ES2853773T3 - Procedimientos novedosos para inducir una respuesta inmune - Google Patents
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Abstract
Una primera composición inmunogénica que comprende un antígeno M72, que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1; y un adyuvante, en el que el adyuvante comprende un agonista de TLR y una saponina inmunológicamente activa, en la que el agonista de TLR es 3DMPL y la saponina es QS21; y una segunda composición inmunogénica que comprende un antígeno M72, que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1; para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento la administración de la primera composición inmunogénica al sujeto, seguida por la administración de la segunda composición inmunogénica al sujeto, en el que el sujeto recibe un total de tres dosis de composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno M72 dentro de un período de cinco años, en el que el sujeto recibe dos dosis de la primera composición y una dosis de la segunda composición, en la que el intervalo de tiempo entre la administración final de la primera composición y la administración de la segunda composición es entre 3 meses y 5 años: en la que la primera y la segunda composición inmunogénica comprende entre 1 ug y 100 ug de antígeno M72; y en la que el primer y, si está presente, el segundo adyuvante se proporcionan como formulaciones liposomales.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimientos novedosos para inducir una respuesta inmune
Campo técnico
La presente invención se refiere a procedimientos para inducir una respuesta inmune, en particular a procedimientos para inmunización que comprenden al menos dos administraciones de una composición inmunogénica con adyuvante en los que se retarda una administración posterior.
Antecedentes de la invención
La vacunación es uno de los procedimientos más eficaces para la prevención de enfermedades infecciosas. Sin embargo, una única administración de un antígeno a menudo no es suficiente para conferir una inmunidad óptima y/o una respuesta de larga duración. Los enfoques para establecer una inmunidad fuerte y duradera ante agentes patógenos específicos incluyen la adición de adyuvantes para vacunas y/o la vacunación repetida, es decir, reforzar una respuesta inmune mediante la administración de más de una o más dosis de antígeno adicionales. Dichas administraciones adicionales se pueden realizar con la misma vacuna (refuerzo homólogo) o con una vacuna diferente (refuerzo heterólogo). El enfoque más común para refuerzo homólogo es no sólo administrar la misma vacuna, sino también administrarla a la misma dosis que la administración anterior.
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa crónica causada por infección con Mycobacterium tuberculosis y otras especies de Mycobacterium. Es una enfermedad importante en los países en desarrollo, así como un problema creciente en áreas desarrolladas del mundo.
Los antígenos de proteína Mtb72f y M72 (descritos, por ejemplo, en las solicitudes de patente internacional WO2006/117240 y WO2012/080369) o fragmentos o derivados de los mismos son antígenos de proteína potencialmente beneficiosos para el tratamiento o la prevención de tuberculosis. Investigaciones anteriores han conducido a que se administre M72 a seres humanos, junto con los inmunoestimulantes monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) y QS21 en una formulación liposomal, y a un programa de 0,1 meses con 10 ug de M72, 25 ug de 3D-MPL y 25 ug de QS21 (Leroux-Roels y col. Vaccine 2013312196-2206, Montoya y col. J. Clin. Immunol. 2013 33(8): 1360-1375).
Una vacuna candidata que utiliza el antígeno M72 se encuentra actualmente en un ensayo de fase IIB (identificador ClinicalTrials.gov: NCT01755598) para evaluar la eficacia protectora de dos dosis contra la TB pulmonar, en comparación con placebo, en adultos de 18-50 años que viven en países endémicos de TB.
Las vacunas de TB también se tratan en: McShane, H, 2011, ' 'Tuberculosis vaccines: beyond bacille Calmette-Guerin", Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, vol. 366, páginas 2782-2789; Von Eschen, K 2009, "The candidate tuberculosis vaccine Mtb72F/AS02A: Tolerability and immunogenicity in humans", Hum Vaccin., páginas 475-482; y Leroux-Roels, I y col., 2012, "Improved CD4+ T cell responses to Mycobacterium tuberculosis in PPD-negative adults by M72/AS01 as compared to the M72/AS02 and Mtb72F/AS02 tuberculosis candidate vaccine formulations: A randomized trial", Vaccine, vol. 31, páginas 2196-2206.
Sigue habiendo la necesidad de procedimientos novedosos de inmunización contra enfermedades, incluyendo la tuberculosis, que sean altamente eficaces, seguros, rentables, de larga duración y que induzcan un amplio espectro de respuestas inmunes de reactividad cruzada.
Sumario de la invención
Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que, en un procedimiento de múltiples dosis de inmunización con una vacuna de M72 con adyuvante, la inmunización era más eficaz cuando una dosis posterior (dosis de refuerzo) se retardaba en comparación con una dosis anterior (dosis de cebado). El adyuvante usado comprendía un agonista de TLR4, 3D-MPL, y una fracción de saponina inmunológicamente activa, QS21.
La presente invención proporciona una primera composición inmunogénica que comprende un antígeno M72, que comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1; y un adyuvante, en el que el adyuvante comprende un agonista de TLR y una saponina inmunológicamente activa, en el que el agonista de TLR es 3DMPL y la saponina es QS21; y una segunda composición inmunogénica que comprende un antígeno M72, que comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1; para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto, dicho procedimiento comprende la administración de la primera composición inmunogénica al sujeto, seguida de la administración de la segunda composición inmunogénica al sujeto, en el que el sujeto recibe un total de tres dosis de composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno M72 dentro de un período de cinco años, en el que el sujeto recibe dos dosis de la primera composición y una dosis de la segunda composición, en el que el intervalo de tiempo entre la administración final de la primera composición y la administración de la segunda composición está entre 3 meses y 5 años; en el que la primera y/o la
segunda composición inmunogénica comprenden entre 1 ug y 100 ug de antígeno M72; y en el que el primer adyuvante y, si está presente, el segundo adyuvante se proporcionan como formulaciones liposomales.
En consecuencia, se proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende la administración de una primera composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con m 72 y un primer adyuvante al sujeto, seguido de la administración de una segunda composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 al sujeto, en el que el primer adyuvante comprende un agonista de TLR y una saponina inmunológicamente activa y en el que el intervalo entre la primera y la segunda administración está entre tres meses y cinco años.
Opcionalmente, la segunda composición inmunogénica comprende un segundo adyuvante, en la que el segundo adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa. Adecuadamente, el segundo adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa y tiene al menos uno de estos dos componentes en común con el primer adyuvante.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Respuestas de linfocitos T CD4 de ratones administrados con M72 en los regímenes estándar y retardado
Figura 2: Respuestas de linfocitos T CD8 de ratones administrados con M72 en los regímenes estándar y retardado
Figura 3: Perfil de citocinas de linfocitos T CD4 de ratones administrados con M72 en los regímenes estándar y retardado
Figura 4: Perfil de citocinas de linfocitos T CD8 de ratones administrados con M72 en los regímenes estándar y retardado
Figura 5: Serología anti-M72 de ratones administrados con M72 en los regímenes estándar y retardado
Breve descripción de los identificadores de secuencia
SEQ ID NO: 1: secuencia polipeptídica de M72
SEQ ID NO: 2: secuencia polipeptídica de la proteína M72 con dos residuos de His N-terminales
SEQ ID NO: 3: secuencia polipeptídica de Mtb72f
Descripción detallada
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa crónica causada por infección con Mycobacterium tuberculosis y otras especies de Mycobacterium. Es una enfermedad importante en los países en desarrollo, así como un problema creciente en áreas desarrolladas del mundo. Se cree que más de 2.000 millones de personas están infectadas con el bacilo de TB, con aproximadamente 9 millones de casos nuevos de TB y 1,5 millones de muertes cada año Tuberculosis facts de la Organización Mundial de la Salud, 2014). El 10 % de las personas infectadas por el bacilo de TB va a desarrollar TB activa, infectando cada persona con TB activa un promedio de otras 10 a 15 al año.
Mycobacterium tuberculosis infecta a los individuos a través de la vía respiratoria. Los macrófagos alveolares envuelven la bacteria, pero es capaz de sobrevivir y proliferar mediante la inhibición de la fusión de fagosoma con lisosomas ácidos. Sobreviene una respuesta inmune compleja que implica linfocitos T CD4 y CD8 , dando como resultado en última instancia la formación de un granuloma. Es fundamental para el éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno el hecho de que la bacteria aislada, pero no erradicada, puede persistir durante largos períodos de tiempo, dejando un individuo vulnerable al desarrollo posterior de TB activa.
