KR100609813B1

KR100609813B1 - 결핵 예방 백신

Info

Publication number: KR100609813B1
Application number: KR1020050015561A
Authority: KR
Inventors: 조상래; 전보영
Original assignee: 학교법인연세대학교
Priority date: 2005-02-24
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2006-08-08

Abstract

본 발명은 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 결핵균의 알파-크리스탈린 단백질(alpha-crystalline protein, 16kDa); Ag85A 단백질(32kDa)과 ESAT-6 단백질(6kDa); Ag85A 단백질과 포스페이트 결합 단백질 1(phosphate binding protein 1, 38kDa); 및 Ag85A 단백질과 ESAT-6 단백질과 알파-크리스탈린 단백질 항원으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 결핵 예방 백신 조성물을 제공한다.

결핵 예방용 백신, Ag85A, ESAT-6, 알파-크리스탈린 단백질(alpha- crystalline protein), 포스페이트 결합 단백질 1(phosphate binding protein 1)

Description

결핵 예방 백신{Prophylactic TB vaccines}

도 1은 정제된 재조합 결핵 항원의 SDS-PAGE 분석 결과이다.

M은 저분량 질량 마커(kDa), 레인 1은 재조합 Ag85A(32kDa), 레인 2는 재조합 16kDa(HspX, 알파 크리스탈린 단백질: alpha-crystalline protein), 레인 3은 재조합 38kDa(포스페이트 결합 단백질 1: phosphate binding protein 1), 레인 4는 재조합 ESAT-6(6kDa) 항원을 나타내다.

도 2는 최후 예방 접종 후 5주 된 마우스에서 얻은 비장 세포를 시험관내에서 혼합 항원으로 재자극한 후, 비장 세포에서의 INF-γ의 생성량을 보여준다. 데이터는 독립적인 세 번 계산값의 평균±표준오차로 나타내었다.

도 3은 최후 예방 접종 후 5주 된 마우스에서 얻은 비장 세포를 시험관내에서 Ag85A(a), ESAT-6(b), 16kDa(c) 및 38kDa(d) 항원으로 재자극한 후, 비장세포에서의 INF-γ의 생성량을 보여준다. 데이터는 독립적인 세 번 계산값의 평균±표준오차로 나타내었다.

도 4는 혼합 백신으로 유도된, Ag85A, ESAT-6, 16kDa 및 38kDa-특이적 IgG1 생성량을 살펴본 것이다. 마우스를 혼합 백신으로 세 번 면역화하거나 BCG 예방 접종하였다. 최종 면역화 후 5주 된 각 그룹의 마우스로부터 혈청 샘플을 수 집하고 Ag85A(a), ESAT-6(b), 16kDa(c), 38kDa(d) 항원에 대한 항체 생성량을 살펴보았다. 그 값을 490nm에서의 흡광도로 나타내었으며, 그 결과는 3마리의 마우스의 평균±표준오차이다.

본 발명은 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

결핵은 마이코박테리움 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 의해 유발되는 만성 감염성 질병이다. 개발도상국에서 발생하는 주요 질병일 뿐 아니라, 선진국에서도 그 심각성이 증가하고 있으며, 매년 약 8백 만명의 환자가 새로 발병하며 약 2백 만명의 환자가 사망한다. 또한 최근 AIDS 환자에게서 결핵의 발병율이 높은 것으로 나타나, AIDS가 결핵의 새로운 유포원으로 알려지고 그 심각성이 더해지고 있다.

결핵은 초기에는 특별한 증상이 없는 경우가 많으나 병이 진행함에 따라 기침, 가래, 전신 피로감, 오후에 나는 미열, 식은 땀, 체중 감소, 객혈 등의 증세가 나타나고, 치료하지 않으면, 심각한 합병증을 초래하고 결국 사망에 이르게 된다.

