CN104736555B

CN104736555B - 结核分枝杆菌疫苗

Info

Publication number: CN104736555B
Application number: CN201380054841.4A
Authority: CN
Inventors: 克劳斯·埃格德; 艾达·罗森克兰达斯; 特吕克·蒂·吉姆·坦·候昂; 彼得·安德森
Original assignee: National Serum Institute
Current assignee: National Serum Institute
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2033-10-18
Also published as: WO2014063704A8; US20150290311A1; JP6470179B2; WO2014063704A2; IN2015DN03962A; ZA201503467B; CN104736555A; US9526773B2; EP2912056B1; BR112015009070A2; WO2014063704A3; EP2912056A2; JP2015536309A

Abstract

本发明针对：针对由毒性分枝杆菌，例如由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、鳍足动物分枝杆菌或曼奇分枝杆菌造成的感染的融合蛋白、抗原混合物以及免疫组合物，如疫苗。这些融合蛋白或抗原混合物是基于ESX分泌性的或相关的蛋白质，例如由ESAT‑6分泌系统1(ESX‑1)分泌的蛋白质，它们属于最免疫显性的结核分枝杆菌(MTB)抗原之中。

Description

结核分枝杆菌疫苗

发明领域

本发明披露了基于来源于结核分枝杆菌的Esx-1相关多肽和esx家族多肽的新免疫原性组合物。

一般背景

对结核分枝杆菌的免疫性的特征在于一些基本特征；特异性致敏的T淋巴细胞介导保护，并且最重要的介体分子似乎是干扰素γ(IFN-γ)。

结核分枝杆菌保持以及分泌数种可能相关的蛋白质以用于产生一种新的TB疫苗。在1998年，科尔(Cole)等人公开结核分枝杆菌的全基因组序列并且预测存在约4000个开放阅读框¹。然而重要地，这种序列信息无法用以预测DNA是否被翻译并且在体内表达为蛋白质。该基因组序列已经广泛地用以设计DNA阵列以用于RNA表达分析和蛋白质组研究以鉴别表达的蛋白质。即使具有大量的表达数据并且计算机模拟预测工具显著改进，仍不可能肯定地预测既定序列将编码免疫原性分子。确定在结核分枝杆菌感染期间或之后分子是否被免疫系统识别的唯一方式是产生既定分子并且在一个如在此所描述的适当分析中测试它。

当前在临床试验中存在数种新的TB疫苗。然而，它们主要是基于在感染的早期表达的有限数目的抗原的经典预防性疫苗。作为表达动态的直接后果，呈递给T细胞的表位模式随时间推移根本上变化-暗示新的疫苗应如何设计。例如对于瞬时表达的早期抗原Ag85B，两个独立T细胞转移研究已经显示，在感染之后3-4周，Ag85B不再呈递给T细胞并且因此在感染的这个或后来的时间点不存在细胞因子、趋化因子等的Ag85B特异性产生^2，3。因此，对于与宿主建立长期共存性的慢性疾病来说，接种疫苗并且诱导对仅在感染的短暂时间段期间表达的蛋白质中的表位具有特异性的记忆T细胞的价值有限。

因此对于疫苗开发，至关重要的是鉴别在感染的后期高度表达的抗原并且在这些抗原之中选择免疫原性的并且可以促进保护的抗原，并且将这种特殊子集的蛋白质包括于TB疫苗中。通过这样做，不仅可能提高疫苗效价和表位覆盖，而且靶向潜伏感染。

分枝杆菌分泌系统造成蛋白质输出到细胞外环境中。结核分枝杆菌具有数种不同类型的分泌系统，其中ESX分泌系统(VII型)对于本发明是相关的。结核分枝杆菌具有这些系统中的五个，称为ESX-1到ESX-5。结核分枝杆菌的6-kDa早期分泌抗原标靶(ESAT-6)和10-kDa培养滤液抗原(CFP-10)是由ESAT-6分泌系统1(ESX-1)分泌的蛋白质，并且属于最免疫显性的结核分枝杆菌(MTB)抗原之中。这些属性使其对于结核(TB)疫苗开发是重要的。基于这种了解，我们测试其他ESX-1相关的蛋白质作为可能的TB疫苗抗原。

发明概述

本发明涉及通过使用一种融合蛋白或抗原混合物来预防和治疗由结核复合体的菌种(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、鳍足动物分枝杆菌、曼奇分枝杆菌)造成的感染，该融合蛋白或抗原混合物包含选自ESX-1相关多肽和esx家族多肽(可能包括潜伏多肽)的结核分枝杆菌抗原。融合蛋白或抗原混合物优选地与佐剂和/或免疫调节剂一起用于疫苗中。

发明的详细披露

本发明披露一种融合蛋白或抗原混合物，它包含选自以下的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO.1(ESAT6)、SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQID NO 4(Rv3865)、SEQ ID NO 5(Rv3849)以及SEQ ID NO 6(Rv3872)，或

(b)SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQID NO 5(Rv3849)以及SEQ ID NO 6(Rv3872)，或

(c)SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQID NO 5(Rv3849)、SEQ ID NO 6(Rv3872)以及SEQ ID NO 7(Rv3616)，或

(d)SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQID NO 5(Rv3849)、SEQ ID NO 6(Rv3872)、SEQ ID NO7(Rv3616)以及SEQ ID NO 8(Rv3881c)，或

(e)SEQ ID NO 2(Rv3614c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)、SEQ ID NO 4(Rv3865)、SEQID NO 5(Rv3849)、SEQ ID NO 6(Rv3872)以及SEQ ID NO 8(Rv3881c)，或

(f)SEQ ID NO 9(Rv3891c)、SEQ ID NO 10(Rv3890)、SEQ ID NO 11(Rv0287)、SEQID NO 12(Rv0288)、SEQ ID NO 13(Rv3620c)以及SEQ ID NO 14(Rv3619)，或

(g)SEQ ID NO 11(Rv0287)、SEQ ID NO 12(Rv0288)、SEQ ID NO 13(Rv3620c)、SEQ ID NO 14(Rv3619)、NO 7(Rv3616c)以及SEQ ID NO 3(Rv3615c)，或

(h)SEQ ID NO 11(Rv0287)、SEQ ID NO 12(Rv0288)、SEQ ID NO 13(Rv3620c)、SEQ ID NO 14(Rv3619)、NO 7(Rv3616c)、SEQ ID NO 3(Rv3615c)以及SEQ ID 9(Rv3881c)，或

(i)SEQ ID NO 1(ESAT6)、SEQ ID NO 15(Ag85B)以及SEQ ID NO 16(Rv1284)，或

(j)与(a)-(i)中的序列中的任一者具有至少80％序列一致性并且同时免疫原性的氨基酸序列类似物。

根据本发明的融合蛋白中的半胱氨酸优选地已经被另一种氨基酸置换以避免硫桥形成和蛋白质聚集。一种优选的置换氨基酸是丝氨酸。

根据本发明的融合蛋白的融合伴侣优选地与连接子分子连接以允许蛋白质折叠和二聚体形成。

优选的根据本发明的融合蛋白提出为SEQ ID NO 18(H64)、SEQ ID NO 19(H68)、SEQ ID NO 20(H69)、SEQ ID NO 21(H70)、SEQ ID NO 22(H71)、SEQ ID NO 23(H65)、SEQID NO 24(H72)、SEQ ID NO 25(H73)或SEQ ID NO 26(H67)。

本发明的另一个实施例是使用一种根据本发明的抗原混合物，例如以上所提到的氨基酸序列(a)-(i)(包含SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15以及16)，而不将多肽融合在一起。

