JP3485916B2 - 組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用 - Google Patents
組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
背景
免疫化
外来抗原(例えば、病原体または毒素)に対する免疫
性は、受動転移または活性誘発により提供することがで
きる。前者の場合において、外来病原体に対する抗体を
個体に注射し、その結果短時間の保護が与えられる。後
者の場合において、無害(無毒)の形態、病原体の成
分、または毒素の変性した形態(すなわち、トキソイ
ド)は個体の免疫系を刺激し、長時間の保護を与える。
性は、受動転移または活性誘発により提供することがで
きる。前者の場合において、外来病原体に対する抗体を
個体に注射し、その結果短時間の保護が与えられる。後
者の場合において、無害(無毒)の形態、病原体の成
分、または毒素の変性した形態(すなわち、トキソイ
ド)は個体の免疫系を刺激し、長時間の保護を与える。
活性免疫性は、個体の免疫系が競合的であるかぎり、
適当な抗原を使用して免疫系を刺激することによって誘
発することができる。例えば、この方法において無毒の
または弱毒化した形態の病原体を使用する免疫化(ワク
チン接種)は直ちの免疫応答、ならびに免疫学的「メモ
リー」を生じ、こうして長期間の保護を同様によく与え
る。一般に、ワクチンは不活性化した、非病原性または
弱毒化した形態の病原体または感染性因子を包含し、こ
れは病原体の抗原決定基を包含し、こうして免疫応答誘
発する。同様に、毒素は、微生物、植物および動物によ
り産生される抗原性物質であり、トキソイドに変換する
ことができる;こうして、それらは修飾して、それらの
毒性を破壊するが、それらの抗原性を保持しそして、結
局、抗毒素抗体の産生を刺激しかつ活性な免疫性を産生
するそれらの能力を保持する。このようなトキソイドは
毒性に対するワクチンのために使用することができる。
適当な抗原を使用して免疫系を刺激することによって誘
発することができる。例えば、この方法において無毒の
または弱毒化した形態の病原体を使用する免疫化(ワク
チン接種)は直ちの免疫応答、ならびに免疫学的「メモ
リー」を生じ、こうして長期間の保護を同様によく与え
る。一般に、ワクチンは不活性化した、非病原性または
弱毒化した形態の病原体または感染性因子を包含し、こ
れは病原体の抗原決定基を包含し、こうして免疫応答誘
発する。同様に、毒素は、微生物、植物および動物によ
り産生される抗原性物質であり、トキソイドに変換する
ことができる;こうして、それらは修飾して、それらの
毒性を破壊するが、それらの抗原性を保持しそして、結
局、抗毒素抗体の産生を刺激しかつ活性な免疫性を産生
するそれらの能力を保持する。このようなトキソイドは
毒性に対するワクチンのために使用することができる。
両者の場合において、変更した形態の感染性病原体の
投与による免疫応答の刺激を含むこと、およびトキソイ
ドの投与を含むこと−−現在利用可能な手順−−は、一
般に有効であるが、ワクチン接種から生ずる副作用およ
び死亡が起こることが知られている。
投与による免疫応答の刺激を含むこと、およびトキソイ
ドの投与を含むこと−−現在利用可能な手順−−は、一
般に有効であるが、ワクチン接種から生ずる副作用およ
び死亡が起こることが知られている。
安全なワクチンは、病原体の抗原決定基および遺伝子
工学/組み換えDNA技術のより良い知識の応用により、
現在開発されている。例えば、免疫応答を引き出すこと
が知られているタンパク質抗原の1成分(例えば、抗原
決定基)であるポリペプチドをつくることができる(例
えば、化学的合成または問題のポリペプチドをエンコー
ドするDNAの発現により)。宿主へのポリペプチドの投
与により、抗原決定基に対する宿主による免疫応答が起
こる。このようなポリペプチドの使用は、生ワクチンま
たは弱毒化ワクチンの使用に伴う感染の危険を伴わな
い。
工学/組み換えDNA技術のより良い知識の応用により、
現在開発されている。例えば、免疫応答を引き出すこと
が知られているタンパク質抗原の1成分(例えば、抗原
決定基)であるポリペプチドをつくることができる(例
えば、化学的合成または問題のポリペプチドをエンコー
ドするDNAの発現により)。宿主へのポリペプチドの投
与により、抗原決定基に対する宿主による免疫応答が起
こる。このようなポリペプチドの使用は、生ワクチンま
たは弱毒化ワクチンの使用に伴う感染の危険を伴わな
い。
免疫化(ワクチンの投与)は普通の普及した手順であ
り、そして使用するワクチンは本質的に「活性な免疫学
的予防を意図する調製物」であり、ビルレント菌株の殺
した微生物、弱毒化菌株の生きている微生物、および微
生物、菌・かび、植物、原生動物または後生動物の誘導
体または産生物の調製物を包含する。ステッドマンの図
解医学辞典(Stedman's Illustrates Medical Dicti
onary)(第24版)、Williams & Wilkins、Baltimor
e、p.1526(1982)。多くの場合において、ワクチンは
1より多い回数で投与して、有効な保護を誘発しなくて
はならない;例えば、抗毒素ワクチンは多数回の投与で
与えなくてはならない。
り、そして使用するワクチンは本質的に「活性な免疫学
的予防を意図する調製物」であり、ビルレント菌株の殺
した微生物、弱毒化菌株の生きている微生物、および微
生物、菌・かび、植物、原生動物または後生動物の誘導
体または産生物の調製物を包含する。ステッドマンの図
解医学辞典(Stedman's Illustrates Medical Dicti
onary)(第24版)、Williams & Wilkins、Baltimor
e、p.1526(1982)。多くの場合において、ワクチンは
1より多い回数で投与して、有効な保護を誘発しなくて
はならない;例えば、抗毒素ワクチンは多数回の投与で
与えなくてはならない。
子供のワクチン接種は平凡であり、そして一般に発展
した国において成功しており、ここで健康のサービスを
容易にえられ、そして多数回の免疫化(例えば、多数の
病原体に対する免疫化および単一の病原体に対する系統
的または多数の免疫化)は可能である。発展途上国にお
いて、ワクチン接種は極めて希であり、そしてさらにい
っそう問題を生ずる。例えば、発展途上国において毎年
生まれた100×106人の子供の約20%にのみが、ジフテリ
ア、百日咳、破傷風、はしか、ポリオおよび結核に対し
てワクチンされる。毎年、発展途上国において5×106
人の子供および他の5×106人の子供はこれらの病気に
より生理学的にまたは精神的に不能となり、これは適切
な免疫化が可能である場合、予防することができるであ
ろう。単一の投与で長期間の免疫性を与えることができ
る有効なワクチンの入手可能性は、もちろん、発展した
国および発展途上国の両者において価値があるであろ
う。
した国において成功しており、ここで健康のサービスを
容易にえられ、そして多数回の免疫化(例えば、多数の
病原体に対する免疫化および単一の病原体に対する系統
的または多数の免疫化)は可能である。発展途上国にお
いて、ワクチン接種は極めて希であり、そしてさらにい
っそう問題を生ずる。例えば、発展途上国において毎年
生まれた100×106人の子供の約20%にのみが、ジフテリ
ア、百日咳、破傷風、はしか、ポリオおよび結核に対し
てワクチンされる。毎年、発展途上国において5×106
人の子供および他の5×106人の子供はこれらの病気に
より生理学的にまたは精神的に不能となり、これは適切
な免疫化が可能である場合、予防することができるであ
ろう。単一の投与で長期間の免疫性を与えることができ
る有効なワクチンの入手可能性は、もちろん、発展した
国および発展途上国の両者において価値があるであろ
う。
大人のワクチン接種は、また、大人における多数の病
気の予防において有効でありそして、子供の場合におけ
るように、発展途上国において、とくに多数の免疫化が
必要である場合、実施が困難であることが証明された。
病気、なかでも、例えば、らい、マラリア、結核および
ポリオは、大人の間で、アフリカ、アジアおよびラテン
アメリカにおいて高い発生率を有し、そして毎年数千人
の死亡の原因である。
気の予防において有効でありそして、子供の場合におけ
るように、発展途上国において、とくに多数の免疫化が
必要である場合、実施が困難であることが証明された。
病気、なかでも、例えば、らい、マラリア、結核および
ポリオは、大人の間で、アフリカ、アジアおよびラテン
アメリカにおいて高い発生率を有し、そして毎年数千人
の死亡の原因である。
多くの努力が主要な病気に対するワクチンの開発にお
いて消費されておりそして、最近、外来遺伝子を発現す
るために組み換えワクチンのベヒクル(例えば、遺伝子
工学したウイルス)が考慮されてきている。例えば、ウ
イルスの抗原がワクシニアウイルスの中に挿入された、
組み換えワクシニアウイルスが開発された。例えば、B
型肝炎の遺伝子、インフルエンザウイルスの遺伝子また
は狂犬病ウイルスをエンコードするDNAは、ワクチンを
つくる努力において、ワクシニアウイルスのDNAにスプ
ライシングされてきている。パニカリ(Panicali)、D.
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA、
80、5364−5368(1983);オール(Orr)、T.、遺伝子
工学のニュース(Genetic Engineering News)、p.17
(1985年3月);パオレッチ(Paoletti)、E.およびD.
パニカリ(Panicali)、米国特許第4,603,112号。
いて消費されておりそして、最近、外来遺伝子を発現す
るために組み換えワクチンのベヒクル(例えば、遺伝子
工学したウイルス)が考慮されてきている。例えば、ウ
イルスの抗原がワクシニアウイルスの中に挿入された、
組み換えワクシニアウイルスが開発された。例えば、B
型肝炎の遺伝子、インフルエンザウイルスの遺伝子また
は狂犬病ウイルスをエンコードするDNAは、ワクチンを
つくる努力において、ワクシニアウイルスのDNAにスプ
ライシングされてきている。パニカリ(Panicali)、D.
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA、
80、5364−5368(1983);オール(Orr)、T.、遺伝子
工学のニュース(Genetic Engineering News)、p.17
(1985年3月);パオレッチ(Paoletti)、E.およびD.
パニカリ(Panicali)、米国特許第4,603,112号。
しかしながら、このような組み換えワクシニアウイル
スはワクチンとして少なくとも2つの重要欠点有するで
あろうことが広く認められている。第1に、処置不可能
な、ワクシニアウイルスに関連する、有意な致死率およ
び罹患率(1:100,000)が存在する。第2に、ワクシニ
アウイルスに前に暴露した個体の組み換えワクシニアを
使用するワクチン接種は、しばしば、満足すべき免疫化
レベルを生成することができなかった。フェンナー(Fe
nner)、F.、ワクチンの開発に対する新規なアプローチ
(New Approch to Vaccine Development)、R.ベル
(Bell)およびG.トリギアニ(Torrigiani)(編)、Sc
hwabe & Co.、p.187(1984)。
スはワクチンとして少なくとも2つの重要欠点有するで
あろうことが広く認められている。第1に、処置不可能
な、ワクシニアウイルスに関連する、有意な致死率およ
び罹患率(1:100,000)が存在する。第2に、ワクシニ
アウイルスに前に暴露した個体の組み換えワクシニアを
使用するワクチン接種は、しばしば、満足すべき免疫化
レベルを生成することができなかった。フェンナー(Fe
nner)、F.、ワクチンの開発に対する新規なアプローチ
(New Approch to Vaccine Development)、R.ベル
(Bell)およびG.トリギアニ(Torrigiani)(編)、Sc
hwabe & Co.、p.187(1984)。
今日まで、所定の病原体に対して免疫性を誘発すると
き多くの場合において有効であるが、1より多い回数で
投与しなくてはならなず、そして病原体に対して、長期
間の基準で、保護を提供することができるワクチンが開
発された。さらに、多くの場合(例えば、らい、マラリ
アなど)において、有効なワクチンはなお開発しなくて
はならない。
き多くの場合において有効であるが、1より多い回数で
投与しなくてはならなず、そして病原体に対して、長期
間の基準で、保護を提供することができるワクチンが開
発された。さらに、多くの場合(例えば、らい、マラリ
アなど)において、有効なワクチンはなお開発しなくて
はならない。
マイコバクテリア
マイコバクテリアは人間および動物の主要な病原体を
表す。例えば、結核は、一般に、ヒトにおいてヒト結核
菌(Mycobacterium(M.)tuberculosis)によりそして
畜牛においてウシ結核菌(Mycobacterium(M.)bovis)
−BCG(これはヒトおよび結核を引き起こす他の動物に
伝播することがある)により引き起こされる。結核は広
く広がったままであり、そしてとくに発展途上国におい
て、重要な公衆の健康の問題である。結核の世界中の広
がりはほぼ10×106の場合が存在し、毎年の致死は3×1
06であると推定される。結核に対するジョイント・イン
ターナショナル・ユニオンおよび世界の健康の機構の研
究グループ(Joint International Against Tubercu
losis and World Health Organization Study Gr
oup)、Tubercle、63:157−169(1982)。
表す。例えば、結核は、一般に、ヒトにおいてヒト結核
菌(Mycobacterium(M.)tuberculosis)によりそして
畜牛においてウシ結核菌(Mycobacterium(M.)bovis)
−BCG(これはヒトおよび結核を引き起こす他の動物に
伝播することがある)により引き起こされる。結核は広
く広がったままであり、そしてとくに発展途上国におい
て、重要な公衆の健康の問題である。結核の世界中の広
がりはほぼ10×106の場合が存在し、毎年の致死は3×1
06であると推定される。結核に対するジョイント・イン
ターナショナル・ユニオンおよび世界の健康の機構の研
究グループ(Joint International Against Tubercu
losis and World Health Organization Study Gr
oup)、Tubercle、63:157−169(1982)。
らいは、らい菌(M.leprae)により引き起こされ、主
として発展途上国において、10×106人を越える人々を
犯す。ブルーム(Bloom)、B.R.およびT.ゴウダル(God
al)、伝染病の外観(Review of Infectious Doseas
es)、5:657−679(1984)。ヒト結核菌(M.tuberculo
sis)およびアビウム−イントラセルラレ−スクロフラ
セウム(avium−intracellulare−scrofulaceum)(MAI
S)群は、後天性免疫欠損病(AIDS)をもつ患者の主要
な日和見病原体を表す。病気の制御のセンター(Center
s for Disease)、罹患率および致死率のウィークリ
ー・リポート(Morbidity and Mortality Weekly R
eport)、34:774(1986)。マイコバクテリア・シュー
ドチューバクロシス(M.pseudotuberculosis)は畜牛の
主要な病原体である。
として発展途上国において、10×106人を越える人々を
犯す。ブルーム(Bloom)、B.R.およびT.ゴウダル(God
al)、伝染病の外観(Review of Infectious Doseas
es)、5:657−679(1984)。ヒト結核菌(M.tuberculo
sis)およびアビウム−イントラセルラレ−スクロフラ
セウム(avium−intracellulare−scrofulaceum)(MAI
S)群は、後天性免疫欠損病(AIDS)をもつ患者の主要
な日和見病原体を表す。病気の制御のセンター(Center
s for Disease)、罹患率および致死率のウィークリ
ー・リポート(Morbidity and Mortality Weekly R
eport)、34:774(1986)。マイコバクテリア・シュー
ドチューバクロシス(M.pseudotuberculosis)は畜牛の
主要な病原体である。
他方において、バシレ・カルメッテ−グエリン(Baci
lle Calmette−Guerin)(BCG)、ウシ結核菌(M.bovi
s)のビルレントは、世界における最も広く使用されて
いるヒトのワクチンであり、そして50年より多い間生ワ
クチンとして使用されてきている。過去35年において、
それは2.5×109人を越える人々に投与されてきており、
悪影響は顕著に少ない(例えば、60/109の推定された致
死率)。BCGは、多数の研究において、結核に対して保
護的効能有することが発見された。しかしながら、最
近、南インドにおいて肺結核の予防において有効である
ことは発見されなかった。結核の予防の実験(Tubercul
osis Prevention Trial)、マドラス(Madras)、イ
ンディアン・ジャーナル・オブ・メディカル・リサーチ
(Indian Journal of Medical Reseach)、72(sup
pl.):1−7(1980)。
lle Calmette−Guerin)(BCG)、ウシ結核菌(M.bovi
s)のビルレントは、世界における最も広く使用されて
いるヒトのワクチンであり、そして50年より多い間生ワ
クチンとして使用されてきている。過去35年において、
それは2.5×109人を越える人々に投与されてきており、
悪影響は顕著に少ない(例えば、60/109の推定された致
死率)。BCGは、多数の研究において、結核に対して保
護的効能有することが発見された。しかしながら、最
近、南インドにおいて肺結核の予防において有効である
ことは発見されなかった。結核の予防の実験(Tubercul
osis Prevention Trial)、マドラス(Madras)、イ
ンディアン・ジャーナル・オブ・メディカル・リサーチ
(Indian Journal of Medical Reseach)、72(sup
pl.):1−7(1980)。
こうして、BCGを包含する、多数の入手可能なワクチ
ンが存在するが、多くは、制限された応答を誘発するの
で、価値において制限され、多数回の投与で与えなくて
はならないおよび/または悪い副作用有する。他の場合
(例えば、らい、マラリア)において、ワクチンは簡単
に入手可能ではない。悪影響を及ぼさないで問題の1ま
た2以上の病原体に対する保護を提供するために十分な
免疫性を受容体において長期間刺激する、前記病原体に
対するワクチンが入手可能である場合、大きい価値があ
るであろう。
ンが存在するが、多くは、制限された応答を誘発するの
で、価値において制限され、多数回の投与で与えなくて
はならないおよび/または悪い副作用有する。他の場合
(例えば、らい、マラリア)において、ワクチンは簡単
に入手可能ではない。悪影響を及ぼさないで問題の1ま
た2以上の病原体に対する保護を提供するために十分な
免疫性を受容体において長期間刺激する、前記病原体に
対するワクチンが入手可能である場合、大きい価値があ
るであろう。
発明の説明
本発明は、遺伝子操作技術を使用して、マイコバクテ
リアの中に組み込まれた問題のDNA(ここでそれはマイ
コバクテリアのゲノムの中に存在する)を発現する、遺
伝子的に組み換え(遺伝子操作された)培養可能なマイ
コバクテリア;問題のDNAをマイコバクテリアの中に導
入するために有用なベクター;マイコバクテリアの中に
DNAを導入する方法、およびマイコバクテリアのゲノム
の中にDNAを組み込んで遺伝子的組み換えマイコバクテ
リアを産生する方法に関する。本発明は、さらに、1ま
たは2以上のシャトルプラスミドである、遺伝子操作し
たシャトルベクターによりマイコバクテリアの異なる属
の間で遺伝子物質を転移する方法に関する。これらのシ
ャトルベクターは、また、本発明の主題であり、マイコ
バクテリアの異なる族の間の遺伝子物質の転移およびマ
イコバクテリアの中への問題のDNAの導入に有用であ
る。
リアの中に組み込まれた問題のDNA(ここでそれはマイ
コバクテリアのゲノムの中に存在する)を発現する、遺
伝子的に組み換え(遺伝子操作された)培養可能なマイ
コバクテリア;問題のDNAをマイコバクテリアの中に導
入するために有用なベクター;マイコバクテリアの中に
DNAを導入する方法、およびマイコバクテリアのゲノム
の中にDNAを組み込んで遺伝子的組み換えマイコバクテ
リアを産生する方法に関する。本発明は、さらに、1ま
たは2以上のシャトルプラスミドである、遺伝子操作し
たシャトルベクターによりマイコバクテリアの異なる属
の間で遺伝子物質を転移する方法に関する。これらのシ
ャトルベクターは、また、本発明の主題であり、マイコ
バクテリアの異なる族の間の遺伝子物質の転移およびマ
イコバクテリアの中への問題のDNAの導入に有用であ
る。
本発明の組み換えDNAベクターは、2つの型をもつ:
テンペレートシャトルプラスミドおよびバクテリア−マ
イコバクテリアのシャトルプラスミド(例えば、E.coli
−マイコバクテリアシャトルプラスミド)。組み換えベ
クターの各型は問題のDNAをマイコバクテリアの中に安
定に導入することができ、ここでDNAを次いで発現する
ことができる。問題のDNAを含む、テンペレートシャト
ルプラスミドの場合において、マイコバクテリアの染色
体またはゲノムの中への安定な組み込みは部位特異的組
み込みを経て起こる。問題のDNAは染色体のDNAの一部分
として複製される。問題のDNAを含む、バクテリア−マ
イコバクテリアのシャトルプラスミドの場合において、
問題のDNAはプラスミドとして染色体外に安定に維持さ
れる(プラスミドの1成分として)。問題のDNAの発現
はプラスミドとして染色体外で起こる(例えば、エピソ
ーム的に)。例えば、問題の1または2以上の遺伝子は
バクテリア−マイコバクテリアのプラスミドの中にクロ
ーニングされ、そして培養可能なマイコバクテリアの中
に導入され、ここでそれはエピソームの複製(染色体外
の複製)を行う。本発明の方法に従い、組み換えプラス
ミドを使用して、問題のDNAをマイコバクテリアの細胞
の中に導入し、そしてDNAをマイコバクテリアのゲノム
の中に組み込む。使用する組み換えプラスミドは、次の
ものを包含する:1)相同性の組み換え(プラスミドを有
する配列とマイコバクテリアのゲノム中の配列間)を起
こすために必要なマイコバクテリアの配列(プラスミド
を有するマイコバクテリアの配列と呼ぶ);2)E.coli中
の複製および選択に必要なDNA配列;および3)問題のD
NA(例えば、選択可能なマーカーをエンコードするDNA
および問題のタンパク質またはポリペプチドをエンコー
ドするDNA)。組み換えプラスミドは、既知の技術を使
用して、マイコバクテリアの細胞の中に導入する。プラ
スミド中のマイコバクテリアの配列は、マイコバクテリ
アのゲノムの中に存在するものと同一であるが、相同性
組み換えを可能とするマイコバクテリアのゲノムの中に
存在するものに十分に類似する。プラスミドを有するマ
イコバクテリアのDNAの中に存在する配列の相同性およ
びマイコバクテリアのゲノムの中に存在する十分に類似
する配列の同一性の「認識」は、入る(プラスミドを有
する)マイコバクテリアのDNAの相同性領域とゲノムの
マイコバクテリアのDNAとの間の交差型およびマイコバ
クテリアのゲノム中への組み換えプラスミドの組み込み
を生ずる。組み込みは、非必須(すなわち、マイコバク
テリアの複製に必須ではない)マイコバクテリアのゲノ
ム中の選択した部位において起こる。相同性プラスミド
の配列の組み込みは、マイコバクテリアのゲノム中の問
題のDNAの組み込みを伴う。
テンペレートシャトルプラスミドおよびバクテリア−マ
イコバクテリアのシャトルプラスミド(例えば、E.coli
−マイコバクテリアシャトルプラスミド)。組み換えベ
クターの各型は問題のDNAをマイコバクテリアの中に安
定に導入することができ、ここでDNAを次いで発現する
ことができる。問題のDNAを含む、テンペレートシャト
ルプラスミドの場合において、マイコバクテリアの染色
体またはゲノムの中への安定な組み込みは部位特異的組
み込みを経て起こる。問題のDNAは染色体のDNAの一部分
として複製される。問題のDNAを含む、バクテリア−マ
イコバクテリアのシャトルプラスミドの場合において、
問題のDNAはプラスミドとして染色体外に安定に維持さ
れる(プラスミドの1成分として)。問題のDNAの発現
はプラスミドとして染色体外で起こる(例えば、エピソ
ーム的に)。例えば、問題の1または2以上の遺伝子は
バクテリア−マイコバクテリアのプラスミドの中にクロ
ーニングされ、そして培養可能なマイコバクテリアの中
に導入され、ここでそれはエピソームの複製(染色体外
の複製)を行う。本発明の方法に従い、組み換えプラス
ミドを使用して、問題のDNAをマイコバクテリアの細胞
の中に導入し、そしてDNAをマイコバクテリアのゲノム
の中に組み込む。使用する組み換えプラスミドは、次の
ものを包含する:1)相同性の組み換え(プラスミドを有
する配列とマイコバクテリアのゲノム中の配列間)を起
こすために必要なマイコバクテリアの配列(プラスミド
を有するマイコバクテリアの配列と呼ぶ);2)E.coli中
の複製および選択に必要なDNA配列;および3)問題のD
NA(例えば、選択可能なマーカーをエンコードするDNA
および問題のタンパク質またはポリペプチドをエンコー
ドするDNA)。組み換えプラスミドは、既知の技術を使
用して、マイコバクテリアの細胞の中に導入する。プラ
スミド中のマイコバクテリアの配列は、マイコバクテリ
アのゲノムの中に存在するものと同一であるが、相同性
組み換えを可能とするマイコバクテリアのゲノムの中に
存在するものに十分に類似する。プラスミドを有するマ
イコバクテリアのDNAの中に存在する配列の相同性およ
びマイコバクテリアのゲノムの中に存在する十分に類似
する配列の同一性の「認識」は、入る(プラスミドを有
する)マイコバクテリアのDNAの相同性領域とゲノムの
マイコバクテリアのDNAとの間の交差型およびマイコバ
クテリアのゲノム中への組み換えプラスミドの組み込み
を生ずる。組み込みは、非必須(すなわち、マイコバク
テリアの複製に必須ではない)マイコバクテリアのゲノ
ム中の選択した部位において起こる。相同性プラスミド
の配列の組み込みは、マイコバクテリアのゲノム中の問
題のDNAの組み込みを伴う。
本発明は、さらに、マイコバクテリアのDNAの中に組
み込まれたか、あるいはプラスミドとして染色体外に維
持される、問題のDNAを発現する組み換えマイコバクテ
リアに関する。このような組み換えマイコバクテリア
は、適当なマイコバクテリア、例えば、スメグマ菌(M.
smegmatis)、ウシ結核菌(M.bovis)−BCG、鳥結核菌
(M.avium)、チモテ菌(M.phlei)、マイコバクテリウ
ム・フォルツイツム(M.fortuitum)、マイコバクテリ
ウム・ルフ(M.lufu)、パラ結核菌(M.paratuberculos
is)、マイコバクテリウム・ハバナ(M.habana)、マイ
コバクテリウム・スクロフラセウム(M.scrofulaceum)
およびマイコバクテリウム・イントラセルラレ(M.intr
acellulare)の中に導入することによって産生すること
ができる。問題のDNAがゲノムのDNAの中に組み込まれ
る、組み換えマイコバクテリアにおいて、問題のDNAは
次のような方法で存在する:1)マイコバクテリアの遺伝
子は置換される(すなわち、マイコバクテリアのゲノム
の中にもはや存在しない)か、あるいは2)問題のDNA
はマイコバクテリアの遺伝子の中に挿入され、その結果
a)マイコバクテリアの遺伝子は完全にかつ機能的に残
るか、あるいはb)マイコバクテリアの遺伝子は崩壊し
かつ非機能的とされる。
み込まれたか、あるいはプラスミドとして染色体外に維
持される、問題のDNAを発現する組み換えマイコバクテ
リアに関する。このような組み換えマイコバクテリア
は、適当なマイコバクテリア、例えば、スメグマ菌(M.
