ES2961840T3 - Nuevos métodos para inducir una respuesta inmunitaria - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan métodos y usos para inducir una respuesta inmune que comprende al menos dos administraciones de una composición inmunogénica, en donde se administra una dosis menor en la segunda administración que en la primera administración, y en donde la segunda administración puede realizarse sin adyuvante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevos métodos para inducir una respuesta inmunitaria
Campo técnico
La presente invención se refiere a métodos para inducir una respuesta inmunitaria, en particular a métodos para la vacunación que comprenden al menos dos administraciones de una composición inmunógena potenciada, en donde en la segunda administración se administra una dosis menor que en la primera administración.
Antecedentes de la invención
La vacunación es uno de los métodos más eficaces para prevenir enfermedades infecciosas. Sin embargo, una sola administración de un antígeno a menudo no es suficiente para conferir inmunidad completa y/o una respuesta duradera. Los enfoques para establecer una inmunidad fuerte y duradera contra patógenos específicos incluyen la adición de adyuvantes a las vacunas y/o la vacunación repetida, es decir, el refuerzo de una respuesta inmunitaria mediante la administración de una o más dosis adicionales de antígeno. Dichas administraciones adicionales pueden realizarse con la misma vacuna (refuerzo homólogo) o con una vacuna diferente (refuerzo heterólogo). El enfoque más común para el refuerzo homólogo no es sólo administrar la misma vacuna, sino también administrarlo en la misma dosis que la administración anterior.
Una enfermedad para la que hasta ahora se ha necesitado la vacunación con múltiples dosis es la malaria. La malaria es uno de los principales problemas de salud del mundo. Durante el año 2010, la Organización Mundial de la Salud informó de unos 219 millones de casos de malaria en todo el mundo. La malaria la provocan parásitos protozoarios del géneroPlasmodium.
El ciclo de vida del parásito es complejo, y necesita dos hospedadores, ser humano y mosquito, para completarse. La infección del ser humano se inicia mediante la inoculación de esporozoítos a través de la saliva de un mosquito infectado. La etapa de esporozoítos se ha identificado como un objetivo potencial de la vacuna contra la malaria. La principal proteína de la superficie del esporozoíto se conoce como proteína circunesporozoítica (proteína CS, del ingléscircumsporozoite protein).RTS,S, un antígeno basado en la proteína CS de la malaria y una proteína de la envoltura vírica del virus de la hepatitis B, lleva más de 25 años en desarrollo y actualmente es la vacuna candidata contra la malaria más avanzada que se está estudiando. Su estructura y producción se describieron en el documento US5928902, publicado el 27 de julio de 1999.
En los primeros trabajos, RTS,S se probó en un pequeño ensayo clínico en combinación con un adyuvante que comprende QS21 y 3D-MPL asociado con un adyuvante de emulsión de aceite en agua (Stouteet al.,1997 NEJM 336:86; Stouteet al.,1998, Journal of Infectious Diseases 178:1139-1144; Ballouet al.,2009, Parasite Immunology 31:492-500). Para este estudio se había planificado un programa de administración de tres dosis completas, pero debido al exceso de reactogenia percibido, la tercera dosis se redujo a 1/5 y se administró más tarde de lo previsto originalmente. Este estudio dio como resultado que seis de siete sujetos estuvieran protegidos. En trabajos posteriores, se utilizó un programa de vacunación de tres dosis completas y, en estudios más recientes, también con un programa de vacunación de tres dosis completas, RTS,S se potenció con una formulación liposómica que comprende QS21 y 3D-MPL. Este adyuvante se denomina AS01 y se describe, por ejemplo, en los documentos WO 96/33739 y WO2007/068907. Datos recientes de un ensayo clínico de fase III a gran escala, en donde se administró RTS,S/AS01 en tres dosis idénticas, con un mes de diferencia, mostraron que durante 18 meses de seguimiento, RTS,S/AS01 reduce casi a la mitad el número de casos de malaria en niños pequeños (de 5 a 17 meses de edad en la primera vacunación) y reduce en aproximadamente una cuarta parte los casos de malaria en lactantes (de 6 a 12 semanas de edad en la primera vacunación) durante un período de seguimiento de 18 meses.
Si bien se han logrado avances significativos en el campo de la investigación y el desarrollo de vacunas, todavía existe la necesidad de nuevas composiciones inmunógenas y métodos de vacunación contra enfermedades, incluida la malaria, que sean altamente eficaces, seguros, económicos, duraderos y que induzcan un amplio espectro de respuestas inmunitarias de reacción cruzada.
Sumario de la invención
Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que, en un método de vacunación multidosis que utiliza una vacuna potenciada contra la malaria, la vacunación fue más eficaz cuando se redujo una dosis posterior (dosis de refuerzo) en comparación con una dosis anterior (dosis inicial) que cuando las dosis eran las mismas. El adyuvante utilizado comprendía un agonista de TLR4, 3D-MPL, y una fracción de saponina inmunológicamente activa, QS21.
Por consiguiente, en un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunógena para su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto humano contra la malaria, en donde el método comprende la administración de una primera composición inmunógena que comprende uno o más antígenos dePlasmodiumy un primer adyuvante al sujeto, seguida de la administración de una segunda composición inmunógena que comprende uno o más antígenos dePlasmodiumy un segundo adyuvante al sujeto, en donde la primera y la segunda composición tienen al menos un antígeno dePlasmodiumen común, en donde el primer y el segundo adyuvante comprenden un agonista de TLR4 en común y una saponina inmunológicamente activa en común y en donde
• el segundo adyuvante contiene una cantidad menor del agonista de TLR4 común y de la saponina inmunológicamente activa común que el primer adyuvante,
• la segunda composición contiene una cantidad menor de dicho antígeno dePlasmodiumcomún que la primera composición,
en donde el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y el adyuvante y la administración de la segunda composición y el adyuvante es de entre 3 y 9 meses,
con la condición de que la primera y la segunda composición no comprendan ambas RTS,S y QS21 y monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL)
asociadas con una formulación de emulsión de aceite en agua, en donde la eficacia de la vacuna, como se determina de acuerdo con el ejemplo 1, mejora al menos un 10 %, en comparación con una pauta de tratamiento en la que la primera composición y la segunda composición son idénticas.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Porcentaje de sujetos vacunados que no desarrollaron parasitemia después de la provocación durante un período de seguimiento de 28 días. Fx indica el grupo de dosis fraccionaria retardada; RRR indica el grupo de 0, 1, 2 meses; CTL indica el grupo de control.
Figuras 2a a c: La secuencia de RTS,S del documento US5928902, publicado el 27 de julio de 1999.
Figuras 3a a b: La secuencia del antígeno VZV.
Figura 4a: 4/30 sujetos en el grupo RRr desarrollaron parasitemia (EV = 87 % [IC al 95 %: 67, 95]); 6/16 sujetos en el grupo RRR desarrollaron parasitemia (EV = 63 % [IC al 95 % 20, 80]).
Figura 4b: Un análisis que compara los resultados del grupo de dosis fraccionaria retardada del estudio con los datos agrupados de 95 sujetos estudiados en cinco ensayos de RTS,S/AS01 de 0, 1 y 2 meses completados hasta la fecha. Figuras 5a a b: Estudio de un refuerzo fraccionado 6 meses después de la última dosis seguida de provocación con esporozoítos un mes después. A los sujetos que estaban desprotegidos después de la primera provocación se les ofreció un refuerzo fraccionario. Los sujetos que estaban protegidos después de la primera provocación se asignaron al azar para recibir o no un refuerzo fraccionario, seguido de una provocación con esporozoítos un mes después. Figura 5a: Sujetos que no recibieron una dosis de refuerzo en el mes 12.
Figura 6: Respuestas de linfocitos T CD4 de ratones a los que se les administró M72 en pautas convencionales y retardadas
Figura 7: Respuestas de linfocitos T CD8 de ratones a los que se les administró M72 en pautas convencionales y retardadas
Figura 8: Perfil de citocinas de linfocitos T CD4 de ratones a los que se les administró M72 en pautas convencionales y retardadas
Figura 9: Perfil de citocinas de linfocitos T CD8 de ratones a los que se les administró M72 en pautas convencionales y retardadas
Figura 10: Serología anti-M72 de ratones a los que se les administró M72 en pautas convencionales y retardadas BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS IDENTIFICADORES DE SECUENCIA SEQ ID NO: 1: Secuencia de aminoácidos de RTS,S, como se describe en cualquier otra parte del presente documento.
SEQ ID NO: 2: Secuencia de aminoácidos de VZV, como se describe en cualquier otra parte del presente documento.
