BR102012003790A2 - Cepa de mycobacterium recombinante, composição imunogênica e uso - Google Patents

Abstract

CEPA DE MYCOBACTERIUM RECOMBINANTE, COMPOSIÇAO IMUNOGÊNICA E USO A presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termolábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termolábil LT de Escherichia coli mutada. A presente invenção refere-se também a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63. Especificamente, a presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63 de serina para lisina. A presente invenção fornece também composições imunogênicas que compreendem as cepas da presente invenção. A presente invenção prevê ainda o uso das referidas cepas e composições imunológicas na manufatura de vacina para prevenção contra tuberculose e infecções causadas por Mycobacterium tuberculosis. Por último, a presente invenção refere-se a métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "CEPA DE MYCOBACTERIÜM RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO IMUNOGÉNICA E USO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Eseheriehia coli mutada.

A presente invenção refere-se também a cepas de Myeobaeterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Eseheriehia coli mutadas na posição 63.

Especificamente, a presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Eseherichia coli mutadas na posição 63 de serina para lisina.

A presente invenção fornece também composições imunogênicas que compreendem as cepas da presente invenção.

A presente invenção prevê ainda o uso das referidas cepas e composições imunológicas na manufatura de vacina para prevenção contra tuberculose e infecções causadas por Mycobacterium tubereulosis.

Por último, a presente invenção refere-se a métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Das micobactérias

As micobactérias compõem o gênero Mycobacterium da família das Mycobacteriaeae da ordem dos Actinomyeetales da classe dos Aetinomyeetes. As micobactérias que compõe esse

gênero possuem um formato de bastonetes ligeiramente curvos, de 1 a 10 μιη de comprimento e 0,2 a 0,6 μπι de diâmetro. Estas bactérias não podem ser classificadas como Gram-positivas, nem como Gram-negativas. A característica mais marcante desse bacilo é a natureza complexa de seu 10 envelope celular, contendo uma percentagem relativamente alta de lipídios, os quais incluem as longas cadeias de ácido micólico. Esse envelope lhe confere uma forte hidrofobicidade, tornando-o resistente à Iise e relativamente impermeável a antibióticos e outros agentes 15 químicos. Os bacilos são ditos ácido-álcool resistentes, ou seja, são resistentes às descolorações por ácidos fracos após coloração com Fucsina ou corantes similares. O DNA genômico contém um alto conteúdo de guanosina/citosina, entre 58-79%, o que prejudica o uso da bactéria Eseheriehia 20 coli como um hospedeiro genético. Estes aspectos são considerados características básicas para a identificação do bacilo como membro do gênero Mycobacterium [ORME, I.

(1995) Medicai Intelligent Unit: Immunity to Mycobacteria. Austin: R.G. Lands Company, p. 5; JAWETZ, E., MELNICK, J.L. & ADELBERG, E.A. (1998) Medicai Microbiology. 21st Ed. Appleton & Lange, Stamford, Connecticut; SHINNICK, T .M. & GOOD, R. C. (1994) Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infeet Dis 11: 884-901].

As micobactérias foram classificadas em dois

principais grupos: bactérias de crescimento lento, que possuem um tempo de geração em torno de 13 horas e que podem levar de 3 semanas a 3 meses de cultura para fornecer colônias visíveis; e as bactérias de crescimento rápido, 10 que possuem um tempo de geração em torno de 2-5 horas. As micobactérias de crescimento lento incluem muitos dos maiores patógenos de animais e humanos, como M. tuberculosis, M. bovis, M. paratuberculosis, M. avium, M. Iepraer etc, enquanto as de crescimento rápido incluem 15 espécies não patogênicas, tais como M. smegmatis, M. aurum, M. vaccae, etc. Quatro das cinco espécies patogênicas de micobactérias são agrupadas no complexo M. tuberculosis - um grupo de quatro espécies que pode causar a doença tuberculose (M. tuberculosis, M. bovis, M. microft e M. 20 africanum) ; a quinta é a M. leprae, o agente causador da doença de Hansen (informalmente conhecida como lepra) [SHINNICK, T .M. & GOOD, R. C. (1994) Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11: 884-901; ORME, I. (1995) Medicai Intelligent Unit: Immunity to Mycobacteria. Austin: R.G. Lands Company, p. 5; CONNELL, N.D. (2001) Expression systems for use in Actinomycetes and related organisms. Current Opinion in Biotechnology 12: 446-449].

OM. tuberculosis (MTB) é transmitido, sobretudo pela

via respiratória e, embora possa causar doenças em diversos órgãos, a tuberculose pulmonar é a mais comum. Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo e que 200 milhões irão apresentar sintomas de 10 tuberculose, dos quais 35 milhões poderão morrer até 2020 se medidas de controle e prevenção não forem tomadas (OMS Publicação Anual, 2000).

Da profilaxia da tuberculose e do uso do bacilo de Calmette-Guérin (BCG)

No inicio do século passado, Albert Calmette e Camille

Guérin, atenuaram uma cepa virulenta de Myeobaeterium bovis. Esta cepa é conhecida atualmente como Bacilo de Calmette-Guérin (BCG), sendo a única vacina contra a tuberculose usada atualmente com sucesso, tendo já sido 20 administrada a mais de três bilhões de indivíduos em todo o mundo.

Não obstante, a sua eficácia contra a forma adulta da tuberculose tem sido motivo de controvérsia, uma vez que pode variar de 0-80%, dependendo do estudo [Andersen, P. and Doherty, T.M. (2005) The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nat Rev Microbiol. 3: 656-662].

Assim, vários esforços têm sido empreendidos no desenvolvimento de novas vacinas, baseadas a) em proteínas recombinantes ou antígenos dominantes de MTB; b) na expressão desses mesmos antígenos em diversos vetores, tais como vetores virais, vetores bacterianos ou vetores baseados em BCG recombinante; c) em outras micobactérias que não causam tuberculose tais como Mycobacterium smegmatis; ou d) no próprio M. tuberculosis atenuado [Sweeney, K.A, Dao, D.N., Goldberg, M.F., Hsu, T., Venkataswamy, M.M., Henao-Tamayo, M., Ordway, D., Sellers, R.S., Jain, P., Chen, B., Chen, M., Kim, J., Lukose, R., Chan, J., Orme, I.M., Porcelli, S.A. and Jacobs, W.R Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against Mycobacterium tuberculosis. Nat Med. 4:1261-1268; Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567-577;

De um modo geral, a idéia por trás destas vacinas é buscar uma forma de mimetizar o que acontece numa situação real, ou seja, apresentar o patógeno por inteiro numa forma morta ou viva, porém, atenuada e que não provoque infecção [Kaufmann, S.Η. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567-577], ou usando uma outra espécie do mesmo gênero, também morta ou atenuada, como a BCG, que possui antígenos 5 importantes em comum com o patógeno de interesse. Outra variante dessas vacinas seria o seu uso como veículos vivos para apresentação ou expressão de antígenos heterólogos, neste caso moléculas de MTB sendo expressas em BCG ou M. smegmatis [Sweeney, K.A, Dao, D.N., Goldberg, M.F., Hsu, 10 T., Venkataswamy, M.M., Henao-Tamayo, M., Ordway, D., Sellers, R.S., Jain, P., Chen, B., Chen, M., Kim, J., Lukose, R., Chan, J., Orme, I.M., Porcelli, S.A. and Jacobs, W.R Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium smegmatis induces potent bactericidal immunity against 15 Mycobacterium tuberculosis. Nat Med. 4:1261-1268; Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567- 577] .

Apesar dos esforços, os resultados em modelo animal 20 quando comparados com a vacina BCG apontam para uma redução da carga bacilar nos pulmões de somente 1,0 log, ainda assim seguindo um regime de imunização baseado em "prime- boost". Neste esquema de imunização, a primeira dose é administrada por uma das formulações mencionada acima seguida por uma segunda dose em uma outra formulação, ou seja, são necessárias duas imunizações com formulações ou apresentações diferentes para se chegar a um resultado melhor que a vacina BCG usada atualmente, que é 5 administrada como dose única [Sweeney, K.A, Dao, D.N., Goldberg, M.F., Hsu, T., Venkataswamy, M.M., Henao-Tamayo, M., Ordway, D., Sellers, R.S., Jain, P., Chen, B., Chen, M., Kim, J., Lukose, R., Chan, J., Orme, I.M., Porcelli, S.A. and Jacobs, W.R Jr. (2011) A recombinant Mycobacterium 10 smegmatis induces potent bactericidal immunity against Myeobaeterium tuberculosis. Nat Med. 4:1261-1268; Kaufmann, S.H. (2010) Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box. Immunity 33: 567- 577] .