一种优选的抗原混合物包含SEQ ID NO 16和H1(SEQ ID NO 17)，其中H1是SEQ IDNO 1与SEQ ID NO 15之间的一种融合体。

在再另一个实施例中，本发明披露一种免疫原性组合物或药物组合物，包含如在此所定义的优选地呈一种疫苗形式的一种融合蛋白或抗原混合物。

在另一个实施例中，本发明披露一种用于使一种动物、包括一名人类针对由毒性分枝杆菌、例如由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、坎纳分枝杆菌、鳍足动物分枝杆菌或曼奇分枝杆菌造成的结核免疫的方法，包括向该动物给予如在此所定义的多肽、根据本发明的免疫原性组合物或根据本发明的疫苗。

根据本发明的疫苗、免疫原性组合物以及药物组合物可以预防上用于未感染一种毒性分枝杆菌的一个受试者或治疗上用于已经感染一种毒性分枝杆菌的一个受试者。

定义

多肽

本发明中的词语“多肽”应具有其常用含义。它是具有任何长度的一条氨基酸链，包括全长蛋白质、寡肽、短肽以及其片段，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。

多肽可以通过糖基化、通过脂化(例如通过用如莫厄特(Mowat)等人1991所描述的棕榈酰氧基琥珀酰亚胺或用如卢斯蒂格(Lustig)等人1976所描述的十二酰氯进行化学脂化)、通过包含辅基或通过含有额外氨基酸(如例如一种纯化标签(例如his标签)或一种信号肽)而被化学修饰。纯化标签被用以获得高度纯的蛋白质制剂，并且例如His标签包含甲硫氨酸作为第一氨基酸，接着在使用N末端时是6-8个组氨酸，并且在使用C末端时是6-8个组氨酸接着是一个终止密码子。当使用N末端时，编码多肽融合体的基因中的甲硫氨酸起始密码子可以缺失以避免假翻译起始位点。在基因含有通常对应地编码缬氨酸和白氨酸的替代性起始密码子GUG或UUG之一时同样如此，但作为一种起始密码子，它们翻译为甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。

每种多肽由一种特异性核酸序列编码。应理解，此类序列包括其类似物和变异体，其中此类核酸序列已经通过取代、插入、添加或缺失一种或多种核酸而被修饰。取代优选地是密码子使用中的沉默取代，这将不会导致氨基酸序列有任何变化，但可以引入以促进蛋白质的表达。

分泌系统

VII型分泌系统(T7SS)是在细菌分泌系统中的一个最近发现，它首先鉴别于结核分枝杆菌中。相对应的基因簇被称为ESX(ESAT-6分泌系统)区^4-6。结核分枝杆菌H37Rv的基因组含有五个基因簇，它们已经通过基因复制事件而演化并且包括T7SS分泌机构的组分。这些簇被称为ESAT-6分泌系统(ESX)1到5。ESX系统已经显示分泌不具有经典信号肽的蛋白质。此外，由ESX1-5分泌的大多数蛋白质对于分泌遵循成对依赖性⁷。

Esx家族

除了Rv3017c(esxR)，编码ESAT-6家族蛋白质的基因被安排在结核分枝杆菌H37Rv染色体上11个基因座处串联对中并且通常前面是pe-ppe基因对。它们编码约100个氨基酸长度并且由ESX1-5系统分泌的蛋白质。

在本说明书通篇，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”或其变化形式(如“包含了(comprises)”或“包含着(comprising)”)将理解为暗示包括一个陈述的元件或整数或者元件或整数组但不排除任何其他元件或整数或者元件或整数组。

一种免疫原性多肽被定义为诱导一种生物样品或当前或先前感染一种毒性分枝杆菌的一名个体中的一种免疫反应的一种多肽。

免疫反应可以通过以下方法之一来监测：

·一种体外细胞反应通过由从当前或先前感染毒性分枝杆菌的一种动物或人类抽取的淋巴细胞释放一种相关细胞因子(如IFN-γ)，或通过检测这些T细胞的增殖来测定。诱导通过以下方式进行：添加多肽或免疫原性部分到包含从1×10⁵个细胞到3×10⁵个细胞/孔的一种悬浮液中。将细胞从血液、脾、肝或者肺中分离，并且添加多肽或免疫原性部分，产生不超过20μg/ml悬浮液的一个浓度，并且进行刺激从两天到五天。为了监测细胞增殖，将细胞用放射性标记的胸苷脉冲，并且在16-22小时的孵育之后，通过液体闪烁计数检测增殖。一种阳性反应是大于本底加两个标准差的一种反应。IFN-γ的释放可以通过ELISA方法测定，该方法为本领域的普通技术人员所熟知。一种阳性反应是大于本底加两个标准差的一种反应。当监测对多肽的免疫反应时，不同于IFN-γ的细胞因子可以是相关的，如IL-12、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-β。用于测定一种细胞因子(例如IFN-γ)的存在的另一种并且更灵敏的方法是ELISPOT方法，其中将从血液、脾、肝或者肺中分离的细胞稀释到优选1到4×10⁶个细胞/毫升的一个浓度，并且在多肽或免疫原性部分存在下孵育18-22小时，产生不超过20μg/ml的一个浓度。此后将细胞悬浮液稀释到1到2×10⁶/ml，并且转移到涂布有抗IFN-γ的Maxisorp板，并且孵育优选地4到16小时。产生IFN-γ的细胞通过使用被标记的二级抗IFN-γ抗体和一种相关底物来测定，产生斑点，这些斑点可以使用一个解剖显微镜进行计数。还可能的是通过使用PCR技术测定编码相关细胞因子的mRNA的存在。通常一种或多种细胞因子将利用例如PCR、ELISPOT或ELISA测量。本领域的普通技术人员应了解，这些细胞因子中的任一者的量由一种特异性多肽诱导的显著增加或减少可以用于评估多肽的免疫活性。

·一种体外细胞反应还可以通过使用来源于一名免疫个体或一个被结核分枝杆菌感染的人的T细胞系来测定，其中已经在添加IL-2的情况下用活分枝杆菌、来自细菌细胞的提取物或者培养滤液驱动T细胞系10天到20天。诱导通过以下方式进行：添加不超过20μg多肽/ml悬浮液到含有从1×10⁵个细胞到3×10⁵细胞个/孔的T细胞系中，并且进行孵育从两天到六天。IFN-γ的诱导或另一种相关细胞因子的释放通过ELISA来检测。T细胞的刺激还可以如上文所描述通过使用放射性标记的胸苷检测细胞增殖来监测。对于两种分析，一种阳性反应都是大于本底加两个标准差的一种反应。

·一种体内细胞反应可以按在皮内注射或局部施用贴片至多100μg的多肽或免疫原性部分到临床或亚临床感染一种毒性分枝杆菌的一名个体之后的一种阳性DTH反应形式测定，一种阳性反应在注射或施用之后具有至少5mm的一个直径72-96小时。

·一种体外体液反应通过一名免疫或被感染的个体中的一种特异性抗体反应来测定。抗体的存在可以通过一种ELISA技术或一种蛋白质印迹法测定，其中多肽或免疫原性部分被吸收到或者一个硝酸纤维膜或者一个聚苯乙烯表面。将血清优选地在PBS中从1:10稀释到1:100，并且添加到被吸收的多肽中，并且进行孵育从1到12小时。通过使用被标记的二级抗体，可以通过例如通过ELISA测量OD来测定特异性抗体的存在，其中一种阳性反应是大于本底加两个标准差的一种反应或可替代地一种蛋白质印迹法中的一种视觉反应。

·另一种相关参数是动物模型中的在用一种佐剂中的多肽接种疫苗之后或在DNA疫苗接种之后诱导的保护的量度。适合的动物模型包括灵长类动物、天竺鼠或小鼠，用一种毒性分枝杆菌的感染对其进行攻击。诱导的保护的读出可以是与未被接种疫苗的动物相比的标靶器官中细菌负荷降低、与未被接种疫苗的动物相比的延长存活时间以及与未被接种疫苗的动物相比的减小体重减轻。

