IT202000009688A1 - Proteine di fusione di ancoraggio a esosomi - Google Patents
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Description
PROTEINE DI FUSIONE DI ANCORAGGIO AD ESOSOMI
FONDAMENTO
[0001] I vaccini sono strumenti efficaci per prevenire e trattare infezioni virali e batteriche. I vaccini possono anche essere usati vaccini per prevenire e trattare vari tipi di cancro. Le cellule B svolgono un ruolo fondamentale nell'immunit? adattativa, fornendo protezione dagli agenti patogeni attraverso la produzione di anticorpi specifici. Anche l'attivazione e l'attivit? delle cellule T, tra cui le cellule T CD4<+ >e CD8<+>, sono una parte importante della risposta immunitaria adattativa. I vaccini progettati per indurre le cellule T possono contribuire direttamente alla clearance degli agenti patogeni attraverso meccanismi cellulo-mediati e l'eliminazione mirata di cellule tumorali.
[0002] Gli esosomi sono vescicole extracellulari legate alla membrana prodotte dalla gemmazione verso l'interno di endosomi tardivi. Gli esosomi hanno attivit? biologiche in vivo ed esercitano ruoli significativi in varie condizioni patologiche come il cancro, le malattie autoimmuni e le malattie infettive e neurodegenerative. Gli esosomi derivati da cellule dendritiche esprimono MHC I, MHC II e molecole costimolatorie e hanno dimostrato di essere in grado di indurre e potenziare le risposte delle cellule T in vivo specifiche per un antigene. Studi clinici hanno dimostrato la fattibilit? degli esosomi come vaccini acellulari nei pazienti. Tuttavia, l'efficacia terapeutica dei vaccini esosomatici sembra essere limitata.
[0003] Pertanto, nel ramo vi ? la necessit? di aumentare l'immunogenicit? dei vaccini esosomatici.
RIEPILOGO
[0004] Abbiamo progettato e testato proteine di fusione che comprendono un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e un dominio polipeptidico di antigene immunogeno. Le proteine di fusione possono essere utilizzate per trattare o prevenire malattie come infezioni virali o il cancro.
[0005] Di conseguenza, in un primo aspetto, viene fornita in questa sede una proteina di fusione. La proteina di fusione comprende, da N-terminale a C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno, in cui il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >tronca avente una sequenza di amminoacidi selezionata dai numeri di identificazione di sequenza (SEQ ID N?): 1-30.
[0006] In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ha la sequenza di amminoacidi della SEQ ID N?: 1. In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ha la sequenza di amminoacidi della SEQ ID N?: 30.
[0007] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene virale o un antigene tumorale.
[0008] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene virale. In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? selezionato dal gruppo costituito da: un antigene del papillomavirus umano (HPV), un antigene del virus dell'immunodeficienza umana (HIV), un antigene del virus dell'epatite B (HBV), un antigene del virus dell'epatite C (HCV), un antigene del virus Ebola, un antigene del virus del Nilo occidentale, un antigene del virus Congo-Crimea, un antigene del virus dengue e un antigene del virus dell'influenza.
[0009] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del papillomavirus umano (HPV). In alcune forme di realizzazione, l'antigene di HPV ? E6 o E7 del papillomavirus umano.
[0010] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dell'immunodeficienza umana (HIV). In alcune forme di realizzazione , l'antigene di HIV ? Gag o Tat del virus dell'immunodeficienza umana.
[0011] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dell'epatite B (HBV). In alcune forme di realizzazione, l'antigene di HBV ? il Core del virus dell'epatite B.
[0012] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dell'epatite C (HCV). In alcune forme di realizzazione, l'antigene di HCV ? Core, NS3, E1 o E2 del virus dell'epatite C.
[0013] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus Ebola. In alcune forme di realizzazione, l'antigene del virus Ebola ? VP24, VP40, NP o GP del virus Ebola.
[0014] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus del Nilo occidentale. In alcune forme di realizzazione, l'antigene del virus del Nilo occidentale ? NS3 del virus del Nilo occidentale.
[0015] In alcune forme di realizzazione , l'antigene virale ? un antigene del virus Congo-Crimea. In alcune forme di realizzazione, l'antigene del virus Congo-Crimea ? GP o NP del virus Congo-Crimea.
[0016] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dengue.
[0017] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dell'influenza. In alcune forme di realizzazione, il virus dell'influenza viene selezionato dal gruppo costituito da: virus parainfluenzale 1, virus parainfluenzale 2, virus dell'influenza A e virus dell'influenza B. In alcune forme di realizzazione, il virus dell'influenza ? il virus dell'influenza A. In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? la nucleoproteina (NP) o la proteina di matrice (M1) del virus dell'influenza A.
[0018] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene batterico. In alcune forme di realizzazione, l'antigene batterico ? un antigene di Mycobacterium tuberculosis.
[0019] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene parassitario. In alcune forme di realizzazione, l'antigene parassitario ? un antigene di Plasmodium.
[0020] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene tumorale. In alcune forme di realizzazione, l'antigene tumorale ? un antigene tumorale specifico. In alcune forme di realizzazione, l'antigene tumorale ? un antigene associato al tumore.
[0021] In un altro aspetto, viene fornito in questa sede un polinucleotide che codifica la proteina di fusione descritta in precedenza. In alcune forme di realizzazione, il polinucleotide ? DNA. In alcune forme di realizzazione, il polinucleotide ? RNA.
[0022] In un altro aspetto, viene fornito in questa sede un vettore comprendente almeno un polinucleotide descritto in precedenza, in cui il vettore esprime almeno una proteina di fusione descritta in precedenza. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore plasmidico. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore virale.
[0023] In un altro aspetto, viene fornita in questa sede una vescicola extracellulare comprendente la proteina di fusione, il polinucleotide o il vettore descritto in precedenza. In alcune forme di realizzazione, la vescicola extracellulare ? un esosoma.
[0024] In un altro aspetto, viene fornita in questa sede una nanoparticella comprendente la proteina di fusione, il polinucleotide o il vettore descritti in precedenza.
[0025] In un altro aspetto, viene fornita in questa sede una composizione farmaceutica comprendente la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare o la nanoparticella descritti in precedenza, e un eccipiente farmaceuticamente accettabile. In alcune forme di realizzazione, la composizione farmaceutica ? formulata per la somministrazione intramuscolare.
[0026] In un altro aspetto, viene fornito in questa sede un metodo per trattare o prevenire una malattia o una condizione in un soggetto che ne abbia bisogno mediante immunizzazione. Il metodo comprende la somministrazione al soggetto di una quantit? efficace di proteina di fusione, polinucleotide, vettore, vescicola extracellulare, nanoparticella o composizione farmaceutica.
[0027] In alcune forme di realizzazione, viene somministrata al soggetto una pluralit? di antigeni immunogeni. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni immunogeni sono espressi dallo stesso vettore. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni immunogeni sono espressi da vettori diversi. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni immunogeni vengono somministrati simultaneamente al soggetto.
[0028] In alcune forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un'infezione virale. In alcune forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un cancro.
[0029] In alcune forme di realizzazione, la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare, la nanoparticella o la composizione farmaceutica viene somministrata mediante somministrazione intramuscolare. In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende inoltre l'elettroporazione immediatamente dopo la somministrazione intramuscolare.
[0030] In un altro aspetto, viene fornito in questa sede un metodo per indurre una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) specifica per l'antigene e/o delle cellule T CD4<+ >specifica per l'antigene in un soggetto che ne ha bisogno. Il metodo comprende la somministrazione al soggetto una quantit? efficace di proteina di fusione, polinucleotide, vettore, vescicola extracellulare, nanoparticella o composizione farmaceutica.
[0031] In alcune forme di realizzazione, viene somministrata al soggetto una pluralit? di antigeni immunogeni. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni immunogeni vengono espressi dallo stesso vettore. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni immunogeni sono espressi da vettori diversi. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni immunogeni vengono somministrati al soggetto simultaneamente.
[0032] In alcune forme di realizzazione, il soggetto ha, o ? a rischio di, infezione virale. In alcune forme di realizzazione, il soggetto ha, o ? a rischio di, cancro.
[0033] In alcune forme di realizzazione, la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare, la nanoparticella o la composizione farmaceutica sono somministrate mediante somministrazione intramuscolare. In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende inoltre l'elettroporazione immediatamente dopo la somministrazione intramuscolare.
[0034] In un altro aspetto, viene fornita in questa sede una proteina di fusione, comprendente: da N-terminale a C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno, in cui il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >o una proteina Nef<mut >tronca avente una sequenza di amminoacidi selezionata da SEQ ID N?: 1-30, e in cui l'antigene immunogeno ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 33 o SEQ ID N?: 36.
[0035] In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >avente la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 1, e in cui l'antigene immunogeno ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 33. In alcune forme di realizzazione, la proteina di fusione ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 39.
[0036] In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >avente la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 1, e in cui l'antigene immunogeno ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 36. In alcune forme di realizzazione, la proteina di fusione ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 42.
[0037] In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >tronca avente la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 30, e in cui l'antigene immunogeno ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 33. In alcune forme di realizzazione, la proteina di fusione ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 45.
[0038] In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >tronca avente la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 30, e in cui l'antigene immunogeno ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 36. In alcune forme di realizzazione, la proteina di fusione ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 48.
[0039] In un altro aspetto, viene fornito in questa sede un polinucleotide che codifica la proteina di fusione descritta in precedenza. In alcune forme di realizzazione, il polinucleotide ? DNA. In alcune forme di realizzazione, il polinucleotide ha la sequenza nucleotidica di SEQ ID N?: 38, 41, 44 o 47. In alcune forme di realizzazione, il polinucleotide ? RNA.
[0040] In un altro aspetto, viene fornito in questa sede un vettore comprendente almeno un polinucleotide descritto in precedenza, in cui il vettore esprime almeno una proteina di fusione descritta in precedenza. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore plasmidico. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore virale.
[0041] In un altro aspetto, viene fornita in questa sede una vescicola extracellulare comprendente la proteina di fusione, il polinucleotide o il vettore descritti in precedenza. In alcune forme di realizzazione, la vescicola extracellulare ? un esosoma.
[0042] In un altro aspetto, viene fornita in questa sede una nanoparticella comprendente la proteina di fusione, il polinucleotide o il vettore descritti in precedenza.
[0043] In un altro aspetto, viene fornita in questa sede una composizione farmaceutica comprendente la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare o la nanoparticella descritti in precedenza, e un eccipiente farmaceuticamente accettabile. In alcune forme di realizzazione, la composizione farmaceutica ? formulata per la somministrazione intramuscolare.
[0044] In un altro aspetto, viene fornito in questa sede un metodo per trattare o prevenire un'infezione da papillomavirus umano (HPV). Il metodo comprende la somministrazione di una quantit? efficace della proteina di fusione, del polinucleotide, del vettore, della vescicola extracellulare, della nanoparticella o della composizione farmaceutica a un paziente che ha, o ? a rischio di, un'infezione da HPV.
[0045] In alcune forme di realizzazione, vengono somministrati al paziente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi dallo stesso vettore. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi da vettori diversi. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 vengono somministrati al paziente simultaneamente.
[0046] In alcune forme di realizzazione, la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare, la nanoparticella o la composizione farmaceutica ? somministrata mediante somministrazione intramuscolare. In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende inoltre l'elettroporazione immediatamente dopo la somministrazione intramuscolare.
[0047] In un altro aspetto, viene fornito in questa sede un metodo per indurre una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) e/o delle cellule T CD4<+ >specifica per l'antigene in un paziente che ha, o ? a rischio di, un'infezione da HPV. Il metodo comprende la somministrazione di una quantit? efficace della proteina di fusione, del polinucleotide, del vettore, della vescicola extracellulare, della nanoparticella o della composizione farmaceutica a un paziente che ha, o ? a rischio di, un'infezione da HPV.
[0048] In alcune forme di realizzazione, vengono somministrati al paziente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi dallo stesso vettore. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi da vettori diversi. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 vengono somministrati al paziente simultaneamente.
[0049] In alcune forme di realizzazione, la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare, la nanoparticella o la composizione farmaceutica ? somministrata mediante somministrazione intramuscolare. In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende inoltre l'elettroporazione immediatamente dopo la somministrazione intramuscolare.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI
[0050] Queste e altre caratteristiche, aspetti e vantaggi della presente invenzione verranno compresi meglio con riferimento alla seguente descrizione e ai disegni allegati, in cui:
[0051] Le Figure 1A e 1B mostrano la struttura del costrutto molecolare di DNA che esprime Nef<mut>/HPV16-E7, con la Figura 1A che mostra uno schema del costrutto: "ie-CMV" ? il promotore CMV immediatamente precoce; "SD" ? il sito principale di splicing del donatore; "SA" ? il sito principale di splicing dell'accettore; "polyA" ? il sito di poliadenilazione ? e la Figura 1B che mostra una porzione della sequenza nucleotidica, inclusa l'estremit? da 5' a 3', l'estremit? 3' dell'ORF di Nef<mut>, il linker GPGP a valle (SEQ ID N?: 55) che include il sito Apa I, e gli altri siti di restrizione rilevanti del vettore di espressione pTarget-Nef<mut>.
[0052] Le Figure 2A e 2B mostrano la risposta delle cellule T CD8<+ >e CD4<+ >specifica per E7 di HPV16 indotta in topi a cui ? stato iniettato un vettore di DNA che esprime Nef<mut>/E7 con o senza una successiva elettroporazione (EP), con la Figura 2A che mostra la risposta delle cellule T CD8<+ >specifica per E7 di HPV16 e la Figura 2B mostra la risposta delle cellule T CD4<+ >specifica per E7 di HPV16. I topi C57BL/6 sono stati inoculati due volte o con il vettore di DNA-Nef<mut>/E7 o con il solo vettore vuoto (Nil). Al momento del sacrificio, 2,5 ?10<5 >splenociti/pozzetto sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati) o specifici per E7 in micropozzetti EliSpot di IFN-? in triplicato. Il numero di SFU (Spot-forming Unit) di IFN-?/pozzetto ? mostrato in valori medi dei triplicati. Vengono inoltre riportati i valori medi infragruppo. ND: non fatto.
[0053] Le Figure 3A e 3B mostrano il rilevamento di prodotti di fusione basati su Nef<mut>/E6 in cellule trasfettate e rispettivi esosomi, con la Figura 3A che mostra l'espressione della proteina di fusione nelle cellule trasfettate e la Figura 3B che mostra la proteina di fusione negli esosomi. L'analisi Western blot ? stata eseguita con 30 ?g di lisati cellulari da cellule 293T trasfettate con vettori di DNA, che esprimono i prodotti di fusione a base di Nef<mut >indicati, e volumi uguali di tampone in cui gli esosomi purificati sono stati risospesi dopo centrifugazioni differenziali dei rispettivi surnatanti. Come controllo, sono state incluse condizioni da cellule sottoposte a trasfezione simulata nonch? da cellule trasfettate con Nef di tipo selvatico. Gli anticorpi policlonali anti-Nef servivano a rilevare i prodotti a base di-Nef<mut>, mentre ?-actina e Alix erano marcatori rispettivamente per lisati cellulari ed esosomi. I relativi prodotti proteici sono indicati dalle frecce: per le linee 2, 3 e 4, la freccia a sinistra indica la proteina Nef selvatica, la proteina Nef<mut >e la proteina Nef<mut>PL. A causa della sua minore lunghezza, Nef<mut>PL si muove leggermente pi? veloce su gel SDS. Per le linee 5, 6 e 7, le frecce al centro indicano un prodotto a base di Nef<mut>/E6 e un prodotto di degradazione a base di Nef<mut>/E6 pi? corto. La freccia a destra indica il prodotto a base di Nef<mut>PL/E6 (linee 8 e 9). Controllo positivo: cellule ed esosomi da trasfezione con pcDNA3-Nef<mut>/GFP. I marcatori molecolari sono forniti in kDa.
[0054] Le Figure 4A e 4B mostrano il rilevamento di prodotti di fusione basati su Nef<mut>/E7 in cellule trasfettate e rispettivi esosomi, con la Figura 4A che mostra l'espressione della proteina di fusione nelle cellule trasfettate e la Figura 4B che mostra la proteina di fusione negli esosomi. L'analisi Western blot ? stata eseguita con 30 ?g di lisati cellulari da cellule 293T trasfettate con vettori di DNA, che esprimono i prodotti di fusione a base di Nef<mut >indicati, e volumi uguali di tampone in cui gli esosomi purificati sono stati risospesi dopo centrifugazioni differenziali dei rispettivi surnatanti. Come controllo, sono state incluse condizioni da cellule sottoposte a trasfezione simulata nonch? da cellule trasfettate con il solo Nef<mut>. Gli anticorpi policlonali anti-Nef servivano a rilevare i prodotti a base di-Nef<mut>, mentre ?-actina e Alix erano marcatori rispettivamente per lisati cellulari ed esosomi. I prodotti della proteina Nef sono indicati dalle frecce: per le linee 2 e 3, la freccia a sinistra indica la proteina Nef<mut >e la proteina Nef<mut>PL. A causa della sua minore lunghezza, Nef<mut>PL si muove leggermente pi? veloce su gel SDS. La freccia a destra indica il prodotto basato su Nef<mut>/E7 e il prodotto basato su Nef<mut>PL/E7 (linee da 4 a 9). I marcatori molecolari sono forniti in kDa.