Menos del 5 % de los individuos infectados desarrollan una TB activa en los primeros años después de la infección. El granuloma puede persistir durante décadas y se cree que contiene Mycobacterium tuberculosis vivas en un estado de latencia, privadas de oxígeno y nutrientes. Sin embargo, recientemente se ha sugerido que la mayoría de las bacterias en el estado de latencia se encuentran en tipos de células no macrófagos extendidas por todo el cuerpo (Locht y col., Expert Opin. Biol. Ther. 2007; 7(11): 1665-1677. El desarrollo de TB activa se produce cuando el equilibrio entre la inmunidad natural del hospedador y el patógeno cambia, por ejemplo como resultado de un evento inmunosupresor (Anderson P Trends in Microbiology 2007 15 (1): 7-13; Ehlers S Infection 200937 (2): 87-95).
Se ha propuesto también una hipótesis dinámica que describe el equilibrio entre la TB latente y la TB activa (Cardana P-J Inflammation & Allergy - Drug Targets 20066: 27-39; Cardana P-J Infection 200937(2): 80-86).
Aunque una infección puede ser asintomática durante un período considerable de tiempo, la enfermedad activa se manifiesta lo más comúnmente como una inflamación aguda de los pulmones, dando como resultado cansancio, pérdida de peso, fiebre y una tos persistente. Si no se trata, da como resultado típicamente complicaciones graves y la muerte.
La tuberculosis en general se puede controlar usando una terapia antibiótica prolongada, aunque dicho tratamiento no es suficiente para prevenir la propagación de la enfermedad. Los individuos infectados activamente pueden ser en gran parte asintomáticos, pero contagiosos, durante algún tiempo. Además, aunque el cumplimiento del régimen de
tratamiento es crítico, el comportamiento del paciente es difícil de controlar. Algunos pacientes no completan el ciclo de tratamiento, lo que puede conducir a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de farmacorresistencia.
La TB multifarmacorresistente (MDR-TB) es una forma que no responde a los medicamentos de primera línea. El 3,3 % de todos los casos de TB son MDR-TB, produciéndose una estimación de 440.000 nuevos casos de MDR-TB cada año. La TB extremadamente farmacorresistente (XDR-TB) se produce cuando se desarrolla resistencia a los medicamentos de segunda línea además de resistencia a los medicamentos de primera línea. La XDR-TB prácticamente intratable se ha confirmado en 58 países (Tuberculosis Facts de la Organización Mundial de la Salud 2010).
Incluso si se ha completado un ciclo completo de tratamiento con antibióticos, la infección por M. tuberculosis puede no erradicarse del individuo infectado y puede permanecer como una infección latente que puede ser reactivada. Con el fin de controlar la propagación de la tuberculosis, un programa de vacunación eficaz y un diagnóstico precoz preciso de la enfermedad son de suma importancia.
En la actualidad, la vacunación con bacterias vivas atenuadas es el procedimiento más ampliamente usado para la inducción de inmunidad protectora. El Mycobacterium más común empleado para este fin es el Bacillus Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de M. bovis que se desarrolló por primera vez hace más de 60 años. Se administra al nacer en las regiones endémicas de TB. Sin embargo, la seguridad y la eficacia de la BCG es una fuente de controversia - aunque protege contra la manifestación de la enfermedad grave en los niños, la eficacia de la vacuna BCG contra la enfermedad es variable. Además, algunos países, como los Estados Unidos, no vacunan al público en general con este agente.
Se ha demostrado que varias de las proteínas que se expresan fuertemente durante las primeras etapas de infección por Mycobacterium proporcionan una eficacia protectora en modelos de vacunación animal. Sin embargo, la vacunación con antígenos que están altamente expresados durante las primeras etapas de la infección puede no proporcionar una respuesta inmune óptima para hacer frente a las etapas posteriores de la infección. El control adecuado durante la infección latente puede requerir linfocitos T que sean específicos de los antígenos particulares que se expresan en ese momento. Vacunas posteriores a la exposición que se orienten directamente a las bacterias persistentes pasivas pueden ayudar en la protección contra la reactivación de TB, potenciando así el control de TB, o incluso permitiendo la remisión de la infección. Una vacuna orientada a TB latente podría, por lo tanto, reducir de manera significativa y económicamente las tasas de infección de TB mundiales.
Las vacunas de subunidades basadas en antígenos de etapa tardía también se podrían utilizar en combinación con los antígenos de fase temprana para proporcionar una vacuna multifásica. Como alternativa, podrían usarse antígenos de fase temprana y/o tardía para complementar y mejorar la vacunación con BCG (ya sea por refuerzo de la respuesta de BCG o mediante el desarrollo de cepas de BCG recombinantes avanzadas).
Mtb72f y M72 son antígenos de proteína potencialmente beneficiosos para el tratamiento o la prevención de tuberculosis. Se ha mostrado que Mtb72f proporciona protección en una serie de modelos animales (véase, por ejemplo: Brandt y col. Infect. Immun. 200472(11): 6622-6632; Skeiky y col. J. Immunol. 2004172: 7618-7628; Tsenova y col. Infect. Immun. 200674(4): 2392-2401). Mtb72f también ha sido objeto de investigaciones clínicas (Von Eschen y col., 2009 Human Vaccines 5 (7): 475-482). M72 es un antígeno mejorado que incorpora una única mutación de serina a alanina en relación con Mtb72f, dando como resultado características mejoradas de estabilidad. Se ha mostrado también que los antígenos relacionados con M72 son de valor en un modelo de TB latente (solicitud de patente internacional WO2006/117240). Investigaciones clínicas anteriores han conducido a que se administre M72 a seres humanos junto con los inmunoestimulantes monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) y QS21 en una formulación liposomal y en un programa de 0,1 meses con 10 ug de M72, 25 ug de 3D-MPL y 25 ug de QS21 (véase, por ejemplo, Leroux-Roels y col. Vaccine 2013312196-2206, Montoya y col. J. Clin. Immunol. 201333(8): 1360-1375).
Una vacuna candidata que utiliza el antígeno M72 se encuentra actualmente en un ensayo de fase IIB (identificador ClinicalTrials.gov: NCT01755598) para evaluar la eficacia protectora de dos dosis contra la TB pulmonar, en comparación con el placebo, en adultos de 18-50 años que viven en países endémicos de TB. No obstante, continúa la necesidad de enfoques de vacunación mejorados.
En un primer aspecto, se proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende la administración de una primera composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 y un primer adyuvante al sujeto, seguido por la administración de una segunda composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionada con M72 al sujeto, en el que el primer adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa y en el que el intervalo entre la primera y la segunda administración está entre dos meses y cinco años.
Tal como se usa en el presente documento, la administración de una primera composición "seguida de" la administración de una segunda composición indica que ha transcurrido un intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración de la segunda composición.
También se proporciona un primera composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 y un primer adyuvante, en la que el primer adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina
inmunológicamente activa, para uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento la administración de la primera composición inmunogénica al sujeto, seguido de la administración de una segunda composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 al sujeto, y en la que el intervalo entre la primera y la segunda administración está entre dos meses y cinco años.
Del mismo modo, se proporciona una segunda composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento la administración de una primera composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 y un primer adyuvante, en la que el primer adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa, a un sujeto, seguido de la administración de la segunda composición inmunogénica al sujeto, y en la que el intervalo entre la primera y la segunda administración está entre dos meses y cinco años.
Además, se proporciona el uso de una primera composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 y un primer adyuvante, en la que el primer adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa, en la fabricación de un medicamento para uso en un procedimiento de inducción de una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento la administración de la primera composición inmunogénica al sujeto, seguido de la administración de una segunda composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 al sujeto, y en la que el intervalo entre la primera y la segunda administración está entre dos meses y cinco años.
Además, se proporciona el uso de una segunda composición inmunogénica en la fabricación de un medicamento para uso en un procedimiento de inducción de una respuesta inmune en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento la administración de una primera composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 y un primer adyuvante, en el que el primer adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa, al sujeto, seguido de la administración de la segunda composición inmunogénica que comprende un antígeno relacionado con M72 al sujeto, y en el que el intervalo entre la primera y la segunda administración está entre dos meses y cinco años.
Opcionalmente, la segunda composición inmunogénica comprende un segundo adyuvante en el que el segundo adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa. Adecuadamente, el segundo adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa y tiene al menos uno de estos dos componentes en común con el primer adyuvante.
Adecuadamente, el sujeto es un ser humano.