免疫原性部分

在本发明的一个优选实施例中，多肽包含多肽的一种免疫原性部分，如一种B细胞或T细胞的一种表位。一种多肽的免疫原性部分是多肽的通过在此所描述的生物分析中的任一者所测定引发一种动物或一名人类中和/或一种生物样品中的一种免疫反应的一个部分。一种多肽的免疫原性部分可以是一种T细胞表位或一种B细胞表位。免疫原性部分可以与多肽的一个或几个相对小的部分相关，它们可以散开遍及多肽序列或位于多肽的特定部分中。对于几种多肽，表位甚至已经被展示为散开遍及多肽，涵盖全序列(拉夫恩(Ravn)等人1999)。

为了鉴别在一种免疫反应期间识别的相关T细胞表位，有可能使用一种“强力”方法：因为T细胞表位是线性的，所以多肽的缺失突变体在系统地构筑时将显示多肽的什么区域在免疫识别中是必需的，例如通过使这些缺失突变体经历例如在此所描述的IFN-γ分析。另一种方法利用重叠寡肽来检测MHC II类表位，优选地合成的，具有例如20个来源于多肽的氨基酸残基的长度。这些肽可以在生物分析(例如如在此所描述的IFN-γ分析)中进行测试，并且这些肽中的一些将给出一种阳性反应(并且由此是免疫原性的)，是肽中存在一种T细胞表位的证据。对于MHC I类表位的检测，有可能预测将结合的肽(斯特林(Stryhn)等人1996)并且此后合成产生这些肽并且在相关生物分析(例如如在此所描述的IFN-γ分析)中测试其。肽优选地具有例如8到11个来源于多肽的氨基酸残基的长度。B细胞表位可以通过分析对涵盖所关注的多肽的重叠肽的B细胞识别来测定，如例如哈博(Harboe)等人1998中所描述。

尽管一种T细胞表位的最小长度已经显示是至少6个氨基酸，但通常此类表位由更长延伸的氨基酸构成。

多肽的免疫原性部分可以通过遗传异种人类群体的广泛部分(高频率)或微小部分(低频率)识别。另外，一些免疫原性部分诱导高免疫反应(显性)，而其他诱导更低但仍显著的反应(亚显性)。高频率〉〈低频率可以与结合到广泛分布的MHC分子(HLA型)或甚至多重MHC分子的免疫原性部分相关(基尔古斯(Kilgus)等人1991，西尼加利亚(Sinigaglia)等人1988)。

然而，在提供用于一种针对结核的新疫苗的候选分子的情况下，亚显性表位与显性表位一般相关，因为已经显示(WO2008000261)此类表位可以无关于亚显性而诱导保护。

本发明的多肽的一种常见特征是其诱导一种免疫反应的能力，如实例中所示。应理解，一种本发明的多肽通过取代、插入、添加或缺失而产生的一种变异体通过在此所描述的分析中的任一者所测定也是免疫原性的。

融合蛋白

术语“融合蛋白”被理解为来自结核分枝杆菌的两种或更多种免疫原性多肽的一个随机顺序或其类似物，用或不用一个或多个任意长度和序列的氨基酸连接子/间隔子融合在一起。为了避免下游产生中的蛋白质聚集，融合蛋白中的所有半胱氨酸都可以被任何氨基酸置换，但丝氨酸由于其与半胱氨酸的高构造类似性而是优选的取代物。

连接子

连接子或间隔子是存在于一种融合蛋白中的多肽伴侣之间的短肽序列。连接子通常由柔性残基(如甘氨酸和丝氨酸)组成，以便相邻蛋白质结构域相对于彼此自由移动并且在分泌/制造期间独立适当折叠。当需要确保两个相邻结构域不空间干扰彼此时，使用较长连接子。

旁系同源物、直系同源物以及同源物

术语“旁系同源物”被理解为由于共有的世系、接着一个或多个复制事件而共有一些程度的同源性的蛋白质或基因。旁系同源物是通过在一种基因组内复制而相关的基因，而直系同源物是不同物种中通过物种形成从一种共同上代基因演化的同源基因。术语同源物适用于通过物种形成的事件分离的基因之间的关系(直系同源物)或通过遗传复制的事件分离的基因之间的关系(旁系同源物)。

类似物

术语序列类似物意指结构上并且免疫原性上类似于彼此但氨基酸组成不同的多肽。

疫苗

本发明的另一部分涉及一种疫苗组合物，包含一种根据本发明的融合蛋白。在用一种毒性分枝杆菌攻击之后，其中一种本发明融合蛋白由动物识别的一种有效疫苗在一种动物模型中与未被接种疫苗的动物相比将能够降低标靶器官中细菌负荷、延长存活时间和/或减小体重减轻。

为了确保这种疫苗组合物的最优性能，优选的是它包含一种免疫学上和药学上可接受的载剂、媒剂或佐剂。

适合载剂选自下组，该组由以下各项组成：一种或多种多肽通过疏水非共价相互作用而结合的一种聚合物，如一种塑料，例如聚苯乙烯；或一种或多种多肽共价结合的一种聚合物，如一种多糖或一种多肽，例如牛血清白蛋白、卵白蛋白或钥孔贝血蓝蛋白。适合媒剂选自下组，该组由以下各项组成：一种稀释剂和一种悬浮剂。佐剂优选地选自下组，该组由以下各项组成：阳离子脂质体(例如二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA))、Quil A、聚I:C、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFN-γ、IL-2、IL-12、单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯(TDB)、胞壁酰二肽(MDP)以及单霉菌酰甘油(MMG)或其组合。

实现用于疫苗的佐剂效应的其他方法包括使用药剂，如氢氧化铝或磷酸铝(矾)、糖的合成聚合物(Carbopol)；通过热处理使蛋白质在疫苗中聚集；通过用针对白蛋白的被胃蛋白酶处理的(Fab)抗体再活化而聚集；还可以使用与革兰氏阴性细菌的细菌细胞(如微小隐孢子虫)或内毒素或脂多糖组分的混合物、生理学上可接受的油媒剂(如二缩甘露醇单油酸酯(Aracel A))中的乳液或具有20％全氟化碳溶液(Fluosol-DA)用作一种封闭取代物的乳液。其他可能性涉及使用免疫调节物质，如细胞因子或合成IFN-γ诱导剂，如聚I:C，与以上提及的佐剂组合。

用于实现佐剂效应的另一种令人感兴趣的可能性是使用戈瑟兰(Gosselin)等人，1992(它特此通过引用结合在此)中描述的技术。简单来说，一种相关抗原，如一种本发明的抗原可以结合到针对单核细胞/巨噬细胞上的Fcγ受体的一种抗体(或抗原结合抗体片段)。

疫苗以与投药配制品相容的一种方式并且以将治疗有效并且免疫原性的一种量给予。待给予的量取决于待治疗的受试者，包括例如个体的免疫系统建立一种免疫反应的能力和所希望的保护程度。适合剂量范围约是几百微克活性成分/疫苗接种，一个优选的范围从约0.1μg到1000μg，如在从约1μg到300μg范围中，并且尤其在从约10μg到50μg范围中。用于初始给药和加强剂量的适合方案也是可变的，但特点是一个初始给药，接着后续接种或其他给药。

施用方式可以广泛变化。用于给予一种疫苗的常规方法中的任一者是适用的。这些方法被认为包括在一种固体生理学上可接受的基质上或在一种生理学上可接受的分散液中的口服、不经肠、通过注射等。疫苗的剂量将取决于给药途径并且将根据待接种疫苗的人的年龄并且较小程度上根据待接种疫苗的人的身材而不同。

疫苗常规地不经肠、通过例如或者皮下或者肌内注射而给予。适用于其他给药方式的额外配制品包括栓剂，并且在一些情况下，包括口服配制品。对于栓剂来说，传统粘合剂和载剂可以包括例如聚烷撑二醇或甘油三酯；此类栓剂可以由含有0.5％到10％、优选地1-2％范围中的活性成分的混合物形成。口服配制品包括通常使用的赋形剂，如例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物呈溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放配制品或散剂形式并且有利地含有10-95％、优选地25-70％的活性成分。

在许多情况下，将需要多次给予疫苗。尤其，疫苗可以被给予以预防一种毒性分枝杆菌感染和/或治疗确定的分支杆菌感染。当给予以预防一种感染时，疫苗在存在一种感染的确定临床征象或症状之前预防地给出。

本发明还涉及一种用于使一种动物、包括一名人类针对由毒性分枝杆菌造成的TB免疫的方法，包括向该动物给予本发明的多肽或一种如上文所描述的本发明的疫苗组合物或一种上文描述的活疫苗。

治疗性疫苗.