[0055] Le Figure 5A e 5B mostrano l'analisi di prodotti E6 ed E7 di HPV16 in cellule trasfettate e rispettivi esosomi, con la Figura 5A che mostra l'espressione di prodotti E6 ed E7 di HPV16 nelle cellule trasfettate e la Figura 5B che mostra i prodotti E6 ed E7 di HPV16 negli esosomi. L'analisi Western blot ? stata eseguita da 30 ?g di lisati cellulari da cellule 293T trasfettate con vettori di DNA, che esprimono gli ORF di HPV16 indicati, e volumi uguali di tampone in cui gli esosomi purificati sono stati risospesi dopo centrifugazioni differenziali dei rispettivi surnatanti. Come controllo, sono state incluse condizioni da cellule sottoposte a trasfezione simulata, nonch? da cellule trasfettate con Nef<mut >fuso con un scFv (Nef<mut >GO) che include un His-tag in corrispondenza del suo C-terminale. Gli anticorpi policlonali anti-Histag sono serviti a rilevare sia prodotti correlati a HPV16 (indicati da una freccia) che prodotti Nef<mut>-GO, mentre ?-actina e Alix sono stati rivelati rispettivamente come marcatori per lisati cellulari ed esosomi. I prodotti proteici rilevanti sono indicati dalle frecce. I marcatori molecolari sono forniti in kDa.
[0056] Le Figure 6A e 6B mostrano l'immunit? delle cellule T CD8<+ >e CD4<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16 indotta nei topi mediante iniezione (intramuscolare elettroporazione; i.m.+EP) dei vettori di DNA indicati, con la Figura 6A che mostra la risposta delle cellule T CD8<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16 e la Figura 6B che mostra la risposta delle cellule T CD4<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16. Ai topi C57BL/6 sono stati inoculati (i.m.+EP) 10 ?g dei vettori di DNA che esprimono prodotti a base di Nef<mut>. Come controllo, i topi sono stati inoculati con il vettore vuoto (Nil). Al momento del sacrificio, 2,5 ?10<5 >splenociti sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati), specifici per E6 o E7 in micropozzetti EliSpot di IFN-? in triplicato. Il numero di SFU (Spot-forming Unit) di IFN-?/pozzetto ? mostrato in valori medi dei triplicati. Vengono inoltre riportati i valori medi infragruppo.
[0057] Le Figure 7A, 7B e 7C mostrano l'accumulo intracellulare di IFN-?, IL-2 e TNF-? in cellule T CD8<+ >da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati, con la Figura 7A che mostra l'accumulo intracellulare di IFN-? in cellule T CD8<+>, la Figura 7B che mostra l'accumulo intracellulare di IL-2 in cellule T CD8<+>, e la Figura 7C che mostra l'accumulo intracellulare di TNF-? in cellule T CD8<+>. Gli splenociti crioconservati sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati), specifici per E6 o E7 in presenza di Brefeldina A, e poi analizzati mediante colorazione intracellulare delle citochine (ICS). Per ciascun topo, sono state riportate le percentuali assolute delle cellule T CD8<+ >positive delle cellule T CD8<+ >vive totali per ciascuna citochina, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. Negli istogrammi, ogni barra rappresenta un singolo animale.
[0058] Le Figure 8A, 8B e 8C mostrano valori medi infragruppo SD delle percentuali delle cellule T CD8<+ >che accumulano IFN-?, IL-2 e TNF-? all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati, con la Figura 8A che mostra i valori medi infragruppo SD delle percentuali di cellule T CD8<+ >che accumulano IFN-?, la Figura 8B che mostra i valori medi infragruppo SD delle percentuali di cellule T CD8<+ >che accumulano IL-2, e la Figura 8C che mostra i valori medi infragruppo SD delle percentuali di cellule T CD8<+ >che accumulano TNF-?. Sono mostrati i valori medi SD delle percentuali assolute delle cellule T CD8<+ >positive da colture trattate con peptidi specifici, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. Negli istogrammi, ogni barra rappresenta un gruppo di animali.
[0059] Le Figure 9A e 9B mostrano l'accumulo intracellulare di IFN-?, IL-2 e TNF-? in cellule T CD8<+ >da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati come determinato mediante rilevamento di sottopopolazioni di cellule T CD8<+ >positive a una, due o tre citochine, con la Figura 9A che mostra i risultati da topi iniettati con Nef<mut>/E7, Nef<mut>/E7<OD >e Nef<mut>PL/E7<OD >e la Figura 9B che mostra i risultati da topi iniettati con Nef<mut>/E6, Nef<mut>/E6<OD >e Nef<mut>PL/E6<OD>. Gli splenociti crioconservati sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati), specifici per E6 o E7 in presenza di Brefeldina A, e quindi analizzati mediante ICS. Sono mostrate percentuali sia assolute che relative di cellule T CD8<+ >positive all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture trattate con peptidi specifici, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. I valori rilevati di splenociti da topi a cui era stato iniettato il vettore di controllo sono stati inferiori alla soglia di sensibilit? del saggio (non mostrata). I dati sperimentali su cui si basa l'analisi sono uguali a quelli delle Figure 7A, 7B e 7C.
[0060] La Figura 10 mostra percentuali medie infragruppo di cellule T CD8<+ >positive a IFN-?, IL-2 e TNF-? all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati come determinato dal rilevamento di sottopopolazioni di cellule T CD8<+ >positive a una, due o tre citochine. Sono mostrate percentuali medie sia assolute che relative di cellule T CD8<+ >positive all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture trattate con peptidi specifici, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. I valori rilevati di splenociti da topi a cui era stato iniettato il vettore di controllo sono stati inferiori alla soglia di sensibilit? del saggio (non mostrata). I dati sperimentali su cui si basa l'analisi sono uguali a quelli delle Figure 8A, 8B e 8C.
[0061] Le Figure 11A e 11B mostrano l'immunit? delle cellule T CD8<+ >e CD4<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16 indotta in topi iniettati o co-iniettati con i vettori di DNA indicati, con la Figura 11A che mostra la risposta delle cellule T CD8<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16 e la Figura 11B che mostra la risposta delle cellule T CD4<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16. I topi C57BL/6 sono stati inoculati (i.m.+EP) con 10 ?g dei vettori di DNA che esprimono Nef<mut>/E6<OD >e Nef<mut>/E7<OD >separatamente o in combinazione. Come controllo, i topi sono stati inoculati con il vettore vuoto (Nil). Al momento del sacrificio, 2,5?10<5 >splenociti sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati), specifici per E6, per E7 o per E6+E7 in micropozzetti EliSpot di IFN-? in triplicato. Il numero di SFU (Spot-forming Unit) di IFN-?/pozzetto ? riportato in valori medi dei triplicati. Vengono inoltre riportati i valori medi infragruppo. Nei topi co-iniettati, ? stata valutata anche la sola risposta immunitaria specifica per E7. ND: non fatto.
[0062] Le Figure 12A, 12B e 12C mostrano l'accumulo intracellulare di IFN-?, IL-2 e TNF-? nelle cellule T CD8<+ >da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati, con la Figura 12A che mostra l'accumulo intracellulare di IFN-? nelle cellule T CD8<+>, la Figura 12B che mostra l'accumulo intracellulare di IL-2 nelle cellule T CD8<+>, e la Figura 12C che mostra l'accumulo intracellulare di TNF-? nelle cellule T CD8<+>. Gli splenociti crioconservati sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati), specifici per E6 o E7 in presenza di Brefeldina A, e quindi analizzati mediante ICS. Vengono riportate le percentuali assolute delle cellule T CD8<+ >positive all'interno delle cellule T CD8<+ >totali per ogni citochina, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. N.D.: non rilevabile, valori inferiori alla soglia di sensibilit? del saggio. Negli istogrammi, ogni barra rappresenta un singolo animale.
[0063] Le Figure 13A, 13B e 13C mostrano valori medi infragruppo SD delle percentuali di accumulo intracellulare di IFN-?, IL-2 e TNF-? nelle cellule T CD8<+ >da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati, con la Figura 13A che mostra i valori medi infragruppo SD delle percentuali di accumulo intracellulare di IFN-? nelle cellule T CD8<+>, la Figura 13B che mostra i valori medi infragruppo SD delle percentuali di accumulo intracellulare di IL-2 nelle cellule T CD8<+>, e la Figura 13C che mostra i valori medi infragruppo SD delle percentuali di accumulo intracellulare di TNF-? nelle cellule T CD8<+>. Sono mostrati valori medi SD delle percentuali assolute delle cellule T CD8<+ >positive all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture trattate con peptidi specifici, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. Negli istogrammi, ogni barra rappresenta un gruppo di animali.
[0064] Le Figure 14A e 14B mostrano l'accumulo intracellulare di IFN-?, IL-2 e TNF-? nelle cellule T CD8<+ >da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati come determinato mediante rilevamento di sottopopolazioni di cellule T CD8<+ >positive a una, due o tre citochine, con la Figura 14A che mostra i risultati da topi con singola iniezione di Nef<mut>/E7<OD >o Nef<mut>/E6<OD >e la Figura 14B che mostra i risultati da topi con coiniezione di Nef<mut>/E7<OD >+ Nef<mut>/E6<OD>. Gli splenociti crioconservati sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati), specifici per E6 o E7 in presenza di Brefeldina A, e quindi analizzati mediante ICS. Sono mostrate percentuali sia assolute che relative di cellule T CD8<+ >positive all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture trattate con peptidi specifici, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. I valori rilevati di splenociti da topi a cui era stato iniettato il vettore di controllo sono stati inferiori alla soglia di sensibilit? del saggio (non mostrata). I dati sperimentali su cui si basa l'analisi sono uguali a quelli delle Figure 12A, 12B e 12C.
[0065] La Figura 15 mostra percentuali medie infragruppo di cellule T CD8<+ >positive a IFN-?, IL-2 e TNF-? all'interno di cellule T CD8<+ >totali da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati come determinato dal rilevamento di sottopopolazioni di cellule T CD8<+ >positive a una, due o tre citochine. Sono mostrate percentuali medie sia assolute che relative di cellule T CD8<+ >positive all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture trattate con peptidi specifici, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. I valori rilevati di splenociti da topi a cui era stato iniettato il vettore di controllo sono stati inferiori alla soglia di sensibilit? del saggio (non mostrata). I dati sperimentali su cui si basa l'analisi sono uguali a quelli delle Figure 13A, 13B e 13C.
[0066] Le Figure 16A e 16B mostrano l'immunit? delle cellule T CD8<+ >e CD4<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16 indotta in topi iniettati (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati, con la Figura 16A che mostra la risposta delle cellule T CD8<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16 e la Figura 16B che mostra la risposta delle cellule T CD4<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16. Dei topi C57BL/6 sono stati inoculati (i.m.+EP) con 10 ?g dei vettori di DNA che esprimono E6<OD>, E7<OD>, Nef<mut>/E6<OD >o Nef<mut>/E7<OD>. Come controllo, i topi sono stati inoculati con il vettore vuoto (Nil). Al momento del sacrificio, 2,5 ?10<5 >splenociti sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati), specifici per E6 o E7 in micropozzetti EliSpot di IFN-? in triplicato. Il numero di SFU (Spot-forming Unit) di IFN-?/pozzetto ? mostrato in valori medi dei triplicati. Vengono inoltre riportati i valori medi infragruppo.
[0067] Le Figure 17A, 17B e 17C mostrano l'accumulo intracellulare di IFN-?, IL-2 e TNF-? in cellule T CD8<+ >da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati, con la Figura 17A che mostra l'accumulo intracellulare di IFN-? nelle cellule T CD8<+>, la Figura 17B che mostra l'accumulo intracellulare di IL-2 nelle cellule T CD8<+>, e la Figura 17C che mostra l'accumulo intracellulare di TNF-? nelle cellule T CD8<+>. Gli splenociti crioconservati sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati), specifici per E6 o E7 in presenza di Brefeldina A, e quindi analizzati mediante ICS. Vengono riportate le percentuali assolute di cellule T CD8<+ >positive all'interno delle cellule T CD8<+ >totali per ogni citochina, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. Negli istogrammi, ogni barra rappresenta un singolo animale.
[0068] Le Figure 18A, 18B e 18C mostrano valori medi infragruppo SD delle percentuali di accumulo intracellulare di IFN-?, IL-2 e TNF-? in cellule T CD8<+ >da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati, con la Figura 18A che mostra l'accumulo intracellulare di IFN-? nelle cellule T CD8<+>, la Figura 18B che mostra l'accumulo intracellulare di IL-2 nelle cellule T CD8<+>, e la Figura 18C che mostra l'accumulo intracellulare di TNF-? nelle cellule T CD8<+>. Sono mostrati i valori medi SD delle percentuali assolute delle cellule T CD8<+ >positive da colture trattate con peptidi specifici, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. Negli istogrammi, ogni barra rappresenta un gruppo di animali.
[0069] Le Figure 19A e 19B mostrano l'accumulo intracellulare di IFN-?, IL-2 e TNF-? in cellule T CD8<+ >all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati come determinato mediante rilevamento di sottopopolazioni di cellule T CD8<+ >positive a una, due o tre citochine, con la Figura 19A che mostra i risultati di ciascun topo iniettato con Nef<mut>/E7<OD >o E7<OD >e la Figura 19B che mostra i risultati di ciascun topo iniettato con Nef<mut>/E6<OD >o E6<OD>. Gli splenociti crioconservati sono stati incubati per una notte con 5 ?g/ml di peptidi non correlati (non mostrati), specifici per E6 o E7 in presenza di Brefeldina A, e quindi analizzati mediante ICS. Sono mostrate percentuali sia assolute che relative di cellule T CD8<+ >positive all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture trattate con peptidi specifici, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. N.D.: i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato erano ? di quelli delle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide E6. I valori rilevati di splenociti da topi a cui era stato iniettato il vettore di controllo sono stati inferiori alla soglia di sensibilit? del saggio (non mostrata). I dati sperimentali su cui si basa l'analisi sono uguali a quelli delle Figure 17A, 17B e 17C.
[0070] La Figura 20 mostra percentuali medie infragruppo di cellule T CD8<+ >positive a IFN-?, IL-2 e TNF-? all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture di splenociti isolati da ciascun topo iniettato (i.m.+EP) con i vettori di DNA indicati come determinato dal rilevamento di sottopopolazioni di cellule T CD8<+ >positive a una, due o tre citochine. Sono mostrate percentuali medie sia assolute che relative di cellule T CD8<+ >positive all'interno delle cellule T CD8<+ >totali da colture trattate con peptidi specifici, sottratti i valori rilevati nelle cellule T CD8<+ >da colture trattate con peptide non correlato. I valori rilevati di splenociti da topi a cui era stato iniettato il vettore di controllo sono stati inferiori alla soglia di sensibilit? del saggio (non mostrata).
[0071] La Figura 21 mostra i risultati del saggio CTL condotto con cellule T CD8<+ >isolate da topi inoculati (i.m.+EP) con i vettori indicati. Sono mostrati i valori medi dei duplicati, calcolati dopo la sottrazione dei valori ottenuti da co-colture con cellule T CD8<+ >isolate da topi a cui ? stato iniettato il vettore vuoto. I dati sperimentali su cui si basa l'analisi sono uguali a quelli delle Figure 18A, 18B e 18C.
[0072] La Figura 22 mostra l'immunit? delle cellule T CD8<+ >specifica per E6 ed E7 di HPV16 indotta in topi portatori di tumore co-iniettati con i vettori di DNA indicati. Dei topi C57BL/6 sono stati iniettati per via s.c. con 2?10<5 >cellule TC-1, e poi inoculati (i.m.+EP) con 10 ?g di entrambi i vettori di DNA che esprimono E6<OD >e E7<OD>, o da soli o fusi con Nef<mut>. Le PBMC sono state isolate a seguito di sanguinamento retro-orbitale, e poi incubate per una notte con 5 ?g/ml di nonameri non correlati (non mostrati), o specifici per E6 e E7 in micropozzetti EliSpot di IFN-? in triplicato. Il numero di SFU (Spot-forming Unit) di IFN-? /10<5 >PBMC ? mostrato in valori medi dei triplicati. A destra, i valori SFU sono associati ad ogni topo. Vengono inoltre riportati i valori infragruppo medi ? SD.