Típicamente, el objetivo del procedimiento de la invención es inducir una respuesta inmune protectora, es decir, inmunizar o vacunar al sujeto frente a un patógeno relacionado. Por lo tanto, la invención se puede aplicar para la profilaxis, tratamiento o mejora de la infección por micobacterias, tal como infección por Mycobacterium tuberculosis. En particular, la invención se puede proporcionar con el fin de:
- profilaxis de tuberculosis activa debida a infección o reactivación, tal como mediante administración a un sujeto que no está infectado o, como alternativa, a un sujeto que tiene una infección latente;
- profilaxis de tuberculosis latente, tal como mediante administración a un sujeto que no está infectado;
- tratamiento de tuberculosis latente;
- prevención o retardo de la reactivación de tuberculosis, especialmente retardo de la reactivación de TB, por ejemplo, durante un período de meses, años o indefinidamente; o
- tratamiento de tuberculosis activa.
La expresión "infección activa" hace referencia a una infección, por ejemplo, la infección por M. tuberculosis, con síntomas de la enfermedad manifestados y/o lesiones, adecuadamente con síntomas de la enfermedad manifestados.
Las expresiones "infección inactiva", "infección pasiva" o "infección latente" o "tuberculosis latente" hacen referencia a una infección, por ejemplo, infección por M. tuberculosis, sin síntomas de enfermedad manifestados y/o lesiones, adecuadamente sin síntomas de enfermedad manifestados. Un sujeto con infección latente será adecuadamente aquel que dé positivo de infección, por ejemplo, por PPD o ensayos basados en linfocitos T, pero que no ha demostrado los síntomas de la enfermedad y/o lesiones que se asocian con una infección activa.
La expresión "tuberculosis primaria" hace referencia a la enfermedad clínica, por ejemplo, la manifestación de síntomas de la enfermedad, directamente después de la infección, por ejemplo, la infección por M. tuberculosis. Véase “Harrison's Principles of Internal Medicine” , capítulo 150, pág. 953-966 (16a ed., Braunwald, y col. Eds., 2005).
Las expresiones "tuberculosis secundaria" o "tuberculosis postprimaria" hacen referencia a la reactivación de una infección pasiva, inactiva o latente, por ejemplo, infección por M. tuberculosis. Véase “Harrison's Principles of Internal Medicine” , capítulo 150, pág. 953-966 (16a ed., Braunwald, y col. Eds., 2005).
La expresión "reactivación de la tuberculosis" hace referencia a la manifestación posterior de síntomas de la enfermedad en un individuo que da positivo de infección (por ejemplo, en una prueba cutánea de tuberculina, adecuadamente en un ensayo basado en linfocitos T in vitro) pero que no tiene síntomas aparentes de la enfermedad.
Adecuadamente, el individuo no se habrá reexpuesto a la infección. La prueba de diagnóstico positiva indica que el individuo está infectado, sin embargo, el individuo puede o no haber manifestado previamente síntomas de la enfermedad activa que se habían tratado suficientemente para llevar la tuberculosis a un estado inactivo o latente.
Adecuadamente, las composiciones inmunogénicas se administran a un sujeto que no está infectado o que tiene una infección latente por micobacterias, tales como infección por Mycobacterium tuberculosis.
En algunas realizaciones, el sujeto se ha vacunado previamente con BCG.
En algunas realizaciones, el sujeto se ha infectado previamente con M. tuberculosis.
Antígenos de uso en la invención.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "antígeno relacionado con M72” hace referencia a la proteína M72 proporcionada en la SEQ ID NO: 1 o a un derivado inmunogénico de la misma. Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado” hace referencia a un antígeno que está modificado con respecto a la secuencia de referencia. Los derivados inmunogénicos son suficientemente similares a la secuencia de referencia para retener las propiedades inmunogénicas de la secuencia de referencia y siguen siendo capaces de permitir crear una respuesta inmune contra la secuencia de referencia. Un derivado puede, por ejemplo, comprender una versión modificada de la secuencia de referencia o, como alternativa, puede consistir en una versión modificada de la secuencia de referencia.
El antígeno relacionado con M72 puede contener, por ejemplo, menos de 1500 residuos de aminoácidos, tales como menos de 1200 residuos de aminoácidos, en particular menos de 1000 residuos de aminoácidos, especialmente menos de 800 residuos de aminoácidos.
Los epítopos de linfocitos T son tramos contiguos cortos de aminoácidos que se reconocen por linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD4+ o CD8+). La identificación de epítopos de linfocitos T puede conseguirse mediante experimentos de cartografía de epítopos que son conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, Paul, “Fundamental Immunology”, 3° ed, 243-247 (1993); Beipbarth y col. Bioinformatics 200521 (Suppl. 1): i29-i37). En una población exogámica diversa, tales como seres humanos, los diferentes tipos de HLA significan que epítopos particulares no pueden reconocerse por todos los miembros de la población. Como resultado de la participación crucial de la respuesta de linfocitos T en la tuberculosis, para maximizar el nivel de reconocimiento y la escala de la respuesta inmune, un derivado inmunogénico de M72 es deseablemente aquel que contiene la mayoría (o adecuadamente todos) los epítopos de linfocitos T intactos.
El experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a la proteína M72 que alteran, añaden o eliminan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos son un "derivado inmunogénico" donde la alteración(es) da(n) como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido funcionalmente similar o la sustitución/deleción/adición de residuos que no afectan sustancialmente a la función inmunogénica.
Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la materia. En general, dichas sustituciones conservativas entran dentro de una de las agrupaciones de aminoácidos especificadas a continuación, aunque en algunas circunstancias otras sustituciones pueden ser posibles sin afectar sustancialmente a las propiedades inmunogénicas del antígeno. Los ocho grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son típicamente sustituciones conservativas entre sí:
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cisteína (C), Metionina (M)
(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins 1984).
De forma adecuada, dichas sustituciones no se producen en la región de un epítopo y no tienen, por lo tanto, un efecto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.
Los derivados inmunogénicos también pueden incluir aquellos en los que se insertan aminoácidos adicionales en comparación con la secuencia de referencia. De forma adecuada, dichas inserciones no se producen en la región de un epítopo y no tienen, por lo tanto, un efecto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno. Un ejemplo de inserciones incluye un tramo corto de residuos de histidina (por ejemplo, 2-6 residuos) para ayudar a la expresión y/o purificación del antígeno en cuestión.
Los derivados inmunogénicos incluyen aquellos en los que se han eliminado aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia. De forma adecuada, dichas deleciones no se producen en la región de un epítopo y no tienen, por lo tanto, un efecto significativo sobre las propiedades inmunogénicas del antígeno.
El experto reconocerá que un derivado inmunogénico particular puede comprender sustituciones, deleciones y adiciones (o cualquier combinación de las mismas).
Las expresiones "idéntico” o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias polipeptídicas, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos que son los mismos (es decir, 70 % de identidad, opcionalmente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad sobre una región especificada), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineamiento manual e inspección visual. Esta definición hace también referencia al complemento de una secuencia de prueba. Opcionalmente, existe identidad sobre una región que es de al menos 500 aminoácidos de longitud, como al menos 600 aminoácidos o al menos 700 aminoácidos. Convenientemente, la comparación se realiza sobre una ventana que corresponde a toda la longitud de la secuencia de referencia (en contraposición a la secuencia derivada).
Para comparación de secuencias, una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia se introducen en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Se pueden usar parámetros del programa por defecto, o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces las identidades de secuencia porcentuales para las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, hace referencia a un segmento en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean de manera óptima. Los procedimientos de alineamiento de secuencias para su comparación son bien conocidos en la materia. La alineamiento óptima de secuencias para su comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85: 2444), mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (g Ap , BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, “Current Protocols in Molecular Biology” (1995) Ausubel y col., eds. 1995 suplemento)).
Otro ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos progresivos por pares para mostrar la relación e identidad de secuencia porcentual. También se representa un árbol o dendograma que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del procedimiento de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351-360 (1987). El procedimiento usado es similar al procedimiento descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5 : 151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineamiento múltiple empieza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, produciendo un agrupamiento de dos secuencias alineadas. Este agrupamiento después se alinea con la siguiente secuencia o agrupamiento de secuencias alineadas más relacionadas. Se alinean dos agrupamientos de secuencias por la simple extensión del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se consigue mediante una serie de alineamientos progresivos por pares. El programa se ejecuta designando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencia y designando los parámetros del programa. Usando PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de prueba para determinar la relación de identidad de secuencia porcentual usando los siguiente parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10), y huecos finales ponderados. PILEUP puede obtenerse del paquete de software de análisis de secuencia GCG, p.ej. la versión 7.0 (Devereaux, y col., Nuc. Acids Res. 12: 387-395(1984)).
