BRPI0905725B1 - vacina e embalagem farmacêutica - Google Patents

Abstract

VACINA, EMBALAGEM FARMACÊUTICA E PROCESSO PARA CRIAR UMA RESPOSTA IMUNE EM TECIDO CELULAR DE INDIVÍDUO. É fornecida uma vacina em que um poIipeptídeo ou combinação de peptídeos de M. tuberculosis é administrada a um indivíduo para suscitar uma resposta imune. A vacina polipeptídica é administrada como parte de uma estratégia de dose inicial-reforço (prime-boost) com a vacina BCG para aumentar a imunoproteção em um indivíduo tal que a prevenção ou eliminação da doença seja alcançada. Finalmente, é provida uma embalagem farmacêutica que abrange uma vacina polipeptídica para M- tuberculosis que, quando administrada a um indivíduo suscita imunoproteção.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção se relaciona geralmente ao campo de vacinas recombinantes e métodos de vacinação. Mais especificamente, a presente invenção relaciona-se à administração de proteína de M. tuberculosis recombinante para uso em uma estratégia de imunização de dose inicial- reforço (“prime-boost”).

Antecedentes da invenção

[002] A cada ano 8 a 10 milhões de pessoas em todo o mundo desenvolvem tuberculose. Globalmente, a incidência de tuberculose está crescendo a uma taxa de 1% ao ano, principalmente devido ao rápido aumento da prevalência da doença na África. Em outras regiões, esforços bem sucedidos de controle começaram a estabilizar a incidência da doença. Todavia, estima-se que aproximadamente 2.000.000.000 de pessoas, o equivalente a um terço da população mundial, estejam infectadas por bacilos de Mycobacterium tuberculosis, os micróbios que causam TB. (Organização Mundial de Saúde 2006, Fatos sobre Tuberculose).

[003] A necessidade de encontrar novos tratamentos e estratégias de vacinação para a tuberculose é enfatizada pela crescente taxa de infecção por HIV em todo o mundo, tal que atualmente, 250.000 mortes por TB sejam associadas ao HIV. A tuberculose por si só é o segundo maior assassino da humanidade, com mais de 2 milhões de mortes que ocorrem anualmente em todo o mundo (Organização Mundial da Saúde 2006, Fatos sobre Tuberculose). A vacina do bacilo Calmette- Guérin (BCG) de Mycobacterium bovis atenuada é a única vacina contra a tuberculose atualmente licenciada para uso humano. A vacina BCG é eficaz contra as formas pediátricas graves e extrapulmonares da tuberculose. Entretanto, a proteção contra a tuberculose pulmonar do adulto nos países em desenvolvimento é pobre, com a proteção do adulto variando entre 0 e 80% (Fine P.E.M., Lancet 2000; 346:1339-1345). A eficácia variável da vacinação contra a tuberculose parece estar centralizada geograficamente. Por exemplo, no Reino Unido aproximadamente 75% de proteção foi observado (Hart P. D. e Sutherland L., BMJ, 1977; 2, 293-295). Em contraste, estudos clínicos na Índia e no Maláui falharam em demonstrar proteção consistente contra a tuberculose pulmonar (Fine, PE, et al. Scand J Infec Dis, 2001; 33:243-45; Ponnighaus J.M., Lancet, 1992; 339:636-639).

[004] Como a única vacina eficaz para TB é a vacina BCG, os esforços de pesquisa atuais estão focados na melhora da eficácia da BCG (Dietrich G., Vaccine, 2003, 21:667-670). Por exemplo, a vacina BCG recombinante superexpressando proteína de fusão do antígeno Ag85B, o antígeno secretado precocemente (ESAT-6) e IFN-Y aumentou os títulos de anticorpos específicos e respostas imunes celulares em relação à vacina BCG padrão, à vacina BCG recombinante expressando Ag85B sozinho, ou à vacina BCG recombinante expressando uma proteína de fusão de Ag85B e ESAT-6 (Xu Y., FEMS Immunology and Medical Microbiology, 2007;51:480-487). ESAT-6, uma proteína produzida por Mycobacterium tuberculosis virulenta, está ausente em cepas da vacina BCG padrão e está atualmente submetida a estudo intenso como uma subunidade vacinal potencial contra a tuberculose. Por exemplo, vacinas de DNA que codificam o ESAT-6 combinadas com imunização com BCG em camundongos subsequentemente desafiados com H37Rv de tuberculose mostraram melhorar o interferon gama específico de ESAT-6 (Fan X., Scandinavian Journal of Immunology Oct. 4, 2007; 66:523-528).

[005] Além dos estudos sobre novas vacinas de subunidade, estratégias de dose inicial-reforço estão atualmente sob investigação como um método para melhorar a imunogenicidade contra BCG (Goonetilleke N. P., Journal of Immunology 2003; 171:1602-1609; SH Kaufmann, Nature Reviews Immunology 2001; 1:20 - 30). Estratégias de dose inicial-reforço comumente empregam vacinas de DNA. Por exemplo, quando uma vacina de DNA expressando Ag85B foi administrada a um modelo murino para M. tuberculosis seguida por reforço com a vacina BCG, foi observada melhora na eficácia protetora sobre a vacina BCG sozinha (Feng C.G., Infectious Immunology 2001; 69:4174- 4176). De maneira similar, injeção de DNA codificando as proteínas de M. tuberculosis Apa, HSP-65 e HSP-70 seguida subsequentemente por vacinação com BCG convencional também melhorou a proteção contra o desafio de tuberculose em camundongos (Ferraz, Infection and Immunity 2004; 72:6945- 6950).

[006] Imunizações tradicionais são geralmente administradas através de uma via intramuscular ou subcutânea. Entretanto, a tuberculose é fundamentalmente uma doença respiratória. Assim, proteção contra infecção e subsequente erradicação da doença pode ser melhor executada por administração direta na mucosa respiratória (Kallenius, et al. Tuberculosis (Edinb), 2007; 87:257 - 66). Vacinação intranasal pode ter vantagens sobre outras vias de administração tal como o fato da vacinação intranasal não ser influenciada por uma imunidade sistêmica pré-formada, enquanto a vacinação parenteral é menos eficaz em indivíduos com anticorpos pré-existentes (van Savage J. M., Journal of Infectious Disease 1990; 161:487-492).

[007] É importante contornar a existência de anticorpos pré-existentes em regiões geográficas onde uma vacina aperfeiçoada contra a tuberculose é mais necessária. Sugeriu- se que a imunidade Th2 basal prévia resultante de exposição prévia a helmintos e microbactérias saprófitas diminui a habilidade da vacina BCG em induzir imunoproteção (Rook, Vaccine, 2005; 23:2115-2120). Adicionalmente, considera-se que a vacinação intranasal poderia ser eficaz na prevenção de infecções por M. tuberculosis no hospedeiro (Kauffman SH., Nature Reviews of Immunology 2006; 6:699-704). Estudos em animais de vacinação intranasal mostraram eficácia protetora aumentada quando comparada à via subcutânea de vacinação (Giri, PK. et al. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 2005; 45:87-93; Chen, L. et al. Infection and Immunity, 2004, 72:238-246).

[008] Embora estudos sobre vacina BCG viva ou morta, vacinas de subunidade proteica, vacinas de vetor bacteriano recombinante, vacinas de DNA plasmático ou abordagens de imunização combinatória em sistemas tanto humanos como animais tenham sido submetidos a estudo preliminar, pouco se sabe quanto a qual método produz a resposta imune mais robusta e o maior nível de proteção no indivíduo. Adicionalmente, detalhes a respeito de características da resposta imune induzida por cada tipo de vacina ainda estão para ser completamente elucidados. O aumento da prevalência da infecção tuberculosa e aumento da resistência, particularmente no mundo em desenvolvimento, criam uma necessidade de uma vacina contra a tuberculose e estratégia de vacinação melhoradas.

Sumário da invenção

[009] É fornecida uma vacina que aumenta uma resposta imune em um indivíduo onde a vacina inclui pelo menos um polipeptídeo de M. tuberculosis, polipeptídeo que é opcionalmente Ag85A, Ag85B, MPT-64, Pst-Sl, Apa, GroES, GroEL, DnaK, CFP- 10, Rv0831c e Rvl324, porções destes, combinações destes, ou múltiplos destes. Essas proteínas recombinantes são purificadas opcionalmente em sua forma natural ou elas compreendem adicionalmente um marcador adequado para purificação. Os polipeptídeos de M. tuberculosis são opcionalmente recombinantes.

[010] Uma vacina da invenção opcionalmente contém uma emulsão. Agentes emulsificantes adequados incluem biovetores supramoleculares (SMBV), nanopartículas, lipossomos, ou combinações destes.

[011] Uma vacina da invenção opcionalmente contém um adjuvante. Adjuvantes adequados ilustrativamente incluem brometo de dimetil dioctadecil-amônio (DDA); monofosforil lipídio A (MPL); LTK63, sal de amônio quaternário lipofílico- DDA, DDA-MPL, sais de alumínio, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de potássio e alumínio, Montanide ISA-51, ISA-720, micropartículas, complexos imunoestimulantes, lipossomos, virossomos, partículas semelhantes a vírus, oligonucleotídeos CpG, toxina da cólera, toxina termolábil de E. coli, lipoproteínas, células dendríticas, IL- 12, GM-CSF, nanopartículas incluindo ilustrativamente nanopartículas de fosfato de cálcio, combinação de óleo de soja, agentes emulsificantes e etanol para formar uma nanoemulsão; AS04, ZADAXIN, ou suas combinações.