Do BCG Recombinante

0 BCG é a vacina mais utilizada no mundo pois apresenta uma resposta imune duradoura e uma frequência muito baixa de efeitos adversos sérios. Essa e outras características tornam a BCG um excelente candidato a 20 veículo para apresentação de antígenos heterólogos através de vacinas recombinantes baseadas em BCG (Patente US 6,673,353). Neste sentido, a expressão de domínios imunogênicos de bactérias, vírus e parasitas tem sido utilizado com sucesso no BCG, gerando cepas recombinantes (rBCG), as quais produzem resposta imune não só contra o bacilo da tuberculose, mas também, contra os patógenos cujas proteínas seriam expressas nesse rBCG (Patente US 5, 504,005) . No entanto, vale salientar que nas rBCGs 5 descritas até a data, a adição de um domínio imunogênico heterólogo confere a proteção imunologica específica esperada contra os patógenos cujas proteínas seriam expressas no referido rBCG. Reações distintas das que são de conhecimento habitual, isto é, em que o rBCG confere a 10 proteção imunologica diferente daquela esperada, ainda não foram descritas.

Da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli e suas propriedades imunomoduladoras

Propriedades adjuvantes têm sido atribuídas a diversas 15 toxinas bacterianas. Por exemplo, é amplamente conhecido que as toxinas tetânica (TT), diftérica (DT), colérica (CT) e a toxina termo-lábil (LT) de Escherichia coli (E. coli), atuam como adjuvantes que direcionam a resposta imunologica para Th2 quando co-administradas com outros antígenos 20 [Ryan, E.J. et al. (2000) Modulation of innate and acquired immune responses by Escherichia coli heat-labile toxin: distinct pro- and anti-inflammatory effects of the nontoxic AB complex and the enzyme activity. J Immunol. 165:5750- 5759; Miyaji, E.N. et al. (2001) Induction of neutralizing antibodies against diphtheria toxin by priming with recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing CRMl97, a mutant diphtheria toxin. Infect Immun. 69:869-874].

Em particular, a toxina LT de E. coli está entre os 5 mais potentes adjuvantes já descritos até o momento [Lycke, N. et al. (1992) The adjuvant effect of Vibrio cholerae and Escherichia coli heat-labile enterotoxins is linked to their ADP-ribosyltransferase activity. Eur J Immunol. 22: 2277-2281; Pizza, M. et al. (2001) Mucosal vaccines: non 10 toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants. Vaccine, 19:2534-2541].

A toxina LT de E. coli é formada por uma única molécula de subunidade A (LTA, 27kDa), com atividade ADP ribosiltransferase, ligada a um pentâmero de subunidade B 15 (LTB, 11,6 kDa cada) que se liga ao receptor gangliosideo GMl de células de mamíferos. A subunidade B de LT é uma potente molécula sinalizadora capaz de modular a resposta imunologica. 0 efeito imunoestimulatório de LTB parece estar relacionado com a capacidade desta de aumentar a 20 apresentação de antígeno via o complexo de histocompatibilidade principal classe I (MHC-I) e classe II (MHC-II), entre outros fatores. Já o efeito adjuvante de LTB tem sido relacionado diretamente à atividade de ligação a GMl, através da ativação de células B e células T CD4 + por meio da interação dos pentâmeros de subunidade B e os receptores GMl destas células. Além disso, LTB aumenta a apresentação de antígenos pela ativação de células dendríticas (DCs) e outras células apresentadoras de 5 antígenos (APCs) . A ligação da LTB ao gangliosídeo GMl permite que a subunidade A, que é tóxica, entre na célula [Spangler, B.D. (1992) Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Microbiol Rev. 56: 622-647].

0 uso da LT como adjuvante não é recomendado, em

função da toxicidade da subunidade A. Já a subunidade B, por não apresentar esta toxicidade, tem sido mais freqüentemente utilizada como adjuvante [de Haan, L., Verweij, W.R., Feil, I.K., Holtrop, M., Hol, W.G., 15 Agsteribbe, E. and Wilschut, J. (1998) Role of GMl binding in the mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the Eseheriehia coli heat-labile enterotoxin and its B subunit. Immunology, 94: 424-430].

As propriedades imunomodulatórias que levam ao aumento 20 da imunogenicidade e eficácia protetora de LT têm sido amplamente estudadas. Embora os mecanismos que levam a esse efeito não sejam bem caracterizados, alguns aspectos como o aumento de citocinas inflamatórias e produção de quimiocinas, bem como recrutamento transiente de células imunoefetoras até o sítio de inflamação têm sido estabelecidos como fatores importantes. LT pode também influenciar a maturação de células dendríticas, apresentação de antígenos e ativação de células T e 5 promover a indução de resposta por células T citotóxica antígeno-específico em modelo animal. 0 uso de LT como adjuvante leva comumente a um balanço de citocinas, envolvendo a produção de uma resposta por citocinas com características tanto Thl como Th2 e algumas classes de 10 anticorpos em camundongos e humanos.

Esta toxina é capaz de ativar uma resposta imunologica contra outro antígeno quando apresentados simultaneamente na superfície de mucosa ou por administração oral, intra- nasal ou parenteral [Holmgren, J., Lycke, N. and 15 Czerkinsky, C. (1993) Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems. Vaccine, 11: 1179-1184].

Como uma conseqüência dessas propriedades, LT tem sido empregada extensivamente como adjuvante em modelos animais. 20 No entanto, apesar da ação imunomodulatória de LT, este é altamente tóxico e inapropriado para uso clínico em humanos. Assim, para evitar a toxicidade associada com o uso da toxina nativa, porém mantendo suas propriedades adjuvantes, diferentes estratégias têm sido utilizadas, incluindo o isolamento da subunidade B (não tóxica) e a construção de mutantes de LT não-tóxicos, contendo mutações sítio-dirigidas especificas. Por meio de estudos de modelagem computacional da estrutura da proteína LT, foi 5 possível identificar alguns aminoácidos potencialmente envolvidos na atividade enzimática desta proteína que poderiam ser estudados através da troca dos mesmos por mutação sítio-dirigida [Magagnoli, C. et al., (1996) Infect Immun. 64: 5434-5438]. Alguns desses mutantes, tais como 10 LTR192G (substituição de arginina para glicina na posição 192), possuem uma mutação numa região de alça que é sensível a protease, tornando esta região insensível à ação de proteases, etapa fundamental para a ativação da atividade enzimática e conseqüentemente da sua toxicidade. 15 Outros mutantes apresentam uma mutação na região enzimaticamente ativa da subunidade A, tal como LTR72 (substituição de alanina por arginina na posição 72), a qual retém somente 1 % da atividade ADP-ribosiltransferase.

Um outro mutante importante é LTK63 (substituição de 20 serina por lisina na posição 63) . Essa mutação elimina a atividade ADP-ribosiltransferase associada à toxicidade; eliminando a mesma, porém, mantém todas as outras propriedades biológicas, incluindo propriedades adjuvantes do LT nativo [Pizza, M., et al., (2001) Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants. Vaccine, 19:2534-2541].

LTK63 tem mostrado atuar como um potente adjuvante quando administrado mucosamente ou parentalmente. De Haan e 5 colaboradores [De Haan, L., Holtrop, M., Verweij, W. R., Agsteribbe, E. and Wilschut, J. (1999) Mucosal immunogenicity and adjuvant activity of the recombinant A subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin. Immunology, 97: 706-7013] sugerem que adjuvantes usando LTA 10 não tóxicos em associação com o pentâmero LTB podem ser mais potentes que adjuvantes usando a subunidade B sozinha, uma vez que o complexo poderia estimular o sistema imunológico mais fortemente do que cada molécula individualmente. Dados que apontam para uma função 15 importante da subunidade A enzimaticamente inativa na indução de uma resposta imune, bem como em atividades imunomoduladoras, tais como efeitos sobre o processamento e apresentação de antígeno, dão suporte a essa visão.

