有し、本質的に染色体ＤＮＡを含有しないイ ー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ミニセルを用いて、ミニセルのプロトプラスト融合を 行うことができる。

エレクトロポレーソヨン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりベクターＤ ＮＡを無傷のエム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｕａｔｉｓ）細胞に直接的 に導入するさらなる方法は、スフェロプラストを生成するプロトコルの使用の結 果、生じるかもしれないミコバクテリア細胞に対する障害の可能性を除去する。

ミコバクテリオファージに基づくベクターによるミコバクテリアの形質転換は、 一般に、ＷＯ２０１０Ｏ５９４に記載のファージ感染法により、すなわち、スト レプトミセスについてのスフェロプラストの調製に関する、オヵニシおよびホッ プウッド（ＯｋａｎｉｓｈｉおよびＨｏｐｖｏｏｄ）によって記載されている方 法の変形により行うことができる。ミコバクテリアのようなストレプトミセスは 、アクチノミセタレス（、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）である。

ＤＮＡ分子を細菌スフェロプラスト中に導入することを容易にするのに、ポリエ チレングリコールの添加を組み合わせた修飾法を用いる。

さらに、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子のような選択可能なマーカーを含む発 現ベクターを、イン・ビトロのパッケージ混合にてラムダ（Ｌａｍｂｄａ）を用 いてバクテリオファージスヘッドに【くツケージする。その後、イー・コリ（Ｅ 、ｃｏ■）をそのファージで形質導入させ、その結果、抗生物質−耐性−コード 遺伝子およびコードＤＮＡを含有するコロニーを、（抗生物質含有の培地を用い て）スクリーンすることが可能となる。

得られた「ライブラリー」を、例えば、エレクトロポレーションを用いてエム・ スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）中に導入する。クローン化された 挿入ＤＮＡ含有のベクターを含むプラークを選択する。その後、組換え型二ム・ スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）を用い、高い効能で、ＢＣＧのよ うな培養可能なミコバクテリウムを感染させることができる。その結果、コード ＤＮＡがミコバクテリアゲノムＤＮＡ中に導入され、そこで該ＤＮＡを発現させ る。

問題のコードＤＮＡ含有のＢＣＧの選択は、抗生物質−耐性−ロード遺伝子また は栄養要求性変異株におけるその欠失を補う遺伝子のような選択可能なマーカー を用いて、またはＬ１バクテリオファージのレプレッサー蛋白質をコードするｃ ｌ遺伝子を用いることにより行うことができる。栄養要求性手段の場合、栄養要 求性ミコバクテリア変異株（例えば、ｐｙｒ−Ｆ変異株）を単離し、対応する野 生型（非変異株）のミコバクテリウム中にある遺伝子をベクター中に組み入れる 。

このｐｙｒ−Ｆ変異株に加えて、グルコンキナーゼ遺伝子の欠陥を有するデオキ シグルコース変異株、ならびに他の生合成経路における変異体（例えば、アラビ ノースおよびガラクトースのような、アミノ酸生合成、ビタミン生合成および炭 水化物代謝における変異体）を有する他のものを単離することが可能である。

いずれかの方法にて、ミコバクテリア変異株を選択し、該変異株を補う遺伝子を ベクター中に組み入れる、それはさらに外因性コードＤＮＡを含有している。

すなわち、多シストロン性発現ベクターの得るのに、マーカー遺伝子を、外因性 コードＤＮＡと同じプロモーターの調整下、ベクターに挿入してもよく、または 該マーカー遺伝子がそれ自身プロモーターであってもよい。

コードＤＮＡが首尾よく導入されているミコバクテリア変異株は、適宜選択され た培地（例えば、その抗生物質に対する耐性が付与されている該抗生物質含有の 培地、用いる変異株に影響を及ぼす生合成経路に関連する栄養素を含有し、また は欠いている培地）にて培養することにより、またはｃｌ遺伝子を用いる場合、 形成されるプラークの外観に基づいて選択することにより同定（選択）すること ができる。

さらに、モノクローナル抗体の使用により、コードＤＮＡ含有のＢＣＧを選択す ることが可能である。この場合、モノクローナル抗体が利用可能である抗原（例 えば、エム・レブラエ（Ｍ、　１ｅｐｒａｅ）またはエム・チューバキュロシス ９［ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の１個以上のエピトープをコードする遺伝子ま たは遺伝子断片をミコバクテリア中に導入する。このようなモノクローナル抗体 を用いて１個以上のこれらのエピトープをコードする遺伝子または遺伝子類を含 有する組換え型ＢＣＧを選択する。この方法にて導入したマーカー抗原遺伝子は 、プロモーター配列および他の調節配列を有する。その結果、遺伝子工学技法を 用いて外因性コードＤＮＡをフレーム中に加えることができ、そのため該マーカ ー抗原に対するモノクローナル抗体により同定された組換え型ＢＣＧもまたその ように導入された外因性コードＤＮＡを発現するであろう。

外因性コードＤＮＡを組換え型ミコバクテリアビヒクル中に導入するにおいて必 須であるプラスミドベクターの別の成分は、自主的に複製する配列（例えば、レ プリコン）であり、その存在はベクターを自主的に（染色体外的に）複製させる ための重大な決定要素である。これらの配列は、例えば、プラスミドレプリコン またはミコバクテリオファージあるいは染色体複製開始点の切片を包含しつる。