[012] Também é fornecido um processo para aumentar uma resposta imune em um indivíduo em que um polipeptídeo de M. tuberculosis é administrado ao indivíduo. A administração é opcionalmente através de vias que incluem intradérmica, transdérmica, subcutânea, intramuscular, intranasal, em aerossol, oral, sublingual, intravaginal, per rectum, intravenosa, intramucosa, ou outros métodos de distribuição conhecidos na técnica. O processo para aumentar uma resposta imune opcionalmente emprega a administração a um indivíduo de uma segunda vacina, que é opcionalmente Ag85A, Ag85B, MPT-64, Pst-Sl, Apa, GroES, GroEL, DnaK, CFP-10, e Rv0831c Rvl324 ou suas combinações, epítopos de polipeptídeos acima mencionados ou seus peptídeos. Opcionalmente, a administração de uma vacina BCG ocorre antes da administração de um polipeptídeo de tuberculose recombinante. Caso contrário, a administração de uma vacina BCG poderia ocorrer subsequentemente à administração de um polipeptídeo de tuberculose recombinante ou, opcionalmente, a administração de uma vacina BCG ocorre simultaneamente à administração de peptídeo (s), epítopo (s) ou polipeptídeo(s) de tuberculose(s) recombinante(s). A vacina BCG é opcionalmente recombinante (expressando um ou mais dos polipeptídeos mencionados acima) ou natural. Além disso, a administração de uma vacina BCG e/ou um polipeptídeo de tuberculose recombinante ocorre antes de, em concomitância com, ou após o indivíduo ser exposto a infecções por micobactéria ou desenvolver uma doença.

[013] Também é fornecida uma embalagem farmacêutica compreendendo pelo menos um polipeptídeo selecionado do grupo que compreende Ag85A, Ag85B, MPT-64, Pst-Sl, Apa, GroES, GroEL, DnaK, CFP-10, e Rv0831c Rvl324 ou combinações dos mesmos. Também um agente emulsificante e um adjuvante. O agente de emulsificação é opcionalmente um brometo de dimetil dioctadecil-amônio. Opcionalmente, o adjuvante é monofosforil lipídeo A.

Breve descrição das figuras

[014] A Figura 1 representa um SDS-PAGE (gel de gradiente de 4 a 20%) de proteínas de M. tuberculosis recombinantes novas purificadas processadas por coloração por prata, em que a raia 1 representa marcadores de peso molecular, a raia 2 é Rv0164, a raia 3 é Rv0831c e a raia 4 é Rvl324;

[015] A Figura 2 representa a cinética das respostas de células T induzidas por vacinação com BCG intranasal ou subcutânea;

[016] A Figura 3 representa a cinética da resposta de NO induzida por vacinação com BCG subcutânea ou intranasal;

[017] A Figura 4 representa a distribuição de células T específicas para filtrado de cultura de curto prazo (STCF) e para lisado celular total (WCL) de M. tuberculosis e de em compartimentos imunes locais e periféricos de indivíduos em momentos iniciais (6 semanas) e tardios (30 semanas) após a vacinação com BCG intranasal onde os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de três a seis determinações após a subtração das SFUs das respectivas culturas não estimuladas;

[018] A Figura 5 representa níveis de anticorpos específicos para lisado celular total (WCL) com M. tuberculosis e para filtrado de cultura de curto prazo (STCF) em fluidos corporais locais e periféricos de indivíduos em momentos iniciais (6 semanas) e tardios (30 semanas) após vacinação com BCG intranasal onde os resultados de medições de ELISA são apresentados como absorbância média de poços em triplicata a 492 nm ± desvio-padrão, após subtração da absorbância de poços controle;

[019] A Figura 6 representa a habilidade de antígenos recombinantes de M. tuberculosis em induzir respostas de célula T em indivíduos vacinados com BCG intranasalmente em momentos iniciais (3 semanas) e tardios (30 semanas), em que os resultados de ensaios de ELISPOT são apresentados como média ± desvio-padrão de determinações em duplicata após a subtração das SFUs das respectivas culturas não estimuladas;

[020] A Figura 7 representa a habilidade de antígenos recombinantes de M. tuberculosis em induzir resposta de célula T em indivíduos imunizados intranasalmente com a vacina de subunidade multicomponente 2 semanas após a imunização, em que os resultados de ensaios de ELISPOT são apresentados como média ± desvio-padrão de determinações em duplicata após a subtração das SFUs das respectivas culturas não estimuladas;

[021] A Figura 8 representa a resposta de anticorpos específicos para antígeno recombinante de M. tuberculosis em indivíduos imunizados intranasalmente com a vacina de subunidade multicomponente 2 semanas após a imunização, em que os resultados são apresentados como absorbância média a 492 nm ± desvio-padrão de determinação em duplicata após a subtração da absorbância de poços controle;

[022] A Figura 9 representa células T expandidas com Apa inibindo o crescimento intracelular de M. tuberculosis em macrófagos em 6 semanas pós-imunização;

[023] A Figura 10 representa respostas proliferativas específicas para imunógeno polipeptídico em indivíduos imunizados intranasalmente onde Rv0164, Rv0831c e Rvl324 são encapsulados individualmente em lipossomo catiônico e administrados individualmente;

[024] A Figura 11 representa respostas proliferativas específicas para imunógeno polipeptídico em indivíduos imunizados intranasalmente com a combinação de Rv0164, Rv0831c e Rvl324 encapsulada em lipossomo catiônico;

[025] A Figura 12 representa a distribuição de células T específicas para imunógeno polipeptídico nos pulmões, CLN e baço de indivíduos imunizados intranasalmente com um único polipeptídeo codificando Rv0164, Rv0831c ou Rvl324;

[026] A Figura 13 representa respostas de anticorpo de isotipo e alótipo específico para imunógeno polipeptídico no lavado nasal e soro de indivíduos imunizados com Rv0164, Rv0831c ou Rvl324 recombinante encapsulado em lipossomo catiônico em 2 e 4 semanas após a imunização;

[027] A Figura 14 representa respostas de anticorpo de isotipo e alotipo específico para imunógeno polipeptídico no lavado nasal e soro de indivíduos imunizados com combinação de Rv0164, Rv0831c e Rvl324 recombinantes encapsulada em lipossomo catiônico em 2 e 4 semanas após a imunização;

[028] A Figura 15 representa a habilidade comparativa de adjuvante DDA-MPL controle, Ag85A recombinante (rAg85A), APA recombinante (rApa) e , Apa nativa (nApa) de M. tuberculosis em induzir resposta Th1 (IFN-Y e IL-2) em camundongos BALB/c imunizados intranasalmente com a respectiva vacina de subunidade proteica ou com adjuvante DDA-MPL sozinho para pulmão, linfonodos cervicais (CLN) ou células esplênicas;

[029] A Figura 16 representa a habilidade comparativa de DDA-MPL controle, Ag85A recombinante, APA recombinante e Apa nativa de M. tuberculosis em induzir a resposta Th2 ou Thl7 em camundongos BALB/c imunizados intranasalmente com a respectiva vacina de subunidade proteica ou adjuvante DDA-MPL sozinho para pulmão, CLN e células esplênicas;

[030] A Figura 17 representa a frequência de células secretoras de citocinas Th1 (IFN-Y e IL-2) em culturas de célula esplênica, linfonodo cervical (CLN) e pulmão de camundongos imunizados com subunidade e em simulação em seguida a desafio com BCG de M. bovis in vitro em quatro semanas pós-imunização em culturas de célula esplênica, CLN e pulmão; e

[031] A Figura 18 representa a frequência de células secretoras de citocina Th2 (IL-4) e Thl7 (IL-17) nas culturas de célula esplênica, linfonodo cervical (CLN) e pulmão de camundongos imunizados com subunidade e em simulação em seguida a desafio com BCG de M. bovis in vitro em quatro semanas pós-imunização.

Descrição detalhada das modalidades preferidas

[032] O aumento da prevalência de HIV aumenta a necessidade de uma vacina contra M. tuberculosis que tenha eficácia tanto em pacientes pediátricos como adultos no mundo desenvolvido e em desenvolvimento. A presente invenção tem utilidade como uma nova vacina contra Mycobacterium.

[033] Para atender a ampla gama de eficácia da vacina BCG contra a tuberculose, uma nova estratégia inventiva é fornecida para reforçar a resposta imune gerada após a administração de uma vacina BCG. Para este fim, as proteínas secretadas de M. tuberculosis representam uma valiosa fonte de antígenos para uso no reforço da eficácia da vacina BCG. A presente invenção fornece uma vacina que utilizada sozinha ou em conjunto com BCG, aumenta a resposta imune de um indivíduo. Uma modalidade preferida da presente invenção utiliza pelo menos um polipeptídeo de M. tuberculosis. Polipeptídeos adequados na presente invenção incluem qualquer polipeptídeo expresso por M. tuberculosis virulenta em um indivíduo. Polipeptídeos adequados para uso na presente invenção incluem opcionalmente Ag85A, Ag85B, MPT-64, Pst-Sl, Apa, GroES, GroEL, DnaK, CFP-10 e Rv0831c Rvl324, porções dos mesmos, combinações dos mesmos, ou múltiplos. Seus múltiplos significam ilustrativamente mais de um tipo de sequência polipeptídica ou mais de uma cópia de uma única sequência polipeptídica. Polipeptídeos adequados na presente invenção são opcionalmente recombinantes ou naturalmente derivados.

[034] De preferência, polipeptídeos adequados na presente invenção são recombinantes e obtidos por métodos conhecidos na técnica. Ilustrativamente, uma sequência nucleotídica é clonada em um plasmídeo que é transfectado em E. coli e expresso. Para facilitar procedimentos de purificação, os polipeptídeos expressos a partir de E. coli incluem opcionalmente uma sequência marcadora. Exemplos ilustrativos de marcadores adequados para uso na presente invenção incluem marcador de poli-histidina, CBP, CYD (peptídeo NorpD covalente ainda que dissociável), strep-2, FLAG, HPC ou cadeia pesada de peptídeo de proteína C, ou sistemas de marcador de proteína de fusão GST e MBP. Aprecia-se que outros sistemas de marcadores sejam operáveis de maneira similar. Em uma modalidade preferida, polipeptídeos recombinantes são expressos em E. coli e purificados usando um sistema de marcador de afinidade, seguido pela clivagem enzimática do marcador, tal como pela incorporação de um fator Xa, trombina, ou outro sítio de clivagem enzimática no polipeptídeo expresso. Métodos de clivagem de marcador são conhecidos na técnica e qualquer método eficaz é apreciado como sendo adequado para uso na presente invenção.

[035] Em uma modalidade preferida, uma vacina multicomponente é empregada. A vacina de multissubunidade contém opcionalmente um grupo de polipeptídeos individuais ou um único ou família de proteínas de fusão em que cada uma das proteínas, opcionalmente, representa uma única proteína expressa pela M. tuberculosis virulenta. De preferência, uma vacina de nove polipeptídeos nove é empregada. Aprecia-se que cada antígeno ou polipeptídeo individual é individualmente adequado para uso na presente invenção. Inesperadamente, a administração de uma vacina multicomponente aumenta a imunogenicidade de cada um dos componentes individuais. Assim, a modalidade preferida de uma vacina de nove subunidades demonstra imunogenicidade sinérgica.