Da expressão de LT e suas variantes LTB e LTK63 recombinantes têm sido expressas

tipicamente em E. coli. No entanto, outros sistemas de expressão têm sido usados. A molécula LTB foi expressa em Mycocabterium bovis BCG, Lactobacillus casei, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, bem como plantas que incluem Oryza sativa (arroz), Lactuca sativa (alface) e Peperomia pellucid. LTK63 tem sido expresso também em tabaco e cloroplastos, assim como Salmonella enterica serovar Typhimurium atenuada [da Hora, V.P. et al. (2011) Non-toxic 5 derivatives of LT as potent adjuvants. Vaccine, 29: 1538- 1544] .

No entanto, o objetivo de todos estes trabalhos, foi utilizar a molécula de LT ou uma de suas subunidades ou variantes para produzir vacinas contra E. coli. O uso de LT em vacinas contra tuberculose não foi descrito nem sugerido na literatura existente.

OBJETIVOS DA INVENÇÃO

Constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutada.

Em particular, constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), recombinantes que codificam a toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutada ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutada.

Mais especificamente, constitui um objetivo da presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium, em particular Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63.

Mais especificamente, constitui um objetivo da 5 presente invenção, fornecer cepas de Mycobacterium, em particular Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli, mutadas na posição 63 de serina para lisina, 10 respectivamente rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63.

Constitui também um objetivo da presente invenção fornecer composições imunogênicas que compreendem as cepas da presente invenção.

Um outro objetivo da invenção é prover o uso das referidas cepas e composições imunológicas na manufatura de vacinas para prevenção contra tuberculose e/ou infecções causadas por Mycobacterium tuberculosis ou por outras micobactérias.

Em particular, tem a presente invenção o objetivo de prover vacinas de BCG melhoradas contra tuberculose (i.e. que induzem melhor proteção que a cepa BCG convencional) que compreendem as cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinantes da presente invenção.

A presente invenção objetiva ainda métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais, mais particularmente humanos.

DEFINIÇÕES

No âmbito deste pedido de patente são utilizadas por diversas vezes abreviaturas cujas definições conforme empregues neste pedido, encontram-se resumidas abaixo:

• BCG refere-se ao Mycobacterium bovis atenuado, Bacilo de Calmette-Guérin;

• LTK63 refere-se à toxina termo-lábil de Eseherichia coli contendo a subunidade A modificada por mutagênese

sítio-dirigida;

• LTAK63 refere-se à subunidade A da toxina termo-lábil de Escherichia coli, modificada por mutagênese sítio- dirigida; e

· rBCG-LTK63 ou rBCG-LTAK63 refere-se ao BCG

recombinante expressando LTK63 ou LTAK63.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As figuras a seguir fazem parte do presente relatório e estão aqui inclusas a fim de ilustrar determinados 20 aspectos da invenção. O objeto da presente invenção pode ser melhor entendido com referência a uma ou mais dessas figuras, em combinação com a descrição detalhada da modalidade preferida aqui apresentada. A Figura 1 mostra um gel de agarose contendo os produtos de PCR que confirmam a presença do gene LTK63 no BCG recombinante (rBCG-LTK63) . Os produtos de PCR foram amplificados à partir do DNA plasmidial extraído da 5 construção rBCG-LTK63 usando oligonucleotídeos iniciadores específicos para amplificar a subunidade LTA ou a unidade LTB. IKb plus, peso molecular; poço 1, fragmento LTA completo (~700 pb) ; poço 2, fragmento LTB completo (~316 pb) .

A Figura 2 mostra a caracterização da expressão de

LTAK63 (~31,0 kDa) em BCG recombinante. Extrato de proteínas solúveis (-10 μς) de rBCG transfomado com pLNIP- LTAK63 (A) , ou BCG vazio como controle negativo (B) foram usados neste imunoensaio. Foi utilizado um soro (policlonal) feito em coelho anti-LT 1:1000).

A Figura 3 mostra a análise comparativa da resposta de anticorpos IgGl e IgG2a induzida contra proteínas recuperadas do sobrenadante de cultivo de BCG - PDS. Camundongos BALB/c, fêmeas, com quatro semanas (18-22g), 20 provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina Veterinária - USP, foram imunizados com BCG ou rBCG-LT e os isotipos determinados em soros isolados um dia antes do desafio contra MTB ou 90 dias após imunização. Os soros de 5 animais por grupo foram analisados individualmente por ELISA, usando anticorpos específicos anti IgGl e IgG2a de camundongo.

A Figura 4 mostra a produção de IFN-γ por esplenócitos cultivados na presença de PDS. Camundongos BALB/c fêmeas 5 foram imunizados com 1 x IO6 UFC de BCG ou rBGC-LT. Após quatro semanas os baços foram recuperados e preparações de células únicas foram cultivadas in vitro (2 x IO6 células/poço) na presença de 2,0 μg/mL de PDS. Os sobrenadantes das culturas foram recuperados após 48 h e os 10 níveis de IFN-γ determinados por ELISA.

A Figura 5 mostra a produção de TNF-α por esplenócitos cultivados na presença de PDS. Camundongos BALB/c fêmeas foram imunizados com 1 x IO6 UFC de BCG ou rBGC-LT. Após 4 semanas os baços foram recuperados e preparações de células 15 únicas foram cultivadas in vitro (2 x IO6 células/poço) na presença de 2,0 pg/mL de PDS. Os sobrenadantes das culturas foram recuperados após 24 h e os níveis de TNF-a determinados por ELISPOT. SFU = unidades formadoras de pontos.

A Figura 6 mostra o resultado dos ensaios de proteção

contra um desafio intra-traqueal com a cepa de M. tuberculosis H37Rv. Camundongos BALB/c fêmeas (n = 10 por grupo) AeB foram imunizados s. c. uma única vez com M. bovis BCG ou com rBCG-LT. Um grupo não imunizado foi usado como controle negativo. Oito semanas após a imunização os animais foram desafiados pela via intra-traqueal com IxlO5 UFC de M. tuberculosis H37Rv. Barras de erro representam o 5 desvio padrão da média. AeB representam dois ensaios realizados em tempos diferentes nas mesmas condições. C, representa um ensaio realizado com camundongos C57BL/6 fêmeas (n = 10 por grupo) imunizados s.c. uma única vez com M. bovis BCG ou rBCG-LTA. Oito semanas após a imunização os 10 animais foram desafiados pela via intra-traqueal com IxlO5 UFC de M. tuberculosis H37Rv. Barras de erro representam o desvio padrão da média.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Descrição das cepas A presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium

recombinantes que codificam a toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutada.

A presente invenção refere-se também a cepas de Mycobacterium recombinantes que codificam a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutada.

Em particular a presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escherichia coli mutadas na posição 63.

Mais particularmente a presente invenção refere-se a cepas de Mycobacterium que codificam a toxina termo-lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Escheriehia eoli mutadas na posição 63 de serina para lisina, respectivamente rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63.

As referidas mutações permitem que a toxina termo- lábil LT de Eseheriehia eoli ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Eseheriehia eoli codificadas pelo 10 Myeobaeterium mantenham as propriedades adjuvantes do LT nativo, porém percam a atividade ADP-ribosiltransferase associada à toxicidade, evitando assim problemas de toxicidade no caso em humanos ou outros animais.

Cepas de Myeobaeterium que codificam a toxina termo- 15 lábil LT ou a subunidade A da toxina termo-lábil LT de Eseheriehia eoli que apresentam outras mutações em sua seqüência que objetivem um efeito equivalente, i.e. manutenção das propriedades adjuvantes do LT nativo e dimunuição ou supressão da toxicidade, estão também 20 contempladas na presente invenção. Tais mutações podem incluir, mas não estão limitadas às posições 72 e 192.

As cepas da presente invenção são obtidas a partir de qualquer cepa do genero Myeobaeterium como carreador para apresentação de um ou mais antígenos de organismos distintos, obtidos e clonados em vetor de expressão em micobactéria e inseridos por meio de manipulação genética.

Preferencialmente as cepas de Mycobacterium recombinantes da presente invenção compreendem cepas do 5 complexo de MTB, Mycobacterium tubereulosis, Mycobaeterium bovis, Myeobaeterium microft e Myeobaeterium afrieanum ou de micobactérias de crescimento rápido, Myeobaeterium smegmatis, M. aurum, M. vaeeae, entre outros.

Mais preferencialmente as cepas de Myeobaeterium recombinantes da presente invenção compreendem cepas de Myeobaeterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG).

