CN106232138A - 新型结核分枝杆菌疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及融合蛋白、抗原混合物和免疫组合物，所述免疫组合物诸如针对由毒性分枝杆菌，例如由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canettii)、Mycobacterium pinnipedii或Mycobacterium mungi引起的感染的疫苗。所述融合蛋白、抗原混合物和免疫组合物基于由ESAT‑6分泌系统1(ESX‑1)分泌的蛋白并属于最免疫显性的结核分枝杆菌(MTB)抗原。

Description

新型结核分枝杆菌疫苗
发明领域
本发明公开了基于源自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的Esx-1相关多肽的新免疫原性组合物。
一般背景
对结核分枝杆菌的免疫通过一些基本特征来表征；特异性致敏的T淋巴细胞介导保护，并且最重要的介体分子似乎是干扰素γ(IFN-γ)。
结核分枝杆菌具有以及分泌与新TB疫苗的产生有潜在相关性的若干种蛋白。1998年，Cole等人公布了结核分枝杆菌的全基因组序列并预测存在约4000个开放阅读框1。然而，重要的是该序列信息无法被用于预测DNA在体内是否被翻译并表达为蛋白。该基因组序列已经被广泛地用以设计DNA阵列用于RNA表达分析，以及被用于蛋白质组研究以鉴定表达的蛋白。即使具有大量的表达数据以及计算机模拟(in silico)预测工具的显著改进，确切地预测给定的序列将编码免疫原性分子仍然是不可能的。确定分子在结核分枝杆菌感染期间或感染之后是否被免疫系统识别的唯一方式是产生给定的分子并如本文中描述的在适当测定中测试它。
目前在临床试验中存在若干种新的TB疫苗。然而，它们主要是基于在感染的早期表达的有限数目的抗原的经典预防性疫苗。作为表达动态的直接后果，呈递给T细胞的表位模式随时间推移在根本上变化—暗示了应如何设计新的疫苗。例如对于瞬时表达的早期抗原Ag85B，两个独立的T细胞转移研究已经显示，在感染后3-4周，Ag85B不再被呈递给T细胞，并因此在感染的该时间点或稍后的时间点无细胞因子、趋化因子等的Ag85B特异性产生2,3。因此，对于与宿主建立长期共存性的慢性疾病来说，针对仅在感染的短暂时间段期间表达的蛋白质中的表位疫苗接种并诱导特异性的记忆T细胞是价值有限的。
因此对于疫苗开发，鉴定在感染的后期高表达的抗原，并在这些抗原中选择具有免疫原性并能够促成保护的那些抗原，并将该特定子集的蛋白包括在TB疫苗中是至关重要的。通过这样做，不仅可能提高疫苗效价和表位覆盖，而且还可能靶向潜伏性感染。
分枝杆菌分泌系统负责将蛋白输出到细胞外环境中。结核分枝杆菌的6-kDa早期分泌性抗原靶标(ESAT-6)和10-kDa培养物滤液抗原(CFP-10)是由ESAT-6分泌系统1(ESX-1)分泌的蛋白，并属于最免疫显性(most immunodominant)的结核分枝杆菌(MTB)抗原。这些属性使它们对于结核(TB)疫苗开发是重要的。基于这种了解，我们测试了其他ESX-1相关蛋白作为潜在的TB疫苗抗原。
发明概述
本发明涉及通过使用融合蛋白或抗原混合物来预防和治疗由结核复合群(tuberculosis complex)的菌种(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、卡氏分枝杆菌(M.canettii)、M.pinnipedii、Mycobacterium mungi)引起的感染，所述融合蛋白或抗原混合物包含选自ESX-1相关多肽的结核分枝杆菌抗原。所述融合蛋白或抗原混合物在疫苗中使用，优选与佐剂和/或免疫调节物一起。
发明的详细公开内容
本发明公开了融合蛋白或抗原混合物，所述融合蛋白或抗原混合物包含选自以下的氨基酸序列：
a)H74＝SEQ ID NO.1(Rv3881)、SEQ ID NO 2(ESAT-6)、SEQ ID NO 3(Rv3614c)、SEQ ID NO4(Rv3615c)、SEQ ID NO 5(Rv3616c)和SEQ ID NO 6(Rv3849)；或
b)H164＝SEQ ID NO.2(ESAT6)、SEQ ID NO.3(Rv3614c)、SEQ ID NO.6(Rv3849)和SEQ ID NO.8(Rv3872)；或
c)H78＝SEQ ID NO.2(ESAT6)、SEQ ID NO.3(Rv3614c)、SEQ ID NO.15(Rv3615的部分)、SEQ ID NO.6(Rv3849)和SEQ ID NO.8(Rv3872)；或
d)H174＝SEQ ID NO.1(Rv3881)、SEQ ID NO 2(ESAT-6)、SEQ ID NO 3(Rv3614c)、SEQ ID NO 5(Rv3616c)和SEQ ID NO 6(Rv3849)；或
e)H264＝SEQ ID NO.2(ESAT6)、SEQ ID NO.6(Rv3849)和SEQ ID NO.8(Rv3872)；或
f)H274＝SEQ ID NO.1(Rv3881)、SEQ ID NO 2(ESAT-6)、SEQ ID NO 5(Rv3616c)和SEQ ID NO 6(Rv3849)；或