[036] O termo indivíduo é ilustrativamente um organismo vivo capaz de montar uma resposta imune para desafio por uma vacina. Exemplos não limitantes de um indivíduo incluem um ser humano, qualquer primata inferior, cão, gato, coelho, rato, camundongo, porquinho-da-índia, porco, criceto, cavalo, burro, phalangeriforme, gambás, texugo, cabra ou outros mamíferos ou não mamíferos.

[037] O termo resposta imune é ilustrativamente qualquer alteração do sistema imune de um indivíduo em resposta ao desafio por uma vacina, fita nucleotídica, anticorpo, antígeno, célula, tecido, organismo infeccioso ou estranho de outro modo, ou outra substância imunoestimulante reconhecida na técnica. Exemplos não limitantes de respostas imunes incluem secreção in vitro de IL-2, IL-4, ou IFN-y em células T CD4+ e CD8+; proteção do desafio após M. tuberculosis H37Rv ou outro organismo infeccioso; alteração nos níveis de nitrito; respostas de citocina Th1 e Th2 em vários compartimentos imunes; alteração nos níveis de anticorpo de alotipo e de isotipo; reconhecimento de antígeno in vitro, respostas de célula B; inibição do crescimento do bacilo de M. tuberculosis em macrófagos infectados; sobrevivência; ou outra resposta conhecida na técnica.

[038] O termo polipeptídeo é ilustrativamente uma cadeia de dois ou mais resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade preferida, um polipeptídeo adequado para uso na presente invenção é a sequência de aminoácidos para a proteína Rv1860 (Apa), proteína natural ou recombinante inteira, mutantes destas, porções, epítopos ou peptídeos destas, homólogos destas, ou a sequência de Apa combinada com outra(s) sequência(s) peptídica(s). A sequência de Apa é encontrada no número de acesso YP_177849.

[039] De preferência, a vacina inventiva é uma vacina multicomponente. Uma vacina multicomponente ilustrativamente inclui nove antígenos polipeptídicos tais como Ag85A, Ag85B, MPT-64, Pst-Sl, Apa, GroES, GroEL, DnaK e CFP-10. Polipeptídeos de Mycobacterium tuberculosis H37Rv representativos operacionais como candidatos para inclusão em uma vacina junto com suas respectivas sequências de nucleotídicas: Ag 85 A (Rv3804c): ID do gene: 886132; ID da proteína: NP_218321 Ag 85 B (Rvl886c): ID do gene: 885785; ID da proteína: NP_216402 MPT-64 (Rvl980c): ID do gene: 885925; ID da proteína: NP_216496 Pst-Sl (Rv0934): ID do gene: 885724; ID da proteína: YP_177770 Apa (Rvl860): ID do gene: 885896; ID da proteína: YP_177849 GroES (Rv3418c): ID do gene: 887583; ID da proteína: NP_217935 GroEL (Rv0440): ID do gene: 886354; ID da proteína: NP_214954 DnaK (Rv0350): ID do gene: 885946; ID da proteína: NP_214864 CFP-10 (Rv3874): ID do gene: 886194; ID da proteína: NP_218391 CFP-31 (Rv0831c): ID do gene: 885349; ID da proteína: NP_215346 CFP-32 (Rvl324): ID do gene: 886897; ID da proteína: NP_215840 MTSP-17/CFP-15 (Rv0164): ID do gene: 886267; ID da proteína: YP_177617

[040] Os polipeptídeos são de preferência de cepas de laboratório ou de isolados clínicos de M. tuberculosis, mas também podem ser de M. bovis, BCG de M. bovis, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis, M. ulcerans ou outra origem de Mycobacterium. A vacina é compreendida opcionalmente por concentrações equimolares de cada antígeno, mas aprecia-se que concentrações molares únicas de cada antígeno também sejam adequadas na presente invenção. Uma vacina exemplar distribuiria um total de 90 μg de mistura de antígenos recombinantes por dose composta por 10 μg de antígeno para um indivíduo pequeno ou até ou superior a 1000 μg de cada antígeno para um indivíduo humano. As vacinas são administradas de forma compatível com a formulação de dosagem, e em quantidade que será profilaticamente, terapeuticamente eficaz e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, incluindo, por exemplo, a capacidade do sistema imune do indivíduo para montar uma resposta imune, e o grau de proteção desejado. Intervalos de dosagem adequados são da ordem de várias centenas de microgramas de ingrediente ativo por vacinação com um intervalo preferido de cerca de 0,1 até 1000 μg. Regimes adequados para administração inicial e injeções de reforço também são variáveis, mas são caracterizadas por uma administração inicial seguida por inoculações subsequentes ou outras administrações. A dosagem da vacina dependerá da via de administração e irá variar de acordo com a idade da pessoa a ser vacinada e, em menor grau, com o tamanho da pessoa a ser vacinada.

[041] Surpreendentemente, distribuição intranasal (i.n.) dos resultados vacina de multissubunidades acima citados em respostas imunes específicas de pulmão para cada um dos nove antígenos individuais. O nível de reconhecimento de cada antígeno é único com o nível de células secretoras de IFN-Y ordenados a partir de:Apa>MPT-64>DnaK>Pst-Sl>GroEL>GroES>Ag85A>Ag85B>CFP-10.

[042] Este padrão de reconhecimento antigênico também foi observado em outros compartimentos imunes. Entretanto, um imunoensaio de citocina baseado em microesfera multiplexada apresentou a maior resposta à Ag85A, Ag85B e Pst-Sl quando os níveis de IL-2 foram medidos. (Tabela 2).

[043] Em uma modalidade preferida, uma vacina contém um único antígeno polipeptídico. De preferência, o antígeno é a proteína de secreção Apa micobacteriana também conhecida como o complexo de proteico de 45/47-kDa, ou como a proteína do gene ModD. (Romain, F. et al., Infect. Immun., 1993; 61:724- 750.) Apa é secretada como uma proteína glicosilada com nove glicoformas. (Horn, C, et al., J. Biol. Chem. 1999; 274:32023-32030.) Estudos anteriores demonstraram que a glicosilação de Apa é necessária para antigenicidade in vitro e in vivo. (Romain, R, et al., Infect Immun, 1999; 67:5567- 5572). Esses autores apresentam três explicações possíveis para o requerimento de glicosilação para que seja suscitada uma resposta imune. Primeiro, respostas específicas para glicopeptídeo foram relatadas quando da imunização com outros glicopeptídeos, implicando que tanto a estrutura peptídica como a glicosilação interagem com o receptor de linfócito T (Carbone, FR, e Gleeson PA, Glycobiology, 1997; 7:725-730; Deck B, et al., J Immunol, 1995; 155:1074-1078; Haurum, JS, et al., J Exp Med, 1994; 180:739-744). Segundo, os receptores responsáveis por suscitar respostas imunes podem ser de natureza inespecífica tal que a manosilação de muitos antígenos seja reconhecível por um único tipo de receptor. (Stahl, PD e Ezekowitz, RAB, Curr Opin Immunol, 1998; 10:50- 55). Finalmente, a presença ou ausência de glicosilação poderia alterar a captação ou processamento de tais moléculas por macrófagos ou células dendríticas. Acredita-se que a antigenicidade de Apa esteja relacionada com a presença de glicosilação. Entretanto, o efeito da glicosilação na imunogenicidade de célula B e T de APA não foi avaliado em detalhe após vacinação com subunidade proteica.

[044] Do mesmo modo, a estratégia de dose inicial-reforço de Romain, et al. foi bem sucedida em suscitar uma melhora da resposta imune em seguida a dose inicial com uma vacina de DNA trivalente incluindo vetores codificando Apa, Hsp70, Hsp65 seguida por reforço com uma vacina BCG. O uso de vacinas de DNA produz antígenos glicosilados (Apa, etc.), conforme os antígenos são expressos em células hospedeiras. No caso de Romain, os antígenos de dose inicial foram submetidos à glicosilação de célula de mamífero durante a expressão e qualquer antigenicidade ou imunogenicidade é esperada como sendo o resultado da exposição ao antígeno glicosilado.

[045] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o polipeptídeo é produzido sem glicosilação. Em um exemplo não limitante, polipeptídeos são sintetizados em E. coli, que é reconhecida na técnica como incapaz de glicosilar corretamente uma proteína em relação a um tipo celular de mamífero ou M. tuberculosis. Aprecia-se que os outros meios sintéticos que não glicosilam o polipeptídeo são semelhantemente adequados. Assim, nesta modalidade, proteínas são livres de glicosilação. Visto que o alto grau de reconhecimento celular de Apa, por exemplo, é atribuível à presença de glicosilação, e todos os estudos prévios que analisaram a imunogenicidade e antigenicidade de Apa eram atribuíveis ao antígeno glicosilado, esperava-se que a ausência de glicosilação não traria resultados eficazes. Surpreendentemente, na presente invenção, a vacinação usando polipeptídeos não glicosilados resultou em imunogenicidade robusta.

[046] A presente invenção é adequada como uma vacina isolada, uma vacina de dose inicial, ou como uma vacina de reforço. De preferência, a presente invenção é usada em uma estratégia de dose inicial-reforço. De maior preferência, a presente invenção é usada como vacina de dose inicial. Quando utilizada como vacina de dose inicial, a presente invenção é ilustrativamente seguida por imunização com a vacina BCG ou outra(s) vacina(s) de subunidade/DNA. Em uma modalidade da invenção, uma única vacina de dose inicial de subunidade é empregada. De preferência, uma vacina em que o polipeptídeo é Apa. Aprecia-se que outros polipeptídeos são semelhantemente adequados. Nesta modalidade, a imunização com a proteína Apa é opcionalmente seguida por imunização com uma vacina de multicomponentes ou de subunidade única empregando ilustrativamente mais de uma proteína, além de ou com a exclusão de Apa. A distribuição de vacinações subsequentes ocorre opcionalmente dentro de um período de tempo curto ou longo. Em um exemplo não limitante, a segunda vacinação é distribuída dentro de um único dia ou semana. Senão, a segunda vacinação é distribuída após um ano ou após alguns anos. Aprecia-se que a distribuição de uma segunda vacina possa ser em qualquer momento durante a vida do indivíduo.