Descrição das composições imunogênicas

A presente invenção refere-se a composições imunogênicas que compreendem uma ou mais cepas da presente invenção e um ou mais dentre um veículo, excipiente, diluente ou solvente fisiologicamente aceitáveis.

Preferencialmente as composições da presente invenção compreendem cepas de Myeobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), que codificam a toxina termo-lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG-LTK63.

Alternativamente, as composições da presente invenção compreendem preferencialmente cepas de Mycobaeterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), que codificam a subunidade A da toxina termo-lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG-LTAK63.

As composições da presente invenção podem ainda compreender uma mistura de cepas de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), que codificam a toxina termo-lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina,

i.e., rBCG-LTK63 e a subunidade A da toxina termo-lábil LT mutada na posição 63 de serina para lisina, i.e., rBCG- LTAK63.

As composições imunogênicas da presente invenção, 10 podem ainda compreender adicionalmente um ou mais antígenos, preferencialmente toxinas inativadas. Tais antígenos podem ser para uso na prevenção e/ou tratamento de tuberculose ou de outras doenças causadas por patógenos distintos. Os componentes inativados das composições 15 imunogênicas sinérgicas da presente invenção podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica, tais como procedimentos quimicos, como o tratamento com formaldeido ou água oxigenada, ou mesmo técnicas de recombinação de DNA.

De acordo com a presente invenção, adjuvantes são

moléculas, componentes, macromoléculas ou microorganismos atenuados ou mortos que potencializam a resposta às imunizações, reduzem a quantidade de antígeno necessária e direcionam o tipo de resposta imune a ser desenvolvida, além de sustentá-la por um período de tempo maior, como um imunógeno; é qualquer material ou substância que altera o tipo, a velocidade, a intensidade ou a duração da resposta imune.

As composições da presente invenção podem compreender

ainda excipientes, como bactericidas, bacteriostáticos, antioxidantes, conservantes, tampões, estabilizantes, ajustadores de pH, ajustadores de osmolaridade, agentes antiespuma e tensoativos; e resíduos de agentes de inativação ou fracionamento de antígenos, componentes de meios de crescimento e solventes comumente utilizados na produção de vacinas; exemplos destes tipos de componentes podem ser encontrados no Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases The Pink Book, 11a edição, seção "Vaeeine Exeipient & Media Summary" (Centers for Disease Control and Prevention. Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases. Atkinson W, Wolfe S, Hamborsky J, McIntyre L, eds. Ilth ed. Washington DC: Public Health Foundation, 2009) incorporado aqui como referência.

Conforme usado na presente invenção, o emprego do termo "farmaceuticamente aceitável" significa um sólido não-tóxico, inerte, excipiente líquido semi-sólido, diluente, formulação auxiliar de qualquer tipo, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como solução salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, os amidos, tais como 5 amido de milho e o amido de batata, a celulose e os seus derivados, tais como a carboximetilcelulose de sódio, a etilcelulose e o acetato de celulose, ciclodextrina; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girasol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de 10 milho e óleo de semente de soja; glicóis, tais como propilenoglicol, polióleos, tais como glicerinaglicol, sorbitol, manitol e de polietileno; ésteres, tais como o laurato etílico, oleato etílico, ágar; agentes tamponantes, tais como o hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio; 15 ácido algínico; água livre de pirogênio; salina isotônica, solução de Ringer; soluções tampões de álcool etílico e fosfato, assim como outras substâncias não tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas.

Uma variedade de vias de administração das composições 20 imunoterápicas e vacinas descritas na presente invenção está disponível. O modo particular selecionado dependerá do princípio ativo em particular selecionado, a dosagem necessária para eficácia terapêutica e do paciente ao qual será administrada a composição. Os métodos da presente invenção, geralmente, podem ser praticados usando qualquer modo de administração biologicamente aceitável, i.e., qualquer modalidade que produzir niveis eficazes de resposta imune sem causar efeitos adversos clinicamente 5 indesejáveis. Tais modos de administração incluem as vias intradérmica, oral, retal, sublingual, tópica, nasal, transdermal ou parenteral. 0 termo "parenteral" inclui subcutânea, intravenosa, epidural, irrigação,

intramuscular, bombas de liberação, ou de infusão.

Particularmente, nesta invenção as vias intradérmica, oral, parenteral e nasal são preferidas para administração das composições aqui reivindicadas.

Para a administração parenteral, os princípios ativos podem igualmente ser dissolvidos em um veículo farmacêutico

e administrados como uma solução, emulsão, incluindo micro e nanoemulsões, ou suspensão. Exemplos de veículos apropriados são água, salina, soluções de dextrose, soluções de frutose ou óleos de origem animal, vegetal ou sintéticos.

Para a administração nasal, os princípios ativos podem

ser dissolvidos em um veículo farmacêutico e administrados como uma solução, emulsão, incluindo micro e nanoemulsões, ou suspensão. Exemplos de veículos apropriados são água e solução salina ou suspensões sólidas, como spray, lactose, frutose ou flocos de quitosana. Outros veículos podem também conter outros ingredientes, por exemplo, preservativos, agentes suspensores, agentes solubilizantes, tampões e similares.

Preferencialmente as composições imunogênicas da

presente invenção são para administração intradérmica, oral e parenteral.

Propriedades das cepas e das composições imunogênicas da presente invenção

As cepas e as composições imunogênicas da presente

invenção apresentam um efeito sinérgico inesperado sobre a resposta imunológica contra Mycobacterium. Os antígenos recombinantes do LTK63 ou LTAK63 apresentam o efeito técnico inesperado de induzir um efeito adjuvante contra as proteínas do próprio Myeobaeterium.

Conforme poderá ser visto nos Exemplos abaixo, as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção apresentam o efeito técnico inesperado de provocar uma resposta imunológica anti-TB mais intensa quando comparadas 20 a vacinas compreendendo BCG tradicional. Ou seja, a adição de um domínio imunogênico, como por exemplo a subunidade não-tóxica LTAK63 da toxina termo-lábil de E. eoli, que sabidamente não tem nenhuma ligação com nenhum tipo de micobactéria, em uma micobactéria recombinante, em partiular BCG, provoca um aumento da resposta protetora contra tuberculose.

Em particular as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção promovem uma diminuição da carga bacilar no pulmão em modelos animais de tuberculose.

Além disso, as cepas e as composições imunogênicas da presente invenção levam a um aumento significativo da expressão de IFN-γ em relação ao grupo controle, uma citocina considerada essencial na resposta contra 10 tuberculose; este fato sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl.

As cepas e as composições imunogênicas da presente invenção levam também a um aumento significativo de TNF-a. Uma vez que o TNF-α é relacionado como sinalizador da ação 15 pro-inflamatória, caracterizando a fase aguda do processo inflamatório desencadeado pelos bacilos, então as vacinas da presente invenção promovem a ativação direta do sistema imune.

Finalmente podemos concluir que as cepas e as 20 composições imunogênicas da presente invenção, ao combinar micobactérias, em particular BCG, e toxinas de outros patôgenos, preferencialmente de Escherichia eoli, gerando uma cepa de micobactéria recombinante, constituem uma nova vacina, mais potente e eficaz que o BCG convencional para a profilaxia ou imunização para tuberculose.

Uso das cepas e das composições imunogênicas da presente invenção.

Considerando as propriedades das cepas de 5 Mycobacterium recombinantes e das composições imunogênicas da presente invenção, constitui outro aspecto da presente invenção o uso das composições imunogênicas para a prevenção de infecções causadas por micobactérias, em partcular Myeobaeterium tubereulosis em animais, mais 10 particularmente humanos.

Constitui um outro aspecto da presente invenção o uso de uma ou mais cepas de Myeobaeterium recombinantes ou de uma ou mais composições imunogênicas da presente invenção na manufatura de uma vacina.

Mais particularmente, constitui um aspecto da presente

invenção o uso de uma ou mais cepas de Myeobaeterium recombinantes ou de uma ou mais composições imunogênicas da presente invenção na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de tuberculose e/ou infecções causadas por micobactérias.

Constitui ainda um outro aspecto da presente invenção métodos de prevenir ou tratar tuberculose em animais, mais particularmente humanos.

EXEMPLOS Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos, são apresentados abaixo, como exemplos, os resultados dos diferentes ensaios efetuados com relação a esta invenção.