プロモーターおよびＲＢＳの調整下での外因性コードＤＮＡの直接的導入は、例 えば、ミニセルプロトプラスト融合を用いて成し遂げることができる。この場合 、抗生物質−耐性遺伝子または染色体変異体とすることができる、ミコバクテリ ウムについて選択可能なマーカーを、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ニスミツド中 にてクローンすることができる。さらに、外因性コードＤＮＡをミコバクテリア 染色体中に効果的に組み込むことを可能とするＤＮＡがイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）コスミソドにて存在する。例えば、エム・レブラエ（Ｍ、　１ｅｐｒａｅ） において、組換えに付随すると思われる繰り返し配列が生じ：類似する配列がＢ ＣＧおよびエム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）にて同定され、 それより単離することができ、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ニスミツド中に（選 択可能なマーカーと共に）組み入れられ、その結果、高度の組換えが起こる。別 法として、外因性コードＤＮＡをエレクトロポレーションにより直接的に導入す ることができる。

外因性コードＤＮＡは記載のベクター（例えば、それはイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）レプリコン、組換えに付随するミコバクテリア染色体ＤＮＡの切片（組換え 原性配列（ｒｅｃｏｍｂｉｎｏｇｅｎｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　）および２個 の選択可能なマーカーで、一方をイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）におけるマーカー として供し、他方をミコバクテリウムにおけるマーカーとして供するものを包含 する）中に組み入れることができる。

ついで、遺伝子（類）を、ＢＣＧまたはエム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇ ｒｎａｔｉｓ）染色体ＤＮＡのようなミコバクテリア染色体ＤＮＡ中に組み込む ことができる。

問題の遺伝子（類）がこの方法にてエム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｔｎｅｇｍ ａｔｉｓ）に組み込まれると、遺伝子／遺伝子類はまた一般的な形質導入ファー ジによりＢＣＧに移動しうる。この場合、他の構成成分に加えて、２種の組換え 原性配列：エム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からの配列と、 ＢＣＧからの配列を含むことが好ましい。

本明細書において、外因性コードＤＮＡは、その中にＤＮＡが組み入れられるミ コバクテリウム以外の源からのＤＮＡと定義する。それは、問題の蛋白質（類） またはポリペプチド（類）をコードする遺伝子または遺伝子類および／または選 択可能なマーカーまたはマーカー類のすべてまたは一部をコードすることができ る。問題の蛋白質またはポリペプチドは、例えば、それに対する免疫応答が望ま しい蛋白質またはポリペプチド（問題の抗原（類））、酵素、リンフ才力イン、 免疫強化剤、薬理剤、ステロイドおよび診断状況における問題の報告分子（例え ば、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）細菌からの、またはホタルオリジン（ｆｉｒｅｆ ｌｙ　ｏｒｉｇｉｎ）のルシフェラーゼ；β−ガラクトシダーゼ；β−グルコロ ニダデー；カテコールデヒドロゲナーゼ）とすることができる。本発明の組換え 型ミコバクテリアは、問題のＤＮＡを発現させることができるビヒクルとして特 に有用である。このようなビヒクルは、例えば、問題の１種以上の病原体の抗原 または抗原類のような、問題のポリペプチドまたは蛋白質（または１種以上のポ リペプチドまたは蛋白質）を発現させるワクチンビヒクルとして用いることがで きる。さらに、該組換え型ミコバクテリアは、免疫強化剤、酵素、薬理剤、ステ ロイドおよび抗腫瘍剤の発現用；避妊性ワクチンビヒクルを生成するに有用なポ リペプチドまたは蛋白質の発現用；またはストレス蛋白質の発現用ビヒクルとし て用いることができ、それは自己免疫疾患（例えば、リウマチ様関節炎）の免疫 応答を引き起こすのに、またはその耐性を誘発するのに投与することができる。

組換え型ミコバクテリアは、例えば、腫瘍細胞の増殖抑制剤であるかまたは細胞 致死性を有する蛋白質（類）またはポリペプチド（類）（例えば、インターフェ ロンα、βまたはγ：インターロイキン１−７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αまた はβ）を発現させることができ、したがって、ある種のヒト癌（例えば、膀胱癌 、黒色腫）を治療する新規な手段の基礎を提供する。問題の病原体は、疾患を引 き起こす、いずれのウィルス、微生物または他の細菌または物質（例えば、トキ シンまたはトキソイド）を包含する。

かくして、本発明は、本発明に係る組換え型ミコバクテリウム中にて外因性ＤＮ Ａを発現させ、要すれば、問題の蛋白質またはポリペプチドを回収することから なる問題の蛋白質またはポリペプチドの製法、および本発明に係る組換え型ミコ バクテリウム中にて生成された問題の蛋白質またはポリペプチドに関する。問題 の蛋白質またはポリペプチドを生成および回収する場合、エム・スメグマティス （Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）が好ましいミコバクテリウムである。

本発明はまた、宿主を組換え型ミコバクテリウムでワクチン処理し、該宿主にお いて保護免疫性を誘発する方法に関する。組換え型ワクチンを用い、体液抗体免 疫性、細胞免疫性（ヘルパーおよび細胞毒性免疫性を包含する）および／または 粘液または分泌液免疫性を得ることができる。加えて、本発明は、ワクチンとし て、または診断薬として、この組換え型の培養可能なミコバクテリウムによって 発現される抗原の使用に関する。