[047] De preferência, a segunda vacina é vacina de subunidade proteica ou mesmo vacina BCG (normal ou recombinante). A distribuição de uma segunda vacina ou vacina subsequente é opcionalmente pela mesma via de distribuição conforme a primeira imunização ou por uma via alternativa. Em um exemplo preferido, a vacina de dose inicial é distribuída por via intranasal. Uma vacina de reforço subsequente também é distribuída por via intranasal.

[048] Em uma modalidade preferida, a distribuição da vacina BCG ocorre antes do reforço com uma vacina de componente único ou de multicomponentes. De preferência, a vacinação com BCG é reforçada pela distribuição de uma vacina de multicomponentes. De maior preferência, a BCG é reforçada pela vacinação com uma vacina de componente único em que o componente único é um polipeptídio que codifica a proteína Apa. É apreciado de forma semelhante que a distribuição da vacina de reforço ocorra opcionalmente a qualquer momento durante a vida do indivíduo.

[049] A presente invenção é opcionalmente usada como uma vacina da combinação. Ilustrativamente, uma vacina BCG é complementada com uma vacina de componente único ou de multicomponentes. Esta estratégia permite a distribuição simultânea de uma vacina de polipeptídeo único, de multicomponentes, e BCG em qualquer combinação.

[050] Em uma modalidade preferida, uma vacina de componente único ou de multicomponentes compreendendo um único ou múltiplos polipeptídeos é distribuída pela via intranasal e uma vacina BCG é distribuída por uma via intradérmica ou subcutânea. De maior preferência, uma vacina de componente único ou de multicomponentes é distribuída por uma via intranasal e uma vacina BCG de reforço também é distribuída por uma via intranasal. Senão, a vacina BCG é dada por via intranasal ou percutânea e uma vacina de multicomponentes ou de componente único de reforço também é distribuída pela mesma via. Aprecia-se que os métodos de distribuição conhecidos na técnica são adequados para distribuir vacina por essas ou outras vias de entrada.

[051] A distribuição da vacina inventiva é opcionalmente administrada antes, durante ou após a infecção ativa ou inativa com TB ou após o desenvolvimento da doença sozinha ou em conjunto com quimioterapia antitubercular. Assim, a distribuição de uma vacina de componente único ou de multicomponentes é opcionalmente profilática, pós-infecção ou terapêutica. Em uma modalidade preferida, a presente invenção é projetada para prevenir ou eliminar a doença, ou para prevenir infecção. Opcionalmente, a distribuição de uma vacina de componente único ou de multicomponentes é terapêutica.

[052] O polipeptídeo é opcionalmente distribuído como polipeptídeo puro, em solução aquosa, em uma emulsão, ou em outras composições de distribuição adequada. Em uma modalidade preferida da presente invenção é entregue como uma vacina ou como um componente da vacina de uma embalagem farmacêutica. Opcionalmente, um polipeptídeo (ou múltiplos polipeptídeos) ou epítopos ou peptídeos imunogênicos estão presentes em uma emulsão composta por agentes de emulsificação adequados. Em uma modalidade preferida, uma vacina de multicomponentes é emulsificada ou encapsulada em um veículo vacinal adequado. De maior preferência, uma vacina de subunidade única é emulsificada. De maior preferência, um polipeptídeo codificando Apa é emulsificado. Agentes de emulsificação adequados ilustrativamente incluem biovetores supramoleculares (SMBV), nanopartículas tais como descrito por Major, M, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1997; 1327:32- 40, De Migel, I, et al., Pharm. Res., 2000; 17:817-824, Patente U. S. Nos. 6.017.513, 7.097.849, 7.041.705, 6.979.456, 6.846.917, 6.663.861, 6.544.646, 6.541.030, 6.368.602, Castignolles, N., et al., Vaccine, 1996; 14:1353- 1360, Prieur, E., et al., Vaccine, 1996; 14:511-520, Baudner B, et al., Infect Immun, 2002; 70:4785-4790; lipossomos tal como descrito por El Guink et al., Vaccine, 1989; 7:147-151, e em Patente U. S. No. 4.196.191; ou outros agentes conhecidos na técnica. Agentes adequados para uso estão geralmente disponíveis comercialmente.

[053] Opcionalmente, a presente invenção inclui co- distribuição de polipeptídeos com um adjuvante. Adjuvantes adequados ilustrativamente incluem brometo de dimetil dioctadecil-amônio (DDA); monofosforil lipídio A (MPL), enterotoxina termolábil de E. coli, derivados geneticamente modificados desta, LTK63, dimicolato de trealose e derivados sintéticos, sal de amônio quaternário lipofílicos-DDA, DDA- MPL, DDA-TDM, DDA-TDB, IC-31, sais de alumínio, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de potássio e alumínio, aqueles descritos na publicação de Patente U. S. 20070212329, adjuvantes poupadores de antígeno, Montanide ISA-51, ISA-720, micropartículas, complexo imunoestimulantes, lipossomos, virossomos, partículas semelhantes a vírus, oligonucleotídeos CpG, toxina da cólera, toxina termolábil de E. coli, lipoproteínas, células dendríticas, IL-12, GM-CSF, nanopartículas ilustrativamente, incluindo nanopartículas de fosfato de cálcio, combinação de óleo de soja, agentes emulsificantes e etanol para formar uma nanoemulsão; AS04 produzido pela Glaxo-Smith Kline (Middlesex, Reino Unido); ZADAXIN disponível a partir de SciClone Pharmaceuticals (Hong Kong); outros agentes conhecidos na técnica, combinações destes, ou fragmentos destes.

[054] A presente invenção é ilustrada adicionalmente com relação aos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplo 1

[055] BCG, produção de vacina de componente único e de multicomponentes: A vacina BCG (Copenhagen) foi provida como um padrão de referência de vacina pré-clínica de TB pelo Centro de Avaliação e Pesquisa Biológica, Food and Drug Administration (FDA), Betesda, EUA. A vacina BCG liofilizada foi ressuspensa em diluente de vacina (meio Sauton diluído; Statens Serum Institute, Copenhague, Dinamarca). Para produção de vacina de componente único ou de multicomponentes uma vacina de dose única consistiu em 10 μg de cada polipeptídeo emulsificado em DDA (250 μg/dose, Sigma-Aldrich, São Luís, MO) e MPL (derivado de Salmonella minnesota Re 595; 25 μg/dose, Sigma-Aldrich, São Luís, MO). A emulsão foi preparada como descrito por Sable SB et al., Vaccine, 2005; 23: 4175-4184. Resumidamente, MPL foi primeiramente misturado com água estéril livre de endotoxina (Burdick & Jackson, Muskegon, MI) contendo 0,2% de trietilamina (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). A mistura foi submetida a três rodadas de aquecimento em banho-maria a 70° C por 30 s e depois sonicação por 30 s. Uma emulsão foi preparada pela suspensão de DDA em água estéril e uma dispersão homogênea do pó foi obtida mediante o aquecimento da suspensão a 80° C por 5-10 min em banho-maria. Após resfriamento à temperatura ambiente, MPL e antígenos foram misturadas com DDA imediatamente antes da utilização.

Exemplo 2

[056] Produção de Polipeptídeo: Nove proteínas de M. tuberculosis H37Rv recombinantes (Tabela 1), lisado celular total (WCL), e proteínas de filtrado de cultura de curta duração (STCF) foram obtidas através do contrato TB Vaccine Testing and Research Material financiado pelo National Institute of Health (NIH)/National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), no Departamento de Microbiologia, Imunologia e Patologia, Universidade do Estado do Colorado, Fort Collins, Colorado. Tabela 1

[057] Alternativamente, polipeptídeos específicos foram clonados, expressos e isolados. Ilustrativamente, o isolamento e a caracterização foram realizados conforme descrito por Sable, S., et al., Infection and Immunity, 2005; 73:3547-3558 e Sable, S, et al., Vaccine, 2005; 23:4175-4184. Resumidamente, os iniciadores usados para clonagem e sequenciamento foram sintetizados na Instalação Central para Biotecnologia, Centros para Controle e Prevenção de Doenças. Os seguintes iniciadores para PCR Rv0164 (mtsp-171/TBl 8.5), Rv0831c (cfp-31) e Rvl324 (cfp-32) sequências gênicas encontradas no banco de dados do NCBI foram projetados especificamente para amplificar o gene correspondente e introduzir um sítio de reconhecimento para enzima de restrição BamHl/Ndel: Rv0164 em sentido direto, GCT CAT ATG ATG ACG GCA ATC TCG TGC TC (SEQ ID NO 1); Rv0164 reverso, GCT GGA TCC TTA GCT GGC CGC CAG CTG CTC GGC GC (SEQ ID NO 2); Rv0831c em sentido direto, GCT CAT ATG CTC CCC GAG ACA AAT CAG G (SEQ ID NO 3); e Rv0831c reverso, GCT GGA TCC TTA CTG GCG AAG CAG CTC AT (SEQ ID NO 4); Rvl324 em sentido direto, GCT CAT ATG ACG CGT CCG CGA CCC CCG C (SEQ ID NO 5); e Rvl324 reverso, GCT GGA TCC TCA GTA CAG CGC GTT GGC GAG (SEQ ID NO 6). Fragmentos de DNA foram obtidos por amplificação de PCR de DNA cromossômico de M. tuberculosis H37Rv com esses grupos de iniciadores, purificados em géis de agarose e clonados em vetor de clonagem TOPO TA (Invitrogen, CA, EUA). Colônias de E. coli (TOP 10) recombinantes putativas foram selecionadas em meio Luria-Bertani com canamicina (25 μg/mL). Plasmídeos foram extraídos e insertos foram confirmados por PCR, digestão por enzima de restrição e sequenciamento. Insertos clivados por BamHl/Ndel foram clonadas em fase no vetor de expressão pET19-b (Novagen, CA, EUA) e os plasmídeos resultantes foram confirmados por sequenciamento.