[0073] Le Figure 23A, 23B, 23C, 23D, 23E, e 23F mostrano l'effetto terapeutico anti-tumorale indotto dall'inoculazione (i.m.+EP) di vettori di DNA indicati, con la Figura 23A che mostra i dati cumulativi ? SE misurati fino ai sacrifici dei topi che sviluppano tumori tardivi, la Figura 23B mostrando i dati da ciascun topo inoculato con vettore vuoto, la Figura 23C che mostra i dati da ciascun topo inoculato con Nef<mut>, la Figura 23D che mostra i dati di ciascun topo inoculato con E6<OD >e E7<OD>, la Figura 23E che mostra i dati di ciascun topo inoculato con Nef<mut>/E6<OD >e Nef<mut>/E7<OD>, e la Figura 23F che mostra la curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier. Dei topi C57BL/6 (12 per gruppo) sono stati sottoposti a infezione sperimentale con 2?10<5 >cellule TC-1 e, il giorno dopo la comparsa del tumore, ovvero quando le masse tumorali sono diventate rilevabili mediante palpazione, sono stati co-inoculati con vettori di DNA che esprimono Nef<mut>/E6<OD >e Nef<mut>/E7<OD>, E6<OD >ed E7<OD>, o, come controllo, con Nef<mut >o con vettore vuoto. Le inoculazioni di DNA sono state ripetute al giorno 17 dopo l'impianto delle cellule tumorali, e la crescita della massa tumorale ? stata seguita nel tempo. Le dimensioni del tumore sono state misurate ogni 2-3 giorni durante il tempo di osservazione. La scala dell'asse X indica i giorni di monitoraggio del tumore, nonch? i tempi di impianto tumorale, immunizzazione e sanguinamento.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
Definizioni
[0074] A meno che non venga definito diversamente, tutti i termini tecnici e scientifici usati in questa sede hanno il significato comunemente inteso da una persona di esperienza ordinaria nel ramo al quale appartiene l'invenzione.
[0075] Nel presente contesto, "Fattore di regolazione negativa", "Fattore negativo" o "Nef" indicano una piccola proteina miristoilata di 27-35 kDa codificata da lentivirus di primati, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV-1 e HIV-2) e il virus dell'immunodeficienza simiana (SIV). HIV-1 Nef ? una proteina di impalcatura/adattatrice da 27 kDa che svolge un ruolo importante nella replicazione virale e nella patogenesi. Il Nef mutante (qui indicato come "Nef<mut>") ? caratterizzato da tre sostituzioni aminoacidiche: una sostituzione dalla glicina (G) alla cisteina (C) in corrispondenza della posizione 3, una sostituzione dalla valina (V) alla leucina (L) in corrispondenza della posizione 153, e una sostituzione dal glutammato (E) alla glicina (G) in corrispondenza della posizione 177. La proteina Nef<mut >? descritta in Lattanzi L. et al., 2012, Vaccine, 30: 7229-7237 e WO 2018/069947, ognuno dei quali ? qui incluso nella sua interezza a titolo di rimando. La sequenza di amminoacidi di Nef<mut >? descritta di seguito (SEQ ID N?: 1) con le sostituzioni aminoacidiche rispetto alla Nef di tipo selvatico sottolineate e in grassetto.
MGCKWSKSSVVGWPAVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNADCAWLEAQEE
EEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQN
YTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPEKLEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPGREVLEWRFDSRL
AFHHVARELHPEYFKNC (SEQ ID N?: 1)
[0076] Nel presente contesto, il termine "vescicola extracellulare (EV)" indica una vescicola derivata da cellule comprendente una membrana che racchiude uno spazio interno. Le vescicole extracellulari comprendono tutte le vescicole legate alla membrana che hanno un diametro inferiore rispetto alla cellula da cui derivano. Generalmente, le vescicole extracellulari possono comprendere vari carichi macromolecolari o all'interno dello spazio interno, visualizzati sulla superficie esterna della vescicola extracellulare, e/o che attraversano la membrana. Il carico pu? comprendere acidi nucleici, proteine, carboidrati, lipidi, piccole molecole e/o loro combinazioni. A titolo d'esempio e senza limitazioni, le vescicole extracellulari includono corpi apoptotici, microvescicole, esosomi e nanovescicole. Le vescicole extracellulari possono essere derivate da un organismo vivente o morto, da tessuti o organi espiantati e/o da cellule coltivate. Le vescicole extracellulari possono essere ingegnerizzate in vivo o in vitro per inserirvi degli antigeni.
[0077] Nel presente contesto, il termine "esosoma" indica una vescicola extracellulare di diametro compreso tra 30 e 150 nm, tipicamente di diametro compreso tra 50 e 100 nm, comprendente una membrana che racchiude uno spazio interno, e che ? generata dalla cellula mediante gemmazione verso l'interno di endosomi tardivi e rilascio dalla cellula mediante fusione di corpi multivescicolari (MVB) con la membrana plasmatica. L'esosoma pu? essere derivato da una cellula produttrice, e isolato dalla cellula produttrice in base a dimensioni, densit?, parametri biochimici, o una loro combinazione, della stessa. Gli esosomi possono essere ingegnerizzati in vivo o in vitro per inserirvi degli antigeni.
[0078] Usato nel presente contesto, il termine "nanovescicola" indica una vescicola extracellulare di diametro compreso tra 20-250 nm, tipicamente di diametro tra 30 e 150 nm, comprendente una membrana che racchiude uno spazio interno, e che viene generata dalla cellula mediante manipolazione diretta o indiretta in modo tale che la nanovescicola non venga prodotta dalla cellula produttrice senza la manipolazione. Manipolazioni appropriate della cellula produttrice comprendono, ma non sono limitate a, estrusione in serie, trattamento con soluzioni alcaline, sonicazione o loro combinazioni. La produzione di nanovescicole pu?, in alcuni casi, comportare la distruzione della cellula produttrice. La nanovescicola, una volta derivata da una cellula produttrice secondo la manipolazione, pu? essere isolata dalla cellula produttrice in base a dimensioni, densit?, parametri biochimici, o una loro combinazione, della stessa. Le nanovescicole possono essere ingegnerizzate in vivo o in vitro per inserirvi degli antigeni.
[0079] Nel presente contesto, il termine "nanoparticella" indica una particella ingegnerizzata di diametro compreso tra 1 e 500 nm, tipicamente di diametro compreso tra 1 e 100 nm. Le nanoparticelle possono essere generate da materiali biologici e/o chimici, come fosfolipidi, lipidi, acido lattico, destrano, chitosano, polimeri, carbonio, silice e metallo. Le applicazioni mediche di nanoparticelle ingegnerizzate includono la somministrazione di farmaci e la diagnostica in vivo o in vitro.
[0080] Per "identit?" in percentuale tra una sequenza polipeptidica e una sequenza di riferimento ? definita come la percentuale di residui di amminoacidi nella sequenza polipeptidica che sono identici ai residui di amminoacidi nella sequenza di riferimento, dopo aver allineato le sequenze e introdotto spazi, se necessario, per ottenere la massima percentuale di identit? di sequenza. L'allineamento volto a determinare l'identit? in percentuale della sequenza di amminoacidi pu? essere ottenuto in vari modi che fanno parte delle competenze nel ramo, ad esempio usando software informatici di dominio pubblico come BLAST, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN (DNASTAR), CLUSTALW, CLUSTAL OMEGA o il software MUSCLE. Gli esperti nel ramo possono determinare parametri appropriati per allineare le sequenze, incluso un qualsiasi algoritmo necessario per ottenere un allineamento massimale sull'intera lunghezza delle sequenze che vengono comparate. Se non diversamente specificato, le identit? in percentuale nel presente contesto sono determinate utilizzando BLAST con parametri di default NCBI.
[0081] Per "soggetto" si intende un mammifero umano o non umano, tra cui, ma senza limitazioni, soggetti bovini, equini, canini, ovini, felini e roditori, tra cui murini e rattus. Un "paziente" ? un soggetto umano.
1.1. Proteina di fusione
[0082] In un primo aspetto, viene fornita in questa sede una proteina di fusione. La proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno.
[0083] In alcune forme di realizzazione, l'N-terminale del dominio polipeptidico di antigene immunogeno viene direttamente fuso al C-terminale del dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico. In alcune altre forme di realizzazione, l'N-terminale del dominio polipeptidico di antigene immunogeno viene fuso al C-terminale del dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico attraverso un linker peptidico.
1.1.1. Dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico
[0084] In varie forme di realizzazione, la proteina di fusione descritta in questa sede comprende un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico.
[0085] In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >(SEQ ID N?: 1). In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ha il 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o il 99% di identit? di sequenza con la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 1, in cui i residui di amminoacidi in posizione 3, posizione 153 e posizione 177 di SEQ ID N?: 1 sono mantenuti.
[0086] In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >tronca. In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ha una sequenza di amminoacidi selezionata tra le SEQ ID N?: 2 - 30. In alcune forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ha il 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o il 99% di identit? di sequenza rispetto a una sequenza di amminoacidi selezionata tra le SEQ ID N?: 2 ? 30, in cui i residui di amminoacidi in posizione 3, posizione 153, e posizione 177 delle SEQ ID N?: 2 ? 30 sono mantenuti. In certe forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 30. In certe forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ha il 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o il 99% di identit? di sequenza con la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 30, in cui i residui di amminoacidi in posizione 3, posizione 153 e posizione 177 di SEQ ID N?: 30 sono mantenuti. La proteina Nef<mut >tronca avente la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 30 ? qui indicata come Nef<mut>PL. Le sequenze di amminoacidi di varie proteine Nef<mut >tronche sono mostrate nella Tabella 1 sottostante.
[0087] In certe forme di realizzazione, la proteina Nef<mut >a lunghezza intera ? codificata dal polinucleotide avente la sequenza di acido nucleico SEQ ID N?: 31.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCA
ATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAG
GAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCT
GTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGA
AGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAAC
TACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCA
GTTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTG
AGCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTA
GCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGA (SEQ ID
N?: 31)
[0088] In certe forme di realizzazione, la proteina Nef<mut>PL tronca ? codificata dal polinucleotide avente la sequenza di acido nucleico SEQ ID N?: 32.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCA
ATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAG
GAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCT
GTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGA
AGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAAC
TACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCA
GTTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTG
AGCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGG (SEQ ID N?: 32)
1.1.2. Dominio polipeptidico di antigene immunogeno
[0089] In varie forme di realizzazione, la proteina di fusione descritta in questa sede comprende un dominio polipeptidico di antigene immunogeno.
[0090] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene virale, un antigene batterico, un antigene fungino, un antigene parassitario o un antigene tumorale.
[0091] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? una proteina a lunghezza intera. In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un frammento di proteina. In certe forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un frammento N-terminale. In certe forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un frammento C-terminale.
[0092] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno viene detossificato per spezzare il legame con le proteine delle cellule ospiti.
1.1.2.1. Antigene virale
[0093] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene virale. In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? una proteina strutturale virale, come una proteina capsidica, una proteina di involucro o una proteina di membrana. In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? una proteina virale non strutturale, come un enzima virale.
[0094] In varie forme di realizzazione, l'antigene virale ? selezionato dal gruppo costituito da: un antigene del papillomavirus umano (HPV), un antigene del virus dell'immunodeficienza umana (HIV), un antigene del virus dell'epatite B (HBV), un antigene del virus dell'epatite C (HCV), un antigene del virus Ebola, un antigene del virus del Nilo occidentale, un antigene del virus Congo-Crimea, un antigene del virus dengue, e un antigene del virus dell'influenza.
[0095] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del papillomavirus umano (HPV). In certe forme di realizzazione, l'antigene di HPV ? E6 o E7 del papillomavirus umano.
[0096] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dell'immunodeficienza umana (HIV). In certe forme di realizzazione, l'antigene di HIV ? Gag o Tat del virus dell'immunodeficienza umana.
[0097] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dell'epatite B (HBV). In certe forme di realizzazione, l'antigene di HBV ? Core del virus dell'epatite B.
[0098] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dell'epatite C (HCV). In certe forme di realizzazione, l'antigene di HCV ? Core, NS3, E1 o E2 del virus dell'epatite C.
[0099] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus Ebola. In certe forme di realizzazione, l'antigene del virus Ebola ? VP24, VP40, NP o GP del virus Ebola.
[00100] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus del Nilo occidentale. In certe forme di realizzazione, l'antigene del virus del Nilo occidentale ? NS3 del virus del Nilo occidentale.
[00101] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus Congo-Crimea. In certe forme di realizzazione, l'antigene del virus Congo-Crimea ? GP o NP del virus Congo-Crimea.
[00102] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dengue.
[00103] In certe forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del virus dell'influenza. In varie forme di realizzazione, il virus influenzale viene selezionato dal gruppo costituito da: virus parainfluenzale 1, virus parainfluenzale 2, virus dell'influenza A e virus dell'influenza B. In certe forme di realizzazione, il virus influenzale ? il virus dell'influenza A. In forme di realizzazione particolari, l'antigene virale ? la nucleoproteina (NP) o la proteina di matrice (M1) del virus dell'influenza A.
1.1.2.1.1. Antigene di HPV
[00104] In alcune forme di realizzazione, l'antigene virale ? un antigene del papillomavirus umano (HPV). In varie forme di realizzazione, l'HPV ? selezionato tra HPV16, HPV18, HPV6 o HPV11. In alcune forme di realizzazione, l'HPV ? HPV16 o HPV18. In certe forme di realizzazione, l'HPV ? HPV16. In certe forme di realizzazione, l'HPV ? HPV18. In alcune forme di realizzazione, l'antigene di HPV ? una proteina strutturale, come una proteina capsidica. In alcune altre forme di realizzazione, l'antigene di HPV ? una proteina non strutturale. In alcune forme di realizzazione, l'antigene di HPV viene selezionato dal gruppo costituito da L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6 ed E7 del papillomavirus umano. In certe forme di realizzazione, l'antigene di HPV ? E6 o E7 del papillomavirus umano. In alcune di queste forme di realizzazione, l'antigene di HPV viene detossificato per spezzare il legame con le proteine delle cellule ospiti. In certe forme di realizzazione, l'antigene di HPV viene detossificato per rimuovere un sito di legame di p53. In certe forme di realizzazione, l'antigene di HPV viene detossificato per rimuovere un sito di legame della proteina del retinoblastoma (pRB).
[00105] In alcune forme di realizzazione, l'antigene di HPV viene selezionato dal gruppo costituito da L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6 ed E7 di HPV16. In certe forme di realizzazione, l'antigene di HPV ? E6 o E7 di HPV16.
[00106] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? E6 di HPV16. In certe forme di realizzazione, la cornice di lettura aperta (ORF) di E6 viene detossificata. In forme di realizzazione particolari, la sequenza di amminoacidi di E6 detossificato di HPV16 ? la SEQ ID N?: 33.
MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRD
GSPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHL
DKKQRFHNIRVRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL (SEQ ID N?: 33)
In certe forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E6 detossificato di HPV16 (E6<DETOX>) ? la SEQ ID N?: 34.
ATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAG
TTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAA
CAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGAT
GGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGA
CATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGAT
TTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTG
GACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGTGCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGC
AGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA (SEQ ID N?: 34)
In certe forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E6 detossificato di HPV16 ? ottimizzata con codoni. In forme di realizzazione specifiche, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E6 di HPV16 detossificato e ottimizzato con codone (E6<OD>) ? la SEQ ID N?: 35.
ATGCACCAGAAGCGCACCGCCATGTTCCAGGACCCCCAGGAGCGCCCCCGCAAGCTGCCCCAG
CTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAGTGCGTGTACTGCAAGCAG
CAGCTGCTGCGCCGCGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGCGACCTGTGCATCGTGTACCGCGAC
GGCAGCCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACTCCAAGATCAGCGAGTACCGC
CACTACTGCTACAGCCTGTACGGCACCACCCTGGAGCAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGAC
CTGCTGATCCGCTGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTGTGCCCCGAGGAGAAGCAGCGCCACCTG
GACAAGAAGCAGCGCTTCCACAACATCCGGGTGCGGTGGACCGGGCGCTGCATGAGCTGCTGC
CGCAGCAGCCGCACCCGCCGCGAGACCCAGCTGTAA (SEQ ID N?: 35)
[00107] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? E7 di HPV16. In certe forme di realizzazione, la cornice di lettura aperta (ORF) di E7 viene detossificata. In forme di realizzazione particolari, la sequenza di amminoacidi di E7 di HPV16 detossificato ? la SEQ ID N?: 36.
MHGDTPTLHEYMLDLQPETTGLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDS
TLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ ID N?: 36)
In certe forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E7 detossificato di HPV16 (E7<DETOX>) ? la SEQ ID N?: 37.
ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGGC
CTCTACGGCTATGGCCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCT
GGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCT
ACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATG
GGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA (SEQ ID N?: 37)
[00108] In certe forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E7 di HPV16 detossificato ? ottimizzata con codoni. In forme di realizzazione specifiche, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E7 di HPV16 ottimizzato con codone e detossificato (E7<OD>) ? la SEQ ID N?: 38.
ATGCACGGCGACACCCCCACCTTGCACGAGTACATGTTGGACTTGCAGCCCGAGACCACCGGC
CTGTACGGCTACGGCCAGTTGAACGACAGCTCCGAGGAGGAGGACGAGATCGACGGCCCCGCC
GGCCAGGCCGAGCCCGACCGCGCCCACTACAACATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACTCC
ACCCTGCGCCTGTGCGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCCGCACCTTGGAGGACCTGCTGATG
GGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCTGCAGCCAGAAGCCCTAA (SEQ ID N?: 38)
[00109] In certe forme di realizzazione, la proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, una proteina Nef<mut >e un E6 di HPV16 detossificato. In alcune forme di realizzazione, il C-terminale della proteina Nef<mut >e l'N-terminale dell'E6 di HPV16 detossificato sono fusi direttamente senza un linker. In forme di realizzazione particolari, la proteina di fusione ha la sequenza di amminoacidi della SEQ ID N?: 39.
MGCKWSKSSVVGWPAVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNADCAWLEAQEE
EEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQN
YTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPEKLEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPGREVLEWRFDSRL
AFHHVARELHPEYFKNCGPGPHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQ
LLRREVYDFAFRDLCIVYRDGSPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDL
LIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRVRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL (SEQ ID
N?: 39)
In certe forme di realizzazione, l'acido nucleico che codifica la proteina di fusione (Nef<mut>/E6<DETOX>) ? la SEQ ID N?: 40.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCA
ATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAG
GAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCT
GTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGA
AGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAAC
TACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCA
GTTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTG
AGCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTA
GCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCGGACCTGGGCCC
CACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTA
TGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAG
TTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGG
AATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACAT
TATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTG
TTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGAC
AAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGTGCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGA
TCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA (SEQ ID N?: 40)
In certe forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E6 di HPV16 detossificato della proteina di fusione ? ottimizzata con codone. In forme di realizzazione specifiche, la sequenza di acido nucleico che codifica la proteina di fusione (Nef<mut>/E6<OD>) ? la SEQ ID N?: 41.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCA
ATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAG
GAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCT
GTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGA
AGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAAC
TACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCA
GTTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTG
AGCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTA
GCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCGGACCTGGGCCC
CACCAGAAGCGCACCGCCATGTTCCAGGACCCCCAGGAGCGCCCCCGCAAGCTGCCCCAGCTG
TGCACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAGTGCGTGTACTGCAAGCAGCAG
CTGCTGCGCCGCGAGGTGTACGACTTCGCCTTCCGCGACCTGTGCATCGTGTACCGCGACGGC
AGCCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACTCCAAGATCAGCGAGTACCGCCAC
TACTGCTACAGCCTGTACGGCACCACCCTGGAGCAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTG
CTGATCCGCTGCATCAACTGCCAGAAGCCCCTGTGCCCCGAGGAGAAGCAGCGCCACCTGGAC
AAGAAGCAGCGCTTCCACAACATCCGGGTGCGGTGGACCGGGCGCTGCATGAGCTGCTGCCGC
AGCAGCCGCACCCGCCGCGAGACCCAGCTGTAA (SEQ ID N?: 41)
[00110] In certe forme di realizzazione, la proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, una proteina Nef<mut >e un E7 di HPV16 detossificato. In alcune forme di realizzazione, il C-terminale della proteina Nef<mut >e l'N-terminale dell'E7 detossificato di HPV16 sono fusi direttamente senza un linker. In forme di realizzazione particolari, la proteina di fusione ha la sequenza di amminoacidi della SEQ ID N?: 42.
MGCKWSKSSVVGWPAVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNADCAWLEAQEE
EEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQN
YTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPEKLEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPGREVLEWRFDSRL
AFHHVARELHPEYFKNCGPGPHGDTPTLHEYMLDLQPETTGLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAG
QAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ ID
N?: 42)
In certe forme di realizzazione, l'acido nucleico che codifica la proteina di fusione (Nef<mut>/E7<DETOX>) ? la SEQ ID N?: 43.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCA
ATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAG
GAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCT
GTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGA
AGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAAC
TACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCA
GTTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTG
AGCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTA
GCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCGGACCTGGGCCC
CATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGGCCTC
TACGGCTATGGCCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGA
CAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACG
CTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGC
ACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA (SEQ ID N?: 43)
In certe forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E7 di HPV16 detossificato della proteina di fusione ? ottimizzata con codone. In forme di realizzazione specifiche, la sequenza di acido nucleico che codifica la proteina di fusione (Nef<mut>/E7<OD>) ? la SEQ ID N?: 44.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCAA
TCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGG
AGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTG
TAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAA
GACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACT
ACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAG
TTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGA
GCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAG
CATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCGGACCTGGGCCCC
ACGGCGACACCCCCACCTTGCACGAGTACATGTTGGACTTGCAGCCCGAGACCACCGGCCTGT
ACGGCTACGGCCAGTTGAACGACAGCTCCGAGGAGGAGGACGAGATCGACGGCCCCGCCGGCC
AGGCCGAGCCCGACCGCGCCCACTACAACATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACTCCACCC
TGCGCCTGTGCGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCCGCACCTTGGAGGACCTGCTGATGGGCA
CCCTGGGCATCGTGTGCCCCATCTGCAGCCAGAAGCCCTAA (SEQ ID N?: 44)
[00111] In certe forme di realizzazione, la proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, una proteina Nef<mut >tronca e un E6 di HPV16 detossificato. In alcune forme di realizzazione, il C-terminale della proteina Nef<mut >tronca e l'N-terminale dell'E6 di HPV16 detossificato sono fusi direttamente senza un linker. In certe forme di realizzazione, la proteina di Nef<mut >tronca ? Nef<mut>PL. In forme di realizzazione particolari, la proteina di fusione ha la sequenza di amminoacidi della SEQ ID N?: 45.
MGCKWSKSSVVGWPAVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNADCAWLEAQEE
EEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQN
YTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPEKLEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPGGPGPHQKRTAMF
QDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGSPYAVCDK
CLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNI
RVRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL (SEQ ID N?: 45)
In certe forme di realizzazione, l'acido nucleico che codifica la proteina di fusione (Nef<mut>PL/E6<DETOX>) ? la SEQ ID N?: 46.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCA
ATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAG
GAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCT
GTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGA
AGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAAC
TACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCA
GTTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTG
AGCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGGGGACCTGGGCCCCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTT
CAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATA
CATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGAC
TTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAA
TGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACA
ACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAA
AAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATA
AGGGTGCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACC
CAGCTGTAA (SEQ ID N?: 46)
In certe forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E6 di HPV16 detossificato della proteina di fusione ? ottimizzata con codone. In forme di realizzazione specifiche, la sequenza di acido nucleico che codifica la proteina di fusione (Nef<mut>PL/E6<OD>) ? la SEQ ID N?: 47.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCA
ATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAG
GAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCT
GTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGA
AGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAAC
TACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCA
GTTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTG
AGCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGGGGACCTGGGCCCCACCAGAAGCGCACCGCCATGTTC
CAGGACCCCCAGGAGCGCCCCCGCAAGCTGCCCCAGCTGTGCACCGAGCTGCAGACCACCATC
CACGACATCATCCTGGAGTGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTGCTGCGCCGCGAGGTGTACGAC
TTCGCCTTCCGCGACCTGTGCATCGTGTACCGCGACGGCAGCCCCTACGCCGTGTGCGACAAG
TGCCTGAAGTTCTACTCCAAGATCAGCGAGTACCGCCACTACTGCTACAGCCTGTACGGCACC
ACCCTGGAGCAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCCGCTGCATCAACTGCCAG
AAGCCCCTGTGCCCCGAGGAGAAGCAGCGCCACCTGGACAAGAAGCAGCGCTTCCACAACATC
CGGGTGCGGTGGACCGGGCGCTGCATGAGCTGCTGCCGCAGCAGCCGCACCCGCCGCGAGACC
CAGCTGTAA (SEQ ID N?: 47)
[00112] In certe forme di realizzazione, la proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, una proteina Nef<mut >tronca e un E7 di HPV16 detossificato. In alcune forme di realizzazione, il C-terminale della proteina tronca Nef<mut >e l'N-terminale dell'E7 di HPV16 disintossicato vengono fusi direttamente senza un linker. In certe forme di realizzazione, la proteina Nef<mut >tronca ? Nef<mut>PL. In forme di realizzazione particolari, la proteina di fusione ha la sequenza di amminoacidi della SEQ ID N?: 48.
MGCKWSKSSVVGWPAVRERMRRAEPAADGVGAASRDLEKHGAITSSNTAATNADCAWLEAQEE
EEVGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGYFPDWQN
YTPGPGVRYPLTFGWCYKLVPVEPEKLEEANKGENTSLLHPVSLHGMDDPGGPGPHGDTPTLH
EYMLDLQPETTGLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQST
HVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP (SEQ ID N?: 48)
In certe forme di realizzazione, l'acido nucleico che codifica la proteina di fusione (Nef<mut>PL/E7<DETOX>) ? la SEQ ID N?: 49.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCA
ATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAG
GAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCT
GTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGA
AGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAAC
TACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCA
GTTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTG
AGCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGGGGACCTGGGCCCCATGGAGATACACCTACATTGCAT
GAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGGCCTCTACGGCTATGGCCAATTAAATGAC
AGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCAT
TACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACA
CACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATC
TGTTCTCAGAAACCATAA (SEQ ID N?: 49)
In certe forme di realizzazione, la sequenza di acido nucleico che codifica l'E7 di HPV16 detossificato della proteina di fusione ? ottimizzata con codone. In forme di realizzazione specifiche, la sequenza di acido nucleico che codifica la proteina di fusione (Nef<mut>PL/E7<OD>) ? la SEQ ID N?: 50.
ATGGGTTGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGGTTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGA
CGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGCATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCA
ATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAG
GAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCT
GTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGA
AGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAAC
TACACACCAGGACCAGGGGTTAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCA
GTTGAGCCAGAGAAGTTAGAAGAAGCCAACAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTG
AGCCTGCATGGAATGGATGACCCGGGGGGACCTGGGCCCCACGGCGACACCCCCACCTTGCAC
GAGTACATGTTGGACTTGCAGCCCGAGACCACCGGCCTGTACGGCTACGGCCAGTTGAACGAC
AGCTCCGAGGAGGAGGACGAGATCGACGGCCCCGCCGGCCAGGCCGAGCCCGACCGCGCCCAC
TACAACATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACTCCACCCTGCGCCTGTGCGTGCAGAGCACC
CACGTGGACATCCGCACCTTGGAGGACCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCCATC
TGCAGCCAGAAGCCCTAA (SEQ ID N?: 50)
1.1.2.2.Antigene batterico
[00113] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene batterico.
[00114] In alcune forme di realizzazione, l'antigene batterico ? un antigene di Mycobacterium tuberculosis.
1.1.2.3.Antigene parassitario
[00115] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene parassitario.
[00116] In alcune forme di realizzazione, l'antigene parassitario ? un antigene di Plasmodium. In varie forme di realizzazione, l'antigene parassitario ? selezionato dal gruppo costituito da: Antigene di Plasmodium falciparum, antigene di Plasmodium vivax, antigene di Plasmodium ovale, antigene di Plasmodium malariae e antigene di Plasmodium knowlesi.
1.1.2.4. Antigene tumorale
[00117] In alcune forme di realizzazione, l'antigene immunogeno ? un antigene tumorale.
[00118] In certe forme di realizzazione, l'antigene tumorale ? un antigene tumorale specifico. In certe forme di realizzazione, l'antigene tumorale deriva da una proteina che viene espressa solo su cellule tumorali. In certe forme di realizzazione, l'antigene tumorale ? un neoantigene tumorale specifico.
[00119] In certe forme di realizzazione, l'antigene tumorale ? un antigene associato a un tumore. In certe forme di realizzazione, l'antigene tumorale deriva da una proteina sovraespressa su cellule tumorali.
1.1.3. Linker peptidico
[00120] In varie forme di realizzazione, la proteina di fusione descritta in questa sede comprende inoltre un linker tra il dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e il dominio polipeptidico di antigene immunogeno.
[00121] In alcune forme di realizzazione, il linker aumenta la stabilit? della proteina di fusione. In alcune forme di realizzazione, il linker aumenta la bioattivit? della proteina di fusione. In alcune forme di realizzazione, il linker facilita l'espressione della proteina di fusione.
[00122] Nelle forme di realizzazione tipiche, il legame ? un linker peptidico. In certe forme di realizzazione, il linker peptidico deriva da una proteina multidominio presente in natura. In certe forme di realizzazione, il linker peptidico ? un linker empirico progettato per scopi specifici, per esempio per migliorare la stabilit? strutturale, potenziare la bioattivit?, aumentare il livello di espressione, alterare i profili PK, e consentire il targeting in vivo della proteina di fusione.
1.1.4. Polinucleotidi
[00123] In un altro aspetto, vengono forniti in questa sede dei polinucleotidi che codificano la proteina di fusione. In alcune forme di realizzazione, il polinucleotide ? DNA. In alcune forme di realizzazione, il polinucleotide ? RNA.
[00124] In alcune forme di realizzazione, il polinucleotide ? una molecola di DNA che codifica una proteina di fusione, in cui la proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno. In certe forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut>. In certe forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >tronca. In varie forme di realizzazione, la molecola di DNA ? ottimizzata con codoni.
[00125] In alcune forme di realizzazione, il polinucleotide ? una molecola di RNA che codifica una proteina di fusione, in cui la proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno. In certe forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut>. In certe forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >tronca. In varie forme di realizzazione, la molecola di RNA ? ottimizzata con codoni.
1.1.5. Vettore
[00126] In un altro aspetto, vengono forniti in questa sede dei vettori che esprimono la proteina di fusione. In varie forme di realizzazione, il vettore comprende almeno un polinucleotide, in cui il polinucleotide codifica la proteina di fusione. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore plasmidico. In certe forme di realizzazione, il vettore plasmidico ? un vettore pVAX1 (Invitrogen). In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore virale.
[00127] In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore di DNA che esprime una proteina di fusione, in cui la proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno. In alcune forme di realizzazione, il vettore ? un vettore di RNA che esprime una proteina di fusione, in cui la proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno.
[00128] In alcune forme di realizzazione, il vettore comprende inoltre uno o pi? dei componenti selezionati da: una sequenza segnale, un'origine di replicazione, uno o pi? geni marcatori, un elemento potenziatore, un promotore, e una sequenza di terminazione della trascrizione. In alcune forme di realizzazione, il vettore comprende inoltre un elemento di regolazione post-trascrizionale, come un elemento di regolazione post-trascrizionale del virus dell'epatite woodchuck (WPRE).
[00129] In alcune forme di realizzazione, il vettore esprime una pluralit? di antigeni immunogeni, come due, tre, quattro o cinque antigeni immunogeni. In alcune forme di realizzazione, il vettore esprime una pluralit? di proteine di fusione, in cui ciascuna proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno. In alcune forme di realizzazione, il vettore esprime due, tre, quattro o cinque proteine di fusione, in cui ciascuna proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno.
1.1.6. Vescicola extracellulare
[00130] In un altro aspetto, in questa sede sono fornite vescicole extracellulari comprendenti la proteina di fusione, il polinucleotide che codifica la proteina di fusione o il vettore che esprime la proteina di fusione.
[00131] In alcune forme di realizzazione, la vescicola extracellulare ? un esosoma. In alcune forme di realizzazione, la vescicola extracellulare ? una nanovescicola.
[00132] In alcune forme di realizzazione, la vescicola extracellulare comprende una proteina di fusione, in cui la proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno. In certe forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut>. In certe forme di realizzazione, il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >tronca. In alcune forme di realizzazione, la proteina Nef<mut >o la proteina Nef<mut >tronca ? ancorata nella membrana della vescicola extracellulare, e l'antigene immunogeno viene visualizzato sulla superficie della vescicola extracellulare.
[00133] In alcune forme di realizzazione, la vescicola extracellulare comprende la proteina di fusione, il polinucleotide che codifica la proteina di fusione o il vettore che esprime la proteina di fusione nello spazio interno della vescicola extracellulare.
1.1.7. Nanoparticelle
[00134] In un altro aspetto, sono fornite in questa sede delle nanoparticelle comprendenti la proteina di fusione, il polinucleotide che codifica la proteina di fusione o il vettore che esprime la proteina di fusione.
1.2. Composizioni farmaceutiche
[00135] In un altro aspetto, sono fornite in questa sede delle composizioni farmaceutiche comprendenti la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare o la nanoparticella, e un eccipiente farmaceuticamente accettabile.
[00136] ? possibile utilizzare qualsiasi eccipiente farmaceutico adatto, e una persona di competenza ordinaria nel ramo ? in grado di selezionare eccipienti farmaceutici adatti. Di conseguenza, gli eccipienti farmaceutici forniti in seguito hanno lo scopo di essere illustrativi e non limitativi. Gli eccipienti farmaceutici aggiuntivi includono, ad esempio, quelli descritti in Handbook of Pharmaceutical Excipients, 8th Revised Ed. (2017), integralmente incluso a titolo di rimando.
[00137] In alcune forme di realizzazione, la composizione farmaceutica comprende una pluralit? di proteine di fusione, per esempio due, tre, quattro, cinque, sei, sette, otto, nove o dieci proteine di fusione, in cui ciascuna proteina di fusione comprende, dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno. In alcune forme di realizzazione, la composizione farmaceutica comprende una pluralit? di polinucleotidi che codificano le proteine di fusione. In alcune forme di realizzazione, la composizione farmaceutica comprende una pluralit? di vettori che esprimono le proteine di fusione.
[00138] In alcune forme di realizzazione, le composizioni farmaceutiche sono formulate per la somministrazione in dosi singole o multiple.