SEQ ID NO: 3: Secuencia de aminoácidos de M72, como se describe en cualquier otra parte del presente documento.
SEQ ID NO: 4: Secuencia de aminoácidos de la proteína M72 con dos restos His aminoterminales, como se describe en cualquier otra parte del presente documento.
Descripción detallada
Como se ha descrito anteriormente, en un primer aspecto, la invención se refiere a una composición inmunógena para su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto humano contra la malaria, en donde el método comprende la administración de una primera composición inmunógena que comprende uno o más antígenos dePlasmodiumy un primer adyuvante al sujeto, seguida de la administración de una segunda composición inmunógena que comprende uno o más antígenos dePlasmodiumy un segundo adyuvante al sujeto, en donde la primera y la segunda composición tienen al menos un antígeno dePlasmodiumen común, en donde el primer y el segundo adyuvante comprenden un agonista de TLR4 en común y una saponina inmunológicamente activa en común y en donde
• el segundo adyuvante contiene una cantidad menor del agonista de TLR4 común y de la saponina inmunológicamente activa común que el primer adyuvante,
• la segunda composición contiene una cantidad menor de dicho antígeno dePlasmodiumcomún que la primera composición,
en donde el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y el adyuvante y la administración de la segunda composición y el adyuvante es de entre 3 y 9 meses,
con la condición de que la primera y la segunda composición no comprendan ambas RTS,S y QS21 y 3D-MPL asociadas con una formulación de emulsión de aceite en agua, en donde la eficacia de la vacuna, como se determina de acuerdo con el ejemplo 1, mejora al menos un 10 %, en comparación con una pauta de tratamiento en la que la primera composición y la segunda composición son idénticas.
Como se utiliza en el presente documento, la administración de una primera composición "seguida de" la administración de una segunda composición indica que ha transcurrido un intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración de la segunda composición.
En un aspecto, el sujeto es un sujeto humano.
Normalmente, el objetivo de la composición inmunógena de la invención es inducir una respuesta inmunitaria protectora, es decir, inmunizar o vacunar al sujeto contra el patógeno del que procede el antígeno dePlasmodium.En una realización, la eficacia de la vacuna del método de la invención mejora en comparación con una pauta de tratamiento en el que la primera composición y la segunda composición son idénticas. Por ejemplo, la eficacia de la vacuna, según lo determinado de acuerdo con el ejemplo del presente documento, puede mejorar al menos un 10 %, tal como un 25 %. En una realización, se consigue una eficacia de la vacuna superior al 80 %, tal como superior al 90 %, según lo determinado de acuerdo con el ejemplo del presente documento. Por lo tanto, el método puede utilizarse para la prevención (es decir, profilaxis) de enfermedades infecciosas. De forma alternativa, el método puede utilizarse en inmunoterapia, es decir, en el tratamiento de una enfermedad, tal como cáncer, mediante la inducción o la potenciación de una respuesta inmunitaria.
Adyuvantes para su uso en el método de la invención
Como se ha descrito anteriormente, en un aspecto de la invención, el primer adyuvante y el segundo adyuvante comprenden un agonista de TLR4 y una saponina inmunológicamente activa en común.
En una realización, el primer adyuvante y el segundo adyuvante consisten en los mismos componentes. Por lo tanto, en una realización de este tipo, los componentes de ambos adyuvantes son los mismos, aunque no necesariamente en las mismas proporciones relativas. Por ejemplo, el primer adyuvante y el segundo adyuvante pueden consistir ambos en un agonista de TLR4 y una saponina en una formulación liposómica, pero la proporción de agonista de TLR4 a saponina puede ser de 5:1 en el primer adyuvante y de 1:1 en el segundo adyuvante. De forma alternativa, la proporción de agonista de TLR4 a saponina puede ser de 4:1 en el primer adyuvante y 1:1 en el segundo adyuvante, 3:1 en el primer adyuvante y 2:1 en el segundo adyuvante, 1:1 en el primer adyuvante y 1:1 en el segundo adyuvante.
En otra realización, el primer adyuvante y el segundo adyuvante consisten en los mismos componentes y las proporciones relativas de estos componentes son las mismas. Sin embargo, en una realización de este tipo, mientras que las proporciones relativas de los componentes adyuvantes son las mismas, las cantidades absolutas de estos componentes pueden diferir entre la primera y la segunda composición inmunógena. Por ejemplo, las cantidades absolutas de todos los componentes en el segundo adyuvante pueden ser, por ejemplo, una quinta parte de las cantidades absolutas de todos los componentes en el primer adyuvante.
En una realización, el segundo adyuvante contiene una cantidad al menos dos veces menor del agonista común de TLR4 y de la saponina inmunológicamente activa común que el primer adyuvante.
En una realización, la cantidad menor de los componentes comunes en el segundo adyuvante es al menos tres veces menor, por ejemplo, al menos cuatro veces menor, tal como al menos cinco veces menor, por ejemplo, al menos seis veces menor, tal como al menos siete veces menor, por ejemplo, al menos ocho veces menor, tal como al menos nueve veces menor, por ejemplo, al menos diez veces menor, tal como al menos 15 veces menor, por ejemplo, una cantidad al menos 20 veces menor que en el primer adyuvante.
En otra realización, la cantidad menor de los componentes comunes en el segundo adyuvante es entre 2 y 50 veces menor, tal como entre 2 y 20 veces menor, por ejemplo, tal como entre 2 y 15 veces menor, tal como entre 2 y 10 veces menor, por ejemplo, tal como entre 3 y 7 veces menor, tal como una cantidad entre 4 y 6 veces menor que en el primer adyuvante.
Como se ha descrito anteriormente, el primer adyuvante y el segundo adyuvante comprenden un agonista de TLR4 (receptor de tipo Toll). El uso de agonistas de TLR en adyuvantes es bien conocido en la materia y se ha revisado, por ejemplo, en Lahiriet al.,(2008) Vaccine 26:6777. Los TLR que se pueden estimular para lograr un efecto adyuvante incluyen TLR2, TLR4, t Lr 5, Tl R7, TLR8 y TLR9. Se prefieren los agonistas de Tl R2, TLR4, TLR7 y t Lr 8, en particular los agonistas de TLR4.
Los agonistas de TLR4 adecuados incluyen lipopolisacáridos, tales como monofosforil lípido A (MPL, del inglésmonophosphoryl lipid A)y monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL, del inglés3-O-deacylated monophosphoryl lipidA). La patente de Estados Unidos 4.436.727 divulga MPL y su fabricación. La patente de Estados Unidos 4.912.094 y el certificado de reexamen B14.912.094 divulgan 3D-MPL y un método para su fabricación. Otro agonista de TLR4 es el adyuvante lipídico glucopiranosil (GLA, del inglésglucopyranosyl lipid adjuvant),una molécula sintética similar a un lípido A (véase, por ejemplo, Foxet al.,(2012) Clin. Vaccine Immunol 19:1633). En una realización adicional, el agonista de TLR4 puede ser un agonista de TLR4 sintético tal como una molécula de disacárido sintético, similar en estructura a MPL y 3D-MPL o pueden ser moléculas de monosacáridos sintéticos, tales como los compuestos de aminoalquilglucosaminida fosfato (AGP, del inglésaminoalkyl glucosaminide phosphate) divulgados en, por ejemplo, los documentos WO9850399, WO0134617, WO0212258, W03065806, WO04062599, WO06016997, WO0612425, W003066065 y WO0190129. Dichas moléculas también se han descrito en la bibliografía científica y de patentes como miméticos del lípido A. Los miméticos del lípido A comparten adecuadamente alguna actividad funcional y/o estructural con el lípido A y, en un aspecto, son reconocidos por los receptores TLR4. Los AGP como se describen en el presente documento a veces se denominan miméticos de lípido A en la materia. En una realización preferida, el agonista de TLR4 es 3D-MPL. Los agonistas de TLR4, tales como monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), y su uso como adyuvantes en vacunas se han descrito, por ejemplo, en los documentos WO 96/33739 y WO2007/068907 y revisado en Alvinget al.,(2012) Curr Opin in Immunol 24:310.
De acuerdo con la invención, el primer adyuvante y el segundo adyuvante comprenden una saponina inmunológicamente activa, tal como una fracción de saponina inmunológicamente activa, tal como QS21.