[058] O vetor de expressão pET19-b contendo o gene de interesse foi subsequentemente usado para transformar células de E. coli BL-21 (DE3) (Novagen; EMD Biosciences, CA, EUA). O gene que codifica a respectiva proteína recombinante foi induzido em meio Luria-Bertani contendo 100μg/mL de ampicilina com 0,25 mL de mM de IPTG (isopropil-β-D tiogalactosídeo) ao mesmo tempo da incubação por 16 h em um banho-maria a 25° C. As células foram lisadas com o kit Bugbuster (Novagen, CA, EUA), conforme as instruções do fabricante, e a proteína recombinante foi purificada a partir de corpos de inclusão usando a matriz de agarose de ácido nitrilotriacético-níquel (Ni-NTA) (kit de purificação His Bind; Novagen, CA, EUA) após solubilização na presença de 8 M de uréia, ou a partir da fração periplasmática solúvel conforme o protocolo do fabricante. A endotoxina foi removida das colunas antes da eluição com 0,5% de ASB-14 em tampão de lavagem, enquanto reenovelamento na coluna foi realizado conforme descrito por Oganesyan, N, et al., 2005; 1345-1371 IX. As preparações de proteína recombinante foram agrupadas e dialisadas contra 0,1 M de PBS (pH 7,2). Rv0164 e Rv0831c dialisados foram purificados adicionalmente por cromatografia líquida rápida para proteínas usando uma coluna Superdex-200 analítica (10/300; Amersham Pharmacia Biotech), equilibrada com o mesmo tampão. Rv 1324 foi purificada usando coluna de troca aniônica UNO Ql (Bio-Rad, CA, EUA), após diálise contra 20 mM de Tris-HCl (pH 8,2) e usando gradiente linear 0-1 M de NaCl. As frações foram analisadas por SDS-PAGE, o tampão trocado por PBS (pH 7,2) e concentrou-se na Centricon YM-3 (Millipore, MA, EUA). As proteínas recombinantes purificadas foram esterilizadas por filtração (0,22 μM; Millipore, MA, EUA) e quantificadas usando método de estimativa proteica microBCA (Kit de Ensaio para BCA QuantiPro; Sigma-Aldrich, MO, EUA). A identidade proteica foi confirmada adicionalmente por LC-MS-MS. O conteúdo lipopolissacarídico (LPS) nas preparações proteicas foi determinado pelo ensaio de lisado de amebócito de Limulus (kit para ensaio LAL-QCL-1000; Cambrex, MD, EUA), conforme protocolo do fabricante. As proteínas foram aliquotadas e estocadas a -70° C até uso adicional.

[059] A expressão das proteínas recombinantes foi obtida de modo consistente em rendimentos que variam de 1-2 mg/L para a proteína Rv0164, 4-5 mg/L para Rv0831c e 6-8 mg/L para Rvl324 como avaliado pelo método de micro BCA. Coloração por prata do gel (FIG. 1) realizada sob condições redutoras (SDS- PAGE; gradiente de 4-20%) revelou o peso molecular de 20,0 kDa para Rv0164 recombinante purificada, 33,0 kDa para Rv0831c recombinante e 37,0 kDa para a proteína Rvl324 recombinante. A identidade de proteínas purificadas foi confirmada adicionalmente por LC-MS-MS. Antes das proteínas serem utilizadas para imunização de indivíduos ou ensaios imunológicos in vitro, as preparações foram analisadas para contaminação com endotoxina (LPS). Em todos os casos, LPS estava presente em quantidades que não são suspeitas de interferir com experimentos de imunogenicidade in vivo ou in vitro (9,0 EU de LPS/mg de Rv0 164, 16 EU de LPS/mg de Rv0831c e Rvl324).

Exemplo 3

[060] Vacinação de indivíduos: Para indivíduos camundongos, a vacina BCG foi distribuída por vacinação subcutânea pela administração de 50 μL de uma suspensão de BCG (7x105 UFCs) injetados acima dos músculos glúteo máximo e bíceps femoral de ambas as pernas traseiras usando uma agulha de calibre 26. A vacina BCG foi administrada pela aplicação de um total de 30 μL da vacina BCG (7x105 UFCs) das narinas externas (15 μL por narina), utilizando uma micropipeta de ponta fina e permitindo que os camundongos inalem a suspensão para os pulmões naturalmente. Para todos os estudos, o diluente da vacina BCG foi usado como um controle para cada via de vacinação. A vacinação dos seres humanos é realizada de forma semelhante. A dosagem de BCG para seres humanos está entre 1-8 x105 UFC administrada intranasalmente ou por injeção subcutânea.

[061] A vacina de multicomponentes foi distribuída a camundongos por via intranasal três vezes em intervalos de 2- semanas, conforme descrito acima, exceto pelo uso de 90 μg de mistura de proteína de M. tuberculosis recombinante por dose (10 μg de cada polipeptídeo). Dosagem de seres humanos envolve a administração de 10-1000 μg de cada polipeptídeo. O intervalo de dose para em indivíduos animais grandes aproxima-se daquele de humanos com compartimentos receptores de tamanho similar. Pequenos animais requereram dosagem na extremidade inferior do espectro conforme o compartimento receptor é proporcionalmente menor em tamanho. Para todos os estudos a imunização em simulação foi realizada pela administração de salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,2) DDA-MPL.

Exemplo 4

[062] Coleta de amostra: Coleta de sangue de pequenos animais foi realizada por punção cardíaca sob anestesia em momentos-alvo. Grandes animais e seres humanos foram/serão extraídos intravenosamente em anticoagulante apropriado. Urina foi coletada por procedimentos estabelecidos. A lavagem nasal foi realizada por repetido fluxo nas narinas e trato respiratório superior associado dos camundongos sacrificados com 200 μL de PBS (pH 7,2) contendo coquetel de inibidores de protease livre de EDTA completo (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). Lavagens nasais, urina e soro foram armazenados a -20° C até o uso.

[063] Para os estudos com camundongos, amostras dos pulmões, baço, tecido linfóide associado ao nariz (NALT), linfonodos cervicais (CLN), linfonodos inguinais (ILN), linfonodos mesentéricos (LNM) e da medula óssea (BM) do fêmur e da tíbia foram assepticamente removidos e colocados em RPMI 1640 suplementado com 100 IU/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 1 mM de L-glutamina, 25 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 5 X 10-5 M de β-mercaptoetanol, vitaminas e aminoácidos não essenciais (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY) e 10% de soro fetal bovino inativado por calor e testado para endotoxina (SFB; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO). Células de exsudatos torácicos e peritoneais foram isoladas por lavagem das respectivas cavidades com meios RPMI 1640. Exemplo 5

[064] Isolamento de células imunes: Para isolar células do pulmão, camundongos foram sangrados por punção cardíaca sob anestesia e seus pulmões foram perfundidos através do ventrículo direito com PBS contendo 1OU mL-1 de heparina para remover leucócitos intravasculares. Os pulmões foram então perfundidos com uma mistura enzimática contendo 1 mg/mL de colagenase tipo IV (Sigma-Aldrich, São Luís, MO) e 25U mL -1 de DNase (Roche, Penzberg, Alemanha) em RPMI suplementado e cortados em pedaços pequenos uma placa estéril e os fragmentos foram incubados na mistura enzimática a 37° C por 1 h. Os fragmentos de pulmão digerido foram forçados com um êmbolo de seringa de 5 mL através de um coletor celular com poro de 70 μm de tamanho (BD Falcon, Bedford, MA) para obter uma única suspensão celular e eritrócitos foram lisados com tampão de lise RBC (eBioscience, São Diego, CA) por 4-5 min em temperatura ambiente. As células do pulmão foram lavadas, recuperadas por centrifugação e ressuspendidas em RPMI suplementado para contagem usando o método de exclusão por corante de azul de tripan. O NALT foi isolado como descrito (Asanuma, H, et al., J Immunol Methods, 1997; 202:123-131) e BM foi isolada pelo jorramento das cavidades femurais e de tíbias com RPMI. Suspensões celulares únicas do baço, linfonodos, BM ou NALT foram obtidas por moagem suave dos respectivos órgãos através de um filtro de células de 70 μm em 10-20 mL de RPMI suplementado. Suspensões celulares foram centrifugadas a 300xg por 10 min e os eritrócitos foram removidos por tratamento com tampão de lise RBC, quando necessário. As células foram lavadas várias vezes com RPMI fresco e a concentração celular foi ajustada em conformidade.

Exemplo 6

[065] Respostas Th1 da administração de BCG intranasal e subcutânea: Após a administração subcutânea ou intranasal a frequência e a distribuição de células-T antígeno-específicas secretoras de interferon-Y (IFN-y), IL-2 e IL-4 nos pulmões, baço e respectivos linfonodos de drenagem foram medidas ao longo de 12 semanas. As células foram isoladas conforme descrito acima com o número total de células obtidas, independente do tipo de imunização realizada. Respostas de IFN-y, IL-2 e IL-4 específicas para WCL de M. tuberculosis, foram avaliadas nos pulmões e baço após imunização com BCG tanto i.n. como s.c. (FIG. 1) por IFN-Y, IL-2 e IL-4 kits de ensaio de ELISPOT de acordo com o protocolo do fabricante. (BD-Biosciences, San Diego, CA).

[066] Mais células secretoras de IFN-Y, IL-2 e IL-4 foram encontradas no pulmão e CLN drenantes após imunização i.n. que após imunização subcutânea (s.c.) em todos os três momentos avaliados, exceto que mais SFUs secretoras de IL-4 específicas para WCL foram observadas nos pulmões após s.c. Imunização por BCG do que após imunização i.n. no tempo de 12 semanas (p<0,0001). Por outro lado, imunização com BCG s.c. induziu maiores respostas de IFN-Y, IL-2 e IL-4 WCL- específicas no ILN, que drena o flanco (o local de vacinação), e baço em relação às de imunização i.n. em todos os momentos avaliados, exceto para IFN-Y e IL-2, onde mais SFUs WCL-específicas foram observadas nos baços do grupo i.n. que no grupo s.c. no tempo de 12 semanas (p<0,01 e 0,05 para IFN-Y e IL-2, respectivamente).

Exemplo 7

[067] Produção de óxido nítrico após imunização com BCG sozinha: O acúmulo de nitrito (NO2-) no sobrenadante de células em cultura foi medido como um indicador da produção de óxido nítrico (NO) por um teste de Griess usando um padrão de nitrito de sódio, como descrito por Sable, S., et al., Eur Respir J 2007; 29:337-346. Sobrenadantes (100 μl) de 1 x 106 células mL-1 de cada estado estimulado com 10 μg mL-1 de WCL, ligante LPS-TLR-4 de E. coli (InvivoGen, São Diego, CA) ou meio RPMI sozinho após 96 h de cultura a 37° C foram analisados em triplicata, e a absorbância foi medida a 550 nm.