ミコバクテリアは、最も一般的な公知特性のうちでアジュバント特性を有し、か くして受容者の免疫系を刺激し、非常な効果で他の抗原に対して応答する。細胞 −介在免疫性を誘発することが期待される、すなわち、細胞−介在免疫性が耐性 で臨界的であると思われる場合に病原体に対して免疫性を付与する可能性を有す るため、この態様は、ワクチンの特に価値のある態様である。また、該ワクチン は長期間の記憶または免疫性を刺激すると考えられる。その結果、単一（一度） の接種が蛋白質抗原に対する長期間の感作をもたらす可能性を有する。本発明の ワクチンビヒクルは長期−持続性のＴ細胞記憶をプライムし、それが感染剤また はトキシンに対する第２の中和抗体応答を刺激する可能性を有する。これは、例 えば、破傷風およびンフテリアトキシン、百日咳、マラリア、インフルエンザ、 ヘルペスウィルス、ヘビおよび昆虫毒、らい病、結核症、ジフテリア、破傷風、 リーシュマニア、サルモ不う、住血吸虫症、麻疹、ムンプス、ＲＳウィルス、水 痘帯状ヘルペスウィルス、トリポ不−マ、赤痢菌、ナイセリア、ボレリア、ラビ エス、ポリオ、ＨＩＶおよびコレラ菌に対して有用である。１種以上の疾患−発 病病原体に対する１種以上の保護抗原をコードする遺伝子は、天然のＤＮＡ　（ 例えば、病原性有機体またはトキンン産生有機体からのＤＮＡ）を単離すること により、公知の遺伝子工学技法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、または例えば 、マニアティス、ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ）ら、モレキュラー・クロー ニング（Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ア・ラボラトリ−’　マニ ュアル（Ａ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）　、：ｌ−ルド・スプリン グ・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）　、ＮＹ、（１９８２ ）参照）を用い、問題のＤＮＡ配列をクローニングおよび増幅することにより、 または機械的合成により得、ミコバクテリウム中に導入することができる。

問題の個々の抗原は、プラスモジウム（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｍ）　ＣＳ蛋白質 遺伝子（ＵＳ４７０７３５７、エアーノット（Ａ　１ｒｎｏｔ）ら）であり、さ らにはビー・ファルシパラム（Ｐ　、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）　ＣＳ蛋白質遺 伝子である。１つの具体例において、抗原をＮ−末端メチオニンでａｌａ、５ｅ ｒａｓ＋とじて発現させる。もう一つ別の具体例において、抗原を完全な長さの 蛋白質ｍｅｔ、ａＳｎ４＋２として発現させる。

さらなる態様において、本発明は、蛋白質についてのＤＮＡコード配列と該コー ド配列の転写およびミコバクテリウム内での翻訳に必須の調節因子とからなるプ ラスモジウム（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｉ）　ＣＳ蛋白質遺伝子発現単位、該遺伝 子発現単位からなるミコバクテリアベクターおよび該遺伝子発現単位からなる組 換え型ミコバクテリウムを提供する。

好ましい態様において、該ベクターは、エム・ボビス（Ｍ、　ｂｏｖｉｓ）　− Ｂ　ＣＧの６４ｋＤ蛋白質についてのプロモーターとＲＢＳの調整下、プラスモ ジウム（Ｐ　ｌａｓｍｏｃｌｉｕｍ）　ＣＳ蛋白質遺伝子を含有する。別の好ま しい態様において、該遺伝子は、その○ＲＦ３−ＯＲＦ４領域にて機能的なミコ バクテリアのプロモーターとＲＢＳを含有するｐＡＬ５０００またはその複製可 能な誘導体の範囲内にある。

１の態様にて、組換え型ミコバクテリウムは、好ましくは、エム・ボビス（Ｍ別 の態様にて、該組換え型ミコバクテリウムは、好ましくは、その０ＲＦ３−ＯＲ Ｆ４領域にてミコバクテリアのプロモーターとＲＢＳおよびその遺伝子を含有す るｐＡＬ５０００またはその複製可能な誘導体で形質転換される。

しかし、Ｏ８蛋白質遺伝子発現単位の発現はまた、ＷＯ２０１０Ｏ５９４に一般 的に記載されている操作により成し遂げうることが認識されるであろう。

蛋白質またはポリペプチドを発現させるための組換え型ミコバクテリアのいずれ の使用においても、シグナル配列をコードするシャトルベクターＤＮＡを含める ことが可能であり、かくしてそれにより、発現した蛋白質またはポリペプチドを 細胞質にて製造し、ついで細胞壁に分泌される手段が得られる。例えば、ミコバ クテリアにて分泌される、α抗原からのシグナル配列を用いることができる。

また、β−ガラクトシダーゼ、アガラーゼまたはαアミラーゼについてのシグナ ル配列も用いることができる。

ＢＣＧはワクチンビヒクルとして以下の点で重要な利点を有する：１）一般に生 まれた時に付与される幼時期のワクチンであること；２）過去４０年間で、結核 症に対するワクチンとして付与した場合、副作用の発生率が極めて低いこと、お よび３）個々にて（例えば、複数形にて）繰り返し投与することができること 特にＢＣＧの、ならびに一般にミコバクテリアのさらなる利点は、そのゲノムの 大きなサイズにある（長さが約３　ｘ　１０’ｂ　ｐ）。そのゲノムが大きいた め、多量の外因性ＤＮＡを収容することが可能であり、かくして多−ワクチンビ ヒクル（すなわち、１種以上の病原体またはトキシン用の保護抗原をコードする ＤＮＡを有するもの）を製造するのに用いることができる。

したがって、ワクチンビヒクルとして使用に好ましいミコバクテリア宿主細胞は エム・ボビス（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）　−ＢＣＧである。