En la materia se han descrito adyuvantes que comprenden saponinas. Las saponinas se describen en: Lacaille-Dubois y Wagner (1996) A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2:363. Las saponinas se conocen como adyuvantes en las vacunas. Por ejemplo, Quil A (procedente de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina) fue descrito por Dalsgaardet al.en 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, vol. 44, Springer Verlag, Berlin, 243) por tener actividad adyuvante. Se han aislado fracciones purificadas de Quil A mediante HPLC que conservan la actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (Kensilet al.,(1991) J. Immunol. 146: 431. Las fracciones de Quil A también se describen en el documento US 5.057.540 y en "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55.
Dos de esas fracciones, adecuadas para su uso en la presente invención, son QS7 y QS21 (también conocidos como QA-7 y QA-21). QS21 es una fracción de saponina inmunológicamente activa preferida para su uso en la presente invención. QS21 se ha revisado en Kensil (2000) en O'Hagan: Vaccine Adjuvants: preparation methods and research protocols. Homana Press, Totowa, Nueva Jersey, Capítulo 15. Sistemas de adyuvantes particulados que comprenden fracciones de Quil A, tales como el QS21 y el QS7, se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/33739, WO 96/11711 y WO2007/068907.
Además de los otros componentes, el adyuvante comprende preferentemente un esterol. La presencia de un esterol puede reducir aún más la reactogenicidad de las composiciones que comprenden saponinas, véase, por ejemplo, el documento EP0822831. Los esteroles adecuados incluyen p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. El colesterol es especialmente adecuado. De manera adecuada, la fracción de saponina inmunológicamente activa es QS21 y la proporción de QS21:esterol es de 1:100 a 1:1 p/p, tal como de 1:10 a 1:1 p/p, por ejemplo, de 1:5 a 1:1 p/p.
En una realización preferida del método de la invención, el agonista de TLR4 es 3D-MPL y la saponina inmunológicamente activa es QS21.
En algunas realizaciones, el adyuvante se presenta en forma de una emulsión de aceite en agua, por ejemplo, que comprende escualeno, a-tocoferol y un tensioactivo (véase, por ejemplo, el documento W095/17210) o en forma de un liposoma. Se prefiere una presentación liposómica.
El término "liposoma", cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a estructuras lipídicas uni o multilaminares (en particular 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 láminas dependiendo del número de membranas lipídicas formadas) que encierran un interior acuoso. Los liposomas y las formulaciones de liposomas son bien conocidos en la materia. Las presentaciones liposómicas se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/33739 y WO2007/068907. Los lípidos que son capaces de formar liposomas incluyen todas las sustancias que tienen propiedades grasas o similares a las grasas. Los lípidos que pueden formar los lípidos en los liposomas se pueden seleccionar del grupo que comprende glicéridos, glicerofosfolípidos, glicerofosfinolípidos, glicerofosfonolípidos, sulfolípidos, esfingolípidos, fosfolípidos, isoprenólidos, esteroides, estearinas, esteroles, arqueolípidos, lípidos catiónicos sintéticos y lípidos que contienen hidratos de carbono. En una realización particular de la invención, los liposomas comprenden un fosfolípido. Los fosfolípidos adecuados incluyen (pero sin limitación): fosfocolina (PC, del inglésphosphocholine),que es un intermediario en la síntesis de fosfatidilcolina; derivados de fosfolípidos naturales: fosfocolina de huevo, fosfocolina de huevo, fosfocolina de soja, fosfocolina de soja hidrogenada y esfingomielina como fosfolípidos naturales; y derivados de fosfolípidos sintéticos: fosfocolina (didecanoíl-L-afosfatidilcolina [DDPC], dilauroíl fosfatidilcolina [DLPC], dimiristoíl fosfatidilcolina [DMPC], dipalmitoíl fosfatidilcolina [DPPC], diestearoíl fosfatidilcolina [DSPC], dioleoíl fosfatidilcolina [DOPC], 1-palmitoíl,2-oleoilfosfatidilcolina [POPC], dielaidoíl fosfatidilcolina [DEPC]), fosfoglicerol (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfoglicerol [DMPG], 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfoglicerol [DPPG], 1,2-diestearoíl-sn-glicero-3-fosfoglicerol [DSPG], 1-palmitoíl-2-oleoíl-sn-glicero-3-fosfoglicerol [POPG]), ácido fosfatídico (ácido 1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfatídico [DMPA], ácido dipalmitoíl fosfatídico [DPPA], ácido diestearoíl-fosfatídico [DSPA]), fosfoetanolamina (1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [DMPE], 1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [DPPE], 1,2-diestearoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [DSPE], 1,2-dioleoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina [DOPE], fosfoserina, fosfolípido de polietilenglicol [PEG].
El tamaño de los liposomas puede variar desde 30 nm hasta varios pm dependiendo de la composición del fosfolípido y del método utilizado para su preparación. En realizaciones particulares de la invención, el tamaño del liposoma estará en el intervalo de 50 nm a 500 nm y en realizaciones adicionales de 50 nm a 200 nm. La dispersión dinámica de luz láser es un método utilizado para medir el tamaño de liposomas bien conocido por los expertos en la materia.
En una realización particularmente adecuada, los liposomas utilizados en la invención comprenden DOPC y un esterol, en particular, el colesterol. Por lo tanto, en una realización particular, las composiciones de la invención comprenden QS21 en cualquier cantidad descrita en el presente documento en forma de un liposoma, en donde dicho liposoma comprende DOPC y un esterol, en particular, el colesterol.
Preferentemente, el primer adyuvante y el segundo adyuvante comprenden 3D-MPL y QS21 en una formulación liposómica.
En una realización, el primer adyuvante comprende entre 25 y 75, tal como 50 microgramos, de 3D-MPL y entre 25 y 75, tal como 50 microgramos, de QS21 en una formulación liposómica y el segundo adyuvante comprende entre 5 y 15, tal como 10 microgramos, de 3D-MPL y entre 5 y 15, tal como 10 microgramos, de QS21 en una formulación liposómica.
En otra realización, el primer adyuvante comprende entre 12,5 y 37,5, tal como 25 microgramos, de 3D-MPL y entre 12,5 y 37,5, tal como 25 microgramos, de QS21 en una formulación liposómica y el segundo adyuvante comprende entre 2,5 y 7,5, tal como 5 microgramos, de 3D-MPL y entre 2,5 y 7,5, tal como 5 microgramos, de QS21 en una formulación liposómica.
En otra realización, el primer adyuvante comprende entre 12,5 y 37,5, tal como entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo aproximadamente o exactamente 25 microgramos) de 3D-MPL y entre 12,5 y 37,5, tal como entre 20 y 30 microgramos (por ejemplo aproximadamente o exactamente 25 microgramos) de QS21 en una formulación liposómica y el segundo adyuvante comprende una cantidad reducida de 3D-MPL o QS21, tal como entre 2,5 y 20, tal como entre 2,5 y 10 microgramos (por ejemplo aproximadamente o exactamente 5 microgramos) de 3D-MPL y tal como entre 2,5 y 20, tal como entre 2,5 y 10 microgramos (por ejemplo aproximadamente o exactamente 5 microgramos) de QS21 en una formulación liposómica. De manera adecuada, en el primer y segundo adyuvante la cantidad de 3D-MPL es la misma que la cantidad de QS21.
Es bien sabido que para la administración parenteral las soluciones deben ser fisiológicamente isotónicas (es decir, tener una osmolalidad farmacéuticamente aceptable) para evitar la distorsión o lisis celular. Una osmolalidad farmacéuticamente aceptable significará en general que las soluciones tendrán una osmolalidad que es aproximadamente isotónica o ligeramente hipertónica. De manera adecuada, las composiciones inmunogénicas de la presente invención tendrán una osmolalidad en el intervalo de 250 a 750 mOsm/kg, por ejemplo, la osmolalidad puede estar en el rango de 250 a 550 mOsm/kg, tal como en el intervalo de 280 a 500 mOsm/kg. La osmolalidad puede medirse de acuerdo con técnicas conocidas en la materia, tal como mediante el uso de un osmómetro disponible comercialmente, por ejemplo, el Advanced® Model 2020 disponible en Advanced Instruments Inc. (EE. UU.). Un "agente de isotonicidad" es un compuesto que se tolera fisiológicamente e imparte una tonicidad adecuada a una formulación (por ejemplo, composiciones inmunógenas de la invención) para evitar el flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con la formulación. Se conocen composiciones adyuvantes acuosas que contienen cloruro de sodio 100 mM o más, por ejemplo el sistema adyuvante A (SAA) en los documentos WO 2005/112991 y WO2008/142133 o los adyuvantes liposómicos divulgados en el documento WO2007/068907.