[068] Estimulação com WCL das culturas de células pulmonares de camundongos imunizados intranasalmente com BCG produziu níveis de nitrito significativamente mais elevados em todos os três tempos em relação aos camundongos imunizados com diluente intranasalmente (p<0,0001) ou imunizados subcutaneamente BCG (p<0,0001) (FIG. 3A). Níveis de nitrito induzidos por WCL em culturas celulares esplênicas após imunização com BCG subcutânea foram significativamente maiores que aqueles observados após imunização subcutânea com diluente em todos os três tempos (p<0,0001) e imunização com BCG intranasal nos tempos de 3 semanas (p<0,0001) e 6 semanas (p<0,05). Entretanto, no tempo de 12 semanas, a imunização com BCG intranasal induziu o aumento dos níveis de nitrito WCL-específicos no baço, em comparação com imunização com BCG subcutânea (p<0,05), embora os níveis em cada caso estivessem relativamente baixos (FIG. 3A).

[069] Além disso, descobriu-se que células do exsudato torácico e peritoneal após imunização com BCG intranasal produzem níveis significativamente maiores de nitrito após a estimulação com WCL (p<0,0001) que aqueles isolados após imunização com BCG subcutânea em 12 semanas (FIG. 3B).

[070] A habilidade de imunização com BCG i.n. em induzir respostas de citocinas Th1 (IFN-Y e IL-2) e Th2 (IL-4) específicas para micobactéria em vários compartimentos imunes locais e distantes foi avaliada utilizando ELISPOT e proliferação de linfócitos em 6 e 30 semanas após a imunização e duas preparações antigênicas de M. tuberculosis,STCF e WCL.

[071] Células isoladas de diferentes sítios foram semeadas em placas de cultura de tecidos de fundo chato de 96 poços estéreis (Costar, Corning, NY) com 1x106 células/mL em 100μl de RPMI-1640 suplementado. Células dendríticas (DC) derivadas de BM foram usadas a 5:1 linfócitos/DC. Para cada grupo de tratamento, as células foram estimuladas em triplicata ou quadruplicata tanto com 100 μL de 10 μg/mL do antígeno recombinante de M. tuberculosis purificado, combinação de antígeno, WCL, STCF ou Con-A em RPMI suplementado como um controle positivo para a viabilidade e reatividade celular ou meio sozinho como um controle negativo. As culturas foram incubadas em atmosfera úmida contendo 5% de CO2 a 37° C por 72 h. Um μCi de timidina-3H (Perkin Elmer, Wellesley, MA) foi adicionado a cada poço e após 18-20 h de incubação as células foram coletadas em filtros de fibra de vidro (Perkin Elmer, Wellesley, MA), usando um coletor de célula automatizado (TOMTEC, Inc. Hamden, CT). Depois de seco, a radioatividade incorporada foi contada usando um contador de cintilação β (Perkin Elmer, Wellesley, MA). A proliferação foi expressa como contagens médias por minuto (CPM) de culturas estimuladas por antígeno após subtração das contagens médias por minuto de culturas sem antígeno e o índice de estimulação (SI) foi calculado pela divisão das contagens médias por minuto em poços estimulados com antígeno pelas contagens médias por minuto em poços não estimulados.

[072] Imunização com BCG intranasal induziu tanto STCF como respostas de células T de longo prazo específicas para WCL nos pulmões, nos linfonodos locais que drenam a cavidade nasal (ou seja, CLN) e no baço (FIG. 4). Respostas de citocina fortes também foram observadas em 6 semanas pós- imunização no MLN que drena o trato gastrointestinal. Entretanto, as respostas específicas para STCF e WCL em MLN declinaram em 30 semanas. Células do exsudato peritoneal (PEC) demonstraram um aumento da resposta a partir de 6 semanas até 30 semanas de células secretoras de citocinas Th1 e Th2 específicas para STCF e WCL após imunização com BCG intranasal. Tanto SFUs secretoras de IL-2 e IFN-Y específicas para WCL e STCF também aumentaram de seis semanas a 30 semanas em células da medula óssea, enquanto SFUs de IL-4 específicas para WCL diminuíram de seis semanas a 30 semanas. NALT demonstrou tanto proliferação específica para STCF como para WCL em tempos iniciais (SI 12,15 e 18,60 em 6 semanas, respectivamente; CPM média da cultura não estimulada 720) e tardios (SI 10,26 e 12,52 em 30 semanas, respectivamente; CPM média da cultura do não estimulada 660).

[073] Níveis de alotipo (IgG e IgA) e isotipo (IgGl e IgG2a) de anticorpo específico para STCF e WCL foram avaliados no soro, lavado nasal e urina de camundongos imunizados com BCG intranasal. A imunização através de via intranasal induziu respostas significativamente elevadas de anticorpo antígeno-específico em 30 semanas, em comparação com o tempo de 6 semanas (FIG. 5) e foi caracterizada por predominância de níveis do alotipo IgG antígeno-específico no soro e de níveis de IgA no lavado nasal e urina.

Exemplo 8

[074] Respostas de IFN-y induzidas por polipeptídeos de M. tuberculosis após imunização com BCG intranasal: A habilidade de polipeptídeos de M. tuberculosis em serem reconhecidos por linfócitos T e B em 3 e 30 semanas foi avaliada e é ilustrada na FIG. 6.

[075] O reconhecimento de todos os antígenos foi maior nos pulmões e CLN no tempo de três semanas que em células do baço. Entre todos os antígenos avaliados, Apa induziu a mais forte resposta de IFN-y em três semanas, enquanto GroEL induziu a mais forte resposta de IFN-Y em 30 semanas. Em geral, as respostas de IFN-Y induzidas por Ag85A, Ag85B, Pst- Sl e GroES foram moderadas em comparação com aquelas induzidas por Apa ou GroEL. A resposta IL-2 induzida por Apa foi baixa em comparação com a resposta induzida por GroEL em todos os momentos avaliados. O padrão de reconhecimento antigênico avaliado em 30 semanas em MLN, PEC e BM foi semelhante àquele observado no pulmão, CLN e baço (FIG. 5), embora a magnitude das respostas antígeno-específicas tenha variado de órgão para órgão.

[076] Respostas de alotipo e isotipo antígeno-específicos no soro, lavado nasal e urina estavam baixas em três semanas. Entretanto, em 30 semanas, a mais forte resposta de anticorpo observada era contra proteínas do complexo Ag85 (média de IgG sérico a A492 1,189 ± 0,009 para Ag85B), seguidas por Pst-Sl, enquanto respostas de anticorpo específico para Apa foram moderadas (média a A492 intervalo 0,3-0,1) em comparação ao resto dos antígenos (média a A492 <0,1).

Exemplo 9

[077] Respostas de células T e de anticorpo após vacinação com polipeptídeo de multicomponentes: A frequência de células secretoras de citocinas Th1 e Th2 em diferentes compartimentos imunes após estimulação in vitro com polipeptídeos individuais é ilustrada na FIG. 7. Após imunização intranasal com coquetel de multicomponentes polipeptídicos DDA-MPL, todos os nove polipeptídeos foram mais fortemente reconhecidos por linfócitos T de pulmão que aqueles derivados de outros órgãos, conforme avaliado por ELISPOT (FIG. 7) e ensaio de proliferação de células T (captação de timidina 3H) . A ordem de reconhecimento de polipeptídeos individuais em termos de indução de células secretoras de IFN-Y em nível dos pulmões foi Apa>MPT- 64>Dnak>Pst-Sl>GroEL>GroES>Ag85A>Ag85B>CFP-10. O padrão de reconhecimento antigênico foi similar em todos os compartimentos imunes avaliados, com exceção de NALT, MLN, e BM. Embora Apa tenha induzido tanto células produtoras de IFN-Y como de IL-4 na maioria dos sítios após a imunização, a frequência de células secretoras de IL-2 foi baixa. Por outro lado, o complexo Ag85 (A e B), Pst-Sl e DnaK foram observados como sendo proeminentes indutores de células secretoras de IL-2.

[078] Os resultados de imunoensaios de citocina baseados em microesfera multiplexadas para medir indução de citocina por polipeptídeos individuais demonstraram que níveis elevados de IL-12 (p70), TNF-α, GM-CSF, IL-4 e IL-10 foram secretados em sobrenadantes de cultura de células pulmonares em resposta à estimulação por Apa. Entre os antígenos purificados avaliados Ag85A, Ag85B e Pst-Sl induziram a resposta mais forte de IL-2, enquanto níveis de IL-2 produzidos por Apa foram menores (Tabela 2).

[079] A habilidade de polipeptídeos individuais em induzir respostas de linfócitos T citotóxicos após a imunização com subunidade de multicomponente foi avaliada. Apenas Apa induziu citotoxicidade de macrófagos significativa (citotoxicidade percentual média de 30%) como observado por captação de vermelho neutro reduzida por células-alvo (dados não mostrados). Tabela 2

Exemplo 10

[080] Respostas de anticorpo específicas para polipeptídeo após imunização intranasal com multicomponentes: A imunização intranasal induziu predominantemente níveis de IgG imunógeno-específicos no soro, enquanto os níveis de IgA e IgG foram observados no lavado nasal (FIG. 8). Apa induziu respostas de isotipo IgA, IgGl e IgG2a proeminentes no lavado nasal, soro e urina, respectivamente. Pst-Sl, Ag85B e Ag85A também induziram fortes respostas humorais.