g)H374＝SEQ ID NO.1(Rv3881)、SEQ ID NO 2(ESAT-6)和SEQ ID NO 6(Rv3849)；或
与其具有至少80％序列同一性并且同时为免疫原性的氨基酸序列类似物。
根据本发明的融合蛋白中的半胱氨酸优选地已经被替换为另一种氨基酸以避免硫桥形成和蛋白聚集。优选的替换氨基酸是丝氨酸。
根据本发明的融合蛋白的融合伴侣优选地与接头分子连接以允许蛋白折叠和二聚体形成。
优选的实施方案是包含SEQ ID NO 7(H74)、SEQ ID NO.9(H164)、SEQ ID NO 10(H174)、SEQ ID NO 11(H264)、SEQ ID NO 12(H274)、SEQ ID NO 13(H374)或SEQ ID NO 14(H78)的融合蛋白。
本发明的另一个实施方案是使用根据本发明的抗原混合物，例如以上提到的氨基酸序列SEQ ID NO.1-6；SEQ ID NO 2、3、6和8；SEQ ID NO.2、3、15、6和8；SEQ ID NO.1、2、3、5和6；SEQ ID NO 2、6和8；SEQ ID NO 1、2、5和6或SEQ ID NO 1、2和6，而不将多肽融合在一起。
在仍然另外的实施方案中，本发明公开了免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含如以上定义的融合蛋白或抗原混合物，所述免疫原性组合物优选为疫苗的形式。
在另一个实施方案中，本发明公开了用于使动物对由毒性分枝杆菌，例如由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、M.pinnipedii或Mycobacterium mungi引起的结核免疫的方法，所述动物包括人类，所述方法包括向所述动物施用如以上定义的多肽、根据本发明的免疫原性组合物或根据本发明的疫苗。
根据本发明的疫苗、免疫原性组合物以及药物组合物可以在预防上用于未感染毒性分枝杆菌的受试者或在治疗上用于已经感染毒性分枝杆菌的受试者。
定义
多肽
本发明中的词语“多肽”应具有其通常的含义。即任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白、寡肽、短肽及其片段，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
多肽可通过糖基化、通过脂化(例如通过如由Mowat等人1991描述的与棕榈酰氧基琥珀酰亚胺化学脂化或由Lustig等人1976描述的与十二酰氯化学脂化)、通过包含辅基、或通过包含另外的氨基酸诸如例如纯化标签(例如his标签)或信号肽而被化学地修饰。纯化标签被用以获得高纯的蛋白制品，并且例如，如果在N末端使用，His标签包含甲硫氨酸作为第一个氨基酸，之后是6-8个组氨酸，并且如果在C末端使用，His标签包含6-8个组氨酸，之后是终止密码子。当在N-末端使用时，编码多肽融合物的基因中的甲硫氨酸起始密码子可被缺失以避免错误的翻译起始位点。如果基因包含可选的起始密码子GUG或UUG中的一个，则同样如此，所述可选的起始密码子GUG或UUG通常分别编码缬氨酸和亮氨酸，但是作为起始密码子，它们被翻译为甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。
每种多肽由特定的核酸序列编码。将被理解的是，此类序列包括其类似物和变体，其中此类核酸序列已经通过置换、插入、添加或缺失一个或更多个核酸而被修饰。置换优选地是密码子使用中的沉默置换，所述沉默置换将不导致氨基酸序列中的任何变化，但可被引入以增强蛋白的表达。分泌系统
VII型分泌系统(T7SS)是细菌分泌系统中的近期发现，它最初在结核分枝杆菌中被鉴定。相应的基因簇被称为ESX(ESAT-6分泌系统)区4-6。结核分枝杆菌H37Rv的基因组含有五个基因簇，所述五个基因簇已经通过基因复制事件而演化并包括T7SS分泌机构的组分。这些簇被称为ESAT-6分泌系统(ESX)1到5。已经显示ESX系统分泌缺乏经典信号肽的蛋白。此外，由ESX1-5分泌的大多数蛋白遵循分泌的成对依赖性7。
Esx家族
除了Rv3017c(esxR)之外，编码ESAT-6家族蛋白的基因在结核分枝杆菌H37Rv染色体上的11个基因座处以串联对排列并且通常前面是pe-ppe基因对。它们编码长度为约100个氨基酸并且由ESX1-5系统分泌的蛋白。
贯穿本说明书，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”或其变形诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，将被理解为隐含包括陈述的要素或整数或者要素或整数的组，但不排斥任何其他的要素或整数或者要素或整数的组。
免疫原性多肽被定义为在当下或之前感染毒性分枝杆菌的生物样品或个体中诱导免疫响应的多肽。
免疫响应可以通过以下方法之一来监测：