1.2.1. Vie di somministrazione
[00139] Le vie di somministrazione adatte per le composizioni farmaceutiche descritte in questa sede includono, ma non sono limitate a, via enterale (ad esempio, per somministrazione orale), via parenterale (ad esempio, per iniezione o infusione sottocutanea, endovenosa, intranasale, intramuscolare, intradermica o intrasternale (ad esempio, sotto forma di soluzioni o sospensioni sterili iniettabili acquose o non acquose, ecc.) e per via topica (ad esempio, sotto forma di crema o pomata). In certe forme di realizzazione, le composizioni farmaceutiche sono formulate per una somministrazione parenterale. In certe forme di realizzazione, le composizioni farmaceutiche sono formulate per un'iniezione intramuscolare. In certe forme di realizzazione, le composizioni farmaceutiche sono formulate per un'iniezione endovenosa. In certe forme di realizzazione, le composizioni farmaceutiche sono formulate per un'iniezione sottocutanea. In certe forme di realizzazione, le composizioni farmaceutiche sono formulate per una somministrazione intranasale.
[00140] In alcune forme di realizzazione, la composizione farmaceutica comprendente un polipeptide che codifica la proteina di fusione ? formulata per un'iniezione intramuscolare. In alcune forme di realizzazione, la composizione farmaceutica comprendente un vettore che esprime la proteina di fusione ? formulata per un'iniezione intramuscolare. In alcune di queste forme di realizzazione, l'iniezione intramuscolare del polipeptide o del vettore ? seguita da elettroporazione. In alcune forme di realizzazione, l'elettroporazione comprende da sei a otto impulsi brevi (<100 ?s) ad alte intensit? di campo (1000-1300 V/cm). In alcune forme di realizzazione, l'elettroporazione comprende da sei a otto impulsi lunghi (10-20 ms) a basse intensit? di campo (200 V/cm). In alcune forme di realizzazione, l'elettroporazione comprende una combinazione di impulsi brevi ad alta tensione e impulsi lunghi a bassa tensione.
1.3. Metodi di prevenzione e trattamento
[00141] In un altro aspetto, in questa sede sono forniti metodi per trattare o prevenire una malattia o una condizione attraverso l'immunizzazione in un soggetto che ne ha bisogno. In questa sede sono forniti anche dei metodi per indurre una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) specifica per l'antigene e/o delle cellule T CD4<+ >specifica per l'antigene in un soggetto che ne ha bisogno. In alcune forme di realizzazione, il metodo induce una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) specifica per l'antigene in un soggetto che ne ha bisogno. In alcune forme di realizzazione, il metodo induce una risposta delle cellule T CD4<+ >specifica per l'antigene in un soggetto che ne ha bisogno. Il metodo comprende la somministrazione al soggetto di una quantit? efficace di proteina di fusione, polinucleotide, vettore, vescicola extracellulare, nanoparticella o composizione farmaceutica descritti in questa sede.
[00142] In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende la somministrazione al soggetto di un singolo antigene immunogeno. In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende la somministrazione al soggetto di una pluralit? di antigeni immunogeni, per esempio due, tre, quattro, cinque, sei, sette, otto, nove o dieci antigeni immunogeni. In certe forme di realizzazione, il metodo comprende la somministrazione al soggetto di una combinazione di due antigeni immunogeni. In certe forme di realizzazione, il metodo comprende la somministrazione al soggetto di una combinazione di tre antigeni immunogeni. In certe forme di realizzazione, il metodo comprende la somministrazione al soggetto di una combinazione di quattro antigeni immunogeni. In certe forme di realizzazione, il metodo comprende la somministrazione al soggetto di una combinazione di cinque antigeni immunogeni. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni immunogeni sono espressi dallo stesso vettore. In alcune forme di realizzazione ulteriori, gli antigeni immunogeni sono espressi da vettori diversi. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni immunogeni vengono somministrati al soggetto simultaneamente. In alcune forme di realizzazione ulteriori, gli antigeni immunogeni vengono somministrati al soggetto in sequenza.
[00143] In alcune forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un'infezione, e il soggetto ha o ? a rischio di infezione. L'infezione pu? essere causata da vari agenti infettivi come virus, batteri, funghi o parassiti. In certe forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un'infezione virale, e il soggetto ha o ? a rischio di un'infezione virale. In varie forme di realizzazione, l'infezione virale ? selezionata tra un'infezione da papillomavirus umano (HPV), un'infezione da virus dell'immunodeficienza umana (HIV), un'infezione da virus dell'epatite B (HBV), un'infezione da virus dell'epatite C (HCV), un'infezione da virus Ebola, un'infezione da virus del Nilo occidentale, un'infezione da virus Congo-Crimea, un'infezione da virus dengue e un'infezione da virus dell'influenza. In certe forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un'infezione batterica, e il soggetto ha o ? a rischio di infezione batterica. In alcune forme di realizzazione, l'infezione batterica ? un'infezione da Mycobacterium tuberculosis, e il soggetto ha o ? a rischio di tubercolosi (TB). In certe forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un'infezione parassitaria e il soggetto ha o ? a rischio di infezione parassitaria. In alcune forme di realizzazione, l'infezione parassitaria ? un'infezione da Plasmodium, e il soggetto ha o ? a rischio di malaria.
[00144] In alcune forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un cancro, e il soggetto ha o ? a rischio di cancro. In certe forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un cancro cervicale, e il soggetto ha o ? a rischio di cancro cervicale. In certe forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un cancro della testa e del collo, e il soggetto ha o ? a rischio di cancro della testa e del collo. In certe forme di realizzazione, la malattia o la condizione ? un cancro al fegato, e il soggetto ha o ? a rischio di cancro al fegato.
1.3.1. Infezione da HPV
[00145] In alcune forme di realizzazione, la malattia o condizione ? un'infezione da papillomavirus umano (HPV). In alcune forme di realizzazione, il metodo induce una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) e/o delle cellule T CD4<+ >specifica per l'antigene in un paziente affetto da infezione da HPV. In alcune forme di realizzazione, il metodo induce una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) e/o delle cellule T CD4<+ >specifica per l'antigene in un paziente che ? a rischio di infezione da HPV. In certe forme di realizzazione, il metodo induce una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) in un paziente affetto da infezione da HPV. In certe forme di realizzazione, il metodo induce una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) in un paziente che ? a rischio di infezione da HPV.
[00146] In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende la somministrazione, ad un paziente affetto da un'infezione da HPV, una quantit? efficace di proteina di fusione, polinucleotide, vettore, vescicola extracellulare, nanoparticella o composizione farmaceutica descritti in questa sede, in cui il dominio polipeptidico di antigene immunogeno ? un antigene immunogeno dal papillomavirus umano (HPV). In alcune forme di realizzazione, il metodo comprende la somministrazione, ad un paziente a rischio di infezione da HPV, di una quantit? efficace di proteina di fusione, polinucleotide, vettore, vescicola extracellulare, nanoparticella o composizione farmaceutica, in cui il dominio polipeptidico di antigene immunogeno ? un antigene immunogeno da HPV.
[00147] In alcune forme di realizzazione, viene somministrata al paziente una proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E6 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, viene somministrata al paziente una proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E7 di HPV16. In certe forme di realizzazione, al paziente vengono somministrate una proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E6 di HPV16 e una proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E7 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, al paziente viene somministrata una proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E6 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, al paziente viene somministrata una proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E7 di HPV16. In certe forme di realizzazione, al paziente vengono somministrate una proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E6 di HPV16 e una proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E7 di HPV16. In alcune di queste forme di realizzazione, l'antigene E6 e/o l'antigene E7 sono detossificati.
[00148] In alcune forme di realizzazione, al paziente viene somministrato un polinucleotide che codifica la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E6 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, al paziente viene somministrato un polinucleotide che codifica la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E7 di HPV16. In certe forme di realizzazione, al paziente vengono somministrati un polinucleotide che codifica la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E6 di HPV16 e un polinucleotide che codifica la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E7 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, al paziente viene somministrato un polinucleotide che codifica la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E6 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, al paziente viene somministrato un polinucleotide che codifica la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E7 di HPV16. In certe forme di realizzazione, al paziente vengono somministrati un polinucleotide che codifica la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E6 di HPV16 e un polinucleotide che codifica la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E7 di HPV16. In alcune di queste forme di realizzazione, l'antigene E6 e/o l'antigene E7 sono detossificati. In certe forme di realizzazione, l'acido nucleico che codifica l'antigene E6 e/o l'antigene E7 ? ottimizzato con codone.
[00149] In alcune forme di realizzazione, viene somministrato al paziente un vettore che esprime la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E6 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, viene somministrato al paziente un vettore che esprime la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E7 di HPV16. In certe forme di realizzazione, al paziente vengono somministrati un vettore che esprime la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E6 di HPV16 e un vettore che esprime la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >e l'antigene E7 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, al paziente viene somministrato un vettore che esprime la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E6 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, al paziente viene somministrato un vettore che esprime la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E7 di HPV16. In certe forme di realizzazione, al paziente vengono somministrati un vettore che esprime la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E6 di HPV16 e un vettore che esprime la proteina di fusione comprendente una proteina Nef<mut >tronca e l'antigene E7 di HPV16. In alcune forme di realizzazione, gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi dallo stesso vettore. In alcune forme di realizzazione ulteriori, gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi da vettori diversi. In certe forme di realizzazione, l'antigene E6 e/o l'antigene E7 vengono detossificati. In certe forme di realizzazione, l'acido nucleico che codifica l'antigene E6 e/o l'antigene E7 ? ottimizzato con codone.
ESEMPI
[00150] Di seguito, vi sono alcuni esempi di forme di realizzazione specifiche per eseguire la presente invenzione. Gli esempi sono presentati solo a scopo illustrativo e non intendono limitare in alcun modo l'ambito della presente invenzione. Sono stati profusi degli sforzi per garantire la precisione in relazione ai numeri riportati (ad esempio, le quantit?, le temperature, ecc.), tuttavia si deve ovviamente tenere conto di alcuni errori e deviazioni sperimentali.
[00151] La pratica della presente invenzione impiegher?, se non altrimenti indicato, dei metodi convenzionali di chimica proteica, biochimica, tecniche del DNA ricombinante e farmacologia che rientrano nelle competenze nel ramo. Tali tecniche sono spiegate integralmente nella letteratura.
Metodi
Vettori
[00152] Vettori di DNA che esprimono Nef selvatico, Nef<mut>, Nef<mut>/E6 (sequenza E6: AF486315.1, www.ncbi.nlm.nih.gov) sono stati precedentemente descritti in D'Aloja P, et al., 2001, J Gen Virol 82:2735-2745 e Di Bonito P, et al., 2015, Viruses 7:1079-1099, ciascuno dei quali ? integralmente incluso a titolo di rimando.
[00153] Il vettore pTarget-Nef<mut>/E7 ? stato ottenuto come segue: la struttura era il vettore di clonazione pTarget (Promega) dove la sequenza Nefmut a lunghezza intera ? stata inserita tra i due overhang T in corrispondenza della regione polylinker. In corrispondenza dell'estremit? 3' della cornice di lettura aperta (ORF) di Nef<mut >, il codone di stop ? stato sostituito da un linker GPGP (SEQ ID N?: 51) che include un sito Apa I in corrispondenza dell'estremit? 3' in modo tale che la ligazione con sequenze eterologhe a valle digerite da Apa I si traduca in una sequenza in-frame unica (Figure 1A e 1B). Questo vettore ? stato indicato come pTarget-Nef<mut>/fusion. I siti di restrizione a valle del polylinker vettoriale erano utili per l'inserimento direzionale di sequenze estranee. L'ORF dell'E7 di HPV16 ? stata amplificata da un vettore che ospita la sequenza AF 486326.1 (www.ncbi.nlm.nih.gov) mediante PCR con Taq polimerasi Platinum High Fidelity (Invitrogen) usando il forward primer: TATAGGGCCCCATGGAGATACACC (SEQ ID N?: 52) e il reverse primer: TATCGTCGACTTATGGTTCTGGGAACA (SEQ ID N?: 53). Il prodotto della PCR ? stato poi digerito con Apa I/Sal I e inserito nel vettore pTarget-Nef<mut>/fusion opportunamente digerito.
[00154] Il pTarget-Nef<mut>PL ? stato ottenuto digerendo il vettore pTarget-Nef<mut>/fusion, ovvero un vettore pTarget (Invitrogen) in cui l'intera sequenza Nef<mut >? stata inserita tra i due overhang T della regione polylinker. In corrispondenza dell'estremit? 3' della cornice di lettura aperta (ORF) di Nef<mut>, il codone di stop ? stato sostituito da un linker GPGP (SEQ ID N?: 51) che include un sito Apa I in corrispondenza di questa estremit? 3' in modo che la ligazione con sequenze eterologhe a valle digerite da Apa I si traduca in una sequenza in-frame unica. Il pTarget-Nef<mut>/fusion ? stato digerito con l'enzima Sma I, riconoscendo un primo sito di restrizione proprio a valle della mutazione Nef<mut >pi? tipica del C-terminale (ovvero, <E>177<G>), e un secondo sito in corrispondenza del polylinker vettoriale del terminale 3'. La successiva riligazione ha generato una delezione di 29 amminoacidi C-terminale, con la formazione de novo di un codone di stop proprio a valle del sito di restrizione Sma I.
[00155] Per il pTarget-Nef<mut>/E6 detossificato (E6<DETOX>), l'ORF dell'E6 di HPV16 ? stata asportata dal vettore pTarget-Nef<mut>/E6 mediante digestione Apa I/Sal I, e sostituita con una ORF di E6 "detossificata" in cui la sostituzione aminoacidica di <G>130<V >ha generato una perdita di funzione dell'E6 ostacolando l'interazione dell'E6 con p53. Si veda Shamanin VA, et al., 2008, J Virol 82:3912-3920, che ? integralmente incluso a titolo di rimando.
[00156] La strategia di clonazione di pTarget-Nef<mut>/E6 ottimizzato-detossificato (E6<OD>) era simile a quella seguita per ottenere il pTarget-Nef<mut>/E6<DETOX>. L'ORF di E6 ? stata detossificata mediante sostituzione aminoacidica <G>130<V>. Inoltre, l'intero ORF di E6 ? stata ottimizzata con codone attraverso un algoritmo ad hoc fornito dal servizio Codon Optimization On-Line (COOL) (cool.syncti.org), che ha introdotto 134 sostituzioni di base.
[00157] Per il pTarget-Nef<mut>PL/E6<DETOX>, l'ORF di Nef<mut>PL ? stata amplificata con PCR usando un reverse primer con un sito Apa I in modo tale che, come nel vettore pTarget-Nef<mut>/fusion, l'inserimento di Apa I delle ORF a valle si traduca in una sequenza in-frame, e quindi in una proteina di fusione. Il vettore risultante ? stato indicato come Nef<mut>PL/fusion. La strategia di clonazione e di sintesi per ottenere il vettore pTarget-Nef<mut>PL/E6<DETOX >era identica a quella descritta per il vettore pTarget-Nef<mut>/E6<DETOX>, eccetto per il fatto che l'ORF di E6<DETOX >? stata inserita nel vettore pTarget-Nef<mut>PL/fusion.
[00158] La strategia di clonazione e di sintesi di pTarget-Nef<mut>PL/E6<OD >era identica a quella descritta per il vettore pTarget-Nef<mut>/E6<DETOX>, eccetto per il fatto che l'ORF di E6<OD >? stata inserita nel vettore pTarget-Nef<mut>PL/fusion.
[00159] Per il pTarget-Nef<mut>/E7 detossificato (E7<DETOX>), l'ORF dell'E7 di HPV16 ? stata asportata dal vettore pTarget-Nef<mut>/E7 mediante digestione di Apa I/Sal I, e sostituita con una ORF di E7 "detossificata". Questa variante di E7 ? stata ottenuta inserendo tre sostituzioni di aminoacidiche, vale a dire tre glicine, in corrispondenza delle posizioni 21, 24 e 26 all'interno del sito di legame della proteina del retinoblastoma (pRB). In questo modo, ? stata terminata l'attivit? di immortalizzazione specifica per E7. Si veda Smahel M, et al., 2001, Virology 281:231-238, che ? integralmente incluso a titolo di rimando.
[00160] La strategia di clonazione del pTarget-Nef<mut>/E7 ottimizzato-detossificato (E7<OD>) era simile a quella seguita per ottenere il pTarget-Nef<mut>/E7<DETOX>. L'ORF di E7 ? stata detossificata. Inoltre, l'intera ORF di E7 ? stata ottimizzata con codone in linea con i risultati pubblicati da Cid-Arregui e colleghi (si veda Cid-Arregui A, et al., 2003, J Virol 77:4928-4937, che ? integralmente incluso a titolo di rimando) attraverso l'introduzione di 64 sostituzioni di base.
[00161] Per il pTarget-Nef<mut>PL/E7<DETOX>, il vettore pTarget-Nef<mut>PL/fusion ? stato asportato in corrispondenza dei siti di restrizione Apa I e Sal I in cui l'ORF di E7<DETOX >descritta in precedenza ? stata inserita in-frame.
[00162] Per il pTarget-Nef<mut>PL/E7<OD>, il vettore pTarget-Nef<mut>PL/fusion ? stato asportato in corrispondenza dei siti di restrizione Apa I e Sal I in cui l'ORF di E7<OD >descritta in precedenza ? stata inserita in-frame.