smegmatis)、ウシ結核菌(M.bovis)−BCG、鳥結核菌
(M.avium)、チモテ菌(M.phlei)、マイコバクテリウ
ム・フォルツイツム(M.fortuitum)、マイコバクテリ
ウム・ルフ(M.lufu)、パラ結核菌(M.paratuberculos
is)、マイコバクテリウム・ハバナ(M.habana)、マイ
コバクテリウム・スクロフラセウム(M.scrofulaceum)
およびマイコバクテリウム・イントラセルラレ(M.intr
acellulare)の中に導入することによって産生すること
ができる。問題のDNAがゲノムのDNAの中に組み込まれ
る、組み換えマイコバクテリアにおいて、問題のDNAは
次のような方法で存在する:1)マイコバクテリアの遺伝
子は置換される(すなわち、マイコバクテリアのゲノム
の中にもはや存在しない)か、あるいは2)問題のDNA
はマイコバクテリアの遺伝子の中に挿入され、その結果
a)マイコバクテリアの遺伝子は完全にかつ機能的に残
るか、あるいはb)マイコバクテリアの遺伝子は崩壊し
かつ非機能的とされる。
生ず遺伝子的に組み換えのマイコバクテリア(例え
ば、組み換えBCG、組み換えスメグマ菌(M.smegmatis)
は、問題のDNAをそれにより発現することができる、ベ
ヒクルとしてとくに有用である。これらは遺伝子的に組
み換えのマイコバクテリアまたはマイコバクテリアの発
現ベヒクルと呼ぶ。このようなベヒクルは、例えば、1
または2以上の問題の病原体のための、問題のタンパク
質またはポリペプチド(または1より多いポリペプチド
またはタンパク質)、例えば、1または2以上の抗原を
発現するワクチンのベヒクルとして使用することができ
る。組み換えマイコバクテリアは、また、イムノポテン
シエイター、例えば、酵素、製剤学的剤および抗腫瘍剤
の発現のための;抗受精ワクチンのベヒクルの産生にお
いて有用なポリペプチドまたはタンパク質の発現のため
の;または免疫応答を誘導するか、あるいは自己免疫病
(例えば、慢性関節リウマチ)における耐性を誘発する
ために投与することができる、ストレスタンパク質の発
現のためのベヒクルとして使用することができる。組み
換えマイコバクテリアは、例えば、増殖阻害因子である
か、あるいは腫瘍細胞の殺細胞性である1または2以上
のタンパク質またはポリペプチド(例えば、インターフ
ェロンα、βまたはγ;インターリューキン1〜7、腫
瘍壊死因子(TNF)αまたはβ)を発現し、こうして、
ある種のヒトの癌(例えば、膀胱癌、黒色症)の処置の
ための新しい方法の基準を提供することができる。問題
の病原体は、ウイルス、微生物、または病気を引き起こ
す他の有機体または物質(例えば、毒素またはトキソイ
ド)を包含する。本発明は、また、宿主を組み換えマイ
コバクテリアでワクチン接種して、宿主の中に保護的免
疫性を引き出す方法に関する。組み換えワクチンを使用
して、体液抗体の免疫性、細胞の免疫性(ヘルパーおよ
び細胞毒性の免疫性を包含する)および/または粘膜ま
たは分泌の免疫性を生成することができる。さらに、本
発明は、組み換え培養可能なマイコバクテリウムにより
発現された抗原をワクチンまたは診断試薬として使用す
ることに関する。
ば、組み換えBCG、組み換えスメグマ菌(M.smegmatis)
は、問題のDNAをそれにより発現することができる、ベ
ヒクルとしてとくに有用である。これらは遺伝子的に組
み換えのマイコバクテリアまたはマイコバクテリアの発
現ベヒクルと呼ぶ。このようなベヒクルは、例えば、1
または2以上の問題の病原体のための、問題のタンパク
質またはポリペプチド(または1より多いポリペプチド
またはタンパク質)、例えば、1または2以上の抗原を
発現するワクチンのベヒクルとして使用することができ
る。組み換えマイコバクテリアは、また、イムノポテン
シエイター、例えば、酵素、製剤学的剤および抗腫瘍剤
の発現のための;抗受精ワクチンのベヒクルの産生にお
いて有用なポリペプチドまたはタンパク質の発現のため
の;または免疫応答を誘導するか、あるいは自己免疫病
(例えば、慢性関節リウマチ)における耐性を誘発する
ために投与することができる、ストレスタンパク質の発
現のためのベヒクルとして使用することができる。組み
換えマイコバクテリアは、例えば、増殖阻害因子である
か、あるいは腫瘍細胞の殺細胞性である1または2以上
のタンパク質またはポリペプチド(例えば、インターフ
ェロンα、βまたはγ;インターリューキン1〜7、腫
瘍壊死因子(TNF)αまたはβ)を発現し、こうして、
ある種のヒトの癌(例えば、膀胱癌、黒色症)の処置の
ための新しい方法の基準を提供することができる。問題
の病原体は、ウイルス、微生物、または病気を引き起こ
す他の有機体または物質(例えば、毒素またはトキソイ
ド)を包含する。本発明は、また、宿主を組み換えマイ
コバクテリアでワクチン接種して、宿主の中に保護的免
疫性を引き出す方法に関する。組み換えワクチンを使用
して、体液抗体の免疫性、細胞の免疫性(ヘルパーおよ
び細胞毒性の免疫性を包含する)および/または粘膜ま
たは分泌の免疫性を生成することができる。さらに、本
発明は、組み換え培養可能なマイコバクテリウムにより
発現された抗原をワクチンまたは診断試薬として使用す
ることに関する。
本発明のワクチンは、現在入手可能なワクチンを越え
た重要な利点を有する。第1に、マイコバクテリアは最
もよく現在知られているなかでアジュバントの性質を有
し、こうして、受容体の免疫系を刺激して、大きい有効
性をもって他の抗原に対して応答させる。これは細胞仲
介免疫性を誘発するのでワクチンのとくに価値ある面で
あり、こうして、細胞仲介免疫性が抵抗性のために重要
であると思われる場合において、病原体に対する免疫性
を提供するとき、ことに有用である。第2に、マイコバ
クテリウムは長期間のメモリーまたは免疫性を刺激す
る。結局、単一(1回)の接種を使用して、タンパク質
抗原に対する長期間の感作を生成することができる。本
発明のワクチンベヒクルを使用すると、長く持続するT
細胞のメモリーをプライミングすることができ、これは
感染性因子または毒素を中和する二次抗体の応答を刺激
する。これは、例えば、破傷風およびジフテリアの毒
素、百日咳、マラリア、インフルエンザ、ヘルペスウイ
ルスおよびへびの毒物に対して有用である。
た重要な利点を有する。第1に、マイコバクテリアは最
もよく現在知られているなかでアジュバントの性質を有
し、こうして、受容体の免疫系を刺激して、大きい有効
性をもって他の抗原に対して応答させる。これは細胞仲
介免疫性を誘発するのでワクチンのとくに価値ある面で
あり、こうして、細胞仲介免疫性が抵抗性のために重要
であると思われる場合において、病原体に対する免疫性
を提供するとき、ことに有用である。第2に、マイコバ
クテリウムは長期間のメモリーまたは免疫性を刺激す
る。結局、単一(1回)の接種を使用して、タンパク質
抗原に対する長期間の感作を生成することができる。本
発明のワクチンベヒクルを使用すると、長く持続するT
細胞のメモリーをプライミングすることができ、これは
感染性因子または毒素を中和する二次抗体の応答を刺激
する。これは、例えば、破傷風およびジフテリアの毒
素、百日咳、マラリア、インフルエンザ、ヘルペスウイ
ルスおよびへびの毒物に対して有用である。
とくにBCGは、ワクチンのベヒクルとして、次の理由
で重要な利点を有する:1)それは出産のとき現在与えら
れる子供のワクチンのみである;2)過去40年間、それは
結核に対するワクチンとして与えられたとき、悪影響の
発生は非常に低かった;そして3)それは個体において
反復して使用することができる(例えば、多数の形態
で)。
で重要な利点を有する:1)それは出産のとき現在与えら
れる子供のワクチンのみである;2)過去40年間、それは
結核に対するワクチンとして与えられたとき、悪影響の
発生は非常に低かった;そして3)それは個体において
反復して使用することができる(例えば、多数の形態
で)。
とくにBCG、ならびに一般にマイコバクテリアのそれ
以上の利点は、そのゲノムの大きさが大きいことである
(ほぼ3×106bpの長さ)。ゲノムは大きいので、それ
は大量のDNAを他の源(すなわち、問題のDNA)を収容す
ることができ、こうして、マルチ−ワクチンベヒクル
(すなわち、1より多い病原体に対する保護的抗原をエ
ンコードする問題のDNAを有するもの)を作るために使
用することができる。
以上の利点は、そのゲノムの大きさが大きいことである
(ほぼ3×106bpの長さ)。ゲノムは大きいので、それ
は大量のDNAを他の源(すなわち、問題のDNA)を収容す
ることができ、こうして、マルチ−ワクチンベヒクル
(すなわち、1より多い病原体に対する保護的抗原をエ
ンコードする問題のDNAを有するもの)を作るために使
用することができる。
図面の簡単な説明
第1図は、スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)
スフェロプラストとマイコバクテリオファージD29 DNA
のトランスフェクションの結果を示す。
スフェロプラストとマイコバクテリオファージD29 DNA
のトランスフェクションの結果を示す。
第2図は、シャトルプラスミド、phAE1の構成の概略
的表示である。
的表示である。
第3図は、シャトルプラスミドphAE1の評価の結果を
示す。
示す。
第3A図は、Kpn Iで消化したマイコバクテリオファー
ジTM4 DNAおよびシャトルプラスミドphAE1 DNAのアガ
ロースゲルを示す。レーン1はHind IIIで消化したラム
ダDNAを含有する;レーン2および3は、Kpn Iによる消
化切断の前に、非結合(レーン2)または結合した(レ
ーン3)TM4 DNAを含有する;レーン4および5は、ス
メグマ菌(M.smegmatis)上で増殖したファージ粒子か
ら分離したphAE1 DNA(レーン4)およびプラスミドと
してE.coli細胞から分離しあphAE1(レーン5)を含有
する。矢印は、粘着末端において結合したとき、3.9Kb
の断片を形成する、2.1Kbおよび1.8Kbを指すことに注意
すべきである。
ジTM4 DNAおよびシャトルプラスミドphAE1 DNAのアガ
ロースゲルを示す。レーン1はHind IIIで消化したラム
ダDNAを含有する;レーン2および3は、Kpn Iによる消
化切断の前に、非結合(レーン2)または結合した(レ
ーン3)TM4 DNAを含有する;レーン4および5は、ス
メグマ菌(M.smegmatis)上で増殖したファージ粒子か
ら分離したphAE1 DNA(レーン4)およびプラスミドと
してE.coli細胞から分離しあphAE1(レーン5)を含有
する。矢印は、粘着末端において結合したとき、3.9Kb
の断片を形成する、2.1Kbおよび1.8Kbを指すことに注意
すべきである。
第3B図は、プローブとしてpHC79を使用する、プラス
ミドphAE1のサザンブロットの分析の結果を示す(パネ
ルB)。第3A図のオートラジオグラフは、バイオトラン
ス(Biotrans)ナイロン膜(ICN)上にブロッティング
し、そして32P−dCTPでニック翻訳したpHC79 DNAでプ
ロービングした後、示された。
ミドphAE1のサザンブロットの分析の結果を示す(パネ
ルB)。第3A図のオートラジオグラフは、バイオトラン
ス(Biotrans)ナイロン膜(ICN)上にブロッティング
し、そして32P−dCTPでニック翻訳したpHC79 DNAでプ
ロービングした後、示された。
第4図はBCG上のphAE1の複製を示す。それは、DS6A、
これはヒト結核菌(M.tuberculosis)およびBCG上でプ
ラーク形成するが、他のマイコバクテリアのプラーク形
成については知られていない;ファージ33D、これはス
メグマ菌(M.smegmatis)上でプラーク形成することは
知られているが、BCG上のそれについては知られていな
い;およびファージTM4、両者上でプラーク形成するこ
とが知られている;によりBCGのグラクソ(Glaxo)ワク
チン菌株の溶菌を比較する。
これはヒト結核菌(M.tuberculosis)およびBCG上でプ
ラーク形成するが、他のマイコバクテリアのプラーク形
成については知られていない;ファージ33D、これはス
メグマ菌(M.smegmatis)上でプラーク形成することは
知られているが、BCG上のそれについては知られていな
い;およびファージTM4、両者上でプラーク形成するこ
とが知られている;によりBCGのグラクソ(Glaxo)ワク
チン菌株の溶菌を比較する。
第4A図は、ファージによるBCGの溶菌を示す。10-1の
希釈で使用したファージ(pfu/ml)の力価は、次の通り
であった:DS6a、ヒト結核菌(M.tuberculosis)、H37R
a、上で2×106;33D、スメグマ菌(M.smegmatis)、mc2
6、上で2×106;TM4、mc26上で3×108;およびphAE1、m
c26上で3×108。ファージの希釈(5μl)を108のBCG
細胞を含有する軟寒天上にスポッティングした。生ずる
溶菌を、37℃において10日後、写真撮影した。
希釈で使用したファージ(pfu/ml)の力価は、次の通り
であった:DS6a、ヒト結核菌(M.tuberculosis)、H37R
a、上で2×106;33D、スメグマ菌(M.smegmatis)、mc2
6、上で2×106;TM4、mc26上で3×108;およびphAE1、m
c26上で3×108。ファージの希釈(5μl)を108のBCG
細胞を含有する軟寒天上にスポッティングした。生ずる
溶菌を、37℃において10日後、写真撮影した。
第4B図は、phAE1中のコスミドDNAの存在を示す。これ
らの平板上のプラークのリフトは、後述するように実施
し、そして32P標識したpHC79 DNAとハイブリダイゼー
ションした;次いで、オートラジオグラフィーを実施し
た。
らの平板上のプラークのリフトは、後述するように実施
し、そして32P標識したpHC79 DNAとハイブリダイゼー
ションした;次いで、オートラジオグラフィーを実施し
た。
第4C図は、シャトルプラスミドphAE1のファージ粒子
の電子顕微鏡写真である。CsClの勾配で精製したファー
ジ粒子を炭素被覆した、パーロイドンン(Parloidon)
被覆したグリッド上に配置し、ブロッティングし、そし
て1滴の1%のホスホタングステン酸で洗浄した。電子
顕微鏡写真はJEOL 1200EX電子顕微鏡を80kV、30,000×
で撮った。
の電子顕微鏡写真である。CsClの勾配で精製したファー
ジ粒子を炭素被覆した、パーロイドンン(Parloidon)
被覆したグリッド上に配置し、ブロッティングし、そし
て1滴の1%のホスホタングステン酸で洗浄した。電子
顕微鏡写真はJEOL 1200EX電子顕微鏡を80kV、30,000×
で撮った。
第5図は、スメグマ菌(M.smegmatis)染色体の中に
マイコバクテリアL1およびL1−シャトルプラスミドDNA
を組み込むことを示す。ファージL1およびL1−シャトル
プラスミドからのDNAおよび対応する溶原化からの染色
体のDNAを、BamH Iで消化し、そしてアガロース中で電
気泳動にかけた。パネルAは臭化エチジウムで染色した
ゲルを示す。パネルBは、32P標識したファージL1 DNA
でプロービングしたこのゲルのサザン分析のオートラジ
オグラフを示す。次は示したレーンで示す:親のファー
ジL1からのファージDNA(レーン2)、シャトルプラス
ミドphAE15から(レーン4)およびaph遺伝子を含有す
るシャトルプラスミドphAE19から(レーン6);親のス
メグマ菌(M.smegmatis)菌株からのバクテリアの染色
体のDNA(レーン1)、L1で病原化した菌株(レーン
3)、phAE15で(レーン5)、およびphAE19(レーン
7)。L1、phAE15、およびphAE19は、各ファージの中に
存在する単一の6.7kbのバンドの主な損失(注、L1、レ
ーン2における四角形)および各リソゲンにおける2つ
の新しいバンド、9.0kbおよび1.7kgの出現(円形)によ
り明らかなように、それらのそれぞれのリソゲンの染色
体内で部位特異的に組み込まれた(パネルB、レーン
3、5および7)。
マイコバクテリアL1およびL1−シャトルプラスミドDNA
を組み込むことを示す。ファージL1およびL1−シャトル
プラスミドからのDNAおよび対応する溶原化からの染色
体のDNAを、BamH Iで消化し、そしてアガロース中で電
気泳動にかけた。パネルAは臭化エチジウムで染色した
ゲルを示す。パネルBは、32P標識したファージL1 DNA
でプロービングしたこのゲルのサザン分析のオートラジ
オグラフを示す。次は示したレーンで示す:親のファー
ジL1からのファージDNA(レーン2)、シャトルプラス
ミドphAE15から(レーン4)およびaph遺伝子を含有す
るシャトルプラスミドphAE19から(レーン6);親のス
メグマ菌(M.smegmatis)菌株からのバクテリアの染色
体のDNA(レーン1)、L1で病原化した菌株(レーン
3)、phAE15で(レーン5)、およびphAE19(レーン
7)。L1、phAE15、およびphAE19は、各ファージの中に
存在する単一の6.7kbのバンドの主な損失(注、L1、レ
ーン2における四角形)および各リソゲンにおける2つ
の新しいバンド、9.0kbおよび1.7kgの出現(円形)によ
り明らかなように、それらのそれぞれのリソゲンの染色
体内で部位特異的に組み込まれた(パネルB、レーン
3、5および7)。
第6図は、テンペレートシャトルプラスミドをクロー
ニングベクターとして使用して、問題のDNAをマイコバ
クテリアの染色体の中に導入することの概略的表示であ
る。問題のDNA(GENE X)をシャトルプラスミドDNAに
おける独特制限部位の中に挿入し、引き続いてマイコバ
クテリアの中に導入することができる。マイコバクテリ
アにおいて、問題のDNAを有する、シャトルプラスミド
を溶原化し、そしてファージとして安定に維持すること
ができる。
ニングベクターとして使用して、問題のDNAをマイコバ
クテリアの染色体の中に導入することの概略的表示であ
る。問題のDNA(GENE X)をシャトルプラスミドDNAに
おける独特制限部位の中に挿入し、引き続いてマイコバ
クテリアの中に導入することができる。マイコバクテリ
アにおいて、問題のDNAを有する、シャトルプラスミド
を溶原化し、そしてファージとして安定に維持すること
ができる。
第7図は、テンペレートシャトルプラスミドphAE19を
使用する溶原性によるカナマイシン抵抗性の発現を示
す。phAE19がmc26細胞を溶原化する場合、コロニーは現
れ、こうしてカナマイシン抵抗性の発現を実証する。多
数の実験において、カナマイシン抵抗性のコロニーはmc
26細胞またはphAE15で溶原化したmc26細胞のいずれの自
発的突然変異体からも観測されなかった。
使用する溶原性によるカナマイシン抵抗性の発現を示
す。phAE19がmc26細胞を溶原化する場合、コロニーは現
れ、こうしてカナマイシン抵抗性の発現を実証する。多
数の実験において、カナマイシン抵抗性のコロニーはmc
26細胞またはphAE15で溶原化したmc26細胞のいずれの自
発的突然変異体からも観測されなかった。
第8図は、pAL5000ゲノム付近の不規則の部位に挿入
された、ネオマイシン/カナマイシン(neo)およびク
ロラムフェニコール(cat)に対する抵抗性を与えるマ
ーカー遺伝子を含有する、E.coliプラスミド、pIJ666、
から成るハイブリッドプラスミド分子のライブラリーを
発生するために使用した全体の方法の概略的表示であ
る。
された、ネオマイシン/カナマイシン(neo)およびク
ロラムフェニコール(cat)に対する抵抗性を与えるマ
ーカー遺伝子を含有する、E.coliプラスミド、pIJ666、
から成るハイブリッドプラスミド分子のライブラリーを
発生するために使用した全体の方法の概略的表示であ
る。
第9図は、スメグマ菌(M.smegmatis)形質転換体の
3つの独立のプール(レーン1、2、3)から分離した
pIJ666::pAL5000組み換えシャトルプラスミドからのDNA
のアガロースゲルの電気泳動の分析の結果を示す。これ
らのプラスミドのプールの各々をE.coli菌株χ2338の中
に別々に形質転換した後、単一の精製した形質転換体、
pYUP13、pYUP14およびpYUP15と表示する、から独特のプ
ラスミドを分離し、そして、それぞれ、レーン5、6お
よび7に示す。レーン4はマイコバクテリウム・フォル
ツイツム(M.fortuitum)プラスミド、pAL5000、を含有
し、そしてレーンpIJ666::pAL5000組み換え体のライブ
ラリーを含有する。スメグマ菌(M.smegmatis)または
E.coliのいずれから分離シャトルプラスミドの大きさは
組み換え体のライブラリーの大きさと同一であり、構成
体の安定性を示す。
3つの独立のプール(レーン1、2、3)から分離した
pIJ666::pAL5000組み換えシャトルプラスミドからのDNA
のアガロースゲルの電気泳動の分析の結果を示す。これ
らのプラスミドのプールの各々をE.coli菌株χ2338の中
に別々に形質転換した後、単一の精製した形質転換体、
pYUP13、pYUP14およびpYUP15と表示する、から独特のプ
ラスミドを分離し、そして、それぞれ、レーン5、6お
よび7に示す。レーン4はマイコバクテリウム・フォル
ツイツム(M.fortuitum)プラスミド、pAL5000、を含有
し、そしてレーンpIJ666::pAL5000組み換え体のライブ
ラリーを含有する。スメグマ菌(M.smegmatis)または
E.coliのいずれから分離シャトルプラスミドの大きさは
組み換え体のライブラリーの大きさと同一であり、構成
体の安定性を示す。
第10図は、BCGのシャトルプラスミドDNAによる形質転
換を示す。パネルAは、シャトルプラスミドDNAを使用
するBCG細胞のエレクトロポレイション後、生ずるカナ
マイシン抵抗性BCGコロニーを示す;パネルBは、シャ
トルプラスミドDNAを使用しないBCG細胞のエレクトロポ
レイション後、生ずるカナマイシン抵抗性BCGコロニー
を示す。
換を示す。パネルAは、シャトルプラスミドDNAを使用
するBCG細胞のエレクトロポレイション後、生ずるカナ
マイシン抵抗性BCGコロニーを示す;パネルBは、シャ
トルプラスミドDNAを使用しないBCG細胞のエレクトロポ
レイション後、生ずるカナマイシン抵抗性BCGコロニー
を示す。
第11図は、プラスミドベクターpUC19のPyrF遺伝子中
のKan挿入が存在する、組み換えプラスミドの構成の概
略的表示である。
のKan挿入が存在する、組み換えプラスミドの構成の概
略的表示である。
第12図は、PyrF遺伝子がKan挿入を含有する、pUC19組
み換えプラスミドを使用するマイコバクテリアの細胞の
形質転換の概略的表示である。第12A図は、Kan遺伝子を
含有するPyrF遺伝子が存在する、マイコバクテリアの細
胞の、カナマイシンを含有する培地上の増殖を使用す
る、選択の概略的表示である。第12B図は、ゲノムのDNA
の中に組み込まれたKan遺伝子を含有するPyrF遺伝子を
有するマイコバクテリアの細胞の、フルオロ−オロチン
酸を含有する培地上の増殖を使用する、選択の概略的表
示である。
み換えプラスミドを使用するマイコバクテリアの細胞の
形質転換の概略的表示である。第12A図は、Kan遺伝子を
含有するPyrF遺伝子が存在する、マイコバクテリアの細
胞の、カナマイシンを含有する培地上の増殖を使用す
る、選択の概略的表示である。第12B図は、ゲノムのDNA
の中に組み込まれたKan遺伝子を含有するPyrF遺伝子を
有するマイコバクテリアの細胞の、フルオロ−オロチン
酸を含有する培地上の増殖を使用する、選択の概略的表
示である。
第13図は、Kanと選択した抗原(Fanと表示する)をエ
ンコードするDNAとのマイコバクテリアのDNAの中への組
み込みの概略的表示である。
ンコードするDNAとのマイコバクテリアのDNAの中への組
み込みの概略的表示である。
第14図は、カナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝
子とのマイコバクテリアのPyrF遺伝子の置換の概略的表
示である。
子とのマイコバクテリアのPyrF遺伝子の置換の概略的表
示である。
第15図は、第14図に表すように産生した組み換えマイ
コバクテリウムの中へのPyrF遺伝子および問題のDNAの
組み込みの概略的表示である。
コバクテリウムの中へのPyrF遺伝子および問題のDNAの
組み込みの概略的表示である。
第16図は、マイコバクテリアのゲノムの中に組み込ま
れた問題のDNAの発現を制御するための発現カセットの
使用の概略的表示である。
れた問題のDNAの発現を制御するための発現カセットの
使用の概略的表示である。
第17図は、スメグマ菌(M.smegmatis)およびBCGの中
でストレス誘発した65kDをエンコードするらい菌(M.le
prae)遺伝子の発現を示す、ウェスタン・ブロット分析
の結果を示す。
でストレス誘発した65kDをエンコードするらい菌(M.le
prae)遺伝子の発現を示す、ウェスタン・ブロット分析
の結果を示す。
発明の詳細な説明
ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)−BCG(BCGまた
はウシ結核菌(M.bovis)−BCGは、世界中で広く使用さ
れている非ビルレントウシ結核菌(M.bovis)の誘導体
であり、そして結核に対する保護与えるために普通に使
用されているが、その有効性は最近問題とされている。
スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)は、BCGと抗
原性およびアジュバントの性質を共有する非病原性バチ
ルスである。両者は、また、培養において増殖するのが
合理的に容易である。
はウシ結核菌(M.bovis)−BCGは、世界中で広く使用さ
れている非ビルレントウシ結核菌(M.bovis)の誘導体
であり、そして結核に対する保護与えるために普通に使
用されているが、その有効性は最近問題とされている。
スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)は、BCGと抗
原性およびアジュバントの性質を共有する非病原性バチ
ルスである。両者は、また、培養において増殖するのが
合理的に容易である。
両者のマイコバクテリアは細胞仲介免疫性の誘発のた
めのきわめてすぐれたアジュバント活性を有し、長期間
のメモリー(免疫性)を刺激し、そしてそれらの使用に
関連する致死率が低いが、それらは組み換えワクチンと
してきわめてすぐれた候補である。すなわち、それら
は、問題の遺伝子物質(DNA)(それが導入されている
マイコバクテリア以外の源からのDNA)を挿入し、引き
続いて発現することができる、ベヒクル(ワクチンのベ
ヒクル)として使用のための、きわめてすぐれた候補で
ある。
めのきわめてすぐれたアジュバント活性を有し、長期間
のメモリー(免疫性)を刺激し、そしてそれらの使用に
関連する致死率が低いが、それらは組み換えワクチンと
してきわめてすぐれた候補である。すなわち、それら
は、問題の遺伝子物質(DNA)(それが導入されている
マイコバクテリア以外の源からのDNA)を挿入し、引き
続いて発現することができる、ベヒクル(ワクチンのベ
ヒクル)として使用のための、きわめてすぐれた候補で
ある。
問題のDNAは任意の由来であることができそして次の
通りである:1)1または2以上の問題のタンパク質また
はポリペプチドをエンコードする1または2以上の遺伝
子のすべてまたは一部分であるDNA;2)選択可能な1ま
たは2以上のマーカーをエンコードするDNA;または3)
両者の選択可能なマーカー(または複数の選択可能なマ
ーカー)少なくとも1つの問題のタンパク質またはポリ
ペプチドをエンコードするDNA。用語問題のポリペプチ
ドは、ここで使用するとき、発現すべきタンパク質のす
べてまたは一部分を包含する。このような問題のDNAは
遺伝子的に組み換えのマイコバクテリアの中で発現さ
れ、ここでそれはマイコバクテリアのゲノムの中に存在
する(組み込まれている)か、あるいは染色体外に存在
する。組み込まれたDNAは、ここで定義するとき、染色
体の中に存在するか、あるいはマイコバクテリアの中に
染色体外に(エピソーム的に)存在するDNAを包含す
る。DNAは1または2以上のシャトルプラスミドにより
組み込まれ、マイコバクテリアの染色体またはゲノムの
DNA中への組み込みまたは問題のDNAのエピソーム的(染
色体外)の存在を生ずる。問題のDNAの組み込みは相同
的または非相同的の組み換え、例えば、ファージエンコ
ーデッド合成の部位特異的組み換えまたは配置可能な要
素により仲介される組み換えにより起こることができ
る。
通りである:1)1または2以上の問題のタンパク質また
はポリペプチドをエンコードする1または2以上の遺伝
子のすべてまたは一部分であるDNA;2)選択可能な1ま
たは2以上のマーカーをエンコードするDNA;または3)
両者の選択可能なマーカー(または複数の選択可能なマ
ーカー)少なくとも1つの問題のタンパク質またはポリ
ペプチドをエンコードするDNA。用語問題のポリペプチ
ドは、ここで使用するとき、発現すべきタンパク質のす
べてまたは一部分を包含する。このような問題のDNAは
遺伝子的に組み換えのマイコバクテリアの中で発現さ
れ、ここでそれはマイコバクテリアのゲノムの中に存在
する(組み込まれている)か、あるいは染色体外に存在
する。組み込まれたDNAは、ここで定義するとき、染色
体の中に存在するか、あるいはマイコバクテリアの中に
染色体外に(エピソーム的に)存在するDNAを包含す
る。DNAは1または2以上のシャトルプラスミドにより
組み込まれ、マイコバクテリアの染色体またはゲノムの
DNA中への組み込みまたは問題のDNAのエピソーム的(染
色体外)の存在を生ずる。問題のDNAの組み込みは相同
的または非相同的の組み換え、例えば、ファージエンコ
ーデッド合成の部位特異的組み換えまたは配置可能な要
素により仲介される組み換えにより起こることができ
る。
現在まで、プラスミドDNAの使用によりマイコバクテ
リアを形質転換することができなかった。さらに、現在
まで、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、免疫応
答を望むもの、をエンコードするDNAが、ゲノムのDNAの
中の選択した部位にかつ選択した向きに安定に組み込ま
れた、組み換えマイコバクテリアのワクチンのベヒクル
を産生することができなかった。
リアを形質転換することができなかった。さらに、現在
まで、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、免疫応
答を望むもの、をエンコードするDNAが、ゲノムのDNAの
中の選択した部位にかつ選択した向きに安定に組み込ま
れた、組み換えマイコバクテリアのワクチンのベヒクル
を産生することができなかった。
発現ベクターまたはワクチンのベヒクルとして使用す
べき組み換えマイコバクテリウムの開発についての研究
の主な目的は、1または2以上の病原体に対する保護に
とって重要な、1または2以上の産生物、例えば、タン
パク質またはポリペプチド、をエンコードするDNAの発
現を指令するDNAベクターのマイコバクテリウム中への
導入である。本発明の方法およびシャトルまたはプラス
ミドのベクターを使用して、培養可能なマイコバクテリ
ウムの中に(例えば、マイコバクテリウムの中に、それ
が染色体外に発現されるように)問題のDNAを組み込む
ことが、今回、可能となった。
べき組み換えマイコバクテリウムの開発についての研究
の主な目的は、1または2以上の病原体に対する保護に
とって重要な、1または2以上の産生物、例えば、タン
パク質またはポリペプチド、をエンコードするDNAの発
現を指令するDNAベクターのマイコバクテリウム中への
導入である。本発明の方法およびシャトルまたはプラス
ミドのベクターを使用して、培養可能なマイコバクテリ
ウムの中に(例えば、マイコバクテリウムの中に、それ
が染色体外に発現されるように)問題のDNAを組み込む
ことが、今回、可能となった。
本発明のシャトルプラスミドのベクターは、バクテリ
アの中でプラスミドとしておよびマイコバクテリアの中
でファージとして複製することにおいて独特である。1
つの特定の実施態様において、シャトルプラスミドと呼
ぶ、シャトルプラスミドのベクターは2種の粘着末端
(またはcos部位)を包含する:ラムダファージについ
て1つ、これはE.coliの中で機能する;およびマイコバ
クテリアについて1つ、これはマイコバクテリアの中で
機能する。すなわち、それは2組の粘着末端を含有す
る。それはラムダについて1組およびマイコバクテリア
について1組を含有するので、それは両者の中に組み込
むことができる。ラムダCOS配列の存在は、また、コス
ミドのクローニングの効率よい技術の使用を可能とし、
これはE.coliの中への大きいDNA分子の効率よりクロー
ニングのためにラムダ生体外パッケージング系を利用す
る。さらに、シャトルベクターは独特のEcoR I部位を有
し、この中に抗原をエンコードするDNAを挿入すること
ができる。こうして、シャトルベクターはトランスフェ
クション合成を発生することができ、これはマイコバク
テリアの中への組み換えDNA分子の導入を可能とする。
アの中でプラスミドとしておよびマイコバクテリアの中
でファージとして複製することにおいて独特である。1
つの特定の実施態様において、シャトルプラスミドと呼
ぶ、シャトルプラスミドのベクターは2種の粘着末端
(またはcos部位)を包含する:ラムダファージについ
て1つ、これはE.coliの中で機能する;およびマイコバ
クテリアについて1つ、これはマイコバクテリアの中で
機能する。すなわち、それは2組の粘着末端を含有す
る。それはラムダについて1組およびマイコバクテリア
について1組を含有するので、それは両者の中に組み込
むことができる。ラムダCOS配列の存在は、また、コス
ミドのクローニングの効率よい技術の使用を可能とし、
これはE.coliの中への大きいDNA分子の効率よりクロー
ニングのためにラムダ生体外パッケージング系を利用す
る。さらに、シャトルベクターは独特のEcoR I部位を有
し、この中に抗原をエンコードするDNAを挿入すること
ができる。こうして、シャトルベクターはトランスフェ
クション合成を発生することができ、これはマイコバク
テリアの中への組み換えDNA分子の導入を可能とする。
問題の遺伝子物質をマイコバクテリアの中に組み込ん
で、本発明の組み換えマイコバクテリアを産生すること
ができる、いくつかの手段が存在する。例えば、問題の
DNAはマイコバクテリアの細胞の中に、シャトルプラス
ミド、とくにテンペレートシャトルプラスミド(例え
ば、細胞を溶原化することができるファージ)の中にク
ローニングすることによって安定に導入(例えば、マイ
コバクテリアの染色体の中に組み込む)ことができる。
この方法における問題のDNAの導入は、マイコバクテリ
アの染色体の中へのDNAの組み込みを生ずる。
で、本発明の組み換えマイコバクテリアを産生すること
ができる、いくつかの手段が存在する。例えば、問題の
DNAはマイコバクテリアの細胞の中に、シャトルプラス
ミド、とくにテンペレートシャトルプラスミド(例え
ば、細胞を溶原化することができるファージ)の中にク
ローニングすることによって安定に導入(例えば、マイ
コバクテリアの染色体の中に組み込む)ことができる。
この方法における問題のDNAの導入は、マイコバクテリ
アの染色体の中へのDNAの組み込みを生ずる。
例えば、E.coliのコスミドをテンペレートのマイコバ
クテリオファージL1の中に導入して、E.coliの中でプラ
スミドとして複製するか、あるいはマイコバクテリアの
宿主を溶原化することができるシャトルプラスミドを産
生した。これらのテンペレートシャトルプラスミドはス
メグマ菌(M.smegmatis)上で濁ったプラークを形成し
そして、溶原化すると、重感染に対する抵抗性を与えそ
してマイコバクテリアの染色体内に組み込む。E.coliの
中でカナマイシン抵抗性を与えるクローニングした遺伝
子を含有するL1シャトルプラスミドをスメグマ菌(M.sm
egmatis)の中に導入するとき、安定な安定なカナマイ
シン抵抗性コロニー(すなわち、溶原)が得られた。
クテリオファージL1の中に導入して、E.coliの中でプラ
スミドとして複製するか、あるいはマイコバクテリアの
宿主を溶原化することができるシャトルプラスミドを産
生した。これらのテンペレートシャトルプラスミドはス
メグマ菌(M.smegmatis)上で濁ったプラークを形成し
そして、溶原化すると、重感染に対する抵抗性を与えそ
してマイコバクテリアの染色体内に組み込む。E.coliの
中でカナマイシン抵抗性を与えるクローニングした遺伝
子を含有するL1シャトルプラスミドをスメグマ菌(M.sm
egmatis)の中に導入するとき、安定な安定なカナマイ
シン抵抗性コロニー(すなわち、溶原)が得られた。
あるいは、プラスミドベクターを使用して問題のDNA
をマイコバクテリアの中に導入することができ、マイコ
バクテリアの中でDNAは染色体外で発現される。例え
ば、シャトルプラスミドマイコバクテリウム・フォルツ
イツム(M.fortuitum)::E.coliハイブリッドプラスミ
ドを、カナマイシン抵抗性およびクロラムフェニコール
抵抗性の遺伝子を含有するマイコバクテリアおよびE.co
liレプリコンから構成した。これらのシャトルプラスミ
ドは、エレクトロポレイションによりスメグマ菌(M.sm
egmatis)またはBCGの中に導入すると、形質転換体に安
定なカナマイシン抵抗性およびクロランフェニコール抵
抗性を与える。こうして、ベクターは、マイコバクテリ
ア中への組み換えDNA分子の導入を許すトランスフェク
ション系の開発を可能とする。
をマイコバクテリアの中に導入することができ、マイコ
バクテリアの中でDNAは染色体外で発現される。例え
ば、シャトルプラスミドマイコバクテリウム・フォルツ
イツム(M.fortuitum)::E.coliハイブリッドプラスミ
ドを、カナマイシン抵抗性およびクロラムフェニコール
抵抗性の遺伝子を含有するマイコバクテリアおよびE.co
liレプリコンから構成した。これらのシャトルプラスミ
ドは、エレクトロポレイションによりスメグマ菌(M.sm
egmatis)またはBCGの中に導入すると、形質転換体に安
定なカナマイシン抵抗性およびクロランフェニコール抵
抗性を与える。こうして、ベクターは、マイコバクテリ
ア中への組み換えDNA分子の導入を許すトランスフェク
ション系の開発を可能とする。
また、ファージなしで宿主の染色体の中に問題のDNA
を導入し、そしてそれをその中に組み込ませることがで
きる。例えば、これは相同的組み換え、部位特異的組み
換えまたは非相同的組み換えにより(例えば、宿主の染
色体物質の中への不規則的挿入を生ずる、トランスボゾ
ンにより)達成することができる。相同的組み換えは、
後述するように、問題のDNA(例えば、カナマイシン抵
抗性遺伝子、65KD らい菌(M.leprae)遺伝子)を組み
込むために使用されてきている。
を導入し、そしてそれをその中に組み込ませることがで
きる。例えば、これは相同的組み換え、部位特異的組み
換えまたは非相同的組み換えにより(例えば、宿主の染
色体物質の中への不規則的挿入を生ずる、トランスボゾ
ンにより)達成することができる。相同的組み換えは、
後述するように、問題のDNA(例えば、カナマイシン抵
抗性遺伝子、65KD らい菌(M.leprae)遺伝子)を組み
込むために使用されてきている。
マイコバクテリアの中にか、あるいはマイコバクテリ
アのゲノムの中に問題のDNAを、本発明のシャトルベク
ターまたはプラスミドベクターによるか、あるいは相同
的組み換えにより首尾よく導入するために、次の一般ア
プローチに従った。それはスメグマ菌(M.smegamatis)
またはウシ結核菌(M.bovis)−BCGにより記載するが、
それは問題のDNAを他のマイコバクテリアの中に導入す
るために使用できること、およびこれらの他の遺伝子的
に組み換えのマイコバクテリアは、また、発現またはワ
クチンのベヒクルであることができることを理解すべき
である。このような他のマイコバクテリアは、次のもの
を包含する:スメグマ菌(M.smegmatis)、ウシ結核菌
(M.bovis)−BCG、鳥結核菌(M.avium)、チモテ菌
(M.phlei)、マイコバクテリウム・フォルツイツム
(M.fortuitum)、マイコバクテリウム・ルフ(M.luf
u)、パラ結核菌(M.paratuberculosis)、マイコバク
テリウム・ハバナ(M.habana)、マイコバクテリウム・
スクロフラセウム(M.scrofulaceum)およびマイコバク
テリウム・イントラセルラレ(M.intracellulare)。ワ
クチンのベヒクルとしてゆっくり増殖するマイコバクテ
リア(例えば、ウシ結核菌(M.bovis)−BCGおよびヒト
結核菌(M.tuberculosis))を使用すべき場合におい
て、スメグマ菌(M.smegmatis)を通過し(すなわち、
その中に1または2以上の抗原をエンコードするDNAを
導入し)引き続いてウシ結核菌(M.bovis)−BCGの中に
入ることはとくに価値がある。
アのゲノムの中に問題のDNAを、本発明のシャトルベク
ターまたはプラスミドベクターによるか、あるいは相同
的組み換えにより首尾よく導入するために、次の一般ア
プローチに従った。それはスメグマ菌(M.smegamatis)
またはウシ結核菌(M.bovis)−BCGにより記載するが、
それは問題のDNAを他のマイコバクテリアの中に導入す
るために使用できること、およびこれらの他の遺伝子的
に組み換えのマイコバクテリアは、また、発現またはワ
クチンのベヒクルであることができることを理解すべき
である。このような他のマイコバクテリアは、次のもの
を包含する:スメグマ菌(M.smegmatis)、ウシ結核菌
(M.bovis)−BCG、鳥結核菌(M.avium)、チモテ菌
(M.phlei)、マイコバクテリウム・フォルツイツム
(M.fortuitum)、マイコバクテリウム・ルフ(M.luf
u)、パラ結核菌(M.paratuberculosis)、マイコバク
テリウム・ハバナ(M.habana)、マイコバクテリウム・
スクロフラセウム(M.scrofulaceum)およびマイコバク
テリウム・イントラセルラレ(M.intracellulare)。ワ
クチンのベヒクルとしてゆっくり増殖するマイコバクテ
リア(例えば、ウシ結核菌(M.bovis)−BCGおよびヒト
結核菌(M.tuberculosis))を使用すべき場合におい
て、スメグマ菌(M.smegmatis)を通過し(すなわち、
その中に1または2以上の抗原をエンコードするDNAを
導入し)引き続いてウシ結核菌(M.bovis)−BCGの中に
入ることはとくに価値がある。
DNAをマイコバクテリアの中へ転移するためのシャトル
ベクターの開発 スメグマ菌(M.smegmatis)の中へのマイコバクテリオ
ファージDNAのトランスフェクション マイコバクテリア中のDNAの操作を可能とする系を開
発するために、バチルスの中にDNAを転移する効率よい
手段を開発することがまず必要であった。使用した技術
は、ストレプトミセス族(Streptomyces)についてのス
フェロプラストの調製に関してオカニシ(Okanishi)お
よびホプウッド(Hopwood)により記載されている変更
であった。ストレプトミセス族(Streptomyces)は、マ
イコバクテリアに似て、アクチノミセタレス(Actinomy
cetales)である。オカニシ(Okanishi)、M.ら、マイ
クロバイオロジー(Microbiology)、80:389−400(197
4);ホプウッド(Hopwood)、D.A.およびH.M.ライト
(Wright)、モレキュラー・ジェニティック(Molecula
r Genetic)、162:307−317(1978)。変更した技術
は、ポリエチレングリコールと組み合わせて使用して、
バクテリアのスフェロプラストの中へDNA分子が入るの
を促進した。
ベクターの開発 スメグマ菌(M.smegmatis)の中へのマイコバクテリオ
ファージDNAのトランスフェクション マイコバクテリア中のDNAの操作を可能とする系を開
発するために、バチルスの中にDNAを転移する効率よい
手段を開発することがまず必要であった。使用した技術
は、ストレプトミセス族(Streptomyces)についてのス
フェロプラストの調製に関してオカニシ(Okanishi)お
よびホプウッド(Hopwood)により記載されている変更
であった。ストレプトミセス族(Streptomyces)は、マ
イコバクテリアに似て、アクチノミセタレス(Actinomy
cetales)である。オカニシ(Okanishi)、M.ら、マイ
クロバイオロジー(Microbiology)、80:389−400(197
4);ホプウッド(Hopwood)、D.A.およびH.M.ライト
(Wright)、モレキュラー・ジェニティック(Molecula
r Genetic)、162:307−317(1978)。変更した技術
は、ポリエチレングリコールと組み合わせて使用して、
バクテリアのスフェロプラストの中へDNA分子が入るの
を促進した。
マイコバクテリアの形質転換のためのプラスミドの中
で有用な抗生物質抵抗性マーカーが入手不可能であるた
めに、DNAをマイコバクテリアの中に転移するために最
適な条件を評価するために選択した系は、溶菌マイコバ
クテリオファージからのDNAのトランスフェクションで
あった。このような系の2つの利点は、得られる結果が
定量的であり、そして24時間以内にプラークとして容易
に可視化されたことである。
で有用な抗生物質抵抗性マーカーが入手不可能であるた
めに、DNAをマイコバクテリアの中に転移するために最
適な条件を評価するために選択した系は、溶菌マイコバ
クテリオファージからのDNAのトランスフェクションで
あった。このような系の2つの利点は、得られる結果が
定量的であり、そして24時間以内にプラークとして容易