결핵의 치료를 위해서는, 항생제 등을 이용하여 최소한 6개월 이상의 장기적이고 중단 없는 규칙적인 약물 복용이 필요하다. 이런 오랜 기간의 약물 투여로 인하여 약물에 대한 내성, 위장관 장애, 간에 대한 부작용, 피부 발진, 발열 등의 전신 증상이 나타나며, 리팜린의 경우에는 혈소판 감소, 에탐부톨의 경우에는 시력 감퇴, 적록색을 구분 못하는 등의 부작용, 피라지나마이드 경우에는 혈중 요산의 증가로 의한 관절의 통증을 유발할 수 있으므로, 효과적인 예방 접종 및 질병의 정확한 초기 진단이 가장 중요하다.

현재, 결핵은 주로 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 비독성 균주인 바실러스 칼메트-구에린(BCG: Bacillus Calmette-Guerin)의 생 세균을 이용하여 예방하고 있다. 그러나, BCG의 안전성 및 효능에 논란이 있으며(Styblo K et al., Tuberc Lung Dis 1976; 57:17-43), 미국과 같은 몇몇 국가는 이의 사용을 금지하고 있다. 또한, BCG는 HIV에 감염된 어린이들에게 사용하기에는 적당하지 못하다고 알려져 있다

이에, BCG를 대체할 보다 안전하고 효과가 우수한 새로운 예방 백신의 개발이 요구되고 있다.

단백질 항원을 백신 조성물로 사용할 경우, 병원균의 노출의 위험이 없으므로 안전하다. 결핵의 동물 모델에서 단백질 항원으로 작용하는 것으로 알려진 단백질이 있는데, 예를 들어 엠. 튜베르쿨로시스의 Ag85A , Ag85B, ESAT-6(6kDa), 16kDa, 23kDa, 38kDa, 65kDa, 71kDa 단백질 등이다.

본 발명자는 마우스 모델에서, 상기 항원성 단백질 중, 예방용 백신으로 최상의 효과를 가지는 단백질들의 조합을 IFN-γ 어세이, 항체 검출 및 면역화된 마 우스를 결핵균으로 감염시켰을 때의 박테리아 수의 감소를 살펴보고, BCG를 대체할 보다 안전하고 효과가 우수한 새로운 예방 백신을 개발하고자 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 결핵균의 알파-크리스탈린 단백질 (alpha-

crystalline protein, 16kDa)을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 결핵균의 Ag85A 단백질(32kDa)과 ESAT-6 단백질(6kDa)을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 결핵균의 Ag85A 단백질과 포스페이트 결합 단백질 1(phosphate binding protein 1, 38kDa)을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 결핵균의 Ag85A 단백질, ESAT-6 단백질 및 알파-크리스탈린 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 결핵균의 알파-크리스탈린 단백질(alpha-crystalline protein, 16kDa)을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 “결핵 예방용 백신 조성물”은 병원성 유기체의 약독화된 균주를 동물에 접종하여 병원체에 대한 면역 반응을 유도한 것이 아니라, 백신 효과를 가지는 단백질 항원을 투여함으로써 이후의 병원균 감염을 예방한 것을 특징으로 하는, 기존의 BCG 면역법에 비하여 보다 안전한 면역법임을 특징으로 한다.

상기 결핵균의 16kDa 단백질은 저-분자량 열 충격 단백질(low-molecular weight heat shock protein)중에서 α-크리스탈린 족(α-crystallin family)에 관계되는 항원으로 알려져 있으며, 인간과 마우스의 T세포의 에피토프(epitope)를 동시에 가지고 있다. 이 항원은 단일클론 항체를 이용한 항원성 검사에서 매우 우수한 항원으로 확인되었다. 또한 이 항원은 진단제로의 사용이 활발하게 연구되었으며, WO 2004/006952에서는 16kDa 항원이 결핵에 대한 치료용 백신으로 사용될 수 있음을 밝히고 있다. 치료용 백신 항원은 예방용 백신 항원과 일치하지 않는데, 이는 병원균이 감염 후 항원의 성질을 바꾸기 때문이다. WO 2004/006952에서 16kDa 항원을 ESAT-6, 38kDa, Ag85A등과 혼합하여 치료 백신으로 사용할 수 있음을 밝히고 있다. US 20040180056에서는 16kDa 항원을 신생아 또는 유아기에 BCG 접종을 한 사람에게 접종할 경우, 이 항원이 결핵에 대한 면역성을 증강시키는 중간(mid-life) 예방 백신으로 사용될 수 있음을 밝히고 있다. 그러나, 16kDa 단백질 항원을 결핵 예방 백신 조성물로서 사용한 시도는 아직까지 이루어지지 않았다. 이에, 본 발명자는 마우스를 16kDa 항원으로 면역화 시킨 후 결핵균을 투여하고 마지막 투여 8주 후의 마우스의 폐와 비장에서 결핵 균수를 측정한 결과, 다른 단독 항원으로 면역화 한 마우스에서와는 달리 결핵 균수가 뚜렷이 감소됨을 확인하여(표 2), 16kDa 단백질 항원이 효과적인 결핵 예방 백신으로 사용될 수 있음을 밝혀내었다.