·体外细胞响应通过相关细胞因子诸如IFN-γ从抽取自当下或先前感染毒性分枝杆菌的动物或人类的淋巴细胞的释放、或通过这些T细胞的增殖的检测来确定。诱导通过以下来进行：将多肽或免疫原性部分添加到包含每孔从1×105个细胞到3×105个细胞的悬浮液中。细胞分离自血液、脾、肝或肺，并且多肽或免疫原性部分的添加导致不超过20μg/ml悬浮液的浓度，且刺激进行两天到五天。为了监测细胞增殖，用放射性标记的胸苷脉冲(pulsed)细胞，并在孵育16-22小时后，通过液体闪烁计数检测增殖。阳性响应是大于背景加两个标准偏差的响应。IFN-γ的释放可以通过ELISA方法来确定，该方法为本领域的技术人员所熟知。阳性响应是大于背景加两个标准偏差的响应。当监测对多肽的免疫学响应时，除了IFN-γ之外的其他细胞因子诸如IL-12、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-β可以是相关的。用于确定细胞因子(例如IFN-γ)的存在的另一种且更灵敏的方法是ELISPOT方法，其中从血液、脾、肝或肺分离的细胞被稀释到优选1到4×106个细胞/ml的浓度，并在多肽或免疫原性部分的存在下孵育18-22小时，导致不超过20μg/ml的浓度。之后将细胞悬浮液稀释到1到2×106/ml，并转移到用抗IFN-γ包被的Maxisorp板，并孵育优选地4到16小时。IFN-γ产生细胞通过使用被标记的二级抗IFN-γ抗体和产生斑点的相关底物来确定，所述斑点可以使用解剖显微镜而被计数。通过使用PCR技术来确定编码相关细胞因子的mRNA的存在也是一个可能性。通常一种或更多种细胞因子将利用例如PCR、ELISPOT或ELISA来测量。本领域普通技术人员将领会到，由特定的多肽诱导的这些细胞因子中的任一个的量的显著增加或减少可被用于评价多肽的免疫活性。
·体外细胞响应还可以通过使用源于免疫个体或结核分枝杆菌感染的人的T细胞系来确定，其中所述T细胞系已经伴随以IL-2的添加被活分枝杆菌、来自细菌细胞的提取物或者培养物滤液驱动持续10到20天。通过以下进行诱导：将不超过20μg多肽/ml悬浮液添加到含有从1×105个细胞到3×105个细胞/孔的T细胞系中，并进行孵育从两天到六天。IFN-γ的诱导或另一种相关细胞因子的释放通过ELISA来检测。T细胞的刺激还可以如上文所描述的通过使用放射性标记的胸苷检测细胞增殖来监测。对于两种测定，阳性响应均为大于背景加两个标准偏差的响应。
·体内细胞响应，所述体内细胞响应可能被确定为在将至多100μg多肽或免疫原性部分皮内注射或将至多100μg多肽或免疫原性部分的贴片局部应用到临床或亚临床感染毒性分枝杆菌的个体后的阳性DTH响应，阳性反应在注射或应用后72-96小时具有至少5mm的直径。
·体外体液响应通过免疫或被感染个体中的特定抗体响应来确定。抗体的存在可以通过ELISA技术或蛋白质印迹法来确定，其中多肽或免疫原性部分被吸附到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯表面。将血清优选地在PBS中稀释从1:10到1:100，并添加到被吸附的多肽，并且进行孵育从1到12小时。通过使用被标记的二级抗体，可以通过测量OD，例如通过ELISA来确定特定抗体的存在，其中阳性响应是大于背景加两个标准偏差的响应或可选地蛋白质印迹法中的可视响应。
·另一个相关参数是在用佐剂中的多肽疫苗接种之后或在DNA疫苗接种之后所诱导的在动物模型中的保护的测量值。适合的动物模型包括灵长类动物、豚鼠或小鼠，用毒性分枝杆菌的感染对其攻击。诱导的保护的读出可以是与未被疫苗接种的动物相比靶器官中细菌载量的降低、与未被疫苗接种的动物相比延长的存活时间以及与未被疫苗接种的动物相比减少的体重减轻。
免疫原性部分
在本发明的优选的实施方案中，多肽包含多肽的免疫原性部分，诸如针对B细胞或T细胞的表位。多肽的免疫原性部分是多肽的一部分，所述部分在动物中或在人中和/或在生物样品中引发通过本文描述的任何生物测定确定的免疫响应。多肽的免疫原性部分可以是T细胞表位或B细胞表位。免疫原性部分可以与多肽的一个或几个相对小的部分相关，它们可以分散遍及多肽序列或位于多肽的特定部分。对于几种多肽，表位甚至已经被表明为分散遍及多肽，覆盖全序列(Ravn等人1999)。
为了鉴定在免疫响应期间被识别的相关T细胞表位，可能利用“蛮力(bruteforce)”法：由于T细胞表位是线性的，如果系统地构建，多肽的缺失突变体将例如通过使这些缺失突变体经受例如本文描述的IFN-γ测定来显示出多肽的哪些区域在免疫识别中是重要的。另一种方法利用重叠寡肽、优选地具有例如源自多肽的20个氨基酸残基长度的合成寡肽来检测MHC II类表位。这些肽可以在生物测定(例如如本文描述的IFN-γ测定)中来测试，并且这些肽中的一些将给出阳性响应(并因此是免疫原性的)，作为在肽中存在T细胞表位的证据。对于MHC I类表位的检测，预测将结合的肽(Stryhn等人1996)并随后合成地产生这些肽并在相关生物测定例如如本文表述的IFN-γ测定中测试它们是可能的。肽优选地具有例如源自多肽的8到11个氨基酸残基的长度。B细胞表位可通过，如例如在Harboe等人1998中表述的，分析对覆盖感兴趣的多肽的重叠肽的B细胞识别来确定。
尽管已经显示T细胞表位的最小长度是至少6个氨基酸，但通常此类表位由氨基酸的更长延伸构成。