に可視化されたことである。
スメグマ菌(M.smegmatis)の中へのマイコバクテリ
オファージDNAのトランスフェクションは、実施例1に
詳細に記載されている。簡潔的には、DNAはを最初に除
去した細胞壁のすべてまたは一部分(すなわち、原形質
体またはスフェロプラスト)を有するマイコバクテリア
の中に、ポリエチレングリコールを使用して、導入し
た。トランスフェクションの実験はマイコバクテリオフ
ァージD29からのDNAを使用して開始し、D29は広範な種
類のマイコバクテリア上で増殖し、そしてスメグマ菌
(M.smegmatis)上で大きな透明なプラークを形成す
る。スメグマ菌(M.smegmatis)上で調製したD29ファー
ジの平板培養のリゼイトは、リゼイトの1ml当たり1011p
fu(プラーク形成単位)より大きい値を絶えず生じた。
収穫したプラークをCsCl平衡勾配で2回精製した;それ
らは1.51の平衡浮遊密度でバンドに別れた。ファージDN
AはプロテイナーゼK処理およびフェノール−クロロホ
ルム抽出により抽出した。結合および非結合のD29 DNA
の制限分析は、ファージのゲノムのDNAが二本鎖であ
り、50kbの大きさであり、そして粘着末端を有すること
を実証した。
オファージDNAのトランスフェクションは、実施例1に
詳細に記載されている。簡潔的には、DNAはを最初に除
去した細胞壁のすべてまたは一部分(すなわち、原形質
体またはスフェロプラスト)を有するマイコバクテリア
の中に、ポリエチレングリコールを使用して、導入し
た。トランスフェクションの実験はマイコバクテリオフ
ァージD29からのDNAを使用して開始し、D29は広範な種
類のマイコバクテリア上で増殖し、そしてスメグマ菌
(M.smegmatis)上で大きな透明なプラークを形成す
る。スメグマ菌(M.smegmatis)上で調製したD29ファー
ジの平板培養のリゼイトは、リゼイトの1ml当たり1011p
fu(プラーク形成単位)より大きい値を絶えず生じた。
収穫したプラークをCsCl平衡勾配で2回精製した;それ
らは1.51の平衡浮遊密度でバンドに別れた。ファージDN
AはプロテイナーゼK処理およびフェノール−クロロホ
ルム抽出により抽出した。結合および非結合のD29 DNA
の制限分析は、ファージのゲノムのDNAが二本鎖であ
り、50kbの大きさであり、そして粘着末端を有すること
を実証した。
マイコバクテリオファージD29 DNAによりスメグマ菌
(M.smegmatis)スフェロプラストのトランスフェクシ
ョンの結果は、第1図に示されている。103〜104pfu/μ
gD29 DNAの効率が得られ、こうしてマイコバクテリア
についての第1の効率的トランスフェクション系を実証
する。これらのプラークはスメグマ菌(M.smegmatis)
スフェロプラストのトランスフェクションの結果である
ということは、次により実証された:(i)トランスフ
ェクションはDNアーゼにより潰滅された;(ii)処理し
た細胞の浸透圧ショックは保護的トランスフェクション
を防止した;そして(iii)スメグマ菌(M.smegmatis)
のD29ファージ抵抗性突然変異体から誘導されたスフェ
ロプラストは、親菌株に匹敵する頻度でトランスフェク
ションされた。これらの技術のそれ以上の洗練は、105p
fu/μgのD29 DNAより大きい頻度を得ることを可能と
した。
(M.smegmatis)スフェロプラストのトランスフェクシ
ョンの結果は、第1図に示されている。103〜104pfu/μ
gD29 DNAの効率が得られ、こうしてマイコバクテリア
についての第1の効率的トランスフェクション系を実証
する。これらのプラークはスメグマ菌(M.smegmatis)
スフェロプラストのトランスフェクションの結果である
ということは、次により実証された:(i)トランスフ
ェクションはDNアーゼにより潰滅された;(ii)処理し
た細胞の浸透圧ショックは保護的トランスフェクション
を防止した;そして(iii)スメグマ菌(M.smegmatis)
のD29ファージ抵抗性突然変異体から誘導されたスフェ
ロプラストは、親菌株に匹敵する頻度でトランスフェク
ションされた。これらの技術のそれ以上の洗練は、105p
fu/μgのD29 DNAより大きい頻度を得ることを可能と
した。
マイコバクテリア中の問題のDNAの導入
E.coliの中でマイコバクテリアのDNA構成体の操作お
よび増幅の両者を可能とし、引き続いてマイコバクテリ
アの中にトランスフェクションしかつ複製するベクター
を開発した。とくに、速く増殖する非病原性マイコバク
テリウム(例えば、スメグマ菌(M.smegmatis))の中
に、ならびに遅く増殖するマイコバクテリア(例えば、
ウシ結核菌(M.bovis)−BCGおよびヒト結核菌(M.tube
rculosis))の中に問題のDNAを導入する能力を有する
ことが高度に望ましかった。プラスミドはMAIS複合体内
のあるマイコバクテリアの菌株およびの中におよびマイ
コバクテリウム・フォルツイツム(M.fortuitum)の中
に発見されたが、スメグマ菌(M.smegmatis)、ウシ結
核菌(M.bovis)−BCGまたはヒト結核菌(M.tuberculos
is)内で複製するものはまだ観測されてきていない。1
つを除外して、これらのプラスミドは選択可能なマーカ
ーを有する。クラウフォード(Crawford)、J.T.および
J.H.ベイツ(Bates)、感染および免疫性(Infection
and Immunity)、24:979−981(1979);ミズグチ(Mi
zuguchi)、Y.ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー(Journal of Bacteriology)、146:656−659(198
1);マイスナー(Meissner)、P.S.およびJ.O.ファル
キンハム(Falkinham)、ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー(Journal of Bacteriology)、157:669−67
2(1984)。対照的に、スメグマ菌(M.smegmatis)、ウ
シ結核菌(M.bovis)−BCGおよびヒト結核菌(M.tuberc
ulosis)の中で複製する種々のファージは記載されそし
て分離物の型別のために使用されてきている。
よび増幅の両者を可能とし、引き続いてマイコバクテリ
アの中にトランスフェクションしかつ複製するベクター
を開発した。とくに、速く増殖する非病原性マイコバク
テリウム(例えば、スメグマ菌(M.smegmatis))の中
に、ならびに遅く増殖するマイコバクテリア(例えば、
ウシ結核菌(M.bovis)−BCGおよびヒト結核菌(M.tube
rculosis))の中に問題のDNAを導入する能力を有する
ことが高度に望ましかった。プラスミドはMAIS複合体内
のあるマイコバクテリアの菌株およびの中におよびマイ
コバクテリウム・フォルツイツム(M.fortuitum)の中
に発見されたが、スメグマ菌(M.smegmatis)、ウシ結
核菌(M.bovis)−BCGまたはヒト結核菌(M.tuberculos
is)内で複製するものはまだ観測されてきていない。1
つを除外して、これらのプラスミドは選択可能なマーカ
ーを有する。クラウフォード(Crawford)、J.T.および
J.H.ベイツ(Bates)、感染および免疫性(Infection
and Immunity)、24:979−981(1979);ミズグチ(Mi
zuguchi)、Y.ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー(Journal of Bacteriology)、146:656−659(198
1);マイスナー(Meissner)、P.S.およびJ.O.ファル
キンハム(Falkinham)、ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー(Journal of Bacteriology)、157:669−67
2(1984)。対照的に、スメグマ菌(M.smegmatis)、ウ
シ結核菌(M.bovis)−BCGおよびヒト結核菌(M.tuberc
ulosis)の中で複製する種々のファージは記載されそし
て分離物の型別のために使用されてきている。
使用する方法は、E.coliの中でプラスミドとしてそし
てマイコバクテリアの中でファージとして複製するベク
ターを構成することであった。シャトルプラスミドのこ
の開発を達成する1つのアプローチは、マイコバクテリ
アのDNAがE.coliの中でよく発現されないので、プラス
ミドベクターの中で、E.coli宿主を溶菌するであろう機
能的マイコバクテリオファージのゲノムをクローニング
することができるであろうという考えに基づいた。こう
して、両者の型の有機体を複製することができるであろ
う。スメグマ菌(M.smegmatis)のトランスフェクショ
ンはマイコバクテリオファージの粒子を生ずるであろう
から、遅く増殖するマイコバクテリア(例えば、BCG)
の中に問題のDNAを導入することは、ファージの感染に
より達成することができるであろう。ストレプトミセス
属(Streptomyces)のための2機能的ベクターは、スア
レズ(Suarez)およびチェイター(Chater)により記載
された。スアレズ(Suarez)J.E.およびK.F.チェイター
(Chater)、ネイチャー(Nature)、286:527−529(19
80)。E.coliの中で二重の機能をもつラムダーColE1ベ
クターは、ブレンナー(Brenner)および共同研究者に
よりプラスミドと呼ばれた。ブランナー(Brenner)、
S.ら、遺伝子(Gene)、17:27−44(1982)。
てマイコバクテリアの中でファージとして複製するベク
ターを構成することであった。シャトルプラスミドのこ
の開発を達成する1つのアプローチは、マイコバクテリ
アのDNAがE.coliの中でよく発現されないので、プラス
ミドベクターの中で、E.coli宿主を溶菌するであろう機
能的マイコバクテリオファージのゲノムをクローニング
することができるであろうという考えに基づいた。こう
して、両者の型の有機体を複製することができるであろ
う。スメグマ菌(M.smegmatis)のトランスフェクショ
ンはマイコバクテリオファージの粒子を生ずるであろう
から、遅く増殖するマイコバクテリア(例えば、BCG)
の中に問題のDNAを導入することは、ファージの感染に
より達成することができるであろう。ストレプトミセス
属(Streptomyces)のための2機能的ベクターは、スア
レズ(Suarez)およびチェイター(Chater)により記載
された。スアレズ(Suarez)J.E.およびK.F.チェイター
(Chater)、ネイチャー(Nature)、286:527−529(19
80)。E.coliの中で二重の機能をもつラムダーColE1ベ
クターは、ブレンナー(Brenner)および共同研究者に
よりプラスミドと呼ばれた。ブランナー(Brenner)、
S.ら、遺伝子(Gene)、17:27−44(1982)。
この目的で、マイコバクテリオファージTM4を使用し
た。TM4は鳥結核菌(M.avium)から分離された溶原性フ
ァージであると報告された。チンメ(Timme)、T.L.お
よびP.L.ブレンナン(Brennan)、ジャーナル・オブ・
ジェネティック・マイクロバイオロジー(Journal of
Genetic Microbiology)、130:205−209(1984)。
それはスメグマ菌(M.smegmatis)を溶原化するファー
ジであると特性決定された。それはスメグマ菌(M.smeg
matis)、BCG、およびヒト結核菌(M.tuberculosis)の
中で複製することができ、そしてテンペレートであると
報告された。このファージは、また、50kbの二本鎖DNA
のゲノムを有し、そして粘着末端を有する。しかしなが
ら、同様な特性を有する他のマイコバクテリオファージ
を使用することができる。TM4とともに使用して次に記
載する手順は、また、ベクターの構成においてこのよう
な他のマイコバクテリオファージとともに使用すること
ができる。
た。TM4は鳥結核菌(M.avium)から分離された溶原性フ
ァージであると報告された。チンメ(Timme)、T.L.お
よびP.L.ブレンナン(Brennan)、ジャーナル・オブ・
ジェネティック・マイクロバイオロジー(Journal of
Genetic Microbiology)、130:205−209(1984)。
それはスメグマ菌(M.smegmatis)を溶原化するファー
ジであると特性決定された。それはスメグマ菌(M.smeg
matis)、BCG、およびヒト結核菌(M.tuberculosis)の
中で複製することができ、そしてテンペレートであると
報告された。このファージは、また、50kbの二本鎖DNA
のゲノムを有し、そして粘着末端を有する。しかしなが
ら、同様な特性を有する他のマイコバクテリオファージ
を使用することができる。TM4とともに使用して次に記
載する手順は、また、ベクターの構成においてこのよう
な他のマイコバクテリオファージとともに使用すること
ができる。
ファージTM4の中にE.coliプラスミドのレプリコンを
導入して、E.coliの中でプラスミドとしてそしてマイコ
バクテリアの中でファージ複製するベクターを発生する
方法を第2図に概略的に示す。平板源リゼイトおよびTM
4ファージのゲノムのDNAを、D29ファージについて記載
したように調製した(参照、実施例1)。TM4 DNAを高
い濃度で結合して、アニリーングした粘着末端の長い鎖
状体を形成した。結合したDNAをSau3Aで部分的に消化し
た。Sau3AはTM4ゲノムを頻繁に(例えば、平均300bp毎
に1回)切断して、大きさが30〜50kbの断片を形成す
る。それは長さはが全TM4ゲノムまたは小さい決失をも
つTM4ゲノムの長さである1組のDNA断片を発生するが、
ゲノム内のSau3A部位のいずれにおいても切断される。
これらのDNA断片を6.5kbのコスミドpHC79に結合し、こ
のpHC79はアンピシリン抵抗性の遺伝子を含有し、そし
てBamH Iで切断されている。ホーン(Hohn)、B.および
J.コリンス(Collins)、遺伝子(Gene)、9:291−298
(1980)。適当な大きさの組み換え分子について選択す
るために、結合混合物を生体外でマイコバクテリオファ
ージラムダのベッドの中にパッケージングした。これは
ラムダCOS部位を含有しそして大きさが38〜53kbであるD
NA断片について選択する。生ずるファージ粒子をE.coli
の柱に形質導入し、そしてpHC79::TM4 DNAを含有する
コロニーをアンピシリンを含有する培地上で選択した。
円形DNAを共有的に閉じたプラスミドを40,000のプール
したアンピシリン抵抗性(ampr)コロニーから分離し
た。バーボイム(Birnboim)、H.およびDoly、ジャーナ
ル・オブ・ヌクレイックアシッド・リサーチ(Journal
of Nucleic Acid Research)、7:1513−1525(19
79)。
導入して、E.coliの中でプラスミドとしてそしてマイコ
バクテリアの中でファージ複製するベクターを発生する
方法を第2図に概略的に示す。平板源リゼイトおよびTM
4ファージのゲノムのDNAを、D29ファージについて記載
したように調製した(参照、実施例1)。TM4 DNAを高
い濃度で結合して、アニリーングした粘着末端の長い鎖
状体を形成した。結合したDNAをSau3Aで部分的に消化し
た。Sau3AはTM4ゲノムを頻繁に(例えば、平均300bp毎
に1回)切断して、大きさが30〜50kbの断片を形成す
る。それは長さはが全TM4ゲノムまたは小さい決失をも
つTM4ゲノムの長さである1組のDNA断片を発生するが、
ゲノム内のSau3A部位のいずれにおいても切断される。
これらのDNA断片を6.5kbのコスミドpHC79に結合し、こ
のpHC79はアンピシリン抵抗性の遺伝子を含有し、そし
てBamH Iで切断されている。ホーン(Hohn)、B.および
J.コリンス(Collins)、遺伝子(Gene)、9:291−298
(1980)。適当な大きさの組み換え分子について選択す
るために、結合混合物を生体外でマイコバクテリオファ
ージラムダのベッドの中にパッケージングした。これは
ラムダCOS部位を含有しそして大きさが38〜53kbであるD
NA断片について選択する。生ずるファージ粒子をE.coli
の柱に形質導入し、そしてpHC79::TM4 DNAを含有する
コロニーをアンピシリンを含有する培地上で選択した。
円形DNAを共有的に閉じたプラスミドを40,000のプール
したアンピシリン抵抗性(ampr)コロニーから分離し
た。バーボイム(Birnboim)、H.およびDoly、ジャーナ
ル・オブ・ヌクレイックアシッド・リサーチ(Journal
of Nucleic Acid Research)、7:1513−1525(19
79)。
このライブラリーは、pHC79コスミドDNAがTM4ゲノム
付近のSau3A部位の中に不規則的に挿入されている、TM4
ゲノムの組み換え分子を含有する。それをスメグマ菌
(M.smegmatis)スフェロプラストの中にトランスフェ
クションして、非必須領域に挿入されたpHC79を有するT
M4ファージについて選択した。こうして、このようなフ
ァージはシャトルプラスミドであった。トランスフェク
ションはプラスミドDNAの1μg当たり100プラーク形成
単位(pfu)を生じた。プラークのリフトを使用して、
32P標識したpHC79 DNAに対するハイブリダイゼーショ
ンについてスクリーニングした;4000のプラークのうち
で10にのみが標識したpHC79にハイブリダイゼーション
した。
付近のSau3A部位の中に不規則的に挿入されている、TM4
ゲノムの組み換え分子を含有する。それをスメグマ菌
(M.smegmatis)スフェロプラストの中にトランスフェ
クションして、非必須領域に挿入されたpHC79を有するT
M4ファージについて選択した。こうして、このようなフ
ァージはシャトルプラスミドであった。トランスフェク
ションはプラスミドDNAの1μg当たり100プラーク形成
単位(pfu)を生じた。プラークのリフトを使用して、
32P標識したpHC79 DNAに対するハイブリダイゼーショ
ンについてスクリーニングした;4000のプラークのうち
で10にのみが標識したpHC79にハイブリダイゼーション
した。
プラークの精製およびスメグマ菌(M.smegmatis)細
胞上の増殖後、1つのこのようなファージを詳細に研究
し、そしてプラスミド、phAE1と表示した。プラスミドp
hAE1は、ブダベスト条約の条項に従い、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション((the American T
ype Culture Collection)(マリイランド州ロックビ
レ)に受け入れ番号40306号で受託された(1986年2月2
6日)。受託物への公衆のアクセスへのすべての制限
は、この出願に基づく米国特許が登録されると、最終的
に除去される。DNAをスメグマ菌(M.smegmatis)上で増
殖したphAE1ファージ粒子から分離し、CsClの勾配で精
製し、結合して鎖状体を形成し、そして生体内でバクテ
リオファージラムダのヘッドの中にパッケージングし
た。生ずる粒子はアンピシリン抵抗性をE.coli細胞に転
移しそして、トランスフェクションすると、スメグマ菌
(M.smegmatis)上にプラークを産生した。これはphAE1
がシャトルベクターとして機能する証拠であった。
胞上の増殖後、1つのこのようなファージを詳細に研究
し、そしてプラスミド、phAE1と表示した。プラスミドp
hAE1は、ブダベスト条約の条項に従い、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション((the American T
ype Culture Collection)(マリイランド州ロックビ
レ)に受け入れ番号40306号で受託された(1986年2月2
6日)。受託物への公衆のアクセスへのすべての制限
は、この出願に基づく米国特許が登録されると、最終的
に除去される。DNAをスメグマ菌(M.smegmatis)上で増
殖したphAE1ファージ粒子から分離し、CsClの勾配で精
製し、結合して鎖状体を形成し、そして生体内でバクテ
リオファージラムダのヘッドの中にパッケージングし
た。生ずる粒子はアンピシリン抵抗性をE.coli細胞に転
移しそして、トランスフェクションすると、スメグマ菌
(M.smegmatis)上にプラークを産生した。これはphAE1
がシャトルベクターとして機能する証拠であった。
スメグマ菌(M.smegmatis)上で増殖したファージ粒
子からislしたphAE1 DNAおよびE.coliから分離したプ
ラスミドDNAとして分離したphAE1 DNAの制限消化は、
ファージDNA調製物において見られる粘着末端により一
緒に保持された非アニリーング断片の存在を除外して、
同一のパターンを示した(第3A図)。サザン分析によ
り、コスミドpHC79はTM4ゲノムの2つの11kbのKpn I制
限断片の1つ内にクローニングされることが実証された
(第3B図)。電子顕微鏡検査により、phAE1粒子は、平
均直径が50μmである6角形のヘッドをもつバクテリオ
ファージラムダに似る。しかしながら、これらの粒子は
長いテイル(180〜220μmの上さ)を有し、テイルの多
くの上にディスク様ベースプレートが存在する(第4C
図)。この構造は親のTM4ファージのそれに非常に類似
する。チンメ(Timme)、T.L.およびP.L.ブレンナン(b
rennan)、ジャーナル・オブ・ジェネティック・マイク
ロバイオロジー(Journal of Gen.Microbiology)、1
30:205−209(1984)。
子からislしたphAE1 DNAおよびE.coliから分離したプ
ラスミドDNAとして分離したphAE1 DNAの制限消化は、
ファージDNA調製物において見られる粘着末端により一
緒に保持された非アニリーング断片の存在を除外して、
同一のパターンを示した(第3A図)。サザン分析によ
り、コスミドpHC79はTM4ゲノムの2つの11kbのKpn I制
限断片の1つ内にクローニングされることが実証された
(第3B図)。電子顕微鏡検査により、phAE1粒子は、平
均直径が50μmである6角形のヘッドをもつバクテリオ
ファージラムダに似る。しかしながら、これらの粒子は
長いテイル(180〜220μmの上さ)を有し、テイルの多
くの上にディスク様ベースプレートが存在する(第4C
図)。この構造は親のTM4ファージのそれに非常に類似
する。チンメ(Timme)、T.L.およびP.L.ブレンナン(b
rennan)、ジャーナル・オブ・ジェネティック・マイク
ロバイオロジー(Journal of Gen.Microbiology)、1
30:205−209(1984)。
pHC79にハイブリダイゼーションしない、スメグマ菌
(M.smegmatis)の中へのpHC79::TM4ライブラリーのト
ランスフェクションから生ずる分離されたファージから
のDNAの制限分析は、それらが同一であることを示し
た。ファージは組み換えの事象から生じたと思われ、こ
の事象は2またはそれ以上のpHC79::TM4分子を含有する
トランスフェクションした細胞の中で起こり、野生型TM
4ゲノムを生ずる。
(M.smegmatis)の中へのpHC79::TM4ライブラリーのト
ランスフェクションから生ずる分離されたファージから
のDNAの制限分析は、それらが同一であることを示し
た。ファージは組み換えの事象から生じたと思われ、こ
の事象は2またはそれ以上のpHC79::TM4分子を含有する
トランスフェクションした細胞の中で起こり、野生型TM
4ゲノムを生ずる。
スメグマ菌(M.smegmatis)から得られたシャトルプ
ラスミドphAE1がその親のTM4に類似し、試験した3つの
異なるウシ結核菌(M.bovis)−BCGワクチン菌株:グラ
クソ(Glaxo)、パスツール(Pasteur)およびダニッシ
(Danish)のBCGを感染し、そしてそれらの中で複製す
るという観察は、とくに興味あることである。これらの
結果は第4A図および第4B図に表されている。
ラスミドphAE1がその親のTM4に類似し、試験した3つの
異なるウシ結核菌(M.bovis)−BCGワクチン菌株:グラ
クソ(Glaxo)、パスツール(Pasteur)およびダニッシ
(Danish)のBCGを感染し、そしてそれらの中で複製す
るという観察は、とくに興味あることである。これらの
結果は第4A図および第4B図に表されている。
こうして、これは組み換えDNA分子であるE.coli−マ
イコバクテリアのシャトルプラスミドの首尾よい構成を
実証し、組み換えDNA分子はプラスミドとしてE.coliの
中で複製する能力を有するばかりでなく、かつまたバク
テリオファージのヘッドの中にまたはバクテリオファー
ジの粒子の中にパッケージングされる能力を有する。そ
れは、また、組み換えDNAは急速に増殖するマイコバク
テリウム(スメグマ菌(M.smegmatis))および遅く増
殖するマイコバクテリウム(ウシ結核菌(M.bovis)−B
CG)の両者の中に導入されたことを実証する。これはシ
ャトルプラスミドでBCGワクチン菌株を感染することを
可能とし、こうして、クローニングした遺伝子をマイコ
バクテリアの中に導入することを可能とする。こうし
て、これはBCGのためのトランスフェクション系の開発
の必要性を排除する。すなわち、E.coli−マイコバクテ
リアのシャトルプラスミドは、マイコバクテリアの中に
トランスフェクションすると、マイコバクテリアの粒子
の中にパッケージングされるので、問題のDNAは形質導
入により遅く増殖するマイコバクテリア(例えば、BC
G)の中に導入することができる。
イコバクテリアのシャトルプラスミドの首尾よい構成を
実証し、組み換えDNA分子はプラスミドとしてE.coliの
中で複製する能力を有するばかりでなく、かつまたバク
テリオファージのヘッドの中にまたはバクテリオファー
ジの粒子の中にパッケージングされる能力を有する。そ
れは、また、組み換えDNAは急速に増殖するマイコバク
テリウム(スメグマ菌(M.smegmatis))および遅く増
殖するマイコバクテリウム(ウシ結核菌(M.bovis)−B
CG)の両者の中に導入されたことを実証する。これはシ
ャトルプラスミドでBCGワクチン菌株を感染することを
可能とし、こうして、クローニングした遺伝子をマイコ
バクテリアの中に導入することを可能とする。こうし
て、これはBCGのためのトランスフェクション系の開発
の必要性を排除する。すなわち、E.coli−マイコバクテ
リアのシャトルプラスミドは、マイコバクテリアの中に
トランスフェクションすると、マイコバクテリアの粒子
の中にパッケージングされるので、問題のDNAは形質導
入により遅く増殖するマイコバクテリア(例えば、BC
G)の中に導入することができる。
現在まで、これは実施することができず、そしてこの
進歩は、1または2以上の問題の抗原に対して免疫化す
るために使用できる、組み換えマイコバクテリアのワク
チンのベヒクルの産生を可能とする。
進歩は、1または2以上の問題の抗原に対して免疫化す
るために使用できる、組み換えマイコバクテリアのワク
チンのベヒクルの産生を可能とする。
これらのプラスミドを構成するために生体外のパッケ
ージングを使用することは、パッケージング系の大きさ
の限界を越えないかぎり、これらのベクターの中に遺伝
子(例えば、それに対する免疫応答を望む、1または2
以上の病原体ための1または2以上の抗原をエンコード
する、遺伝子、または問題のDNA)をクローニングする
方法として拡張することができる。また、追加のTM4::p
HC79組み換えプラスミドをスクリーニングすることによ
って、TM4ファージから欠失することができるDNAの最大
量を決定すること、およびその中にDNAを挿入すること
ができるファージのゲノムの追加の非必須領域を定める
ことができる。
ージングを使用することは、パッケージング系の大きさ
の限界を越えないかぎり、これらのベクターの中に遺伝
子(例えば、それに対する免疫応答を望む、1または2
以上の病原体ための1または2以上の抗原をエンコード
する、遺伝子、または問題のDNA)をクローニングする
方法として拡張することができる。また、追加のTM4::p
HC79組み換えプラスミドをスクリーニングすることによ
って、TM4ファージから欠失することができるDNAの最大
量を決定すること、およびその中にDNAを挿入すること
ができるファージのゲノムの追加の非必須領域を定める
ことができる。
シャトルプラスミドによりマイコバクテリアの中に新
しい遺伝子(例えば、抗原をエンコードする問題のDN
A)を導入することは、E.coliの中でシャトルプラスミ
ドの中にDNA断片をクローニングし、引き続いてスメグ
マ菌(M.smegmatis)スフェロプラストの中にそれらを
トランスフェクションすることを伴う。これはクローニ
ングした遺伝子を含有する組み換えファージ粒子を生ず
る。生ずる組み換えファージを含有するスメグマ菌(M.
smegmatis)スフェロプラストを使用して、BCGを高い効
率(100%の効率に近付く)感染し、こうして組み換え
ファージ中に含まれる問題のDNAをBCGの中に導入するこ
とができる。マイコバクテリアの細胞の中で外来遺伝子
の安定な発現を可能とする、溶原性または組み換えのた
めの条件を開発することは、高度に望ましい。
しい遺伝子(例えば、抗原をエンコードする問題のDN
A)を導入することは、E.coliの中でシャトルプラスミ
ドの中にDNA断片をクローニングし、引き続いてスメグ
マ菌(M.smegmatis)スフェロプラストの中にそれらを
トランスフェクションすることを伴う。これはクローニ
ングした遺伝子を含有する組み換えファージ粒子を生ず
る。生ずる組み換えファージを含有するスメグマ菌(M.
smegmatis)スフェロプラストを使用して、BCGを高い効
率(100%の効率に近付く)感染し、こうして組み換え
ファージ中に含まれる問題のDNAをBCGの中に導入するこ
とができる。マイコバクテリアの細胞の中で外来遺伝子
の安定な発現を可能とする、溶原性または組み換えのた
めの条件を開発することは、高度に望ましい。
マイコバクテリアの細胞の中への問題のDNAの導入
前述のおよび下の節に記載するシャトルベクターを使
用して、1または2以上の問題の病原体のための1また
は2以上の抗原をエンコードする問題のDNAを、マイコ
バクテリア、例えば、ウシ結核菌(M.bovis)−BCGまた
はスメグマ菌(M.smegmatis)の中に導入することがで
きる。それは、また、適当な抗原、例えば、ヒトのゴナ
ドトロピンホルモン(HGH)断片をマイコバクテリアの
中に導入して、抗生殖「ワクチン」を産生することがで
きる。これらのベクターを、また、使用して、腫瘍細胞
のための増殖阻害因子または殺細胞因子であるタンパク
質またはポリペプチドをエンコードするDNAを導入する
ことができる。生ずる組み換えマイコバクテリアを使用
して、それぞれ、マイコバクテリアの中で発現された外
来抗原に対する免疫応答を非特異的に増強し、そしてあ
るヒトの癌を処置することができる。このシャトルベク
ターは、バクテリア(例えば、E.coli、ストレプトミセ
ス属(Streptomyces)、バチルス属(Bacillus))、ま
たは他の有機体(例えば、酵母菌)の中で組み換えDNA
構成体を操作および増幅し、引き続いてそれらをDNAが
発現されるマイコバクテリウムの中に転移する手段を提
供する。
用して、1または2以上の問題の病原体のための1また
は2以上の抗原をエンコードする問題のDNAを、マイコ
バクテリア、例えば、ウシ結核菌(M.bovis)−BCGまた
はスメグマ菌(M.smegmatis)の中に導入することがで
きる。それは、また、適当な抗原、例えば、ヒトのゴナ
ドトロピンホルモン(HGH)断片をマイコバクテリアの
中に導入して、抗生殖「ワクチン」を産生することがで
きる。これらのベクターを、また、使用して、腫瘍細胞
のための増殖阻害因子または殺細胞因子であるタンパク
質またはポリペプチドをエンコードするDNAを導入する
ことができる。生ずる組み換えマイコバクテリアを使用
して、それぞれ、マイコバクテリアの中で発現された外
来抗原に対する免疫応答を非特異的に増強し、そしてあ
るヒトの癌を処置することができる。このシャトルベク
ターは、バクテリア(例えば、E.coli、ストレプトミセ
ス属(Streptomyces)、バチルス属(Bacillus))、ま
たは他の有機体(例えば、酵母菌)の中で組み換えDNA
構成体を操作および増幅し、引き続いてそれらをDNAが
発現されるマイコバクテリウムの中に転移する手段を提
供する。
結局、例えば、らい、結核、マラリア、ジフテリア、
テタヌス、レイシュマニア、サルモネラ、シストミアシ
ス(schistomiasis)、はしか、おたふくかぜ、ヘルペ
スおよびインフルエンザに対して個体を免疫化するため
に使用できるマイコバクテリアのワクチンを製造するこ
とができる。T細胞のメモリーまたはエフェクターの機
能を必要とする、病原体の抗原ををエンコードする遺伝
子を固有する能力は、とくに価値がある。生ずる組み換
えマイコバクテリアのワクチンを宿主に投与すると、宿
主の免疫系は刺激されて保護的免疫応答を生成する。
テタヌス、レイシュマニア、サルモネラ、シストミアシ
ス(schistomiasis)、はしか、おたふくかぜ、ヘルペ
スおよびインフルエンザに対して個体を免疫化するため
に使用できるマイコバクテリアのワクチンを製造するこ
とができる。T細胞のメモリーまたはエフェクターの機
能を必要とする、病原体の抗原ををエンコードする遺伝
子を固有する能力は、とくに価値がある。生ずる組み換
えマイコバクテリアのワクチンを宿主に投与すると、宿
主の免疫系は刺激されて保護的免疫応答を生成する。
病原体または毒素に対するワクチンは、本発明のシャ
トルプラスミドを使用して、次の手順により生成するこ
とができる:それに対する保護を望む病原体または毒素
のための抗原(または複数の抗原)をエンコードするDN
Aが得られる。DNAは天然に産出するDNAの分離(例え
ば、病原性有機体または毒素産生有機体から)すること
によって;既知の遺伝子操作技術(例えば、参照、マニ
アチス(Maniatis)T.ら、モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning);実験室のマニュアル(A La
boratory Mannual)、コールド・スプリング・ハーバ
ー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク(1982)を
使用して、問題のDNAの配列をクローニングおよび増幅
することによって;あるいは機械的合成により得ること
ができる。
トルプラスミドを使用して、次の手順により生成するこ
とができる:それに対する保護を望む病原体または毒素
のための抗原(または複数の抗原)をエンコードするDN
Aが得られる。DNAは天然に産出するDNAの分離(例え
ば、病原性有機体または毒素産生有機体から)すること
によって;既知の遺伝子操作技術(例えば、参照、マニ
アチス(Maniatis)T.ら、モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning);実験室のマニュアル(A La
boratory Mannual)、コールド・スプリング・ハーバ
ー(Cold Spring Harbor)、ニューヨーク(1982)を
使用して、問題のDNAの配列をクローニングおよび増幅
することによって;あるいは機械的合成により得ること
ができる。
次の手順により、問題の1または2以上の遺伝子(す
なわち、それに対する免疫性を望む1または2以上の抗
原をエンコードする)をシャトルプラスミドの中にクロ
ーニングされる。これは第2図を参照して説明すること
ができ、第2図はシャトルプラスミドphAE1の概略的表
示である。既知の技術を使用して、シャトルプラスミド
の粘着末端を結合する。生ずるシャトルプラスミドを独
特制限酵素(例えば、シャトルプラスミド中の独特部位
において切断する制限酵素、例えば、EcoR IおよびEcoR
V)で切断(消化)する。このようにして作られる切断
に対する別のアプローチは、他の制限酵素とともに有用
である(それにより切断することができる)ポリリンカ
ー(オリゴヌクレオチド配列)の付加(結合による)で
ある。この場合において、リンカーは選択した制限酵素
で切断して開かれ、問題のDNAを挿入することができる
部位を生成する。
なわち、それに対する免疫性を望む1または2以上の抗
原をエンコードする)をシャトルプラスミドの中にクロ
ーニングされる。これは第2図を参照して説明すること
ができ、第2図はシャトルプラスミドphAE1の概略的表
示である。既知の技術を使用して、シャトルプラスミド
の粘着末端を結合する。生ずるシャトルプラスミドを独
特制限酵素(例えば、シャトルプラスミド中の独特部位
において切断する制限酵素、例えば、EcoR IおよびEcoR
V)で切断(消化)する。このようにして作られる切断
に対する別のアプローチは、他の制限酵素とともに有用
である(それにより切断することができる)ポリリンカ
ー(オリゴヌクレオチド配列)の付加(結合による)で
ある。この場合において、リンカーは選択した制限酵素
で切断して開かれ、問題のDNAを挿入することができる
部位を生成する。
第1の場合(独特制限酵素を使用する切断)におい
て、1回切断されそして問題のDNAを挿入することがで
きる、シャトルプラスミドの分子が生ずる。第2の場合
において、また、DNAを挿入できる少なくとも1つの部
位が存在する。抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子
(例えば、アンピシリン抵抗性をエンコードする遺伝
子)およびそれに対する免疫性を望む1または2以上の
抗原をエンコードするDNAを、既知の技術を使用して、
制限部位において結合することができる。挿入されるDN
AおよびシャトルプラスミドのDNAは、一般に、等モル量
で結合される。生ずる結合されたDNA、この場合におい
てこれはシャトルプラスミドのDNA、抗生物質抵抗性遺
伝子および抗原をエンコードするDNAを包含する、を、
ラムダ生体外パッケージング混合物を使用して、バクテ
リオファージのヘッドの中にパッケージングする。引き
続いて、E.coliをファージで形質導入し、その結果抗生
物質抵抗性をエンコードする遺伝子および抗原をエンコ
ードするDNAを含有するコロニーについてスクリーニン
グする(抗生物質を含有する培地を使用して)ことがで
きる。
て、1回切断されそして問題のDNAを挿入することがで
きる、シャトルプラスミドの分子が生ずる。第2の場合
において、また、DNAを挿入できる少なくとも1つの部
位が存在する。抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子
(例えば、アンピシリン抵抗性をエンコードする遺伝
子)およびそれに対する免疫性を望む1または2以上の
抗原をエンコードするDNAを、既知の技術を使用して、
制限部位において結合することができる。挿入されるDN
AおよびシャトルプラスミドのDNAは、一般に、等モル量
で結合される。生ずる結合されたDNA、この場合におい
てこれはシャトルプラスミドのDNA、抗生物質抵抗性遺
伝子および抗原をエンコードするDNAを包含する、を、
ラムダ生体外パッケージング混合物を使用して、バクテ
リオファージのヘッドの中にパッケージングする。引き
続いて、E.coliをファージで形質導入し、その結果抗生
物質抵抗性をエンコードする遺伝子および抗原をエンコ
ードするDNAを含有するコロニーについてスクリーニン
グする(抗生物質を含有する培地を使用して)ことがで
きる。
生ずるライブラリーは、例えば、エレクトロポレイシ
ョンを使用してスメグマ菌(M.smegmatis)の中に導入
する。クローニングしたインサートのDNAを含有するシ
ャトルプラスミドを含有するプラークを選択する。引き
続いて、組み換えスメグマ菌(M.smegmatis)を使用し
て、培養可能なマイコバクテリウム、例えば、BCGを高
い効率で感染することができる。結局、抗原をエンコー
ドするDNAをマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に導入
し、ここでそれは発現されるであろう。
ョンを使用してスメグマ菌(M.smegmatis)の中に導入
する。クローニングしたインサートのDNAを含有するシ
ャトルプラスミドを含有するプラークを選択する。引き
続いて、組み換えスメグマ菌(M.smegmatis)を使用し
て、培養可能なマイコバクテリウム、例えば、BCGを高
い効率で感染することができる。結局、抗原をエンコー
ドするDNAをマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に導入
し、ここでそれは発現されるであろう。
問題のDNA(ここでそれらのゲノムのDNAの中に組み込
まれた1または2以上の抗原をエンコードする)を含有
するBCGの選択は、選択可能なマーカーを使用して実施
することができる。組み換えファージで感染して導入さ
れた、1または2以上の抗原をエンコードするDNAを含
有するBCGの選択するためにアプローチは、抗生物質抵
抗性遺伝子である、選択可能なマーカーの使用にに基づ
く。この場合において、シャトルプラスミドは、例え
ば、カナマイシン抵抗性、ビオマイシン抵抗性、チオス
トレプトン抵抗性、ハイグロマイシン抵抗性またはブレ
オマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子を包含する。
まれた1または2以上の抗原をエンコードする)を含有
するBCGの選択は、選択可能なマーカーを使用して実施
することができる。組み換えファージで感染して導入さ
れた、1または2以上の抗原をエンコードするDNAを含
有するBCGの選択するためにアプローチは、抗生物質抵
抗性遺伝子である、選択可能なマーカーの使用にに基づ
く。この場合において、シャトルプラスミドは、例え
ば、カナマイシン抵抗性、ビオマイシン抵抗性、チオス
トレプトン抵抗性、ハイグロマイシン抵抗性またはブレ
オマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子を包含する。
選択可能なマーカーを使用して問題のDNAを含有するB
CGを選択する、第2のアプローチは、栄養要求変異種の
方法(すなわち、突然変異体を誘導する有機体が要求し
ない、ある栄養または物質を要求する突然変異体の有機
体の使用に頼る方法)である。この場合において、突然
変異体を有するマイコバクテリウムを使用し、そして失
なったまたは突然変した機能をエンコードする遺伝子を
シャトルプラスミド(これは、また、抗原をエンコード
するDNAを含有する)の中に組み込む。こうして、抗原
をエンコードするDNAを含有するマイコバクテリアにつ
いての選択は、適当な培地上で増殖したとき、シャトル
プラスミドが首尾よく導入されるマイコバクテリアが生
き残る能力に基づく。
CGを選択する、第2のアプローチは、栄養要求変異種の
方法(すなわち、突然変異体を誘導する有機体が要求し
ない、ある栄養または物質を要求する突然変異体の有機
体の使用に頼る方法)である。この場合において、突然
変異体を有するマイコバクテリウムを使用し、そして失
なったまたは突然変した機能をエンコードする遺伝子を
シャトルプラスミド(これは、また、抗原をエンコード
するDNAを含有する)の中に組み込む。こうして、抗原
をエンコードするDNAを含有するマイコバクテリアにつ
いての選択は、適当な培地上で増殖したとき、シャトル
プラスミドが首尾よく導入されるマイコバクテリアが生
き残る能力に基づく。
例えば、宿主突然変異体(例えば、スメグマ菌(M.sm
egmatis)、BCG)および突然変異体を補足する選択可能
なマーカーを包含する系を使用することができる。この
ような系は、pyrF-BCG突然変異体である宿主突然変異体
および選択可能なマーカー、例えば、pyrF+遺伝子(そ
れらは(突然変異体)BCGの中に抗原をエンコードするD
NAを導入するために使用するプラスミドのシャトルベク
ターの中に存在する)を包含することができる。例え
ば、プラスミドは、コスミドのDNAの中に挿入された抗
原をエンコードするDNAに加えて、pyrF+遺伝子を含むこ
とができる。こうして、別のアプローチは2−デオキシ
グルコース抵抗性突然変異体を使用することである:こ
の場合において、マイコバクテリアのグルコキナーゼ遺
伝子を、pyrFについて前述したように、プラスミドの中
にクローニングしそして選択に使用する。
egmatis)、BCG)および突然変異体を補足する選択可能
なマーカーを包含する系を使用することができる。この
ような系は、pyrF-BCG突然変異体である宿主突然変異体
および選択可能なマーカー、例えば、pyrF+遺伝子(そ
れらは(突然変異体)BCGの中に抗原をエンコードするD
NAを導入するために使用するプラスミドのシャトルベク
ターの中に存在する)を包含することができる。例え
ば、プラスミドは、コスミドのDNAの中に挿入された抗
原をエンコードするDNAに加えて、pyrF+遺伝子を含むこ
とができる。こうして、別のアプローチは2−デオキシ
グルコース抵抗性突然変異体を使用することである:こ
の場合において、マイコバクテリアのグルコキナーゼ遺
伝子を、pyrFについて前述したように、プラスミドの中
にクローニングしそして選択に使用する。
この基準に基づく選択は、ゲノムのDNAの中に安定に
組み込まれそしてバチルス属(Bacillus)により発現さ
れた、抗原をエンコードするDNAを有するBCG生ずるであ
ろう。このために、遺伝子の発現シグナル(例えば、プ