ワクチン調製物は、一般に、ニュー・トレンズ・アンド・デベロツプメンツ・イ ン”ワクチンズ（Ｎｅｗ　Ｔｒｅｎｄｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　 ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）　、ボラ−（Ｖｏｌｌｅｒ）ら編、ユニパーツティー ・パーク・プレ７、　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ＰａｒｋＰｒｅｓｓ）　、ボル チモア、メリーランド州、Ｕ、Ｓ、Ａ、、１９７８に記載されている。リポゾー ム内のカプセル化が、例えば、フラートン（Ｆ　ｕｌｌｅｒｔｏｎ）の米国特許 第４．２３５．８７７号に記載されている。

各ワクチン用量中に存在する組換え型ミコバクテリアの量は、典型的なワクチン にて有意な副作用を生じることな（、免疫保護応答を誘発する量として選択され る。このような量は用いる個々の免疫原に依存して変化する。一般に、各用量は １〜１０００μｇ、好ましくは、１〜２００μｇの蛋白質からなると思われる。

個々のワクチンの最適量は、対象における抗体力価および他の応答を観察するこ とを包含する標準的研究により確認することができる。最初のワクチン処理後、 約４週間で対象はブーストを受け、つづいて感染の危険がある間は６力月毎にブ ーストを繰り返すことが好ましい。

本発明はまた、本発明に係る組換え型ミコバクテリアを医薬上許容される担体と 組み合わせてなるワクチン組成物、宿主をワクチン処理するのに用いる本発明に 係る組換え型ミコバクテリアおよびワクチンの製造における本発明に係る組換え 型ミコバクテリアの使用を提供するものである。

本発明を次の実施例を引用して説明する。

実施例１ ビー・ファルシパラム（Ｐ　、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサーカムスポロゾイ ト蛋白質を発現するプラスミドｐＮＩＶ２１１９　（アミノ酸１８−３９１）ｐ ＡＬ８　（図１）は、ビー・ギキュエル（Ｂ　、　Ｇ　１ｃｑｕｅｌ）によりパ リのパスツール研究所（ｔｈｅ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ）で構築さ れたシャトルベクターである。

（Ｕｎｉｔ！　ｄｅ　Ｇｅｎ１ｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅ、　２８　 ｒｕｅ　ｄｕ　Ｄｒ、　Ｒｏｕｘ、　Ｆ−７５７２４Ｐａｒ奄刀A　Ｃｅｄｅｘ 　１５） それは、独特（ｕｎｉｑｕｅ）　Ｋｐｎ１部位を介して直鎖状とされたプラスミ ドｐＴＺ１９Ｒ（ファーマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）から購入したアンピシ リン耐性遺伝子と複製開始点を含有するイー・コリ（旦コ旦■）プラスミド）を 、その独特ＫｐｎＩ制限部位（ラウザー（Ｒａｕｚｉｅｒ）らによって公表され たｐＡＬ５０００配列の１９８３位）に挿入したエム・フォーチュイタム（Ｍ、 　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）　ｐ　Ａ　Ｌ　５０００プラスミドからなる。さらには 、Ｋａｎ’耐性遺伝子（Ｔｎ９０３から）を、ＰｓｔＩ断片としてｐＵＣ４Ｋ　 （ファーマンアから購入）から単離し、ｐＴＺ１９Ｒ独特（ｂ）プラスミドｐＮ ＩＶ２１１６ （１）プラスミドｐＲＩＢ１０００　（トーレ（Ｔｈｏｌｅ）　ら、１９８５お よびトーレら、１９８７）からの平滑なＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＵｃ１ ９　（ヤニツシューペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｏｅｒｒｏｎ）中にてサブクロー ンし、ＨｉｎｄＩＩで切断し、ｐＲＩＢ−ｐＵＣと称する中間構築物を得た。該 Ｍ１ｕＪ−Ｂａ思Ｈ１断片はコード配列までにｐＲＩＢｌｏｏｏのＰ６４遺伝子 の５′非翻訳領域を含んでいる。

ｐＲＩＢ−ｐＴＪＣ，この断片は１１５位で開始し、Ｐ６４の第２コドンの最初 の塩基（Ｇ）およびＡＴＧで、５７９で終える。

（ｉ　１）１１２０ｂｐの５ｔｕＩ−Ｂｃｌｌ断片を、プラスモジウム・ファル シバラム（Ｐ　ｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサーカムスボロ ゾイト蛋白質をコードするｐＮＩＶ２１０４　（Ｗ０９０１０７００６）より削 り取った（ＵＳ　４７０７３５７）。この断片は、サーカムスポロゾイト蛋白質 のａ　１　ａｓｓをコードするトリプレットの第２塩基で開始し、５ｅｒ３□の 後で停止する・３９１　５ｔｏｐ　Ｂｅ１ｌ ＡＧＴ　ＴＧＡ　ＴＧＡＴＣＡ （ｉ　ｉ　ｉ）　（ｉ）および（１１）からの断片を連結し、プラスミドｐＵＬ Ｂ１２２１　（ＥＰＯ１８６６４３Ｒｅｇｉｏｎ　Ｗａｌｌｏｎｎｅ）の、Ａ、 ｖａＩと］３ａｉＨ１部位の間に導入される発現力セントを生成し、プラスミド ｐＮＩＶ、２１１６を得た。