本发明还涉及一种本发明的融合蛋白的用途，基于当以一种疫苗形式给予时其减轻实验动物中的结核分枝杆菌感染的严重性或预防前一感染的再活化的能力而用作治疗性疫苗。用于治疗性疫苗的组合物可以如上文关于疫苗所描述而制备。

H64、H68、H69、H70以及H71：包含ESX-1相关多肽的融合蛋白

分枝杆菌分泌系统造成毒性因子输出或者到细胞外环境或者直接到宿主细胞中，并且因此在细菌的毒性和存活中起一种至关重要的作用。ESX-1分泌系统的部分在对减毒的牛分枝杆菌BCG和病原性分支杆菌种进行比较基因组分析期间被鉴别出⁸。主要基因组差异之一是牛分枝杆菌基因组中的一个重大缺失，它包括编码分泌性抗原CFP10和ESAT-6的区。观察到这个区尤其造成该区的毒性和恢复，不仅实现ESAT-6的分泌，而且导致牛分枝杆菌BCG的毒性增加⁴。

ESX-1分泌系统在包括结核分枝杆菌复合体内的所有病原性分枝杆菌的缓慢生长分枝杆菌之中是保守的，并且为分枝杆菌体内存活所需。分泌性效应分子的功能为起始肉芽肿形成和吞噬体成熟所需，为从吞噬体逃逸、细胞溶解和细胞到细胞扩散、通过卡斯蛋白酶活化的细胞凋亡以及通过干扰TLR2信号传导的免疫调节所必需^6，9。

现今我们知晓ESX-1分泌系统由三个不同基因座编码，ESX-1基因座、espA操纵子以及用于转录调节因子EspR的基因座^10，11。参与ESX-1分泌的组分的确切数目仍在讨论中，并且似乎在不同分支杆菌种之间不同。当前以下结核分枝杆菌基因已经显示了与ESX-1系统的关系：espR、espA、espB、espC、espD、espF、esxA、esxB、mycP1、PE35、Rv3862(WhiB6)、Rv3866、Rv3868、Rv3869、Rv3870、Rv3871、Rv3876、Rv3877、Rv3879c、Rv3881c、Rv3882c以及MCE1蛋白质Mce1B、Mce1C、MCe1F和Rv0177 ^12，13。

六种实验验证的ESX-1底物Rv3616c(EspA)、Rv3615c(EspC)、Rv3849(EspR)、ESAT-6、CFP-10以及Rv3881c(EspB)对于分泌互相依赖于彼此⁷。

所有已知ESX-1分泌性底物都是在感染的不同阶段高度表达的强抗原，与例如Ag85和其他代谢相关抗原形成对比，它们在感染之后不久下调。

考虑到在感染期间不同时间点的高表达和许多ESX-1相关蛋白质的高免疫原性，我们基于六种ESX-1相关蛋白质制造H64骨架融合蛋白，并且由此骨架制造H68、H69、H70以及H71融合蛋白。

H64融合蛋白由三种实验证实的ESX-1底物(ESAT-6、EspR、EspC)加三种与ESX-1相关的分泌性蛋白(EspD、PE35以及EspF)组成。H64融合体中的蛋白质的顺序是：ESAT-6、EspD、EspC、EspF、EspR、PE35，但可以使用任何其他顺序。H64由716个氨基酸组成，理论分子量是75698g/mol，并且等电点4.56。在从结核分枝杆菌染色体编码的野生型序列中，在EspD、EspC以及EspR中存在一个半胱氨酸。为在再折叠期间避免硫桥形成和蛋白质聚集的问题，全部三个半胱氨酸都已经被氨基酸丝氨酸置换。

关于H64中的单个蛋白质的信息：

ESAT-6(Rv3875)与CFP10一起经由ESX-1以一种异源二聚体形式分泌¹⁴。

EspR(Rv3849)是其自身表达的一种转录活化子和一种操纵子，它包括EspA(Rv3616c)、C以及D。EspR蛋白质经由ESX-1¹⁵分泌。

EspC(Rv3615c)基因表达由EspR调节。EspC由ESX-1分泌¹¹。

EspD(Rv3614c)基因表达由EspR调节。EspD与espC共转录。EspD表达而非分泌为EsxA分泌所需。EspD使EspA-EspC复合体稳定。EspD分泌不排他性地需要ESX-1系统¹⁶。

PE35(Rv3872)是一种分泌性PE蛋白。基因pe35(Rv3872)的失活削弱CFP-10和ESAT-6的表达，表明在调节中的一个作用。

EspF(Rv3865)是一种分泌性蛋白。EspF的氨基酸序列与EspC 36％一致。EspF蛋白质的失活导致分枝杆菌减毒，证实其对于存活的重要性。结核分枝杆菌EspF突变体的减毒并不由ESAT-6分泌的缺乏造成，而实际上由ESX-1系统的另一种仍未知的功能的中断造成¹⁷。

H68融合蛋白包含与H64相同的蛋白质，不同之处在于ESAT-6归因于其在结核诊断中的重要性而在这种构筑体中被省去：Rv3614c-Rv3615c-Rv3865-Rv3849-PE35。

H69融合蛋白包含与H68相同的蛋白质，但添加有EspC(Rv3616c)：Rv3614c-Rv3615c-Rv3616c-Rv3865-Rv3849-PE35。

关于H69中的额外蛋白质的信息

EspC(Rv3616c)基因表达由EspR调节。EspC由ESX-1分泌¹¹。

H70融合蛋白包含与H69相同的蛋白质，但添加有EspB(Rv3881c)：Rv3881c-Rv3614c-Rv3615c-Rv3616c-Rv3865-Rv3849-PE35。

关于H70中的额外蛋白质的信息

EspB(Rv3881c)由ESX-1分泌系统分泌。在分泌过程期间，它通过膜锚定的蛋白酶MycP1裂解¹⁸。

H71融合蛋白包含与H68相同的蛋白质，但添加有EspB(Rv3881c)：Rv3881-Rv3614-Rv3615-Rv3865-Rv3849-PE35。

H65、H72以及H73：包含ESAT-6家族多肽的融合蛋白

来自分枝杆菌的数种分泌性蛋白已经显示诱导强细胞免疫反应¹⁸。来自结核分枝杆菌的两种最常被识别的T细胞抗原是小分泌性蛋白ESAT-6(6kDa的早期分泌抗原标靶)和CFP-10(10kDa的培养滤液蛋白)，Esx家族的原型¹⁹。编码ESAT-6和CFP-10的基因与彼此直接相邻定位并且共转录²⁰。结核分枝杆菌H37Rv基因组序列的分析展现11对编码旁系同源ESAT-6家族蛋白质的串联基因¹。