多肽的免疫原性部分可能被遗传异质性人类群体的大部分(高频率)或小部分(低频率)识别。另外，一些免疫原性部分诱导高免疫学响应(显性)，而其他的免疫原性部分诱导较低但仍显著的响应(亚显性)。高频率><低频率可能与结合广泛分布的MHC分子(HLA型)或甚至多重MHC分子的免疫原性部分相关(Kilgus等人1991、Sinigaglia等人1988)。
然而，在提供用于针对结核的新疫苗的候选分子的上下文中，亚显性表位与显性表位同样有意义，因为已经显示(WO2008000261)，此类表位尽管是亚显性表位，可以诱导保护。
本发明的多肽的常见特征是其诱导免疫学响应的能力，如实施例中所示。应理解，本发明的多肽通过置换、插入、添加或缺失而产生的变体通过本文描述的任何测定确定也是免疫原性的。
融合蛋白
术语“融合蛋白”被理解为使用或不用随机长度和序列的氨基酸接头/间隔物融合在一起的随机顺序的来自结核分枝杆菌的两种或更多种免疫原性多肽或其类似物。为了避免下游生成中的蛋白聚集，可将融合蛋白中的所有半胱氨酸用任何氨基酸替换，但由于丝氨酸与半胱氨酸的高的结构相似性，它是优选的置换。
接头
接头或间隔物是在融合蛋白中的多肽伴侣之间存在的短肽序列。接头通常包括柔性残基如甘氨酸和丝氨酸，以使得毗邻的蛋白结构域相对于彼此自由地移动并在分泌/产生期间自由地独立适当折叠。当有必要确保两个毗邻结构域在空间上不彼此干扰时，使用较长的接头。
旁系同源物、直系同源物以及同源物
术语“旁系同源物”被理解为由于共有的祖先、接着一次或更多次复制事件而共有一些程度的同源性的蛋白或基因。旁系同源物是通过在基因组内复制而相关联的基因，而直系同源物是通过物种形成从共同的祖先基因演化的不同物种中的同源基因。术语同源物适用于通过物种形成的事件分离的基因之间的关系(直系同源)或适用于通过遗传复制的事件分离的基因之间的关系(旁系同源)。
类似物
术语序列类似物意指在结构上并且在免疫原性上与彼此相似但在氨基酸组成上不同的多肽。
疫苗
本发明的另一部分涉及疫苗组合物，所述疫苗组合物包含根据本发明的融合蛋白。在用毒性分枝杆菌攻击之后，其中本发明的融合蛋白被动物识别的有效疫苗将在动物模型中能够与未被疫苗接种的动物相比降低靶器官中的细菌载量、延长存活时间和/或减少体重减轻。
为了确保此类疫苗组合物的最优性能，优选的是它包含免疫学上和药学上可接受的载体、媒介物或佐剂。
适合的载体选自由以下组成的组：多肽通过疏水非共价相互作用与其结合的聚合物，诸如塑料，例如聚苯乙烯；或多肽与其共价结合的聚合物，诸如多糖；或多肽，例如牛血清白蛋白、卵白蛋白或钥孔血蓝蛋白。适合的媒介物选自由以下组成的组：稀释剂和悬浮剂。佐剂优选地选自由以下组成的组：阳离子脂质体(例如二甲基双十八烷基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium bromide)(DDA))、Quil A、聚I:C、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFN-γ、IL-2、IL-12、单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯(TDB)、胞壁酰二肽(MDP)以及单分枝酰基甘油(monomycolyl glycerol，MMG)或其组合。
实现疫苗的佐剂效果的其他方法包括诸如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)的剂、糖的合成聚合物(Carbopol)的使用，还可采用疫苗中的蛋白通过热处理的聚集、通过用胃蛋白酶处理的白蛋白(Fab)抗体再活化的聚集、与细菌细胞如微小隐孢子虫(C.parvum)或革兰氏阴性细菌的内毒素或脂多糖组分的混合、在生理学上可接受的油媒介物(如二缩甘露醇单油酸酯(Aracel A))中的乳化或以用作封闭取代物(block substitute)的20％全氟化碳溶液(Fluosol-DA)乳化。其他的可能性包括免疫调节物质诸如细胞因子或合成IFN-γ诱导剂诸如聚I:C与以上提及的佐剂的组合使用。
用于实现佐剂效果的另一种感兴趣的可能性是采用Gosselin等人，1992(将其通过引用特此并入本文)中描述的技术。简而言之，可将相关抗原诸如本发明的抗原与针对单核细胞/巨噬细胞上的Fcγ受体的抗体(或抗原结合抗体片段)缀合。
疫苗以与剂型相容的方式、并以将是治疗有效且是免疫原性的量被施用。待施用的量取决于待被治疗的受试者，包括例如个体的免疫系统产生免疫响应的能力和期望的保护程度。合适的剂量范围为每次疫苗接种(per vaccination)数百微克活性成分的量级，优选的范围为从约0.1μg至1000μg，诸如在从约1μg至300μg的范围内，并且特别是在从约10μg至50μg的范围内。初始施用和加强注射的合适方案也是可变化的，但是典型的是初始施用接着后续接种或其他施用。
施用的方式可以广泛变化。用于施用疫苗的任何常规方法是适用的。这些方法被认为包括在固体的生理上可接受的基质上或在生理上可接受的分散液中口服应用、胃肠外、通过注射等。疫苗的剂量将取决于施用的途径并将根据待疫苗接种的人的年龄，以及在较小的程度上根据待疫苗接种的人的尺寸而变化。