１．２　プラスミドｐＮＩＶ２１１９とＩＩ）ＮＩＶ２１２６の製造発現カセッ トを、ＫｐｎｌおよびＰｖｕｌｌで制限することにより、１．　１　（ｂ）から のプラスミドｐＮＩＶ２１１６より単離した。この断片、ｐＵＬＢ１２２１のポ リリンカーから５個塩基（ＣＴＧＡＧ）先にあり、ａｌａ、、をコードするトリ プレットの第２の塩基で開始するサーカムスポロゾイト蛋白質遺伝子についての コード配列の後にあるｐ６４の塩基１１５〜５７９を、各々、６１４５および７ ９８６位（ｐＡＬ５０００の２０３５および３８７６位に対応する）でＥｃｏＲ ＶおよびＡｐａＩ独特制限部位の間にある１、１　（ａ）からのｐＡＬＳ中に導 入した。その結果、該発現カセットにより該プラスミドの１８４１ｂｐの非必須 断片の置換が起こり、プラスミドｐＮＩＶ２１１９（図２）およびプラスミドｐ ＮＩＶ２１２６（反対方向にて発現カセットを含有する）を得た。

１．３　エム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉ　ｓ）中のサーカムス ポロゾイト蛋白質の発現 １、　２カラ＋７）７’５スミｌ’ｐＮ　Ｉ　Ｖ２１１９およびｐＮＩＶ２１２ ６をエレクトロポレーションによりエム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａ ｔｉｓ）中に導入した。形質転換体をカナマイシンに対するその耐性に基づいて 選択した。それらは、ＥＬＩＳＡ法およびウェスタンプロット法（Ｗｅｓｔｅｒ ｎ　ｂｌｏｔ）　（チャン・ディー・ダブリュ（Ｃｈａｎ、Ｄ、Ｗ、）　：　） ウビネット（７ｏｖｂｉｎｅｔ）ら）により、発現カセットの方向がいずれであ っても、約０６％の全細胞蛋白質レベルでビー・ファル１．２からのプラスミド ｐＮＩＶ２１１９をエレクトロポレーションによりＢＣＧ中に導入した。形質転 換体をカナマイシンに対するその耐性に基づき、およびＣ８Ｐプローブとのハイ ブリダイゼーションにより選択した。それらは、ＥＬＩＳＡ法およびウェスタン プロット法により、約０．１５％の全細胞蛋白質レベルでピー・ファルシパラム （Ｐ　、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のサーカムスボロゾイト蛋白質を発現するこ とがわかった。

実施例２ ビー・ファルシバラムの完全なサーカムスポロゾイト蛋白質を発現するプラスミ ドｐＮＩＶ２１２４およびｐＮＩＶ２１２５２．１　プ５スミＦｐＮＴＶ２１２ ４およびｐＮＴＶ２１２５（７）製造（ｉ）４５０ｂｐのＸｈｏＩ　−Ａｓｐ７ ００断片をｐＲＩＢ−ｐＵＣ（実施例１゜１（ｂ）（ｉ））から削り取った。こ の断片は１１５位で開始し、ＡＴＧより８塩基上流の５６７で終える。それを以 下の配列を有する合成断片（９０００９／９００１０）に連結した。

Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｅ’ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＡｌａＴＣＴ　 ＴＣＣＴＴＴ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＣＣＴＡＧＡ　ＡＧＧ　Ａ ｊ頃ＡＡＴ　ＡＡＡ　Ｃ触ＣＴＣＣＧＧ　Ａ　ＡＧＣＴｔｕＩ そしてｐＢＲ３２２からのレプリコンがｐＵｃ１９のものと置換されてζ＼るｐ ＵＬＢ１２２１の誘導体をｐＮＩｖ１０３のＸｈＯ１部位に挿入し、ｐ　Ｎ　Ｉ 　Ｖ　２２２３を得た。

その合成断片は、Ｐ６４プロモーターの８最終塩基の先にあるＣ３Ｐのａａ１〜 １８をコードする。ａａ１７とａａ１８を重ねているＳｔυ１部位はＸｈｏ　Ｉ 　Ｉ＝み出し末端の直後にある。

（ｉ　１）Ｓｔｕｌ−ＤｄｅＩ断片をｐＮＴＶ２１０７　（Ｗ０９０１０７００ ６）力）ら単離した。この断片はＡ１ａ１８をコードするトリブレ・ノドの第２ の塩基で開始し、Ｃ８Ｐの本来の停止（ＴＡＧ）コドンの下流にある１７塩基で 終わる。そのｐｄｅＩ末端を平滑にした後、この断片をｐＮＩＶ２２２３の５ｔ ｕＩ部位中１＝挿入し、ｐＮＩＶ２１２３を得た（図３ａ）。すなわち、このプ ラスミドは、ｐ６４プロモーターおよびシャイン・ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ− Ｄａｌｇａｒｎｏｓｅｑｕｅｎｃｅ）　（１１５〜５７５位）と、つづいて完全 なＣ８Ｐをコードする配列とからなる発現力セントを含有する。

Ｃｉ　ｉ　ｉ）該発現カセットをＰｖｕ　Ｉ　Ｉ　−Ｍｓｃ　Ｉ断片としてｐＮ ｒＶ２１２３から削り取り、平滑なＡｐａｌとＥｃｏＲＶ部位の間のｐＡＬＳ中 に挿入し、その結果、ｐＮＩＶ２１２４およびｐＮＩＶ２１２５　（発現カセ・ ｙトが反対言回である）を得た（図３ｂ）。

’）　’）　工り、−７Ｊグマテイス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）中の完全な Ｃ３Ｐの発現＋−一 プラスミドｐＮＩＶ２１２４をエム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉ ｓ）細胞中にエレクトロポレーション処理に付し、組換え型コロニーをカナマイ シンに対するその耐性に基づいて選択した。それらはＥＬＩＳＡ法およびウェス タンプロット法により、約０．３％の全細胞蛋白質でＣ８Ｐを発現することがわ かった。