ESAT-6(esx)家族具有23个成员(11个基因对和一个单独的，Rv0287、Rv0288、Rv1037c、Rv1038c、Rv1197、Rv1198、Rv1792、Rv1793、Rv2346c、Rv2347c、Rv3017c、Rv3019c、Rv3020c、Rv3444c、Rv3445c、Rv3619c、Rv3620c、Rv3874、Rv3875、Rv3890c、Rv3891c、Rv3904c以及Rv3905c)。序列一致性在Esx蛋白质之间从35％到98％变化，但它们全部属于WXG100家族，特征在于约100个氨基酸的大小并且存在一种Trp-Xaa-Gly(W-X-G)基序²¹。因此，ESAT-6家族成员的确切生物功能远远未知，但它们是毒性因子。

ESAT-6与CFP10相互作用以形成1:1杂二聚体，它为其经由ESX-1分泌系统分泌所必需²²。由两种其他旁系同源基因对EsxR-EsxS和EsxH-EsxG编码的蛋白质也形成1:1复合体，表明这可以是所有Esx蛋白质偶联体的典型特征^23，24。

EsxH-EsxG复合体由ESX-3分泌。它们为体外生长所必需，参与铁/锌内稳定^25，26，并且由铁依赖性转录抑制子IdeR和锌吸收调节因子Zur调节^27，28。

ESX-5已知为海分枝杆菌中的PE和PPE蛋白的分泌和巨噬细胞颠覆所需^29，30。最可能，它还造成五种ESAT-6旁系同源物esxl(rv1037c)、esxL(rv1198)、esxO,(rv2346c)、esxV(rv3619c)以及五种CFP10旁系同源物esxJ(rv1038c)、esxK(rv1197)、esxP(rv2347c)、esxW(rv3620c)的分泌。在海分枝杆菌中，ESX-5介导的蛋白质分泌的功能是建立一种中度并且持续的感染³¹。ESX-5不足的海分枝杆菌是高毒性的，ESX-5还见于结核分枝杆菌中。

ESX-2和ESX-4的功能保持未知的，但基于与其他ESX分泌系统的功能和物理同源性，它们有可能对应地分泌esxC-esxD和esxT-esxU复合体。

因为ESAT-6家族蛋白质在一种结核分枝杆菌感染期间是高度表达的，是高度免疫原性的，并且实验数据支持其在疫苗接种之后的保护性功效^32，33，所以我们基于六种ESAT-6家族蛋白质构筑H65融合蛋白。为了使得疫苗与当前诊断测试相容，不包括最突出的家族成员ESAT-6和CFP10。

H65融合体中的ESAT-6蛋白质的顺序是：Rv3891c-Rv3890c-Rv0287-Rv0288-Rv3620c-Rv3619c，但可以使用任何顺序。在3个蛋白偶联中的每一者之间，插入9氨基酸GLVPRGSTG连接子序列以允许蛋白质折叠和二聚体形成。在Rv3890c与Rv0287之间插入20氨基酸LIGAHPRALNWKFGGAAFL连接子，并且在Rv0288与Rv3630c之间插入20氨基酸LGFGAGRLRGLFTNPGSWRI连接子。两种20氨基酸连接子的序列都来自Rv1886结核分枝杆菌HRv37蛋白质序列并且对应于这种蛋白质中的氨基酸位置61-80和161-180³⁴。包括这些连接子，因为它们已经显示是人类表位并且因为T细胞响应于这些连接子分泌大量细胞因子IL-2。IL-2为T细胞变成效应T细胞的生长、增殖以及分化所需。除了增加疫苗诱导的T细胞池的多样性之外，这些IL-2分泌性T细胞可以提供细胞因子，有助于其他T细胞在其分化中从原始成为效应T细胞。

H72融合体中的ESAT-6蛋白质的顺序是：Rv3616c-Rv3615c-Rv3620c-Rv3619c-Rv0287-Rv0288-，但可以使用任何顺序。

H73融合体中的ESAT-6蛋白质的顺序是Rv3881c-Rv3616c-Rv3615c-Rv3620c-Rv3619c-Rv0287-Rv0288-，但可以使用任何顺序。

H67：包含一种潜伏多肽的一种融合蛋白Ag85B-ESAT6-Rv1284

H1疫苗，Ag85B与ESAT-6的一种蛋白质融合体(Ag85B-ESAT6)是一种非常高效的针对一种初次感染的疫苗，但归因于两种抗原的表达谱，它在感染的较早阶段期间具有其初始效应。为了开发在早期和晚期感染(持续和从潜伏期再活化)两者中都有效的一种疫苗，使H1融合蛋白富集有Rv1284。表达研究已经显示，Rv1284在模拟晚期感染的体外条件下强表达。因此通过添加Rv1284，应可能不仅增加H1在早期感染阶段中的保护性功效，而且将功效延伸到感染的后期。

我们基于Ag85B、ESAT-6以及R1284设计H67融合蛋白，它反映蛋白质的顺序，但可以使用任何多肽顺序。H67由549个氨基酸组成，理论分子量是59548g/mol，并且等电点5.36。在从结核分枝杆菌染色体编码的野生型序列中，在Ag85B中存在三个半胱氨酸，并且在Rv1284中存在三个半胱氨酸。为在再折叠期间避免硫桥形成和蛋白质聚集的问题，全部三个半胱氨酸都已经被氨基酸丝氨酸置换。

关于H67中的单个蛋白质的信息：

Ag85B(Rv1886c)是霉菌酰转移酶85B，一种细胞外蛋白质，并且选择为融合蛋白中的最具免疫原性的蛋白质，特征在于Ag85B表达有一个初始瞬态增加，但在10天感染之后细菌Ag85B表达的水平已经下降约15倍/CFU，并且这种低水平在感染后维持至少多达100天³⁵。

ESAT-6(Rv3875)与CFP10一起经由ESX-1以一种异源二聚体形式分泌。ESX-1底物ESAT-6在感染期间不同时间点展示高表达并且显示出高免疫原性。

Rv1284编码一种β-碳酸酐酶，并且该基因已经显示为结核分枝杆菌所必需。基因的表达先前已经报告在营养饥饿的培养物中的14到40倍增加³⁶。

图例

图1.在用单一抗原预防性疫苗接种之后小鼠中的分支杆菌负荷。在气雾剂攻击之后六周对单个小鼠的肺中的结核分枝杆菌细菌计数。在攻击之前，用单个抗原或BCG对小鼠群组接种疫苗，并且一组接受生理盐水注射。如果在攻击之后六周接种疫苗的群组中的细菌数目显著低于来自生理盐水对照组的动物的肺中(***p<0.01)，那么将单向方差分析(ANOVA)与杜凯多重比较测试的组合用以统计测试。示出每一组的平均值和平均标准误差(SEM)。

图2.在H64疫苗接种之后的免疫反应和分枝杆菌负荷。在用CAF01佐剂(DDA/TDB)中的融合蛋白H64或H56(Ag85B-ESAT6-Rv2660c)进行疫苗接种之后，测试对两种融合体中的单个蛋白质的T细胞反应(A)。读出是在用单一抗原进行三天的体外刺激之后的分泌性IFN-g。在用M.tb攻击之后六周，测量肺中的细菌负担，并且使用单向ANOVA与杜凯多重比较测试的组合在群组之中进行比较(***p<0.01*^*p<0.05)。示出每一组的平均值和SEM。

图3用Rv3614或Rv3615c暴露后疫苗接种产生显著疫苗特异性免疫反应。在疫苗接种之后1周，将获自小鼠的肺的淋巴细胞用以评估疫苗诱导的T细胞免疫反应。读出是在用疫苗抗原，即(A)Rv3614或(B)Rv3615c进行5小时的体外刺激之后在细胞培养物中的细胞因子阳性CD4T细胞(表达IFN-γ、IL-2、TNF-α或者任何组合)的频率。包括TB10.4作为对于感染驱动的免疫反应的一种对照抗原。数据以平均值形式示出并且代表4只小鼠的一个池。