[00163] Per il pcDNA3.1-E6<OD>, l'ORF di E6<OD >descritta in precedenza, ma che include sia le sequenze Kozak che il codone di inizio ATG in corrispondenza dell'estremit? 5', ? stata inserita nei siti Not I e Apa I del polylinker del vettore pcDNA3.1 (Invitrogen). Una sequenza 6?His tag (ovvero 5' CACCATCACCATCACCAT 3' (SEQ ID N?: 54)) ? stata inclusa in corrispondenza dell'estremit? 3' proprio prima del codone di stop.
[00164] Per il pcDNA3.1-E7<OD>, l'ORF di E7<OD >descritta in precedenza, ma che include sia le sequenze Kozak che il codone di inizio ATG in corrispondenza dell'estremit? 5', ? stata inserita nei siti Not I e Apa I del polylinker del vettore pcDNA3.1 (Invitrogen). Una sequenza 6?His tag (ovvero 5' CACCATCACCATCACCAT 3' (SEQ ID N?: 54)) ? stata inclusa in corrispondenza dell'estremit? 3' proprio prima del codone di stop.
Analisi dell'espressione della proteina di fusione
[00165] Le cellule HEK293T sono state trasfettate in modo transiente con i vettori di DNA descritti in precedenza. 5?10<6 >cellule sono state seminate in piastre Petri di 10 cm in DMEM di FCS al 10%. Dopo 24 ore, sono state eseguite le trasfezioni cellulari usando 3 ?g/ml di polietilenimmina (PEI) (Sigma, cat n.408727) e 5 ?g di DNA in DMEM di FCS al 2%.
[00166] Dopo ulteriori 24 ore, ? stato aggiunto terreno privato di EV (ovvero, DMEM integrato con FCS al 5% precedentemente privato di EV mediante ultracentrifugazione per 4 ore a 70.000 g, 4 ?C). Al completamento del saggio (ovvero 48-72 ore dopo la trasfezione), sono state raccolte sia le cellule che i surnatanti.
[00167] L'analisi Western blot su lisati cellulari ? stata eseguita lavando le cellule due volte con 1?PBS (pH 7,4) e lisandole per 20 minuti su ghiaccio con tampone di lisi (20 mM di HEPES pH 7,9, 50 mM di NaCl, 10 mM di EDTA, 2 mM di EGTA, detergente non ionico IGEPAL CA-630 allo 0,5%, 0,5 mM di ditiotreitolo, 20 mM di molibdato di sodio, 10 mM di ortovanadato di sodio, 100 mM di fluoruro di sodio, 10 ?g/ml di leupeptina, 0,5 mM di fenilmetilsulfonil fluoruro). I lisati cellulari interi sono stati centrifugati a 6.000?g per 10 minuti a 4?C. La concentrazione proteica degli estratti cellulari ? stata determinata mediante saggio Lowry di quantificazione delle proteine. Aliquote di estratti cellulari contenenti da 30 a 50 ?g di proteine totali sono state risolte mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecil solfato all'8-12% (SDS-PAGE) e trasferite mediante elettroblotting su una membrana di nitrocellulosa con pori di 0,45 ?M (Amersham) per una notte usando un Bio-Rad Trans-Blot. Per i saggi immunologici, le membrane sono state bloccate con latte in polvere non grasso al 5% in PBS contenente Triton X-100 allo 0,1% per 1 ora a temperatura ambiente, quindi incubate per una notte a 4 ?C con anticorpi specifici diluiti in PBS contenente Triton X-100 allo 0,1%.
[00168] Per l'isolamento degli esosomi, i surnatanti da cellule trasfettate sono stati sottoposti a centrifugazioni differenziali, inclusa una prima ultracentrifugazione a 10.000 ? g per 30 minuti. I surnatanti sono stati poi raccolti, filtrati con pori di 0,22 ?M e ultracentrifugati a 70.000 g per 2 ore. Le vescicole pellettate sono state risospese in PBS e ultracentrifugate nuovamente a 70.000 g per 1 h. Infine, gli esosomi sono stati lisati in PBS contenente Triton X-100 allo 0,1% per l'analisi Western blot. Si veda Thery C, et al., 2006, Curr Prot Cell Biol.doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30, integralmente incluso a titolo di rimando.
[00169] Gli anticorpi utilizzati negli immunoblot erano: antisiero anti-Nef di pecora ARP 444 (offerto gentilmente da M. Harris, University of Leeds, Leeds, Regno Unito, per uso senza limitazioni), anti-His-tag (BioRad MCA1396GA), anti-ALIX (Santa Cruz SC9901), anti-?-Actina (Cell Signaling 5125S) e gli anticorpi secondari appropriati coniugati con HRP: antipecora (Santa Cruz SC2770), anti-topo (BIORAD 170-6516), anti-coniglio (Amersham NA934). La rivelazione ECL (Thermo Scientific 34580) ? stata condotta con un apparecchio ChemiDoc (BioRad).
Studio in vivo
[00170] Dei topi C57BL/6 femmine di sei settimane d'et? sono stati ottenuti da Charles River. Il giorno prima della prima inoculazione, dei microchip di DATAMARS sono stati inseriti per via sottocutanea (s.c.) nella parte posteriore del collo tra le scapole sulla linea mediana dorsale. Le quantit? indicate di entrambi i vettori di espressione della proteina di fusione e di controllo sono state diluite in soluzione salina sterile allo 0,9%. Come vettore di controllo, ? stato usato il pcDNA3.1 (Invitrogen) omologo del pTarget.
[00171] Sia la qualit? che la quantit? della preparazione di DNA sono state controllate con saggi di assorbanza ed elettroforesi da 260/280 nm. Ciascun volume di inoculo ? stato misurato mediante micropipetta, caricato singolarmente in una siringa da 1 mL senza spazio morto, e iniettato in quadricipiti di topo.
[00172] Per la procedura di elettroporazione, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano. Immediatamente dopo l'inoculazione, ? stata applicata l'elettroporazione in corrispondenza del sito di iniezione attraverso il dispositivo Agilpulse BTX utilizzando un array a 4 aghi con distanza di 4 mm, lunghezza dell'ago di 5 mm (BTX, cat n.15497370) con i seguenti parametri:
1 impulso da 450 V per 50 ?sec;
intervallo 0,2 msec;
1 impulso da 450 V per 50 ?sec;
intervallo 50 msec;
8 impulsi da 110 V per 10 msec con intervalli di 20 msec.
I parametri EP erano quelli descritti nella letteratura (Hobernik D, et al., 2018, Int. J. Med Sci 19: e3605, integralmente inclusi a titolo di rimando) e raccomandati dal produttore.
[00173] Le milze sono state espiantate e collocate in provette Eppendorf da 2 mL riempite con 1 mL di RPMI 1640 (Gibco), 50 ?M di 2-mercaptoetanolo (Sigma). Le milze sono state trasferite in una piastra Petri di 60 mm contenente 2 mL di RPMI 1640 (Gibco), 50 ?M di 2-mercaptoetanolo (Sigma). Gli splenociti sono stati estratti incidendo la milza con forbici sterili e spingendo le cellule fuori dal sacco splenico con lo stantuffo di una siringa da 1 ml. Dopo l'aggiunta di 2 mL di terreno RPMI, le cellule sono state trasferite in una provetta conica da 15 mL, e la piastra Petri ? stata lavata con 4 mL di terreno per raccogliere le cellule rimanenti. Dopo una sedimentazione di tre minuti, gli splenociti sono stati trasferiti in una nuova provetta sterile per rimuovere detriti cellulari e tissutali. Le conte di cellule vive sono state eseguite mediante il metodo di esclusione con trypan blue. Un totale di 5?10<6 >splenociti freschi ? stato risospeso in terreno RPMI completo, contenente 50 ?M di 2- mercaptoetanolo e FBS al 10%, e testato mediante saggio EliSpot di IFN-?. Le cellule rimanenti sono state congelate in aliquote di 20-30?10<6 >cellule/mL in FBS al 90% (Gibco), DMSO al 10% (Sigma).
Modello murino singenico
[00174] Le cellule TC-1 usate per generare il modello murino singenico sono state derivate da un tumore impiantato per via s.c. in un topo femmina C57BL/6. Si assumeva che le cellule TC-1 espiantate avessero una tumorigenicit? ottimale. Sono state espanse e, dopo non pi? di cinque passaggi, sono stati congelati pi? stock per preservare la loro tumorigenicit?. Nei presenti esperimenti, le cellule sono state caratterizzate mediante analisi qRT-PCR per l'espressione di E6 e E7 di HPV16 prima dell'impianto. Il saggio ? stato condotto su RNA totale estratto da un milione di cellule TC-1 o, come controllo negativo, macrofagi murini RAW 264,7 (ATCC, TIB71), con il reagente TRIzol (Invitrogen), seguendo le raccomandazioni del produttore. Un ?g di RNA ? stato utilizzato per sintetizzare il cDNA impiegando il System kit (Promega) per la Trascrizione inversa (RT). Un'aliquota (2 ?l) di cDNA ? stata amplificata utilizzando i primer oligonucleotidici dalla sequenza E6 (forward: 5'-AATGTTTCAGGACCCACAGG-3' (SEQ ID N?: 55), e reverse: 5'-TTGTTTGCAGCTCTGTGCAT-3' (SEQ ID N?: 56)) o dalla sequenza E7 (forward: 5'-CAAGTGTGACTCTACGCTTCGG-3' (SEQ ID N?: 57), e reverse: 5'-GTGGCCCATTAACAGGTCTTCCAA-3' (SEQ ID N?: 58)). La contaminazione genomica del DNA ? stata controllata includendo i controlli RT (-), ovvero le condizioni in assenza di RT. La reazione di RT ? stata normalizzata amplificando i campioni anche per l'ipoxantina guanina fosforibosiltransferasi (HPRT) come gene costitutivo. La RT-PCR ? stata eseguita per mezzo del kit SYBR Green RT-PCR (Qiagen) e dell'Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). La miscela di reazione per ciascun campione di PCR comprendeva: 12,5 ?l di miscela SYBR Green, 8,5 ?l di acqua distillata, 2 ?l di cDNA, 1 ?l di miscela di primer (20 nM di ciascun primer). Le reazioni di PCR sono state condotte a 95 ?C per 15", a 60 ?C per 30", a 72 ?C per 1', per 40 cicli. I dati sono stati raccolti durante ogni fase di allungamento (72 ?C) e durante la terminazione (per controllare la specificit?), e analizzati mediante il software Applied Biosystems 7500 SDS (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) usando il metodo 2-DDCt.
[00175] Dei topi C57BL/6 (12 per gruppo) sono stati sottoposti a infezione sperimentale con 2?10<5 >cellule TC-1 e, il giorno dopo la comparsa del tumore, cio? quando le masse tumorali sono diventate rilevabili mediante palpazione, le quantit? indicate di ciascun vettore di espressione sono state iniettate nei quadricipiti di topo, cui ? seguita l'elettroporazione.
[00176] Per raccogliere le cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) per valutare le risposte immunitarie, sette giorni dopo la seconda immunizzazione sono stati raccolti 200 ?L di sangue da ciascun topo tramite sanguinamento retro-orbitale. La crescita tumorale ? stata monitorata quotidianamente mediante ispezione visiva, palpazione e misurazione del diametro mediante un calibratore elettronico, e calcolata come (lunghezza?larghezza<2>)/2. I topi sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale, se in cattiva salute o non appena i tumori hanno raggiunto le dimensioni di 1 cm<3>. Dopo l'incubazione con tampone di lisi ACK (Gibco) per eliminare i globuli rossi, il saggio EliSpot di IFN-? ? stato eseguito seminando 0,5-2?10<5 >cellule vive (verificate mediante il metodo di esclusione con trypan blue) in ciascun micropozzetto.
Saggio EliSpot di IFN-?
[00177] In ciascun micropozzetto sono stati seminati 2,5?10<5 >splenociti vivi o 0,5-2?10<5 >PBMC. Le colture sono state condotte in triplicato in piastre multipozzetto EliSpot (Millipore, cat n. MSPS4510) pre-rivestite con anticorpo monoclonale (mAb) AN18 contro gli IFN-? di topo (Mabtech) in RPMI 1640 (Gibco) pi? FBS al 10% (Gibco) per 16 h in presenza o assenza di 5 ?g/mL dei seguenti peptidi: E6 (CD4) 68-83: CIVYRDGNPYAVCDKC (SEQ ID N?: 59); 96-110: EQQYNKPLCDLLIRC (SEQ ID N?: 60); E6 (CD8) 18-26: KLPQLCTEL (SEQ ID N?: 61); 50-57: YDFAFRDL (SEQ ID N?: 62); 109-117: RCINCQKPL (SEQ ID N?: 63); 127-135: DKKQRFMNI (SEQ ID N?: 64). E7 (CD4): 44-60: QAEPDRAHYNIVTFCCK (SEQ ID N?: 65; E7 (CD8): 21-28: DLYCYEQL (SEQ ID N?: 66); 49-57: RAHYNIVTF (SEQ ID N?: 67); 67-75: LCVQSTHVD (SEQ ID N?: 68). Si veda Tindle RW, et al., 1991, PNAS 88:5887-5891; Bauer S, et al., 1995, Scand J. Immunol 42:317-323; de Oliveira LM, et al., 2015, PLoSOne doi.org/10.1371/journal.pone.0138686.g001; e Azoury-Ziadeh R, et al., 1999, Viral Immunol 12: 297-312; ciascuno dei quali ? integralmente incluso a titolo di rimando. Come controllo negativo, sono stati usati 5 ?g/mL di ITQMYTNV peptidico specifico di HCV-NS3 legante con H2-K<b >(SEQ ID N?: 69) (si veda Mikkelsen M, et al., 2011, J. Immunol 186:2355-2364, integralmente incluso a titolo di rimando). Pi? del 70% di preparazioni pure dei peptidi sono state ottenute da UFPeptides, Ferrara, Italia, o da JPT, Berlino, Germania. Per il controllo dell'attivazione cellulare, le colture sono state trattate con 10 ng/mL di PMA (Sigma) pi? 500 ng/mL di ionomicina (Sigma). Dopo 16 ore, le colture sono state rimosse e i pozzetti sono stati incubati con 100 ?L di 1 ?g/ml dell'anti-IFN-? biotinilato R4-6A2 (Mabtech) per 2 ore a temperatura ambiente. I pozzetti sono stati poi lavati e trattati per 1 ora a temperatura ambiente con preparazioni di streptavidina-ALP diluite 1:1000 di Mabtech. Dopo il lavaggio, sono stati sviluppati degli spot aggiungendo 100 ?L/pozzetto di SigmaFast BCIP/NBT, cat. n. B5655. Le cellule spot-forming sono state infine analizzate e contate utilizzando un lettore EliSpot AELVIS.
Colorazione intracellulare delle citochine (ICS) e saggio di citometria a flusso
[00178] Sono stati seminati splenociti decongelati (2?10<6 >cellule vive per pozzetto) in piastre a 48 pozzetti in terreno RPMI, FCS al 10%, 50 ?M di 2-mercaptoetanolo (Sigma), e 1 ?g/mL di Brefeldina A (BD Biosciences) per 16 ore a 37 ?C. Le condizioni di controllo per l'attivazione cellulare sono state eseguite aggiungendo 10 ng/ml di PMA (Sigma) e 1 ?g/mL di ionomicina (Sigma). Per saggiare l'attivazione specifica per E6 e E7 di HPV16 delle cellule T CD8<+>, sono stati aggiunti 5 ?g/mL dei peptidi 9-mer descritti in precedenza che legano il complesso H2-K<b >di topi C57BL/6. Come controllo negativo, sono stati usati 5 ?g/ml del peptide specifico di HCV-NS3 legante H2-K<b>.
[00179] Dopo 16 ore, le colture sono state colorate con 1 ?l di reagente LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell (Invitrogen ThermoFisher) in 1 mL di PBS per 30 minuti a 4 ?C e lavate due volte con 500 ?l di PBS. Per ridurre al minimo la colorazione aspecifica, le cellule sono state pre-incubate con 0,5 ?g di mAb bloccanti l'Fc (cio? anticorpi anti-CD16/CD32, Invitrogen/eBioscience) in 100 ?L di PBS con FBS al 2% per 15 minuti a 4?C.
[00180] Tutti le partite di mAb sono state preventivamente testate per stabilire le concentrazioni ottimali da usare nei saggi ICS sugli splenociti. Per il rilevamento dei marcatori di superficie cellulare, le cellule sono state colorate con 2 ?L dei seguenti anticorpi: Anti-topo CD3 coniugato con FITC, anti-topo CD8a coniugato con APC-Cy7, e anti-topo CD4 coniugato con PerCP (BD Biosciences) e incubato per 1 ora a 4 ?C.
[00181] Dopo il lavaggio, le cellule sono state permeabilizzate e fissate attraverso il kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) secondo le raccomandazioni del produttore, e colorate per 1 ora a 4 ?C con 2 ?l dei seguenti anticorpi: Anti-topo IFN-? coniugato con PE-Cy7, anti-topo IL-2 coniugato con PE (Invitrogen eBioscience), e anti-topo TNF-? BD Biosciences di ratto BV421 in un totale di 100 ?L di 1? Perm/Wash Buffer (BD Biosciences). Dopo due lavaggi, le cellule sono state fissate in 200 ?L di 1 ? PBS/formaldeide (2% v/v). I campioni sono stati poi valutati mediante un citometro a flusso Gallios e analizzati usando il software Kaluza (Beckman Coulter).