No Exemplo 1 é descrita a obtenção das vacinas da presente invenção. Nos demais Exemplos (2 a 3) são ilustradas as propriedades e o uso da vacina da presente invenção. Estes Exemplos são apresentados a titulo 10 meramente ilustrativo e não devem ser de forma alguma considerados como limitativos do âmbito e do alcance da presente invenção.

EXEMPLO 1: Obtenção das vacinas rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63

Este exemplo descreve a obtenção das vacinas rBCG- LTK63 e rBGC-LTAK63.

a) Preparação de lote estoque de BCG competente: para preparação de estoques de BCG competente, uma ou mais colônias de BCG foi cultivada em meio liquido Middlebrook 7H9 mais Tween-80 e suplementado com albumina-dextrose- 20 catalase 10% (MB7H9/Tw/ADC) até a fase exponencial. Composição do meio Middlebrook 7H9 de acordo com o fabricante (Difco-BD): Sulfato de Amônio, Ácido L- Glutâmico, Citrato de Sódio, Piridoxina, Biotina, Di- Fosfato de Sódio, Mono-fosfato de Potássio, Citrato de Amônio Férrico, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco e Sulfato de Cobre. Em seguida, a cultura foi sedimentada por centrifugação a 4000 rpm e lavada duas vezes com glicerol 10% a 4°C, sendo finalmente re- 5 suspendida em 5% do volume original com glicerol 10% e armazenada à -70°C até ser transformada por eletroporação com o plasmídeo pNL12-LTK63 ou com o plasmídeo pNL12- LTAK63.

b) Construção do vetor de expressão do gene LTK63 em BCG recombinante aqui denominado de pNLl2-LTK63; o vetor de expressão de micobactéria usado para expressão de LTK63 em BCG recombinante é denominado pMIP12 e foi descrito por Le Dantec [Le Dantec et al. 2001 J Bacteriol. 183: 2157-2164]. O gene LTK63 foi gentilmente cedido pelo Dr. Rino Rappuoli (Novartis) . 0 vetor de expressão em BCG recombinante do gene LTK63 foi construído usando métodos convencionais de biologia molecular. 0 gene LTK63 foi amplificado por PCR usando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: N- terminal (5'- TAGGGTACCCAAAAATATAACTTCATTTTTTTTATTTT-3"), contendo o sítio de restrição Kpn I (sublinhado) e C- terminal (5'- TAGCTGCAGCTAGTTTTT CATACTGATT GCCC-3'),

contendo o sítio de restrição Pst I (sublinhado). 0 produto de PCR correspondente ao gene LTK63 foi gerado usando as seguintes condições de PCR: 94°C por 4 minutos; 25 ciclos de 94°C por 1 min, 50°C por 1 min e 72°C por 30 s; e 4°C final. Esse produto de PCR foi então digerido com as enzimas de restrição Kpn I e Pst I e então clonado no vetor de expressão pMIP12, que foi também previamente digerido 5 com as mesmas enzimas Kpn I e Pst I, gerando assim o vetor de expressão denominado de pMIPl2/LTK63.

Seqüência gênica do plasmídeo pNP12-LTK63: GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAG CTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGA GTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG TGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGA ATTCGAGCTCGACTTAATTAACTCCGGGTGGTCACTGAGTACATCCCGTCGGTGCGTTC GGCATCGGTCGGGGTGTGGGTGGGTGTCGGCTCCCGCGACGAAGGACGAAGCGTCGCGG GTGCCGCCCACTTCTTGGAGCATCTGCTGTTCAAGGCCACCCCGACGCGCACGCGGTCG ACATCGCGCAGGCTGTCGATGCCGTCGGCGGTGAGCTGAACGCGTTCACCACGCGCGAG CACACCTGTTACTACGCGCATGTGCTCGACTCCGACCTGGAGCTCGCGGTCGACCTGGT GCGCCGATGTCGTGTTGCGTGGGCGTTGTGCCACCGAGGATGTCGAAGTGGAGCGCGAC GTCGTCCTCGAGGAGATCGCCATGCGTGACGACGATCCCGAGGACAGCCTCGGCGACGT GTTCCTCTCGGCGATGTTCGGCGATCACCCGGTGGGACGTCCGGTGATCGGCAGCGTCG 2 0 AGTCGATCGAGACCATGACGCGTGCACAGCTGCATTCGTTCCACGTCCGGCGTTACACA CCCGAACGGATGATCGTGGCGGTGGCCGGCAACGTCGACCACGACGTGTGGTGTCGTTG GTCCGAGAGCATTTCGGCCCCCGGCTGGAGGCCGACGTTCCGCGGTGGCTCCCCGTAAG GCTCGGGACGGGTCGGTGGTAAGCCATCGCTGCTCGTGGTCGACCGCGACGGGGAACAG TCCCATGTCTCGCTGGGCGTTCGCACGCCCGGCCGGCACTGGGAGCACCGGTGGGCCCT GTCGGTGTTGAACACCGCGCTGGGAGGCGGGCTCAGTTCTCGTCTGTTCCAACAGATTC GCGAGTCCCGCGGCCTGGCCTACCTCGGTGTACTCGACCGTGGACCACTTCGCGACAGC GGGGCTCTGTCGGTGTATGCGGGATGTCAGCCGGAACGTTTCGACGAAGTGGTGCGGGT GACCACCGAAGTTTTGGAAGGTGTTGCCAGAGACGGGATCACCGCCGACGAATGCCGGA 5 TCGCCAAAGGCTCGTTGCGCGGTGGGCTGGTGCTCGGCCTGGAGGATTCCGGATCACGT ATGCACCGGATCGGCCGTAGCGAGCTCAATTACGGTGgAGCACCGGACCATCGACCACA CGCTGGCCCAGATCGAGGCAGTCACTCTAGAAGAGGTCAACGCCGTCGCTCACCAGTTG CTGTCGCGGGACTACGGTGCCGCCGTACTCGGTCCCTATAGTTCGAAAAAGGCGCTGCC ACAACAGCTTCAAACTATCGCCGGCTGACCCGCTACACTGGGTCCAATGGATTAGAAGG IO AGAAGTACCGATGGGATCCGGTACCAATGGCGACAGATTATACCGTGCTGACTCTAGAC CCCCAGATGAAATAAAACGTTCCGGAGGTCTTATGCCCAGAGGGCATAATGAGTACTTC GATAGAGGAAC T CAAAT GAATAT TAAT C T T TAT GAT CAC GCGAGAGGAACACAAAC CGG CTTTGTCAGATATGATGACGGATATGTTTCCACTAAGCTTAGTTTGAGAAGTGCTCACT TAGCAGGACAGTCTATATTATCAGGATATTCCACTTACTATATATATGTTATAGCGACA 15 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CATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGT TACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAG AGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTG IO ATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGCAGGGGGGG GGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGAACGAGGA CAGTCGCACGACGAAGTTCTTCTGGATCGCGCCCGTGCTGGAAGCACTCAACCTCGAAG CGTGTGGTTGCGGAGCCATCTAGCAACCACACGAAACATGCGCAACGAACCGCGCAACG AACAACGCCTAGAACTGGCCCTAGATGAGCTGACTCGTATCGTTGGTAAACCTAGTTTG 15 ACCAGCATGTTTTAACTACGTTCGGTGAGCTGTCAACGGGGCCTGTAACGGCACAACGA ACCGTGCAACGAGAGTGGCCACGGATGCCACCACAGGCACTACAACGGAGTTCGCCACG TACATCACCACAACCACCGATTCTGGCGGTGAGCTCCCCGATATTCAGCGGAAATGGCT TGGTATCGACCAAGATTCGTAGAACCCCGTCTCGTCTGGCTGGTATTCAAAACGGGCGC AACGAAACACGCAACGAGACAGGCATGGCCCAAACCAGAAAACTAGCGTCTACCAGGAC 2 O TTTTACCTGTCCGACCCGTTGCAACGGAACCCCCCACGGAACCCCCGCGACACCCGCTC CCCAATTGCGTTAGAACAGCGGTGGATTGTCGGCTTCGTTGTGGGCCTTTTGAGCCGCT TCCTGTTCTGCCGCACGCTCTTTCCTCGCCCGATAGCCGAGTCGCTTAACGGTGTCCAG 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CGGATGGGACCCCCGGGCGCTGAGCGCTCGGAGCGCTGCGTCTGGATGGTCTACGTCCA CGACCAGCAGGTTTGCCAGCGCTGTTGGGTTCGCCTCGATGTACCGGCGGCCTAGGGCC GACGCGCGGCTTTGGCGGTAGATCCCCTCGAGCAGATCGTCGCTTGCCAGCGGCCAGTA CGGCAGCCAGAGCTGCTCAAATTCGTCGGCGACGTGGCTCACGCTTGGTAGTAGACCAC GATTAATCACCGGTGTATGGTCCGACACGAGCTCCAAGTCAGATATTTCGCTGAGGGGC 2 O CACCCCACAACTGCACACTCCCCCGCTCTCCCGTCGAGCCCTGGTGGTGGAACACCAGC GACAGCCGAGCACCCCCAACCACCTGTACCAACCAGGAGGAACACATGCGTCGTTTCGA GGACGTTTCCGGGCCGCTGAGAGCCGCTGTGGCGGCCGTACACGCCGCCTTAGACCCGT TAGACCCCCTGCCGCCTGAATGCGCGGGTACGAGCCACACAGCGCCCGAACTTACGGAG CTGGTGGGCTCACCTGGCTTTATGGCGTACGAATCGGCTGTGTGCGACCTGTTGGGCGA GGTGAGGTACGCGCTACTCACGCTGGCAAGGGCGACACAGCCGCCCCACCGAGCCCGCA CGGCCGCGCGCGGTGTCAACAACCGGGTGAGTCGTGCACACCAGCAGGTGTTCGAGGCT TGGCTCGAAGTGCAGGACATCGTGGCGAACGCCGCCCGATGAGCCGCGCCTTACGCTGG CTGCCAGCCGTTCGCGGGCTGGTTGGTGCAGCGCGTCGAGCGGTTAGAGGCCCTGCGGT 5 GTTCCACCACCGCAGGGCCTCGCCCTTTTTAAGGCTGAATTTGCTTGTCTCCGAATCCA ACTGGCTTGTCCAAGGGTGTATCTACGCTTAATCCAAAGTTCAAACGAGGGGATTACAC ATGACCAACTTCGATAACGTTCTCGGCTCGATCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGA AAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTG AACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTT IO CAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAAT GCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCA AATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGT TTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTA TCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAA 15 AAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGC AAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATC AAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAA ATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGG AACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTG 20 GAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGA TAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATC TCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGC 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GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGG ACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGG GGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCG ATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCT TTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCC 2 O CCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAG CCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA

c) Construção do vetor de expressão do gene LTAK63 em BCG recombinante aqui denominado de pLNl2-LTAK63: o vetor de expressão em BCG recombinante do gene LTAK63 foi construído usando métodos convencionais de biologia molecular. 0 gene LTAK63 foi amplificado por PCR a partir do gene LTK63 usando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: N-terminal (5'-

5 TAGGGATCCAATGGCGACAGATTATACCGTTG-3') , contendo o sítio de restrição BamH I (sublinhado) e C-terminal (5'- TAGGGTACCTAATTCATCCCGAATTCTGTTATA-3 ) , contendo o sítio de restrição Kpn I (sublinhado). 0 produto de PCR correspondente ao gene LTAK63 foi gerado usando as seguintes condições de PCR: 94°C por 4 minutos; 25 ciclos de 94°C por 1 min, 50°C por 1 min e 72°C por 30 s; e 4°C final. Esse produto de PCR foi então digerido com as enzimas de restrição BamH I e Kpn I e então clonado no vetor de expressão pMIP12, que foi também previamente digerido com as mesmas enzimas BamH I e Kpn I, gerando assim o vetor de expressão denominado de pLNIP-LTAK63. Seqüência gênica do plasmídeo pNL12-LTAK63 GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAG CTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGA 2 0 GTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG TGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGA ATTCGAGCTCGACTTAATTAACTCCGGGTGGTCACTGAGTACATCCCGTCGGTGCGTTC GGCATCGGTCGGGGTGTGGGTGGGTGTCGGCTCCCGCGACGAAGGACGAAGCGTCGCGG GTGCCGCCCACTTCTTGGAGCATCTGCTGTTCAAGGCCACCCCGACGCGCACGCGGTCG ACATCGCGCAGGCTGTCGATGCCGTCGGCGGTGAGCTGAACGCGTTCACCACGCGCGAG CACACCTGTTACTACGCGCATGTGCTCGACTCCGACCTGGAGCTCGCGGTCGACCTGGT GCGCCGATGTCGTGTTGCGTGGGCGTTGTGCCACCGAGGATGTCGAAGTGGAGCGCGAC GTCGTCCTCGAGGAGATCGCCATGCGTGACGACGATCCCGAGGACAGCCTCGGCGACGT 5 GTTCCTCTCGGCGATGTTCGGCGATCACCCGGTGGGACGTCCGGTGATCGGCAGCGTCG AGTCGATCGAGACCATGACGCGTGCACAGCTGCATTCGTTCCACGTCCGGCGTTACACA CCCGAACGGATGATCGTGGCGGTGGCCGGCAACGTCGACCACGACGTGTGGTGTCGTTG GTCCGAGAGCATTTCGGCCCCCGGCTGGAGGCCGACGTTCCGCGGTGGCTCCCCGTAAG GCTCGGGACGGGTCGGTGGTAAGCCATCGCTGCTCGTGGTCGACCGCGACGGGGAACAG IO TCCCATGTCTCGCTGGGCGTTCGCACGCCCGGCCGGCACTGGGAGCACCGGTGGGCCCT GTCGGTGTTGAACACCGCGCTGGGAGGCGGGCTCAGTTCTCGTCTGTTCCAACAGATTC GCGAGTCCCGCGGCCTGGCCTACCTCGGTGTACTCGACCGTGGACCACTTCGCGACAGC GGGGCTCTGTCGGTGTATGCGGGATGTCAGCCGGAACGTTTCGACGAAGTGGTGCGGGT GACCACCGAAGTTTTGGAAGGTGTTGCCAGAGACGGGATCACCGCCGACGAATGCCGGA 15 TCGCCAAAGGCTCGTTGCGCGGTGGGCTGGTGCTCGGCCTGGAGGATTCCGGATCACGT ATGCACCGGATCGGCCGTAGCGAGCTCAATTACGGTGgAGCACCGGACCATCGACCACA CGCTGGCCCAGATCGAGGCAGTCACTCTAGAAGAGGTCAACGCCGTCGCTCACCAGTTG CTGTCGCGGGACTACGGTGCCGCCGTACTCGGTCCCTATAGTTCGAAAAAGGCGCTGCC ACAACAGCTTCAAACTATCGCCGGCTGACCCGCTACACTGGGTCCAATGGATTAGAAGG 2 O AGAAGTACCGATGGGATCCGGTACCAATGGCGACAGATTATACCGTGCTGACTCTAGAC CCCCAGATGAAATAAAACGTTCCGGAGGTCTTATGCCCAGAGGGCATAATGAGTACTTC GATAGAGGAACTCAAATGAATATTAATCTTTATGATCACGCGAGAGGAACACAAACCGG CTTTGTCAGATATGATGACGGATATGTTTCCACTAAGCTTAGTTTGAGAAGTGCTCACT TAGCAGGACAGTCTATATTATCAGGATATTCCACTTACTATATATATGTTATAGCGACA 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CGAACCGCGCAACGAACAACGCCTAGAACTGGCCCTAGATGAGCTGACTCGTATCGTTG GTAAACCTAGTTTGACCAGCATGTTTTAACTACGTTCGGTGAGCTGTCAACGGGGCCTG TAACGGCACAACGAACCGTGCAACGAGAGTGGCCACGGATGCCACCACAGGCACTACAA 2 0 CGGAGTTCGCCACGTACATCACCACAACCACCGATTCTGGCGGTGAGCTCCCCGATATT CAGCGGAAATGGCTTGGTATCGACCAAGATTCGTAGAACCCCGTCTCGTCTGGCTGGTA TTCAAAACGGGCGCAACGAAACACGCAACGAGACAGGCATGGCCCAAACCAGAAAACTA GCGTCTACCAGGACTTTTACCTGTCCGACCCGTTGCAACGGAACCCCCCACGGAACCCC CGCGACACCCGCTCCCCAATTGCGTTAGAACAGCGGTGGATTGTCGGCTTCGTTGTGGG CCTTTTGAGCCGCTTCCTGTTCTGCCGCACGCTCTTTCCTCGCCCGATAGCCGAGTCGC TTAACGGTGTCCAGATGCAGCCCGAAATGTTTGGCCGTTTGCGGCCAAGAGTGGCCCTC GTCGTCGTGATAGGCGCGGATGCGTTCGCGGCGTGCAGCCTGCTCGGCGAGCCACTCGC TGCGTTCCTGCGCCACGAGCCGGACGACGTGGCGTTCGGATAGTCCGGTGATTCGAGCG 5 CCTTCGGCGGCGGTCACGCGCCGCTTTTTGCGGACAGTCGGCTGCCGGTTGTAGCCGTC GCTGTAGCCGTCGCTCATAGCAATGCCTCCATGGCTGACGCGGACTTTGCGCGCCGCGC AACTGTGCTCGCCGCCGTGCGCGCTGCTGCGCCCTTCCGCGAGATGGCCGACTGGCGCG CACTGAGTGTGGCCTCGTAGACCACGATCCCGTCCGCCCAAATGCGCGACTTGGTTGTG 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TAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTA IO ATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAAC GTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGA GATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGC GGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCA GCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTC 15 AAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGC TGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATA AGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACG ACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGA AGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGA 2 O GGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTC TGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCT TTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGAT ACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA e) Obtenção da cepa de BCG recombinante expressando LTK63, rBCG-LTK63: para preparação de rBCG-LTK63, uma alíquota estoque de 50-200 μΐ de BCG competente foi misturada com 0,1-1 pg de pNL12-LTK63, em cubetas de 5 eletroporação de 2 mm e esta submetida a pulsações de 2,5 kV, 25 pF e 1000 Ω, num eletroporador de pulsação (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, UK). Após eletroporação, o conteúdo das cubetas foi recuperado em 2 mL de meio (MB7H9/Tw/ADC) sem antibiótico e incubado a 37°C 10 por 20 h antes de ser semeado em meio sólido Middlebrook 7H10 (Difco), suplementado com ácido oléico-albumina- dextrose-catalase 10%(MB7H9/OADC) mais canamicina (20 yg/mL) para seleção dos transformantes. Composição aproximada do meio sólido Middlebrook 7H10 de acordo com o 15 fabricante (Difco-BD): Sulfato de Amônio, Mono-fosfato de Potássio, Bi-Fosfato de Potássio, Citrato de Sódio, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco, Sulfato de Cobre Ácido L-Glutâmico, Citrato de Amônio Férrico, Hidrocloreto de Piridoxina, Biotina, Verde de Malaquita e 20 Agar. As colônias de rBCG selecionadas foram então transferidas para 5 mL de meio líquido de cultura MB7H9/Tw/ADC com canamicina (20 pg/mL).