２．３ＢＣＧ中の完全なｃｓｐの発現 プラスミドｐＮＩＶ２１２４をＢＣＧ中にエレクトロポレーション処理に付し、 組換え型コロニーをカナマイシンに対するその耐性に基づき、およびＣ８Ｐプロ ーブとのハイブリダイゼーションにより選択した。それらは約０．０１％の全細 胞蛋白質でピー・ファルシパラム（Ｐ　、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の完全なサ ーカムスポロゾイト蛋白質を発現することがわかった。

プラスミドｐＮＩＶ２１２０およびｐＮＩＶ２１２１の構築ハ、ｐＲＩＢ−ｐＵ Ｃから削り取ったＰ６４遺伝子の５°非翻訳領域の断片が、５６７位で終了する ＸｈｏＩ　−Ａｓｐ７００断片であることを除いて、実施例１のｐＮＩＶ２１１ ９の構築と同じであった。この断片は合成オリゴヌクレオチドの後にあり、ＡＴ ＧＧ（５７９位）までの完全な配列を復元する。本来の配列と得られた配列との 違いは、５７５位のＡＴＧのＡの直前にあるＡの代わりにＣがある、すなわち都 合のよいＮｃｏＩ制限部位を導入しであるだけである。該合成断片の配列は以下 のとおりである： ５’ＡＣＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧ３’ ３’ＴＧＡＡＧＣＣＧＴＡＣＣ５゜ ＸｈｏＩ　−Ａｓｐ７００断片および合成断片をまずｐＮＩＶ１０３のＸｈｏＩ およびＭｓｃ１部位の間に挿入した。

得られたプラスミドｐＮＩＶ２２２１　（図４）をＡｓｐ７００の復元、Ｎｃｏ Ｉの存在およびＭｓｃＴの復元について試験した。サーカムスポロゾイト蛋白質 をコードする５ｔｕｌ−ＢｃｌＩ断片を、ＭｓｃｌとＢａｍＨＩの間のプラスミ ドｐＮｒＶ２２２１に挿入した。・°フいで、完全な発現カセットを、（Ａｌａ １８残基で開始するＣ３Ｐ分子をコードする）　Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ　−Ａｓｐ７１ ８断片として、前記の１４．２に記載されているようにＡｐａＩとＥ　ｃｏ　Ｒ ，Ｖの間にあるｐＡＬＳ中に移した。両方向の発現カセットを有するプラスミド （ｐＮＩＶ２１２０　（図５）およびｐＮＩＶ２１２１）を得た。

プラスミドｐＮＩＶ２１２０をエム・スメグマティス（Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｌ ｓ）中ニエレクトロポレーション処理に付し、それはｐＮＩＶ２１１９およびｐ 　Ｎ　Ｉ　Ｖ　２１２５で得られるのと同じレベルでＣ８Ｐの発現を支配するこ とがわかった。

３．３　ＢＣＧ中のサーカムスポロゾイト蛋白質の発現プラスミドｐＮＩＶ２１ ２０をＢＣＧ中にエレクトロポレーション処理に付した。形質転換体をカナマイ シンに対するその耐性に基づいて選択した。それらはＥＬＩ　ＳＡ法およびウェ スタンプロット法によりｐＮｒＶ２１１９およびｐＮＩＶ２１２５で得られるの と同じレベルでＣ８Ｐを発現することがわかった。

実施例４ 融和プラスミドｐＮＴＶ２１４１からのピー・ファルンバラム（Ｐ　、　ｆａｌ ｃｉｐａｒｕの）の完全なサーカムスポロゾイト蛋白質の発現４１　プラスミド ｐＮＩＶ２１４１の構築ａ）プラスミドｐＮＩＶ２２０３は、オルニチン・カル バモイル・トランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有するＢＣＧＤＮＡの２ ３２０ｂｐゲノム断片を含むｐＵｃ１９ベースプラスミドである。このプラスミ ドを、ｐｏＴｃからの平滑なＮｄｅｌ−ＢｇｌＪ　１断片をｐＵｃ１９のＨｉｎ ｄ１１部位中にサブクローンすることにより構築した。ｐｏＴｃ自体は、５ａｕ ３Ａを部分的に消化したＢＣＧＤＮＡをｐＡＳＩのＢａｍＨ１部位に挿入するこ とにより構築したゲノムライブラリーのＤＮＡにより、タラベール（Ｃｒａｂｅ ｅｌンら（ジン（Ｇｅｎｅ）５．　２０７−２３１．１９７９）に記載の○ＴＣ フイナスイー・コリ菌株（ＯＴＣｍ１ｎｕｓ　Ｅｃｏｌｉ　５ｔｒａｉｎ）の相 補により選択した。

ｂ）ｐＮＩＶ２１４１　（図６ｉＨｔ）　は、ｐＵＣ４Ｋ　（７７ｖ’ｚ７）　 がら０）Ｈｉｎｄｌｌ断片として単離したに、　ａ　ｎ　ＲカセットおよびｐＮ ＩＶ２１２３からのＰｖｕ　Ｉ　Ｉ−Ｍｓｃｌ断片として単離したＰ６４−Ｃ３ Ｐｓ”″ａ゛カセットを、ｐＮＩＶ２２０３のＯＴ　Ｃａｓｅコード配列中の独 特の平滑なＸｈｏｌ制限部制限部連中することにより構築した。