Otros ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col., Nuc. Acids Res. 25: 3389 3402, 1977 y Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (sitio web en www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta valoración (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que se ajusta a o satisface alguna puntuación umbral T de valoración positiva cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se hace referencia como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul, y col., citado anteriormente). Estos aciertos iniciales de palabra vecina actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación acumulativa de alineamiento. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulativa de alineamiento disminuye en la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa llega a cero o por debajo, debido a la
acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra de 3, una esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)), alineamiento (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se produciría por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01, y lo más preferiblemente menor de aproximadamente 0.001.
En cualquier caso, los derivados inmunogénicos de una secuencia de polipéptido tendrán esencialmente la misma actividad que la secuencia de referencia. Por esencialmente la misma actividad se entiende al menos 50 %, adecuadamente al menos 75 % y especialmente al menos 90 % de actividad de la secuencia de referencia en un ensayo de reestimulación in vitro de PBMC o sangre entera con antígenos específicos (por ejemplo, reestimulación durante un período de entre varias horas a un máximo de dos semanas, como hasta un día, de 1 día a 1 semana o de 1 a 2 semanas) que mide la activación de las células a través de linfoproliferación, producción de citocinas en el sobrenadante de cultivo (medida por ELISA, CBA etc.) o caracterización de las respuestas de linfocitos T y B por tinción intra- y extracelular (por ejemplo, usando anticuerpos específicos de marcadores inmunitarios tales como CD3, CD4, CD8, iL2, TNF-alfa, IFN-gamma, CD40L, CD69 etc.), seguido de análisis con un citómetro de flujo. De forma adecuada, por esencialmente la misma actividad se entiende al menos 50 %, adecuadamente al menos 75 % y especialmente al menos 90 % de la actividad de la secuencia de referencia en un ensayo de proliferación de linfocitos T y/o de producción de IFN-gamma.
Los derivados particulares de la proteína M72 incluyen aquellos con residuos de His adicionales en el extremo N (por ejemplo, dos residuos de His, como se proporciona en la SEQ ID NO: 2; o un marcador de polihistidina de cinco o particularmente seis residuos de His, que puede usarse para purificación de afinidad con níquel). Mtb72f (SEQ ID NO: 3), que contiene el residuo de serina original que ha mutado en M72, es un derivado adicional de M72, como son las proteínas Mtb72f con residuos de His adicionales en el extremo N (por ejemplo, dos residuos de His, o un marcador de polihistidina de cinco o particularmente seis residuos de His, que se pueden usar para purificación de afinidad con níquel).
Adecuadamente, un antígeno relacionado con M72 comprenderá, tal como consistirá en, una secuencia que tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, tal como al menos un 80 %, en particular al menos un 90 %, especialmente al menos un 95 %, tal como al menos un 98 %, por ejemplo al menos un 99 %.
Los antígenos típicos relacionados con M72 comprenderán, tal como consistirán en, un derivado inmunogénico de SEQ ID NO: 1 o 2 que tiene un pequeño número de deleciones, inserciones y/o sustituciones. Son ejemplos aquellos que tienen deleciones de hasta 5 residuos en 0-5 localizaciones, inserciones de hasta 5 residuos en 0-5 cinco localizaciones y sustituciones de hasta 20 residuos.
Otros derivados inmunogénicos de M72 son aquellos que comprenden, tal como que consisten en, un fragmento de SEC ID No: 1 o 2 que es al menos de 300 aminoácidos de longitud, tal como al menos de 350 aminoácidos de longitud, tal como al menos de 400 aminoácidos de longitud, tal como al menos de 500 aminoácidos de longitud, tal como al menos de 600 aminoácidos de longitud o tal como al menos de 700 aminoácidos de longitud. Como M72 es una proteína de fusión derivada de dos antígenos individuales, cualquier fragmento de al menos 300 residuos comprenderá una pluralidad de epítopos de la secuencia de longitud completa (Skeiky y col., J. Immunol. 2004 172: 7618-7628; Skeiky, Infect. Immun. 199967(8): 3998-4007; Dillon, Infect. Immun. 1999; 67(6): 2941-2950. En algunas formas de realización, el derivado inmunogénico de M72 comprende al menos 300 residuos de Mtb39A.
En realizaciones particulares, el antígeno relacionado con M72 comprenderá los residuos 2-723 de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, comprenderá (o consistirá en) las SEQ ID NO: 1 o 2.
Se pueden preparar antígenos relacionados con M72 mediante procedimientos descritos previamente (documento WO2006/117240) o procedimientos análogos a ellos.
Las composiciones inmunogénicas pueden comprender uno o más componentes antigénicos adicionales. Los componentes antigénicos adicionales pueden estar destinados a reforzar o complementar las respuestas inmunes provocadas por el antígeno relacionado con M72 en el campo de la prevención y terapia de la tuberculosis, o podrían asociarse antígenos adicionales con otros patógenos y destinarse a la administración con el antígeno relacionado con M72 por razones de conveniencia. Cuando están presentes una serie de componentes antigénicos dentro de la
formulación, estos se pueden proporcionar en forma de polipéptidos individuales o proteínas de fusión. En algunas circunstancias, pueden proporcionarse componentes antigénicos adicionales como un polinucleótido (o polinucleótidos).
El antígeno es un antígeno de M. tuberculosis tal como el antígeno M72, por ejemplo, el antígeno se describe en el documento WO2006/117240, concedido como Patente de los Estados Unidos. N.°: 8.470.338 y describe las proteínas adecuadas para uso en la presente invención.
Típicamente para administración a seres humanos, la primera y segunda composiciones inmunogénicas comprenderán entre 1 ug y 100 ug de antígeno relacionado con M72, tal como entre 1 ug y 50 ug. Adecuadamente, la primera composición inmunogénica contendrá entre 1 ug y 50 ug de antígeno relacionado con M72 (tal como entre 5 ug y 50 ug), especialmente entre 1 ug y 20 ug (tal como entre 5 ug y 20 ug) y, en particular, aproximada o exactamente 10 ug.
En algunas realizaciones, la segunda composición inmunogénica contendrá la misma cantidad de antígeno relacionado con M72 que la primera composición inmunogénica. Por ejemplo, la segunda composición inmunogénica contendrá entre 1 ug y 50 ug de antígeno relacionado con M72 (tal como entre 5 ug y 50 ug), especialmente entre 1 ug y 20 ug (tal como entre 5 ug y 20 ug) y, en particular, aproximada o exactamente 10 ug.
En otras realizaciones, la segunda composición inmunogénica contendrá una cantidad reducida de antígeno relacionado con M72 en relación con la primera composición inmunogénica. Por ejemplo, la segunda composición inmunogénica contendrá entre 1 ug y 40 ug de antígeno relacionado con M72 (tal como entre 2 ug y 40 ug), especialmente entre 1 ug y 16 ug (tal como entre 2 ug y 16 ug) y, en particular, menos de 10 ug (tal como de 1 a 8 ug).
En una realización, la menor cantidad de antígeno relacionado con M72 en la segunda composición inmunogénica es una cantidad al menos un 10 % menor, tal como al menos un 25 % menor, por ejemplo, al menos dos veces menor, tal como al menos tres veces menor , por ejemplo, al menos cuatro veces menor, tal como al menos cinco veces menor, por ejemplo, al menos seis veces menor, tal como al menos siete veces menor, por ejemplo, al menos ocho veces menor, tal como al menos nueve menor, por ejemplo, al menos diez veces menor, que en la primera composición inmunogénica.
La cantidad del antígeno relacionado con M72 en la segunda composición inmunogénica es típicamente entre 5/4 (es decir, 125 %) y 1/10 (es decir, 10 %) de la de la primera composición inmunogénica.
En una realización de la invención, la primera y segunda composiciones inmunogénicas contienen el mismo antígeno relacionado con M72.
En algunas formas de realización, todos los antígenos en la primera y segunda composiciones inmunogénicas son iguales.
Adyuvantes para su uso en el procedimiento de la invención
Como se describió anteriormente, en un aspecto de la invención, el primer adyuvante comprende un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa.
Por tanto, en una realización, el primer adyuvante comprende un agonista de TLR. En otra realización, el primer adyuvante comprende una saponina inmunológicamente activa. En aún otra realización, el primer adyuvante comprende un agonista de TLR y una saponina inmunológicamente activa.
En otro aspecto, el primer adyuvante y segundo adyuvante comprenden un agonista de TLR y/o una saponina inmunológicamente activa y tienen al menos uno de estos dos componentes en común.