En algunas realizaciones, el agente de ¡sotonicidad utilizado para la composición es una sal. En otras realizaciones, sin embargo, la composición comprende un agente de isotonicidad no iónico y la concentración de cloruro de sodio o la fuerza iónica en la composición es inferior a 100 mM, tal como inferior a 80 mM, por ejemplo, inferior a 30 mM, tal como inferior a 10 mM o inferior a 5 mM. En una realización preferida, el agente de isotonicidad no iónico es un poliol, tal como sorbitol. La concentración de sorbitol puede estar, por ejemplo, entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 15 % (p/v), tal como entre aproximadamente un 4 % y aproximadamente un 10 % (p/v). En el documento WO2010142685 se han descrito adyuvantes que comprenden una fracción de saponina inmunológicamente activa y un agonista de TLR4 en donde el agente de isotonicidad es una sal o un poliol, véanse, por ejemplo, los ejemplos 1 y 2 en el documento WO2010142685.
En una realización adicional, el primer adyuvante y/o el segundo adyuvante no comprenden aluminio.
Antígenos para su uso en los métodos de la invención.
De acuerdo con la invención, la segunda composición contiene una cantidad menor del antígeno dePlasmodiumcomún que la primera composición.
En una realización, la cantidad menor de antígeno dePlasmodiumcomún en la segunda composición es al menos tres veces menor, por ejemplo, al menos cuatro veces menor, tal como al menos cinco veces menor, por ejemplo, al menos seis veces menor, tal como al menos siete veces menor, por ejemplo, al menos ocho veces menor, tal como al menos nueve veces menor, por ejemplo, al menos diez veces menor, tal como al menos 15 veces menor, por ejemplo, una cantidad de antígeno al menos 20 veces menor que en la primera composición.
En otra realización, la cantidad menor de antígeno dePlasmodiumcomún en la segunda composición es entre 2 y 50 veces menor, tal como entre 2 y 20 veces menor, por ejemplo, tal como entre 2 y 15 veces menor, tal como entre 2 y 10 veces menor, por ejemplo, tal como entre 3 y 7 veces menor, tal como una cantidad de antígeno entre 4 y 6 veces menor que en la primera composición.
Como se ha descrito anteriormente, la primera composición inmunógena y la segunda composición inmunógena tienen al menos un antígeno dePlasmodiumen común. En algunas realizaciones, todos los antígenos en la primera y segunda composiciones son iguales.
En una realización, el antígeno común es un antígeno deP. falciparumo deP. vivax.En una realización, el antígeno común es la proteína circunesporozoítica (CS) o un fragmento inmunógeno o una variante de la misma, tal como la proteína CS deP. falciparumo un fragmento inmunógeno o una variante de la misma o una proteína CS deP. vivaxo un fragmento inmunógeno o una variante de la misma.
En otra realización, el antígeno común es CelTOS (número de registro de Genbank Q8I5P1: 3D7 CelTOS deP. falciparum; también GenBank: AAN36249).), TRAP (Registro de Genbank: CAD52497.1 Gl:23615505) o Pfs25 (Número de registro de Genbank: AAN35500.1 Gl:23495169) o un fragmento inmunógeno o una variante de CelTOS, TRAP y/o Pfs25.
En una realización adicional, el antígeno común es una proteína inmunógena que consiste en el antígeno de superficie S de la hepatitis B (HBsAg) o un fragmento inmunógeno de la misma o una proteína inmunógena que comprende HBsAg o un fragmento inmunógeno de la misma, por ejemplo, una proteína de fusión de HBsAg con un antígeno diferente.
Un fragmento inmunógeno puede tener cualquier longitud siempre que conserve propiedades inmunogénicas. Por ejemplo, el fragmento puede comprender 5 o más aminoácidos consecutivos, tal como 10 o más aminoácidos consecutivos, por ejemplo, 20 o más aminoácidos consecutivos, tal como 50 o más aminoácidos consecutivos, por ejemplo, 100 o más aminoácidos consecutivos de la proteína en cuestión.
En una realización adicional, el antígeno dePlasmodiumcomún comprende o consiste en una variante de la proteína en cuestión.
Un polipéptido variante puede contener varias sustituciones, preferentemente sustituciones conservativas, (por ejemplo, 1 a 50, tal como 1 a 25, en particular 1 a 10 y especialmente 1 resto de aminoácido puede estar alterado) en comparación con la secuencia de referencia. De manera adecuada, dichas sustituciones no ocurren en la región de un epítopo y, por lo tanto, no tienen un impacto significativo en las propiedades inmunogénicas del antígeno.
Las variantes de proteínas también pueden incluir aquellas en donde se insertan aminoácidos adicionales en comparación con la secuencia de referencia, por ejemplo, dichas inserciones pueden ocurrir en 1 a 10 ubicaciones (tal como 1 a 5 ubicaciones, de manera adecuada 1 o 2 ubicaciones, en particular, 1 ubicación) y pueden implicar, por ejemplo, la adición de 50 o menos aminoácidos en cada ubicación (tal como 20 o menos, en particular 10 o menos, en especial 5 o menos). De manera adecuada, dichas inserciones no ocurren en la región de un epítopo y, por lo tanto, no tienen un impacto significativo en las propiedades inmunogénicas del antígeno. Un ejemplo de inserciones incluye una corta extensión de restos de histidina (por ejemplo, 2 a 6 restos) para ayudar a la expresión y/o purificación del antígeno en cuestión.
Las variantes también incluyen aquellas en donde se han eliminado aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, por ejemplo, dichas eliminaciones pueden ocurrir en 1 a 10 ubicaciones (tal como 1 a 5 ubicaciones, de manera adecuada 1 o 2 ubicaciones, en particular, 1 ubicación) y pueden implicar, por ejemplo, la eliminación de 50 o menos aminoácidos en cada ubicación (tal como 20 o menos, en particular 10 o menos, en especial 5 o menos). De manera adecuada, dichas eliminaciones no ocurren en la región de un epítopo y, por lo tanto, no tienen un impacto significativo en las propiedades inmunogénicas del antígeno.
El experto reconocerá que una variante proteica particular puede comprender sustituciones, eliminaciones y adiciones (o cualquier combinación de las mismas).
Preferentemente, las variantes presentan al menos aproximadamente un 70 % de identidad, más preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de identidad y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % de identidad (tal como al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %) a la secuencia de referencia asociada.
Los ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschulet al.,Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschulet al.,J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente.
Una variante adecuada de la proteína CS puede ser una variante en donde partes de la proteína CS están en forma de una proteína híbrida con el antígeno de superficie S de la hepatitis B (HBsAg). El antígeno variante CS puede estar, por ejemplo, en forma de una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la parte carboxiterminal de la proteína CS, cuatro o más repeticiones en tándem de la región inmunodominante de la proteína CS y HBsAg. La proteína híbrida puede comprender una secuencia que contiene al menos 160 aminoácidos y que es sustancialmente homóloga a la parte carboxiterminal de la proteína CS, pero desprovista de la secuencia de anclaje hidrófoba. La proteína CS puede carecer de los últimos 12 aminoácidos del extremo C. Además, puede contener 4 o más, por ejemplo, 10 o más, motivos repetidos del tetrapéptido Asn-Ala-Asn-Pro (NANP).
La proteína híbrida para su uso en la invención puede ser una proteína que comprende una parte de la proteína CS deP. falciparumsustancialmente como correspondiente a los aminoácidos 207 a 395 del clon 3D7 deP. falciparum,procedente de la cepa NF54 fusionada en marco mediante un enlazador lineal al extremo N de HBsAg. El enlazador puede comprender una parte de preS2 de HBsAg. Las construcciones CS adecuadas para su uso en la presente invención se describen en el documento WO 93/10152, que se concedió en EE. UU. como patentes de EE. UU. n.° 5.928.902 y 6.169.171.
Una proteína híbrida particular para su uso en la invención es la proteína híbrida conocida como RTS (Figura 2 y SEQ ID<n>O: 1) (descrita en el documento WO93/10152 (en donde se denomina RTS* y en el documento WO98/05355) que consiste en:
- un resto de metionina
- tres restos de aminoácidos Met Ala Pro
- un tramo de 189 aminoácidos que representan los aminoácidos 207 a 395 de la proteína CS de la cepa 3D7 deP. falciparum
- un resto de glicina
- cuatro restos de aminoácidos Pro Val Thr Asn, que representan los cuatro restos carboxiterminales de la proteína preS2 del virus de la hepatitis B (serotipo adw), y
- un tramo de 226 aminoácidos, codificado por los nucleótidos 1653 a 2330, y que especifica la proteína S del virus de la hepatitis B (serotipo adw).