또한 본 발명자는, 단백질 항원을 단독 또는 다양하게 조합하여 예방 백신으로 사용하였을 때, 결핵균 감염에 따른 각각의 예방 효과를 살펴보았다. 그 결과, 백신의 예방 효과는 단백질 항원의 조합에 따라 매우 큰 차이가 나는 것을 확인하였다.

항원의 상승적 예방 효과에 항원 단백질의 조합이 결정적인 역할을 한다는 것은, Ag85A 단백질, ESAT-6, 알파-크리스탈린 단백질, 및 포스페이트 결합 단백질 1을 모두 혼합한다고 하여, 백신 효과가 가장 우수하지 않다는 것을 통하여 알 수 있다. 따라서, 각 단백질 항원의 조합에 의한 예방 백신으로서의 상승적 효과는 쉽게 예측할 수 없다. 본 발명에서 구체적인 실험으로 살펴본 결과, 알파-크리스탈린 단백질 항원; Ag85A 단백질 및 ESAT-6 단백질 항원; Ag85A 단백질 및 포스페이트 결합 단백질 1 항원; 또는 Ag85A 단백질, ESAT-6 단백질 및 알파-크리스탈린 단백질 항원의 조합인 경우, 혼합에 의한 상승적 효과를 도모할 수 있었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 결핵균의 Ag85A 단백질과 ESAT-6 단백질 항원을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는 Ag85A 단백질과 ESAT-6 단백질은 중량을 기준으로 1대 1의 비율로 혼합하도록 한다.

85 항원 복합체는 엠. 보비스의 BCG 분비 항원으로 사람 피브로넥틴 (fibronectin)과 결합하는 항원으로 알려져 있고, 그 각각의 항원은 85A, 85B, 85C항원이다. 이들 각각은 시험관 내에서 마이코박테리아의 특징적인 세포벽을 합성하는데 필수적인 마이코릴트란스페라제(mycolyltansferase)의 활성과 관련이 있다. 그 중 85A는 결핵 환자에게서 감마인터페론 생산을 유도하는 것으로 알려져 있다.

ESAT-6는 세포외 항원(extracellular antigen)으로 종-특이 시약을 개발하기 위한 목적의 일환으로 클론화되었고, 이를 이용하여 활발한 연구가 진행 중이다.

상기의 Ag85A와 ESAT-6는 가장 광범위하게 연구되고 있는 항원중의 하나로, 단백질 뿐 아니라 DNA 백신으로서도 유효한 효과를 나타내고 있다고 알려져 있다(Huygen K et al., Nat Med 1996; 2(8):893-898. Minion FC et al., Infect Immun 2003; 71:2239-2243).

본 발명에서 ESAT-6는 단독으로는 폐와 비장에서 세균 수의 뚜렷한 감소효과를 나타내지 못하였다. 이는 이전의 연구 결과와는 상반된 것으로(Brandt L, Elhay M, Rosenkrands I, Lindblad EB, Andersen P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun 2000; 68:791-795.), 단지 이 두 연구의 차이점은 ESAT-6와 혼합한 애쥬번트의 종류 뿐이며(이전 연구에서는 애쥬번트로 MPL-DDA를 사용하였으며, 본 연구에서는 MPL_SE를 사용하였음), 이것이 결과에 영향을 미친 것으로 보인다.