Por tanto, en una realización, el primer adyuvante y el segundo adyuvante comprenden ambos un agonista de TLR. En otra realización, el primer adyuvante y el segundo adyuvante comprenden ambos una saponina inmunológicamente activa. En aún otra realización, el primer adyuvante y el segundo adyuvante comprenden ambos un agonista de TLR y un saponina inmunológicamente activa.
En una realización, el primer adyuvante y el segundo adyuvante consisten en los mismos componentes. Por tanto, en dicha realización, los componentes de ambos adyuvantes son iguales, aunque no necesariamente en las mismas proporciones relativas. Por ejemplo, el primer adyuvante y el segundo adyuvante pueden consistir ambos en un agonista de TLR y una saponina en una formulación liposomal, pero la relación de agonista de TLR a saponina puede ser 5: 1 en el primer adyuvante y 1: 1 en el segundo adyuvante, 4: 1 en el primer adyuvante y 1: 1 en el segundo adyuvante, 3: 1 en el primer adyuvante y 2: 1 en el segundo adyuvante, 1: 1 en el primer adyuvante y 1: 1 en el segundo adyuvante.
En otra realización, el primer adyuvante y el segundo adyuvante consisten en los mismos componentes y las proporciones relativas de estos componentes son los mismos. Sin embargo, en dicha realización, aunque que las proporciones relativas de los componentes adyuvantes son las mismas, las cantidades absolutas de estos
componentes pueden ser diferentes entre la primera y segunda composiciones inmunogénicas. Por ejemplo, las cantidades absolutas de todos los componentes en el segundo adyuvante pueden ser, por ejemplo una quinta parte de las cantidades absolutas de todos los componentes en el primer adyuvante.
Como se ha descrito anteriormente, en una realización, el segundo adyuvante contiene una cantidad menor del componente común (es decir, una cantidad menor del agonista de TLR o una cantidad menor de la saponina o una cantidad menor de ambos) que el primer adyuvante.
En una realización, la cantidad menor del componente común en el segundo adyuvante es una cantidad al menos un 10 % menor, tal como al menos un 25 % menor, por ejemplo, al menos dos veces menor, tal como al menos tres veces menor, por ejemplo, al menos cuatro veces menor, tal como al menos cinco veces menor, por ejemplo, al menos seis veces menor, tal como al menos siete veces menor, por ejemplo, al menos ocho veces menor, tal como al menos nueve veces menor, por ejemplo, al menos diez veces menor, tal como al menos 15 veces menor, por ejemplo, al menos 20 veces menor que en el primer adyuvante.
En otra realización, la cantidad menor del componente común en el segundo adyuvante es una cantidad entre 2 y 50 veces menor, tal como entre 2 y 20 veces menor, por ejemplo, entre 2 y 15 veces menor, tal como entre 2 y 10 veces menor, por ejemplo, entre 3 y 7 veces menor, tal como entre 4 y 6 veces menor que en el primer adyuvante.
La cantidad del componente adyuvante común (tal como todos los componentes adyuvantes comunes) en la segunda composición inmunogénica es típicamente entre 5/4 (es decir, 125 %) y 1/10 (es decir, 10 %) de la de la primera composición inmunogénica.
Como se describió anteriormente, en una realización, el primer adyuvante y el segundo adyuvante comprenden un agonista de TLR (receptor de tipo Toll). El uso de agonistas de TLR en adyuvantes es bien conocido en la materia y se ha revisado por ejemplo, por Lahiri y col. (2008) Vaccine 26: 6777. Los TLR que pueden estimularse para lograr un efecto adyuvante incluyen TLR2, TLr 4, TlR5, TLR7, TLR8 y TLR9. Se prefieren agonistas de TLR2, TlR4, TLR7 y TLR8, en particular agonistas de TLR4.
Los agonistas de TLR4 adecuados incluyen lipopolisacáridos, tales como monofosforil-lípido A (MPL) y monofosforillípido A 3-O-desacilado (3D-MPL). La patente de EE.UU. 4.436.727 da a conocer MPL y su fabricación. La patente de EE.UU. 4.912.094 y el certificado de reexamen B1 4.912.094 dan a conocer 3D-MPL y un procedimiento para su fabricación. Es otro agonista de TLR4 es el adyuvante lipídico glucopiranosilo (GLA), una molécula de tipo A lipídica sintética (véase, por ejemplo Fox y col. (2012) Clin. Vaccine Immunol 19: 1633). En una realización adicional, el agonista de TLR4 puede ser un agonista de TLR4 sintético, tal como una molécula de disacárido sintético, similar en estructura a MPL y 3D-MPL, o puede ser moléculas de monosacáridos sintéticos, tales como compuestos de fosfato de aminoalquilglucosaminida (AGP) descritos, por ejemplo, en los documentos WO9850399, WO0134617, WO0212258, W03065806, WO04062599, WO06016997, WO0612425, WO03066065 y WO0190129. Dichas moléculas también se han descrito en la bibliografía científica y de patentes como miméticos de lípido A. Los miméticos de lípido A comparten adecuadamente alguna actividad funcional y/o estructural con el lípido A, y en un aspecto son reconocidos por los receptores de TLR4. Se hace referencia a veces a los AGP como se describen en el presente documento como miméticos de lípido A en la materia. En una realización preferida, el agonista de TLR4 es 3D-MPL. Los agonistas de TLR4, tales como monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), y su uso como adyuvantes en vacunas se han descrito, por ejemplo, en los documentos WO 96/33739 y WO2007/068.907 y revisado en Alving y col. (2012) Curr Opin in Immunol 24: 310.
En una realización adicional del procedimiento de la invención, el primer adyuvante y el segundo adyuvante comprenden una saponina inmunológicamente activa, tal como una fracción de saponina inmunológicamente activa, tal como QS21.
Los adyuvantes que comprenden saponinas se han descrito en la materia. Las saponinas se describen en: Lacaille-Dubois y Wagner (1996) “A review of the biological and pharmacological activities of saponins”. Phytomedicine vol. 2: 363. Las saponinas son conocidas como adyuvantes en vacunas. Por ejemplo, Quil A (derivado de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina), se describió por Dalsgaard y col. en 1974 ("Saponin adjuvants", “Archiv. für die gesamte Virusforschung”, Vol. 44, Springer Verlag, Berlín, 243) que tenía actividad adyuvante. Se han aislado fracciones purificadas de Quil A por HPLC que retienen la actividad adyuvante sin la toxicidad asociada a Quil A (Kensil y col. (1991) J. Immunol. 146: 431. Se describen también fracciones de Quil A en el documento US 5.057.540 y "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R. , Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55.
Dos de dichas fracciones, adecuadas para uso en la presente invención, son QS7 y QS21 (también conocidas como QA-7 y QA-21). QS21 es una fracción de saponina inmunológicamente activa preferida para uso en la presente invención. QS21 se ha revisado en Kensil (2000) En O'Hagan: “Vaccine Adjuvants: preparation methods and research protocols”. Homana Press, Totowa, Nueva Jersey, capítulo 15. Se describen sistemas de partículas adyuvantes que comprenden fracciones de Quil A, tales como QS21 y QS7, por ejemplo en los documentos WO 96/33739, Wo 96/11711 y WO2007/068907.
Además de los demás componentes, el adyuvante comprende preferentemente un esterol. La presencia de un esterol puede reducir aún más la reactogenicidad de composiciones que comprenden saponinas, véase, por ejemplo el
documento EP0822831. Los esteróles adecuados incluyen beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. El colesterol es particularmente adecuado. Adecuadamente, la fracción de saponina inmunológicamente activa es QS21 y la relación de QS21:esterol es de 1:100 a 1:1 p/p, tal como de 1:10 a 1:1 p/p, p.ej. de 1:5 a 1:1 p/p.
En una realización preferida del procedimiento de la invención, el agonista de TLR4 es 3D-MPL y la saponina inmunológicamente activa es QS21.
En algunas realizaciones, el adyuvante se presenta en forma de una emulsión de aceite en agua, por ejemplo, que comprende escualeno, alfa-tocoferol y un agente tensioactivo (véase, por ejemplo el documento W095/17210) o en forma de un liposoma. Se prefiere una presentación liposomal.