４．２　ＢＣＧ中のサーカムスポロゾイト蛋白質の発現プラスミドｐＮＩＶ２１ ４１をエレクトロポレーションによりＢＣＧ中に導入した。形質転換体をカナマ イシンに対するその耐性に基づき、Ｃ８Ｐプローブとのハイブリダイゼーソヨン により選択した。それらはＥＬＩ　ＳＡ法およびウェスタンプロット法により、 ピー・ファルンパラム（Ｐ　、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｏ＋）のサーカムスポロゾ イト蛋白質を発現することがわかった。プラスミドｐＮＩＶ２１４１は、サザー ン・プロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）により異 種の組み換えによるＢＣＧゲノム中に組み込まれていることがわかった。

プラスミドｐＡＬ８ −　ｐＡＬ５０００からのベクター配列■■■　ｐＴＺ１９Ｒからのベクター配 列２２２２　ｐＡＬ５００００ＲＦ３ ＥＳＸＪ　ｐＡＬ５００００ＲＦ４ Ｋａｎ’　カナマイシン耐性遺伝子 Ａｍｐ’　アンピンリン耐性遺伝子 盈ｌ プラスミドｐＮｒＶ２１１９ ｐＰ６４−　ｐＵＬＢ１２２１のポリリンカーから５個塩基先にあるエム・ボＣ ３Ｐ−ａｌａ、８をコードするトリブレットの第２の塩基で開始し、ｐＮＩＶ１ ０３のポリリンカーからＴＧＡＴＣＣＡＴＧ後にあるＴＡＧ停止コドンの後にあ るｓ　ｅ　ｔ３９．で終えるピー・ファルシバラム（Ｐ　、　ｆａｌｃｉｐａｒ ｕｍ）サーカムスポロゾイト蛋白質についてのコード配列 他の特記は図１と同じである。

図３ａおよびｂ プラスミドｐＮＩＶ２１２３．２１２４および２１２５の製造Ｐ５４−　！ム− ボビ７．　（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）　ＢＣＧ６４ｋＤ遺伝子のヌクレオチド１１５− ５６７ オリゴ（ネクレオチド）−合成オリゴヌクレオチド９０００９／９００１０Ｃ３ Ｐ　ａｌａ＋ａをコードするトリブレットの第２の塩基で開始し、蛋白質の本来 の停止コドン（ＴＡＧ）の下流にある１７塩基で終了するピー・ファルンパラム （Ｐ　、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）サーカムスポロゾイト蛋白質についてのコー ド配列 Ｃ３Ｐｓ″ａ゛−ピー−７フルンバラム（Ｐ　、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の完 全な（アミノ酸１〜４１２）サーカムスポロゾイト蛋白質についてのコード配列 図４ プラスミドｐＮＩＶ２２２１ ０ＲＩ−ｐＵｃ１９からのレブリーン Ｐ５４−ｘム・ホビス（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ６４ｋＤ遺伝子のヌクレオチ ド１１５−５６７ 合成断片−５’、ＡＣＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧ３′３°ＴＧＡＡＧＣＣＧＴ、ＡＣ Ｃ５’ 里旦 プラスミドｐＮＩＶ２１２０ Ｐ６４−　ｐＵＬＢ１２２１のポリリンカーから５個塩基先にあり、５７５位で Ｃ＠育するエム・ボビス（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ６４ｋＤ遺伝子のヌクレオ チド１１５−５７９ ＣＳＰ　ａｌａ＋ａをコードするトリブレットの第２の塩基で開始し、ｐＮＩＶ １０３のポリリンカーから始まる２個のＴＧＡ停止コドンおよび配列ＴＣＣＡＴ Ｇの後のｓ　ｅ　ｔ３ｇ、で終了するピー・ファルシバラム（Ｐ　、　ｆａｌｃ ｉｐａｒｕｍ）サーカムスポロゾイト蛋白質についてのコード配列 界旦 プラスミドｐＮＩＶ２１４１の製造 Ｐ６４−　ｐＵＬＢ１２２１のポリリンカーがら５個塩基先にあるエム・ボ〜４ １２）サーカムスボロゾイト蛋白質についてのコード配列０ＴＣ−○ＴＣａｓｅ 遺伝子含有のゲノムＢＣＧ断片チャン１　ディー・ダビリュ（Ｃｈａｎ、　Ｄ　 、　Ｗ、　）、イムノアッセイ（Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ア・プラクティ カル・ガイド（Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ）　、アカデミツク・プレ ス・インコーポレイテッド（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉ　ｎｃ、　）　 １９８７コリンス、ピー・エル（Ｃｏｌｌｉｎｓ、　Ｐ、　Ｌ、）ら、ジャーナ ル・オブ・パイ口ロジダビソン、エイ・ジェイ（Ｄａｖｉｓｏｎ、　Ａ、　Ｊ　 、　）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイｏｏジーＣＪ、ｇｅｎ、　Ｖｉ ｒｏｌ、）　１９８６旦ヱ１７５９フエルガー、ジェイ・エム（Ｆ　ｅｌｇｅｒ 、　Ｊ　、　Ｍ、　）ら、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ）１９８８　６２　（６）２０７６オーブンシヨウ、ピー・ジェイ・エム（○ｐ ｅｎｓｈａｖ、　Ｐ　、　Ｊ　、　Ｍ、　）ら、ジャーナル・オブ・パイロロジ ー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）１９９０６４　（４）１６８３ラウザー、ジエイ（Ｒａ ｕｚｉｅｒ、　Ｊ、）ら、ジン（Ｇｅｎｅ）　１９８８ユ１３１５ストバー、シ ー・ケイ（Ｓ　ｔｏｖｅｒ、　Ｃ、Ｋ、　）ら、ネイチ’ｒ　（Ｎａｔｕｒｅ） 、１９９１．３５１．４５６−４６０ トーレ、ジェイ・イー・アール（Ｔｈｏｌｅ、　Ｊ　、　Ｅ、　Ｒ，）ら、（１ ９８，５）、インフェクション・アンド・イムニティ（Ｔ　ｎｆｅｃｔｉｏｎ　 ａｎｄ　Ｔ　ｏ＋ｍｕｎｉｔｙ）　１９８５旦旦トーレ、ジェイ・イー・アール （Ｔｈｏｓｅ、　Ｊ　、　Ｅ、　Ｒ，）ら、（１９８７）、インフエクンヨン・ アンド・イムニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）　１９ ８７５旦トウビン、エッチ（Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｈ，）ら、プロシーディンゲス・ オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス・ニー・ニス・エイ（Ｐ　 ｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ。