본 발명에서 Ag85A와 ESAT-6의 조합으로 혼합한 백신으로 마우스를 면역화시키고 결핵균을 감염시킨 후 5주와 8주 후의 마우스의 폐와 비장에서 결핵균 수를 비교한 결과, 단독 항원으로 면역화한 경우와는 달리 뚜렷한 균수의 감소를 나타 내었다(표 2참조). 이는 Ag85A와 ESAT-6 혼합 백신이 각각 단독의 항원 백신과 비교해 볼 때, 결핵 예방 백신으로서 보다 우수한 효능을 가지고 있음을 나타내는 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 결핵균의 Ag85A 단백질과 포스페이트 결합 단백질 1 항원(38kDa)을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는 Ag85A 단백질과 포스페이트 결합 단백질 1은 중량을 기준으로 1대 1의 비율로 혼합하도록 한다.

상기에서 38kDa 단백질 항원은 결핵균의 면역원성이 강한(immunodominant) 지단백질(lipoprotein)로서 포스페이트 결합 단백질(phosphate binding protein)이다. 38kDa 항원은 결핵균의 배양액 상청액으로부터 단일클론 항체를 이용하여 정제하기 시작하였고, 이 항원을 대장균을 이용하여 대량 생산하기 시작하였다. 38kDa 항원은 아직 충분한 연구가 되고 있지 않지만, 마우스가 본 단백질에 의해 면역화되고 결핵균에 감염되었을 경우, 부분적인 예방 효과를 나타낸 결과가 보고되었다 (Vordermeier HM et al., Vaccine 1995; 13:1576-1582).

Ag85A와 38kDa의 조합으로 혼합한 백신은 INF-γ의 생성량과 결핵균수에서의 감소에 탁월한 효과를 보이면서 예방 백신으로서 매우 우수한 효과를 나타내었다. Ag85A 와 38kDa을 혼합한 백신으로 마우스를 면역화시키고 결핵균을 감염시킨 후, 5주와 8주 후의 마우스의 폐와 비장에서의 결핵균 수를 비교한 결과, 다른 두개의 항원을 혼합한 백신 또는 BCG 백신과 비교해 볼 때 가장 뚜렷한 균수의 감소를 나 타내었다. 반면, 38kDa는 Ag85A 이외의 다른 항원들과 혼합했을 경우에는 예방 효과를 나타내지 못하였다(표 2참조).

또 다른 양태로서, 본 발명은 결핵균의 Ag85A 단백질, ESAT-6 단백질 및 알파-크리스탈린 단백질 항원을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, Ag85A 단백질, ESAT-6 단백질 및 알파-크리스탈린 단백질 항원은 중량을 기준으로 1대 1대 1의 비율로 혼합하도록 한다.

Ag85A, ESAT-6 및 알파-크리스탈린 단백질 항원의 조합으로 혼합한 백신은 상대적으로 세 개의 다른 항원을 조합한 백신보다 INF-γ의 생성에 있어서 낮은 수치를 나타내었다(도 2). 그러나 상기 백신으로 마우스를 면역화시키고 결핵균을 감염시킨 후, 5주와 8주 후의 마우스의 폐와 비장에서의 결핵균 수를 비교한 결과, 단독 항원을 사용한 경우 뿐 아니라 다른 세 개의 항원을 혼합한 백신과 비교해 볼 때, 세균수의 감소에 있어서는 뚜렷한 효과를 보였다. INF-γ 생성과 마우스 기관에서 박테리아 수의 감소를 살펴본 실험 결과가 정확하게 일치하지 않는 이유는 INF-γ의 생성이 백신 예방 효과를 알 수 있는 절대적이 아닌 상대적 척도가 되는 것으로 설명할 수 있다(Agger EM and Andersen P., Vaccine 2001; 2298-2302).

본 발명은 항원 단백질의 단독 또는 다양한 조합에 따른 면역 백신으로서의 상승적 효과를 확인하여, 생균 백신인 BCG를 대체할 수 있는 가장 뛰어난 효과를 보이는 단백질 항원 조합으로 이루어진 안전하고 우수한 효과의 새로운 형태의 단백질 항원 백신을 제공한다.