El término "liposoma" cuando se usa en el presente documento hace referencia a estructuras lipídicas uni- o multilamelares (en particular 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 lamelas dependiendo del número de membranas lipídicas formadas) que encierran un interior acuoso. Los liposomas y formulaciones de liposomas son bien conocidos en la materia. Se describen presentaciones liposomales, p.ej., en los documentos WO 96/33739 y WO2007/068907. Los lípidos que son capaces de formar liposomas incluyen todas las sustancias que tienen propiedades grasas o de tipo grasa. Los lípidos que pueden constituir los lípidos en los liposomas se pueden seleccionar del grupo que comprende glicéridos, glicerofosfolípidos, glicerofosfinolípidos, glicerofosfonolípidos, sulfolípidos, esfingolípidos, fosfolípidos, isoprenolidas, esteroides, estearinas, esteroles, arqueolípidos, lípidos catiónicos sintéticos y lípidos que contienen hidratos de carbono. En una realización particular de la invención, los liposomas comprenden un fosfolípido. Los fosfolípidos adecuados incluyen (pero no se limitan a): fosfocolina (PC) que es un intermedio en la síntesis de fosfatidilcolina; derivados de fosfolípidos naturales: fosfocolina de huevo, fosfocolina de huevo, fosfocolina de soja, de fosfocolina de soja hidrogenada y esfingomielina como fosfolípidos naturales; y derivados sintéticos de fosfolípidos: fosfocolina (didecanoil-L-a-fosfatidilcolina [DDPC], dilauroilfosfatidilcolina [DLPC], dimiristoilfosfatidilcolina [DMPC], dipalmitoilfosfatidilcolina [DPPC], diestearoilfosfatidilcolina [DSPC], dioleoilfosfatidilcolina, [DOPC], 1 -palmitoil-2 -oleoilfosfatidilcolina [POPC], dielaidoilfosfatidilcolina [DEPC]), fosfoglicerol (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol [DMPG], 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol [d Pp G], 1, 2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol [DSPG], 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3 fosfoglicerol [POPG]), ácido fosfatídico (ácido 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatídico [DMPA], ácido dipalmitoilfosfatídico [DPPA], ácido diestearoilfosfatídico [DSPA]), fosfoetanolamina (1,2-dimiristoil-snglicero-3-fosfoetanolamina [DMPE], 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [DPPE], 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [DSPE], 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [DOPE]), fosfoserina y fosfolípido de polietilenglicol [PEG ].
El tamaño de los liposomas puede variar de 30 nm a varios um dependiendo de la composición de fosfolípidos y del procedimiento usado para su preparación. En realizaciones particulares de la invención, el tamaño de los liposomas estará en el intervalo de 50 nm a 500 nm y, en otras realizaciones de 50 nm a 200 nm. La dispersión dinámica de luz láser es un procedimiento usado para medir el tamaño de los liposomas bien conocido por los expertos en la materia.
En una realización particularmente adecuada, los liposomas usados en la invención comprenden DOPC y un esterol, en particular colesterol. Por tanto, en una realización particular, las composiciones de la invención comprenden QS21 en cualquier cantidad descrita en este documento en forma de un liposoma, en las que dicho liposoma comprende DOPC y un esterol, en particular colesterol.
Preferiblemente, el primera adyuvante y el segundo adyuvante comprenden 3D-MPL y QS21 en una formulación liposomal.
En una realización, el primer adyuvante comprende entre 12,5 y 75 microgramos de 3D-MPL y entre 12,5 y 75 microgramos de QS21 en una formulación liposomal, y el segundo adyuvante comprende entre 12,5 y 75 microgramos de 3D-MPL y entre 12,5 y 75 microgramos de QS21 en una formulación liposomal.
En otra realización, el primer adyuvante comprende entre 12,5 y 37,5, tal como entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo aproximada o exactamente 25 microgramos) de 3D-MPL y entre 12,5 y 37,5, tal como entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo aproximada o exactamente 25 microgramos) de QS21 en una formulación liposomal y el segundo adyuvante comprende entre 12,5 y 37,5, tal como entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo aproximada o exactamente 25 microgramos) de 3D-MPL y entre 12,5 y 37,5, tal como entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo aproximada o exactamente 25 microgramos) de QS21 en una formulación liposomal. Adecuadamente, en el primer y segundo adyuvantes, la cantidad de 3D-MPL es la misma que la cantidad de QS21.
En otra realización, el primer adyuvante comprende entre 12,5 y 37,5, tal como entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo aproximada o exactamente 25 microgramos) de 3D-MPL y entre 12,5 y 37,5, tal como entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo, aproximada o exactamente 25 microgramos) de QS21 en una formulación liposomal, y el segundo adyuvante comprende entre 2,5 y 7,5, tal como 5 microgramos, de 3D-MPL y entre 2,5 y 7,5, tal como 5 microgramos, de QS21 en una formulación liposomal.
En otra realización, el primer adyuvante comprende entre 12,5 y 37,5, tal como entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo aproximada o exactamente 25 microgramos) de 3D-MPL y entre 12,5 y 37,5, por ejemplo entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo, aproximada o exactamente 25 microgramos) de QS21 en una formulación liposomal, y el segundo adyuvante comprende una cantidad reducida de 3D-MPL o QS21, tal como entre 2,5 y 20, tal como entre 2,5 y 10
microgramos (por ejemplo, aproximadamente o exactamente 5 microgramos) de 3D-MPL y tal como entre 2,5 y 20, tal como entre 2,5 y 10 microgramos (por ejemplo, aproximada o exactamente 5 microgramos) de QS21 en una formulación liposomal. Adecuadamente, en el primer y segundo adyuvantes, la cantidad de 3D-MPL es la misma que la cantidad de QS21.
Es bien sabido que, para administración parenteral, las soluciones deben ser fisiológicamente isotónicas (es decir, tener una osmolalidad farmacéuticamente aceptable) para evitar la distorsión o lisis celular. Una osmolalidad farmacéuticamente aceptable por lo general significará que las soluciones tendrán una osmolalidad que es aproximadamente isotónica o ligeramente hipertónica. Adecuadamente, las composiciones inmunogénicas de la presente invención tendrán una osmolalidad en el intervalo de 250 a 750 mOsm/k g, por ejemplo, la osmolalidad puede estar en el intervalo de 250 a 550 mOsm/kg, tal como en el intervalo de 280 a 500 mOsm/kg. La osmolalidad se puede medir según técnicas conocidas en la materia, tales como mediante el uso de un osmómetro comercialmente disponible, por ejemplo, el modelo Advanced® 2020 disponible en Advanced Instruments Inc. (EE. UU.). Un "agente de isotonicidad" es un compuesto que se tolera fisiológicamente y confiere una tonicidad adecuada a una formulación (p.ej. composiciones inmunogénicas de la invención) para evitar el flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con la formulación. Son conocidas composiciones acuosas adyuvantes que contienen cloruro de sodio 100 mM o más, por ejemplo el sistema adyuvante A (ASA), en los documentos WO 2005/112991 y WO2008/142133 o los adyuvantes liposómicos descritos en el documento WO2007/068907.
En algunas realizaciones, el agente de isotonicidad usado para la composición es una sal. En otras realizaciones, sin embargo, la composición comprende un agente de isotonicidad no iónico y la concentración de cloruro de sodio o la fuerza iónica en la composición es menor de 100 mM, tal como menor de 80 mM, por ejemplo, menor de 30 mM, tal como menor de 10 mM o menor de 5 mM. En una realización preferida, el agente de isotonicidad no iónico es un poliol, tal como sorbitol. La concentración de sorbitol puede estar, por ejemplo, entre aproximadamente 3 % y aproximadamente 15% (p/v), tal como entre aproximadamente 4 % y aproximadamente 10 % (p/v). Los adyuvantes que comprenden una fracción de saponina inmunológicamente activa y un agonista de TLR4 en los que el agente de isotonicidad es sal o un poliol se han descrito en el documento WO2012/080369.
En una realización adicional, el primero adyuvante y/o el segundo adyuvante no comprenden aluminio.
El pH de las composiciones inmunogénicas debe ser adecuado para administración parenteral. Típicamente, el pH estará en el intervalo de 7,0 a 9,0, especialmente de 7,25 a 8,75, tal como de 7,5 a 8,5, en particular, de pH 7,75 a 8,25. Un pH de aproximadamente 8,0 es de particular interés.
Regímenes de inmunización, poblaciones diana y modos de administración
En una realización, el sujeto recibe dos dosis de composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno de M72 en un período de dos años o, como alternativa, en un periodo de cinco años. En una segunda realización, el sujeto recibe tres dosis de composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno de M72 en un período de dos años o, como alternativa, en un periodo de cinco años.