ロモーター、リボソーム結合部位)は、外来(抗原をエ
ンコードする)DNAより上流に含まれて、抗原をエンコ
ードするDNAを含有するBCGはそれを十分なレベルで発現
して、それを投与した宿主において免疫応答を誘発する
ことができる。
組み込まれそしてバチルス属(Bacillus)により発現さ
れた、抗原をエンコードするDNAを有するBCG生ずるであ
ろう。このために、遺伝子の発現シグナル(例えば、プ
ロモーター、リボソーム結合部位)は、外来(抗原をエ
ンコードする)DNAより上流に含まれて、抗原をエンコ
ードするDNAを含有するBCGはそれを十分なレベルで発現
して、それを投与した宿主において免疫応答を誘発する
ことができる。
また、1または2以上の抗原をエンコードするDNAを
含有するBCGを、モノクローナル抗体の使用により選択
することができる。この場合において、モノクローナル
抗体を利用できる抗原(例えば、らい菌、(M.leprae)
またはヒト結核菌(M.tuberculosis))の1または2以
上のエピトープをエンコードする遺伝子または遺伝子断
片は、マイコバクテリアの中に導入される。このような
モノクローナル抗体を使用して、これらのエピトープの
1または2以上をエンコードする1または2以上の遺伝
子を含有する組み換えBCGについて選択する。このよう
にして導入された抗原遺伝子は、プロモーター配列およ
び他の調節配列を含有する。結局、追加の系列(例え
ば、他の抗原をエンコードするDNA)を、遺伝子操作技
術を使用して、インフレームで付加することができ、こ
うして1つの抗原に対するモノクローナル抗体により同
定される組み換えBCGは、また、そのように導入された
他の外来抗原をエンコードするDNAを発現するであろ
う。
含有するBCGを、モノクローナル抗体の使用により選択
することができる。この場合において、モノクローナル
抗体を利用できる抗原(例えば、らい菌、(M.leprae)
またはヒト結核菌(M.tuberculosis))の1または2以
上のエピトープをエンコードする遺伝子または遺伝子断
片は、マイコバクテリアの中に導入される。このような
モノクローナル抗体を使用して、これらのエピトープの
1または2以上をエンコードする1または2以上の遺伝
子を含有する組み換えBCGについて選択する。このよう
にして導入された抗原遺伝子は、プロモーター配列およ
び他の調節配列を含有する。結局、追加の系列(例え
ば、他の抗原をエンコードするDNA)を、遺伝子操作技
術を使用して、インフレームで付加することができ、こ
うして1つの抗原に対するモノクローナル抗体により同
定される組み換えBCGは、また、そのように導入された
他の外来抗原をエンコードするDNAを発現するであろ
う。
プラスミドを使用して培養可能なマイコバクテリアの
中に抗原をエンコードするDNAを導入する平行な方法
を、また、使用してワクチンのベヒクルをつくることが
できる。これはプラスミドとして問題のDNAを染色体外
に安定に維持し、そしてそれを引き続いて発現するであ
ろう。
中に抗原をエンコードするDNAを導入する平行な方法
を、また、使用してワクチンのベヒクルをつくることが
できる。これはプラスミドとして問題のDNAを染色体外
に安定に維持し、そしてそれを引き続いて発現するであ
ろう。
このようなシャトルプラスミドの構成は、第8図に概
略的に表されている。この場合において、抗原をエンコ
ードするDNAを含有する細胞の選択を可能とする、選択
可能なマーカーを使用する。選択可能なマーカーは、例
えば、抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子または、
シャトルプラスミドを参照して前述したように、栄養要
求変異種における損失を補足する遺伝子であることがで
きる。栄養要求変異種の方法において、栄養要求変異種
のマイコバクテリア突然変異体(例えば、pyr-F突然変
異体)を分離し、対応する野生型(非突然変異体)マイ
コバクテリウムの中に存在遺伝子をプラスミドの中に組
み込む。pyr-F突然変異体に加えて、グルコキナーゼ遺
伝子において欠失を有する、デオキソグルコース突然変
異体、ならびに他の生合成通路(例えば、アミノ酸生合
成、ビタミン生合成および炭水化物の代謝、例えば、ア
ラビノースおよびガラクトース)において突然変異体を
有する他のものを分離することができる。
略的に表されている。この場合において、抗原をエンコ
ードするDNAを含有する細胞の選択を可能とする、選択
可能なマーカーを使用する。選択可能なマーカーは、例
えば、抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子または、
シャトルプラスミドを参照して前述したように、栄養要
求変異種における損失を補足する遺伝子であることがで
きる。栄養要求変異種の方法において、栄養要求変異種
のマイコバクテリア突然変異体(例えば、pyr-F突然変
異体)を分離し、対応する野生型(非突然変異体)マイ
コバクテリウムの中に存在遺伝子をプラスミドの中に組
み込む。pyr-F突然変異体に加えて、グルコキナーゼ遺
伝子において欠失を有する、デオキソグルコース突然変
異体、ならびに他の生合成通路(例えば、アミノ酸生合
成、ビタミン生合成および炭水化物の代謝、例えば、ア
ラビノースおよびガラクトース)において突然変異体を
有する他のものを分離することができる。
いずれのアプローチにおいても、マイコバクテリアの
突然変異体を選択し、そして突然変異を補足する遺伝子
を、また、抗原をエンコードする問題のDNAを含有す
る、プラスミドベクターの中に組み込まれる。抗原をエ
ンコードするDNAが首尾よく導入されるマイコバクテリ
アの突然変異体は、適当に選択した培地(例えば、それ
に対する抵抗性を与える抗生物質を含有する培地、使用
する突然変異体において影響を受ける生合成の通路に含
まれる栄養を含有するか、あるいは欠く培地)上で培養
するか、あるいはc I遺伝子を使用するとき、形成する
プラークの出現を基準にして選択することによって、同
定(または選択)することができるであろう。
突然変異体を選択し、そして突然変異を補足する遺伝子
を、また、抗原をエンコードする問題のDNAを含有す
る、プラスミドベクターの中に組み込まれる。抗原をエ
ンコードするDNAが首尾よく導入されるマイコバクテリ
アの突然変異体は、適当に選択した培地(例えば、それ
に対する抵抗性を与える抗生物質を含有する培地、使用
する突然変異体において影響を受ける生合成の通路に含
まれる栄養を含有するか、あるいは欠く培地)上で培養
するか、あるいはc I遺伝子を使用するとき、形成する
プラークの出現を基準にして選択することによって、同
定(または選択)することができるであろう。
組み換えマイコバクテリアのワクチンのベヒクルの中
に抗原をエンコードするDNAを導入するとき有用なプラ
スミドの他の成分は、自律的に複製する配列(例えば、
レプリコン)であり、その存在はプラスミドを自律的に
複製させる(染色体外で)ための重要決定因子である。
これらの配列は、例えば、プラスミドのレプリコン、マ
イコバクテリアのセグメントまたは染色体の複製由来を
包含することができる。
に抗原をエンコードするDNAを導入するとき有用なプラ
スミドの他の成分は、自律的に複製する配列(例えば、
レプリコン)であり、その存在はプラスミドを自律的に
複製させる(染色体外で)ための重要決定因子である。
これらの配列は、例えば、プラスミドのレプリコン、マ
イコバクテリアのセグメントまたは染色体の複製由来を
包含することができる。
シャトルプラスミドphAE1の設計は、これらの因子の
いくつかを包含する。例えば、E.coliコスミドpHC79を
マイコバクテリアTM4の中への導入は、E.coliプラスミ
ドのレプリコン由来および選択可能なアンピシリン抵抗
性遺伝子、ならびにバクテリオファージラムダの粘着
(cos)配列および独特EcoR I部位を提供できるように
する。TM4ファージ内にEcoR I部位は存在しない;phAE1
内の独特EcoR I部位を使用して1または2以上の外来遺
伝子をプラスミドの中に導入することができる。実施例
4に記載するように、Tn903からのアミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼ(aph)遺伝子をエンコードす
る1.6kbのEcoR I断片を、このコスミドのクローニング
方法を使用して、phAE1の中にクローニングした。
いくつかを包含する。例えば、E.coliコスミドpHC79を
マイコバクテリアTM4の中への導入は、E.coliプラスミ
ドのレプリコン由来および選択可能なアンピシリン抵抗
性遺伝子、ならびにバクテリオファージラムダの粘着
(cos)配列および独特EcoR I部位を提供できるように
する。TM4ファージ内にEcoR I部位は存在しない;phAE1
内の独特EcoR I部位を使用して1または2以上の外来遺
伝子をプラスミドの中に導入することができる。実施例
4に記載するように、Tn903からのアミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼ(aph)遺伝子をエンコードす
る1.6kbのEcoR I断片を、このコスミドのクローニング
方法を使用して、phAE1の中にクローニングした。
ワクチンのベヒクルとして使用すべき、培養可能なマ
イコバクテリウム、例えば、ウシ結核菌(M.bovis)−B
CGまたはスメグマ菌(M.smegmatis)の中に抗原をエン
コードするDNAを効率よく導入するいくつかのアプロー
チが存在する。1または2以上の問題の抗原をエンコー
ドするDNA、選択可能なマーカーおよび自律的に複製す
る配列を包含する、プラスミドについて、原形質体の融
合を使用してマイコバクテリアの中に効率よく導入する
ことができる。この場合において、クローニングしたプ
ラスミドを有するE.coliまたはストレプトミセス属(St
reptomyces)を、既知の技術を使用して、マイコバクテ
リアのスフェロプラストと融合する。このアプローチを
使用して、外来(抗原をエンコードする)DNAをマイコ
バクテリウムの中に転移することができる。あるいは、
プラスミドのDNAを含有しそして染色体のDNAを本質的に
含有しない、E.coliミニ細胞は、ミニ細胞の原形質体の
融合を実施するとき使用することができる。
イコバクテリウム、例えば、ウシ結核菌(M.bovis)−B
CGまたはスメグマ菌(M.smegmatis)の中に抗原をエン
コードするDNAを効率よく導入するいくつかのアプロー
チが存在する。1または2以上の問題の抗原をエンコー
ドするDNA、選択可能なマーカーおよび自律的に複製す
る配列を包含する、プラスミドについて、原形質体の融
合を使用してマイコバクテリアの中に効率よく導入する
ことができる。この場合において、クローニングしたプ
ラスミドを有するE.coliまたはストレプトミセス属(St
reptomyces)を、既知の技術を使用して、マイコバクテ
リアのスフェロプラストと融合する。このアプローチを
使用して、外来(抗原をエンコードする)DNAをマイコ
バクテリウムの中に転移することができる。あるいは、
プラスミドのDNAを含有しそして染色体のDNAを本質的に
含有しない、E.coliミニ細胞は、ミニ細胞の原形質体の
融合を実施するとき使用することができる。
別法において、問題のDNAをマイコバクテリウムの中
に効率的に動かすことができる場合、自律的に複製する
配列が必要でなくそして、その代わり、問題のDNA(例
えば、抗原をエンコードする)をマイコバクテリアの染
色体の中に組み込むことができる。これは、例えば、ミ
ニ細胞の原形質体の融合を使用して達成することができ
る。この場合において、マイコバクテリアのための選択
可能なマーカーは、抗生物質抵抗性遺伝子または染色体
の突然変異体であることができ、E.coliコスミドの中に
クローニングすることができる。マイコバクテリアの染
色体の中に問題のDNAを効率よく組み込むことを可能と
するDNAが、また、E.coliコスミドの中に存在するであ
ろう。例えば、らい菌(M.leprae)において、組み換え
に関連する思われる反復配列が起こる;類似する配列を
BCGおよびスメグマ菌(M.smegmatis)において同定しそ
してそれから分離することができ、E.coliコスミドの中
に組み込むことができ(選択可能なマーカーと一緒に)
そしてこれは高い程度の組み換えを生ずる。
に効率的に動かすことができる場合、自律的に複製する
配列が必要でなくそして、その代わり、問題のDNA(例
えば、抗原をエンコードする)をマイコバクテリアの染
色体の中に組み込むことができる。これは、例えば、ミ
ニ細胞の原形質体の融合を使用して達成することができ
る。この場合において、マイコバクテリアのための選択
可能なマーカーは、抗生物質抵抗性遺伝子または染色体
の突然変異体であることができ、E.coliコスミドの中に
クローニングすることができる。マイコバクテリアの染
色体の中に問題のDNAを効率よく組み込むことを可能と
するDNAが、また、E.coliコスミドの中に存在するであ
ろう。例えば、らい菌(M.leprae)において、組み換え
に関連する思われる反復配列が起こる;類似する配列を
BCGおよびスメグマ菌(M.smegmatis)において同定しそ
してそれから分離することができ、E.coliコスミドの中
に組み込むことができ(選択可能なマーカーと一緒に)
そしてこれは高い程度の組み換えを生ずる。
1または2以上の遺伝子(1または2以上の抗原をエ
ンコードする)を記載する構成体(例えば、E.coliのレ
プリコン、組み換えに関連するマイコバクテリアの染色
体DNAのセグメント(組み換え発生配列)および2つの
選択可能なマーカー−1つはE.coliの中でマーカーとし
て働きそして第2はマイコバクテリウムの中でマーカー
として働く−を包含する)の中に組み込むことができ
る。次いで、1または2以上の遺伝子をマイコバクテリ
アの染色体のDNA、例えば、BCGまたはスメグマ菌(M.sm
egmatis)の染色体のDNAの中に組み込むことができる。
1または2以上の問題の遺伝子をこのようにしてスメグ
マ菌(M.smegmatis)の中に組み込む場合、1または2
以上の遺伝子は、また、一般の形質導入ファージにより
BCGの中に動くことができる。この場合において、他の
構成成分に加えて、2つの組み換え発生配列:1つはスメ
グマ菌(M.smegmatis)からおよび1つはBCGから、を含
むことが好ましい。
ンコードする)を記載する構成体(例えば、E.coliのレ
プリコン、組み換えに関連するマイコバクテリアの染色
体DNAのセグメント(組み換え発生配列)および2つの
選択可能なマーカー−1つはE.coliの中でマーカーとし
て働きそして第2はマイコバクテリウムの中でマーカー
として働く−を包含する)の中に組み込むことができ
る。次いで、1または2以上の遺伝子をマイコバクテリ
アの染色体のDNA、例えば、BCGまたはスメグマ菌(M.sm
egmatis)の染色体のDNAの中に組み込むことができる。
1または2以上の問題の遺伝子をこのようにしてスメグ
マ菌(M.smegmatis)の中に組み込む場合、1または2
以上の遺伝子は、また、一般の形質導入ファージにより
BCGの中に動くことができる。この場合において、他の
構成成分に加えて、2つの組み換え発生配列:1つはスメ
グマ菌(M.smegmatis)からおよび1つはBCGから、を含
むことが好ましい。
本発明の組み換えマイコバクテリアを産生しそして使
用する方法を、次の節において詳細に記載する。それら
の節は次の事項を記載しそして例示する:シャトルプラ
スミドにより問題のDNAをマイコバクテリアの中に導入
して、問題のDNAをマイコバクテリアの染色体のDNAの中
に組み込むこと;シャトルプラスミドにより問題のDNA
をマイコバクテリアの中に導入して、その中で問題のDN
Aがエピソーム的に発現されるマイコバクテリアを産生
すること;組み換えプラスミドベクターにより問題のDN
Aをマイコバクテリアの中に導入して、相同的組み換え
を通して問題のDNAをマイコバクテリアの染色体の中に
導入すること;組み換えマイコバクテリアの特性決定;
およびこのような産生物の使用。
用する方法を、次の節において詳細に記載する。それら
の節は次の事項を記載しそして例示する:シャトルプラ
スミドにより問題のDNAをマイコバクテリアの中に導入
して、問題のDNAをマイコバクテリアの染色体のDNAの中
に組み込むこと;シャトルプラスミドにより問題のDNA
をマイコバクテリアの中に導入して、その中で問題のDN
Aがエピソーム的に発現されるマイコバクテリアを産生
すること;組み換えプラスミドベクターにより問題のDN
Aをマイコバクテリアの中に導入して、相同的組み換え
を通して問題のDNAをマイコバクテリアの染色体の中に
導入すること;組み換えマイコバクテリアの特性決定;
およびこのような産生物の使用。
シャトルプラスミドにより問題のDNAの導入
本発明の研究は、スメグマ菌(M.smegmatis)を安定
に溶原化するマイコバクテリオファージの同定を生じ
た。1つのこのようなファージL1はスメグマ菌(M.smeg
matis)上で濁ったプラークを産生する従来報告され
た、そして推定上の溶原体は重感染に対して抵抗性であ
り、そして誘発してファージを産生することができた。
ドーキ(Doke)、S.J.Kumamoto Med.Soc.Soc.34、1360
−1373(960)。トクナガ(Tokunaga)、T.およびセラ
ーズ(Sellers)、M.I.、マイコバクテリウム、ノルカ
ルディア、およびアクチノミセテスにおける宿主−ウイ
ルスの関係(Host−Virus Relationships in Mycoba
cterium,Norcardia,and Actinomycetes)[ジュハスズ
(juhaz)、S.E.およびプランンマー(Plummer)、G.
編]227−243[チャールス(Charles)C.、トマス(Tho
mas)、イリノイ州スプリングフィールド、1970]。こ
れらの観察は確証されそして、さらに、サザン分析によ
り、プロファージはスメグマ菌(M.smegmatis)染色体
の中に組み込まれることが実証された(第5図、パネル
B、レーン2、3)。多数の独立の溶原体の分析はファ
ージの組み込みから生ずる独特のバンドの同一パターン
を明らかにし、L1ファージ組み込みは部位特異的である
ことを示唆する(第5図、パネルB)。
に溶原化するマイコバクテリオファージの同定を生じ
た。1つのこのようなファージL1はスメグマ菌(M.smeg
matis)上で濁ったプラークを産生する従来報告され
た、そして推定上の溶原体は重感染に対して抵抗性であ
り、そして誘発してファージを産生することができた。
ドーキ(Doke)、S.J.Kumamoto Med.Soc.Soc.34、1360
−1373(960)。トクナガ(Tokunaga)、T.およびセラ
ーズ(Sellers)、M.I.、マイコバクテリウム、ノルカ
ルディア、およびアクチノミセテスにおける宿主−ウイ
ルスの関係(Host−Virus Relationships in Mycoba
cterium,Norcardia,and Actinomycetes)[ジュハスズ
(juhaz)、S.E.およびプランンマー(Plummer)、G.
編]227−243[チャールス(Charles)C.、トマス(Tho
mas)、イリノイ州スプリングフィールド、1970]。こ
れらの観察は確証されそして、さらに、サザン分析によ
り、プロファージはスメグマ菌(M.smegmatis)染色体
の中に組み込まれることが実証された(第5図、パネル
B、レーン2、3)。多数の独立の溶原体の分析はファ
ージの組み込みから生ずる独特のバンドの同一パターン
を明らかにし、L1ファージ組み込みは部位特異的である
ことを示唆する(第5図、パネルB)。
こうして、L1はスメグマ菌(M.smegmatis)を安定に
溶原化することが示された。複製のColE1由来およびE.c
oliの中の選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子を含
有する、E.coliコスミドpHC79を、L1−ゲノムの非必須
領域の中に導入することによって、L1−シャトルプラス
ミドを構成した(第6図)。L1−シャトルプラスミド、
phAE15と表示する、をプラスミドとしてE.coliの中でお
よびファージとしてマイコバクテリアの中で複製するこ
とが示されそして、親のファージのように、スメグマ菌
(M.smegmatis)染色体の中に組み込まれることが示さ
れた(第5図、パネルB、レーン4、5)。L1ファージ
はEcoR I部位を欠く。pHC79の導入はphAE15のための独
特EcoR I部位を提供し、問題の遺伝子の導入を可能とす
る。これらの遺伝子は、シャトルプラスミドのベクター
で溶原化すると、マイコバクテリア内に導入しかつ安定
に維持することができることが示された(第6図)。
溶原化することが示された。複製のColE1由来およびE.c
oliの中の選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子を含
有する、E.coliコスミドpHC79を、L1−ゲノムの非必須
領域の中に導入することによって、L1−シャトルプラス
ミドを構成した(第6図)。L1−シャトルプラスミド、
phAE15と表示する、をプラスミドとしてE.coliの中でお
よびファージとしてマイコバクテリアの中で複製するこ
とが示されそして、親のファージのように、スメグマ菌
(M.smegmatis)染色体の中に組み込まれることが示さ
れた(第5図、パネルB、レーン4、5)。L1ファージ
はEcoR I部位を欠く。pHC79の導入はphAE15のための独
特EcoR I部位を提供し、問題の遺伝子の導入を可能とす
る。これらの遺伝子は、シャトルプラスミドのベクター
で溶原化すると、マイコバクテリア内に導入しかつ安定
に維持することができることが示された(第6図)。
E.coliの中でカナマイシン抵抗性を与える、Tn903か
らのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(ap
h)を含有する1.6kgの断片は、コスミドのクローニング
方法により、phAE15の中に導入することができる。オカ
(Oka)、A.スギサキ(Sugisaki)、H.およびタカナミ
(Takanami)、M.ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(J.Mol.Biol.)、147、217−226(1981)。
EcoR I末端をもつaph遺伝子を、線状phAE15 DNAに結合
し、そしてバクテリオファージラムダ−ヘッドの中に生
体外でパッケージングする。生ずる組み換え分子をE.co
liから分離した。アンピシリンおよびカナマイシンの両
者に対して抵抗性であるE.coliのクローンから、閉じた
円形のプラスミドDNAを分離し、そしてスメグマ菌(M.s
megmatis)原形質体の中にトランスフェクションした。
これはプラスミドDNAをパッケージングしたマイコバク
テリアのファージ粒子を生じた。このプラスミドは、ph
AE19と表示し、スメグマ菌(M.smegmatis)細胞を溶原
化し、そしてカナマイシン抵抗性コロニーを発生する能
力を有する(第7図)。マイコバクテリオファージはこ
れらの溶原体から誘発され、L1感染に対する免疫性およ
び感受性スメグマ菌(M.smegmatis)細胞に対するカナ
マイシン抵抗性を同時トランスフェクションし、カナマ
イシンに対する抵抗性がクローニングしたaph遺伝子の
発現から生ずることを実証する。phAE19は、また、ウシ
結核菌(M.bovis)−BCGを溶原化し、そしてウシ結核菌
(M.bovis)−BCGにカナマイシン抵抗性を与える。こう
して、カナマイシン抵抗性はマイコバクテリアについて
第1の有用な選択可能なマーカーを表す。さらに、これ
らの結果は実証するように、溶原性は問題のDNAをマイ
コバクテリアの中に導入しそしてその中で発現すること
ができる。
らのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(ap
h)を含有する1.6kgの断片は、コスミドのクローニング
方法により、phAE15の中に導入することができる。オカ
(Oka)、A.スギサキ(Sugisaki)、H.およびタカナミ
(Takanami)、M.ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(J.Mol.Biol.)、147、217−226(1981)。
EcoR I末端をもつaph遺伝子を、線状phAE15 DNAに結合
し、そしてバクテリオファージラムダ−ヘッドの中に生
体外でパッケージングする。生ずる組み換え分子をE.co
liから分離した。アンピシリンおよびカナマイシンの両
者に対して抵抗性であるE.coliのクローンから、閉じた
円形のプラスミドDNAを分離し、そしてスメグマ菌(M.s
megmatis)原形質体の中にトランスフェクションした。
これはプラスミドDNAをパッケージングしたマイコバク
テリアのファージ粒子を生じた。このプラスミドは、ph
AE19と表示し、スメグマ菌(M.smegmatis)細胞を溶原
化し、そしてカナマイシン抵抗性コロニーを発生する能
力を有する(第7図)。マイコバクテリオファージはこ
れらの溶原体から誘発され、L1感染に対する免疫性およ
び感受性スメグマ菌(M.smegmatis)細胞に対するカナ
マイシン抵抗性を同時トランスフェクションし、カナマ
イシンに対する抵抗性がクローニングしたaph遺伝子の
発現から生ずることを実証する。phAE19は、また、ウシ
結核菌(M.bovis)−BCGを溶原化し、そしてウシ結核菌
(M.bovis)−BCGにカナマイシン抵抗性を与える。こう
して、カナマイシン抵抗性はマイコバクテリアについて
第1の有用な選択可能なマーカーを表す。さらに、これ
らの結果は実証するように、溶原性は問題のDNAをマイ
コバクテリアの中に導入しそしてその中で発現すること
ができる。
シャトルプラスミドによる問題のDNAの導入
シャトルプラスミドによる問題のDNAの導入は、クロ
ーニング容量の増加、DNAの操作の容易さ、およびコピ
ー数の増加によりファージの能力を拡張する。スメグマ
菌(M.smegmatis)からのプラスミドは従来記載されて
きておらず、そしてマイコバクテリアの中で遺伝子操作
は困難である。したがって、E.coliおよびマイコバクテ
リアの両者の中で問題のDNAを複製しかつ発現すること
ができるシャトルプラスミドのベクターを次のようにし
て構成した。マイコバクテリアのための機能的レプリコ
ンを確実にするため、Tn5からのネオマイシン/カナマ
イシンホスホトランスフェラーゼII(neo)遺伝子、複
製のP15A由来およびpACYC184からのクロランフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ(cat)遺伝子を含有す
る、E.coliプラスミドpIJ666を、マイコバクテリウム・
フォルツイツム(M.fortuitum)の中で複製するプラス
ミドpAL5000の中に不規則的に挿入した。キーザー(Kie
ser)、T.およびR.E.メルトン(Melton)、遺伝子(Gen
e)、65:83−91(1988);ベルグ(Berg)、D.E.ら、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA、72:362
8−3632(1975);チャング(Chang)、A.C.Y.およびS.
N.コーヘン(Cohen)、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー(J.Bactriology)、134:1141−1156(1978);
ラビディ(Labidi)、A.ら、FEMSマイクロバイオロジー
・レターズ(Microbiology Letters)、30:221−225
(1985)。第8図は、pIJ666::pAL5000ライブラリーの
構成を概略的に示す。
ーニング容量の増加、DNAの操作の容易さ、およびコピ
ー数の増加によりファージの能力を拡張する。スメグマ
菌(M.smegmatis)からのプラスミドは従来記載されて
きておらず、そしてマイコバクテリアの中で遺伝子操作
は困難である。したがって、E.coliおよびマイコバクテ
リアの両者の中で問題のDNAを複製しかつ発現すること
ができるシャトルプラスミドのベクターを次のようにし
て構成した。マイコバクテリアのための機能的レプリコ
ンを確実にするため、Tn5からのネオマイシン/カナマ
イシンホスホトランスフェラーゼII(neo)遺伝子、複
製のP15A由来およびpACYC184からのクロランフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ(cat)遺伝子を含有す
る、E.coliプラスミドpIJ666を、マイコバクテリウム・
フォルツイツム(M.fortuitum)の中で複製するプラス
ミドpAL5000の中に不規則的に挿入した。キーザー(Kie
ser)、T.およびR.E.メルトン(Melton)、遺伝子(Gen
e)、65:83−91(1988);ベルグ(Berg)、D.E.ら、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA、72:362
8−3632(1975);チャング(Chang)、A.C.Y.およびS.
N.コーヘン(Cohen)、ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジー(J.Bactriology)、134:1141−1156(1978);
ラビディ(Labidi)、A.ら、FEMSマイクロバイオロジー
・レターズ(Microbiology Letters)、30:221−225
(1985)。第8図は、pIJ666::pAL5000ライブラリーの
構成を概略的に示す。
このライブラリーをスメグマ菌(M.smegmatis)の中
に形質転換することは、多分再生する生存しうる細胞の
問題のために、困難であった。したがって、DNAはエレ
クトロポレイションにより完全なスメグマ菌(M.smegma
tis)細胞の中に直接導入して、スフェロプラストを産
生するためのプロトコルの使用から生じうるマイコバク
テリアの細胞への起こり得る損傷を排除した。5×103p
fu/μgより多い値を生じた、溶菌ファージDNAのエレク
トロポレイションのための条件が開発された。これらの
条件下にpIJ666::pAL5000をスメグマ菌(M.smegmatis)
の中にエレクトロポレイションすると、カナマイシン抵
抗性およびクロランフェニコール抵抗性の形質転換体が
生じた。3つの別々の実験においてスメグマ菌(M.smeg
matis)形質転換体のプールから分離したプラスミドDNA
をE.coliの中に形質転換しもどして、カナマイシン抵抗
性について選択した。PIJ666は分離したE.coli形質転換
体の多くにおけるpAL5000内の異なる部位に挿入した
が、すべてのプラスミドは両者の種において安定であっ
た(第9図)。これらの方法は、実施例9に記載しそし
て第10図に示すように、あるBCGワクチン菌株をpIJ66
6::pAL5000組み換えライブラリーで形質転換することを
可能とし、カナマイシン抵抗性を発現させた。第10図の
パネルAは、シャトルプラスミドDNAとBCG細胞をエレク
トロポレイションした後、発生したカナマイシン抵抗性
BCGコロニーを示す;パネルBは、シャトルプラスミドD
NAの不存在下にエレクトロポレイションした後、発生し
たカナマイシン抵抗性BCGコロニーを示す。同様なアプ
ローチを使用して、第17図に表される結果により示され
るように、65kDのらい菌(M.leprae)をBCGの中に導入
し、ここでそれは発現された。
に形質転換することは、多分再生する生存しうる細胞の
問題のために、困難であった。したがって、DNAはエレ
クトロポレイションにより完全なスメグマ菌(M.smegma
tis)細胞の中に直接導入して、スフェロプラストを産
生するためのプロトコルの使用から生じうるマイコバク
テリアの細胞への起こり得る損傷を排除した。5×103p
fu/μgより多い値を生じた、溶菌ファージDNAのエレク
トロポレイションのための条件が開発された。これらの
条件下にpIJ666::pAL5000をスメグマ菌(M.smegmatis)
の中にエレクトロポレイションすると、カナマイシン抵
抗性およびクロランフェニコール抵抗性の形質転換体が
生じた。3つの別々の実験においてスメグマ菌(M.smeg
matis)形質転換体のプールから分離したプラスミドDNA
をE.coliの中に形質転換しもどして、カナマイシン抵抗
性について選択した。PIJ666は分離したE.coli形質転換
体の多くにおけるpAL5000内の異なる部位に挿入した
が、すべてのプラスミドは両者の種において安定であっ
た(第9図)。これらの方法は、実施例9に記載しそし
て第10図に示すように、あるBCGワクチン菌株をpIJ66
6::pAL5000組み換えライブラリーで形質転換することを
可能とし、カナマイシン抵抗性を発現させた。第10図の
パネルAは、シャトルプラスミドDNAとBCG細胞をエレク
トロポレイションした後、発生したカナマイシン抵抗性
BCGコロニーを示す;パネルBは、シャトルプラスミドD
NAの不存在下にエレクトロポレイションした後、発生し
たカナマイシン抵抗性BCGコロニーを示す。同様なアプ
ローチを使用して、第17図に表される結果により示され
るように、65kDのらい菌(M.leprae)をBCGの中に導入
し、ここでそれは発現された。
マイコバクテリアのゲノムのDNAの中に問題のDNAを組み
込むためのプラスミドベクター マイコバクテリアのゲノムのDNAの中に非マイコバク
テリア由来のDNA(すなわち、それを組み込むしたマイ
コバクテリア以外の源からの)を組み込むために使用し
たプラスミドベクターを、第11図に表すように構成し
た。ウシ結核菌(M.bovis)−BCGのPyrF遺伝子の分離
は、次のようにしてそして実施例10に記載するようにし
て実施した。ウシ結核菌(M.bovis)−BCG DNAを制限
酵素Sau3Aで部分的に消化し、大きさで選択し、そして
ベクターpUC19の中に挿入した。生ずるライブラリーを
使用して、E.coliのPyrF遺伝子の中に挿入を有するE.co
li細胞を形質転換した。ウラシルの不存在下に増殖する
能力を獲得した、4つの独立のコロニーが同定され、そ
してプラスミドDNAをそれらから分離した。このプラス
ミドDNAを使用して、組み換えプラスミドベクターを構
成した。既知の技術を使用して、スメグマ菌(M.smegma
tis)のPyrF遺伝子をpUC19プラスミドベクターの中のBa
mH I部位に組み込み、そしてカナマイシン抵抗性遺伝子
(Kan)をPyrF遺伝子の中のBamH I部位に挿入した。Pyr
F+細胞はウラシルの不存在下に培地の中で増殖すること
ができ、そしてフルオロ−オロチン酸感受性(FOAs)で
ある;PyrF-細胞増殖にウラシルを必要とし、そしてフル
オロ−オロチン酸抵抗性(FOAr)である。カナマイシン
抵抗性遺伝子を含有する細胞はカナマイシン抵抗性(KA
Nr)であり、そしてこの遺伝子をもたない細胞はカナマ
イシン感受性(KANs)である。アウスベル(Ausubel
z)、F.M.ら(編)分子生物学における現在のプロトコ
ル(Current Protocols in Molecular Biology)、
p.1、5、4、Green Pub.(1987)。pUC19、スメグマ
菌(Mycobacterium smegmatis)およびTn903からのDNA
を含有するプラスミドDNA、pRH1100と表示する、は、ブ
ダベスト条約の条項に従い、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(the American Type Culture
Collection)(マリイランド州ロックビレ)に受け入
れ番号40468号で受託された(受託日、1988年7月6
日)。受託物への公衆のアクセスへの制限は、この出願
に基づく米国特許が登録されたとき最終的に除去される
であろう。
込むためのプラスミドベクター マイコバクテリアのゲノムのDNAの中に非マイコバク
テリア由来のDNA(すなわち、それを組み込むしたマイ
コバクテリア以外の源からの)を組み込むために使用し
たプラスミドベクターを、第11図に表すように構成し
た。ウシ結核菌(M.bovis)−BCGのPyrF遺伝子の分離
は、次のようにしてそして実施例10に記載するようにし
て実施した。ウシ結核菌(M.bovis)−BCG DNAを制限
酵素Sau3Aで部分的に消化し、大きさで選択し、そして
ベクターpUC19の中に挿入した。生ずるライブラリーを
使用して、E.coliのPyrF遺伝子の中に挿入を有するE.co
li細胞を形質転換した。ウラシルの不存在下に増殖する
能力を獲得した、4つの独立のコロニーが同定され、そ
してプラスミドDNAをそれらから分離した。このプラス
ミドDNAを使用して、組み換えプラスミドベクターを構
成した。既知の技術を使用して、スメグマ菌(M.smegma
tis)のPyrF遺伝子をpUC19プラスミドベクターの中のBa
mH I部位に組み込み、そしてカナマイシン抵抗性遺伝子
(Kan)をPyrF遺伝子の中のBamH I部位に挿入した。Pyr
F+細胞はウラシルの不存在下に培地の中で増殖すること
ができ、そしてフルオロ−オロチン酸感受性(FOAs)で
ある;PyrF-細胞増殖にウラシルを必要とし、そしてフル
オロ−オロチン酸抵抗性(FOAr)である。カナマイシン
抵抗性遺伝子を含有する細胞はカナマイシン抵抗性(KA
Nr)であり、そしてこの遺伝子をもたない細胞はカナマ
イシン感受性(KANs)である。アウスベル(Ausubel
z)、F.M.ら(編)分子生物学における現在のプロトコ
ル(Current Protocols in Molecular Biology)、
p.1、5、4、Green Pub.(1987)。pUC19、スメグマ
菌(Mycobacterium smegmatis)およびTn903からのDNA
を含有するプラスミドDNA、pRH1100と表示する、は、ブ
ダベスト条約の条項に従い、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(the American Type Culture
Collection)(マリイランド州ロックビレ)に受け入
れ番号40468号で受託された(受託日、1988年7月6
日)。受託物への公衆のアクセスへの制限は、この出願
に基づく米国特許が登録されたとき最終的に除去される
であろう。
マイコバクテリアのゲノム物質の中への非マイコバクテ
リア由来のDNAの安定な組み込み 下および実施例10に記載するように、エレクトロポレ
イションを使用して、生ずる組み換えプラスミドベクタ
ーをマイコバクテリアの中に導入した。第12A図に表さ
れるように、組み換えプラスミドで形質転換した細胞に
おいて、入るPyrF配列およびKan配列の組み込みにおい
て、相同的組み換えは、PyrF遺伝子を含有する入る組み
換えプラスミドおよび相同的マイコバクテリアの染色体
(ゲノム)の配列上で配列の間で起こった。Kan遺伝子
を含有する、組み込まれた組み換えプラスミドを含有す
るマイコバクテリアの細胞は、カナマイシンを含有する
培地上でエレクトロポレイションした細胞を培養するこ
とによって選択した。Kan遺伝子の組み込みが起こった
細胞のみが生き残った。
リア由来のDNAの安定な組み込み 下および実施例10に記載するように、エレクトロポレ
イションを使用して、生ずる組み換えプラスミドベクタ
ーをマイコバクテリアの中に導入した。第12A図に表さ
れるように、組み換えプラスミドで形質転換した細胞に
おいて、入るPyrF配列およびKan配列の組み込みにおい
て、相同的組み換えは、PyrF遺伝子を含有する入る組み
換えプラスミドおよび相同的マイコバクテリアの染色体
(ゲノム)の配列上で配列の間で起こった。Kan遺伝子
を含有する、組み込まれた組み換えプラスミドを含有す
るマイコバクテリアの細胞は、カナマイシンを含有する
培地上でエレクトロポレイションした細胞を培養するこ
とによって選択した。Kan遺伝子の組み込みが起こった
細胞のみが生き残った。
問題のDNA(ここで、Kan遺伝子)が同定されたマイコ
バクテリアの細胞は次の通りである。全体の組み込まれ
た組み換えプラスミドは、それがその中に組み込むマイ
コバクテリアのゲノムが互いに密に近接して2つの同一
の配列を含有するので、不安定である。結局、相同的配
列の組み換えは再び起こることができる。これはルーピ
ングアウト(分割)を生じ、これは組み換えプラスミド
を除去し、マイコバクテリアのゲノムの正味の変化を生
成しないか、あるいはKanを含有するPyrF遺伝子がマイ
コバクテリアのゲノムの中に止まるような方法で組み換
えプラスミドを除去する。分割を低い頻度で起こるが、
それが起こった細胞を同定し、そしてそれらが示す表現
型に基づいて分離することができる。PyrF+細胞(ゲノ
ムの中で正味変化を生じない)は、第12図に示すよう
に、カナマイシン感受性およびフルオロ−オロチン酸感
受性(FOAs)であろう。Kanを含有するPyrF遺伝子の組
み込みを生ずる細胞は、PyrF遺伝子が崩壊し、こうして
非機能的であるので、カナマイシン抵抗性であり、そし
てFOArである。こうして、FOAを含有する培地上でKANr
マイコバクテリアの集団を平板培養すると、Kan遺伝子
がゲノムのDNAの中に安定に組み込まれた細胞が同定さ
れる(第12B図、下左:KANr、FOAr)。
バクテリアの細胞は次の通りである。全体の組み込まれ
た組み換えプラスミドは、それがその中に組み込むマイ
コバクテリアのゲノムが互いに密に近接して2つの同一
の配列を含有するので、不安定である。結局、相同的配
列の組み換えは再び起こることができる。これはルーピ
ングアウト(分割)を生じ、これは組み換えプラスミド
を除去し、マイコバクテリアのゲノムの正味の変化を生
成しないか、あるいはKanを含有するPyrF遺伝子がマイ
コバクテリアのゲノムの中に止まるような方法で組み換
えプラスミドを除去する。分割を低い頻度で起こるが、
それが起こった細胞を同定し、そしてそれらが示す表現
型に基づいて分離することができる。PyrF+細胞(ゲノ
ムの中で正味変化を生じない)は、第12図に示すよう
に、カナマイシン感受性およびフルオロ−オロチン酸感
受性(FOAs)であろう。Kanを含有するPyrF遺伝子の組
み込みを生ずる細胞は、PyrF遺伝子が崩壊し、こうして
非機能的であるので、カナマイシン抵抗性であり、そし
てFOArである。こうして、FOAを含有する培地上でKANr
マイコバクテリアの集団を平板培養すると、Kan遺伝子
がゲノムのDNAの中に安定に組み込まれた細胞が同定さ
れる(第12B図、下左:KANr、FOAr)。
こうして、Kan遺伝子は、隣接するPyrF配列の相同的
組み換えを使用して、マイコバクテリアのゲノムの中に
安定に組み込まれた。第12B図に図解されている本発明
の方法の重要な利点は、問題のDNAの組み込みが起こる
と同時に、プラスミドまたはファージDNAはゲノムの中
に組み込まれる。すなわち、正味の作用はプラスミド配
列が組み換えマイコバクテリアの細胞の中に存在しない
ことである。Kan遺伝子の発現は、また、実証され、そ
して組み込みおよび分割の両者が起こった細胞を細胞の
表現型に基づいて選択した(この場合において、KANr、
FOAr)。前述の研究において、非マイコバクテリア由来
のDNA(すなわち、カナマイシン抵抗性遺伝子)はスメ
グマ菌(M.smegmatis)のゲノムのDNAの中に首尾よく導
入および安定に組み込まれた。同一技術を使用して、非
マイコバクテリア由来のDNAをウシ結核菌(M.bovis)−
BCGまたは他のマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に導
入することができる。
組み換えを使用して、マイコバクテリアのゲノムの中に
安定に組み込まれた。第12B図に図解されている本発明
の方法の重要な利点は、問題のDNAの組み込みが起こる
と同時に、プラスミドまたはファージDNAはゲノムの中
に組み込まれる。すなわち、正味の作用はプラスミド配
列が組み換えマイコバクテリアの細胞の中に存在しない
ことである。Kan遺伝子の発現は、また、実証され、そ
して組み込みおよび分割の両者が起こった細胞を細胞の
表現型に基づいて選択した(この場合において、KANr、
FOAr)。前述の研究において、非マイコバクテリア由来
のDNA(すなわち、カナマイシン抵抗性遺伝子)はスメ
グマ菌(M.smegmatis)のゲノムのDNAの中に首尾よく導
入および安定に組み込まれた。同一技術を使用して、非
マイコバクテリア由来のDNAをウシ結核菌(M.bovis)−
BCGまたは他のマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に導
入することができる。
1または2以上の抗原をエンコードするDNAのマイコバ
クテリアのゲノムのDNAの中への安定な組み込む 中断されたPyrF遺伝子の組み込み 同様な方法において、それに対する免疫応答を望む、
1または2以上の抗原をエンコードするDNAを、マイコ
バクテリアのゲノムのDNAの中に組み込むことができ
る。問題のDNAをマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に
組み込む、本発明の方法は、第13図に概略的に表されて
いる。この方法は、実施した(参照、実施例11)スメグ
マ菌(M.smegmatis)中の65kDのらい菌(M.leprae)遺
伝子であるDNAの組み込みをとくに参照して記載する。
しかしながら、同一アプローチを使用して、らい菌(M.