상기 항원 단백질은 천연에서 추출하여 얻거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 항원 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질 전환하여 상기 형질전환체를 배양한 뒤, 형질전환체로부터 항원 단백질을 획득하는 과정으로 이루어진다. 또한 우수한 효과를 나타내는 결핵균의 항원 단백질 조합을 살펴본 본 발명의 목적상, 면역 유도 기능을 가지는 한, 각 항원 단백질의 자연적 또는 인위적 아미노산 서열 변이체 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 예방용 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만 바람직하게는, 애쥬번트와 함께 투여한다.

애쥬번트는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자등을 의미한다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol,. 4:369). 본 발명의 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 애쥬번트는 임의의 다양한 애쥬번트를 포함하며, 전형적인 애쥬번트로는 프로인트 애쥬번트((Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A 등이 알려져 있다. 본 발명에서는, 모노포스포릴 리피드 A를 애쥬번트로 사용하였다. 상기 애쥬번트는 백신 예방용 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 허용 가능한 약제학적 담체와 함께 적절한 제제로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. 투여 경로는 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 정맥주사, 근육주사, 피하주사, 피내주사 등의 방법으로 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적 양태에서는, 주사제로 피하 투여하였다.

본 발명의 조성물은 면역학적 유효량으로 투여한다. 용어 "면역학적 유효량"이란 결핵 예방효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - 재료 및 방법

마우스

생후 5내지 6주된 특이적 병원체가 없는 암컷 C57BL/6 마우스를 Japan SLC, Inc. (Shijuoka, Japan)로부터 구입하여, 연세대학교 의학 연구 센터 내의 BL-3 바이오해저드 애닐멀 룸의 제한 공간에서 사육하였다. 마우스에게는 멸균된 판매용 마우스 먹이와 물을 임의적으로 제공하였다.

박테리아

엠. 튜베르쿨로시스 H37Rv (M. tuberculosis H37Rv)와 엠. 보비스 BCG(Pastuer strain)는 0.4% 소디움 글루타메이트와 3.0% 글리세롤을 함유한 사우톤 배지(Sauton medium) 표면 피막(surface pellicles)에서 배양하였다. 이후 표면 피막을 수집한 후, 6mm 글래스 비드로 부드럽게 볼텍싱하면서 파쇄하였다. 응집물이 가라앉은 다음 상청액은 수거하고 각각 나누어 -70℃에 보관한다. 해동 후, 살아있는 박테리아를 Middlebrook 7H11 아가 (Difco, Detroit, MI, USA))에서 단계적 희석 평판 배양하여 카운팅하였다. 마우스에게 엠. 튜베르쿨로시스를 접종하기 위해, 박테리아 현탁액을 음파조(sonic bath)에서 가볍게 음파처리하고, pH7.2의 PBS(phosphate buffered saline)로 희석시켜서 원하는 수의 박테리아를 얻었다.

마이코박테리움 항원

이. 콜라이에서 발현되고 재생된, 엠. 튜베르쿨로시스의 재조합 단백질 Ag85A, ESAT-6, 16 kDa 및 38 kDa을 Standard Diagnostics Inc. (Suweon, Korea)에서 구입하였다. 사용한 재조합 단백질의 종류는 표 1에 나타내었고 SDS-PAGE 프로필을 도 1에 나타내었다. 엠. 튜베르쿨로시스의 CFP(Culture filtrate protein)는 J.T. Belisle(Colorado State University, Fort Collins, CO, USA)로부터 제공되었다. 단백질 농도는 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석 키트 (Pierce, Rocktford, IL, USA)를 이용하여 제조사의 지침서에 따라 행해졌다. 2개에서 4개의 항원을 포함하는 혼합 서브유니트 백신은 Ag85A를 중심 항원으로 ESAT-6, 16 kDa 및/또는 38 kDa를 혼합하여 제조하였다.