ＵＳＡ）１９７９　７６　４３５０ ヤニツシユーペロン・シー（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，）ら、ジン （Ｇｅｎｅ）　１９８国際調査報告 ＦｆｌＰＣ’ｒｆｌｌ＃ｔｌＯ１ｍ審１ｗ１ｌｕｌトＰｋｌｆｉ１１６１１１国 際調査報告 ＥＰ　９１０１３３２ Ｓ＾　４９１５５ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，”　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１００　 Ｃ８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：３４） （Ｃ１２Ｐ　２１．１００ Ｃ１２Ｒ１：３４） （７２）発明者　マツサエール、マルクベルギー国ベー−１４４０ウォティエー ルーブレーヌ、ショゼ、ドファン　図番 Ｉ （７２）発明者　ポラン、アレックス ベルギー国ベー−１７０１イッテルベツク、ガスペックストラ−トロ５番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ミコバクテリウムのゲノムに対して外因性のＤＮＡからなる組換え型ＤＮＡ であって、該ＤＮＡが蛋白質をコードし、エム・ボビス−ＢＣＧの６４ＫＤ蛋白 質のブロモ−ターおよびリポゾーム結合部位の調整下にある組換え型ＤＮＡ。 ２．請求項１に記載のＤＮＡからなる組換え型ベクター。 ３．外因性ＤＮＡをミコバクテリウムのゲノムに導入するに適当な請求項２記載 のベクター。 ４．ミコバクテリア発現ベクターである請求項２または請求項３記載のベクタ５ ．ミコバクテリアプラスミドまたはミコバクテリオファージからなる請求項４記 載のベクター。 ６．ミコバクテリアプラスミドまたはミコバクテリオファージを直鎖状とし、そ れをミコバクテリウム以外の微生物中にて複製可能な直鎖状のプラスミドまたは ファージに融合させるシャトルベクターからなる請求項５記載のベクター。 ７．プロモーターおよびリポゾーム結合部位が、ミコバクテリウム・ボビス−Ｂ ＣＧ６４ＫＤ遺伝子の断片１１５〜５７５またはその機能的誘導体からなる請求 項４〜６記載のいずれか１つのベクター。 ８．機能的誘導体が機能的プロモーターおよびリボゾーム結合部位活性を保持し ている断片１１５〜５７５の変異体または切形体である請求項７記載のベクタ９ ．外因性コードＤＮＡおよびプロモーターとリポゾーム結合部位をＯＲＦ３−Ｏ ＲＦ４の領域（塩基１５４１−３９０８）にて挿入するエム・フォーチュイタム プラスミドｐＡＬ５０００またはその複製可能な誘導体からなる請求項４〜８記 載のいずれか１つのベクター。 １０．外因性ＤＮＡが抗原をコードする請求項２〜９記載のいずれか１つのベク ター。 １１．抗原がブラスモジウム・サーカムスポロゾイト蛋白質である請求項１０記 載のベクター。 １２．請求項２〜１１記載のいずれか１つのベクターで形質転換された組換え型 ミコバクテリウム。 １３．エム・スメグマティス、エム・ポビス−ＢＣＧ、エム・アビウム、エム・ フレイ、エム・フォーチュイタム、エム・ルツー、エム・バーチューバキニロシ ス、エム・ハバナ、エム・スクロフラセウムおよびエム・インターセルラーから なる群より選択される請求項１２記載の組換え型ミコバクテリウム。 １４．エム・ポビス−ＢＣＧである請求項１３記載の組換え型ミコバクテリウム 。 １５．適当な条件下、ミコバクチリウムを請求項２〜１１記載のいずれか１つの 組換え型ベクターで形質転換することを特徴とする組換え型ミコバクテリウムの 製法。 １６．外因性ＤＮＡを請求項１２〜１４記載のいずれか１つの組換え型ミコバク テリウム中にて発現させることからなる、ミコバクテリウムのゲノムに対して外 因性のＤＮＡによりコードされた蛋白質の製法。 １７．組換え型ミコバクテリウムがエム・スメグマティスである請求項１６記載 の方法。 １８．請求項１２〜１４記載のいずれか１つの組換え型ミコバクテリウムと、医 薬上許容される担体とからなるワクチン組成物。 １９．ヒトまたは動物をワクチン処理するのに用いる請求項１２〜１４記載のい ずれか１つの組換え型ミコバクテリウム。 ２０．宿主を有効量の請求項１８記載のワクチン組成物でワクチン処理すること からなる宿主における予防免疫性の誘導方法。