leprae)の65kDの遺伝子を他のマイコバクテリアの中に
導入することができ、ならびに免疫応答を求めるortポ
リペプチドまたはタンパク質をエンコードするDNAをウ
シ結核菌(M.bovis)−BCG、スメグマ菌(M.smegmati
s)またはマイコバクテリアの中に組み込むことができ
る。
クテリアのゲノムのDNAの中への安定な組み込む 中断されたPyrF遺伝子の組み込み 同様な方法において、それに対する免疫応答を望む、
1または2以上の抗原をエンコードするDNAを、マイコ
バクテリアのゲノムのDNAの中に組み込むことができ
る。問題のDNAをマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に
組み込む、本発明の方法は、第13図に概略的に表されて
いる。この方法は、実施した(参照、実施例11)スメグ
マ菌(M.smegmatis)中の65kDのらい菌(M.leprae)遺
伝子であるDNAの組み込みをとくに参照して記載する。
しかしながら、同一アプローチを使用して、らい菌(M.
leprae)の65kDの遺伝子を他のマイコバクテリアの中に
導入することができ、ならびに免疫応答を求めるortポ
リペプチドまたはタンパク質をエンコードするDNAをウ
シ結核菌(M.bovis)−BCG、スメグマ菌(M.smegmati
s)またはマイコバクテリアの中に組み込むことができ
る。
選択した抗原(Fanと表示する、外来抗原について)
をエンコードするDNAの組み込みは、第13図に表されて
いる。適当なプラスミドベクター(例えば、E.coliの中
で複製するが、マイコバクテリアの中で複製しないも
の)、例えば、第13図に表されている組み換えpUC19プ
ラスミドを使用する。組み換えプラスミドは、マイコバ
クテリアの遺伝子またはDNA配列、例えば、第13図に表
されているPyrF遺伝子を包含する;この遺伝子中の配列
は、マイコバクテリアのゲノム中のものに相同し、プラ
スミドを有するマイコバクテリアの配列とゲノムのマイ
コバクテリアの配列との間で起こるべき相同的組み換え
のための基準を提供する。組み換えプラスミドは、ま
た、E.coli中の複製および選択のために必要なDNA配列
およびマイコバクテリア中の選択のために必要なDNA配
列を包含する。選択において使用する配列は細胞に明確
な表現型を与え、こうしてその遺伝子を含有する細胞の
同定および分離を可能とする。遺伝子は、例えば、薬物
抵抗性をエンコードすることができる。第13図におい
て、組み換えプラスミドはカナマイシン抵抗性を与える
遺伝子を包含し、こうしてカナマイシンを含有する培地
上で単に培養することによって、その遺伝子を含有する
マイコバクテリアの選択を可能とする。組み換えプラス
ミドは、また、マイコバクテリアのゲノムのDNAの中に
組み込まれる、それに対する免疫応答を望む1または2
以上のポリペプチドまたはタンパク質をエンコードする
DNA(Fanと表示する)を含有する。
をエンコードするDNAの組み込みは、第13図に表されて
いる。適当なプラスミドベクター(例えば、E.coliの中
で複製するが、マイコバクテリアの中で複製しないも
の)、例えば、第13図に表されている組み換えpUC19プ
ラスミドを使用する。組み換えプラスミドは、マイコバ
クテリアの遺伝子またはDNA配列、例えば、第13図に表
されているPyrF遺伝子を包含する;この遺伝子中の配列
は、マイコバクテリアのゲノム中のものに相同し、プラ
スミドを有するマイコバクテリアの配列とゲノムのマイ
コバクテリアの配列との間で起こるべき相同的組み換え
のための基準を提供する。組み換えプラスミドは、ま
た、E.coli中の複製および選択のために必要なDNA配列
およびマイコバクテリア中の選択のために必要なDNA配
列を包含する。選択において使用する配列は細胞に明確
な表現型を与え、こうしてその遺伝子を含有する細胞の
同定および分離を可能とする。遺伝子は、例えば、薬物
抵抗性をエンコードすることができる。第13図におい
て、組み換えプラスミドはカナマイシン抵抗性を与える
遺伝子を包含し、こうしてカナマイシンを含有する培地
上で単に培養することによって、その遺伝子を含有する
マイコバクテリアの選択を可能とする。組み換えプラス
ミドは、また、マイコバクテリアのゲノムのDNAの中に
組み込まれる、それに対する免疫応答を望む1または2
以上のポリペプチドまたはタンパク質をエンコードする
DNA(Fanと表示する)を含有する。
本発明の1つの実施態様において、Fanがらい菌(M.l
eprae)の遺伝子である、第13図に表されるような組み
換えプラスミドを使用することによって、らい菌(M.le
prae)の65kDの遺伝子をスメグマ菌(M.smegmatis)の
ゲノムのDNAの中に組み込んだ。
eprae)の遺伝子である、第13図に表されるような組み
換えプラスミドを使用することによって、らい菌(M.le
prae)の65kDの遺伝子をスメグマ菌(M.smegmatis)の
ゲノムのDNAの中に組み込んだ。
組み換えプラスミド(例えば、65kDのらい菌(M.lepr
ae)の遺伝子およびKan遺伝子が挿入されたPyrF遺伝子
を含有するプラスミド)を、標準のエレクトロポレイシ
ョン技術を使用して、マイコバクテリアの細胞(スメグ
マ菌(M.smegmatis))の中に導入した。(参照、実施
例11)。次いで、エレクトロポレイションした細胞をカ
ナマイシンを含有する培地上に配置した。カナマイシン
抵抗性(KANr)の細胞のみがこれらの条件下に増殖し
た;このような細胞はゲノムのDNAの中に組み込まれ、K
ANr遺伝子およびらい菌(M.leprae)の遺伝子は、ま
た、FOAsであった(組み換えプラスミドからおよびマイ
コバクテリアからのPyrF遺伝子が崩壊したために)。
ae)の遺伝子およびKan遺伝子が挿入されたPyrF遺伝子
を含有するプラスミド)を、標準のエレクトロポレイシ
ョン技術を使用して、マイコバクテリアの細胞(スメグ
マ菌(M.smegmatis))の中に導入した。(参照、実施
例11)。次いで、エレクトロポレイションした細胞をカ
ナマイシンを含有する培地上に配置した。カナマイシン
抵抗性(KANr)の細胞のみがこれらの条件下に増殖し
た;このような細胞はゲノムのDNAの中に組み込まれ、K
ANr遺伝子およびらい菌(M.leprae)の遺伝子は、ま
た、FOAsであった(組み換えプラスミドからおよびマイ
コバクテリアからのPyrF遺伝子が崩壊したために)。
細胞を引き続いてFOAを含有する培地に移して、Fan遺
伝子(ここで、らい菌(M.leprae)遺伝子)がゲノムの
DNAの中に安定に組み込まれた細胞を同定した。第13図
の下のパネル(左側)に示されているように、カナマイ
シン抵抗性遺伝子およびFan遺伝子を含有する崩壊したP
yrF遺伝子を、このような細胞のゲノムのDNA(KANr、FO
Ar)の中に組み込む。下のパネルの右側に示されている
ように、ルーピングアウトが起こり、その結果ゲノムの
中に完全に外来遺伝子のみが残る、マイコバクテリアの
細胞はカナマイシン感受性でありかつフルオロ−オロチ
ン酸感受性である。
伝子(ここで、らい菌(M.leprae)遺伝子)がゲノムの
DNAの中に安定に組み込まれた細胞を同定した。第13図
の下のパネル(左側)に示されているように、カナマイ
シン抵抗性遺伝子およびFan遺伝子を含有する崩壊したP
yrF遺伝子を、このような細胞のゲノムのDNA(KANr、FO
Ar)の中に組み込む。下のパネルの右側に示されている
ように、ルーピングアウトが起こり、その結果ゲノムの
中に完全に外来遺伝子のみが残る、マイコバクテリアの
細胞はカナマイシン感受性でありかつフルオロ−オロチ
ン酸感受性である。
こうして、上にそして実施例11に記載するように、タ
ンパク質抗原をエンコードするをマイコバクテリアのゲ
ノムのDNAの中に組み込むこと、および安定に組み込ま
れた問題のDNAを含有する試料を同定および選択するこ
とが可能となった。さらに、このような問題のDNAはマ
イコバクテリアのゲノムの中の選択した部位(この場合
において、PyrF遺伝子の部位)に組み込まれた。この同
一のアプローチは、もちろん、問題のDNAをマイコバク
テリアのゲノムのDNA上の他の選択した部位の中に組み
込むために使用できる。この場合において、組み込みを
望む、ゲノム上の部位を選択することができる。選択し
たゲノムの配列に対して相同性であるか、あるいはそれ
に十分に類似する配列;問題のDNA;E.coli中の複製およ
び選択に必要な配列;およびマイコバクテリア中の選択
に必要なDNA配列を含有する組み換えプラスミドは、前
述したようにして、構成することができる。問題のDNA
はマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に安定に組み込
むことができ、そして、前述と同一方法で、安定に組み
込まれた問題のDNAを含有する細胞を選択することがで
きる。
ンパク質抗原をエンコードするをマイコバクテリアのゲ
ノムのDNAの中に組み込むこと、および安定に組み込ま
れた問題のDNAを含有する試料を同定および選択するこ
とが可能となった。さらに、このような問題のDNAはマ
イコバクテリアのゲノムの中の選択した部位(この場合
において、PyrF遺伝子の部位)に組み込まれた。この同
一のアプローチは、もちろん、問題のDNAをマイコバク
テリアのゲノムのDNA上の他の選択した部位の中に組み
込むために使用できる。この場合において、組み込みを
望む、ゲノム上の部位を選択することができる。選択し
たゲノムの配列に対して相同性であるか、あるいはそれ
に十分に類似する配列;問題のDNA;E.coli中の複製およ
び選択に必要な配列;およびマイコバクテリア中の選択
に必要なDNA配列を含有する組み換えプラスミドは、前
述したようにして、構成することができる。問題のDNA
はマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に安定に組み込
むことができ、そして、前述と同一方法で、安定に組み
込まれた問題のDNAを含有する細胞を選択することがで
きる。
マイコバクテリア中の発現をのぞむ、遺伝子のすべて
または一部分をマイコバクテリアの中に、同一方法を使
用して、導入することができる。すなわち、次の方法を
使用して、問題のマイコバクテリアのゲノムのDNAの中
に安定に組み込むことができる: E.coliの中で複製するが、マイコバクテリアの中で複
製することができない、組み換えプラスミドベクター
は、次のものを包含する: 1、 組み換えプラスミドで形質転換されたマイコバク
テリアのゲノムの中の相同配列との組み換えに必要な、
マイコバクテリアの遺伝子、またはその一部分; 2、 組み換えプラスミドで形質転換されたマイコバク
テリアの中で、その発現を望む、ポリペプチドまたはタ
ンパク質をエンコードする遺伝子のすべてまたは一部
分; 3、 E.coli中の複製および選択に必要なDNA配列;お
よび 4、 マイコバクテリア中の選択に必要なDNA配列(例
えば、薬物抵抗性)。
または一部分をマイコバクテリアの中に、同一方法を使
用して、導入することができる。すなわち、次の方法を
使用して、問題のマイコバクテリアのゲノムのDNAの中
に安定に組み込むことができる: E.coliの中で複製するが、マイコバクテリアの中で複
製することができない、組み換えプラスミドベクター
は、次のものを包含する: 1、 組み換えプラスミドで形質転換されたマイコバク
テリアのゲノムの中の相同配列との組み換えに必要な、
マイコバクテリアの遺伝子、またはその一部分; 2、 組み換えプラスミドで形質転換されたマイコバク
テリアの中で、その発現を望む、ポリペプチドまたはタ
ンパク質をエンコードする遺伝子のすべてまたは一部
分; 3、 E.coli中の複製および選択に必要なDNA配列;お
よび 4、 マイコバクテリア中の選択に必要なDNA配列(例
えば、薬物抵抗性)。
この組み換えプラスミドを使用して、マイコバクテリア
の細胞、例えば、スメグマ菌(M.smegmatis)またはウ
シ結核菌(M.bovis)−BCGを形質転換する。組み換えプ
ラスミドは、既知の技術を使用して、マイコバクテリア
の細胞の中に導入される。1つの実施態様において、プ
ラスミドをエレクトロポレイションにより、標準のバク
テリアのエレクトロポレイション手順を使用して導入す
る。(参照、実施例11)。
の細胞、例えば、スメグマ菌(M.smegmatis)またはウ
シ結核菌(M.bovis)−BCGを形質転換する。組み換えプ
ラスミドは、既知の技術を使用して、マイコバクテリア
の細胞の中に導入される。1つの実施態様において、プ
ラスミドをエレクトロポレイションにより、標準のバク
テリアのエレクトロポレイション手順を使用して導入す
る。(参照、実施例11)。
エレクトロポレイションした細胞を、組み込むがその
中で起こった細胞の選択を可能とする条件下に平板培養
する。前述したように、プラスミドは薬物抵抗性、例え
ば、カナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子を含有
することができる。その場合において、エレクトロポレ
イションした細胞をカナマイシンを含有する培地上で平
板培養する。プラスミドDNAが組み込まれた細胞であ
る、カナマイシン抵抗性(KANr)細胞のみはこれらの条
件下に生き残るであろう。
中で起こった細胞の選択を可能とする条件下に平板培養
する。前述したように、プラスミドは薬物抵抗性、例え
ば、カナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子を含有
することができる。その場合において、エレクトロポレ
イションした細胞をカナマイシンを含有する培地上で平
板培養する。プラスミドDNAが組み込まれた細胞であ
る、カナマイシン抵抗性(KANr)細胞のみはこれらの条
件下に生き残るであろう。
引き続いて、生き残る細胞を、問題のDNAがゲノムのD
NAの中に安定に組み込まれた細胞の同定および選択を可
能とする条件下に、平板培養する。PyrF遺伝子が問題の
DNAの挿入により崩壊している場合において、生き残る
細胞をFOAを含有する培地上に平板培養し、これによ
り、細胞がFOArである(こうして、このような培地の中
で増殖する)ために分割が起こった細胞を同定すること
ができる。
NAの中に安定に組み込まれた細胞の同定および選択を可
能とする条件下に、平板培養する。PyrF遺伝子が問題の
DNAの挿入により崩壊している場合において、生き残る
細胞をFOAを含有する培地上に平板培養し、これによ
り、細胞がFOArである(こうして、このような培地の中
で増殖する)ために分割が起こった細胞を同定すること
ができる。
それに対する免疫応答を望み、組み換えプラスミドの
中に存在するポリペプチドまたはタンパク質をエンコー
ドするDNAは、それが事実存在する源から分離すること
ができ、この源は標準の遺伝子操作技術により、適当な
宿主の中で産生されるか、あるいは化学的または機械的
に合成される。同様に、相同的組み換えに必要なプラス
ミドを有するDNA配列は、それが事実存在する源から分
離することができ、この源は標準の遺伝子操作技術によ
れか、あるいは化学的または機械的に合成される。組み
込まれた問題のDNAを含有するマイコバクテリアの細胞
の選択のための基準として働く特性は、記載したよう
に、薬物抵抗性であることができる。遺伝子は、例え
ば、カナマイシン抵抗性、ビオマイシン抵抗性、チオス
トレプトン抵抗性、ヒグロマイシン抵抗性またはブレオ
マイシン抵抗性をエンコードする。あるいは、栄養要求
変異種の方法を使用することができ、こうして選択は組
み込みが起こったマイコバクテリアが、適当な培地上で
増殖するとき、生き残る能力に基づく。
中に存在するポリペプチドまたはタンパク質をエンコー
ドするDNAは、それが事実存在する源から分離すること
ができ、この源は標準の遺伝子操作技術により、適当な
宿主の中で産生されるか、あるいは化学的または機械的
に合成される。同様に、相同的組み換えに必要なプラス
ミドを有するDNA配列は、それが事実存在する源から分
離することができ、この源は標準の遺伝子操作技術によ
れか、あるいは化学的または機械的に合成される。組み
込まれた問題のDNAを含有するマイコバクテリアの細胞
の選択のための基準として働く特性は、記載したよう
に、薬物抵抗性であることができる。遺伝子は、例え
ば、カナマイシン抵抗性、ビオマイシン抵抗性、チオス
トレプトン抵抗性、ヒグロマイシン抵抗性またはブレオ
マイシン抵抗性をエンコードする。あるいは、栄養要求
変異種の方法を使用することができ、こうして選択は組
み込みが起こったマイコバクテリアが、適当な培地上で
増殖するとき、生き残る能力に基づく。
PyrF−問題のDNA(Fan)の組み合わせの組み込み
マイコバクテリアの遺伝子(例えば、PyrF)を薬物抵
抗性および問題のDNAにより崩壊する、前述のものに対
する別のアプローチは、前に記載した方法の結果として
起こるような、追加の配列を使用せずに(例えば、Kan
遺伝子を使用せずに)問題のDNAをマイコバクテリアの
ゲノムの中に組み込むアプローチである。この方法は第
14図に表されている。
抗性および問題のDNAにより崩壊する、前述のものに対
する別のアプローチは、前に記載した方法の結果として
起こるような、追加の配列を使用せずに(例えば、Kan
遺伝子を使用せずに)問題のDNAをマイコバクテリアの
ゲノムの中に組み込むアプローチである。この方法は第
14図に表されている。
この方法において、それ以上の操作および問題のDNA
の導入の標的である、組み換えマイコバクテリアの細胞
をまず産生する。これは、例えば、マイコバクテリアの
PyrF遺伝子をカナマイシン抵抗性の遺伝子で正確に置換
することによって、実施することができる。標準のDNA
技術をこの置換手順において使用し、ここでPyrF遺伝子
をフランキングする配列を使用してKan遺伝子を挿入す
る。組み換えプラスミド(ここでPyrF遺伝子がKanと置
換されている)を、標準のエレクトロポレイション方法
を使用して、マイコバクテリアの細胞の中に導入する。
生ずるエレクトロポレイションした細胞をカナマイシン
を含有するがウラシルを含有しない培地上で平板培養す
る。カナマイシン抵抗性遺伝子およびゲノムのPyrF遺伝
子の両者が存在する、マイコバクテリアの細胞をこの時
点において選択する。すべての他の細胞(KANrUra-;KAN
sUra-;KANsUra+)は死亡するであろう。第14図に示すよ
うに、これはURA-およびFOArである(それらはPyrF遺伝
子を含有しないために)ならびにKANr(組み込まれたKa
n遺伝子のために)であるマイコバクテリアの細胞の選
択を生ずる。
の導入の標的である、組み換えマイコバクテリアの細胞
をまず産生する。これは、例えば、マイコバクテリアの
PyrF遺伝子をカナマイシン抵抗性の遺伝子で正確に置換
することによって、実施することができる。標準のDNA
技術をこの置換手順において使用し、ここでPyrF遺伝子
をフランキングする配列を使用してKan遺伝子を挿入す
る。組み換えプラスミド(ここでPyrF遺伝子がKanと置
換されている)を、標準のエレクトロポレイション方法
を使用して、マイコバクテリアの細胞の中に導入する。
生ずるエレクトロポレイションした細胞をカナマイシン
を含有するがウラシルを含有しない培地上で平板培養す
る。カナマイシン抵抗性遺伝子およびゲノムのPyrF遺伝
子の両者が存在する、マイコバクテリアの細胞をこの時
点において選択する。すべての他の細胞(KANrUra-;KAN
sUra-;KANsUra+)は死亡するであろう。第14図に示すよ
うに、これはURA-およびFOArである(それらはPyrF遺伝
子を含有しないために)ならびにKANr(組み込まれたKa
n遺伝子のために)であるマイコバクテリアの細胞の選
択を生ずる。
このようにして産生されたマイコバクテリアの細胞
は、この方法においてそれ以上の操作のための標的(標
的マイコバクテリアの細胞)として、既知の技術を使用
して使用し、これにより問題のDNA、および完全なPyrF
遺伝子をマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に組み込
む。第15図に示すように、前述のものおよび実施例10に
おけるもの類似し、完全なPyrF遺伝子および問題のDNA
(PyrF遺伝子の1端の次にまたは直後)を包含する、組
み換えプラスミドを使用する。組み換えプラスミドを、
標準の技術(例えば、エレクトロポレイション)を使用
して、「標的」マイコバクテリアの細胞(これはKan遺
伝子を含むが、PyrF遺伝子を含まない)の中に導入す
る。相同的組み換えは、配列の間で、標的マイコバクテ
リアの細胞の中に存在するKan遺伝子の1つの側に対し
て、および組み換えプラスミドの中に存在するPyrF遺伝
子の1つの側で起こり、第15図に示すように、標的マイ
コバクテリアの細胞の中にPyrF遺伝子のゲノム−問題の
DNAの組み合わせを組み込む。
は、この方法においてそれ以上の操作のための標的(標
的マイコバクテリアの細胞)として、既知の技術を使用
して使用し、これにより問題のDNA、および完全なPyrF
遺伝子をマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に組み込
む。第15図に示すように、前述のものおよび実施例10に
おけるもの類似し、完全なPyrF遺伝子および問題のDNA
(PyrF遺伝子の1端の次にまたは直後)を包含する、組
み換えプラスミドを使用する。組み換えプラスミドを、
標準の技術(例えば、エレクトロポレイション)を使用
して、「標的」マイコバクテリアの細胞(これはKan遺
伝子を含むが、PyrF遺伝子を含まない)の中に導入す
る。相同的組み換えは、配列の間で、標的マイコバクテ
リアの細胞の中に存在するKan遺伝子の1つの側に対し
て、および組み換えプラスミドの中に存在するPyrF遺伝
子の1つの側で起こり、第15図に示すように、標的マイ
コバクテリアの細胞の中にPyrF遺伝子のゲノム−問題の
DNAの組み合わせを組み込む。
エレクトロポレイションした細胞を、カナマイシンを
含有するが、ウラシルを含有しない培地上で平板培養す
る。Kan遺伝子およびPyrF遺伝子(それらとともに問題
のDNAが細胞に入った)を含有する細胞のみは、これら
の条件下に生き残るであろう。引き続いて、添加したウ
ラシルを含有しない生き残る細胞の培養は、第15図に示
すように、それらのゲノムの中にPyrF遺伝子−問題のDN
Aの組み合わせを組み込んで有するもののみを増殖させ
る。
含有するが、ウラシルを含有しない培地上で平板培養す
る。Kan遺伝子およびPyrF遺伝子(それらとともに問題
のDNAが細胞に入った)を含有する細胞のみは、これら
の条件下に生き残るであろう。引き続いて、添加したウ
ラシルを含有しない生き残る細胞の培養は、第15図に示
すように、それらのゲノムの中にPyrF遺伝子−問題のDN
Aの組み合わせを組み込んで有するもののみを増殖させ
る。
問題のDNAがマイコバクテリアの中で発現するその能
力を生ずる源からである場合において、発現カセットを
使用することができる。発現カセットはマイコバクテリ
アのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含有する
することができ、これらは問題のDNAの発現を制御する
発現シグナルとして働くであろう。第16図に示すよう
に、発現カセットはPyrF遺伝子を取り囲む配列の中にポ
リリンカーを含むことができる。結局、問題のDNAは挿
入されることができ、そしてマイコバクテリアのシグナ
ルはその発現を制御するであろう。PyrF−発現カセット
−問題のDNAの組み合わせがその中に安定に組み込まれ
るマイコバクテリアの細胞の選択は、第15図に関して前
述したように実施することができる。
力を生ずる源からである場合において、発現カセットを
使用することができる。発現カセットはマイコバクテリ
アのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含有する
することができ、これらは問題のDNAの発現を制御する
発現シグナルとして働くであろう。第16図に示すよう
に、発現カセットはPyrF遺伝子を取り囲む配列の中にポ
リリンカーを含むことができる。結局、問題のDNAは挿
入されることができ、そしてマイコバクテリアのシグナ
ルはその発現を制御するであろう。PyrF−発現カセット
−問題のDNAの組み合わせがその中に安定に組み込まれ
るマイコバクテリアの細胞の選択は、第15図に関して前
述したように実施することができる。
問題のDNAをマイコバクテリアのゲノムの中に組み込
むことができる、わずかに異なるが、関係する方法は、
既知の技術を使用して、通常存在するPyrF解読配列を除
去したマイコバクテリアを使用する。問題のDNA(PyrF
の1端にまたはその付近に位置する)と組み合わせて完
全な(非崩壊)PyrF遺伝子を含む以外、前述の方法に類
似する組み換えプラスミドを、PyrFを欠失したマイコバ
クテリア(例えば、エレクトロポレイションにより)の
中に導入する。完全なPyrF遺伝子(および、こうして、
問題のDNA)を含有する細胞は、ウラシルを含有しない
エレクトロポレイションした細胞を培養することによっ
て同定する。PyrF遺伝子を含有する細胞にのみが生き残
るであろう。引き続いて、ウラシルを含有しない培地上
の増殖は、また、ルーピングアウトがPyrFおよび問題の
DNAをマイコバクテリアのゲノムの中に安定に組み込ま
せた、細胞を同定するであろう。
むことができる、わずかに異なるが、関係する方法は、
既知の技術を使用して、通常存在するPyrF解読配列を除
去したマイコバクテリアを使用する。問題のDNA(PyrF
の1端にまたはその付近に位置する)と組み合わせて完
全な(非崩壊)PyrF遺伝子を含む以外、前述の方法に類
似する組み換えプラスミドを、PyrFを欠失したマイコバ
クテリア(例えば、エレクトロポレイションにより)の
中に導入する。完全なPyrF遺伝子(および、こうして、
問題のDNA)を含有する細胞は、ウラシルを含有しない
エレクトロポレイションした細胞を培養することによっ
て同定する。PyrF遺伝子を含有する細胞にのみが生き残
るであろう。引き続いて、ウラシルを含有しない培地上
の増殖は、また、ルーピングアウトがPyrFおよび問題の
DNAをマイコバクテリアのゲノムの中に安定に組み込ま
せた、細胞を同定するであろう。
PyrFがKan遺伝子と置換されているか、あるいはPyrF
がマイコバクテリアのゲノムから欠失されている、これ
らの後者のアプローチの両者の結果は、生ずる組み換え
マイコバクテリアのゲノムが機能的PyrF遺伝子および問
題のDNAを包含するが、薬物抵抗性をエンコードする遺
伝子(例えば、Kan)または他の選択可能なマーカーを
含有しないことである。
がマイコバクテリアのゲノムから欠失されている、これ
らの後者のアプローチの両者の結果は、生ずる組み換え
マイコバクテリアのゲノムが機能的PyrF遺伝子および問
題のDNAを包含するが、薬物抵抗性をエンコードする遺
伝子(例えば、Kan)または他の選択可能なマーカーを
含有しないことである。
本発明のシャトルベクターおよび方法の使用および利点
の外観 本発明のプラスミドおよびプラスミドベクター、なら
びにそれらを使用する本発明の方法について多数の用途
が存在する。これらを後述し、そしてワクチンのベヒク
ルの構成におけるそれらの使用を次の節において記載す
る。マイコバクテリアの中に導入されたDNAを発現し
た、本発明の方法の結果、病気の病原性の問題を理解す
ることについての新規な遺伝子手順は現在利用可能であ
る。ファージまたはプラスミドベクターの系を使用し
て、相同的組み換えによるか、あるいはトランスボゾン
仲介挿入または欠失により、ビルレンスおよび病原性に
要求される、特異的遺伝子機能を同定することを目的と
して、病原性マイコバクテリアの遺伝子を挿入的に突然
変異誘発しかつマーキングすることができるべきであ
る。例えば、これらのベクターおよびマイコバクテリア
(例えば、スメグマ菌(M.smegmatis)、ウシ結核菌
(M.bovis)−BCG)を使用して、ヒト結核菌(M.tuberc
ulosis)またはらい菌(M.leprae)のビルレンス遺伝子
を同定し、そして診断(診断試験)を開発することがで
きる。それの遺伝子を特異的に欠失または置換すること
によって、現在のウシ結核菌(M.bovis)−BCGのワクチ
ンより結核に対してより特異的かつ有効な弱毒化したワ
クチンを開発することができる。あるいは、結核および
らいに対して特異的な保護的抗原を抵抗性個体からのT
細胞により認識される抗原の研究により同定されるの
で、現在存在するウシ結核菌(M.bovis)−BCGワクチン
の中にそれらを導入しそして発現することが、今回、可
能である。
の外観 本発明のプラスミドおよびプラスミドベクター、なら
びにそれらを使用する本発明の方法について多数の用途
が存在する。これらを後述し、そしてワクチンのベヒク
ルの構成におけるそれらの使用を次の節において記載す
る。マイコバクテリアの中に導入されたDNAを発現し
た、本発明の方法の結果、病気の病原性の問題を理解す
ることについての新規な遺伝子手順は現在利用可能であ
る。ファージまたはプラスミドベクターの系を使用し
て、相同的組み換えによるか、あるいはトランスボゾン
仲介挿入または欠失により、ビルレンスおよび病原性に
要求される、特異的遺伝子機能を同定することを目的と
して、病原性マイコバクテリアの遺伝子を挿入的に突然
変異誘発しかつマーキングすることができるべきであ
る。例えば、これらのベクターおよびマイコバクテリア
(例えば、スメグマ菌(M.smegmatis)、ウシ結核菌
(M.bovis)−BCG)を使用して、ヒト結核菌(M.tuberc
ulosis)またはらい菌(M.leprae)のビルレンス遺伝子
を同定し、そして診断(診断試験)を開発することがで
きる。それの遺伝子を特異的に欠失または置換すること
によって、現在のウシ結核菌(M.bovis)−BCGのワクチ
ンより結核に対してより特異的かつ有効な弱毒化したワ
クチンを開発することができる。あるいは、結核および
らいに対して特異的な保護的抗原を抵抗性個体からのT
細胞により認識される抗原の研究により同定されるの
で、現在存在するウシ結核菌(M.bovis)−BCGワクチン
の中にそれらを導入しそして発現することが、今回、可
能である。
本発明のベクターは、まず、マイコバクテリアの中で
ゲノムのライブラリーの構成を可能とする。これは、病
原性マイコバクテリアのための抗原または酵素または薬
物の標的を同定するとき、とくに有用である。例えば、
らい菌(M.leprae)において、ゲノムのDNAを切りそし
てクローニングして、全体のゲノムのDNAが含まれるこ
とを確実にする。主題のベクターを使用して、らい菌
(M.leprae)の断片のライブラリーをまずバクテリアの
宿主、例えば、E.coliの中に導入し、ここでそれを発現
する。引き続いて、それはマイコバクテリウム(例え
ば、スメグマ菌(M.smegmatis)、BCG)の中に動く。結
局、ライブラリーはマイコバクテリアの宿主の中に存在
し、こうしてマイコバクテリアの抗原、酵素、薬物の標
的および診断プローブの探索をより効率よくする。
ゲノムのライブラリーの構成を可能とする。これは、病
原性マイコバクテリアのための抗原または酵素または薬
物の標的を同定するとき、とくに有用である。例えば、
らい菌(M.leprae)において、ゲノムのDNAを切りそし
てクローニングして、全体のゲノムのDNAが含まれるこ
とを確実にする。主題のベクターを使用して、らい菌
(M.leprae)の断片のライブラリーをまずバクテリアの
宿主、例えば、E.coliの中に導入し、ここでそれを発現
する。引き続いて、それはマイコバクテリウム(例え
ば、スメグマ菌(M.smegmatis)、BCG)の中に動く。結
局、ライブラリーはマイコバクテリアの宿主の中に存在
し、こうしてマイコバクテリアの抗原、酵素、薬物の標
的および診断プローブの探索をより効率よくする。
ショットガンのアプローチを使用して、DNAをBCGの中
に導入し、そして遅く増殖するマイコバクテリアであ
る、現在入手可能なBCGより速くクローンを増殖させる
ことができる遺伝子を含有するクローンを同定すること
ができる。引き続いて、この方法において同定された遺
伝子を使用して、現在使用されているBCGより速く増殖
するBCGを産生することができる。同様なアプローチを
使用して、らい菌(M.leprae)の遺伝子を培養可能なマ
イコバクテリウムの中にクローニングし、そして増殖す
る組み換え細胞を同定することができる。このアプロー
チを使用して、培養可能なマイコバクテリウムかららい
菌(M.leprae)をつくり、こうして病原体を産生すると
いう現在の困難を軽減することができる。
に導入し、そして遅く増殖するマイコバクテリアであ
る、現在入手可能なBCGより速くクローンを増殖させる
ことができる遺伝子を含有するクローンを同定すること
ができる。引き続いて、この方法において同定された遺
伝子を使用して、現在使用されているBCGより速く増殖
するBCGを産生することができる。同様なアプローチを
使用して、らい菌(M.leprae)の遺伝子を培養可能なマ
イコバクテリウムの中にクローニングし、そして増殖す
る組み換え細胞を同定することができる。このアプロー
チを使用して、培養可能なマイコバクテリウムかららい
菌(M.leprae)をつくり、こうして病原体を産生すると
いう現在の困難を軽減することができる。
本発明のベクターを、また、使用して、結核またはら
いの予防または処置のための新規な薬物を同定すること
ができる。例えば、薬物をそれに対して向けらるべき標
的は、病原性マイコバクテリウムにより産生される酵素
(例えば、ジャイレース)である。スメグマ菌(M.smeg
matis)中の対応する酵素をエンコードする遺伝子は、
主題のベクターを使用して、ヒト結核菌(M.tuberculos
is)またはらい菌(M.leprae)の酵素をエンコードする
遺伝子と置換することができる。これにより、酵素に対
して有効な薬物(ならびに鳥結核菌(M.avium)および
マイコバクテリウム・イントラセルラレ(Mycobacteriu
m intracellulare))を同定するための試験のために
使用できる、組み換えスメグマ菌(M.smegmatis)が産
生する。
いの予防または処置のための新規な薬物を同定すること
ができる。例えば、薬物をそれに対して向けらるべき標
的は、病原性マイコバクテリウムにより産生される酵素
(例えば、ジャイレース)である。スメグマ菌(M.smeg
matis)中の対応する酵素をエンコードする遺伝子は、
主題のベクターを使用して、ヒト結核菌(M.tuberculos
is)またはらい菌(M.leprae)の酵素をエンコードする
遺伝子と置換することができる。これにより、酵素に対
して有効な薬物(ならびに鳥結核菌(M.avium)および
マイコバクテリウム・イントラセルラレ(Mycobacteriu
m intracellulare))を同定するための試験のために
使用できる、組み換えスメグマ菌(M.smegmatis)が産
生する。
ここで記載する遺伝子のアプローチは、カナマイシン
抵抗性をエンコードするaphおよびneo遺伝子の両者がウ
シ結核菌(M.bovis)−BCGのワクチンの菌株の中で安定
に発現されることができる(そして発現された)ことを
明瞭にする。
抵抗性をエンコードするaphおよびneo遺伝子の両者がウ
シ結核菌(M.bovis)−BCGのワクチンの菌株の中で安定
に発現されることができる(そして発現された)ことを
明瞭にする。
ここに記載する研究の結果として、選択可能なマーカ
ー(選択の基準することができる、同定可能な特性をエ
ンコードする遺伝子)は今回マイコバクテリアのために
入手可能である。3つのこのようなマーカーは、今回マ
イコバクテリアのために入手可能である:クロランフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼまたはcat遺伝
子、これはクロランフェニコール抵抗性を与える;2)Tn
903からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
またはaph遺伝子、これはカナマイシン抵抗性を与え
る;およびc I遺伝子、これはL1バクテリオファージの
リプレッサータンパク質をエンコードする。適当な薬物
を含有する培地の増殖は、catまたはaph遺伝子を含有す
るマイコバクテリアを選択する薬物抵抗性遺伝子の場合
において使用する。培養するとき形成するプラークの外
観(曇りまたは透明)に基づく変動の選択は、c I遺伝
子を選択に使用する場合において使用する。
ー(選択の基準することができる、同定可能な特性をエ
ンコードする遺伝子)は今回マイコバクテリアのために
入手可能である。3つのこのようなマーカーは、今回マ
イコバクテリアのために入手可能である:クロランフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼまたはcat遺伝
子、これはクロランフェニコール抵抗性を与える;2)Tn
903からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
またはaph遺伝子、これはカナマイシン抵抗性を与え
る;およびc I遺伝子、これはL1バクテリオファージの
リプレッサータンパク質をエンコードする。適当な薬物
を含有する培地の増殖は、catまたはaph遺伝子を含有す
るマイコバクテリアを選択する薬物抵抗性遺伝子の場合
において使用する。培養するとき形成するプラークの外
観(曇りまたは透明)に基づく変動の選択は、c I遺伝
子を選択に使用する場合において使用する。
また、ここに記載する研究の結果として、溶原性およ
び部位特異的組み換えは、マイコバクテリアの染色体の
DNA上のおよびマイコバクテリアのファージ上の、特異
的部位、組み込み部位(attachment site)として知ら
れている、またはatt部位の間で起こることが示され
た。ファージラムダで感染したバクテリアにおいて、フ
ァージDNAの生理学的状態は溶菌および溶原性の状態に
おいて異なる。これらの状態の1つから他の状態への変
化は、部位特異的組み換えを包含する。宿主DNAの中へ
のラムダDNAの組み込み(プロファージDNAとなる遊離の
ラムダDNAを生ずる)は、溶原性が起こるために起こら
なくてはならない;逆に、宿主の染色体からのプロファ
ージDNAの切り出しは溶菌が起こるために起こらなくて
はならない。組み込みおよび切り出しは部位特異的組み
換えを包含する。この現象はバクテリアのいくつかの属
について知られているが、これはそれがマイコバクテリ
アについて実証された最初である。それは、問題のDNA
がマイコバクテリアの中に効率よくかつ安定に組み込む
ことができる手段として使用することができる。
び部位特異的組み換えは、マイコバクテリアの染色体の
DNA上のおよびマイコバクテリアのファージ上の、特異
的部位、組み込み部位(attachment site)として知ら
れている、またはatt部位の間で起こることが示され
た。ファージラムダで感染したバクテリアにおいて、フ
ァージDNAの生理学的状態は溶菌および溶原性の状態に
おいて異なる。これらの状態の1つから他の状態への変
化は、部位特異的組み換えを包含する。宿主DNAの中へ
のラムダDNAの組み込み(プロファージDNAとなる遊離の
ラムダDNAを生ずる)は、溶原性が起こるために起こら
なくてはならない;逆に、宿主の染色体からのプロファ
ージDNAの切り出しは溶菌が起こるために起こらなくて
はならない。組み込みおよび切り出しは部位特異的組み
換えを包含する。この現象はバクテリアのいくつかの属
について知られているが、これはそれがマイコバクテリ
アについて実証された最初である。それは、問題のDNA
がマイコバクテリアの中に効率よくかつ安定に組み込む
ことができる手段として使用することができる。
例えば、これはcos−attベクターと呼ぶものを使用し
て達成することができる。このようなベクターは、次の
ものを包含することができる:1)E.coliまたは複製の他
の適当なバクテリアの由来;2)E.coliまたは他のバクテ
リアの宿主中の選択のための、選択可能なマーカー、例
えば、アンピシリン抵抗性をエンコードする遺伝子;3)
テンペレートファージのatt領域、例えばL1;4)ラムダc
os部位、ラムダ生体外パッケージング系を使用すること
ができるために;および5)選択可能なマーカー、例え
ば、カナマイシン抵抗性、クロランフェニコール抵抗性
をエンコードする遺伝子またはファージL1のc Iリプレ
ッサーをエンコードする遺伝子。ベクターは、、既知の
技術およびここに記載する技術を使用して構成すること
ができる。ベクターの組み込みを仲介するために必要な
遺伝子は、同一ベクター上に存在することができるか、
あるいは途中で設けることができる。
て達成することができる。このようなベクターは、次の
ものを包含することができる:1)E.coliまたは複製の他
の適当なバクテリアの由来;2)E.coliまたは他のバクテ
リアの宿主中の選択のための、選択可能なマーカー、例
えば、アンピシリン抵抗性をエンコードする遺伝子;3)
テンペレートファージのatt領域、例えばL1;4)ラムダc
os部位、ラムダ生体外パッケージング系を使用すること
ができるために;および5)選択可能なマーカー、例え
ば、カナマイシン抵抗性、クロランフェニコール抵抗性
をエンコードする遺伝子またはファージL1のc Iリプレ
ッサーをエンコードする遺伝子。ベクターは、、既知の
技術およびここに記載する技術を使用して構成すること
ができる。ベクターの組み込みを仲介するために必要な
遺伝子は、同一ベクター上に存在することができるか、
あるいは途中で設けることができる。
ここに記載する研究は、マイコバクテリア(例えば、
スメグマ菌(M.smegmatis)、BCG)の中で染色体外で複
製するプラスミドのレプリコンの同定を生ずる。記載す
るように、pAL5000レプリコンが同定された。同一方法
を使用して、また、使用することができる他のものを同
定することができる。
スメグマ菌(M.smegmatis)、BCG)の中で染色体外で複
製するプラスミドのレプリコンの同定を生ずる。記載す
るように、pAL5000レプリコンが同定された。同一方法
を使用して、また、使用することができる他のものを同
定することができる。
記載する研究は、また、組み換えDNA分子である、E.c
oliマイコバクテリアのシャトルプラスミドの首尾よい
構成を実証し、そして組み換えDNA分子はE.coliの中で
プラスミドとして複製しかつマイコバクテリアの中でフ
ァージとして複製する能力を有するばかりでなく、かつ
またバクテリオファージラムダのヘッドの中にまたはマ
イコバクテリオファージ粒子の中にパッケージングされ
る能力を有する。研究において、さらに、組み換えDNA
は急速に増殖するマイコバクテリウム(スメグマ菌(M.