면역화

마우스를 3주 간격으로 애쥬번트와 함께 주사당 40g의 재조합 단백질 또는 CFP를 포함하는 실험용 백신으로 등에 피하주사하여 면역화시켰다. MPL-SE(Monophosphoryl lipid A in stable emulsion, Corixa Co., Seattle, WA, USA)을 실온에서 가볍게 흔든 후, 제조사의 지침서에 따라 멸균 식염수에 항원과 함께 희석시켰다. 식염수 중 MPL-SE와 항원을 1:4의 비율로 희석시켰다. 200㎕ 주사 당 40㎕의 항원과 10㎕의 MPL-SE을 포함한 혼합액을 만들었다. 두번째 서브유니트 면역화할 때, 마우스의 한 그룹은 꼬리밑에 BCG(1x10⁵ CFU/mouse)를 1회 투여량으로 피하주사로 접종시켰다. 음성대조군은 200㎕ 의 멸균, 병원체가 없는 식염수 또는 200㎕ 의 애쥬번트로 피하 주사하였다.

통계 분석

Student t-test는 처리 그룹들간에 결과를 비교하기 위해 사용되었으며, 0.05미만의 P 값을 유의한 것으로 하였다.

실시예 2 - 혼합 백신으로 면역화한 마우스 비장세포의 INF-γ 생성결과

세포-매개된 면역반응을 유도함에 있어, 혼합 항원 서브유니트 백신을 서로 비교하기 위해 면역화한 마우스로부터 얻은 비장세포를 시험관 내에서 각 재조합 단백질과 CFP로 자극하고, INF-γ 생성량을 측정하였다.

임파구는 멸균된 슬라이드 글라스에 조직을 분산킴으로써 비장으로부터 단일세포현탁액을 제조하여 획득하였다. 155mM의 염화암모니움과 10mM의 중탄산칼륨 버퍼를 포함하는 용액으로 적혈구를 용해시킨 후, 세포들은 96웰 세포 배양 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에서 배양하였다. 각 웰들은 5x10^-5 M의 2-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1mM 글루타민과 10%(vol/vol) 소 태아 혈청을 보강한 RPMI 1640 200㎕ 당 2x10⁵의 임파구를 포함하였다. 마이코박테리움 항원, 재조합 단백질과 CFP는 최종 농도가 10 μg/mL로 하였다. 콘카나발린 A(Concanavalin A (Sigma, St. Louis, MO, USA))는 2.5 μg/mL농도로 세포 생존능을 위한 양성 대조군으로 사용하였다. 6일 후 배양물로부터 상청액을 회수하고, IFN-γ를 마우스 IFN-γ Opt EIA^TM 키트(Pharmingen, San Diego, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지침서에 따라 측정하였다.

비장세포를 4개 항원들의 다양한 조합을 이용하여 자극한 결과, Ag85A와 38 kDa로 면역화된 마우스가 가장 높은 INF-γ 생성을 보였으며, 그 뒤로는 Ag85A + 16 kDa, Ag85A + 16 kDa + 38 kDa, Ag85A + ESAT-6 + 38 kDa로 면역화된 마우스 순이었다 (도 2). 그러나, 흥미롭게도 4개의 모든 항원으로 면역화한 마우스에서는 뚜렷한 INF-γ 증가를 관찰하지 못하였다. 또한, 단독 항원으로 면역화된 마우스 중에서는, Ag85A를 제외하고는 약한 INF-γ 생성을 보였다.

INF-γ 생성을 또한 각각의 단백질 항원으로 비장세포를 자극한 후 측정하였다(도 3). 일반적으로, 혼합 항원 백신으로 면역화된 마우스는 혼합 백신에 존재하는 개개의 단백질로 자극될 때 INF-γ 를 생산하였다. 예를 들어 Ag85A은 4개의 모든 항원으로 구성된 혼합 백신을 제외하고 혼합 백신으로 면역화 된 마우스의 비장세포에서 INF-γ 를 생산하였다. 마찬가지로 16kDa와 38kDa는 2-3개의 항원으로 구성된 혼합 백신으로 면역화된 마우스의 비장세포에서 INF-γ을 생산하였다. 그러나 ESAT-6은 ESAT-6 단독으로 면역화된 마우스의 비장세포에서만 INF-γ 을 생산하였으며, 혼합 항원으로 면역화 된 마우스로부터는 그러한 결과를 얻지 못하였다.