RTS puede estar en forma de partículas mixtas RTS,S. Las partículas RTS,S comprenden dos polipéptidos, RTS y S, que pueden sintetizarse de manera simultánea y formar de manera espontánea estructuras particuladas compuestas (RTS,S).
La proteína RTS puede expresarse en levaduras, por ejemplo, en S.cerevisiae.En dicho hospedador, RTS se expresará como partículas lipoproteicas. Es posible que la cepa de levadura receptora ya lleve en su genoma varias copias integradas de un casete de expresión de S de la hepatitis B. Por tanto, la cepa resultante sintetiza dos polipéptidos, S y RTS, que se ensamblan juntos de manera espontánea en partículas lipoproteicas mixtas (RTS,S). Estas partículas pueden presentar en su superficie las secuencias de la proteína CS del híbrido. El RTS y el S en estas partículas mixtas pueden estar presentes en una proporción particular, por ejemplo, 1:4.
Se ha revisado RTS,S, por ejemplo, en Vekemanset al.,(2009) Vaccine 275:G67 y en Reguleset al.,(2011) Expert Rev. Vaccines 10:589.
En una realización, la primera composición inmunógena comprende entre 25 y 75, tal como 50 microgramos, de RTS,S y la segunda composición inmunógena comprende entre 5 y 15, como 10 microgramos, de RTS,S.
En otra realización, la primera composición inmunógena comprende entre 12,5 y 37,5, tal como 25 microgramos, de RTS,S y la segunda composición inmunógena comprende entre 2,5 y 7,5, como 5 microgramos, de RTS,S.
En una realización adicional, el antígeno común procede de la proteína CS deP. vivax.Se han descrito variantes de la proteína CS deP. vivaxadecuadas. Por ejemplo, el documento W02008009652, que se publicó en EE. UU. como US20100150998, describe proteínas de fusión híbridas inmunógenas que comprenden: a. al menos una unidad repetida procedente de la región de repetición de una proteína circunesporozoítica de tipo I deP. vivax,b. al menos una unidad repetida procedente de la región de repetición de una proteína circunesporozoítica de tipo II deP. vivaxy c. un antígeno de superficie S procedente del virus de la hepatitis B, o un fragmento del mismo. La SEQ ID NO: 17 del documento WO2008009652 describe una proteína de fusión híbrida específica, denominada CSV-S. Cuando se expresa junto con el antígeno de superficie S procedente del virus de la hepatitis B se forman las partículas CSV-S,S (Documento W02008009652). Dichas partículas también pueden utilizarse en la presente invención.
En una realización adicional, el antígeno común es una partícula mixta que comprende RTS y CSV-S. Dichas partículas se han descrito en el documento WO2008009650, que se publicó en EE. UU. como US20100062028.
Pautas de vacunación, poblaciones diana y modos de administración
Como se ha descrito anteriormente, la composición inmunógena de la invención es para su uso en un método que comprende la administración de una primera composición inmunógena que comprende uno o más antígenos dePlasmodiumy un primer adyuvante, seguida de la administración de una segunda composición inmunógena que comprende uno o más antígenos dePlasmodiumy un segundo adyuvante, en donde el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y el adyuvante y la administración de la segunda composición y el adyuvante es de entre 3 y 9 meses.
En una realización, el intervalo de tiempo entre la administración inicial de la primera composición y la administración de la segunda composición es de entre 4 y 8 meses, tal como entre 7 y 8 meses.
El método de la invención puede comprender una o más administraciones adicionales de composiciones inmunógenas además de la administración inicial de la primera composición y la administración de la segunda composición. Por ejemplo, el sujeto puede recibir múltiples dosis de la primera composición antes de la administración de la segunda composición. Por lo tanto, por ejemplo, en una realización, la primera composición se administra dos veces antes de la administración de la segunda composición. Como alternativa o además, el sujeto puede recibir múltiples dosis adicionales de la segunda composición después de la administración inicial de la segunda composición. Por consiguiente, en una realización del método de la invención, la segunda composición se administra una o más veces más. Por lo tanto, las posibles pautas incluyen, pero sin limitación, los siguientes:
a. Primera composición y después segunda composición
b. Primera composición, después primera composición y después segunda composición
c. Primera composición, después segunda composición y después segunda composición
d. Primera composición, después primera composición, después primera composición y después segunda composición
e. Primera composición, después primera composición, después segunda composición y después segunda composición
f. Primera composición, después segunda composición, después segunda composición y después segunda composición
Los intervalos de tiempo para la pauta b. podrían ser, por ejemplo, 0, 1, 5 (es decir, mes 0, mes 1, mes 5) o 0, 1, 6 o 0, 1, 7 o 0, 1, 8 o 0, 1, 12. De manera similar, los intervalos de tiempo para la pauta c. podrían ser, por ejemplo, 0, 1, 5 o 0, 1,6 o 0, 1, 7 o 0, 1, 8 o 0, 1, 12.
En una realización adicional, la segunda composición podría administrarse, por ejemplo, como refuerzo anual recurrente, por ejemplo, durante 1 a 5 años o más. En una realización, en un intervalo de tiempo de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 o más meses después de la administración de la segunda composición, la segunda composición se administra una o más veces más. En una realización, en un intervalo de tiempo de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 años después de la administración de la segunda composición, la segunda composición se administra una o más veces más.
El sujeto a tratar que utiliza el método de la invención puede tener cualquier edad. En un aspecto de la invención, el sujeto es un ser humano. El método de la invención podría utilizarse como parte de un programa de eliminación de la malaria, en cuyo caso podría ser útil la vacunación de esencialmente toda la población, es decir, de todos o de la mayoría de los grupos de edad. En una realización, sin embargo, el sujeto humano tiene más de 18 años cuando se le administra la primera composición. En otra realización, el sujeto humano tiene menos de cinco años de edad cuando se le administra la primera composición. En una realización adicional, el sujeto tiene entre 6 y 12 semanas o entre 5 y 17 meses. Otra población diana especialmente adecuada son los viajeros que se dirigen a regiones donde la malaria es endémica.
La primera y segunda composiciones pueden administrarse a través de diversas vías adecuadas, incluida la administración parenteral, tal como intravenosa o subcutánea.
En una realización particular, la segunda composición se administra por vía intradérmica. El término intradérmica, como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a la aplicación de antígenos en la dermis y/o epidermis de la piel humana. La aplicación intradérmica de una composición inmunógena se puede realizar mediante cualquier método cutáneo conocido por el experto que incluye, pero sin limitación, la administración mediante un dispositivo de aguja corta (un dispositivo que comprende una microaguja que tiene entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 0,6 mm de longitud) o la administración mediante un parche cutáneo. Los dispositivos adecuados para su uso con las vacunas cutáneas descritas en el presente documento incluyen dispositivos de aguja corta como los descritos en los documentos US 4.886.499, US5.190.521, US 5328483, US 5527288, US 4270537, US 5015235, US 5141496, US 5417662 y EP1092444. Las vacunas cutáneas también pueden administrarse mediante dispositivos que limitan la longitud de penetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los descritos en el documento WO99/34850. También son adecuados los dispositivos de inyección a chorro que administran vacunas líquidas a la dermis mediante un inyector de chorro líquido o mediante una aguja. Además, son adecuados los dispositivos de administración balística de polvo/partículas que utilizan gas comprimido para acelerar las vacunas en forma de polvo a través de las capas externas de la piel hasta la dermis. Por lo general, los parches para la piel comprenderán una placa de soporte que incluye un sustrato sólido. Los parches administran el antígeno y el adyuvante utilizados en la invención a la dermis o epidermis. En una realización particular, los parches útiles en la presente invención comprenden una pluralidad de microproyecciones. Las microproyecciones pueden tener cualquier forma adecuada para perforar el estrato córneo, la epidermis y/o la dermis y administrar el antígeno y el adyuvante a la epidermis o dermis. En una realización particular, las microproyecciones son biodegradables y comprenden un polímero biodegradable.
Las composiciones inmunógenas utilizadas en la invención se pueden preparar mediante la mezcla del(los) antígeno(s) y el adyuvante. El antígeno o los antígenos pueden proporcionarse en forma liofilizada o en una formulación líquida. Para cada composición, se puede proporcionar un kit que comprende un primer recipiente que comprende el antígeno y un segundo recipiente que comprende el adyuvante.
De manera adecuada, las composiciones inmunógenas de acuerdo con la presente invención tienen un volumen de dosis en humanos de entre 0,05 ml y 1 ml, tal como entre 0,1 y 0,5 ml, en particular un volumen de dosis de aproximadamente 0,5 ml o 0,7 ml. El volumen de la segunda composición inmunógena puede reducirse y, por ejemplo, estar entre 0,05 ml y 0,5 ml, tal como entre 0,1 y 0,2 ml. Los volúmenes de las composiciones utilizadas pueden depender de la vía de administración, administrándose dosis más pequeñas por vía intradérmica.