疫苗常规地通过例如皮下或肌内注射而胃肠外施用。适用于其他施用模式的另外的制剂包括栓剂和在一些情况中口服制剂。对于栓剂来说，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷二醇(polyalkalene glycols)或甘油三酯；此类栓剂可以由含有在0.5％到10％、优选地1％-2％的范围内的活性成分的混合物形成。口服制剂包括诸如以下的通常采用的赋形剂：例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物呈溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式并且有利地含有10％-95％、优选地25％-70％的活性成分。
在许多例子中，将有必要多次施用疫苗。特别是，可以施用疫苗以预防感染毒性分枝杆菌和/或治疗已建立的分枝杆菌感染。当被施用以预防感染时，疫苗在存在感染的确定的临床迹象或症状之前被预防性地给予。
本发明还涉及用于使动物、包括人类针对由毒性分枝杆菌造成的TB免疫的方法，包括向所述动物施用本发明的多肽或如上文所描述的本发明的疫苗组合物或上文描述的活疫苗。
治疗性疫苗
本发明还涉及本发明的融合蛋白基于其当作为疫苗被施用时减轻实验动物中的结核分枝杆菌感染的严重度或预防之前的感染的再活化的能力而用作治疗性疫苗的用途。用于治疗性疫苗的组合物可以如上文针对疫苗所描述的而被制备。
包含ESX-1相关多肽的融合蛋白
分枝杆菌分泌系统负责将毒性因子输出到细胞外环境或直接到宿主细胞中，并因此在细菌的毒性和存活中发挥着至关重要的作用。ESX-1分泌系统的部分在减毒的牛分枝杆菌BCG和病原性分枝杆菌物种的比较基因组分析期间被鉴定出8。主要的基因组差异之一是牛分枝杆菌基因组中的重大缺失，所述缺失包括编码分泌性抗原CFP10和ESAT-6的区域。观察到该区域特别地负责毒性，且该区域的恢复不仅使ESAT-6能够分泌，而且还导致牛分枝杆菌BCG的增加的毒性4。
ESX-1分泌系统在包括结核分枝杆菌复合群(M.tuberculosis complex)内的所有病原性分枝杆菌在内的缓慢生长的分枝杆菌之中是保守的，并且为分枝杆菌的体内存活所需。分泌的效应子分子的功能为肉芽肿形成起始和吞噬体成熟所需，为从吞噬体逃逸、细胞溶解和细胞到细胞扩散、通过半胱天冬酶活化的细胞凋亡以及通过干扰TLR2信号传导的免疫调节所必需6,9。
现今我们知晓ESX-1分泌系统由三个不同的基因座编码，ESX-1基因座、espA操纵子以及转录调节因子EspR的基因座10,11。ESX-1分泌中涉及的组分的精确数目仍有争论并且似乎在不同的分枝杆菌物种之间是变化的。目前已显示以下结核分枝杆菌基因与ESX-1系统相关：espR、espA；espB；espC、espD、espF esxA；esxB；mycP1；PE35；Rv3862(WhiB6)、Rv3866、Rv3868；Rv3869；Rv3870；Rv3871；Rv3876；Rv3877；Rv3879c；Rv3881c Rv3882c以及MCE1蛋白Mce1B、Mce1C MCe1F和Rv017712,13。
六种在实验上验证的ESX-1底物Rv3616c(EspA)、Rv3615c(EspC)、Rv3849(EspR)、ESAT-6、CFP-10以及Rv3881c(EspB)对于分泌互相依赖于彼此7。
所有已知的ESX-1分泌的底物都是在感染的不同阶段高表达的强抗原—与例如Ag85和其他代谢相关抗原相反，Ag85和其他代谢相关抗原在感染之后不久下调。
考虑到许多ESX-1相关蛋白在感染期间不同时间点的高表达和高免疫原性，我们基于六种ESX-1相关蛋白制备了H74主链融合蛋白。
H74融合蛋白由三种在实验上证实的ESX-1底物(ESAT-6、EspR、EspC)加三种与ESX-1相关的分泌蛋白(EspD、EspA、EspB)组成。在H74融合物中蛋白的顺序是：EspB、ESAT-6、Rv3614、EspC、EspA、EspR。H74由1319个氨基酸组成，理论分子量是137.917g/mol，并且等电点4.77。在由结核分枝杆菌染色体编码的野生型序列中，在EspD、EspC和EspR中有一个半胱氨酸。为了避免在重折叠期间硫桥形成和蛋白聚集的问题，所有三个半胱氨酸都已经被氨基酸丝氨酸替换。
关于H74中个体蛋白的信息：
ESAT-6(Rv3875)与CFP10一起经由ESX-1作为异源二聚体分泌14。
EspR(Rv3849)是其自身表达的转录激活物和包含espA(Rv3616c)、C和D的操纵子。EspR蛋白经由ESX-1分泌15。
EspC(Rv3615c)基因表达由EspR调节。EspC由ESX-1分泌11。
EspD(Rv3614c)基因表达由EspR调节。EspD与espC和espA共转录。EspD表达而非分泌为EsxA分泌所需。EspD使EspA-EspC复合体稳定。EspD分泌不唯一地需要ESX-1系统16。
EspA(Rv3616)基因表达由EspR调节。EspA由ESX-1分泌7。
EspB(Rv3881)由ESX-1分泌{Xu,2007#912；McLaughlin,2007#591}。