图4.用H64的暴露后疫苗接种。疫苗反应和保护性功效。在用H64进行暴露后疫苗接种之后，测试对单个蛋白质和/或全融合体的T细胞反应(A，B以及D)。读出是在用单一抗原或全融合蛋白进行三天的体外刺激之后的IFN-γ分泌，并且对于接种疫苗的FvB(A)和CB6F1小鼠(D)以及对照小鼠(B)两者进行。(C)M.tb.攻击后37周(最后疫苗接种后21周)，测量肺中的细菌负担，并且使用单向ANOVA与杜凯多重比较测试的组合在群组之间进行比较。示出每一组的平均值和SEM。

图5.在用单一抗原预防性疫苗接种之后小鼠中的结核分支杆菌负荷。在气雾剂攻击之后六周对单个小鼠的肺中的结核分枝杆菌细菌计数。在攻击之前，用单个抗原或BCG对小鼠群组接种疫苗，并且一组接受三次生理盐水注射。在A和B中，使用B6C3F1小鼠品系，并且在C中，使用CB6F1品系。如果在攻击之后六周接种疫苗的群组中的细菌数目显著低于来自生理盐水对照组的动物的肺中(***p<0.01)，那么将单向方差分析(ANOVA)与杜凯多重比较测试的组合用以统计测试。示出每一组的平均值和平均标准误差(SEM)。

图6.将CB6F1小鼠群组或者用H64融合蛋白使用从0.01到25μg/动物/疫苗接种回合的蛋白质剂量接种疫苗三次，或者用5μg的H56融合蛋白接种疫苗。在第三次疫苗接种之后三周，通过用疫苗抗原再刺激来测量脾(A)(n＝3)和血液(B)中的疫苗特异性T细胞反应。在疫苗接种之后六周，用毒性M.tb.菌株Erdman对所有动物进行气雾剂攻击。在感染之后六周，对单个小鼠的肺中的M.tb细菌计数(C)。如果接种疫苗的群组中的细菌数目显著低于来自生理盐水对照组的动物的肺中(***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05)，那么将ANOVA和杜凯多重比较测试用以统计测试。

图7.在用单一抗原预防性疫苗接种之后小鼠中的分支杆菌负荷。在气雾剂攻击之后六周对单个小鼠的肺中的结核分枝杆菌细菌计数。在攻击之前，用Rv3891、Rv3619、Rv3620或BCG对小鼠群组接种疫苗，或使其接受生理盐水注射。将单向方差分析(ANOVA)与杜凯多重比较测试的组合用以在群组之中比较细菌负担(相对于生理盐水组，***p<0.01；**p<0.05)。

图8.ESAT-6家族蛋白质的二聚体融合体。六种融合体的示意性图示(A)。CFP10旁系同源物是Rv3891c、Rv0287、Rv3445c、Rv3620c、Rv3905c或者CFP10。ESAT-6旁系同源物是Rv3890c、Rv0288、Rv3444c、Rv3619c、Rv3904c或者ESAT-6。连接子的氨基酸序列在所有六种构筑体中都是GLVPRGSTG。在CB6F1小鼠(B)和B6C3F1小鼠(C)中进行气雾剂攻击之后六周，测量单个小鼠的肺中的保护性功效。在第三次疫苗接种之后3周，通过刺激分离的PBMC来测定B6C3F1小鼠中的疫苗诱导的反应(D)。每个图展示来自一个疫苗接种组的结果。用或者疫苗抗原或者一种对照蛋白质(BSA)刺激来自每个群组的PBMC。

图9.用H65对B6C3F1小鼠进行疫苗接种。由六种由或者一种9aa连接子(L)或者20aa连接子(LL1和LL2)分隔的ESAT-6家族蛋白质组成的H65融合体的示意性图示(A)。9aa连接子与用于二聚体融合体的连接子一致(GLVPRGSTG)。LL1连接子的序列是LIGAHPRALNWKFGGAAFL并且LL2连接子的序列是LGFGAGRLRGLFTNPGSWRI。通过流式细胞术在第三次H65疫苗接种之后三周分离的脾细胞中针对ESX-2(Rv3891c-Rv3890c)、ESX-3(Rv0287-Rv0288)以及ESX-5(Rv3620c-Rv3619c)二聚体底物中的每一者测量的细胞因子反应(B)。在用H65或BCG预防性疫苗接种之后B6C3F1小鼠中的分支杆菌负荷(C)。在气雾剂攻击之后六周对单个小鼠的肺中的结核分枝杆菌细菌计数。将单向ANOVA与杜凯多重比较测试的组合用以在群组之中比较细菌负担(相对于生理盐水组，*p<0.1)。

图10.CB6F1小鼠中的H65疫苗接种-免疫反应和保护性功效。在用H65/CAF01(A)第三次疫苗接种或用生理盐水第三次注射(B)之后三周分离的脾细胞中细胞因子IFN-γ的抗原特异性分泌。在攻击之后六(C)和二十四(D)周四组CB6F1小鼠中的CFU。

图11.在用H65进行暴露后疫苗接种之后的疫苗诱导的免疫反应。在用H65进行暴露后疫苗接种之后，测试对单个蛋白质和/或全融合体的T细胞反应(A-C)。读出是在对于CB6F1小鼠品系用单一抗原(C)并且在FvB小鼠品系中用单一抗原和全融合蛋白两者进行三天的体外刺激之后的IFN-γ分泌(A：接种疫苗的，和B：对照)。

图12.两种小鼠品系中的Rv1284(canA)疫苗接种。在用或者2μg的Rv1284或Rv0287或者缓冲液对照孵育PBMC 72小时之后，测量细胞培养基中的分泌性细胞因子IFN-γ。在第三次Rv1284/CAF01疫苗接种之后两周，将PBMC从CB6F1小鼠(A)或B6C3F1小鼠(B)中分离。在Mtb攻击之后六周，测量CB6F1小鼠(C)或B6C3F1小鼠(D)中的分枝杆菌数目。

图13.H1+Rv1284疫苗接种。在一个气雾剂Mtb攻击之后六周的FVB小鼠群组中的细菌负荷(CFU)。对小鼠或者用5μg H1(Ag85B-ESAT6)/CAF01、5μg(总)配制于CAF01中的H1(Ag85B-ESAT6)+Rv1284接种疫苗三次或者用生理盐水注射三次(对照组)。

图14.在用抗原Ag85B、ESAT-6或Rv1284进行暴露后疫苗接种之后的免疫反应。在疫苗接种之后1周，将获自小鼠的肺的淋巴细胞用以评估对Ag85B、ESAT6或者Rv1284(都是H67的组分)的疫苗诱导的T细胞免疫反应。读出是在用疫苗抗原进行5小时的体外刺激之后在细胞培养物中的细胞因子阳性CD4T细胞(表达IFN-γ、IL-2、TNF-α或者任何组合)的频率，并且对于(A)Ag85B，(B)ESAT6，以及(C)Rv1284示出。包括TB10.4作为对于感染驱动的免疫反应的一种对照抗原。数据以平均值形式示出并且代表4只小鼠的一个池。

图15.来自对数期并且饥饿条件的培养滤液蛋白的2D DIGE图像。将被编号的蛋白质斑点在用银染色后从2D DIGE凝胶切除，并且使其经历MS鉴别。斑点编号1666和1669对应地通过PMF和MS/MS鉴别为Rv1284。