Se entiende que una composición, método o proceso definido como "que comprende" determinados elementos abarca una composición, método o proceso (respectivamente) que consiste en esos elementos. La invención se describirá adicionalmente con referencia al siguiente ejemplo no limitante:
EJEMPLO 1: Vacunación con RTS.S y adyuvante AS01 y provocación experimental contra la malaria
Vacuna utilizada en el estudio
Se produjo RTS,S en levadura(S. cerevisiae)esencialmente como se describe en el documento WO 93/10152.
Una dosis "patrón" de RTS,S/AS01 contiene 50 pg de antígeno RTS,S liofilizado reconstituido en 500 pl de adyuvante AS01 que contiene los inmunoestimulantes 3D-MPL® (GlaxoSmithKline Biologicals, Montana, EE. UU.) y QS21 (50 pg de cada uno) en una formulación con liposomas.
Una dosis "fraccionaria" de RTS,S/AS01 es 100 pl de la solución anterior, es decir, que contiene 10 pg de antígeno RTS,S liofilizado y 10 pg de cada uno de 3D-MPL y QS21 con liposomas.
Terminología
En el presente documento, la dosis patrón de RTS,S/AS01 se denomina "R", mientras que la dosis fraccionaria se denomina "r". Una pauta patrón de tres dosis patrón se denomina "RRR", mientras que la pauta en el que la tercera dosis es fraccionaria se denomina "RRr". Una pauta con dos dosis patrón seguidas de dos dosis fraccionarias sería "RRrr", etc.
Metodología
Se realizó un ensayo clínico para evaluar la seguridad, la reactogenicidad y la eficacia frente a la provocación a esporozoítos de una vacuna contra la malaria que contiene el antígeno RTS,S potenciado con AS01, administrada por vía intramuscular en voluntarios sanos sin tratamiento previo contra la malaria de entre 18 y 50 años. El grupo de "Dosis fraccionaria retardada" recibió dos dosis patrón, a los 0 y 1 mes, y una dosis fraccionaria (un quinto (1/5°) de la dosis patrón) a los 7 meses. El grupo ("0, 1, 2 meses") recibió tres dosis patrón con un mes de diferencia.
Se reclutaron 46 sujetos en dos cohortes y se aleatorizaron en los grupos antes mencionados de "Dosis fraccionaria retardada" (30 sujetos) y "0, 1, 2 meses" (16 sujetos). 12 sujetos más formaron parte del control de "infectividad", es decir, voluntarios que no recibieron ninguna vacuna, pero se sometió a la provocación con esporozoítos.
Para cada cohorte, se pidió a los voluntarios que se sometieran a una provocación primaria estandarizada de malaria (Chulayet al.,(1986) Am J Trop Med Hyg. 35:66), también conocido comúnmente como "provocación con esporozoítos", aproximadamente 3 semanas después de la tercera dosis de cualquiera del grupo anterior. La provocación principal consistió en permitir que cinco mosquitosAnophelese stevensiinfectados con esporozoítos deP. falciparumse alimentaran de cada voluntario durante cinco minutos.
Después de la provocación, se realizó un seguimiento diario de los sujetos durante un período de al menos 30 días para evaluar si se habían infectado de malaria. El método principal para detectar la infección fue una evaluación de un frotis de sangre periférica teñido con Giesma para detectar parásitos en fase asexual mediante microscopía óptica. La presencia de parásitos en fase asexual indica que un sujeto ha sufrido una infección productiva, los parásitos se han liberado del hígado y han progresado a la fase eritrocítica y, por lo tanto, no se ha logrado una protección estéril contra la provocación.
Al primer signo de infección, los sujetos se declararon positivos para la malaria y recibieron una dosis curativa de cloroquina. El principal indicador de eficacia fue la protección estéril, es decir, que el sujeto nunca desarrolló parasitemia en fase asexual. Además, se registró el tiempo entre la provocación y la aparición de la parasitemia en aquellos que no estaban completamente protegidos. La protección se evaluó mediante la proporción de participantes inmunizados que permanecen libres de la infección porP. falciparumdespués de la provocación con esporozoítos y por un retraso en el período previo a la infección.
La eficacia de la vacuna (EV) se definió como 100*(1-Riesgo relativo). Se utilizó la prueba exacta de Fisher para la comparación de la incidencia de malaria entre cada uno de los grupos de vacuna "Dosis Fraccionada Retardada" y "0, 1, 2 meses" y los controles de "infectividad".
Resultados
Tabla 1. Eficacia de la vacuna
* Análisis de rangos logarítmicos (tiempo hasta la parasitemia), Fx sobre RRRp= 0,0455.
** La parasitemia se midió el día 28 después de la provocación.
El estudio no tuvo el poder para detectar la superioridad del grupo de dosis fraccionaria retardada sobre el grupo de 0, 1 y 2 meses, y la diferencia entre los dos grupos no es del todo estadísticamente significativa (aumento de la E<v>de Fx sobre RRR = 57,0 %, [-7,9-88,3],p= 0,0741, prueba exacta de Fisher). Sin embargo, un análisis de la diferencia en el tiempo de supervivencia del grupo de dosis fraccionada retardada respecto del grupo de 0, 1,2 meses, que tiene en cuenta el retraso en el tiempo hasta la infección en el grupo de dosis fraccionada retrasada, alcanza significación estadística (p = 0,0455, rango logarítmico): 4/30 sujetos en el grupo RRr desarrollaron parasitemia (EV = 87 % [IC al 95 %: 67, 95]); 6/16 sujetos en el grupo Rr R desarrollaron parasitemia (EV = 63 % [iC al 95 % 20, 80]). Figura 4a. Adicionalmente, un análisis que compara los resultados del grupo de dosis fraccionaria retardada del estudio con los datos agrupados de 95 sujetos estudiados en cinco ensayos con RTS,S/AS01 de 0, 1 y 2 meses completados hasta la fecha indica que es muy poco probable que los resultados actuales hayan ocurrido por casualidad (p = 0,0045, prueba exacta de Fisher). Figura 4b.
Ampliación del estudio
El estudio se amplió y algunos sujetos recibieron un refuerzo fraccionario 6 meses después de la última dosis, seguido de una provocación con esporozoítos un mes después. A los sujetos que estaban desprotegidos después de la primera provocación se les ofreció un refuerzo fraccionario. Los sujetos que estaban protegidos después de la primera provocación se asignaron al azar para recibir o no un refuerzo fraccionario, seguido de una provocación con esporozoítos un mes después. Los resultados se resumen en la tabla 2 y en las figuras 5a y 5b. NP significa no protegido durante la primera provocación, P significa protegido durante la primera provocación. Todos los refuerzos fueron fraccionarios (una quinta parte de una dosis de RTS,S/AS01 B).
Tabla 2. Refuerzo de dosis fraccionaria.
La mayoría de los sujetos no protegidos después de la pauta Fx (n = 2) o de la pauta de dosis patrón de RTS,S (n = 3) pueden protegerse con una dosis de refuerzo posterior (1/5° de la dosis) (datos no mostrados).
Valores de anticuerpos anti-CS
Los valores de anticuerpos anti-CS se determinaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) convencional desarrollado por GSK Biologicals. Clementet al.(2012)Malar J11:384. Los valores de anticuerpos se calcularon utilizando una curva convencional de referencia y se expresaron en unidades ELISA (UE) como se describe. Los resultados se resumen en la tabla 3.
Tabla 3. Valores de anticuerpos anti-CS. Fx, RRR, NP, P, Fx NP, Fx P, RRR NP y RRR P son como se describen en r r l r n m n .
Ensayo de avidez
Se evaluó el índice de avidez (IA) de los anticuerpos anti-CS contra la región repetida de CSP. Para las mediciones de avidez de IgG, se evaluaron muestras como se describe en Olotuet al.(2014)PLoS One15;9(12):e115126. doi: 10.1371/journal.pone.0115126 utilizando dos placas ELISA diferentes; una tratada con un agente caotrópico y una placa sin tratar. Como agente caotrópico, se añadió una solución 1 M de tiocianato de amonio (NH4SCN) a la placa de tratamiento, mientras que a la placa sin tratar se le añadió Tween-20 al 0,05 % en PBS y ambas placas de ELISA se lavaron y revelaron adicionalmente como se describe. El índice de avidez (IA) se calculó como la relación de la concentración de IgG anti-CSP (UE/ml) que permaneció unida al antígeno recubierto después del tratamiento con NH4SCN, dividida por la concentración de IgG (UE/ml) que permaneció unida al antígeno recubierto en la placa no tratada. Los resultados se resumen en la tabla 4.