Cuando el sujeto recibe dos dosis de composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno de M72 en un período de cinco años, estas serán la primera composición inmunogénica y la segunda composición inmunogénica. En una realización, el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y administración de la segunda composición está entre 2 meses y 5 años, tal como entre 3 meses y 5 años, tal como entre 3 meses y 24 meses, por ejemplo, entre 3 y 18 meses, tal como entre 3 y 14 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración de la segunda composición está entre 3 y 10 meses, por ejemplo, entre 3 y 9 meses, tal como entre 3 y 8 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración de la segunda composición está entre 4 y 14 meses, por ejemplo, entre 4 y 9 meses, tal como entre 4 y 8 meses.
Cuando el sujeto recibe tres dosis de composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno de M72 en un período de cinco años, estas pueden ser (a) dos dosis de la primera composición inmunogénica y una dosis de la segunda composición inmunogénica o pueden ser (b) una dosis de la primera composición inmunogénica y dos dosis de la segunda composición inmunogénica.
En una realización de (a), el intervalo de tiempo entre la administración inicial de la primera composición y la administración de la segunda composición está entre 3 meses y 5 años, tal como entre 3 meses y 24 meses, por ejemplo entre 3 y 18 meses, tal como entre 3 y 14 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración inicial de la primera composición y la administración de la segunda composición está entre 3 y 10 meses, por ejemplo, entre 3 y 9 meses, tal como entre 3 y 8 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración inicial de la primera composición y la administración de la segunda composición está entre 4 y 14 meses, por ejemplo, entre 4 y 9 meses, tal como entre 4 y 8 meses. En otra realización de (a), el intervalo de tiempo entre la administración final de la primera composición y administración de la segunda composición está entre 2 meses y 5 años, tal como entre 3 meses y 5 años, tal como entre 3 meses y 24 meses, por ejemplo, entre 3 y 18 meses, por ejemplo entre 3 y 14 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración final de la primera composición y la administración de la segunda composición está entre 3 y 10 meses, por ejemplo, entre 3 y 9 meses,
tal como entre 3 y 8 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración final de la primera composición y la administración de la segunda composición está entre 4 y 14 meses, por ejemplo, entre 4 y 9 meses, tal como entre 4 y 8 meses.
En una realización de (b), el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración final de la segunda composición está entre 3 meses y 5 años, tal como entre 3 meses y 24 meses, por ejemplo entre 3 y 18 meses, como entre 3 y 14 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración final de la segunda composición está entre 3 y 10 meses, por ejemplo entre 3 y 9 meses, tal como entre 3 y 8 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración final de la segunda composición está entre 4 y 14 meses, por ejemplo entre 4 y 9 meses, tal como entre 4 y 8 meses. En otra realización de (b), el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración inicial de la segunda composición está entre 2 meses y 5 años, tal como entre 3 meses y 5 años, tal como entre 3 meses y 24 meses, por ejemplo, entre 3 y 18 meses, tal como entre 3 y 14 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración final de la segunda composición está entre 3 y 10 meses, por ejemplo entre 3 y 9 meses, tal como entre 3 y 8 meses. En algunas realizaciones, el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración final de la segunda composición está entre 4 y 14 meses, por ejemplo entre 4 y 9 meses, tal como entre 4 y 8 meses.
Cuando se administra al sujeto la primera composición dos veces, el intervalo de tiempo entre la administración inicial de la primera composición y la administración adicional de la primera composición puede estar entre 2 semanas y 2 meses.
Cuando se administra al sujeto la segunda composición dos veces, el intervalo de tiempo entre la administración inicial de la segunda composición y la administración adicional de la segunda composición puede estar entre 3 meses y 5 años, tal como entre 3 meses y 24 meses, tal como entre 6 y 14 meses.
En una realización adicional, la segunda composición podría por ejemplo procurarse como una dosis de refuerzo anual recurrente, por ejemplo, durante 1-5 años o más. En una realización, en un intervalo de tiempo de al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 o más meses después de la administración de la segunda composición, la segunda composición se administra uno o más veces adicionales.
El sujeto a tratar mediante el procedimiento de la invención puede ser de cualquier edad. En un aspecto de la invención, el sujeto es un ser humano.
En una realización, el sujeto es un ser humano adulto (típicamente de 18-60 años).
La primera y segunda composiciones se pueden administrar mediante diversas vías adecuadas, incluyendo parenteral, tal como administración intramuscular o subcutánea.
En una realización particular, la segunda composición se administra por vía intradérmica. La expresión por vía intradérmica tal como se usa en el presente documento pretende hacer referencia a la aplicación de los antígenos en la dermis y/o epidermis de la piel humana. La aplicación intradérmica de una composición inmunogénica se puede realizar mediante el uso de cualquier procedimiento cutáneo conocido por el experto incluyendo, pero no limitado a, suministro usando un dispositivo de aguja corta (un dispositivo que comprende una microaguja que está entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 0,6 mm de longitud) o suministro usando un parche cutáneo. Los dispositivos adecuados para uso con las vacunas cutáneas descritas en este documento incluyen dispositivos de aguja corta tales como los descritos en los documentos US 4.886.499, US 5.190.521, US 5.328.483, US 5.527.288, US 4.270.537, US 5.015.235, US 5.141.496, US 5.417.662 y EP1092444. Las vacunas cutáneas también se pueden administrar mediante dispositivos que limitan la longitud de penetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los descritos en el documento WO99/34850. También son adecuados los dispositivos de inyección a chorro que suministran vacunas líquidas a la dermis a través de un inyector a chorro de líquido o a través de una aguja. También son adecuados los dispositivos de suministro balístico de polvo/partículas que usan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo a través de las capas externas de la piel hasta la dermis. Los parches cutáneos comprenderán generalmente una lámina de soporte que incluye un sustrato sólido. Los parches suministran el antígeno y el adyuvante usados en la invención a la dermis o epidermis. En una realización particular, los parches útiles en la presente invención comprenden una pluralidad de microsalientes. Los microsalientes pueden ser de cualquier forma adecuada para perforar el estrato córneo, epidermis y/o dermis y suministrar antígeno y adyuvante a la epidermis o la dermis. En una realización particular, los microsalientes son biodegradables y comprenden un polímero biodegradable.
Las composiciones inmunogénicas usadas en la invención pueden elaborarse mediante la mezcla del(de los) antígeno (s) y el adyuvante. El(los) antígeno (s) se puede(n) proporcionar en una forma liofilizada o en una formulación líquida. Para cada composición, puede proporcionarse un kit que comprende un primer recipiente que comprende el antígeno y un segundo recipiente que comprende el adyuvante.
Adecuadamente, las composiciones inmunogénicas según la presente invención tienen un volumen de dosis humana
de entre 0,05 ml y 1 ml, tal como entre 0,1 y 0,5 ml, en particular un volumen de dosis de aproximadamente 0,5 ml, o 0,7 ml. El volumen de la segunda composición inmunogénica puede ser reducido, y estar, por ejemplo, entre 0,05 ml y 0,5 ml, tal como entre 0,1 y 0,2 ml. Los volúmenes de las composiciones usadas pueden depender de la ruta de suministro, procurándose dosis más pequeñas por vía intradérmica.
Una composición o procedimiento o proceso definido como "que comprende" ciertos elementos se entiende que engloba una composición, procedimiento o proceso (respectivamente) que consiste en esos elementos. La invención se describirá adicionalmente por referencia al siguiente ejemplo no limitante.
Ejemplo 1: Vacunación usando de M72 y adyuvante AS01
Se investigó el impacto de las dosificaciones retardadas y reducidas del antígeno de tuberculosis M722-his (SEQ ID NO: 2) en un modelo de ratón.
Materiales y procedimientos
Modelo animal
Se inyectaron a ratones C57BL/6JOlaHsd hembra de 6 semanas de edad -12 ratones por grupo - por vía intramuscular 50 |jl en los días 0-14 y 28 o 98 como se indica en la tabla a continuación.
El adyuvante AS01E contenía los inmunoestimulantes 3D-MPL® (GlaxoSmithKline Biologicals, Montana, EE.UU.) y QS21 (2,5 ug de cada uno) en una formulación con liposomas. Las diluciones se realizaron usando el tampón de adyuvante.
Lectura:
ICS en sangre completa en
día 21 - 7 días después de II (G1-7);
día 35 - 7 días después de III (G1-3);
día 105 - 77 días después de III (G1-3) y 7 días después de III (G4-7)
Serología anti-Ig de M72 Tot en
día 28 -14 días después de II (G1-7)
día 42 -14 días después de III (G1-3)
día 112 - 84 días después de III (G1-3) y 14 días después de III (G4-7)
Con el fin de tener un volumen suficiente, se recogió la sangre completa de 4 grupos de 3 ratones para grupos los días 21, 35 y 105. Se recogieron sueros individuales los días 28, 42, y 112.