smegmatis))および遅く増殖するマイコバクテリウム
(BCG)の両者の中に導入されたことが実証された。こ
れにより、ウシ結核菌(M.bovis)−BCGのワクチンの菌
株をシャトルプラスミドで感染することおよび、こうし
て、クローニングした遺伝子をマイコバクテリアの中に
導入することができる。こうして、これはBCGのために
トランスフェクション系を開発する必要性を排除する。
すなわち、E.coli−マイコバクテリアのシャトルプラス
ミドは、マイコバクテリアの中にトランスフェクション
すると、マイコバクテリアの粒子の中にパッケージング
されるので、問題のDNAをトランスフェクションよりむ
しろ形質導入により遅く増殖するマイコバクテリア(例
えば、ウシ結核菌(M.bovis)−BCG)の中に安定に導入
することができる。これにより、問題の1または2以上
の抗原に対して免疫化するために使用することができ
る、組み換えマイコバクテリアのワクチンのベヒクルを
産生することができる。
oliマイコバクテリアのシャトルプラスミドの首尾よい
構成を実証し、そして組み換えDNA分子はE.coliの中で
プラスミドとして複製しかつマイコバクテリアの中でフ
ァージとして複製する能力を有するばかりでなく、かつ
またバクテリオファージラムダのヘッドの中にまたはマ
イコバクテリオファージ粒子の中にパッケージングされ
る能力を有する。研究において、さらに、組み換えDNA
は急速に増殖するマイコバクテリウム(スメグマ菌(M.
smegmatis))および遅く増殖するマイコバクテリウム
(BCG)の両者の中に導入されたことが実証された。こ
れにより、ウシ結核菌(M.bovis)−BCGのワクチンの菌
株をシャトルプラスミドで感染することおよび、こうし
て、クローニングした遺伝子をマイコバクテリアの中に
導入することができる。こうして、これはBCGのために
トランスフェクション系を開発する必要性を排除する。
すなわち、E.coli−マイコバクテリアのシャトルプラス
ミドは、マイコバクテリアの中にトランスフェクション
すると、マイコバクテリアの粒子の中にパッケージング
されるので、問題のDNAをトランスフェクションよりむ
しろ形質導入により遅く増殖するマイコバクテリア(例
えば、ウシ結核菌(M.bovis)−BCG)の中に安定に導入
することができる。これにより、問題の1または2以上
の抗原に対して免疫化するために使用することができ
る、組み換えマイコバクテリアのワクチンのベヒクルを
産生することができる。
これらのプラスミドを構成するために生体外パッケー
ジングの使用は、パッケージング系の大きさの限界を越
えないかぎり、遺伝子(例えば、それに対する免疫応答
を望む1または2以上の病原体のための1または2以上
の抗原をエンコードする遺伝子またはDNA)をこれらの
ベクターの中にクローニングする効率よい方法として拡
張することができる。追加のL1::pHC79組み換えプラス
ミドをスクリーニングすることによって、L1ファージか
ら欠失することができるDNAの最大量を決定すること、
およびその中にDNAを挿入することができる、ファージ
のゲノムの追加の非必須領域を定めることが、また、可
能である。
ジングの使用は、パッケージング系の大きさの限界を越
えないかぎり、遺伝子(例えば、それに対する免疫応答
を望む1または2以上の病原体のための1または2以上
の抗原をエンコードする遺伝子またはDNA)をこれらの
ベクターの中にクローニングする効率よい方法として拡
張することができる。追加のL1::pHC79組み換えプラス
ミドをスクリーニングすることによって、L1ファージか
ら欠失することができるDNAの最大量を決定すること、
およびその中にDNAを挿入することができる、ファージ
のゲノムの追加の非必須領域を定めることが、また、可
能である。
問題のDNAの発現に有用な遺伝子的に組み換えのマイコ
バクテリアの構成 本発明の方法は、マイコバクテリウムの中に組み込ま
れた問題のDNAによりエンコードされる1または2以上
のタンパク質またはポリペプチドの発現のための、遺伝
子的に組み換えのマイコバクテリアのベヒクルを構成す
るために有用である。このような遺伝子的に組み換えの
マイコバクテリアは多数の用途を有する。
バクテリアの構成 本発明の方法は、マイコバクテリウムの中に組み込ま
れた問題のDNAによりエンコードされる1または2以上
のタンパク質またはポリペプチドの発現のための、遺伝
子的に組み換えのマイコバクテリアのベヒクルを構成す
るために有用である。このような遺伝子的に組み換えの
マイコバクテリアは多数の用途を有する。
本発明のベヒクルは、例えば、問題のDNAによりエン
コードされる病原性抗原に対する免疫性を誘発するため
のワクチンとして、使用することができる。病原体は、
病気を引き起こす、任意のウイルス、微生物、または他
の有機体または物質(例えば、毒素)である。らいに対
する免疫化のために有用なワクチンのベヒクルをつくる
ことができる。マイコバクテリア、例えば、BCGの例外
的なアジュバントの活性のために、このようなワクチン
は、とくに長期間のまたは耐久性の性質の、細胞仲介免
疫性の産生において有効である。らいの寄生体らい菌
(M.leprae)のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子
は、ヤング(Young)により分離され、そして同時係属
米国特許出願第892,095号、1986年7月31日提出、その
教示を引用によってここに加える、に詳細に記載されて
いる。とくに、5つの免疫原性タンパク質抗原(すなわ
ち、分子量65kD、36kD、28kD、18kDおよび12kDの抗原)
をエンコードする遺伝子が分離された。さらに、65kD抗
原のための遺伝子によりエンコードされる6つの異なる
エピトープが定められた。これらの少なくとも1つのエ
ピトープはらい菌(M.leprae)に対して独特であること
が示された;他のエピトープは他のマイコバクテリアの
65kDタンパク質と共有されることが示された。
コードされる病原性抗原に対する免疫性を誘発するため
のワクチンとして、使用することができる。病原体は、
病気を引き起こす、任意のウイルス、微生物、または他
の有機体または物質(例えば、毒素)である。らいに対
する免疫化のために有用なワクチンのベヒクルをつくる
ことができる。マイコバクテリア、例えば、BCGの例外
的なアジュバントの活性のために、このようなワクチン
は、とくに長期間のまたは耐久性の性質の、細胞仲介免
疫性の産生において有効である。らいの寄生体らい菌
(M.leprae)のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子
は、ヤング(Young)により分離され、そして同時係属
米国特許出願第892,095号、1986年7月31日提出、その
教示を引用によってここに加える、に詳細に記載されて
いる。とくに、5つの免疫原性タンパク質抗原(すなわ
ち、分子量65kD、36kD、28kD、18kDおよび12kDの抗原)
をエンコードする遺伝子が分離された。さらに、65kD抗
原のための遺伝子によりエンコードされる6つの異なる
エピトープが定められた。これらの少なくとも1つのエ
ピトープはらい菌(M.leprae)に対して独特であること
が示された;他のエピトープは他のマイコバクテリアの
65kDタンパク質と共有されることが示された。
本発明のシャトルベクターおよび組み換えプラスミド
ベクターの使用により、前述の方法および次の実施例の
方法を使用して、BCGの中にらい菌(M.leprae)タンパ
ク質抗原をエンコードする1または2以上の遺伝子を導
入することができる。65kDのらい菌(M.leprae)タンパ
ク質をエンコードする遺伝子は、事実、組み換えの中に
導入されそして組み換えBCGにより発現された。ウェス
タン・ブロット分析の結果(第17図)は、65kDのらい菌
(M.leprae)抗原および選択可能なマーカーの両者の存
在を実証した。例えば、65kDらい菌(M.leprae)抗原を
エンコードする遺伝子はBCGの中に導入し、そのゲノム
のDNAの中に安定に組み込み、そしてそれを投与した宿
主において免疫応答を刺激または導入ために十分なレベ
ルで発現することができる。実施例11に詳細に記載され
ているように、65kDのらい菌(M.leprae)タンパク質に
対して特異的なモノクローナル抗体を使用して、遺伝子
をその中に導入したスメグマ菌(M.smegmatis)の抽出
物の中で65kDのらい菌(M.leprae)遺伝子の発現を実証
した。さらに、SIV1エンヴェロープタンパク質をエンコ
ードする遺伝子を、Kanおよびらい菌(M.leprae)の遺
伝子について記載した技術を使用して、スメグマ菌(M.
smegmatis)の中に導入すべき、同様なプラスミドベク
ターの中にクローニングした。同様な構成体を、BCGの
中に導入するために、また、つくった。このようにし
て、らい菌(M.leprae)の1または2以上の保護的抗原
を含有し、寛容性決定因子もたず、そして細胞仲介免疫
性を誘発するためにきわめてすぐれたアジュバントを有
することにおいて、理想的に近いワクチンを構成するこ
とができる。
ベクターの使用により、前述の方法および次の実施例の
方法を使用して、BCGの中にらい菌(M.leprae)タンパ
ク質抗原をエンコードする1または2以上の遺伝子を導
入することができる。65kDのらい菌(M.leprae)タンパ
ク質をエンコードする遺伝子は、事実、組み換えの中に
導入されそして組み換えBCGにより発現された。ウェス
タン・ブロット分析の結果(第17図)は、65kDのらい菌
(M.leprae)抗原および選択可能なマーカーの両者の存
在を実証した。例えば、65kDらい菌(M.leprae)抗原を
エンコードする遺伝子はBCGの中に導入し、そのゲノム
のDNAの中に安定に組み込み、そしてそれを投与した宿
主において免疫応答を刺激または導入ために十分なレベ
ルで発現することができる。実施例11に詳細に記載され
ているように、65kDのらい菌(M.leprae)タンパク質に
対して特異的なモノクローナル抗体を使用して、遺伝子
をその中に導入したスメグマ菌(M.smegmatis)の抽出
物の中で65kDのらい菌(M.leprae)遺伝子の発現を実証
した。さらに、SIV1エンヴェロープタンパク質をエンコ
ードする遺伝子を、Kanおよびらい菌(M.leprae)の遺
伝子について記載した技術を使用して、スメグマ菌(M.
smegmatis)の中に導入すべき、同様なプラスミドベク
ターの中にクローニングした。同様な構成体を、BCGの
中に導入するために、また、つくった。このようにし
て、らい菌(M.leprae)の1または2以上の保護的抗原
を含有し、寛容性決定因子もたず、そして細胞仲介免疫
性を誘発するためにきわめてすぐれたアジュバントを有
することにおいて、理想的に近いワクチンを構成するこ
とができる。
同様な方式で、本発明のシャトルまたはプラスミドの
ベクターおよび方法を使用して、ワクチンを構成し、結
核に対する特異的保護を提供することができる。このよ
うなワクチンは、前述したように、現在使用されている
ワクチンが無効であることが証明されているという最近
報告された発見を考慮すると、とくに魅力的である。結
核のバチルス属のヒト結核菌(M.tuberculosis)の免疫
原性タンパク質抗原をエンコードする遺伝子は、次の出
願に記載されている:同時係属米国特許出願第07/010,0
07号、発明の名称「ヒト結核菌のタンパク質抗原をエン
コードする遺伝子およびその使用」(Robert N.Husson
およびRichard A.Young)、1987年2月2日提出(現在
放棄された)、および一部継続米国特許出願第07/154,3
31号(1988年2月10日、エキスプレス・メイル・プロセ
ジュアー(Express Mail procedure)により提出され
た)、発明の名称「ヒト結核菌のタンパク質抗原をエン
コードする遺伝子およびその使用」(Robert N.husso
n、Richard A.YoungおよびThomas M.Shinnick)、そ
れらの教示を引用によってここに加える。
ベクターおよび方法を使用して、ワクチンを構成し、結
核に対する特異的保護を提供することができる。このよ
うなワクチンは、前述したように、現在使用されている
ワクチンが無効であることが証明されているという最近
報告された発見を考慮すると、とくに魅力的である。結
核のバチルス属のヒト結核菌(M.tuberculosis)の免疫
原性タンパク質抗原をエンコードする遺伝子は、次の出
願に記載されている:同時係属米国特許出願第07/010,0
07号、発明の名称「ヒト結核菌のタンパク質抗原をエン
コードする遺伝子およびその使用」(Robert N.Husson
およびRichard A.Young)、1987年2月2日提出(現在
放棄された)、および一部継続米国特許出願第07/154,3
31号(1988年2月10日、エキスプレス・メイル・プロセ
ジュアー(Express Mail procedure)により提出され
た)、発明の名称「ヒト結核菌のタンパク質抗原をエン
コードする遺伝子およびその使用」(Robert N.husso
n、Richard A.YoungおよびThomas M.Shinnick)、そ
れらの教示を引用によってここに加える。
この場合において、ヒト結核菌(M.tuberculosis)の
免疫原性タンパク質抗原をエンコードする遺伝子を、前
述したように、シャトルまたはプラスミドのベクターに
よりBCGの中に導入する。また、各々がタンパク質抗原
をエンコードする、1より多いヒト結核菌(M.tubercul
osis)遺伝子をBCGの中に導入することができる。例え
ば、分子量12kD、14kD、19kD、65kDおよび71kDの免疫原
性ヒト結核菌(M.tuberculosis)抗原、またはこれらの
遺伝子の2またはそれ以上の組み合わせをBCGの中に挿
入し、ゲノムのDNAの中に安定に組み込み、そして発現
することができる。結核に対する免疫化に対して特異的
であり、そしてバチルス属に対する長期間持続する免疫
性を誘発するワクチンが得られる。
免疫原性タンパク質抗原をエンコードする遺伝子を、前
述したように、シャトルまたはプラスミドのベクターに
よりBCGの中に導入する。また、各々がタンパク質抗原
をエンコードする、1より多いヒト結核菌(M.tubercul
osis)遺伝子をBCGの中に導入することができる。例え
ば、分子量12kD、14kD、19kD、65kDおよび71kDの免疫原
性ヒト結核菌(M.tuberculosis)抗原、またはこれらの
遺伝子の2またはそれ以上の組み合わせをBCGの中に挿
入し、ゲノムのDNAの中に安定に組み込み、そして発現
することができる。結核に対する免疫化に対して特異的
であり、そしてバチルス属に対する長期間持続する免疫
性を誘発するワクチンが得られる。
また、本発明の方法を使用して、多目的的または多機
能的ワクチン(すなわち、各遺伝子が異なる病原体また
は毒素のためのタンパク質抗原をエンコードする、1よ
り多い遺伝子を含む問題のDNAをを含有しかつそれを発
現する、単一のワクチンのベヒクル)を構成することが
できる。例えば、記載したシャトルベクターのプラスミ
ドまたはプラスミドベクターを使用して、らい菌(M.le
prae)のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子、ヒト
結核菌(M.tuberculosis)のタンパク質抗原をエンコー
ドする遺伝子、レイシュマニアの抗原をエンコードする
遺伝子、およびマラリアのタンパク質抗原をエンコード
する遺伝子をBCGの中に導入することができる。この多
価ワクチンの投与は、各抗原に対する免疫応答を刺激
し、そしてらい、結核、レイシュマニアおよびマラリア
に対する長期間の保護を提供するであろう。
能的ワクチン(すなわち、各遺伝子が異なる病原体また
は毒素のためのタンパク質抗原をエンコードする、1よ
り多い遺伝子を含む問題のDNAをを含有しかつそれを発
現する、単一のワクチンのベヒクル)を構成することが
できる。例えば、記載したシャトルベクターのプラスミ
ドまたはプラスミドベクターを使用して、らい菌(M.le
prae)のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子、ヒト
結核菌(M.tuberculosis)のタンパク質抗原をエンコー
ドする遺伝子、レイシュマニアの抗原をエンコードする
遺伝子、およびマラリアのタンパク質抗原をエンコード
する遺伝子をBCGの中に導入することができる。この多
価ワクチンの投与は、各抗原に対する免疫応答を刺激
し、そしてらい、結核、レイシュマニアおよびマラリア
に対する長期間の保護を提供するであろう。
組み換えマイコバクテリアは、また、抗受精「ワクチ
ン」のベヒクルとして使用することができる。例えば、
ヒトの成長ホルモン(HGH)の断片のような抗原をエン
コードするDNAを含有しマイコバクテリアを、抗受精ワ
クチンとして使用し、そして産児制限剤として投与する
ことができる。本発明のワクチンのベヒクルはヒトの
癌、例えば、膀胱癌または黒色腫を処理する(例えば、
増殖阻害因子または殺細胞産生物の発現により)ために
使用することができる。これに関して、インターフェロ
ンα、βおよび/またはγ、1または2以上のインター
リューキン(インターリューキン1〜7)および/また
はTNFαまたはβを含有しそしてそれらを発現する組み
換えマイコバクテリアはとくに有用である。他の応用に
おいて、組み換えマイコバクテリアを使用して、保護的
免疫応答(例えば、引き続くまたは長期間の感染に対す
る)を引き出す目的で、あるいは自己免疫病(例えば、
慢性関節リウマチ)における耐性を誘発する目的で、ス
トレスタンパク質を発現するために使用することができ
る。ストレスタンパク質、例えば、同時係属米国特許出
願第207,298号、発明の名称「ストレスタンパク質およ
びその使用」(Richard A.YoungおよびDouglas Youn
g)、1988年6月15日提出、に記載されているものを、
この目的に使用することができる。それらのゲノムは大
きい(例えば、BCGゲノムは約3×106bpの長さである)
ために、マイコバクテリアは大量の問題のDNAを収容し
そして、こうして、多目的ベヒクルとして働くことがで
きる。
ン」のベヒクルとして使用することができる。例えば、
ヒトの成長ホルモン(HGH)の断片のような抗原をエン
コードするDNAを含有しマイコバクテリアを、抗受精ワ
クチンとして使用し、そして産児制限剤として投与する
ことができる。本発明のワクチンのベヒクルはヒトの
癌、例えば、膀胱癌または黒色腫を処理する(例えば、
増殖阻害因子または殺細胞産生物の発現により)ために
使用することができる。これに関して、インターフェロ
ンα、βおよび/またはγ、1または2以上のインター
リューキン(インターリューキン1〜7)および/また
はTNFαまたはβを含有しそしてそれらを発現する組み
換えマイコバクテリアはとくに有用である。他の応用に
おいて、組み換えマイコバクテリアを使用して、保護的
免疫応答(例えば、引き続くまたは長期間の感染に対す
る)を引き出す目的で、あるいは自己免疫病(例えば、
慢性関節リウマチ)における耐性を誘発する目的で、ス
トレスタンパク質を発現するために使用することができ
る。ストレスタンパク質、例えば、同時係属米国特許出
願第207,298号、発明の名称「ストレスタンパク質およ
びその使用」(Richard A.YoungおよびDouglas Youn
g)、1988年6月15日提出、に記載されているものを、
この目的に使用することができる。それらのゲノムは大
きい(例えば、BCGゲノムは約3×106bpの長さである)
ために、マイコバクテリアは大量の問題のDNAを収容し
そして、こうして、多目的ベヒクルとして働くことがで
きる。
本発明の組み換えマイコバクテリアを使用して、問題
の1または2以上のポリペプチド、例えば、ステロイド
を産生することができる。この場合において、ステロイ
ドをエンコードする遺伝子のすべてまたは一部分を適当
なマイコバクテリアの宿主の中に導入し、ここでそれを
発現する。こうして、組み換えマイコバクテリアはこの
ようなタンパク質を産生する価値ある手段を提供する。
の1または2以上のポリペプチド、例えば、ステロイド
を産生することができる。この場合において、ステロイ
ドをエンコードする遺伝子のすべてまたは一部分を適当
なマイコバクテリアの宿主の中に導入し、ここでそれを
発現する。こうして、組み換えマイコバクテリアはこの
ようなタンパク質を産生する価値ある手段を提供する。
さらに、本発明のシャトルベクターおよび遺伝子的に
組み換えのマイコバクテリアは診断において使用するこ
とができる。例えば、病原性有機体(例えば、ヒト結核
菌(M.tuberculosis)、鳥結核菌(M.avium))に対し
て特異的であり(問題のDNAを導入することができる)
そしてリポーター分子をエンコードするDNA(例えば、
ビブリオバクテリアからのまたはホタルのルシフェラー
ゼ;β−ガラクトシダーゼ;β−グルコシダーゼ;カテ
コールデヒドロゲナーゼ)および強いマイコバクテリア
のプロモーター(転写の開始に必要なDNA配列)を包含
し、リポーター分子をエンコードする遺伝子の発現を制
御(推進)するシャトルプラスミドを構成する。病原性
有機体の存在または不存在について評価すべき個体から
試料(例えば、血液または尿)を得る。例えば、個体を
結核について試験する場合、ヒト結核菌(M.tuberculos
is)に対して特異的なシャトルプラスミドを使用する。
試料を培養し、そして適当な量のヒト結核菌(M.tuberc
ulosis)特異的プラスミドと組み合わせる。適当な条件
下に短時間(例えば、数時間)後、試料を、既知の技術
を使用して、ベクター中のDNAによりエンコードされる
リポーター分子の発生(存在または不存在または必要に
応じて、量)についてアッセイする。試料が、非常に低
いレベルでさえ、ヒト結核菌(M.tuberculosis)を含有
する場合、ファージの中に存在するDNAは有機体の中に
導入されるであろう。いったん試料の中にヒト結核菌
(M.tuberculosis)が存在すると、リポーター分子をエ
ンコードするものを包含する、プラスミド(ファージ)
DNAは複製されるであろう。リポーター分子がルシフェ
ラーゼである場合、かなりな量のルシフェラーゼは産生
され(産生は強いプロモーターにより推進されるので)
そして研究装置、例えば、フォトメーターを使用して検
出することができる。個体におけるヒト結核菌(M.tube
rculosis)の感染の存在または不存在の決定は可能であ
り、同様に必要に応じて定量は可能である。本発明の方
法が開発されるまで、結核を診断する利用可能な技術は
遅かった(例えば、数週を要した)。今回マイコバクテ
リアの中で発現された、β−グルコシダーゼは、また、
リポーター分子として使用することができる。
組み換えのマイコバクテリアは診断において使用するこ
とができる。例えば、病原性有機体(例えば、ヒト結核
菌(M.tuberculosis)、鳥結核菌(M.avium))に対し
て特異的であり(問題のDNAを導入することができる)
そしてリポーター分子をエンコードするDNA(例えば、
ビブリオバクテリアからのまたはホタルのルシフェラー
ゼ;β−ガラクトシダーゼ;β−グルコシダーゼ;カテ
コールデヒドロゲナーゼ)および強いマイコバクテリア
のプロモーター(転写の開始に必要なDNA配列)を包含
し、リポーター分子をエンコードする遺伝子の発現を制
御(推進)するシャトルプラスミドを構成する。病原性
有機体の存在または不存在について評価すべき個体から
試料(例えば、血液または尿)を得る。例えば、個体を
結核について試験する場合、ヒト結核菌(M.tuberculos
is)に対して特異的なシャトルプラスミドを使用する。
試料を培養し、そして適当な量のヒト結核菌(M.tuberc
ulosis)特異的プラスミドと組み合わせる。適当な条件
下に短時間(例えば、数時間)後、試料を、既知の技術
を使用して、ベクター中のDNAによりエンコードされる
リポーター分子の発生(存在または不存在または必要に
応じて、量)についてアッセイする。試料が、非常に低
いレベルでさえ、ヒト結核菌(M.tuberculosis)を含有
する場合、ファージの中に存在するDNAは有機体の中に
導入されるであろう。いったん試料の中にヒト結核菌
(M.tuberculosis)が存在すると、リポーター分子をエ
ンコードするものを包含する、プラスミド(ファージ)
DNAは複製されるであろう。リポーター分子がルシフェ
ラーゼである場合、かなりな量のルシフェラーゼは産生
され(産生は強いプロモーターにより推進されるので)
そして研究装置、例えば、フォトメーターを使用して検
出することができる。個体におけるヒト結核菌(M.tube
rculosis)の感染の存在または不存在の決定は可能であ
り、同様に必要に応じて定量は可能である。本発明の方
法が開発されるまで、結核を診断する利用可能な技術は
遅かった(例えば、数週を要した)。今回マイコバクテ
リアの中で発現された、β−グルコシダーゼは、また、
リポーター分子として使用することができる。
タンパク質またはポリペプチドを発現するための使用
のいずれにおいても、シグナル配列をエンコードするシ
ャトルベクターのDNAを含めることが可能であり、こう
して、発現されたタンパク質またはポリペプチドを細胞
質中につくり、次いで細胞壁において分泌する手段を提
供することができる。例えば、マイコバクテリアの中で
分泌するα抗原からシグナル配列を使用することができ
るであろう。あるいは、β−ガラクトシダーゼ、アガロ
ースまたはα−アミラーゼのためのシグナル配列を使用
するすることができるであろう。
のいずれにおいても、シグナル配列をエンコードするシ
ャトルベクターのDNAを含めることが可能であり、こう
して、発現されたタンパク質またはポリペプチドを細胞
質中につくり、次いで細胞壁において分泌する手段を提
供することができる。例えば、マイコバクテリアの中で
分泌するα抗原からシグナル配列を使用することができ
るであろう。あるいは、β−ガラクトシダーゼ、アガロ
ースまたはα−アミラーゼのためのシグナル配列を使用
するすることができるであろう。
次の実施例によって、本発明をここで説明する。これ
らの実施例はいかなる方法おいても限定的に考慮すべき
ではない。
らの実施例はいかなる方法おいても限定的に考慮すべき
ではない。
実施例1
マイコバクテリオファージD29 DNAを使用するスメグマ
菌(M.smegmatis)スフェロプラストのトランスフェク
ション スメグマ菌(M.smegmatis)菌株mc26のスフェロプラ
ストを、次の方法に従い調製した。mc26は単一のコロニ
ーの分離物であり、ATCC 607スメグマ菌(M.smegmati
s)原培養物から分離した主なコロニーの型である。そ
れは再生培地上でオレンジ色の粗いコロニーを形成す
る。ホプウッド(Hopwood)、D.A.ら、ストレプトミセ
ス属の遺伝子操作−実験室のマニュアル(Genetic Man
ipulation of the Streptomyces−A Laboratory
Manual)、The John Innes Foundation、英国ノーウ
ィッチ(1985)。
菌(M.smegmatis)スフェロプラストのトランスフェク
ション スメグマ菌(M.smegmatis)菌株mc26のスフェロプラ
ストを、次の方法に従い調製した。mc26は単一のコロニ
ーの分離物であり、ATCC 607スメグマ菌(M.smegmati
s)原培養物から分離した主なコロニーの型である。そ
れは再生培地上でオレンジ色の粗いコロニーを形成す
る。ホプウッド(Hopwood)、D.A.ら、ストレプトミセ
ス属の遺伝子操作−実験室のマニュアル(Genetic Man
ipulation of the Streptomyces−A Laboratory
Manual)、The John Innes Foundation、英国ノーウ
ィッチ(1985)。
スメグマ菌(M.smegmatis)のスフェロプラストを、
スメグマ菌(M.smegmatis)についてウドウ(Udou)ら
により記載されたスフェロプラストの調製のための培地
を使用して、ストレプトミセス属(Streptomyces)につ
いて調製した。ウドウ(udou)T.ら、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー(J.Bactriology)、151:1035−103
9(1982)。適度の震盪を有する250mlのバッフル付きフ
ラスコ内で40mlの1%のグルコースおよび0.2%のツイ
ーン80を有するトリプシン大豆ブロスの中で、mc26細胞
を37℃においてA600=0.2に増殖させ、この時20%のグ
リシン溶液を1%の最終濃度に添加した。細胞をさらに
16時間インキュベーションし、次いで室温において5000
×gで10分間遠心することによって収穫した。沈澱を10
mlの10.3%のスクロースで2回洗浄し、次いで2mg/mlの
リゾチーム溶液を含有する原形質体(p)の緩衝液の中
に再懸濁した。37℃において2時間インキュベーション
した後、5mlの緩衝液を添加し、そしてスフェロプラス
トを3000×gにおいて7分間遠心することによって沈澱
させた。沈澱を10mlのp緩衝液の中に再懸濁させ、そし
て3時間以内に使用した。
スメグマ菌(M.smegmatis)についてウドウ(Udou)ら
により記載されたスフェロプラストの調製のための培地
を使用して、ストレプトミセス属(Streptomyces)につ
いて調製した。ウドウ(udou)T.ら、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー(J.Bactriology)、151:1035−103
9(1982)。適度の震盪を有する250mlのバッフル付きフ
ラスコ内で40mlの1%のグルコースおよび0.2%のツイ
ーン80を有するトリプシン大豆ブロスの中で、mc26細胞
を37℃においてA600=0.2に増殖させ、この時20%のグ
リシン溶液を1%の最終濃度に添加した。細胞をさらに
16時間インキュベーションし、次いで室温において5000
×gで10分間遠心することによって収穫した。沈澱を10
mlの10.3%のスクロースで2回洗浄し、次いで2mg/mlの
リゾチーム溶液を含有する原形質体(p)の緩衝液の中
に再懸濁した。37℃において2時間インキュベーション
した後、5mlの緩衝液を添加し、そしてスフェロプラス
トを3000×gにおいて7分間遠心することによって沈澱
させた。沈澱を10mlのp緩衝液の中に再懸濁させ、そし
て3時間以内に使用した。
mc2−11をATCC 607スメグマ菌(M.smegmatis)原培
養物の自発的D29抵抗性分離物として分離し、このとき1
08細胞を3×108プラーク形成単位と混合し、そしてト
リプシン大豆寒天平板上で平板培養した。D29抵抗性コ
ロニーは10-7の頻度で発生した。
養物の自発的D29抵抗性分離物として分離し、このとき1
08細胞を3×108プラーク形成単位と混合し、そしてト
リプシン大豆寒天平板上で平板培養した。D29抵抗性コ
ロニーは10-7の頻度で発生した。
mc26スフェロプラストを1μgのD29 DNAと混合し
た;生ずる混合物の1/10を、0.5モルのスクロースの存
在または不存在下に、トリプシン大豆寒天平板上で平板
培養した。次いで、それらを108mc26細胞を含有する適
当な軟寒天で覆った。DNアーゼi(Sigma)を50μg/ml
の最終濃度でD29 DNAを添加することによって、DNアー
ゼ処理を実施した。
た;生ずる混合物の1/10を、0.5モルのスクロースの存
在または不存在下に、トリプシン大豆寒天平板上で平板
培養した。次いで、それらを108mc26細胞を含有する適
当な軟寒天で覆った。DNアーゼi(Sigma)を50μg/ml
の最終濃度でD29 DNAを添加することによって、DNアー
ゼ処理を実施した。
等しい量のmc211スフェロプラストを同一方法におい
て使用したが、次いでmc26細胞で引き続いて覆って、プ
ラーク形成単位(pfu)をアッセイした。
て使用したが、次いでmc26細胞で引き続いて覆って、プ
ラーク形成単位(pfu)をアッセイした。
ファージの平板のストック:D29の平板リゼイトを2ミ
リモルのCaCl2を含有するトリプシン大豆寒天培地上で
調製した。バッフル付きフラスコ内で37℃においてADC
エンリッチメント(enrichment)を含有するミドルブロ
ック(Middlebrook)7H9ブロス中で対数中期に増殖した
スメグマ菌(M.smegmatis)細胞を、MP緩衝液(10ミリ
モルのトリス−HCl、pH7.6−10ミリモルのMgCl2−100ミ
リモルのNaCl−2ミリモルのCaCl2)中で希釈したファ
ージと混合し、そして37℃において36時間インキュベー
ションして、全面平板培養した。ファージをMP緩衝液で
収穫し、次いで2つのCsCl平衡勾配で精製し、次いでMP
緩衝液に対して広範に透析した。EDTAを50ミリモルの最
終濃度に添加し、100μg/mlのプロイテイナーゼで55℃
において24時間処理し、次いでフェノール−クロロホル
ムで抽出し、そしてTE緩衝液に対して広範に透析するこ
とによって、ファージからDNAを抽出した。
リモルのCaCl2を含有するトリプシン大豆寒天培地上で
調製した。バッフル付きフラスコ内で37℃においてADC
エンリッチメント(enrichment)を含有するミドルブロ
ック(Middlebrook)7H9ブロス中で対数中期に増殖した
スメグマ菌(M.smegmatis)細胞を、MP緩衝液(10ミリ
モルのトリス−HCl、pH7.6−10ミリモルのMgCl2−100ミ
リモルのNaCl−2ミリモルのCaCl2)中で希釈したファ
ージと混合し、そして37℃において36時間インキュベー
ションして、全面平板培養した。ファージをMP緩衝液で
収穫し、次いで2つのCsCl平衡勾配で精製し、次いでMP
緩衝液に対して広範に透析した。EDTAを50ミリモルの最
終濃度に添加し、100μg/mlのプロイテイナーゼで55℃
において24時間処理し、次いでフェノール−クロロホル
ムで抽出し、そしてTE緩衝液に対して広範に透析するこ
とによって、ファージからDNAを抽出した。
トランスフェクション:各トランスフェクションのた
めに、2.5mlのスフェロプラスト懸濁液を15mlのコニカ
ルポリスチレン管内で沈澱させた。上澄み液を注意して
デカンテーションし、そしてスフェロプラストを残る緩
衝液の滴中に再懸濁した。10μlより少ない合計の体積
で1μgのDNAを添加した後、0.5mlのP緩衝液中で調製
した25%のPEG−1000(J.T.Baker Chemical Co.、ペ
ンシルベニア州フィラデルフィア)溶液を添加した。3
分以内に、5mlのP緩衝液を混合物に添加し、そしてス
フェロプラストを上のように沈澱させた。上澄み液を注
意して注ぎ出した後、沈澱を1mlのP緩衝液中に再懸濁
し、そして試料を0.5モルのスクロースのの存在または
不存在下にトリプシン大豆の寒天に移した。次いで、平
板に3.0mlの軟トリプシン大豆寒で覆い、そして37℃に
おいてインキュベーションした。24時間インキュベーシ
ョン後、プラークを計数した。
めに、2.5mlのスフェロプラスト懸濁液を15mlのコニカ
ルポリスチレン管内で沈澱させた。上澄み液を注意して
デカンテーションし、そしてスフェロプラストを残る緩
衝液の滴中に再懸濁した。10μlより少ない合計の体積
で1μgのDNAを添加した後、0.5mlのP緩衝液中で調製
した25%のPEG−1000(J.T.Baker Chemical Co.、ペ
ンシルベニア州フィラデルフィア)溶液を添加した。3
分以内に、5mlのP緩衝液を混合物に添加し、そしてス
フェロプラストを上のように沈澱させた。上澄み液を注
意して注ぎ出した後、沈澱を1mlのP緩衝液中に再懸濁
し、そして試料を0.5モルのスクロースのの存在または
不存在下にトリプシン大豆の寒天に移した。次いで、平
板に3.0mlの軟トリプシン大豆寒で覆い、そして37℃に
おいてインキュベーションした。24時間インキュベーシ
ョン後、プラークを計数した。
実施例2
シャトルプラスミドphAE1の構成
TM4 ファージDNAを250μg/mlの濃度で結合した。系
統的に希釈したSau3Aでアリコートを部分的に消化し
た;長さが平均30〜50kbの断片(アガロースゲルの電気
泳動により分析した)がこの方法で得られた。これらの
断片を1:4のTM4断片対BamH Iで切断したpHC79のモル比
で結合した。この結合のアリコートを生体外パッケージ
ング混合物(Gigapack plus、Stratagene、カリフォル
ニア州サンディエゴ)でパッケージングし、引き続いて
ER1381(hsdR mcrA+ mcrB+、E.Raleigh)の中に形質
導入すると、50μg/mlでアンピシリンを含有するL寒天
上で平板培養するとき、106のアンピシリン/μgのTM4
DNAインサートを生じた。
統的に希釈したSau3Aでアリコートを部分的に消化し
た;長さが平均30〜50kbの断片(アガロースゲルの電気