Tabla 4. Índice de avidez (IA). Fx, RRR, NP, P, Fx NP, Fx P, RRR NP y RRR P son como se describen en otra parte
El IA puede utilizarse para comparar pautas, pero no explica la protección a nivel individual.
EJEMPLO 2: Vacunación con M72 y adyuvante AS01(ejemplo comparativo)
Se investigó el impacto de dosis retardadas y reducidas del antígeno de tuberculosis M722-his (SEQ ID NO: 4) en un modelo de ratón.
Material y métodos
Modelo animal
Se inyectaron ratones hembra C57BL/6JOIaHsd de 6 semanas de edad, 12 ratones por grupo, por vía intramuscular 50 pl en los días 0, 14 y 28 o 98 como se indica en la tabla siguiente.
El adyuvante AS01E contenía los inmunoestimulantes 3D-MPL® (GlaxoSmithKline Biologicals, Montana, EE. UU.) y QS21 (2,5 pg de cada uno) en una formulación con liposomas. Las diluciones se realizaron con el tampón adyuvante. Lectura:
ICS de sangre total en
día 21 - 7 días post-Il (G1-7);
día 35 - 7 días post-III (G1-3);
día 105 - 77 días post-III (G1-3) y 7 días post-III (G4-7)
Serología de Igtot anti-M72 en
día 28 -14 días post-Il (G1-7)
día 42 -14 días post-III (G1-3)
día 112 - 84 días post III (G1-3) y 14 días post III (G4-7)
Para tener suficiente volumen, se recogió la sangre completa de 4 grupos de 3 ratones por grupos los días 21, 35 y 105. Se recogieron sueros individuales los días 28, 42 y 112. Los ratones se identificaron individualmente para vincular los resultados de PII y PIll para ICS y serología.
Descripción de las lecturas
Respuesta inmunitaria celular - tinción de citocinas intracelulares (ICS)
Aislamiento de leucocitos
En cada punto temporal, se recogió sangre de cada ratón y posteriormente se agrupó (5 grupos de 3 ratones). La sangre se recogió en tubos que contenían RPMI/aditivos (RPMI 1640, complementado con glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y 2-mercaptoetanol) que contienen heparina (1/10). Se añadieron diez volúmenes de tampón de lisis a la sangre completa y los tubos se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 10 minutos. Después de la centrifugación (335g, 10 min a TA), el sedimento se recogió en RPMI/aditivos y se filtró (filtro celular 100 pm). Las células se sedimentaron nuevamente (335g, 10 min a TA) y se resuspendieron en medio completo (RPMI 1640, complementado con glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y 2-mercaptoetanol, y suero fetal bovino inactivado por calor al 5 %).
Estimulaciónin vitrode leucocitos frescos
Los leucocitos se colocaron en placas de fondo redondo de 96 pocillos aproximadamente a 1 millón de células por pocillo. Después se estimularon los leucocitos durante 6 horas (37 °C, CO2 al 5 %) con anti-CD28 (clon 9C10 (MFR4.B)) y anti-CD49d (clon 37.51) a 1 pg/ml, con o sin 1 pg/ml de péptidos que cubren la secuencia M72. Después de 2 horas de estimulación, se añadió brefeldina A diluida 1/200 en medio completo durante 4 horas adicionales. Después las placas se transfirieron a 4 °C, durante una noche.
ICS
Las células se tiñeron y analizaron utilizando un ensayo ICS de 5 colores.
Las células se transfirieron a placas de 96 pocillos con fondo en V, se centrifugaron a 189g durante 5 min a 4 °C después del lavado con 200 pl de tampón de flujo (PBS 1*, FCS al 1 %), se resuspendieron las células en 50 pl de tampón de flujo que contenía anti-CD16/32 (clon 2.4G2) diluido 1/50, durante 10 min a 4 °C. A continuación, se añadieron 50 pl de tampón de flujo que contenía anticuerpos anti-CD4-V450 (clon RM4-5, diluido 1/50) y anti-CD8-PerCp-Cy5.5 (clon 53-6.7, diluido 1 /50 ) y Live&Death PO (diluido 1/500) durante 30 min a 4 °C. Las células se centrifugaron (189g durante 5 min a 4 °C) y se lavaron con 200 pl de tampón de flujo.
Los leucocitos se fijaron y permeabilizaron mediante la adicción de 200 pl de solución Cytofix/Cytoperm (tampón comercial Becton Dickinson) durante 20 min a 4 °C. Las células se centrifugaron (189g durante 5 min a 4 °C) y se lavaron con 200 pl de tampón Perm/Wash (tampón comercial Becton Dickinson diluido 1:10 en agua destilada). Después de una etapa de centrifugación adicional, las células se tiñeron en 50 pl de tampón Perm/Wash con anticuerpos anti-IL2-FITC (clon JES6-5H4, diluido 1/400), anti-IFNY-APC (clon XMG1.2, diluido 1/50) y anti-TNFa-PE (clon MP6-XT22, diluido 1/700), durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con el tampón Perm/Wash y se resuspendieron en 220 pl de solución fijadora estabilizadora BD. Las células teñidas se analizaron por citometría de flujo usando un LSRII y el programa informático FlowJo.
Respuesta humoral-Serología de la Ig tot anti-M72 mediante Elisa
Se recubrieron placas Elisa de 96 pocillos con el antígeno recombinante M72 a 0,25 pg/ml en PBS y se incubaron durante la noche a 4 °C. Los sueros de ratones vacunados en post II y post III se diluyeron a 1/10000, en PBS (0,2 %)-BSA y después se realiza una dilución en serie de 2 veces del pocillo 1 al 12 y se incuba. Se utilizaron diluciones en serie del material patrón y de control para calcular los valores convencionales de anticuerpos anti-M72 de los sueros analizados y para garantizar la validez de la prueba. Las placas se lavaron con tampón de PBS Tween20 al 0,1 % después de cada etapa de incubación. A continuación se añade un anticuerpo de cabra biotinilado específico para Ig de ratón y el complejo antígeno-anticuerpo se revela mediante incubación con un complejo de estreptavidinaperoxidasa y un sustrato de peroxidasa orto-fenilendiamina diclorhidrato/H2O2. Las densidades ópticas (DO) se registraron a 490-620 nm. El valor de anticuerpos anti-M72 de cada suero de ratón individual se determina a partir de la curva convencional de ELISA utilizando un modelo de regresión y se expresa en unidades ELISA (UE)/ml. A continuación, se calculan los valores de la media geométrica (GMT, del inglésGeometric Mean Titers)para cada grupo de ratones.
Resultados
Respuestas de los linfocitos T
A.Cinética de las respuestas de los linfocitos T CD4 y CD8 específicas de M72
Para evaluar un posible beneficio de la tercera dosis fraccionaria y/o retrasada en la respuesta de los linfocitos T CD4 y CD8, los ratones se inmunizaron con una dosis máxima de 0,25 pg de M72 en el estudio actual para estar en el intervalo dinámico de la respuesta de los linfocitos T CD4 y al mismo tiempo inducir una respuesta de linfocitos T CD8 detectable.
Como se muestra en la figura 6, la administración de una tercera dosis fraccionaria en la pauta patrón (D0-D14-D28) no proporcionó una mejor respuesta de los linfocitos T CD4, ya que se observaron refuerzos comparables de 7PII a 7PIII en los grupos que recibieron una dosis completa, 1/5° y 1/25° de la dosis.
Sin embargo, a pesar de cierta variabilidad de la respuesta de los linfocitos T CD4 específicos de M72 entre grupos, se observó un mayor refuerzo 7 días después de una tercera dosis retardada de 0,25 pg de M72 en comparación con la pauta patrón. Adicionalmente, el nivel de respuesta de los linfocitos T CD4 específicos de M72 en ratones que recibieron una tercera dosis retardada y fraccionaria o una tercera dosis retardada y sin adyuvante fue comparable a los niveles observados en el grupo inmunizado con la dosis completa en la pauta patrón. Esto sugiere un beneficio de una pauta retardada en términos del nivel de respuesta de los linfocitos T CD4.