关于H78中个体蛋白的信息：
ESAT-6(Rv3875)与CFP10一起经由ESX-1作为异源二聚体分泌14。
EspD(Rv3614c)基因表达由EspR调节。EspD与espC和espA共转录。EspD表达而非分泌为EsxA分泌所需。EspD使EspA-EspC复合体稳定。EspD分泌不唯一地需要ESX-1系统16。
EspC(Rv3615c)蛋白序列的氨基酸1-56。espC基因表达由EspR调节。EspC蛋白由ESX-1分泌11。
EspR(Rv3849)是其自身表达的转录激活物和包含espA(Rv3616c)、C和D的操纵子。EspR蛋白经由ESX-1分泌15。
PE35(Rv3872)是分泌性PE蛋白。基因pe35(Rv3872)的失活损害CFP-10和ESAT-6的表达，表明了在调节中的作用。
图例
图1.疫苗接种后抗原特异性免疫响应。
用在CAF01佐剂中配制的融合蛋白H74或H56疫苗接种动物后，测量T细胞响应的强度和特异性。通过用2ug H74或H56抗原混合物(antigen pools)刺激细胞，在从血液分离的PBMC中(A和C)或在脾中(B和D)定量对H74中组合的6种蛋白或H56中组合的3种蛋白的响应。通过用两种疫苗中的每种单一抗原2ug再刺激来测量抗原特异性(E和F)。读取为在体外刺激三天后通过ELISA在培养物上清液中测量的分泌的IFN-γ。
图2.疫苗诱导的T细胞多功能性和保护效力。
在用疫苗抗原刺激后，利用流式细胞术测量能够产生细胞因子IFN-γ、TNF-γ或IL-2中的至少一种的疫苗特异性CD4T细胞的频率(A)。PBS刺激对照被扣除。对个体CD4T细胞测量3种细胞因子的细胞因子表达谱，并对每组4个个体动物产生三种、两种和单种细胞因子的T细胞的频率制表。总体来说，3种细胞因子有7种组合。饼状图表明了对于每个疫苗接种组细胞因子产生亚型的分布(B)。对于所有6个饼，使用相同的颜色编码。在用结核分枝杆菌气雾攻击后，测量个体动物的肺中的细菌负荷并在组间比较(C)。测试后通过单因素ANOVA和Tukey多重比较进行组的统计学比较(***p<0,001；**p<0,01；*p<0,05)。对每组示出了平均值和SEM。
图3.宽范围的H74疫苗剂量能改进BCG保护。
(A)在用结核分枝杆菌菌株Erdman感染12周后，在小鼠的组中确定结核分枝杆菌细菌的数目。三个月后，使动物疫苗接种单独的BCG或BCG接着是在CAF01佐剂中配制的H74。为了鉴定相关H74疫苗剂量，测试5种不同剂量的H74(从0.01ug到25ug)。基于单因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比较，测试显示出所有的疫苗接种组相对于盐水对照(黑色圆圈，p<0.001)具有显著较低的CFU数目。尽管0.1ug、1ug和5ug H74疫苗接种组具有比仅BCG疫苗接种的组(红色圆圈)低的CFU，但差异不显著。(B)使用0.1ug或5ug H74的实验的重复显示H74显著地减少在预先BCG疫苗接种的被保护的动物中的CFU载量(*，与仅BCG疫苗接种的组相比p<0.05)。
图4.H64和H74能补充BCG疫苗并诱导针对结核分枝杆菌的临床分离株的长期保护。
在用结核分枝杆菌菌株Beijing(A)或Kazakhstan(B)感染24周后，在小鼠的组中确定结核分枝杆菌细菌的数目。两个月后，在两个实验中，动物疫苗接种单独的BCG或BCG接着是在CAF01佐剂中配制的2ug H64或H74。仅在来自其中用H64或H74补充BCG的疫苗接种组的动物中细菌载量的减少是基于单因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比较测试统计学显著的(p<0.05)。
图5.H74针对结核分枝杆菌攻击提供保护并且在与BCG同时注射时能够补充BCG用于改进的保护。
小鼠组可以用BCG疫苗接种一次、用H74/CAF01疫苗接种三次或者用BCG和H74/CAF01(在两个不同的位点注射)一次然后两次H74/CAF01疫苗接种。感染结核分枝杆菌菌株Erdman 6周后确定细菌载量。所有的疫苗给出显著的保护(p<0.001)，但在第一轮疫苗接种中注射BCG和H74两者诱导了比任一种疫苗自身显著更好的保护(p<0.001)。
图6.H64或H78疫苗接种后的T细胞响应。
从个体动物分离来自H64或H78疫苗接种的小鼠的脾细胞并用2ug/ml ESAT-6、Rv3614c、Rv3615c或Rv3865在37℃刺激持续6小时。洗涤后用荧光标记的抗表面标志物CD4和CD44以及细胞因子IFN-g、TNF-a、IL-2和IL17的抗体对细胞染色。通过流式细胞术测量标记的标志物和细胞因子的表达。在对CD4和CD44的高表达门控后，对该激活的T细胞亚组中的细胞因子产生细胞的频率绘图。
实施例
实施例1:
H74融合蛋白-在预防性TB疫苗接种模型中的免疫响应和保护。用0.01ug；0.1ug、1ug、5ug或25ug融合蛋白H74或5ug融合蛋白H56对CB6F1小鼠组疫苗接种3次。两种蛋白均在注射前在基于脂质体的佐剂CAF01中被配制。对照组用等体积的盐水(200uL)注射3次或用200uL BCG疫苗接种一次(5x107CFU/mL)。疫苗接种之间的间隔为2周并且。第3次疫苗接种后3周，分离PBMC和脾细胞并测量疫苗诱导的T细胞响应。用2ug存在于两种融合蛋白中的个体蛋白或2ug融合蛋白孵育分离的细胞(5x 106/孔)持续3天，并通过ELISA在培养基中测量分泌的IFN-g(图1A-F)。在H56疫苗接种的对照动物中，存在强的H56蛋白和Ag85B识别以及中等的ESAT-6识别。H74疫苗接种的动物具有对Rv3881c特异性的强响应以及对Rv3849c和Rv3616c的中度响应。在该近交小鼠品系中，不存在对Rv3615c或Rv3614c的响应。在生理盐水注射的动物中不存在响应，证实了响应是疫苗特异性的。根据器官(图1A和B)，H74响应的强度在接受1ug或5ug H74蛋白的动物中是最强的。但是，即使0.1ug的低剂量的H74也给出了比用5ug H56蛋白疫苗接种高的IFN-γ释放。对于由脾T细胞产生的另外的细胞因子，响应的T细胞的最大频率被发现于1ug H74组，但是再次，0.01ug H74给出比5ug H56高的响应(图2A)。在疫苗剂量和T细胞的多功能性方面，在产生IL-2的T细胞的相对比例和H74疫苗接种剂量之间存在负相关(图2B)。
在第3次疫苗接种后六周，用毒性结核分枝杆菌菌株Erdman对所有动物气雾攻击。在攻击之后12周，将所有小鼠安乐死，并通过平板接种肺匀浆的稀释液并对菌落的数目计数来确定个体动物的肺中的细菌数目(图2C)。三种H74疫苗剂量和BCG与盐水对照组相比全都诱导显著的保护。重要的是，对照疫苗H56疫苗在该时间点不诱导统计水平的保护。
实施例2:
H74和H64融合蛋白作为BCG的补充疫苗。除了对照动物之外，所有的CB6F1小鼠为BCG疫苗接种的。
为了确定用于在BCG疫苗基础上疫苗接种的最佳H74剂量，用在基于脂质体的佐剂CAF01中配制的不同剂量的融合蛋白H74对BCG疫苗接种的动物组疫苗接种3次。第一次H74疫苗接种在BCG疫苗接种后3个月注射。对照动物接受用盐水体积(无BCG、无H74)注射4次或用BCG疫苗接种一次。H74疫苗接种之间的间隔为2周。在第3次H74疫苗接种之后6周，用毒性结核分枝杆菌菌株Erdman对动物气雾攻击。12周后，将所有小鼠安乐死，并通过平板接种肺匀浆的稀释液并对菌落的数目计数来确定个体动物的肺中的细菌数目(图3A和B)。
从0.1ug至5ug的H74剂量诱导相似的保护水平，CFU数目稍低于仅BCG疫苗接种的动物中的CFU数目。所有的疫苗接种组诱导与盐水对照相比显著的保护(p<0.001)。在仅包含H74疫苗接种剂量0.1ug和5ug H74的重复实验中(图3B)，结果相似。所有经疫苗接种的动物具有显著较低的细菌载量(p<0.001)，但是在这次，H74补充组还具有比仅BCG疫苗接种的组显著低的CFU。为了比较作为BCG补充疫苗的H74和H64，对动物进行BCG疫苗接种并在2个月后如以上用0.1ug H64/CAF01或H74/CAF01疫苗接种。在本实验中，在第三次H64或H74疫苗接种后6周，用临床结核分枝杆菌分离株Beijing(图4A)或临床结核分枝杆菌分离株Kazakhstan(图4B)攻击动物。感染24周后，计算个体肺中的细菌载量。在该晚的时间点，BCG对任何分离株的保护效力不显著。但是，用H64或H74补充BCG针对结核分枝杆菌的两种临床分离株均给出显著的保护(p<0.001)。
实施例3：
H74能补充BCG，即使第一次疫苗接种在与BCG疫苗接种相同的时间点。
在本实验中有四个疫苗接种组和一个盐水对照组。一个疫苗接种组只接受BCG以及一个组接受三次5ug H74/CAF01。其余两组用一个注射器接受BCG疫苗接种并用另一个注射器接受H74/CAF01或CAF01疫苗接种(并行的疫苗接种(side-by-side vaccination))作为它们的第一次疫苗接种。在第二次和第三次疫苗接种中，它们分别接受H74/CAF01或CAF01。在第三次疫苗接种后6周，用结核分枝杆菌菌株Erdman攻击所有动物，并在6周后如以上在肺中确定CFU数目(图5)。所有的疫苗诱导显著的保护(p<0.001)并且对于BCG、BCG:CAF01和H74水平是相似的。但是，在接受BCG:H74和两次H74增强的组中的动物在肺中具有比其他疫苗接种组-BCG、BCG:CAF01和H74显著低的细菌(p<0.001)。
实施例4：
H78和H64疫苗接种诱导针对融合蛋白中的主要抗原的可比的T细胞响应。
H64融合蛋白包含来自结核分枝杆菌的6种蛋白。这些蛋白中的两种，Rv3865和Rv3615，在TB患者中被高频率且特异性地识别，并因此在即将到来的TB诊断试剂盒中作为蛋白抗原具有重要价值。由于抗原重叠，H64疫苗的世界范围的应用会危及该诊断试剂盒。为了避免该问题，全长Rv3865和Rv3615蛋白的一半被从H64移除，以产生稍短的融合蛋白，被称为H78。为了比较H64和H78诱导免疫响应的能力，将动物组用在CAF01佐剂中配制的2ugH64或H78疫苗接种3次或用盐水注射3次。第3次疫苗接种后3周，将来自每组的三只动物处死并在脾细胞中通过流式细胞术测量针对最重要的抗原的T细胞响应(图6)。H64和H78两者均诱导预期的抗原模式。H64诱导出针对研究的所有4种抗原(ESAT-6、Rv3615c、Rv3614c和Rv3865)的T细胞响应。如预期的，在H78疫苗接种的动物中不存在针对Rv3865的响应，但是，相当重要的是，尽管H78缺少一半的Rv3615c蛋白，仍然以与在H64疫苗接种的动物中发现的相似的T细胞频率存在针对Rv3615c的特异性响应。