泳動により分析した)がこの方法で得られた。これらの
断片を1:4のTM4断片対BamH Iで切断したpHC79のモル比
で結合した。この結合のアリコートを生体外パッケージ
ング混合物(Gigapack plus、Stratagene、カリフォル
ニア州サンディエゴ)でパッケージングし、引き続いて
ER1381(hsdR mcrA+ mcrB+、E.Raleigh)の中に形質
導入すると、50μg/mlでアンピシリンを含有するL寒天
上で平板培養するとき、106のアンピシリン/μgのTM4
DNAインサートを生じた。
40,000アンピシリン抵抗性コロニーのプールを、Lブ
ロスをガラススプレダーで均質化することによって調製
した。アルカリSDS抽出、引き続くフェノール−クロロ
ホルム抽出およびエタノールを使用する濃縮により、プ
ラスミドをコロニーのプールから調製した。共有的に閉
じたプラスミドのDNAを、実施例1に記載するようにmc2
6スフェロプラストの中にトランスフェクションした。
ベントン(Benton)およびバイオトランス(Biorans)
ナイロン膜(ICN)のプロトコルを使用して、プラーク
のリフトを実施することによって、プラークをpHC79の
存在についてスクリーニングした。ベントン(Benton)
W.D.およびR.W.デイビス(Davis)、サイエンス(Scien
ce)、196:180−182(1977)。32P−dCTPでニック翻訳
したpHC79と膜をハイブリダイゼーションし、そしてオ
ートラジオグラフィーを実施した。
ロスをガラススプレダーで均質化することによって調製
した。アルカリSDS抽出、引き続くフェノール−クロロ
ホルム抽出およびエタノールを使用する濃縮により、プ
ラスミドをコロニーのプールから調製した。共有的に閉
じたプラスミドのDNAを、実施例1に記載するようにmc2
6スフェロプラストの中にトランスフェクションした。
ベントン(Benton)およびバイオトランス(Biorans)
ナイロン膜(ICN)のプロトコルを使用して、プラーク
のリフトを実施することによって、プラークをpHC79の
存在についてスクリーニングした。ベントン(Benton)
W.D.およびR.W.デイビス(Davis)、サイエンス(Scien
ce)、196:180−182(1977)。32P−dCTPでニック翻訳
したpHC79と膜をハイブリダイゼーションし、そしてオ
ートラジオグラフィーを実施した。
実施例3
シャトルプラスミドphAE1によるBCGおよびスメグマ菌
(M.smegmatis)の感染 BCG−グラクソ(Glaxo)(W.Jones)を、37℃におい
てスタンディング培養物(standing cultures)中のAD
Cエンリッチメント(Difco)および0.5%のツイーン80
(Sigma)を含有するミドルブロック(Middlebrook)7H
9ブロス(Difco)の中で増殖した。108BCG細胞を補充し
た上部の軟寒天と混合し、そしてOADSエンリッチメント
(Difco)を補充したツイーン80(Difco)を含まないデ
ュボス(Dubos)寒天上に注ぐことによって、BCG−グラ
クソ(Glaxo)またはmc26細胞の菌叢を調製した。ジョ
ンズ(Jones)、W.D.Jr.、チュバークル(Tubercle)、
60:55−58(1979)。4つのファージ、DS6A、TM4、phAE
1、および33Dを系統的に希釈し、そして2つの菌叢上に
スポッティングした。平板を14日および2日に、それぞ
れ、BCG−グラクソ(Glaxo)およびスメグマ菌(M.smeg
matis)について読んだ。
(M.smegmatis)の感染 BCG−グラクソ(Glaxo)(W.Jones)を、37℃におい
てスタンディング培養物(standing cultures)中のAD
Cエンリッチメント(Difco)および0.5%のツイーン80
(Sigma)を含有するミドルブロック(Middlebrook)7H
9ブロス(Difco)の中で増殖した。108BCG細胞を補充し
た上部の軟寒天と混合し、そしてOADSエンリッチメント
(Difco)を補充したツイーン80(Difco)を含まないデ
ュボス(Dubos)寒天上に注ぐことによって、BCG−グラ
クソ(Glaxo)またはmc26細胞の菌叢を調製した。ジョ
ンズ(Jones)、W.D.Jr.、チュバークル(Tubercle)、
60:55−58(1979)。4つのファージ、DS6A、TM4、phAE
1、および33Dを系統的に希釈し、そして2つの菌叢上に
スポッティングした。平板を14日および2日に、それぞ
れ、BCG−グラクソ(Glaxo)およびスメグマ菌(M.smeg
matis)について読んだ。
実施例4
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子のph
AE1中のクローニング Tn903からのアミノグリコシドホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子(aph)をエンコードする1.6kbのEcoR I断片
を、コスミドクローニング方法を利用してphAE1の中に
クローニングした。プラスミドphAE1のDNAをE.coliから
分離し、EcoR Iで切断し、そして1.6kbの断片をこれら
の大きいDNA分子に結合した。結合産生物をファージラ
ムダの中に生体外でパッケージングし、粒子を産生し、
これらはカナマイシン抵抗性およびアンピシリン抵抗性
をE.coli細胞に形質導入した。プラスミドDNAをE.coli
細胞から分離し、そしてスメグマ菌(M.smegmatis)mc2
6原形質体の中にトランスフェクションするとき、高い
頻度のプラーク形成単位を生じた。これは、少なくとも
1.6kbの追加のDNAをphAE1の独特EcoR I部位の中にクロ
ーニングできることを実証する。同様な結果がシャトル
プラスミドphAE2を使用して得られ、phAE2はphAE1の特
性に類似する特性を有するが、phAE1より2kbだけ小さ
く、少なくとも3.6kbの追加のDNAのクローニングを可能
とするであろうシャトルベクターである。両者の場合に
おいて、aph遺伝子の導入は新しいNru I部位を導入し、
追加のDNA断片をクローニングし、そしてシャトルプラ
スミドの中に安定に維持することができるという証拠を
提供する。こうして、それ以上の修飾をもたないこれら
のベクターは追加の遺伝子をマイコバクテリアの中にク
ローニングするために有用であることがある。
AE1中のクローニング Tn903からのアミノグリコシドホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子(aph)をエンコードする1.6kbのEcoR I断片
を、コスミドクローニング方法を利用してphAE1の中に
クローニングした。プラスミドphAE1のDNAをE.coliから
分離し、EcoR Iで切断し、そして1.6kbの断片をこれら
の大きいDNA分子に結合した。結合産生物をファージラ
ムダの中に生体外でパッケージングし、粒子を産生し、
これらはカナマイシン抵抗性およびアンピシリン抵抗性
をE.coli細胞に形質導入した。プラスミドDNAをE.coli
細胞から分離し、そしてスメグマ菌(M.smegmatis)mc2
6原形質体の中にトランスフェクションするとき、高い
頻度のプラーク形成単位を生じた。これは、少なくとも
1.6kbの追加のDNAをphAE1の独特EcoR I部位の中にクロ
ーニングできることを実証する。同様な結果がシャトル
プラスミドphAE2を使用して得られ、phAE2はphAE1の特
性に類似する特性を有するが、phAE1より2kbだけ小さ
く、少なくとも3.6kbの追加のDNAのクローニングを可能
とするであろうシャトルベクターである。両者の場合に
おいて、aph遺伝子の導入は新しいNru I部位を導入し、
追加のDNA断片をクローニングし、そしてシャトルプラ
スミドの中に安定に維持することができるという証拠を
提供する。こうして、それ以上の修飾をもたないこれら
のベクターは追加の遺伝子をマイコバクテリアの中にク
ローニングするために有用であることがある。
実施例5
シャトルプラスミドを使用するマイコバクテリア中の選
択可能なマーカーの安定な発現 TM4ファージについて構成したものに類似する方法
で、シャトルプラスミドをファージL1(ATCC#27199)
から構成した。ドウク(Doke)、S.クマモト・メディカ
ル・ジャーナル(kumamoto Medical Journal)、34:1
360−1373(1960)。L1−シャトルプラスミドのすべて
はスメグマ菌(M.smegmatis)を溶原化する能力を有す
る。L1はスメグマ菌(M.smegmatis)の染色体の物質の
中に組み込み、そして安定な溶原体を形成することが示
された。他のファージ、例えば、L3(ATCC#27200)、
プラスミドとして残る(染色体外)ファージおよびL5
(ATCC#27201)を、また、シャトルプラスミドの構成
において使用することができる。結果は、これらのシャ
トルプラスミドがスメグマ菌(M.smegmatis)を溶原化
し、こうして問題のDNAをマイコバクテリアの中に最初
に安定に組み込むすることができることを示した。aph
遺伝子を、E.coli中のTM4−シャトルプラスミドについ
て前述したように、phAE15と表示するL1−シャトルプラ
スミドの独特EcoR I部位の中にクローニングした。スメ
グマ菌(M.smegmatis)細胞(mc26)を、カナマイシン
を含有するデュボス(Dubos)寒天平板上の寒天の上部
にオーバーレイした。シャトルプラスミドphAE15および
phAE19(クローンaph遺伝子をもつphAE15)の希釈物を
寒天の菌叢上にスポッティングした。平板を37℃におい
て5日間インキュベーションした。増殖したコロニーの
すべては、aph遺伝子がクローニングされたL1−シャト
ルプラスミドで溶原化された。生ずるシャトルプラスミ
ドphAE19は、スメグマ菌(M.smegmatis)細胞を溶原化
することができた。生ずる溶原体は、カナマイシン抵抗
性であるので、クローニングしたaphを発現した。さら
に、これらの溶原体はマイコバクテリオファージの粒子
を生じ、これらの粒子は、また、引き続いてカナマイシ
ン感受性スメグマ菌(M.smegmatis)細胞を転移および
溶原化すると、カナマイシン抵抗性の表現型を発現し
た。これらのファージの転移は、溶原性状態(すなわ
ち、重感染に対する免疫性)およびカナマイシン抵抗性
の同時形質導入を生じた。スメグマ菌(M.smegmatis)
の溶原化に使用したL1ファージはBCG上でプラーク形成
しない。しかしながら、BCG上でプラークを形成するL1
およびシャトルプラスミドphAE19の両者が分離された。
これらを、テンペレートシャトルプラスミドにより、BC
Gおよびヒト結核菌(M.tuberculosis)の中に問題の遺
伝子を導入しそして安定に発現する、それらの能力につ
いて試験した。こうして、これらのファージはスメグマ
菌(M.smegmatis)の中に問題のDNAを安定に導入する能
力を有する。さらに、BCGを感染しそして溶原化する宿
主の範囲の変異型(例えば、phAE19)を分離した。これ
により、問題のDNAを含有する組み換えマイコバクテリ
ウムを産生することができる。このような組み換えマイ
コバクテリアはワクチンとして使用することができる。
択可能なマーカーの安定な発現 TM4ファージについて構成したものに類似する方法
で、シャトルプラスミドをファージL1(ATCC#27199)
から構成した。ドウク(Doke)、S.クマモト・メディカ
ル・ジャーナル(kumamoto Medical Journal)、34:1
360−1373(1960)。L1−シャトルプラスミドのすべて
はスメグマ菌(M.smegmatis)を溶原化する能力を有す
る。L1はスメグマ菌(M.smegmatis)の染色体の物質の
中に組み込み、そして安定な溶原体を形成することが示
された。他のファージ、例えば、L3(ATCC#27200)、
プラスミドとして残る(染色体外)ファージおよびL5
(ATCC#27201)を、また、シャトルプラスミドの構成
において使用することができる。結果は、これらのシャ
トルプラスミドがスメグマ菌(M.smegmatis)を溶原化
し、こうして問題のDNAをマイコバクテリアの中に最初
に安定に組み込むすることができることを示した。aph
遺伝子を、E.coli中のTM4−シャトルプラスミドについ
て前述したように、phAE15と表示するL1−シャトルプラ
スミドの独特EcoR I部位の中にクローニングした。スメ
グマ菌(M.smegmatis)細胞(mc26)を、カナマイシン
を含有するデュボス(Dubos)寒天平板上の寒天の上部
にオーバーレイした。シャトルプラスミドphAE15および
phAE19(クローンaph遺伝子をもつphAE15)の希釈物を
寒天の菌叢上にスポッティングした。平板を37℃におい
て5日間インキュベーションした。増殖したコロニーの
すべては、aph遺伝子がクローニングされたL1−シャト
ルプラスミドで溶原化された。生ずるシャトルプラスミ
ドphAE19は、スメグマ菌(M.smegmatis)細胞を溶原化
することができた。生ずる溶原体は、カナマイシン抵抗
性であるので、クローニングしたaphを発現した。さら
に、これらの溶原体はマイコバクテリオファージの粒子
を生じ、これらの粒子は、また、引き続いてカナマイシ
ン感受性スメグマ菌(M.smegmatis)細胞を転移および
溶原化すると、カナマイシン抵抗性の表現型を発現し
た。これらのファージの転移は、溶原性状態(すなわ
ち、重感染に対する免疫性)およびカナマイシン抵抗性
の同時形質導入を生じた。スメグマ菌(M.smegmatis)
の溶原化に使用したL1ファージはBCG上でプラーク形成
しない。しかしながら、BCG上でプラークを形成するL1
およびシャトルプラスミドphAE19の両者が分離された。
これらを、テンペレートシャトルプラスミドにより、BC
Gおよびヒト結核菌(M.tuberculosis)の中に問題の遺
伝子を導入しそして安定に発現する、それらの能力につ
いて試験した。こうして、これらのファージはスメグマ
菌(M.smegmatis)の中に問題のDNAを安定に導入する能
力を有する。さらに、BCGを感染しそして溶原化する宿
主の範囲の変異型(例えば、phAE19)を分離した。これ
により、問題のDNAを含有する組み換えマイコバクテリ
ウムを産生することができる。このような組み換えマイ
コバクテリアはワクチンとして使用することができる。
実施例6
スメグマ菌(M.smegmatis)染色体の中へのマイコバク
テリオファージL1およびL1−シャトルプラスミドDNAの
組み込み 0.05%のツイーン80を含有するトリプシン大豆ブロス
中で増殖した、特定しないマイコバクテリウム、ATCC27
199、からの培養上澄み液を、クローニングしたスメグ
マ菌(M.smegmatis)菌株、mc26、上で平板培養するこ
とによって、ファージL1を得た。ジャコブス(Jacob
s)、W.R.Jr.、ツクマン(Tucman)、M.およびブルーム
(Bloom)、B.R.ネイチャー(Nature)、327:532−535
(1987)。ファージをプラーク精製し、そして高い力価
の平板リゼイトを、2ミリモルのCaCl2を含有するデュ
ボス寒天培地(ツイーンを含まない)上で37℃において
増殖したmc26から得た。ファージ粒子をCsCl平衡密度の
遠心により精製し、そしてファージDNAを前述したよう
に分離した。ジャコブス(Jacobs)、W.R.Jr.、ツクマ
ン(Tucman)、M.およびブルーム(Bloom)、B.R.ネイ
チャー(Nature)、327:532−535(1987)。前述のプロ
トコルに従い、コスミドとしてpHC79およびTM4 DNAの
代わりにL1 DNAを使用して、L1−シャトルプラスミド
を構成した。ジャコブス(Jacobs)、W.R.Jr.、ツクマ
ン(Tucman)、M.およびブルーム(Bloom)、B.R.ネイ
チャー(Nature)、327:532−535(1987)。独特EcoR I
部位で切断したphAE15、DNAをTn903 EcoR I aphカセ
ット(Pharmacia)に結合することによって、903からの
aph遺伝子を1つのL1−シャトルプラスミド、phAE154、
の中に導入した。生ずる結合体をラムダ−ファージのヘ
ッドの中に生体外パッケージングし、次いでE.coli菌株
2338の中に形質導入し、アンピシリン抵抗性およびカナ
マイシン抵抗性の両者について選択した。ジャコブス
(Jacobs)、W.R.ら、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.
Acad.Sci.)USA、83:1926−1930(1986)。プラスミドD
NAをE.coliから分離し、mc26原形質体の中にトランスフ
ェクションし、そして生ずるマイコバクテリオファージ
をphAE19と表示した。mc26細胞を含有する寒天上でプラ
スミドをスポッティングした後、溶原体を濁ったプラー
クから精製した。推定上の溶原体をファージの解放およ
びL1による重感染に対する抵抗性について試験した。染
色体のDNAをブラウン(Braun)ホモジナイザーで分離
し、次いでフェノール−クロロホルム抽出した。バイオ
トランス(ICN)ナイロン膜を使用して製造業者の推奨
に従い実施した。L1 DNAをニック翻訳キット(BRL)お
よび[χ−32P]−dCTP(Amersham)を使用して放射線
標識した。
テリオファージL1およびL1−シャトルプラスミドDNAの
組み込み 0.05%のツイーン80を含有するトリプシン大豆ブロス
中で増殖した、特定しないマイコバクテリウム、ATCC27
199、からの培養上澄み液を、クローニングしたスメグ
マ菌(M.smegmatis)菌株、mc26、上で平板培養するこ
とによって、ファージL1を得た。ジャコブス(Jacob
s)、W.R.Jr.、ツクマン(Tucman)、M.およびブルーム
(Bloom)、B.R.ネイチャー(Nature)、327:532−535
(1987)。ファージをプラーク精製し、そして高い力価
の平板リゼイトを、2ミリモルのCaCl2を含有するデュ
ボス寒天培地(ツイーンを含まない)上で37℃において
増殖したmc26から得た。ファージ粒子をCsCl平衡密度の
遠心により精製し、そしてファージDNAを前述したよう
に分離した。ジャコブス(Jacobs)、W.R.Jr.、ツクマ
ン(Tucman)、M.およびブルーム(Bloom)、B.R.ネイ
チャー(Nature)、327:532−535(1987)。前述のプロ
トコルに従い、コスミドとしてpHC79およびTM4 DNAの
代わりにL1 DNAを使用して、L1−シャトルプラスミド
を構成した。ジャコブス(Jacobs)、W.R.Jr.、ツクマ
ン(Tucman)、M.およびブルーム(Bloom)、B.R.ネイ
チャー(Nature)、327:532−535(1987)。独特EcoR I
部位で切断したphAE15、DNAをTn903 EcoR I aphカセ
ット(Pharmacia)に結合することによって、903からの
aph遺伝子を1つのL1−シャトルプラスミド、phAE154、
の中に導入した。生ずる結合体をラムダ−ファージのヘ
ッドの中に生体外パッケージングし、次いでE.coli菌株
2338の中に形質導入し、アンピシリン抵抗性およびカナ
マイシン抵抗性の両者について選択した。ジャコブス
(Jacobs)、W.R.ら、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.
Acad.Sci.)USA、83:1926−1930(1986)。プラスミドD
NAをE.coliから分離し、mc26原形質体の中にトランスフ
ェクションし、そして生ずるマイコバクテリオファージ
をphAE19と表示した。mc26細胞を含有する寒天上でプラ
スミドをスポッティングした後、溶原体を濁ったプラー
クから精製した。推定上の溶原体をファージの解放およ
びL1による重感染に対する抵抗性について試験した。染
色体のDNAをブラウン(Braun)ホモジナイザーで分離
し、次いでフェノール−クロロホルム抽出した。バイオ
トランス(ICN)ナイロン膜を使用して製造業者の推奨
に従い実施した。L1 DNAをニック翻訳キット(BRL)お
よび[χ−32P]−dCTP(Amersham)を使用して放射線
標識した。
実施例7
テンペレートシャトルプラスミドphAE19を使用する溶原
性によるカナマイシン抵抗性の発現 ADCエンリッチメントおよび0.05%のツイーン80を補
充したミドルブロック(Middlebrook)7H9ブロス(M−
ADC−TWブロス)の中で37℃において培養物を震盪する
ことによって増殖した、スメグマ菌(M.smegmatis)、m
c26、[2×107]細胞を、15μg/mlのカナマイシンを含
有するデュボス(Dubos)寒天平板上にオーバーレイし
た。L1−シャトルプラスミド、phAE15およびphAE19(=
phAE15::aph)のリゼイトを、0.45μmのフィルターを
通して濾過し、そしてMP緩衝液を使用してほぼ5×106p
fu/mlに希釈した。シャコブス(Jacobs)、W.R.Jr.、ツ
クマン(Tucman)、M.およびブルーム(Bloom)、B.R.
ネイチャー(Nature)、327:532−535(1987)。系統的
10倍の希釈物(10μl)を表示した区域においてスポッ
ティングし、そして平板を37℃において5日間インキュ
ベーションした。第7図に示すように、phAE19がmc26を
溶原化するコロニーが現れ、こうしてカナマイシン抵抗
性の発現を実証する。多数の実験において、カナマイシ
ン抵抗性のコロニーがmc26の自発的突然変異体またはph
AE15で溶原化したmc26細胞から観測されなかった。phAE
19で溶原化したmc26であるスメグマ菌(M.smegmatis)
菌株、mc269と表示する、は、1988年7月22日に、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the Ame
rican Type Culture Collection)(マリイランド州
ロックビレ)に受託No.67746で受託された。受託物への
公衆のアクセスについてのすべての制限は、この出願に
基づく米国特許が登録されたとき最終的に除去されるで
あろう。
性によるカナマイシン抵抗性の発現 ADCエンリッチメントおよび0.05%のツイーン80を補
充したミドルブロック(Middlebrook)7H9ブロス(M−
ADC−TWブロス)の中で37℃において培養物を震盪する
ことによって増殖した、スメグマ菌(M.smegmatis)、m
c26、[2×107]細胞を、15μg/mlのカナマイシンを含
有するデュボス(Dubos)寒天平板上にオーバーレイし
た。L1−シャトルプラスミド、phAE15およびphAE19(=
phAE15::aph)のリゼイトを、0.45μmのフィルターを
通して濾過し、そしてMP緩衝液を使用してほぼ5×106p
fu/mlに希釈した。シャコブス(Jacobs)、W.R.Jr.、ツ
クマン(Tucman)、M.およびブルーム(Bloom)、B.R.
ネイチャー(Nature)、327:532−535(1987)。系統的
10倍の希釈物(10μl)を表示した区域においてスポッ
ティングし、そして平板を37℃において5日間インキュ
ベーションした。第7図に示すように、phAE19がmc26を
溶原化するコロニーが現れ、こうしてカナマイシン抵抗
性の発現を実証する。多数の実験において、カナマイシ
ン抵抗性のコロニーがmc26の自発的突然変異体またはph
AE15で溶原化したmc26細胞から観測されなかった。phAE
19で溶原化したmc26であるスメグマ菌(M.smegmatis)
菌株、mc269と表示する、は、1988年7月22日に、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the Ame
rican Type Culture Collection)(マリイランド州
ロックビレ)に受託No.67746で受託された。受託物への
公衆のアクセスについてのすべての制限は、この出願に
基づく米国特許が登録されたとき最終的に除去されるで
あろう。
実施例8
E.coli−マイコバクテリアのシャトルプラスミドの構成
および分析 前述したように分離したプラスミドpAL5000DNAをMbo
Iで部分的に消化し、5kbの線状断片を電気泳動後にアガ
ロースゲルから分離した。バーンボイム(Birnboim)、
H.およびドリイ(Doly)、核酸の研究(Nucleic Acids
Research)、7:1513−1525(1979)。これらの断片
をポジティブ(positive)選択のベクターpIJ666に結合
し、このpIJ666はTn5から由来するneo遺伝子、およびBa
mH IおよびEcoR Vで切断しそしてE.coliの中に形質転換
した、pACYC184からの複製のP15A由来およびcat遺伝子
を含有した。キーゼル(Kieser)、T.およびR.E.メルト
ン(Melton)、遺伝子(Gene)、65:83−91(1988);
ベルグ(Berg)、D.E.ら、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.N
atl.Acad.Sci.)USA、72:3628−3632(1975);チャン
グ(Chang)、A.C.Y.およびS.N.コウヘン(Cohen)、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bactriolog
y)、134:816−821(1978)。クロランフェニコール抵
抗性の形質転換体(200コロニー、25g/mlに対して抵抗
性)をプールし、そして混合培養において増殖させ、こ
れからプラスミドを分離した。バーンボイム(Birnboi
m)、H.およびドリイ(Doly)、核酸の研究(Nucleic
Acids Research)、7:1513−1525(1979)。pIJ666::
pAL5000のこのライブラリーを、ジーン・パルサー(Gen
e Pulser)(Biorad)エレクトロポレイターにより、
スメグマ菌(M.smegmatis)の中に形質転換した。チャ
シー(Chassy)、B.M.およびJ.L.フリッキンガー(Flic
kinger)、FEMSマイクロバイオロジー・レターズ(Micr
obiology letters)、44:173−177(1987)。mc26細胞
の新鮮な培養物をM−ADC−TWブロスの中で震盪しなが
らA600=1.7に増殖させた。細胞を遠心により収穫し、
エレクトロポレイション緩衝液(7ミリモルのホスファ
ージ、pH7.2−272ミリモルのスクロース)中で洗浄し、
そしてもとの体積の1/10に再懸濁した。プラスミドDNA
(1μg)を0.8mlのスメグマ菌(M.smegmatis)細胞を
有するエレクトロポレイションのクベットに添加した。
氷上で10分間インキュベーションした後、細胞を単一の
パルスのエレクトロポレイション(6250V/cmで25μF)
に暴露し、次いで等しい体積のM−ADC−TWブロスと混
合し、そして37℃において2時間インキュベーションし
た。次いで、細胞を10μg/mlのカナマイシンを含有する
7H10寒天平板上で平板培養し、そして37℃において7日
間インキュベーションした。カナマイシン抵抗性の形質
転換体を10μg/mlのカナマイシンを含有する7H9−ADC−
TWブロス中で継代培養し、そしてファージD29をプラー
ク形成するそれらの能力を保持し、それらがスメグマ菌
(M.smegmatis)であることを確証した。フロマン(Fro
man)、S.ら、Am.J.Public Health、44:1326−1334(1
954)。これらの形質転換体は、また、100μg/mlのクロ
ランフェニコールに対して抵抗性であった。プラスミド
DNAを細胞の1mlの試料からバーンボイムの手順の修正に
より分離し、順次にリゾチーム、アルカリ性−SDSおよ
び最終高い塩の中で一夜インキュベーションした。スメ
グマ菌(M.smegmatis)から分離したDNAを2338の中に形
質転換し、そしてDNAの1μg当たり104のカナマイシン
抵抗性E.coli形質転換体を得た。バーンボイム(Birnbo
im)、H.およびドリイ(Doly)、核酸の研究(Nucleic
Acids Research)、7:1513−1525(1979)。個々の
E.coli形質転換体から分離したすべての独特のプラスミ
ドは、形質転換し、そしてカナマイシン抵抗性およびク
ロランフェニコール抵抗性をスメグマ菌(M.smegmati
s)にを与えることができた。
および分析 前述したように分離したプラスミドpAL5000DNAをMbo
Iで部分的に消化し、5kbの線状断片を電気泳動後にアガ
ロースゲルから分離した。バーンボイム(Birnboim)、
H.およびドリイ(Doly)、核酸の研究(Nucleic Acids
Research)、7:1513−1525(1979)。これらの断片
をポジティブ(positive)選択のベクターpIJ666に結合
し、このpIJ666はTn5から由来するneo遺伝子、およびBa
mH IおよびEcoR Vで切断しそしてE.coliの中に形質転換
した、pACYC184からの複製のP15A由来およびcat遺伝子
を含有した。キーゼル(Kieser)、T.およびR.E.メルト
ン(Melton)、遺伝子(Gene)、65:83−91(1988);
ベルグ(Berg)、D.E.ら、プロシーディングス・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.N
atl.Acad.Sci.)USA、72:3628−3632(1975);チャン
グ(Chang)、A.C.Y.およびS.N.コウヘン(Cohen)、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bactriolog
y)、134:816−821(1978)。クロランフェニコール抵
抗性の形質転換体(200コロニー、25g/mlに対して抵抗
性)をプールし、そして混合培養において増殖させ、こ
れからプラスミドを分離した。バーンボイム(Birnboi
m)、H.およびドリイ(Doly)、核酸の研究(Nucleic
Acids Research)、7:1513−1525(1979)。pIJ666::
pAL5000のこのライブラリーを、ジーン・パルサー(Gen
e Pulser)(Biorad)エレクトロポレイターにより、
スメグマ菌(M.smegmatis)の中に形質転換した。チャ
シー(Chassy)、B.M.およびJ.L.フリッキンガー(Flic
kinger)、FEMSマイクロバイオロジー・レターズ(Micr
obiology letters)、44:173−177(1987)。mc26細胞
の新鮮な培養物をM−ADC−TWブロスの中で震盪しなが
らA600=1.7に増殖させた。細胞を遠心により収穫し、
エレクトロポレイション緩衝液(7ミリモルのホスファ
ージ、pH7.2−272ミリモルのスクロース)中で洗浄し、
そしてもとの体積の1/10に再懸濁した。プラスミドDNA
(1μg)を0.8mlのスメグマ菌(M.smegmatis)細胞を
有するエレクトロポレイションのクベットに添加した。
氷上で10分間インキュベーションした後、細胞を単一の
パルスのエレクトロポレイション(6250V/cmで25μF)
に暴露し、次いで等しい体積のM−ADC−TWブロスと混
合し、そして37℃において2時間インキュベーションし
た。次いで、細胞を10μg/mlのカナマイシンを含有する
7H10寒天平板上で平板培養し、そして37℃において7日
間インキュベーションした。カナマイシン抵抗性の形質
転換体を10μg/mlのカナマイシンを含有する7H9−ADC−
TWブロス中で継代培養し、そしてファージD29をプラー
ク形成するそれらの能力を保持し、それらがスメグマ菌
(M.smegmatis)であることを確証した。フロマン(Fro
man)、S.ら、Am.J.Public Health、44:1326−1334(1
954)。これらの形質転換体は、また、100μg/mlのクロ
ランフェニコールに対して抵抗性であった。プラスミド
DNAを細胞の1mlの試料からバーンボイムの手順の修正に
より分離し、順次にリゾチーム、アルカリ性−SDSおよ
び最終高い塩の中で一夜インキュベーションした。スメ
グマ菌(M.smegmatis)から分離したDNAを2338の中に形
質転換し、そしてDNAの1μg当たり104のカナマイシン
抵抗性E.coli形質転換体を得た。バーンボイム(Birnbo
im)、H.およびドリイ(Doly)、核酸の研究(Nucleic
Acids Research)、7:1513−1525(1979)。個々の
E.coli形質転換体から分離したすべての独特のプラスミ
ドは、形質転換し、そしてカナマイシン抵抗性およびク
ロランフェニコール抵抗性をスメグマ菌(M.smegmati
s)にを与えることができた。
実施例9
シャトルプラスミドDNAを使用するスメグマ菌(M.smegm
atis)およびBCGの形質転換 BCG−パスツール(Pasteur)菌株P1173P2を、M−ADC
−TWブロス中で震盪しながら37℃において5日間増殖し
た(推定した生存能力4.5×107cfu/ml)。これらの細胞
を、前述と同一の手順に従い、pIJ666::pAL5000組み換
えライブラリーでエレクトロポレイションすることによ
って形質転換し、そしてADCエンリッチメントおよび20
μg/mlのカナマイシンを含有する7H10寒天上で平板培養
した。45のカナマイシン抵抗性BCG細胞のプールを、20
μg/mlのカナマイシンを含有する液体培地の中で37℃に
おいて3週間培養した。この培養から、プラスミドを実
施例8に記載するように分離した。それらはすべて11.2
kbの大きさであり、そして形質転換したとき、E.coli細
胞にカナマイシン抵抗性を与えた。このプラスミドDNA
を再び使用してBCG細胞を形質転換した。上に示した平
板を37℃において18日間インキュベーションし、次いで
写真撮影した。シャトルプラスミドで形質転換したBCG
−パスツール(Pasteur)下位菌株、pYUP1100と表示す
る(また、pYUB13と呼ぶか、あるいは表示する)は、カ
ナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子およびクロラ
ンフェニコール抵抗性をエンコードする遺伝子を包含
し、1988年7月22日にアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(the American Type Culture Coll
ection)(マリイランド州ロックビレ)に受託No.67745
で受託された。受託物への公衆のアクセスについてのす
べての制限は、この出願に基づく米国特許が登録された
とき最終的に除去されるであろう。
atis)およびBCGの形質転換 BCG−パスツール(Pasteur)菌株P1173P2を、M−ADC
−TWブロス中で震盪しながら37℃において5日間増殖し
た(推定した生存能力4.5×107cfu/ml)。これらの細胞
を、前述と同一の手順に従い、pIJ666::pAL5000組み換
えライブラリーでエレクトロポレイションすることによ
って形質転換し、そしてADCエンリッチメントおよび20
μg/mlのカナマイシンを含有する7H10寒天上で平板培養
した。45のカナマイシン抵抗性BCG細胞のプールを、20
μg/mlのカナマイシンを含有する液体培地の中で37℃に
おいて3週間培養した。この培養から、プラスミドを実
施例8に記載するように分離した。それらはすべて11.2
kbの大きさであり、そして形質転換したとき、E.coli細
胞にカナマイシン抵抗性を与えた。このプラスミドDNA
を再び使用してBCG細胞を形質転換した。上に示した平
板を37℃において18日間インキュベーションし、次いで
写真撮影した。シャトルプラスミドで形質転換したBCG
−パスツール(Pasteur)下位菌株、pYUP1100と表示す
る(また、pYUB13と呼ぶか、あるいは表示する)は、カ
ナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子およびクロラ
ンフェニコール抵抗性をエンコードする遺伝子を包含
し、1988年7月22日にアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(the American Type Culture Coll
ection)(マリイランド州ロックビレ)に受託No.67745
で受託された。受託物への公衆のアクセスについてのす
べての制限は、この出願に基づく米国特許が登録された
とき最終的に除去されるであろう。
ストレス誘発した65kD抗原をエンコードするらい菌
(M.leprae)遺伝子を、また、導入しそしてスメグマ菌
(M.smegmatis)およびBCGの中で発現した。らい菌(M.