실시예 3 - 혼합 백신으로 면역화 된 마우스에서의 항체 반응

혼합 백신과 각각의 단백질로 처리한 마우스의 면역화 정도를 확인하기 위해 혈청 샘플에서 항원 특이적 IgG 항체를 검출하였다. 또한, Th1 반응의 추가적 징표인 IgG2b로의 이소타입 스위칭 여부를 확인하기 위해 IgG 이소타입을 분석하였다. 마지막 면역화한 후 5주째 마우스에서 혈청 샘플을 수득하여, 항원-특이적 IgG와 이의 서브 클래스 항체를 ELISA로 분석하였다.

마이코박테리움 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)을 실시하였다. 96 웰 평판 EIA 플레이트(Costar, Cambridge, MA, USA)를 밤새 4℃에서 카보네이트 버퍼(pH9.6) 중의 재조합 단백질(2 μg/mL)로 코팅하였다. 그 후 플레이트를 세척하고, 0.1% Tween 20 과 5% (vol/vol) 정상 염소 혈청을 포함하는 pH 7.4의 PBS(PBST-NGS)로 37℃에서 2시간 동안 차단시켰다. PBST-NGS로 1:100으로 희석된 마우스 혈청을 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 배양하였다. 이소타입 분석을 위해, 친화성을 이용하여 정제된 바이오티닐화된 래트 항-마우스 항체(immunoglobulin G [IgG], 1/14,000; IgG1, 1/8,000, and IgG2b, 1/2,000 [SEROTEC Ltd., Oxford, UK])를 항원에 결합된 항체를 검출하기 위해 사용하였고, AV-HRP(avidin-horseradish peroxidase) 컨쥬게이트(1/2,000 dilution; Pharmingen, San diego, CA, USA)와 반응시켰다. O-페닐디아민(OPD; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 기질로 사용하고, 흡광도를 자동 ELISA 검출기 (Molecular Device, Biotek Instruments, Hyland Park, VA, USA)로 490nm에서 측정하였다.

그 결과, IgG1 이소타입이 다수를 차지하므로, 각 단백질에 대한 IgG1 항체반응만이 나타났다. Ag85A, 16kDa 및 38kDa 에 대한 IgG1의 강한 반응성이 단일 단백질 또는 혼합 백신으로 면역화 된 마우스의 혈청에서 관찰되었다. 또한, ESAT-6에 대한 IgG1의 상대적으로 약하지만 명확한 반응은 ESAT-6 단독 백신이 아닌, ESAT-6를 포함한 혼합 백신에서만 관찰되었다. INF-γ 생성량과 항체 반응의 결과를 조합해 볼 때, 그 결과는 마우스의 모든 실험 그룹들은 Ag85A, ESAT-6, 16kDa 및 38kDa 항원 각각 또는 그의 조합에 의해 충분히 면역화 되었음을 나타내고 있다.

실시예 4 - 혼합 서브유니트 백신에 의한 예방 효과

결핵균 감염에 대한 예방 효과가 있는 혼합 백신으로 면역화 된 마우스에서 박테리아 수의 감소를 조사하였다. 상기 상술한 바와 같이 마우스에 각각의 단백질이나 혼합 항원으로 면역화 한 후, 병독성이 강한 H37Rv 균을 흡입시켜 감염시켰다. 감염 후 5주 및 8주 때, 서브유니트 백신으로 면역화한 마우스의 폐와 비장에서 박테리아의 수를 확인하고, 그 결과를 대조군 마우스와 비교하였다.

약 200개의 박테리아가 폐로 들어가도록 조정된 흡입 기구(Glas-Col, Terre Haute, IN, USA)를 이용하여, 마우스를 결핵균에 에어로졸로 노출시켜 감염시켰다. 마우스를 마지막 면역 4주 후 감염시키고, 감염 후 5주와 8주째 희생시켰다. 폐와 비장에서 살아있는 박테리아 수를 Middlebrook 7H11 아가상에서 전체 기관 균질현탁액을 순차적으로 희석하여 플레이팅함으로써 확인하였다. 37℃에서 3-4주간 배양한 후 콜로니를 카운팅하였다. 결과는 기관 당 평균 log₁₀CFU±표준편차로 나타내었다.