e) Obtenção da cepa de BCG recombinante expressando a s-ubunidade A LTAK63, rBCG-LTAK63: para preparação de rBCG- LTAK63, uma alíquota estoque de 50-200 μΐ de BCG competente foi misturada com 0,1-1 pg de pLN12-LTAK63, em cubetas de eletroporação de 2 mm e esta submetida a pulsações de 2,5 kV, 25 pF e 1000 Ω, num eletroporador de pulsação (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, ÜK) . Após eletroporação, o conteúdo das cubetas foi recuperado em 2 mL de meio (MB7H9/Tw/ADC) sem antibiótico e incubado a 37°C por 20 h antes de ser semeado em meio sólido Middlebrook 7H10 (Difco) suplementado com ácido oléico-albumina- dextrose-catalase 10%(MB7H9/OADC) mais canamicina (20 pg/mL) para seleção dos transformantes. Composição aproximada do meio sólido Middlebrook 7H10 de acordo com o fabricante (Difco-BD): Sulfato de Amônio, Mono-fosfato de Potássio, Bi-Fosfato de Potássio, Citrato de Sódio, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco, Sulfato de Cobre Ácido L-Glutâmico, Citrato de Amônio Férrico, Hidrocloreto de Piridoxina, Biotina, Verde de Malaquita e Agar. As colônias de rBCG selecionadas foram então transferidas para 5 mL de meio líquido de cultura MB7H9/Tw/ADC com canamicina (20 pg/mL).

g) Preparação dos lotes de rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63: Em seguida, os clones destas duas cepas foram expandidos para 50 mL de meio líquido MB7H9/Tw/ADC ou em qualquer meio descrito para cultivo de micobactérias mais canamicina (20 pg/mL) . Após 2-3 semanas, quando o cultivo atinge DC>6oo 0,6-

0,8, as amostras foram centrifugadas, lavadas duas vezes com H2O destilada, resuspendidas em 1 mL de glicerol 10% e aliquotadas em volume de 50 μΐ e então armazenadas a -80°C, para posterior utilização nos ensaios de imunização.

h) Avaliação dos Lotes de rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63: a viabilidade dos lotes de rBCG-LTK63 e rBCG-LTAK63 foi avaliada por meio de contagem do número de unidades formadoras de colônia (UFC) . 0 número de UFC foi

determinado como segue: uma ou mais alíquotas do lote congelado a -80°C foram descongeladas e realizadas várias diluições sucessivas (lxlO2, IxlO4, IxlO5 e IxlO6) . Em seguida as diluições IxlO5 e IxlO6 foram plaqueadas em meio MB7HlO/OADC mais kanamicina (20 pg/mL) e incubadas a 37°C.

Após 3-4 semanas fez-se a contagem do número de colônias na placa.

i) Caracterização da expressão de LTK63 em BCG recombinante

Uma vez que não foi possível determinar a

expressão do gene LTK63 pelo método clássico de imunoensaio, a caracterização da expressão LTK63 foi realizada de maneira indireta pela confirmação da presença do gene LTK63 no plasmídeo dentro do BGC recombinante. Essa caracterização foi realizada através de ensaio de PCR utilizando iniciadores específicos, os mesmos já descritos acima e utilizados para amplificar e clonar o gene LTK63 no vetor pMIP12 (Figura 1).

j)Caracterização da expressão LTAK63 em BCG recombinante

Para verificação da expressão do gene LTAK63, foi utilizado um imunoensaio (Western blot), usando um soro policlonal anti-LT, procedendo-se da seguinte maneira: uma ou mais alíquotas estoques de rBCG-LTAK63 foram sonicadas 10 por 1,5 min sob gelo numa amplitude constante correspondente a metade do valor máximo (Soniprep 150 MSE, UK) e centrifugadas para precipitação de sólidos. Os sobrenadantes foram recuperados e a concentração de proteínas dosada usando o kit BIO-RAD Protein Assay (Bio- 15 Rad), utilizando albumina bovina como padrão. Amostras contendo 10 pg de proteínas totais foram aplicadas em gel de poliacrilamida 10% em presença de duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE 10%). A eletroforese foi realizada à temperatura ambiente a 120 V até o corante atingir o final 20 do gel. Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana de PDVF com poros de 0,45 pm (GE Healthcare), utilizando-se um sistema de transferência semi-seco. O gel contendo LT, como controle positivo, foi colado sob a membrana de PDVF, mergulhado em tampão de transferência (Tris 0,25 Μ, ρΗ 8,3, glicina 0,129 M e metanol 20 %) e colocados entre cinco folhas de filtro também embebidos no mesmo tampão. O conjunto foi colocado entre duas placas e submetido a uma corrente de 120 mA por 1,5 h a temperatura 5 ambiente. Ao final da eletrotransferência, a membrana foi retirada do sistema e incubada em solução bloqueadora (PBS contendo leite 5% - PBS-L) a 4°C, durante toda noite. Ao término do bloqueio, a membrana foi incubada a temperatura ambiente por 2 h com soro anti-LT diluído em PBS-L 10 (diluição 1:1000). Após este período de incubação a membrana de PVDF foi lavada três vezes, sob leve agitação, com PBS/Tween20 0, 1% (PBS-T) , em intervalos de 10 min. A membrana foi então incubada por 2 h nas mesmas condições em PBS-L contendo anticorpo anti-IgG conjugado a HRP (Sigma, 15 Chem Co, St. Luis) e novamente lavada 3 vezes com PBS-T. A revelação foi feita por quimiluminescência usando o kit ECL (Amersham) por exposição em aparelho de fotodocumentação (ImageQuant LAS4000 - GE)(Figura 2).