Exemplo 11

[081] Inibição de bacilos de M. tuberculosis em macrófagos infectados por Apa expandiu linfócitos após imunização com BCG: O efeito in vitro de linfócitos T efetores expandidos por antígeno sobre o crescimento de M. tuberculosis intracelular em macrófagos foi efetuado conforme descrito por Worku e Hoft, Infect Immun, 2003; 71:1763-1773 com as seguintes modificações. Macrófagos peritoneais de camundongos imunizados com BCG ou imunizados em simulação foram preparados pelo cultivo de células do exsudato peritoneal em placas de 24 poços (Costar, Cambridge, Mass.) e deixou-se os macrófagos diferenciarem-se por 5 dias na presença de células T peritoneais a 37° C. Após 5 dias, células não aderentes foram removidas por lavagem suave para obter população de macrófagos aderentes. Células efetoras, células pulmonares e esplenócitos (2x105 células/mL) de camundongos imunizados com BCG ou imunizados em simulação foram cultivadas por 5 dias em meio RPMI sozinho para servir como controles negativos de célula T em repouso ou estimulados por 5 dias com WCL (20 μg/mL) ou Apa (10 μg/mL) em placas de 24 poços. No dia 6, os macrófagos foram infectados com M. tuberculosis em uma multiplicidade de infecção de 1. Após 4 h, os bacilos extracelulares foram removidos por centrifugação em baixa velocidade (<1.000 rpm) e os macrófagos ressuspensos em meio fresco. Macrófagos infectados foram semeados a 1 x 106 células mL-1 em placas de 96 poços (100 μL poço-1) e co-cultivados com células efetoras esplénica ou pulmonares não aderentes (100 μL poço-1) em uma proporção de 1:1 por 72 h a 37° C com 5% de CO2. A enumeração de UFC em 72 h foi realizada por lise dos macrófagos com 0,06% de dodecil sulfato de sódio (Sigma-Aldrich, São Luís, MO) por 15 min. Três grupos de diluições seriadas de 10 vezes dos lisados de cada poço foram preparados em 0,05% de Tween- 80 (Sigma-Aldrich, São Luís, MO) e plaqueadas em ágar 7Hl 1. As colônias foram contadas após 3-4 semanas de incubação a 37° C com 5% de CO2. Porcentagens de inibição do crescimento de M. tuberculosis foram determinadas usando a seguinte fórmula: por cento de inibição = 100 - [100 x [(UFC de estimuladas por antígeno) / (UFC de células T em repouso em meio)]].

[082] Células T pulmonares isoladas seis semanas após imunização com BCG intranasal e expandidas com Apa exibiram maior inibição do crescimento de M. tuberculosis em macrófagos peritoneais em comparação com células T expandidas apenas por meio. (FIG. 9). Adicionalmente, a inibição foi significativamente maior que aquela concedida por células pulmonares isoladas após imunização com BCG subcutânea (p<0,01).

Exemplo 12

[083] Indução de respostas proliferativas após imunização intranasal com vacina de componente único: A habilidade de polipeptídeos individuais em induzir respostas proliferativas em células isoladas de pulmões, CLN, ou baço foi avaliada após imunização intranasal com uma vacina de polipeptídeo único ou múltiplo compreendendo polipeptídeo encapsulado com lipossomos catiônicos. A incorporação de timidina-3[H] foi avaliada como uma medida da resposta proliferativa. Células pulmonares demonstraram maior incorporação que células isoladas do baço após estimulação in vitro com polipeptídeos representativos. (FIG. 10) Os polipeptídeos Rv0831c e Rvl324 induziram resposta proliferativa comparável em diferentes órgãos-alvo, enquanto a resposta induzida por Rv0 164 foi baixa conforme avaliado nos tempos de 2 e 4 semanas. A imunização com polipeptídeo codificando Apa também induz uma forte resposta proliferativa após imunização intranasal que é observada igualmente em 2 semanas pós-imunização.

[084] Após imunização com uma combinação de Rv0831c, Rvl324 e Rv0164 (10 μg de cada proteína/dose), Rv0831c e Rvl324 induziram proliferação significativamente melhor em culturas de órgão-alvo após estimulação in vitro, em comparação com Rv0 164 (Fig. 11).

Exemplo 13

[085] Frequência de células secretoras de citocina imunógeno-específica após imunização intranasal única ou de multicomponentes: A habilidade de Rv0831c, Rvl324 ou Rv0164 em induzir células secretoras de citocina Th1 e Th2 foi avaliada por ELISPOT, conforme descrito no exemplo anterior. A imunização intranasal com Rv0831c demonstrou um maior número de células secretoras de IFN-Y, IL-2 e IL-4 em comparação com a imunização com Rv1324 ou Rv0164 em 2 e 4 semanas pós-imunização. (FIG. 12) A imunização com Apa produz altos níveis de células secretoras de citocina Th1 e Th2. A frequência de células secretoras de citocina específica para imunógeno individual foi superior em nível dos pulmões entre os três órgãos avaliados, comparáveis aos resultados dos ensaios de proliferação.

[086] Quando três polipeptídeos foram co-administrados intranasalmente, Rv0831c induziu maiores números de células secretoras de citocina que Rvl324 e Rv0164. Os níveis observados nos pulmões para a proteína Apa foram mais que duas vezes maiores que Rv0831c (compare as FIGS. 7 e 12). Exemplo 14

[087] Resposta de alotipo e isotipo imunógeno-específica no soro e lavado nasal após imunização intranasal única ou de multicomponentes: A resposta de imunoglobulina alotípica e isotípica foi medida 2 e 4 semanas pós-imunização por ELISA. Em resumo, imunoglobulina G total (IgG), imunoglobulina A (IgA), e isotipos de IgG IgGl e IgG2a específicos para antígenos recombinantes purificados e combinação de antígenos foram estimados. Deixou-se antígenos individuais ou mistura de antígenos ressuspendidos em uma concentração de 2 μg/mL em 100 μl de tampão de revestimento (0,05 M de carbonato, pH 9,5) ligarem-se a poços de placas de ELISA Maxisorp (Nalge Nunc International, Rochester, NY) por 2 h a 37° C. Após três lavagens com PBS-T, os poços foram bloqueados durante a noite a 4° C com 3% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma-Aldrich, São Luís, MO) em PBS-T. Amostras de soro ou lavado nasal (100 μl) foram adicionadas por poço em diluições de 1:200 ou 1:100, respectivamente, em PBS-T contendo 1% de BSA. Deixou- se a ligação antígeno-anticorpo proceder por 2 h a 37° C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS-T e 100 μl de anticorpos secundários anti-camundongo conjugados a peroxidase de rábano-picante (anti-IgG e IgA de camundongo, Sigma-Aldrich , São Luís, MO e anti-IgG1 e IgG2a de camundongo, BD-Biosciences, São Diego, CA) diluídos 1:1.000 em PBS-T contendo 1% de BSA foram adicionados aos respectivos poços. Após 90 minutos, as placas foram lavadas por seis vezes com PBS-T. A reação foi desenvolvida com o- fenilenodiamina (Sigma-Aldrich, São Luís, MO) e peróxido de hidrogênio em tampão de substrato citrato (pH 5,0). A reação foi interrompida após 20 min pela adição de 100 μl de 1 M de H2SO4 e a absorbância foi medida a 492 nm (A492).

[088] A imunização com Rv1324 demonstrou uma forte resposta de anticorpo imunógeno-específico em excesso àquela observada para Rv0831c e Rv0164. (FIG. 13) A resposta de anticorpo induzida por imunização intranasal com Rvl324 foi caracterizada por uma forte resposta de IgG imunógeno- específica com níveis de isotipo tanto IgGl como IgG2a no soro e resposta de IgA e IgG mista com níveis do isotipo IgGl predominantes no lavado nasal, conforme avaliado tanto no tempo de 2 como no de 4 semanas.

[089] O título de alotipos e isotipos específicos paraRvl324 no soro e lavado nasal de camundongos imunizados comRvl324 encapsulado em lipossomo catiônico foisubsequentemente avaliado no tempo de 2 semanas e estáretratado na FIG. 14.

Exemplo 15

[090] Imunogenicidade de vacinas de subunidade experimental baseada em Apa nativa e recombinante em camundongos.

[091] Para vacinação com subunidade, camundongos BALB/c foram imunizados pela via intranasal três vezes em intervalos 2 semanas usando 10 μg de Apa nativa de M. tuberculosis , Apa recombinante expressa em E. coli ou Ag85A recombinante individualmente [10 ug de cada imunógeno emulsificados individualmente em brometo de dimetil-dioctadecil-amônio (DDA; 250 μg/dose, Sigma-Aldrich, São Luís, MO) e monofosforil lipídio A (MPL derivado de Salmonella minnesota Re 595; 25 μg/dose, Sigma-Aldrich, São Luís, MO)]. MPL foi primeiramente misturado com água estéril livre de endotoxina (Burdick & Jackson, Muskegon, MI) contendo 0,2% de trietilamina (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). A mistura foi aquecida em banho-maria a 70° C por 30 s e depois sonicada por 30 s. O procedimento de aquecimento e sonicação foi repetido duas vezes. Para preparar a emulsão, o DDA foi ressuspendido em água estéril e uma dispersão homogênea do pó foi obtida por aquecimento da suspensão em 80° C por 5-10 min em banho-maria. Após resfriamento à temperatura ambiente, MPL e antígenos foram misturadas com DDA imediatamente antes da utilização. Os camundongos imunizados em simulação receberam PBS (pH 7,2) emulsificado em DDA-MPL.

[092] Após a vacinação, camundongos foram sangrados por punção cardíaca sob anestesia e sacrificados em 2 e 4 semanas pós-imunização. Pulmões, baço e linfonodos cervicais (CLN) foram removidos assepticamente e colocados em RPMI 1640 suplementado com 100 IU mL-1 de penicilina, 50 μg mL-1 de estreptomicina, 1 mM de L-glutamina, 25 mM de HEPES, 1 mM de piruvato de sódio, 5 X 10-5 M de β-mercaptoetanol, vitaminas e aminoácidos não essenciais (Gibco-Invitrogen, Grand Island, NY) e 10% de soro bovino fetal inativado por calor testado para endotoxina (SFBN; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO). Em cada caso, os respectivos órgãos linfóides ou extra- linfóides foram reunidos a partir de 4 camundongos para cada grupo de tratamento e células foram extraídas para análise de respostas celulares antígeno-específicas para M. tuberculosis in vitro. Respostas de anticorpo antígeno-específicos foram avaliadas usando soro e lavado nasal agrupados coletados de cada grupo de tratamento.