감염 후 5주째 박테리아 수를 확인하였을 때, Ag85A + ESAT-6 (P < 0.05, Student t-test), Ag85A + 38 kDa (P < 0.01), Ag85A + ESAT-6 + 16 kDa (P < 0.01) 및 양성 대조군으로 사용된 BCG (P < 0.01) 로 면역화 된 마우스의 폐에서 박테리아 수가 현저하게 감소 되었으며, 이는 표 2에 나타내었다. 반면 4개의 항원으로 구성된 혼합 항원을 포함한 다른 혼합 항원, 그리고 다른 각각의 항원으로 면역화 된 마우스의 폐에서는 뚜렷한 박테리아 수의 감소가 관찰되지 않았다.

감염 후 8주 째 박테리아 수를 확인하였을 때, Ag85A + ESAT-6 (P < 0.01), Ag85A + 38 kDa (P < 0.01) 및 Ag85A + ESAT-6 + 16 kDa (P < 0.01)의 혼합 백신으로 면역화 한 마우스의 폐에서 박테리아 수의 현소한 감소가 확인되었으며, 이는 표 2에 나타내었다. 또한, 단독 항원 Ag85A (P < 0.05), ESAT-6 (P < 0.01) 또는 16 kDa (P < 0.05)로 면역화 된 마우스에서도 결핵 균에 대한 현저한 예방 효과를 나타내었다.

그러나 비장에서는 Ag85A + 38 kDa 로 면역화 된 마우스에서만 감염 후 5주 및 8주 째에 현저한 박테리아 수의 감소가 관찰되었다. 이 데이터는 Ag85A + ESAT-6, Ag85A + 38 kDa, 및 Ag85A + ESAT-6 + 16 kDa로 구성된 혼합 서브유니트 백신은 결핵균 감염에 대해 마우스의 폐에서 현저한 예방 효과를 나타냄을 보여주고 있다. 그러나 이 세 종류의 서브유니트 백신들 중, 단지 Ag85A + 38 kDa 만이 마우스에서 폐와 비장 모두에 있어서 예방효과를 보이고 있다.

log₁₀CFU±표준편차의 평균. 박테리아 수는 마우스의 폐와 비장으로부터 분리된 결핵군의 log₁₀CFU로서 표현된다.

각 그룹은 5마리의 마우스로 구성된다.

*P<0.05 , **P<0.01 Student t-test

본 발명의, 결핵균 항원 단백질의 다양한 조합으로 이루어진 결핵 예방용 백신 조성물은, 현재 유일하게 사용하고 있는 BCG 백신을 대체하여 안전하고 유효한 결핵 예방 백신으로 사용될 수 있다.

Claims

결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 알파-크리스탈린 단백질 (alpha-crystalline protein, 16kDa)을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물.
결핵균의 Ag85A 단백질(32kDa)과 ESAT-6(6kDa) 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물.
제2항에 있어서, Ag85A 단백질과 ESAT-6 단백질이 중량을 기준으로 하여 1 대 1로 혼합된 결핵 예방용 백신 조성물.
결핵균의 Ag85A 단백질과 포스페이트 결합 단백질 1 (phosphate binding protein 1, 38kDa)을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물.
제4항에 있어서, 결핵균의 Ag85A 단백질과 포스페이트 결합 단백질 1이 중량을 기준으로 하여 1 대 1로 혼합된 결핵 예방용 백신 조성물.
결핵균의 Ag85A 단백질 , ESAT-6 단백질 및 알파-크리스탈린 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물.
제6항에 있어서, Ag85A 단백질, ESAT-6 단백질 및 알파-크리스탈린 단백질이 중량을 기준으로 하여 1 대 1대 1로 혼합된 결핵 예방용 백신 조성물.