EXEMPLO 2: Ensaio de resposta imunológica humoral e celular dos animais imunizados com rBCG-LTK63.

Foram utilizados camundongos das linhagens BALB/c (Mus musculus, Rodentia, Mammalia), fêmeas, adultas, com 6 a 8 semanas de vida, provenientes e mantidos nas condições padrões do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Os animais foram divididos em três grupos (n=30):

• Grupo BCG: animais imunizados por via subcutânea (s.c.) com 0,1 mL de suspensão de BCG (IxlO6 UFC/camundongo

suspensas em PBS IX) ;

• Grupo rBCG-LTK63: animais imunizados por via subcutânea (s.c.) com 0,1 mL de suspensão de rBCG-LTK63 (IxlO6 UFC/camundongo suspensas em PBS IX);

• Grupo rBCG-LTKA63: animais imunizados por via subcutânea (s. c.) com 0,1 mL de suspensão de rBCG-LTAK63

(IxlO6 UFC/camundongo suspensas em PBS IX);

• Grupo Controle: animais inoculados com 0,1 mL de salina (PBS IX).

a)Resposta humoral: para tal procedimento, os animais 15 imunizados ou inoculados com o controle, foram sangrados pela via retro-orbital um dia antes do desafio e o soro separado e aliquotado para posterior caracterização pelo método de ELISA. A análise da resposta humoral foi realizada comparando a concentração dos anticorpos e/ou 20 subtipos IgGl e IgG2a específicos contra PDS nos diferentes grupos de imunização. Para tal foi utilizada a curva padrão desses anticorpos detectados por anticorpos monoclonais específicos contra as respectivas imunoglobulinas. A análise comparativa da resposta de anticorpos IgGl e IgG2a induzida contra proteínas de micobactérias (PDS) é importante, uma vez que pode fornecer dados sobre o perfil ou comportamento da resposta imune contra essas proteínas.

Destacando que um perfil de resposta mais Thl e, portanto mais adequado para combater uma infecção por MTB, pode ser identificado através da relação IgGl/IgG2a (Figura 3).

b)Resposta celular: a avaliação da resposta celular dos grupos Salina, BC6 e rBCG-LTK63 foi feita pelos métodos de 10 ELISA e ELISPOT. Inicialmente os baços dos camundongos imunizados como descrito acima, foram removidos 30 dias após a primeira e única imunização, macerados e passados por peneiras com porosidade de 70 μιη (Cell strainer-BD Falcon, Bedford, MA) . Os esplenócitos, assim obtidos, de 15 cada grupo (Salina, BCG e rBCG-LTK63) foram contados em câmara de Neubauer e tiveram sua viabilidade avaliada através da coloração de azul de Trypan. Procedeu-se, então, à diluição celular em meio RPMI completo [RPMI 1640 (GIBCO Life Technologies), penicilina (100 U/ml), estreptomicina 20 (100 μg/ml) mais 10% de soro fetal bovino], na concentração de 2xl06 células/mL no ensaio de ELISA e IxlO5 células/mL no ensaio de ELISPOT, seguida de semeadura em placa de cultura celular de 24 poços sob o estímulo de PDS (2 pg/mL) e incubadas por 24 horas e 48 horas, respectivamente, a 37°C com atmosfera de CO2 a 5%.

No grupo tratado com rBCG-LTK63 observou-se um aumento significativo nos niveis de INF-γ e TNF-α em relação ao grupo BCG. Fato este, que sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl (Figuras 4 e 5).

EXEMPLO 3: Desenvolvimento do modelo animal de desafio contra tuberculose.

Foram utilizados camundongos das linhagens C57BL/6 ou BALB/c (Mus musculus, Rodentia, Mammalia), fêmeas, adultas, com 6 a 8 semanas de vida, provenientes e mantidos nas condições padrões do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Utilizou-se para os ensaios de desafio a cepa de Mycobacterium tuberculosis (MTB) 37HRv, a qual foi 15 cultivada em meio líquido MB7H9/Tw/ADC em estufa a 37 0C e 5% de CO2. A suspensão bacilar de MTB foi cultivada em meio 7H9/Tw/ADC por duas semanas e somente suspensões com no mínimo de 80% de bacilos viáveis foram usados para o desafio pela via intratraqueal. 0 cultivo bacilar foi 20 centrifugado a 4000 rpm e lavados duas vezes com igual volume do cultivo com PBS IX. Em seguida o sedimento foi ressuspendido em I mL de PBS IX e o número de bacilo estimado usando a escala de Macfarland.

O desafio intratraqueal seguiu o método previamente descrito [Pelizon et al. (2010) Neonatal BCG immunization followed by DNAhsp65 boosters: highly immunogenic but not protective against tuberculosis - a paradoxical effect of the vector? Scand J Immuno1. 71: 63-69]. Os camundongos 5 foram infectados com IxlO5 UFC de MTB viáveis ou inoculados com 100 pL de PBS (Tampão Fosfato Salina) intratraquealmente sob anestesia (200 pL de uma mistura de Quetamina/Xilazina).

Os animais foram acompanhados por quatro semanas. 10 Após este período todos foram sacrificados em câmera de CO2 e os pulmões retirados para serem processados. Um dos lóbulos de cada pulmão foi separado e macerado num volume total de 1 mL de solução de PBS IX. Em seguida esse material foi diluído serialmente e semeado em placas de 15 petri contendo meio sólido 7HlO/OADC. Trinta dias depois, o número de UFC foi determinado nas placas correspondentes a cada grupo de animais imunizados (Figura 6).

Claims (17)

1. Cepa de Mycobacterium recombinante caracterizada pelo fato de que codifica a toxina termo-lábil LT de Eseheriehia eoli mutada.

2. Cepa de Myeobaeterium recombinante caracterizada pelo fato de que codifica a subunidade A da toxina termo- lábil LT de Eseheriehia eoli mutada.

3. Cepa de Myeobaeterium recombinante de acordo com qualquer uma das reivinidicações 1 ou 2 caracterizada pelo fato de que a toxina termo-lábil LT Eseheriehia eoli é mutada na posição 63.

4. Cepa de Myeobacterium recombinante de acordo com a revindicação 3 caracterizada pelo fato de que a mutação é uma substituição de serina por lysina.

5. Cepa de Myeobaeterium recombinante de acordo com qualquer uma das reivinidicações 1 a 4 caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo consistindo de cepas de Myeobaeterium tubereulosis, Myeobaeterium bovis, Myeobaeterium mieroft, Myeobaeterium afrieanum, Myeobaeterium smegmatis, Myeobaeterium avium e Myeobaeterium vaeeae.

6. Cepa de Myeobaeterium recombinante de acordo com a reivinidicação 5 caracterizada pelo fato de que a cepa de Myeobacterium recombinante é uma cepa de Myeobaeterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG).

7. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de compreender ao menos uma cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin (BCG), recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um ou mais dentre um veículo, excipiente, diluente ou solvente fisiologicamente aceitáveis.

8. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 7 caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um ou mais antígenos.

9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivinidcações 7 ou 8 caracterizada pelo fato de ser para administração intradérmica, oral ou parenteral.

10. Uso de uma ou mais cepas de Myeobaeterium recombinantes conforme definidas nas reivinidicações 1 a 6 ou de uma ou mais composições imunogênicas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou infecções causadas por bactérias do gênero Mycobaeterium.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato de ser na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de doenças e/ou infecções causadas por Mycobacterium tuberculosis.

13. Uso de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo de ser na manufatura de uma vacina para prevenção e/ou tratamento de tuberculose.

14. Método de prevenir ou tratar doenças e/ou infecções causadas por bactérias do gênero Mycobacterium em animais caracterizado por ser administrada aos animais uma quantidade efetiva de uma ou mais cepas de Myeobaeterium recombinantes conforme definidas nas reivinidicações 1 a 6 ou de uma ou mais composições imunogênicas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.

15. Método de prevenir ou tratar tuberculose em animais, caracterizado por ser administrada aos animais uma quantidade efetiva de uma ou mais cepas de Myeobaeterium recombinantes conforme definidas nas reivinidicações 1 a 6 ou de uma ou mais composições imunogênicas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 7 a 9.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o animal é um mamífero.

17. Método de acordo com a reivindicação 16 caracterizado pelo fato de que o mamífero é um humano.