[093] Para isolar células do pulmão, camundongos foram sangrados por punção cardíaca sob anestesia e seus pulmões foram perfundidos através do ventrículo direito com PBS contendo 10U mL-1 de heparina para remover leucócitos intravasculares. Os pulmões foram então perfundidos com uma mistura enzimática contendo 1 mg/mL de colagenase tipo IV (Sigma-Aldrich, São Luís, MO) e 25U mL -1 de DNase (Roche, Penzberg, Alemanha) em RPMI suplementado e cortados em pedaços pequenos uma placa estéril e os fragmentos foram incubados na mistura enzimática a 37° C por 1 h. Os fragmentos de pulmão digerido foram forçados com um êmbolo de seringa de 5 mL através de um coletor celular com poro de 70 μm de tamanho (BD Falcon, Bedford, MA) para obter uma única suspensão celular e eritrócitos foram lisados com tampão de lise RBC (eBioscience, São Diego, CA) por 4-5 min em temperatura ambiente. As células do pulmão foram lavadas, recuperadas por centrifugação e ressuspendidas em RPMI suplementado para contagem usando o método de exclusão por corante de azul de tripan. Suspensões celulares únicas do baço e linfonodos foram obtidas por moagem suave dos respectivos órgãos através de um filtro de células de 70 μm em 10-20 mL de RPMI suplementado. Suspensões celulares foram centrifugadas a 300xg por 10 min e os eritrócitos foram removidos por tratamento com tampão de lise RBC, quando necessário. As células foram lavadas várias vezes com RPMI fresco e a concentração celular foi ajustada em conformidade.

[094] Kits de interferon (IFN)-Y, IL-2, IL-4 (grupo para ELISPOT de camundongo; BD-Biosciences, San Diego, CA) e IL-17 (grupo para ELISPOT de camundongo, eBioscience) comercialmente disponíveis foram usados para enumerar frequências de células antígeno-específicas para M. tuberculosis de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, placas de ELISPOT de 96 poços foram revestidas com 100 μl de 5 μg mL-1 de anticorpo de captura em PBS (pH 7,2) e incubadas durante a noite a 4° C. Sítios de ligação livres foram bloqueados com 200 μL de RPMI suplementado contendo 10% de SFB por 2h a temperatura ambiente. A concentração celular foi ajustada para 1x106 e 2x106 células mL-1 para todos os sítios e adicionada aos poços apropriados. Nenhum macrófago ou DC derivado da BM foi adicionado para complementar as células apresentadoras de antígeno já presentes na suspensão celular, como descrito previamente para estudos de antigenicidade e imunogenicidade. Para cada grupo de tratamento, as células foram estimuladas em triplicata com 10 μg mL-1 de antígenos de M. tuberculosis purificados individuais, WCL, concanavalina A (Con-A; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ou meio sozinho em um volume de 100 μL. Após 36 h de incubação a 37° C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2, as células não aderidas foram aspiradas do poço e as células remanescentes foram lisadas com água destilada. Os poços foram lavados novamente com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T) e o local de secreção de citocina foi detectado com um anticorpo anti-citocina de camundongo marcado com biotina e estreptavidina conjugada a peroxidase de rábano-picante. A reação enzimática foi desenvolvida usando conjunto de reagente de substrato 3-amino-9- etilcarbazol (AEC) (BD-Bioscience, San Diego, CA). O número de unidades formadoras de ponto (SFUs) por poço foi contado automaticamente utilizando um leitor de ELISPOT (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH).

[095] A imunização de camundongos com Apa nativa ou recombinante em adjuvante DDA-MPL induziu respostas de citocina Th1 (IFN-y e IL-2) (FIG. 15), Th2 (IL-4) e Thl7 (IL- 17) (FIG. 16) comparáveis em pulmões, linfonodos cervicais (CLN) e baço, conforme avaliado pelo ensaio de ELISPOT em quatro semanas pós-imunização. Na Fig. 15, a habilidade comparativa de adjuvante DDA-MPL controle, Ag85A recombinante (rAg85A), APA recombinante (rApa) e Apa nativa (nApa) de M. tuberculosis em induzir resposta Th1 (IFN-y e IL-2) em camundongos BALB/c imunizados intranasalmente com a respectiva vacina de subunidade proteica ou com adjuvante DDA-MPL sozinho para pulmão, linfonodos cervicais (CLN) ou células esplênicas. Vacinação de subunidade rAg85A-DDA-MPL intranasal foi usada como um controle positivo para avaliação da imunogenicidade de Apa nativa ou recombinante. Quatro semanas pós-imunização (momento a ser utilizado para desafio com M. tuberculosis de camundongos vacinados), as frequências de células secretoras de citocinas Th1 (IFN-y e IL-2) antígeno-específicas nos pulmões, linfonodos cervicais (CLN), e baço foram enumeradas pelo ensaio de ELISPOT e expressas como unidades formadoras de spot (SFUs)/ milhão de células de órgão. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de três a seis determinações. Na Fig. 16, a habilidade comparativa de DDA-MPL controle, Ag85A recombinante, APA recombinante e Apa nativa de M. tuberculosis em induzir resposta Th2 ou Th17 em camundongos BALB/c imunizados intranasalmente com a respectiva vacina de subunidade proteica ou com adjuvante DDA-MPL sozinho para pulmão, CLN e células esplênicas. Quatro semanas pós-imunização, as frequências de células secretoras de citocina Th2 (IL-4) e Thl7 (IL-17) antígeno-específicas nos pulmões, linfonodos cervicais (CLN), e baço foram enumeradas pelo ensaio de ELISPOT e expressas como unidades formadoras de spot (SFUs)/ milhão de células de órgão. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de três a seis determinações. As respostas de células T induzidas por Apa nativa ou recombinante também foram comparáveis àquelas induzidas por imunização com rAg85A. Nenhuma diferença foi igualmente observada em três grupos imunizados com vacina em induzir respostas de célula T (Th1, Th2 e Thl7) após estimulação com BCG de M. bovis viva in vitro nas respectivas culturas de células de baço, CLN e pulmão, indicando que três grupos de vacina podem induzir respostas de citocina de célula T similares após O encontro com M. tuberculosis ou desafio experimental in vivo (Figs. 17 e 18). Na Fig. 17, a frequência de células secretoras de citocina Th1 (IFN-Y e IL- 2) nas culturas de célula esplênica, linfonodo cervical (CLN) e pulmão de camundongos imunizados com subunidade e em simulação após desafio com BCG de M. bovis in vitro em quatro semanas pós-imunização em culturas de célula esplênica, CLN e pulmão. UFCs Copenhague de BCG de M. bovis viva foram usadas para estimular a respectiva cultura celular de órgão proporção 1:10) sem antibiótico por 36 h. Células secretoras de IFN-Y e IL-2 foram enumeradas pelo ensaio de ELISPOT e expressas como unidades formadoras de spot (SFUs)/ milhão de células do órgão. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de três a seis determinações.

[096] Todos os reagentes necessários para uso na presente invenção estão disponíveis a partir de fontes conhecidas na técnica ou são prontamente sintetizadas por técnicas aqui descritas ou por métodos reconhecidos na técnica.

[097] As referências citadas ou de outro modo apresentadas aqui são indicativas do nível de conhecimento da técnica a que a invenção pertence. Essas referências são por meio deste incorporadas como referência na mesma medida como se cada referência individual fosse explicita e individualmente incorporada aqui.Lista de referências 1. Anonymous. 2006. Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second-line drugs— worldwide, 2000-2004. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR 55:301-305. 2. Agger, E. M., and P. Andersen. 2002. A novel TB vaccine; towards a strategy based on our understanding of BCG failure. Vaccine 21:7-14. 3. Andersen, P., and T. M. Doherty. 2005. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nat Rev Microbiol 3:656-662. 4. Arulanandam, B. P., R. H. Raeder, J. G. Nedrud, D. J. Bucher, J. Le, and D. W. Metzger. 2001. 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Claims (10)

1. Vacina, caracterizada pelo fato de consistir de: - um polipeptídeo M. TUBERCULOSIS não-glicosilado de Rv1324; e - um adjuvante.

2. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do citado polipeptídeo ser recombinante.

3. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do citado polipeptídeo ser Rvl324 não-glicosilado.

4. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do citado polipeptídeo compreender ainda um marcador apropriado para purificação.

5. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do citado adjuvante ser brometo de dimetil dioctadecil-amônio (DDA); monofosforil lipídio A (MPL); LTK63, sal de amônio quaternário lipofílico-DDA, dimicolato de trealose e derivados sintéticos, DDA-MPL, DDA-TDM, DDA- TDB, IC- 31, sais de alumínio, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de potássio e alumínio, Montanide ISA- 51, ISA-720, micropartículas, complexos imunoestimulantes, lipossomos, virossomos, partículas semelhantes a vírus, oligonucleotídeos CpG, toxina da cólera, toxina termolábil de E. COLI, lipoproteínas, células dendríticas, IL-12, GM-CSF, nanopartículas incluindo ilustrativamente nanopartículas de fosfato de cálcio, uma combinação de óleo de soja, agentes emulsificantes e etanol para formar uma nanoemulsão; AS04, ZADAXIN, ou combinações destes.

6. Vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um agente emulsificante ou um agente encapsulante.

7. Vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato do citado agente de emulsificação ser biovetor supramolecular (SMBV), nanopartícula, lipossomo, ou combinações destes.

8. Embalagem farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender a vacina, conforme definida na reivindicação 1, sozinha ou em combinação com vacina BCG; um agente de emulsificação; e um adjuvante.

9. Embalagem farmacêutica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato do citado adjuvante ser brometo de dimetil dioctadecil-amônio (DDA); monofosforil lipídio A (MPL); LTK63, sal de amônio quaternário lipofílico-DDA, dimicolato de trealose e derivados sintéticos, DDA-MPL, DDA- TDM, DDA-TDB, IC- 31, sais de alumínio, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de potássio e alumínio, Montanide ISA-51, ISA-720, micropartículas, complexos imunoestimulantes, lipossomos, virossomos, partículas semelhantes a vírus, oligonucleotídeos CpG, toxina da cólera, toxina termolábil de E. COLI, lipoproteínas, células dendríticas, IL-12, GM-CSF, nanopartículas incluindo ilustrativamente nanopartículas de fosfato de cálcio, combinação de óleo de soja, agentes emulsificantes e etanol para formar uma nanoemulsão; AS04, ZADAXIN, ou combinações destes.

10. Embalagem farmacêutica, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato do citado agente de emulsificação ser biovetor supramolecular (SMBV), nanopartícula, lipossomo, ou combinações destes.

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