实例

实例1:一种预防性TB疫苗接种模型中的单一蛋白质和保护

将CB6F1小鼠群组或者用5μg的配制于基于脂质体的佐剂CAF01中的重组蛋白之一接种疫苗三次、用相等体积的盐水(200μL)注射3次或者用BCG接种疫苗一次。疫苗接种之间的间隔是2周，并且在第三次疫苗接种之后六周，用毒性结核分枝杆菌Erdman对所有动物进行气雾剂攻击。在攻击之后六周，将所有小鼠处死，并且通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图1)。用单个ESX-1相关蛋白质Rv3615c、Rv3614c以及Rv3849进行疫苗接种诱导针对结核的相当并且显著的保护，因此不在BCG的水平下。

实例2：一种预防性TB疫苗接种模型中的H64融合蛋白-免疫反应和保护.将CB6F1小鼠群组或者用5μg的配制于基于脂质体的佐剂CAF01中的融合蛋白H56或H64之一接种疫苗三次、用相等体积的盐水(200μL)注射3次或者用BCG接种疫苗一次。疫苗接种之间的间隔是2周，并且在第3次疫苗接种之后三周，对动物放血，分离PBMC，并且测量疫苗诱导的T细胞反应。用2μg的存在于两种融合蛋白中的单个蛋白质孵育5×10⁶个PMBC三天，并且通过ELISA测量培养基中的分泌性IFN-g(图2A)。在H56接种疫苗的动物中，存在对Ag85B和ESAT-6的强识别以及对第三种蛋白质Rv2660c的弱识别。H64接种疫苗的动物具有特异性针对ESAT-6和Rv3614的强反应以及对PE35(Rv3872)和Rv3849的中度反应。在这种近交小鼠品系中，不存在对Rv3865和Rv3615c的反应。在生理盐水注射的动物中不存在反应，证实反应是疫苗特异性的。

在第三次疫苗接种之后六周，用毒性结核分枝杆菌H37Rv(图2B)对所有动物进行气雾剂攻击。在攻击之后六周，将所有小鼠处死，并且通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图2B)。

在两个实验中，用或者H64或者H56进行疫苗接种与生理盐水对照组相比，诱导显著保护。此外，对H56与H64接种疫苗的动物中的CFU进行的统计比较显示，在H37Rv攻击之后，H64减少细菌数目显著超过H56(图2B)。

实例3：在一种暴露后TB疫苗接种模型中进行疫苗接种之后的Rv3614c和Rv3615c免疫反应

在暴露后TB疫苗接种模型中，最初用M.tb.经由气雾剂途径攻击小鼠。为了模拟感染的潜伏期，在感染后(p.i.)从6到12周在饮用水中向小鼠随意给出抗生素。在p.i.10、13以及16周用或者5μg的配制于基于脂质体的佐剂CAF01中的重组蛋白或者相等体积的盐水(200μl)对小鼠群组接种疫苗。在最后疫苗接种之后1周(p.i.17周)，评估肺中的疫苗诱导的免疫反应，并且在用疫苗抗原或TB10.4对肺淋巴细胞进行6小时的再刺激之后对于细胞因子通过细胞内染色来测定(图3)。用Rv3614c或Rv3615c进行疫苗接种诱导显著疫苗特异性免疫反应，在对照小鼠的肺中并不以相当水平可测量。

实例4：一种暴露后TB疫苗接种模型中的H64融合蛋白-免疫反应和保护.

如实例3中所描述产生暴露后TB疫苗接种模型，并且将其用以评估用H64融合蛋白的暴露后免疫效应。将小鼠群组或者用5μg配制于基于脂质体的佐剂CAF01中的H64接种疫苗三次、用相等体积的盐水(200μL)注射3次或者用BCG接种疫苗一次。评估CB6F1(C57BL/6xBALB/c)(图4A-C)和FvB小鼠(图4D)两者中的H64免疫原性。在三次免疫之后，将淋巴细胞从小鼠的肺获得，并且用单个组分和/或融合蛋白体外刺激。在p.i.17周，其中测量疫苗诱导的反应，感染驱动的反应如在生理盐水注射的对照组中所测量是可忽略的(图4B)。这与接种疫苗的组中测量的IFN-γ反应形成对比(图4A和D)。正如所料，识别模式在两种不同小鼠品系FvB(图4A)与CB6F1(图4D)之间确实不同。对FvB小鼠进行H64疫苗接种主要导致诱导针对Rv3615c的一种IFN-γ反应，而在CB6F1小鼠中诱导对ESAT6、Rv3614c、Rv3849以及较小程度上Rv3872的一种反应。因此，H64是一种高度免疫原性的疫苗，导致相当大量的IFN-γ产生。在p.i.37周，将所有小鼠处死，并且通过连续平板接种肺匀浆的稀释液并且对在37℃下2-3周的孵育之后的菌落的数目计数来测定单个小鼠的肺中的细菌数目。在这个时间点，对照动物具有4.021log10CFU的一个平均细菌负荷，与BCG疫苗接种之后的平均细菌负荷(3.807log10GFU)相当，而H64接种疫苗的动物的细菌负荷略低(2.917log10CFU)(图4C)。

实例5：两种预防性TB疫苗接种模型中的七种ESX-1抗原针对气雾剂TB攻击的单一蛋白质保护

将CB6F1或B6C3F1小鼠群组或者用5μg的配制于基于脂质体的佐剂CAF01中的重组蛋白之一接种疫苗三次、用相等体积的盐水(200μL)注射3次或者用BCG接种疫苗一次。疫苗接种之间的间隔是2周，并且在第三次疫苗接种之后六周，用毒性结核分枝杆菌Erdman对所有动物进行气雾剂攻击。在攻击之后六周，将所有小鼠处死，并且通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图5A-C)。

在B6C3F1品系(图5A和B)中，用七种单个ESX-1相关蛋白质Rv3616c、Rv3615c、Rv3614c、Rv3865、ESAT-6、Rv3849或Rv3872进行疫苗接种诱导可变程度的保护，个体动物的肺中的细菌负荷相对于生理盐水对照组的减小在从0.30到1.31log₁₀范围中。单一蛋白质中无一者达到在牛分枝杆菌BCG疫苗接种之后获得的1.53log₁₀减小。在CB6F1小鼠品系(图5C)中，用七种蛋白质中的四种Rv3615c、Rv3614c、ESAT-6以及Rv3849进行疫苗接种诱导一种保护性免疫反应，产生在0.24与0.52log₁₀之间的一个CFU减小。

实例6：H64用于CB6F1小鼠品系的最优预防性疫苗接种剂量是5μg于CAF01中的蛋白质。将CB6F1小鼠群组或者用不同剂量的配制于基于脂质体的佐剂CAF01中的重组H64融合蛋白接种疫苗三次、用相等体积的盐水(200μL)注射3次或者用BCG接种疫苗一次。疫苗接种之间的间隔是2周，并且在第三次疫苗接种之后六周，用毒性结核分枝杆菌Erdman对所有动物进行气雾剂攻击。在免疫之后三周，通过体外刺激被分离的PBMC和脾细胞来测量脾(图6A)和血液(图6B)中所存在的可能的疫苗特异性T细胞。一般趋势是疫苗剂量越高，T细胞反应越强。在攻击之后六周，将所有小鼠处死，并且通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图6C)。用5μg H64进行免疫产生最低细菌数目和然而最佳保护。

实例7:一种预防性TB疫苗接种模型中的单一蛋白质和保护

将CB6F1小鼠群组或者用5μg的配制于基于脂质体的佐剂CAF01中的重组蛋白之一接种疫苗三次、用相等体积的盐水(200μL)注射3次或者用BCG接种疫苗一次。疫苗接种之间的间隔是2周，并且在第三次疫苗接种之后六周，用毒性结核分枝杆菌Erdman对所有动物进行气雾剂攻击。在攻击之后六周，将所有小鼠处死，并且通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图7)。用单个ESX-2和ESX-5分泌性蛋白质Rv3891、Rv3619以及Rv3620进行疫苗接种诱导针对结核的相当并且显著的保护，但不在BCG的水平下。

实例8：一种预防性TB疫苗接种模型中的CFP10-ESAT6家族融合体-免疫反应和保护.