Los ratones fueron identificados individualmente con el fin de vincular los resultados de PII y PIII para ICS y serología. Descripción de la(s) lectura(s)
Respuesta inmune celular- tinción intracelular de atocinas (ICS)
Aislamiento de leucocitos
En cada punto temporal, se recogió sangre de cada ratón y posteriormente se agruparon (5 grupos de 3 ratones). La
sangre se recogió en tubos que contienen RPMI/aditivos (RPMI 1640 suplementado con glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato sódico, aminoácidos no esenciales y 2-mercaptoetanol) que contiene heparina (1/10). Se añadieron diez volúmenes de tampón de lisis a la sangre completa y se incubaron los tubos a temperatura ambiente (TA) durante 10 min. Después de la centrifugación (335 g, 10 min a TA), el sedimento se recogió en RPMI/aditivos y se filtró (tamiz celular de 100 pm). Las células se sedimentaron de nuevo (335 g, 10 min a TA) y se resuspendieron en medio completo (RPMI 1640 suplementado con glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato sódico, aminoácidos no esenciales y 2-mercaptoetanol, y suero fetal de ternero al 5 % termoinactivado).
Estimulación in vitro de leucocitos recientes
Los leucocitos se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo redondo a aproximadamente 1 millón de células por pocillo. Los leucocitos se estimularon entonces durante 6 horas (37 °C, 5 % de CO2) con anti-CD28 (clon 9C10 (MFR4.B) y anti-CD49d (clon 37.51) a 1 g/ml, con o sin 1 pg/ml de péptidos que cubren la secuencia de M72. Después de una estimulación de 2 horas, se añadió brefeldina A diluida 1/200 en medio completo durante 4 horas adicionales. Las placas se transfirieron entonces a 4° C durante una noche.
ICS
Las células se tiñeron y analizaron mediante un ensayo de ICS de 5 colores.
Las células se transfirieron a placas de 96 pocillos de fondo en V, se centrifugaron a 189 g durante 5 min a 4° C después de lavado con 200 pl de tampón de flujo (PBS 1X, 1 % de FCS) y se resuspendieron las células en 50 pl de tampón de flujo que contiene anti-CD16/32 (clon 2.4G2) diluido 1/50, durante 10 minutos a 4 °C. A continuación, se añadieron 50 pl de tampón de flujo que contiene anticuerpos anti-CD4-V450 (clon RM4-5, diluido 1/50) y anti-CD8-PerCp-Cy5.5 (clon 53-6.7 diluido 1/50) y Live&Death p O (diluido 1/500) durante 30 min a 4 °C. Las células se centrifugaron (189 g durante 5 min a 4 °C) y se lavaron con 200pl de tampón de flujo.
Los leucocitos se fijaron y se permeabilizaron mediante la adición de 200 pl de solución de Cytofix/Cytoperm (tampón comercial de Becton Dickinson) durante 20 min a 4 °C. Las células se centrifugaron (189 g durante 5 min a 4 °C) y se lavaron con 200 pl de tampón Perm/lavado (tampón comercial de Becton Dickinson diluido 1:10 en agua destilada). Después de una etapa de centrifugación adicional, se tiñeron las células en 50 pl de tampón Perm/lavado con anticuerpos anti-IL2-FITC (clon JES6-5H4, diluido 1/400), anti-IFNy-APC (clon XMG1.2 , diluido 1/50) y anti-TNFa-PE (clon MP6-XT22, diluido 1/700) durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con el tampón Perm/lavado y se resuspendieron en 220 pl de solución fijadora estabilizante BD. Las células teñidas se analizaron por citometría de flujo usando un LSRII y el software FlowJo.
Respuesta humoral- serología anti-Ig tot de M72 por Elisa
Se recubrieron placas de 96 pocillos de ELISA con el antígeno recombinante M72 a 0,25 pg/ml en PBS y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se diluyeron los sueros de ratones vacunados después de II y después de III a 1/10000 en PBS (al 0,2 %)-BSA y después se realizó una dilución en serie de 2 veces del pocillo 1 al 12 y se incubaron. Las diluciones en serie del material estándar y de control se usaron para calcular los títulos estándares del anticuerpo anti-M72 de sueros ensayados y para asegurar la validez de la prueba. Las placas se lavaron con tampón PBS Tween 20 al 0,1 % después de cada etapa de incubación. Se añade entonces un anticuerpo de cabra biotinilado específico de Ig de ratones y se revela el complejo antígeno-anticuerpo por incubación con un complejo de estreptavidina-peroxidasa y el sustrato de peroxidasa diclorhidrato de orto-fenilendiamina/H2O2. Las densidades ópticas (DO) se registraron a 490-620 nm. El título de anticuerpos anti-M72 de cada suero de ratón individual se determina a partir de la curva estándar de ELISA usando un modelo de regresión y se expresa en unidades de ELISA (UE)/ml. Los títulos medios geométricos (GMT) se calculan a continuación para cada grupo de ratones.
Resultados
Respuestas de linfocitos T
A. Cinética de las respuestas de linfocitos T CD4 y CD8 específicos de M72
Para evaluar el posible beneficio de la tercera dosis fraccionada y/o retardada sobre respuesta de linfocitos T CD4 y CD8, se inmunizaron ratones con una dosis máxima de 0,25 ug de M72 en el estudio actual con el fin de estar en el rango dinámico de respuesta de los linfocitos T CD4 mientras que induce una respuesta de linfocitos T CD8 detectable.
Como se muestra en la Figura 1, procurar una tercera dosis fraccionada en el programa estándar (D0-D14-D28) no proporcionó una respuesta de linfocitos T CD4 mejorada como se observaron refuerzos comparables de 7PII a 7PIII a en grupos que recibieron una dosis completa, 1/5° y 1/25° de la dosis.
Sin embargo, a pesar de cierta variabilidad de la respuesta de linfocitos T CD4 específica de M72 entre grupos, se observó un mayor refuerzo 7 días después de una tercera dosis retardada de 0,25 ug de M72, en comparación con el programa estándar. Además, el nivel de respuesta de linfocitos T CD4 T específica de M72 en ratones que recibieron una tercera dosis retardada y fraccionada o una tercera dosis retardada y sin adyuvante era comparable a los niveles observados en el grupo inmunizado con la dosis completa en el programa estándar. Esto sugiere un beneficio del programa retardado en términos del nivel de respuesta de linfocitos T CD4.
Claims (8)
1. Una primera composición inmunogénica que comprende un antígeno M72, que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1; y un adyuvante, en el que el adyuvante comprende un agonista de TLR y una saponina inmunológicamente activa, en la que el agonista de TLR es 3DMPL y la saponina es QS21; y una segunda composición inmunogénica que comprende un antígeno M72, que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1;
para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento la administración de la primera composición inmunogénica al sujeto, seguida por la administración de la segunda composición inmunogénica al sujeto, en el que el sujeto recibe un total de tres dosis de composiciones inmunogénicas que comprenden un antígeno M72 dentro de un período de cinco años, en el que el sujeto recibe dos dosis de la primera composición y una dosis de la segunda composición, en la que el intervalo de tiempo entre la administración final de la primera composición y la administración de la segunda composición es entre 3 meses y 5 años:
en la que la primera y la segunda composición inmunogénica comprende entre 1 ug y 100 ug de antígeno M72; y en la que el primer y, si está presente, el segundo adyuvante se proporcionan como formulaciones liposomales.
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el intervalo de tiempo entre la administración final de la primera composición y la administración de la segunda composición es entre 3 meses y 24 meses, entre 3 y 18 meses, entre 3 y 14 meses, entre 3 y 10 meses, entre 3 y 9 meses o entre 3 y 8 meses.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el intervalo de tiempo entre la administración final de la primera composición y la administración de la segunda composición es entre 4 y 14 meses o entre 4 y 9 meses.
4. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el intervalo de tiempo entre la administración final de la primera composición y la administración de la segunda composición es entre 4 y 8 meses.
5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el antígeno M72 comprende los restos 2-723 de la SEQ ID NO: 1.
6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el antígeno M72 comprende la SEQ ID NO: 2.
7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la segunda composición inmunogénica comprende un segundo adyuvante y en la que el segundo adyuvante comprende un agonista de TLR4 y una saponina inmunológicamente activa.
8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la cantidad de antígeno M72 en la segunda composición inmunogénica está entre 5/4 y 1/10 de la de la primera composición inmunogénica.
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