Se detectaron niveles bajos de respuesta de los linfocitos T CD8 específicos de M72 en ratones que recibieron una dosis de 0,25 pg de M72 en la pauta patrón y la tercera dosis de vacunación no logró estimular la respuesta de los linfocitos T CD8 específicos de M72 (Figura 8)
Se observó una disminución de la respuesta de los linfocitos T CD8 específicos de M72 en ratones que recibieron una tercera dosis fraccionaria en la pauta patrón. Esto está en línea con datos anteriores (no mostrados) donde la respuesta de los linfocitos T CD8 se vio afectada en gran medida por el intervalo de dosis de la proteína M72 utilizada para inmunizar a los ratones y donde una dosis más elevada de M72 (1 pg u 8 pg) indujo un nivel de respuesta superior que 0,1 pg o 0,25 pg de M72.
En ratones que recibieron una tercera dosis retardada de 0,25 pg de M72, se observó un aumento de la respuesta de los linfocitos T CD8 específicos de M72 desde 7PII a 7PIII en todos los grupos analizados. Sin embargo, las medianas de la respuesta de los linfocitos T CD8 mostraron variabilidad entre los grupos en 7PII (de 0,231 a 0,817) a pesar de que todos los grupos recibieron 2 dosis de 0,25 pg de M72/AS01E.
6.Perfil de citocinas de las respuestas de los linfocitos T CD4 y CD8 específicos de M72
Se observaron perfiles de expresión de citocinas de T CD4 similares en los grupos que recibieron una dosis completa, 1/5o y 1/25o de la dosis en la pauta patrón tanto en 7PII como en 7PIII. La respuesta de los linfocitos T CD4 específicos de M72 fue triple (IL2/IFNY/TNFa) y doble (IFNY/TNFa) después de 2 inmunizaciones. La tercera dosis de vacunación no logró respaldar la progresión de las células CD4 Th1 polifuncionales y, en cambio, aumentó los linfocitos T CD4 productores dobles (|L2/IFNy) y simples (solo IFNy) (Figura 7).
La administración de una tercera dosis retardada parece respaldar la progresión de las células CD4 Th1 polifuncionales, ya que la respuesta de los linfocitos T CD4 específicos de M72 está compuesta principalmente por linfocitos T CD4 productores de IL2/IFNY/TNFa e IFNY/TNFa (Figura 7). AS01 mejoró aún más la progresión de los linfocitos T polifuncionales, ya que se observaron niveles reducidos de IL2/IFNY/TNFa e IFNY/TNFa y niveles aumentados de linfocitos T CD4 que solo producen IFN<y>en ratones que recibieron una tercera dosis retardada y sin adyuvante.
Aunque el nivel de respuesta de los linfocitos T CD4 específicos de M72 en ratones que recibieron una tercera dosis retardada y fraccionaria es similar a lo que se observa con la referencia, el perfil de citocinas es ligeramente diferente y en conjunto estos datos sugieren una progresión mejorada de las células CD4 Th1 polifuncionales en una pauta de vacunación retardada.
Se ha demostrado que la magnitud y calidad de los linfocitos T CD4 multifuncionales son un correlato de la protección en ratones (Derricket al.,2011Vaccine29:2902-2909).
Se observaron perfiles de citocinas de linfocitos T CD8 específicos de M72 similares en todos los grupos tanto en 7PII como en 7PIII (Figura 8). Las respuestas de los linfocitos T CD8 específicos de M72 estaban compuestas principalmente por linfocitos T CD8 productores dobles (IFNY/TNFa) y simples (solo IFNy). También se detectaron niveles muy bajos de linfocitos T CD8 productores de IL2/IFNY/TNFa y TNFa.
Respuestas de anticuerpos
A.Serología de Ig tot anti-M72
Como se muestra en la figura 10, se observó un aumento de la respuesta serológica anti-M72 entre 14PII y 14 PIII en los grupos que recibieron una dosis completa, 1/5o y 1/25o de la dosis en la pauta patrón. Se observó una tendencia de efecto de intervalo de dosis, donde la dosis más elevada proporcionó la respuesta serológica específica de M72 más elevada. La persistencia de la respuesta disminuyó con el tiempo, como lo muestra la respuesta serológica más baja en 84PIII.
En ratones que recibieron una tercera vacunación retardada, se observó una mayor magnitud de la respuesta. Se observaron niveles similares de Ig específica de M72 en presencia y ausencia de AS01E, lo que sugiere que M72 por sí solo es suficiente para inducir una respuesta serológica elevada después de una tercera vacunación retardada.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunógena para su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto humano contra la malaria, en donde el método comprende la administración de una primera composición inmunógena que comprende uno o más antígenos dePlasmodiumy un primer adyuvante al sujeto, seguida de la administración de una segunda composición inmunógena que comprende uno o más antígenos dePlasmodiumy un segundo adyuvante al sujeto, en donde la primera y la segunda composición tienen al menos un antígeno dePlasmodiumen común y el primer y el segundo adyuvante comprenden un agonista de TLR4 en común y una saponina inmunológicamente activa en común y en donde
• el segundo adyuvante contiene una cantidad menor del agonista de TLR4 común y de la saponina inmunológicamente activa común que el primer adyuvante, y
• la segunda composición contiene una cantidad menor de dicho antígeno dePlasmodiumcomún que la primera composición,
en donde el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y el adyuvante y la administración de la segunda composición y el adyuvante es de entre 3 y 9 meses,
con la condición de que la primera y la segunda composición no comprendan ambas RTS,S y QS21 y monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL)
asociadas con una formulación de emulsión de aceite en agua,
en donde la eficacia de la vacuna, como se determina de acuerdo con el ejemplo 1, mejora al menos un 10 %, en comparación con una pauta de tratamiento en la que la primera composición y la segunda composición son idénticas.
2. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cantidad menor en el segundo adyuvante es al menos tres veces menor, por ejemplo, al menos cuatro veces menor, tal como al menos cinco veces menor, por ejemplo, al menos seis veces menor, tal como al menos siete veces menor, por ejemplo, al menos ocho veces menor, tal como al menos nueve veces menor, por ejemplo, al menos diez veces menor, tal como al menos 15 veces menor, por ejemplo, una cantidad al menos 20 veces menor que en el primer adyuvante.
3. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cantidad menor en el segundo adyuvante es entre 2 y 50 veces menor, tal como entre 2 y 20 veces menor, por ejemplo, entre 2 y 15 veces menor, tal como entre 2 y 10 veces menor, por ejemplo, entre 3 y 7 veces menor, tal como una cantidad entre 4 y 6 veces menor que en el primer adyuvante.
4. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agonista de TLR4 es 3D-MPL.
5. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la saponina inmunológicamente activa es QS21.
6. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer y el segundo adyuvante comprenden 3D-MPL y QS21 en una formulación liposómica.
7. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer y el segundo adyuvante comprenden además un esterol
8. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cantidad menor de antígeno dePlasmodiumcomún en la segunda composición es al menos tres veces menor, por ejemplo, al menos cuatro veces menor, tal como al menos cinco veces menor, por ejemplo, al menos seis veces menor, tal como al menos siete veces menor, por ejemplo, al menos ocho veces menor, tal como al menos nueve veces menor, por ejemplo, al menos diez veces menor, tal como al menos 15 veces menor, por ejemplo, una cantidad de antígeno al menos 20 veces menor que en la primera composición.
9. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cantidad menor de antígeno dePlasmodiumcomún en la segunda composición es entre 2 y 50 veces menor, tal como entre 2 y 20 veces menor, por ejemplo, entre 2 y 15 veces menor, tal como entre 2 y 10 veces menor, por ejemplo, entre 3 y 7 veces menor, tal como una cantidad de antígeno entre 4 y 6 veces menor que en la primera composición.
10. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho antígeno común es un antígeno deP. falciparumo deP. vivax.
11. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho antígeno dePlasmodiumcomún es una proteína circunesporozoítica o un fragmento inmunógeno de una variante de la misma.
12. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el antígeno dePlasmodiumcomún se selecciona del grupo que consiste en: RTS, CSV-S, RTS,S y CSV-S,S y partículas mixtas que comprenden RTS y CSV-S.
13. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el antígeno dePlasmodiumcomún es RTS,S.
14. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el intervalo de tiempo entre la administración de la primera composición y la administración de la segunda composición está entre 4 y 8 meses, tal como entre 7 y 8 meses.
15. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la primera composición inmunógena se administra dos veces antes de la administración de la segunda composición inmunógena.
16. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en un intervalo de tiempo de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16. al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 o más meses después de la administración de la segunda composición, la segunda composición se administra una o más veces más.
17. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer y el segundo adyuvante consisten en 3D-MPL y QS21 en una formulación liposómica en las mismas proporciones relativas.
18. La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la primera y la segunda composición inmunógena comprenden el antígeno RTS,S.
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