leprae)遺伝子をE.coli−マイコバクテリアのシャトル
プラスミド、pYUB12と表示する、の中にクローニング
し、このプラスミドは、pRH1100を含む、前にpYUPと表
示したシャトルプラスミドの群の1員である。生ずる構
成体、pYUB39、をスメグマ菌(M.smegmatis)およびBCG
−パスツール(Pasteur)の両者の中に形質転換し、そ
して形質転換体からの細胞リゼイトをSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動させた。生ずるgmをナイロン
膜上にブロッティングし、次いでこれをらい菌(M.lepr
ae)特異的エピトープIIE9を認識するマウスモノクロー
ナル抗体でプロービングした。次いで、ブロットをアル
カリ性ホスファターゼに結合したマウス特異的ウサギ抗
体でプロービングし、ホスファターゼ活性について展開
し、そして写真撮影した。生ずるゲルは、外来らい菌
(M.leprae)の65kDの抗原をエンコードするクローニン
グした遺伝子が、第17図に表すように、スメグマ菌(M.
smegmatis)およびBCGの両者において発現され、ここで
第17図は組み換えプラスミドpYUB12またはpYUB39を含有
する細胞リゼイトのSDSポリアクリルアミドゲルの電気
泳動のウェスタン・ブロット分析の写真である。
(M.leprae)遺伝子を、また、導入しそしてスメグマ菌
(M.smegmatis)およびBCGの中で発現した。らい菌(M.
leprae)遺伝子をE.coli−マイコバクテリアのシャトル
プラスミド、pYUB12と表示する、の中にクローニング
し、このプラスミドは、pRH1100を含む、前にpYUPと表
示したシャトルプラスミドの群の1員である。生ずる構
成体、pYUB39、をスメグマ菌(M.smegmatis)およびBCG
−パスツール(Pasteur)の両者の中に形質転換し、そ
して形質転換体からの細胞リゼイトをSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動させた。生ずるgmをナイロン
膜上にブロッティングし、次いでこれをらい菌(M.lepr
ae)特異的エピトープIIE9を認識するマウスモノクロー
ナル抗体でプロービングした。次いで、ブロットをアル
カリ性ホスファターゼに結合したマウス特異的ウサギ抗
体でプロービングし、ホスファターゼ活性について展開
し、そして写真撮影した。生ずるゲルは、外来らい菌
(M.leprae)の65kDの抗原をエンコードするクローニン
グした遺伝子が、第17図に表すように、スメグマ菌(M.
smegmatis)およびBCGの両者において発現され、ここで
第17図は組み換えプラスミドpYUB12またはpYUB39を含有
する細胞リゼイトのSDSポリアクリルアミドゲルの電気
泳動のウェスタン・ブロット分析の写真である。
実施例10
Kan遺伝子のスメグマ菌(M.smegmatis)中の導入および
Kanのスメグマ菌(M.smegmatis)ゲノム中の組み込みの
ための組み換えプラスミドの構成 次のバクテリア菌株を使用した:RY1103(DB6507、バ
ッチ(Bach)、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.S
ci.)USA、76:386−390(1979))HB101、PyrF::Tn5、t
hr−、leu−、pro−、B1−、r−、m−、su IIおよびR
Y1107(DB6566、ロウズ(Rose)、M.ら、遺伝子(Gen
e)、29:113−124(1984))B15,PyrF::Mu、trpam、lac
Zam、hsdR-、m+、Su-。両者はデイビッド・ボトステイ
ン(David boststein)博士(マサチュセッツ工業大
学)から入手した。Y1109(DH5alpha)F-、endA1、hsdR
17(rK、mK+)、supE44、thi1、recA1、gyrA96、rela、
del(argF−lacZYA)(U169、lamda-、phi80dlacZde1M1
5、これらはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bet
hesda Research Laboratories)から入手した。MC2−
6、単一のコロニーの分離物スメグマ菌(M.smegmati
s)プロトトローフ、これはウィリアム・ジャコブス(W
illiam Jacobs)博士(アルバート・アインシュタイ薬
科大学)から入手した。FOAr−3はウラシル栄養要求変
異種へのMC2−6の自発的突然変異体であり、そして5
−フルオロ−オロチン酸に対して抵抗性である。ウシ結
核菌(M.bovis)−BCG(Moreau)はATCC 35736であ
る。ウシ結核菌(M.bovis)−BCG(Montreal)はATCC
35735。
Kanのスメグマ菌(M.smegmatis)ゲノム中の組み込みの
ための組み換えプラスミドの構成 次のバクテリア菌株を使用した:RY1103(DB6507、バ
ッチ(Bach)、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.S
ci.)USA、76:386−390(1979))HB101、PyrF::Tn5、t
hr−、leu−、pro−、B1−、r−、m−、su IIおよびR
Y1107(DB6566、ロウズ(Rose)、M.ら、遺伝子(Gen
e)、29:113−124(1984))B15,PyrF::Mu、trpam、lac
Zam、hsdR-、m+、Su-。両者はデイビッド・ボトステイ
ン(David boststein)博士(マサチュセッツ工業大
学)から入手した。Y1109(DH5alpha)F-、endA1、hsdR
17(rK、mK+)、supE44、thi1、recA1、gyrA96、rela、
del(argF−lacZYA)(U169、lamda-、phi80dlacZde1M1
5、これらはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Bet
hesda Research Laboratories)から入手した。MC2−
6、単一のコロニーの分離物スメグマ菌(M.smegmati
s)プロトトローフ、これはウィリアム・ジャコブス(W
illiam Jacobs)博士(アルバート・アインシュタイ薬
科大学)から入手した。FOAr−3はウラシル栄養要求変
異種へのMC2−6の自発的突然変異体であり、そして5
−フルオロ−オロチン酸に対して抵抗性である。ウシ結
核菌(M.bovis)−BCG(Moreau)はATCC 35736であ
る。ウシ結核菌(M.bovis)−BCG(Montreal)はATCC
35735。
マイコバクテリアのゲノムのDNAのライブラリー
スメグマ菌(M.smegmatis)のゲノムのDNAはグルコー
スおよび80を補充したトリプシン大豆ブロス中で増殖
後、MC2−6から得た。培養物はグリシンを0.5%に最後
の数時間の間添加して飽和に増殖した。細胞を遠心によ
り収穫し、洗浄し、そして50ミリモルのトリスpH8.0、
0、10ミリモルのEDTA、10%のスクロースの中に再懸濁
し、次いで0.2μg/mlのリゾチームで1時間処理し、次
いで50ミリモルのEDTAおよび1%のSDSで15分間処理し
た。多数回のフェノール:クロロホルム抽出を実施し、
次いでイソプロパノール沈澱し、RNアーゼ処理し、フェ
ノール:クロロホルム抽出、クロロホルム抽出およびエ
タノール沈澱した。沈澱を70%のエタノールで洗浄し、
そしてTE pH7.5の中に再懸濁した。ウシ結核菌(M.bov
is)−BCG(Moreau)ゲノムのDNAをグアスキンスキー
(Graskinsky)博士の寛大な贈り物であった。
スおよび80を補充したトリプシン大豆ブロス中で増殖
後、MC2−6から得た。培養物はグリシンを0.5%に最後
の数時間の間添加して飽和に増殖した。細胞を遠心によ
り収穫し、洗浄し、そして50ミリモルのトリスpH8.0、
0、10ミリモルのEDTA、10%のスクロースの中に再懸濁
し、次いで0.2μg/mlのリゾチームで1時間処理し、次
いで50ミリモルのEDTAおよび1%のSDSで15分間処理し
た。多数回のフェノール:クロロホルム抽出を実施し、
次いでイソプロパノール沈澱し、RNアーゼ処理し、フェ
ノール:クロロホルム抽出、クロロホルム抽出およびエ
タノール沈澱した。沈澱を70%のエタノールで洗浄し、
そしてTE pH7.5の中に再懸濁した。ウシ結核菌(M.bov
is)−BCG(Moreau)ゲノムのDNAをグアスキンスキー
(Graskinsky)博士の寛大な贈り物であった。
マイコバクテリアのゲノムのDNAをSau3Aで部分的に消
化し、DE81紙上へのアガロースゲルの電気泳動により大
きさで選択し、エタノール沈澱し、そしてBamH Iで切断
しかつ仔ウシ腸ホスファターゼで処理したpUC19の中に
結合した。ハナハン(hanahan)の手順により形質転換
体について競合的とした、DH5alphaを、この結合体で形
質転換し、そして50μgのアンピシリンを含有するルリ
ア・ベルタニ(Luria Bertani)寒天上に平板培養し
た。組み換えプラスミドを含有するコロニーの比率は、
XGalおよびIPTGを含有するインジケーター平板上に平板
培養し、そして白色コロニー対合計(白色+青色)のコ
ロニーの比を決定することによって決定した。プールし
たプラスミドDNAは、平板からコロニーを引っ掻き取
り、50ミリモルのトリスpH8.0、10ミリモルのEDTA、50
ミリモルのグルコースの中に再懸濁することによって得
た。生ずる懸濁液をプラスミドDNAを得るためのアルカ
リ性溶菌方法により処理した。スメグマ菌(M.smegmati
s)の組み換えDNAライブラリーは35,000の独立の初期の
形質転換体から成り、それらの85%は組み換え体であっ
た。ウシ結核菌(M.bovis)−BCGの組み換えDNAライブ
ラリーは64,000の独立の初期の形質転換体から成り、そ
れらの55%は組み換え体であった。
化し、DE81紙上へのアガロースゲルの電気泳動により大
きさで選択し、エタノール沈澱し、そしてBamH Iで切断
しかつ仔ウシ腸ホスファターゼで処理したpUC19の中に
結合した。ハナハン(hanahan)の手順により形質転換
体について競合的とした、DH5alphaを、この結合体で形
質転換し、そして50μgのアンピシリンを含有するルリ
ア・ベルタニ(Luria Bertani)寒天上に平板培養し
た。組み換えプラスミドを含有するコロニーの比率は、
XGalおよびIPTGを含有するインジケーター平板上に平板
培養し、そして白色コロニー対合計(白色+青色)のコ
ロニーの比を決定することによって決定した。プールし
たプラスミドDNAは、平板からコロニーを引っ掻き取
り、50ミリモルのトリスpH8.0、10ミリモルのEDTA、50
ミリモルのグルコースの中に再懸濁することによって得
た。生ずる懸濁液をプラスミドDNAを得るためのアルカ
リ性溶菌方法により処理した。スメグマ菌(M.smegmati
s)の組み換えDNAライブラリーは35,000の独立の初期の
形質転換体から成り、それらの85%は組み換え体であっ
た。ウシ結核菌(M.bovis)−BCGの組み換えDNAライブ
ラリーは64,000の独立の初期の形質転換体から成り、そ
れらの55%は組み換え体であった。
マイコバクテリアのPyrF遺伝子を含有する組み換えプラ
スミドの分離 Y1103およびY1107をハナハン(Hanahan)の方法によ
り競合的とし、プラスミドのライブラリーのDNAで形質
転換し、そして最小寒天平板上で平板培養した。スメグ
マ菌(M.smegmatis)のライブラリーについて最初にス
クリーニングした180,000の形質転換体のうちで、31は
最小培地上で増殖ことができた。
スミドの分離 Y1103およびY1107をハナハン(Hanahan)の方法によ
り競合的とし、プラスミドのライブラリーのDNAで形質
転換し、そして最小寒天平板上で平板培養した。スメグ
マ菌(M.smegmatis)のライブラリーについて最初にス
クリーニングした180,000の形質転換体のうちで、31は
最小培地上で増殖ことができた。
プラスミドDNAの分離、制限マッピングおよびDNAのスク
リーニング プラスミドDNAをアルカリ性溶菌法により液体培養に
より分離した。組み換えプラスミドDNAの制限マッピン
グを標準の方法に従い多数の酵素を使用して実施した。
ニュー・イングランド・バイオラブス(New England
Biolabs)および米国バイケミカルス(U.S.Biochemical
s)からの配列決定既知の技術を使用して、M13mp18およ
びM13mp19の中にサブクローニング後、ジデオキシ方法
を使用してDNAの配列決定を実施した。
リーニング プラスミドDNAをアルカリ性溶菌法により液体培養に
より分離した。組み換えプラスミドDNAの制限マッピン
グを標準の方法に従い多数の酵素を使用して実施した。
ニュー・イングランド・バイオラブス(New England
Biolabs)および米国バイケミカルス(U.S.Biochemical
s)からの配列決定既知の技術を使用して、M13mp18およ
びM13mp19の中にサブクローニング後、ジデオキシ方法
を使用してDNAの配列決定を実施した。
実施例11
スメグマ菌(M.smegmatis)のゲノムのDNA中のらい菌
(M.leprae)の65kD遺伝子の組み込み カナマイシン抵抗性およびらい菌(M.leprae)の65kDの
抗原発現する組み換えプラスミドの構成 pPP25、PyrF-E.coliと競合することができるスメグマ
菌(M.smegmatis)からのDNAを含有する組み換えプラス
ミド、を、BamH Iで消化し、そしてpUC4kSACから分離し
た、Tn903のアミノグリコシドホスホトランスフェラー
ゼをエンコードする1.3kBのBamH I断片に結合した。ら
い菌(M.leprae)の65kDの抗原をエンコードする遺伝子
を含有するY3178のEcoR I断片を、引き続いて、このプ
ラスミドにおいてマイコバクテリアのDNA中の独特Xho I
およびEcoR Vの中にクローニングした。各場合におい
て、マイコバクテリアのオープンリーディングフレー
ム、カナマイシン抵抗性の遺伝子およびらい菌(M.lepr
ae)の65kDの遺伝子の転写の向きは同一向きであると決
定された。
(M.leprae)の65kD遺伝子の組み込み カナマイシン抵抗性およびらい菌(M.leprae)の65kDの
抗原発現する組み換えプラスミドの構成 pPP25、PyrF-E.coliと競合することができるスメグマ
菌(M.smegmatis)からのDNAを含有する組み換えプラス
ミド、を、BamH Iで消化し、そしてpUC4kSACから分離し
た、Tn903のアミノグリコシドホスホトランスフェラー
ゼをエンコードする1.3kBのBamH I断片に結合した。ら
い菌(M.leprae)の65kDの抗原をエンコードする遺伝子
を含有するY3178のEcoR I断片を、引き続いて、このプ
ラスミドにおいてマイコバクテリアのDNA中の独特Xho I
およびEcoR Vの中にクローニングした。各場合におい
て、マイコバクテリアのオープンリーディングフレー
ム、カナマイシン抵抗性の遺伝子およびらい菌(M.lepr
ae)の65kDの遺伝子の転写の向きは同一向きであると決
定された。
エレクトロポレイションによりマイコバクテリアの形質
転換 スメグマ菌(M.smegmatis)およびウシ結核菌(M.bov
is)−BCGを、ADCエンリッチメントおよび0.05%のツイ
ーン80を補充したミドルブロック(Middlebrook)7H9培
地の中でほぼ0.3〜0.5のA600に増殖した。細胞を遠心に
より収穫し、10ミリモルのヘペス(Hepes)pH7.0中で洗
浄し、遠心し、そして1/10の体積の10ミリモルのヘペス
pH7.0、10%のグリセロール(スメグマ菌(M.smegmati
s))の中に再懸濁するか、あるいは1/10体積の7ミリ
モルのリン酸ナトリウムpH7.2、272ミリモルのスクロー
ス(BCG)中で洗浄しそしてその中に再懸濁した。DNAを
添加し、そして細胞を単一のパルスの6.25kV/cmに25マ
イクロファラドでバイオラド・ジーン・パルサー(Bior
ad Gene Pulser)を使用して暴露した。次いで、3〜
5体積のM−ADC−TWを添加し、細胞を37℃において2
〜3時間インキュベーションし、遠心し、小さい体積の
M−ADC−TWの中に再懸濁し、そして1%のグルコース
を補充し、10μg/mlのカナマイシンを含有するトリプシ
ン大豆の寒天(スメグマ菌(M.smegmatis))またはADC
エンリッチメントを補充し、10μg/mlのカナマイシンを
含有するミドルブロック(Middlebrook)7H9寒天上で平
板培養した。
転換 スメグマ菌(M.smegmatis)およびウシ結核菌(M.bov
is)−BCGを、ADCエンリッチメントおよび0.05%のツイ
ーン80を補充したミドルブロック(Middlebrook)7H9培
地の中でほぼ0.3〜0.5のA600に増殖した。細胞を遠心に
より収穫し、10ミリモルのヘペス(Hepes)pH7.0中で洗
浄し、遠心し、そして1/10の体積の10ミリモルのヘペス
pH7.0、10%のグリセロール(スメグマ菌(M.smegmati
s))の中に再懸濁するか、あるいは1/10体積の7ミリ
モルのリン酸ナトリウムpH7.2、272ミリモルのスクロー
ス(BCG)中で洗浄しそしてその中に再懸濁した。DNAを
添加し、そして細胞を単一のパルスの6.25kV/cmに25マ
イクロファラドでバイオラド・ジーン・パルサー(Bior
ad Gene Pulser)を使用して暴露した。次いで、3〜
5体積のM−ADC−TWを添加し、細胞を37℃において2
〜3時間インキュベーションし、遠心し、小さい体積の
M−ADC−TWの中に再懸濁し、そして1%のグルコース
を補充し、10μg/mlのカナマイシンを含有するトリプシ
ン大豆の寒天(スメグマ菌(M.smegmatis))またはADC
エンリッチメントを補充し、10μg/mlのカナマイシンを
含有するミドルブロック(Middlebrook)7H9寒天上で平
板培養した。
サザンブロット分析
マイコバクテリアの形質転換体のゲノムのDNAを制限
酵素で消化し、アガロースゲルでエレクトロポレイショ
ンし、ニトロセルロースに移し、そして32Pニック翻訳
で標識したDNAでプロービングし、すべて標準の手順を
使用した。
酵素で消化し、アガロースゲルでエレクトロポレイショ
ンし、ニトロセルロースに移し、そして32Pニック翻訳
で標識したDNAでプロービングし、すべて標準の手順を
使用した。
ウェスタン・ブロット(イムノブロット)分析
65kDのらい菌(M.leprae)タンパク質の発現を、ウェ
スタン・ブロットの技術を使用して実証した。マイコバ
クテリアのリゼイトおよびE.coliの形質転換体をSDSポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、ニトロセルロ
ースに電気転移させ、そして標準の技術を使用してほぼ
1:1000の希釈でモノクローナル抗体IIIE9でプロービン
グした。ブロトブロット(Protoblot)キット(Promega
Biotec)を使用して抗体の結合を検出し、そして製造
業者の指示に従い使用した。これにより、らい菌(M.le
prae)遺伝子を含有するプラスミドで形質転換した細胞
中で65kDのタンパク質の発現が検出された。
スタン・ブロットの技術を使用して実証した。マイコバ
クテリアのリゼイトおよびE.coliの形質転換体をSDSポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、ニトロセルロ
ースに電気転移させ、そして標準の技術を使用してほぼ
1:1000の希釈でモノクローナル抗体IIIE9でプロービン
グした。ブロトブロット(Protoblot)キット(Promega
Biotec)を使用して抗体の結合を検出し、そして製造
業者の指示に従い使用した。これにより、らい菌(M.le
prae)遺伝子を含有するプラスミドで形質転換した細胞
中で65kDのタンパク質の発現が検出された。
同等の実施態様
当業者は日常の実験を越えないものを使用して、ここ
に記載する発明を逸脱しないで特定の実施態様に対する
多くの同等の態様を、認識するか、あるいは確証するこ
とができるであろう。このような同等の態様は次の請求
の範囲包含されることを意図する。
に記載する発明を逸脱しないで特定の実施態様に対する
多くの同等の態様を、認識するか、あるいは確証するこ
とができるであろう。このような同等の態様は次の請求
の範囲包含されることを意図する。
なお本発明の主たる特徴及び態様を示せば次のとおり
である。
である。
1.プラスミドにより組み込まれた目的のDNAを発現する
ことができる組み換えマイコバクテリウム。
ことができる組み換えマイコバクテリウム。
2.目的のDNAが組み換えマイコバクテリウムのゲノムのD
NAの選択した部位の中に安定に組み込まれている。上記
第1項記載の組み換えマイコバクテリウム。
NAの選択した部位の中に安定に組み込まれている。上記
第1項記載の組み換えマイコバクテリウム。
3.目的のDNAが染色体外に維持されている、上記第1項
記載の組み換えマイコバクテリウム。
記載の組み換えマイコバクテリウム。
4.プラスミドがマイコバクテリアのゲノムのDNAと相同
的組み換えのためのDNA配列を包含する、上記第2項記
載の組み換えマイコバクテリウム。
的組み換えのためのDNA配列を包含する、上記第2項記
載の組み換えマイコバクテリウム。
5.プラスミドがマイコバクテリアのPyrF遺伝子を包含す
る、上記第4項記載の組み換えマイコバクテリウム。
る、上記第4項記載の組み換えマイコバクテリウム。
6.目的のDNAが少なくとも1つのタンパク質またはポリ
ペプチドをエンコードする、上記第1〜5項のいずれか
に記載の組み換えマイコバクテリウム。
ペプチドをエンコードする、上記第1〜5項のいずれか
に記載の組み換えマイコバクテリウム。
7.組み換えマイコバクテリウムが少なくとも1つの目的
のタンパク質またはポリペプチドをコードする目的のDN
Aを発現することができる、組み換えウシ結核菌(Mycob
acterium bovis)−BCGまたはその遺伝子変異型であ
る、上記第1〜6項のいずれかに記載の組み換えマイコ
バクテリウム。
のタンパク質またはポリペプチドをコードする目的のDN
Aを発現することができる、組み換えウシ結核菌(Mycob
acterium bovis)−BCGまたはその遺伝子変異型であ
る、上記第1〜6項のいずれかに記載の組み換えマイコ
バクテリウム。
8.E.coli中およびマイコバクテリア中で目的のDNAを複
製および発現することができる、マイコバクテリア−E.
coliハイブリッドプラスミドである、上記第1〜7項の
いずれかに記載の組み換えマイコバクテリウムを産生す
るためのシャトルプラスミドベクター。
製および発現することができる、マイコバクテリア−E.
coliハイブリッドプラスミドである、上記第1〜7項の
いずれかに記載の組み換えマイコバクテリウムを産生す
るためのシャトルプラスミドベクター。
9.E.coli中およびマイコバクテリア中で目的のDNAを複
製および発現することができる、 a) E.coli中のプラスミドの複製および選択に必要
なDNA、 b) マイコバクテリア中のプラスミドの選択のため
の選択可能なマーカーをコードするDNA、 c) マイコバクテリア中で機能する複製起点、およ
び d) マイコバクテリア中で複製することができるプ
ラスミドの非必須部位中に挿入された目的のDNA、 からなる、上記第8項記載のシャトルプラスミドベクタ
ー。
製および発現することができる、 a) E.coli中のプラスミドの複製および選択に必要
なDNA、 b) マイコバクテリア中のプラスミドの選択のため
の選択可能なマーカーをコードするDNA、 c) マイコバクテリア中で機能する複製起点、およ
び d) マイコバクテリア中で複製することができるプ
ラスミドの非必須部位中に挿入された目的のDNA、 からなる、上記第8項記載のシャトルプラスミドベクタ
ー。
10.バクテリアプラスミドDNA、マイコバクテリアプラス
ミドDNAおよび目的のDNAからなり、E.coli中で目的のDN
Aを複製および発現することができ且つマイコバクテリ
ウム中で目的のDNAを複製および発現することができ
る、 a) Tn5からのneo遺伝子、pACYC184からのP15A複製
起点およびpACYC184からのcat遺伝子からなる、E.coli
プラスミドpIJ666DNA、 b) プラスミドpAL5000DNA、および c) 目的のDNA、 からなり、E.coliプラスミドDNAがpAL5000DNA内に挿入
されている、 上記第8または9項のいずれかに記載のハイブリッドマ
イコバクテリア−バクテリアベクター。
ミドDNAおよび目的のDNAからなり、E.coli中で目的のDN
Aを複製および発現することができ且つマイコバクテリ
ウム中で目的のDNAを複製および発現することができ
る、 a) Tn5からのneo遺伝子、pACYC184からのP15A複製
起点およびpACYC184からのcat遺伝子からなる、E.coli
プラスミドpIJ666DNA、 b) プラスミドpAL5000DNA、および c) 目的のDNA、 からなり、E.coliプラスミドDNAがpAL5000DNA内に挿入
されている、 上記第8または9項のいずれかに記載のハイブリッドマ
イコバクテリア−バクテリアベクター。
11.上記第8〜10項のいずれかに記載のバクテリア−マ
イコバクテリアシャトルプラスミドが安定に組み込まれ
ている組み換えマイコバクテリウム。
イコバクテリアシャトルプラスミドが安定に組み込まれ
ている組み換えマイコバクテリウム。
12.アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(t
he American Type Culture Collection)に受託No.6774
5で寄託された、シャトルブラスミドpYUP1100で形質転
換された下位菌株(substrain)P11733P2である、上記
第1項記載の組み換えマイコバクテリウム(Mycobacter
ium)BCG−パスツール(Pasteur)。
he American Type Culture Collection)に受託No.6774
5で寄託された、シャトルブラスミドpYUP1100で形質転
換された下位菌株(substrain)P11733P2である、上記
第1項記載の組み換えマイコバクテリウム(Mycobacter
ium)BCG−パスツール(Pasteur)。
13.目的のDNAおよび該目的のDNAを発現することができ
るDNAを含むプラスミドをマイコバクテリウム中に導入
することからなる、上記第1〜7、11または12項のいず
れかに記載の組み換えマイコバクテリウムの産生方法。
るDNAを含むプラスミドをマイコバクテリウム中に導入
することからなる、上記第1〜7、11または12項のいず
れかに記載の組み換えマイコバクテリウムの産生方法。
14.プラスミドをエレクトロポレイションにより導入す
る、上記第13項記載の方法。
る、上記第13項記載の方法。
15.薬剤耐性をコードする遺伝子および目的の抗原をコ
ードするDNAが挿入されているマイコバクテリアPyrF遺
伝子を、マイコバクテリアのゲノム中に、安定に組み込
むことからなる、上記第13または14項記載のマイコバク
テリウム中に目的の抗原をコードするDNAを導入する方
法。
ードするDNAが挿入されているマイコバクテリアPyrF遺
伝子を、マイコバクテリアのゲノム中に、安定に組み込
むことからなる、上記第13または14項記載のマイコバク
テリウム中に目的の抗原をコードするDNAを導入する方
法。
16.少なくとも1つのタンパク質抗原をコードする目的
のDNAを発現することができる、上記第1〜7、11また
は12項のいずれかに記載の組み換えマイコバクテリウ
ム、および適当な担体からなるワクチン。
のDNAを発現することができる、上記第1〜7、11また
は12項のいずれかに記載の組み換えマイコバクテリウ
ム、および適当な担体からなるワクチン。
17.ヒト以外の哺乳動物宿主に上記第16項記載のワクチ
ンを投与することからなる、1または2以上の病原体に
対して哺乳動物宿主を免疫化する方法。
ンを投与することからなる、1または2以上の病原体に
対して哺乳動物宿主を免疫化する方法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 361,944
(32)優先日 平成1年6月5日(1989.6.5)
(33)優先権主張国 米国(US)
微生物の受託番号 ATCC 67745
(73)特許権者 500065679
アルバート・アインシユタイン・カレツ
ジ・オブ・メデ イシン・オブ・イエシ
バ・ユニバーシテイ,ア・デイビ ジヨ
ン・オブ・イエシバ・ユニバーシテイ
アメリカ合衆国ニユーヨーク州10461ブ
ロンクス・モリスパークアベニユー1300
(73)特許権者 500065750
ザ・ボード・オブ・トラステイーズ・オ
ブ・ザ・レラン ド・スタンフオード・
ジユニア・ユニバーシテイ
アメリカ合衆国カリフオルニア州94305
スタンフオード(番地なし)
(72)発明者 ブルーム,バリイ・アール
アメリカ合衆国ニユーヨーク州10706
ヘイステイングズオンハドソン・サミツ
トドライブ61
(72)発明者 デビス,ロナルド・ダブリユー
アメリカ合衆国カリフオルニア州94301
パロアルト・キングズレイアベニユー
433
(72)発明者 ジエイコブズ,ウイリアム・アール,ジ
ユニア
アメリカ合衆国ニユーヨーク州10462
ブロンクス・ポールデイングアベニユー
2031
(72)発明者 ヤング,リチヤード・エイ
アメリカ合衆国マサチユセツツ州01890
ウインチエスター・ソーミルブルツクロ
ード5
(72)発明者 ハツソン,ロバート・エヌ
アメリカ合衆国ワシントンデイシー
20007 アパートメント1・ツエンテイ
エイトスストリート エヌダブリユー
1600
(56)参考文献 GENE,19(1)(1982)p.21−
32
Ann Inst.Pasteur
/Microbiol,vol.136B
(1985)p.209−215
J.Gen.Virol,68(4)
(1987)p.949−956
FEMS Microbiology
Letters 30(1985)p.221
−225
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N
C12P
A61K 39
BIOSIS(STN)
MEDLINE(STN)
Genbank/EMBL/DDBJ/G
eneSeq
Claims (4)
- 【請求項1】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション(the American Type Culture Collection)に受
託No.67745で寄託された、シャトルプラスミドpYUP1100
で形質転換された下位菌株(substrain)P1173P2である
組換えマイコバクテリウム(Mycobacterium)BCG−パス
ツール(Pasteur)。 - 【請求項2】請求項1に記載のバクテリア−マイコバク
テリアシヤトルプラスミドをマイコバクテリウム中に導
入することを特徴とする請求項1に記載の組換えマイコ
バクテリウムの産生方法。 - 【請求項3】少なくとも1つのタンパク質抗原をコード
する目的のDNAを発現することができる請求項1に記載
の組換えマイコバクテリウムおよび適当な担体からなる
ワクチン。 - 【請求項4】ヒト以外の哺乳動物宿主に請求項3に記載
のワクチンを投与することを特徴とする、1または2以
上の病原体に対して哺乳動物宿主を免疫化する方法。
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US21639088A | 1988-07-07 | 1988-07-07 | |
US216,390 | 1988-07-07 | ||
US22308988A | 1988-07-22 | 1988-07-22 | |
US223,089 | 1988-07-22 | ||
US361,944 | 1989-06-05 | ||
US07/361,944 US5504005A (en) | 1987-03-02 | 1989-06-05 | Recombinant mycobacterial vaccine |
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---|---|---|---|
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Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04500305A JPH04500305A (ja) | 1992-01-23 |
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Family
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Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50758089A Expired - Fee Related JP3485916B2 (ja) | 1988-07-07 | 1989-07-07 | 組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用 |
JP2000072963A Pending JP2000350578A (ja) | 1988-07-07 | 2000-03-15 | 組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000072963A Pending JP2000350578A (ja) | 1988-07-07 | 2000-03-15 | 組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用 |
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---|---|
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AU (1) | AU3867789A (ja) |
CA (1) | CA1339526C (ja) |
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ATE250133T1 (de) * | 1989-06-19 | 2003-10-15 | Whitehead Biomedical Inst | Verktorvermittelte genominsertion und expression von dna in bcg |
EP0517751A4 (en) * | 1990-02-26 | 1993-03-31 | Commonwealth Scientific & Industrial Research Organisation ( C.S.I.R.O. ) | Shuttle plasmid for escherichia coli and mycobacteria |
CA2045842A1 (en) * | 1990-07-16 | 1992-01-17 | William R. Jacobs | Dna capable of site-specific integration into mycobacteria |
GB9015888D0 (en) * | 1990-07-19 | 1990-09-05 | Smithkline Biolog | Vectors |
EP0554335A4 (en) * | 1990-10-25 | 1994-09-14 | Commw Scient Ind Res Org | Corynebacteria and related organisms as vaccine vectors |
US5637303A (en) * | 1990-10-25 | 1997-06-10 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Use of a phospholipase D mutant of Corynebacterium pseudotuberculosis for vaccination |
AU643842B2 (en) * | 1990-10-25 | 1993-11-25 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Corynebacteria and related organisms as vaccine vectors |
EP0587775A4 (en) * | 1991-06-06 | 1994-11-02 | Medimmune Inc | INDUCTION OF THE CTL RESPONSE BY FOREIGN ANTIGENS EXPRESSED IN MYCOBACTERIES. |
AU2221992A (en) * | 1991-06-06 | 1993-01-08 | Med Immune, Inc. | Induction of immune response against tetanus toxin through administration of mycobacteria expressing tetanus toxin or fragments |
US6566121B1 (en) * | 1991-06-13 | 2003-05-20 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Insertional mutations in mycobacteria |
WO1992022326A1 (en) * | 1991-06-13 | 1992-12-23 | Albert Einstein College Of Medicine, A Division Of Yeshiva University | Insertional mutations in mycobacteria |
EP0521220A1 (en) * | 1991-06-14 | 1993-01-07 | Institut Pasteur | Recombinant immunogenic actinomycetale |
US5750384A (en) * | 1992-02-07 | 1998-05-12 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University, A Division Of Yeshiva University | L5 shuttle phasmids |
US6300061B1 (en) | 1992-02-07 | 2001-10-09 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Mycobacterial species-specific reporter mycobacteriophages |
US5330754A (en) * | 1992-06-29 | 1994-07-19 | Archana Kapoor | Membrane-associated immunogens of mycobacteria |
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US6238676B1 (en) | 1992-12-10 | 2001-05-29 | Brigham And Women's Hospital | Presentation of hydrophobic antigens to T-cells by CD1 molecules |
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