[00182] La strategia di gating era la seguente: cellule vive come rilevato da Aqua LIVE/DEAD Dye vs. FSC-A, cellule singolette da FSC-A vs. FSC-H (singoletto 1) e SSC-A vs. SSC-W (singoletto 2), cellule positive CD3 da CD3 (FITC) vs. cellule positive SSC-A, CD8 o CD4 da CD8 (APC-Cy7) vs. CD4 (PerCP). La popolazione di cellule CD8<+ >? stata "ghettata" rispetto ad APC-Cy7, PE e BV421 per osservare, rispettivamente, cambiamenti nella produzione di IFN-?, IL-2 e TNF-?. Sono stati creati dei gate booleani al fine di determinare qualsiasi modello di co-espressione delle citochine.
Saggio CTL
[00183] Le cellule T CD8<+ >sono state isolate dagli splenociti mediante selezione immunomagnetica positiva (Miltenyi Biotec Gmbh, Teterow, Germania). Sono state messe in co-coltura per 4 ore in RPMI con FCS al 10% con cellule EL-4 (ATCC TIB-39) precedentemente etichettate con estere succinimmidico della carbossifluoresceina (CFSE, Invitrogen, Thermo Fisher) seguendo le raccomandazioni del produttore, e trattate per una notte con E7 o peptidi non correlati. Le co-colture sono state eseguite a un rapporto cellula effettrice/bersaglio di 10:1 in 200 ?l di RPMI al 10% in piastre a 96 pozzetti con fondo a U. Successivamente, ? stata valutata la mortalit? delle cellule EL-4 mediante analisi FACS subito dopo l'aggiunta di 7-AAD (Sigma) alla concentrazione finale di 1 ?g/ml.
Esempio 1: Dose-risposta del DNA dopo la somministrazione intramuscolare o somministrazione intramuscolare elettroporazione
[00184] Sono state confrontate le risposte immunitarie delle cellule T CD8<+ >specifiche per HPV16 E7 suscitate dall'iniezione intramuscolare (i.m.) di vettori di DNA che esprimono Nef<mut>/E7 con o senza procedure di elettroporazione (EP). Il progetto sperimentale ? delineato nella Tabella 2 di seguito.
[00185] Tutti i gruppi includevano 3 topi, ad eccezione dei gruppi di controllo A ed E contenenti 2 topi. Le dosi di DNA indicate in precedenza sono state iniettate in ciascun quadricipite, che erano i siti in cui il campo elettrico ? stato applicato nelle condizioni di EP. Le iniezioni sono state ripetute 14 giorni dopo.
[00186] Le efficienze di immunizzazione sono state valutate mediante attivazione dei linfociti T CD4<+ >e CD8<+ >specifici per E7 di HPV16 in saggi EliSpot di IFN-? condotti con splenociti isolati da topi iniettati con il vettore di DNA che esprime Nef<mut>/E7.
[00187] L'immunit? delle cellule T CD4<+ >e CD8<+ >specifica per E7 di HPV16 indotta nei topi mediante iniezione del vettore di DNA che esprime Nef<mut>/E7 in assenza o presenza di EP ? mostrata nelle Figure 2A e 2B. Quando le iniezioni di DNA sono state seguite da EP, sono state prodotte immunit? di T CD8<+ >e CD4<+ >specifiche per E7 pi? potenti. In particolare, nei topi iniettati con 10 ?g di DNA, l'EP successivo ha portato a un aumento di 5 volte dell'immunogenicit? rispetto alla sola iniezione i.m. utilizzando la dose di DNA pi? alta, ovvero 50 ?g. In particolare, questa dose ? apparsa meno immunogenica della dose di 5 ?g somministrata mediante iniezione i.m. EP.
[00188] Sulla base di questi risultati, l'iniezione i.m. di 10 ?g di DNA seguita da EP ? stata la dose scelta per gli esempi successivi.
Esempio 2: Ottimizzazione del DNA
[00189] Sono stati generati vettori di DNA per testare l'effetto della detossificazione e dell'ottimizzazione con codoni. Per la detossificazione, E6 ed E7 sono stati detossificati per spezzare rispettivamente il legame con le proteine delle cellule ospiti e con i geni p53 e pRb soppressori dei tumori. Inoltre, sono stati testati il caricamento di EV e l'immunogenicit? di un Nef<mut >tronco C-terminale (indicato come Nef<mut>PL). Il progetto sperimentale ? delineato nella Tabella 3 di seguito.
[00190] Tutti i gruppi includevano 3 topi, ad eccezione del gruppo di controllo (A) comprendente 2 topi. Gli inoculi sono stati condotti in ciascun quadricipite ed ? stata eseguita l'elettroporazione dopo ciascuna iniezione di DNA. Una seconda immunizzazione identica ? stata eseguita 14 giorni dopo.
[00191] Per l'antigene E6, l'espressione in cellule trasfettate ? apparsa simile tra tutti i prodotti di fusione indipendentemente dall'ottimizzazione con codoni, dalla detossificazione e dal troncamento di Nef<mut>. Tuttavia, l'efficienza del caricamento di esosomi ? stata diversa tra i prodotti di fusione. In particolare, Nef<mut>/E6<OD >e Nef<mut>PL/E6<OD >sono stati associati agli esosomi in modo pi? efficiente (Figure. 3A e 3B). Quando espresso da solo, E6<OD>, ma non E6<DETOX>, era rilevabile nelle cellule mediante analisi Western blot, mentre entrambi erano assenti quando sono stati analizzati gli esosomi (Figure. 5A e 5B).
[00192] La detossificazione di Nef<mut>/E7 ha reso il prodotto di fusione appena rilevabile nelle cellule, e lo stesso si ? verificato quando l'E7 detossificato ? stato fuso con Nef<mut>PL. Analogamente all'E6, sia Nef<mut>/E7<OD >che Nef<mut>PL/E7<OD >sono stati ben espressi nelle cellule e caricati negli esosomi in modo efficiente (Figure 4A e 4B). Quando espresso da solo, E7<OD>, ma non E7<DETOX>, era rilevabile nelle cellule mediante analisi western blot, mentre non erano rilevabili negli esosomi (Figure 5A e 5B).
[00193] Sia l'espressione che l'associazione degli esosomi di Nef<mut>PL apparivano paragonabili a quelle di Nef<mut >a lunghezza intera (Figure 3A e 3B; Figure 4A e 4B).
[00194] I dati ottenuti negli studi di immunogenicit? mediante saggio EliSpot di IFN-? (Figura 6A e 6B) hanno mostrato livelli inferiori di immunogenicit? dei vettori che esprimono Nef<mut>/E6 rispetto alle controparti basate su E7 in generale. L'ottimizzazione e la detossificazione di E7 non hanno influenzato la potenza della risposta immunitaria specifica per E7, mentre hanno aumentato la risposta immunitaria delle cellule T CD8<+ >specifica per E6.
Il troncamento di Nef<mut >non ha diminuito l'immunogenicit? dei prodotti fusi, e l'attivazione delle cellule T CD8<+ >rilevata era paragonabile o superiore ai vettori di Nef<mut >a lunghezza intera.
[00195] Al fine di analizzare i dati di immunizzazione in maggiore dettaglio, nonch? di quantificare con precisione le risposte immunitarie, sono state eseguite analisi di ICS/citometria a flusso su splenociti crioconservati. Queste analisi avevano lo scopo di rilevare il linfocita T CD8<+ >attivato da peptidi riguardante l'accumulo intracellulare di IFN-?, IL-2 e TNF-?. I risultati sono stati calcolati come: i) percentuali di cellule T CD8<+ >da ciascun topo iniettato positive per ciascuna citochina; ii) rispettivi valori medi infragruppo; iii) frazioni delle cellule T CD8<+ >totali che esprimono ciascuna delle possibili combinazioni di citochine, ovvero, cellule che esprimono positivit? a una citochina, a tutte e tre, a IFN-?+IL-2, a IL-2+TNF-?, e a IFN-?+TNF-?, e iv) loro mezzi infragruppo.
[00196] Dall'analisi di ICS/citometria a flusso dell'accumulo di IFN-? in cellule T CD8<+>, le percentuali di cellule T CD8<+ >positive a IFN-? erano in media il 3% delle cellule T CD8<+ >totali in topi iniettati con Nef<mut>/E7 e sono aumentate a pi? del 4% nel caso dell'immunizzazione con Nef<mut>/E7<OD>. Il troncamento di Nef<mut >ha aumentato l'induzione di IFN-? rispetto a quella rilevata nelle cellule di topi immunizzati con Nef<mut >a lunghezza intera. Una tendenza simile, tuttavia in presenza di livelli complessivi inferiori di induzione di IFN-?, ? stata rilevata nel caso dell'immunizzazione con prodotti derivati da E6. Sono state rilevate percentuali pi? elevate di cellule T CD8<+ >che accumulano IL-2 o TNF-? (fino al 2 e al 3%, rispettivamente) in cellule T CD8<+ >da topi iniettati con vettori di DNA basati su E7 rispetto a vettori di DNA basati su E6 (0,7% per IL-2 e 1,8% per TNF-?) (Figure 7A-7C; Figure 8A-8C).
[00197] ? importante sottolineare che l'analisi dell'accumulo di pi? citochine in cellule T CD8<+ >ha evidenziato la presenza di sottopopolazioni di T CD8<+ >bi- e tri-funzionali in tutti i topi rispondenti a livelli paragonabili a quelli rilevabili nelle cellule trattate con ionomicina PMA. In particolare, le cellule T CD8<+ >triple positive erano in media fino al 7% delle cellule T CD8<+ >attivate nel caso dell'immunizzazione con prodotti a base di E7, e fino al 6% nel caso dell'immunizzazione con prodotti a base di E6. Il troncamento di Nef<mut >ha aumentato la percentuale di cellule T CD8<+ >triple positive per proteine di fusione sia basate su E7 che su E6 (Figure 9A e 9B; Figura 10).
[00198] Il rilevamento di cellule T CD8<+ >specifiche per l'antigene che esprimono sia due che tre citochine indica che le immunizzazioni hanno indotto una risposta immunitaria funzionale cellulo-mediata da T CD8<+ >potenzialmente in grado di bersagliare e distruggere le cellule che esprimono l'antigene.
Esempio 3: Co-immunizzazione con due vettori di DNA che esprimono l'antigene
[00199] ? stata testata la co-iniezione di due vettori che esprimono antigeni HPV16 distinti fusi con Nef<mut>. Due vettori di DNA che esprimono Nef<mut>/E6<OD >o Nef<mut>/E7<OD >sono stati iniettati i.m.+EP in topi separatamente o in combinazione. Il progetto sperimentale ? delineato nella Tabella 4 di seguito.
[00200] Il gruppo di controllo A includeva 2 topi, i gruppi B e C includevano 3 topi, e il gruppo D comprendeva 5 topi. Gli inoculi sono stati condotti in ciascun quadricipite e l'elettroporazione ? stata eseguita dopo ciascuna iniezione di DNA in tutti i topi come descritto in precedenza. Una seconda immunizzazione identica ? stata eseguita 14 giorni dopo.
[00201] Come osservato negli esperimenti precedenti, i risultati del saggio EliSpot di IFN-? hanno indicato risposte delle cellule T CD8<+ >pi? forti contro E7 rispetto a E6. Quando i due vettori sono stati co-iniettati, ? stata generata una risposta immunitaria additiva o sinergica specifica per E6 ed E7, escludendo cos? possibili effetti di interferenza tra i vettori di DNA iniettati. Questa conclusione ? stata anche supportata dall'evidenza che la risposta delle cellule T CD8<+ >specifica per E7 negli animali co-iniettati non ? stata ridotta (anzi, risultava leggermente aumentata) rispetto a quella dei topi iniettati con il solo vettore che esprime Nef<mut>/E7<OD >(Figure 11A e 11B).
[00202] I dati di ICS/citometria a flusso sulla risposta con IFN-? delle cellule T CD8<+ >ottenuti con splenociti crioconservati sono serviti a quantificare con precisione la risposta immunitaria rilevata mediante saggio EliSpot di IFN-?. L'immunizzazione con il vettore Nef<mut>/E7<OD >ha prodotto il 3,7% di cellule T CD8<+ >producenti IFN-?, mentre la risposta specifica per E6 dava una media dello 0,8% di cellule T CD8<+ >da topi immunizzati con Nef<mut>/E6<OD>. Quando i due vettori sono stati co-iniettati, ? stata indotta una risposta immunitaria additiva o sinergica che ha raggiunto una media del 4,8% di cellule T CD8<+ >producenti IFN-?. La risposta specifica per E6 ? si ? concentrata principalmente sulla produzione di IFN-?, mentre, sotto stimolazione peptidica, le cellule T CD8<+ >da topi co-iniettati hanno espresso sia IL-2 (pi? del 3%) che TNF? (quasi il 2%) (Figure 12A-12C; Figure 13A-13C). Inoltre, una media del 9% di cellule T CD8<+ >attivate con nonameri da topi co-iniettati con Nef<mut>/E6<OD >e Nef<mut>/E7<OD >ha co-espresso le tre citochine, consigliando fortemente l'induzione di CTL polifunzionali specifici per l'antigene (Figure 14A e 14B; Figura 15).
[00203] Questi risultati indicano che l'immunizzazione con due vettori di DNA che esprimono antigeni diversi ? fattibile, aprendo cos? alla possibilit? di immunizzazione con pi? antigeni utilizzando pi? vettori che esprimono ciascuno un antigene diverso o, a seconda della dimensione dell'antigene, pi? antigeni nello stesso vettore.
Esempio 4: Vaccino di DNA ottimizzato per l'analisi comparativa
[00204] Sono state confrontate l'immunogenicit? di E6 ed E7 di HPV16 indotta mediante iniezione di vettori di DNA che esprimono le ORF di E6 o E7 da sole o come proteina di fusione con Nef<mut>. Il progetto sperimentale ? delineato nella Tabella 5 di seguito.
[00205] Tutti i gruppi includevano 3 topi, ad eccezione del gruppo di controllo A con 2 topi. Le iniezioni sono state condotte in entrambi i quadricipiti ed ? stata eseguita l'elettroporazione dopo ogni iniezione di DNA in tutti i topi. Una seconda immunizzazione ? stata eseguita 14 giorni dopo.
[00206] I risultati dell'EliSpot di IFN-? sono mostrati nelle Figure 16A e 16B. La risposta alla vaccinazione con la proteina di fusione Nef<mut >ha determinato un aumento ?5 volte delle risposte immunitarie delle cellule T CD8<+ >e CD4<+ >specifiche per E7 e un aumento di circa 3 volte delle risposte immunitarie delle cellule T CD8<+ >e CD4<+ >specifiche per E6 rispetto alla vaccinazione con i vettori che esprimono E7 ed E6 senza Nef<mut>.
[00207] Analogamente, i saggi di ICS/citometria a flusso hanno indicato che la risposta di IFN-? all'interno delle cellule T CD8<+ >era molto pi? forte nei topi immunizzati con Nef<mut>/E7<OD>, raggiungendo una media di oltre il 4% delle cellule T CD8<+ >totali, rispetto alla risposta di IFN-? rilevata negli splenociti da topi immunizzati con vettore che esprimeva E7<OD>, che era inferiore all'1%. La risposta di IFN-? all'interno delle cellule T CD8<+ >da topi immunizzati con Nef<mut>/E6<OD >si avvicinava all'1%, mentre era a livello basico in topi iniettati con il vettore che esprime E6<OD >(Figure. 17A-17C; Figure 18A-18C).
[00208] I topi immunizzati con Nef<mut>/E7<OD >hanno indotto le cellule T CD8<+ >a esprimere IL-2 (pi? del 5%) e TNF-? (1,4%). Queste percentuali erano significativamente maggiori rispetto a quelle indotte in topi immunizzati con E7<OD>, ovvero, rispettivamente, lo 0,7% e lo 0,2%. In tutti i topi a cui sono stati iniettati vettori che esprimono prodotti a base di E6, la risposta specifica per l'antigene dell'espressione di IL-2 e TNF-? nelle cellule T CD8<+ >? apparsa ai livelli di fondo, ovvero quelli rilevati negli splenociti da topi a cui ? stato iniettato il vettore vuoto (Figure 17A-17C; Figure 18A-18C).
[00209] Percentuali simili di cellule T CD8<+ >trifunzionali sono state rilevate tra i topi immunizzati con vettori di DNA che esprimono Nef<mut>/E7<OD >o E7<OD>. La percentuale di cellule T CD8<+ >trifunzionali ? aumentata al 5% in topi iniettati con Nef<mut>/E6<OD >rispetto all'1% in topi iniettati con il solo E6<OD >(Figure 19A e 19B; Figura 20).
[00210] Quando le cellule T CD8<+ >isolate dagli splenociti sono state testate per la loro funzionalit? nel riconoscimento dell'antigene mediante un saggio di citotossicit?, le cellule T CD8<+ >isolate dagli splenociti raccolti da topi iniettati con vettori che esprimono Nef<mut>/E7<OD >hanno ucciso circa il 10% dei target cellulari corrispondenti alla Classe I. Al contrario, tale effetto non ? stato rilevabile quando le cellule T CD8<+ >sono state isolate dagli splenociti raccolti dai topi iniettati con il vettore che esprime E7<OD >(Figura 21).