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Claims (11)

1.一种融合蛋白或抗原混合物，所述融合蛋白或抗原混合物包含选自以下的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO.1(Rv3881)、SEQ ID NO 2(ESAT-6)、SEQ ID NO 3(Rv3614c)、SEQ ID NO4(Rv3615c)、SEQ ID NO 5(Rv3616c)和SEQ ID NO 6(Rv3849)；或
b)SEQ ID NO.2(ESAT6)、SEQ ID NO.3(Rv3614c)、SEQ ID NO.6(Rv3849)和SEQ IDNO.8(Rv3872)；或
c)SEQ ID NO.2(ESAT6)、SEQ ID NO.3(Rv3614c)、SEQ ID NO.9(Rv3615的部分)、SEQID NO.6(Rv3849)和SEQ ID NO.8(Rv3872)；或
d)SEQ ID NO.1(Rv3881)、SEQ ID NO 2(ESAT-6)、SEQ ID NO 3(Rv3614c)、SEQ ID NO5(Rv3616c)和SEQ ID NO 6(Rv3849)；或
e)SEQ ID NO.2(ESAT6)、SEQ ID NO.6(Rv3849)和SEQ ID NO.8(Rv3872)；或
f)SEQ ID NO.1(Rv3881)、SEQ ID NO 2(ESAT-6)、SEQ ID NO 5(Rv3616c)和SEQ ID NO6(Rv3849)；或
g)SEQ ID NO.1(Rv3881)、SEQ ID NO 2(ESAT-6)和SEQ ID NO6(Rv3849)；或
与其具有至少80％序列同一性并且同时是免疫原性的氨基酸序列类似物。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白或抗原混合物，其中所述氨基酸序列类似物与所述序列具有至少90％或更优选95％的序列同一性。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中半胱氨酸已被另一种氨基酸替换以避免硫桥形成和蛋白聚集。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述半胱氨酸已被丝氨酸替换。
5.根据权利要求1-4所述的融合蛋白，其中融合伴侣与接头分子连接。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO 7(H74)、SEQ ID NO.9(H164)、SEQ ID NO.10(H174)、SEQ ID NO 11(H264)、SEQ ID NO 12(H274)、SEQ ID NO 13(H374)或SEQ ID NO.14(H78)。
7.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白或抗原混合物用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于针对由毒性分枝杆菌引起的感染的疫苗接种，所述由毒性分枝杆菌引起的感染例如由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)或牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的感染。
8.一种疫苗，所述疫苗包含根据权利要求1-6所述的融合蛋白或抗原混合物。
9.根据权利要求8所述的疫苗，所述疫苗另外包含佐剂。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其中所述佐剂选自由以下组成的组：阳离子脂质体(例如二甲基双十八烷基溴化铵(DDA))、Quil A、聚I:C、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFN-γ、IL-2、IL-12、单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯(TDB)、胞壁酰二肽(MDP)以及单分枝酰基甘油(MMG)或其组合。
11.一种用于使动物包括人类针对由毒性分枝杆菌引起的结核免疫的方法，所述由毒性分枝杆菌引起的结核例如由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌或牛分枝杆菌引起的结核，所述方法包括向所述动物施用根据权利要求8-10中任一项所述的疫苗。
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