Esempio 5: Efficacia terapeutica anti-tumorale
[00211] Per valutare l'efficacia anti-tumorale dell'immunizzazione con vettori a base di Nef<mut>, ? stato utilizzato il sistema di tumori trapiantabili basato su cellule TC-1 singeniche impiantate per via sottocutanea su topi C57BL/6. Il progetto sperimentale ? delineato nella Tabella 6 di seguito.
[00212] Ciascun gruppo includeva 12 topi. Un totale di 2?10<5 >cellule TC-1 sono state impiantate per via s.c. Non appena i tumori sono diventati palpabili, gli inoculi sono stati iniettati in ogni quadricipite con EP dopo l'iniezione di DNA. Una seconda immunizzazione ? stata eseguita 7 giorni dopo.
[00213] L'espressione di entrambi i geni E6 ed E7 di HPV16 in cellule TC-1 usate per l'impianto tumorale ? stata confermata mediante saggio qRT-PCR.
[00214] L'analisi della risposta immunitaria delle cellule T CD8<+ >specifica per E6 ed E7 mediante saggio Elispot di IFN-? su PBMC recuperate da sanguinamenti retro-orbitali ha mostrato una risposta immunitaria circa 5 volte pi? potente nei topi iniettati con vettori di DNA che esprimono le proteine detossificate e ottimizzate di HPV16 fuse con Nef<mut >rispetto a quella rilevata nei topi co-iniettati con vettori che esprimono E6<OD >ed E7<OD >(Figura 22).
[00215] La valutazione della dimensione del tumore estesa fino a 140 giorni dopo l'impianto del tumore ha indicato che l'immunizzazione con vettori che esprimono Nef<mut>/E6<OD >pi? Nef<mut>/E7<OD >ha generato un effetto anti-tumorale. In particolare, al giorno 35 dopo l'impianto del tumore (ovvero, quando tutti i topi dei gruppi di controllo erano deceduti) ? stato osservato uno sviluppo tumorale nullo o molto limitato nei topi co-iniettati con Nef<mut>/E6<OD >pi? Nef<mut>/E7<OD>. Al giorno 65 dopo l'impianto tumorale, era vivo solo 1 topo sui 12 topi iniettati con vettori di DNA che esprimono E6<OD >ed E7<OD>, mentre tutti i topi immunizzati con Nef<mut>/E6<OD >pi? Nef<mut>/E7<OD >erano ancora vivi (Figure 23A-23E). Come mostrato dalla curva di sopravvivenza (Figura 23F), sette topi del gruppo immunizzati con vettori di DNA che esprimono Nef<mut>/E7<OD >e Nef<mut>/E6<OD >sono rimasti senza tumore. Diversamente, solo un topo del gruppo a cui sono stati iniettati vettori di DNA che esprimono E7<OD >ed E6<OD >? sopravvissuto senza sviluppare un tumore.
[00216] La Figura 22 mostra i livelli di attivazione delle cellule T CD8<+ >rilevati mediante saggio Elispot di IFN-? su PBMC osservati il giorno 35 insieme ai dati di efficacia. Nel gruppo di topi co-immunizzati con Nef<mut>/E7<OD >e Nef<mut>/E6<OD>, sono stati rilevati bassi livelli di attivazione cellulare nei topi n? 6715, 6712, e 6709, che hanno sviluppato il tumore. Diversamente, il pi? alto livello di attivazione delle cellule T CD8<+ >in topi iniettati con vettori che esprimono E6<OD >ed E7<OD >? stato rilevato nell'unico topo (ovvero, n? 6631) del gruppo che non ha sviluppato il tumore.
[00217] Presi insieme, questi dati dimostrano che il vaccino Nef<mut>/E6<OD >+ Nef<mut>/E7<OD >porta a un controllo potente della crescita tumorale, superiore a quello indotto dal vaccino di DNA che esprime proteine detossificate e ottimizzate E6 ed E7 di HPV16.
EQUIVALENTI E AMBITO DI APPLICAZIONE
[00218] Gli esperti nel ramo riconosceranno o saranno in grado di accertare, utilizzando niente pi? che la sperimentazione di routine, molti equivalenti delle forme di realizzazione specifiche secondo l'invenzione descritte in questa sede. L'ambito della presente invenzione non ? inteso per essere limitato alla Descrizione di cui sopra, ma piuttosto ? esposto nelle rivendicazioni allegate.
[00219] Nelle rivendicazioni, articoli come "un", "uno/a" e "il/la" significano uno o pi? di uno se non diversamente indicato o altrimenti evidente dal contesto. Le rivendicazioni o le descrizioni che includono "o" tra uno o pi? membri di un gruppo sono considerate soddisfatte se uno, pi? di uno o tutti i membri del gruppo sono presenti, impiegati, o altrimenti rilevanti per un determinato prodotto o processo se non diversamente indicato o altrimenti evidente dal contesto. L'invenzione include forme di realizzazione in cui esattamente un membro del gruppo ? presente, impiegato o altrimenti rilevante per un dato prodotto o processo. L'invenzione include forme di realizzazione in cui sono presenti pi? di uno o tutti i membri del gruppo, impiegati, o comunque rilevanti per un dato prodotto o processo.
[00220] Si noti inoltre che i termini "comprendente" e "comprendendo" intendono essere aperti e consentono, ma non richiedono, l'inclusione di elementi o passaggi aggiuntivi. Quando i termini "comprendente" e "comprendendo" sono usati in questa sede, anche il termine "costituito da" ? quindi incluso e descritto.
[00221] Nei casi in cui vengano forniti degli intervalli, vengono inclusi degli endpoint. Inoltre, si deve comprendere che, se non diversamente indicato o altrimenti evidente dal contesto e dalla comprensione di un esperto ordinario nel ramo, i valori che sono espressi come intervalli possono assumere qualsiasi valore specifico o sotto-intervallo all'interno degli intervalli dichiarati in diverse forme di realizzazione dell'invenzione, al decimo dell'unit? del limite inferiore dell'intervallo, a meno che il contesto non indichi chiaramente diversamente.
[00222] Tutte le fonti citate, ad esempio riferimenti, pubblicazioni, database, voci di database e tecniche citate in questa sede, sono inserite nella presente domanda a titolo di rimando, anche se non espressamente indicato nella citazione. In caso di conflitto tra le dichiarazioni di una fonte citata e la presente domanda, prevale la dichiarazione della presente domanda.
[00223] I titoli delle sezioni e delle tabelle non intendono essere limitativi.
CD8<+ >T cell response Risposta cellule T CD8<+>
SFUs, mean values Valori medi SFU
CD4<+ >T cell response Risposta cellule T CD4<+>
Cells Cellule
Exosomes Esosomi
Void vector Vettore vuoto
Mouse Topo
% of 7AAD positive EL-4 target cells % di cellule target EL-4 positive a 7AAD Peptides unrelated Peptidi non correlati
CD8<+ >T cell response in injected, tumor Risposta delle cellule T CD8<+ >nei topi bearing mice iniettati, portatori di tumore
Group average tumor volumes with standard Gruppo di volumi medi di tumore con errore error standard
Tumor volume Volume del tumore
Tumor implantation Impianto tumorale
Immunizations Immunizzazioni
Days post-tumor implantation Giorni post-impianto tumorale
Empty vector Vettore vuoto
Bleeding Prelievo sangue
Kaplan-Meier survival curve Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier Survival Sopravvivenza
Claims (9)
1. Proteina di fusione, comprendente:
dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno,
in cui il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >o una proteina Nef<mut >tronca avente una sequenza di amminoacidi selezionata tra le SEQ ID N?: 1-30.
2. Proteina di fusione secondo la rivendicazione 1, in cui il polipeptide di ancoraggio esosomatico ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 1 o di SEQ ID N?: 30 o in cui l'antigene immunogeno ? un antigene virale o un antigene tumorale, preferibilmente l'antigene immunogeno ? un antigene virale, preferibilmente l'antigene virale ? selezionato dal gruppo costituito da: un antigene del papillomavirus umano (HPV), un antigene del virus dell'immunodeficienza umana (HIV), un antigene del virus dell'epatite B (HBV), un antigene del virus dell'epatite C (HCV), un antigene del virus Ebola, un antigene del virus del Nilo occidentale, un antigene del virus Congo-Crimea, un antigene del virus dengue e un antigene del virus dell'influenza, preferibilmente l'antigene del virus ? un antigene del papillomavirus umano (HPV), preferibilmente l'antigene dell'HPV ? E6 o E7 del papillomavirus umano, preferibilmente l'antigene virale ? un virus dell'immunodeficienza umana (HIV), preferibilmente l'antigene dell'HIV ? Gag o Tat del virus dell'immunodeficienza umana, preferibilmente l'antigene virale ? un antigene del virus dell'epatite B (HBV), preferibilmente l'antigene dell'HBV ? Core del virus dell'epatite B, preferibilmente l'antigene virale ? un antigene del virus dell'epatite C (HCV), preferibilmente l'antigene dell'HCV ? Core, NS3, E1, o E2 del virus dell'epatite C, preferibilmente l'antigene virale ? un antigene del virus Ebola, preferibilmente l'antigene del virus Ebola ? VP24, VP40, NP o GP del virus Ebola, preferibilmente l'antigene virale ? un antigene del virus del Nilo Occidentale, preferibilmente l'antigene del virus del Nilo Occidentale ? NS3 del virus del Nilo Occidentale, preferibilmente l'antigene virale ? un antigene del virus Congo-Crimea, preferibilmente l'antigene del virus Congo-Crimea ? GP o NP del virus Congo-Crimea, preferibilmente l'antigene virale ? un antigene del virus dengue, preferibilmente l'antigene virale ? un antigene del virus dell'influenza , preferibilmente il virus dell'influenza ? selezionato dal gruppo costituito da: virus della parainfluenza 1, virus della parainfluenza 2, virus dell'influenza A e virus dell'influenza B, preferibilmente il virus dell'influenza ? un virus dell'influenza A, preferibilmente l'antigene virale ? la nucleoproteina (NP) o la proteina di matrice (M1) del virus dell'influenza A, preferibilmente l'antigene immunogeno ? un antigene batterico, preferibilmente l'antigene batterico ? un antigene del Mycobacterium tuberculosis , preferibilmente l'antigene immunogeno ? un antigene parassitario, preferibilmente l'antigene parassitario ? un antigene del Plasmodium , preferibilmente l'antigene immunogeno ? un antigene tumorale, preferibilmente l'antigene tumorale ? un antigene di un tumore specifico, preferibilmente l'antigene tumorale ? un antigene associato a un tumore.
3. Polinucleotide che codifica la proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, preferibilmente il polinucleotide ? DNA, preferibilmente il polinucleotide ? RNA.
4. Vettore che comprende almeno un polinucleotide secondo la rivendicazione 3, in cui il vettore esprime almeno una proteina di fusione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, preferibilmente il vettore ? un vettore plasmidico, preferibilmente il vettore ? un vettore virale.
5. Vescicola extracellulare comprendente la proteina di fusione, il polinucleotide o il vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, preferibilmente la vescicola extracellulare ? un esosoma o una nanoparticella comprendente la proteina di fusione, il polinucleotide o il vettore di una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti o una composizione farmaceutica comprendente la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare o la nanoparticella di una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, e un eccipiente farmaceuticamente accettabile, preferibilmente detta composizione ? formulata per la somministrazione intramuscolare.
6. Metodo per trattare o prevenire una malattia o una condizione mediante immunizzazione in un soggetto che ne ha bisogno, comprendente:
la somministrazione al soggetto di una quantit? efficace della proteina di fusione, del polinucleotide, del vettore, della vescicola extracellulare, della nanoparticella o della composizione farmaceutica di una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, preferibilmente vengono somministrati al soggetto una pluralit? di antigeni immunogeni, preferibilmente gli antigeni immunogeni sono espressi dallo stesso vettore, preferibilmente gli antigeni immunogeni vengono espressi da vettori diversi, preferibilmente gli antigeni immunogeni vengono somministrati al soggetto simultaneamente, preferibilmente la malattia o la condizione ? un'infezione virale, preferibilmente la malattia o condizione ? un cancro, preferibilmente la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare, la nanoparticella, o la composizione farmaceutica ? somministrata mediante somministrazione intramuscolare, preferibilmente il metodo comprende inoltre l'elettroporazione immediatamente dopo la somministrazione intramuscolare.
7. Metodo per indurre una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) specifica per l'antigene e/o delle cellule T CD4<+ >specifica per l'antigene in un soggetto che ne ha bisogno, comprendendo:
la somministrazione al soggetto di una quantit? efficace della proteina di fusione, del polinucleotide, del vettore, della vescicola extracellulare, della nanoparticella, o della composizione farmaceutica di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 da 5, preferibilmente viene somministrata al soggetto una pluralit? di antigeni immunogeni, preferibilmente gli antigeni immunogeni sono espressi dallo stesso vettore, preferibilmente gli antigeni immunogeni sono espressi da vettori diversi, preferibilmente gli antigeni immunogeni vengono somministrati al soggetto simultaneamente, preferibilmente il soggetto ha o ? a rischio di infezione virale, preferibilmente il soggetto ha o ? a rischio di cancro, preferibilmente la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare, la nanoparticella o la composizione farmaceutica ? somministrata mediante somministrazione intramuscolare, preferibilmente il metodo comprende inoltre l'elettroporazione immediatamente dopo la somministrazione intramuscolare.
8. Proteina di fusione, comprendente:
dall'N-terminale al C-terminale, (a) un dominio polipeptidico di ancoraggio esosomatico e (b) un dominio polipeptidico di antigene immunogeno,
in cui il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >o una proteina Nef<mut >tronca avente una sequenza di amminoacidi selezionata tra le SEQ ID N?: 1-30, e in cui l'antigene immunogeno ha la seguente sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 33 o SEQ ID N?: 36,
preferibilmente il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >avente la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 1, e in cui l'antigene immunogeno ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 33, preferibilmente la proteina di fusione ha la seguente sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 39, preferibilmente il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >avente la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 1, e in cui l'antigene immunogeno ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 36, preferibilmente la proteina di fusione ha la seguente sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 42, preferibilmente il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >tronca avente la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 30, e in cui l'antigene immunogeno ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 33, preferibilmente la proteina di fusione ha la seguente sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 45, preferibilmente il polipeptide di ancoraggio esosomatico ? una proteina Nef<mut >tronca avente la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 30, e in cui l'antigene immunogeno ha la sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 36, preferibilmente la proteina di fusione ha la seguente sequenza di amminoacidi di SEQ ID N?: 48 o un polinucleotide che codifica detta proteina di fusione, preferibilmente il polinucleotide ? DNA, preferibilmente il polinucleotide ha la sequenza nucleotidica delle SEQ ID N?: 38, 41, 44, o 47, preferibilmente il polinucleotide ? RNA o un vettore comprendente almeno uno di detto polinucleotide, in cui il vettore esprime almeno una di detta proteina di fusione, preferibilmente il vettore ? un vettore plasmidico, preferibilmente il vettore ? un vettore virale o una vescicola extracellulare comprendente detta proteina di fusione, detto polinucleotide, o detto vettore, preferibilmente la vescicola extracellulare ? un esosoma o una nanoparticella comprendente detta proteina di fusione, detto polinucleotide, o detto vettore o una composizione farmaceutica comprendente detta proteina di fusione, detto polinucleotide, detto vettore, detta vescicola extracellulare, o detta nanoparticella, e un eccipiente farmaceuticamente accettabile, preferibilmente la composizione ? formulata per la somministrazione intramuscolare.
9. Metodo per trattare o prevenire un'infezione da papillomavirus umano (HPV), comprendendo:
la somministrazione a un paziente che ha o ? a rischio di infezione da HPV di una quantit? efficace della proteina di fusione, del polinucleotide, del vettore, della vescicola extracellulare, della nanoparticella o della composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, preferibilmente vengono somministrati al paziente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16, preferibilmente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi dallo stesso vettore, preferibilmente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi da vettori diversi, preferibilmente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 vengono somministrati al paziente simultaneamente, preferibilmente la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare, la nanoparticella o la composizione farmaceutica viene somministrata mediante somministrazione intramuscolare, preferibilmente il metodo comprende inoltre l'elettroporazione immediatamente dopo la somministrazione intramuscolare o
un metodo per indurre una risposta dei linfociti T citotossici (CTL) e/o delle cellule T CD4<+ >specifica per l'antigene in un paziente che ha o ? a rischio di infezione da HPV, comprendendo:
la somministrazione a un paziente che ha o ? a rischio di infezione da HPV di una quantit? efficace della proteina di fusione, del polinucleotide, del vettore, della vescicola extracellulare, della nanoparticella o della composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, preferibilmente vengono somministrati al paziente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16, preferibilmente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi dallo stesso vettore, preferibilmente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 sono espressi da vettori diversi, preferibilmente gli antigeni E6 ed E7 di HPV16 vengono somministrati al paziente simultaneamente, preferibilmente la proteina di fusione, il polinucleotide, il vettore, la vescicola extracellulare, la nanoparticella o la composizione farmaceutica viene somministrata mediante somministrazione intramuscolare, preferibilmente il metodo comprende inoltre l'elettroporazione immediatamente dopo la somministrazione intramuscolare.
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