将十二种旁系同源ESAT-6家族蛋白质融合为六种蛋白质二聚体：CFP10-ESAT6、Rv3891c-3890c、Rv0287-0288、Rv3445c-3444c、Rv3620c-3619c以及Rv3905c-3904c(图8A)。在所有结构中，两种蛋白质由一种九个氨基酸长的间隔序列(GLVPRGSTG)分隔。将CB6F1或B6C3F1小鼠群组或者用5μg的配制于基于脂质体的佐剂CAF01中的重组二聚体蛋白质中的每一者接种疫苗三次、用相等体积的盐水(200μL)注射3次或者用BCG接种疫苗一次。疫苗接种之间的间隔是2周，并且在第三次疫苗接种之后六周，用毒性结核分枝杆菌Erdman对所有动物进行气雾剂攻击。在攻击之后六周，将所有小鼠处死，并且通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图8B和C)。在CB6F1小鼠中，用CFP10-ESAT6、Rv3891c-3891c或Rv0287-0288进行疫苗接种导致肺中的细菌数目有在0.25-0.45之间的一个log₁₀减小(图8B)。相同三个二聚体融合体加Rv3620c-3619c保护的B6C3F1小鼠(图8C)。在两种品系中无一者中，是测试的二聚体融合体对用活疫苗BCG的水平的保护性功效，诱导1.4与0.85的一个log₁₀减小。在B6C3F1小鼠中，疫苗特异性反应见于CFP10-ESAT6、Rv0287-0288、Rv3445c-3444c、Rv3620c-3619c以及Rv3905c-3904c接种疫苗的群组中的第三次疫苗接种后3周的血液中(图8D)。

实例9：一种预防性TB疫苗接种模型中的H65融合蛋白-免疫反应和保护.

将B6C3F1小鼠群组用5μg的配制于CAF01佐剂中的H65(图9A)接种疫苗三次，或用活疫苗牛分枝杆菌BCG接种疫苗一次。为了证实针对三种ESX分泌性二聚体中的每一者的疫苗诱导的反应，在第三次疫苗接种后3周分离脾细胞。用2μg或者Rv3891c-Rv3890c、Rv0287-Rv0288或者Rv3620c-Rv3619c二聚体融合蛋白刺激5×10⁶个脾细胞6小时。通过多色流式细胞术测量IL-2、TNF-α以及IFN-γ细胞因子响应于抗原刺激的CD4T细胞表达(图9B)。反应的等级是Rv3891c-Rv3890c>Rv0287-Rv0288>Rv3620c-Rv3619c，然而对于所有三种二聚体蛋白质，我们都观察到疫苗特异性多官能T细胞，包括IL-2⁺、TNF-α⁺、IFN-γ⁺以及IL-2⁺、TNF-α⁺CD4T细胞。在第三次疫苗接种之后六周，用毒性结核分枝杆菌Erdman对所有动物进行气雾剂攻击，并且六周后将其处死。通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图9C)。H65和BCG两者都诱导显著保护(log₁₀减小约0.7)。

将CB6F1小鼠群组用5μg的配制于CAF01佐剂中的H65(图9A)或H56(Ag85B-ESAT6与Rv2660c的融合体)接种疫苗三次，或用活疫苗牛分枝杆菌BCG接种疫苗一次。为了确定H65中的6种抗原中有哪些在CB6F1近交小鼠品系中是免疫原性的，在第三次疫苗接种后3周分离脾细胞。用2μg的或者Rv3891c、Rv3890c、Rv0287、Rv0288、Rv3620c或者Rv3619c单一蛋白质刺激5×10⁶个脾细胞72小时(图10A)。大量的IFN-γ由从H65接种疫苗并且用Rv0287、Rv0288、Rv3620c或Rv3619c刺激的动物中分离的细胞释放到培养基中，而不存在对Rv3891c或Rv3890c的反应(图10A)。在生理盐水注射的动物中，不存在在刺激之后对6种抗原中的任一者的反应(图10B)。

在第三次疫苗接种之后六周，用毒性结核分枝杆菌Erdman对所有动物进行气雾剂攻击，并且六或二十四周后将其处死。通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图10C和D)。在攻击之后六周(图9C)，H65和H56两者都产生类似并且显著的保护(log₁₀减小约0.8)。在攻击后24周(图10D)，用H65或H56进行疫苗接种仍诱导一种相当的肺中细菌数目减小，但与对照组(CAF01)相比，差值不再是统计显著的(log₁₀减小＝0.37，对于H65，和0.34，对于H56)。

实例10：两种小鼠品系中的在暴露后疫苗接种之后的H65融合蛋白-免疫反应.

在暴露后TB疫苗接种模型中，最初用M.tb.经由气雾剂途径攻击小鼠。为了模拟感染的潜伏期，在感染后(p.i.)从6到12周在饮用水中向小鼠随意给出抗生素。将FvB或CB6F1小鼠群组或者用5μg配制于基于脂质体的佐剂CAF01中的H65接种疫苗三次或者用相等体积的盐水(200μL)注射3次。

在p.i.17周测量被感染的FvB小鼠的肺中的特异性针对H65的组分(Rv3891c、Rv3890c、Rv0287、Rv0288、Rv3620c、Rv3619c)的感染驱动的免疫反应，并且反应仅只是可检测的(图11B)。在疫苗接种之后，我们测量FvB小鼠品系的肺中针对Rv3619c的显著反应(图11A)。在CB6F1小鼠品系中，另外存在对Rv0287和Rv0288引起的一种反应(图11C)。因此，H65融合蛋白是高度免疫原性的，导致稳定诱导疫苗特异性IFN-γ释放。在37周感染之后，对单个小鼠中的细菌数目进行计数(图10D)。H65接种疫苗的组与阴性对照组之间的比较展示H65接种疫苗的动物中的CFU的减小。保护水平与阳性对照(H56)相当，并且比BCG疫苗更显著。

实例11：Rv1284蛋白质的丰度在营养饥饿下增加

Rv1284先前已经通过蛋白质组研究鉴别于结核分枝杆菌溶解物中³⁷。为了研究蛋白质在营养饥饿下的丰度，应用二维差异凝胶电泳(2D DIGE)以研究正常对数期生长中和在六周营养饥饿之后的结核分枝杆菌H37Rv细菌的培养滤液(CF)和溶解物蛋白质组。

将含有200ml的改良苏通培养基的爱伦美氏烧瓶用2×10⁶个细菌/毫升接种，并且放置于一个标准振荡孵育箱中37℃下。在7天生长到对数期之后，将培养物集结，用PBS洗涤两次，并且再悬浮于200ml PBS中，接着在不振荡的情况下孵育六周。在37℃下在振荡条件下在500ml烧瓶中在200ml改良苏通培养基中培养7天之后，获得对照对数期培养物。在收集培养物之后，将细菌集结粒在PBS中洗涤两次，再悬浮于10mM Tris，250mM蔗糖缓冲液，pH7.0中，并且使用一个Mini-Beadbeater用玻璃珠使其破碎。将溶解物无菌过滤，并且通过2-D Quant试剂盒(通用电气医疗(GE Healthcare))测定蛋白质浓度。另外，将培养基收集，无菌过滤，并且在Centriprep-3超滤装置中浓缩约160倍。

分析两个单独实验中的溶解物和CF样品。每个2D DIGE实验包括三个重复对数期和饥饿样品。对于2D DIGE，通过2D Clean-up试剂盒(通用电气医疗)制备50μg的每种样品，并且将其溶解于30mM Tris，7M脲，2M硫基-脲，4％CHAPS，pH 8.5中。用125pmol的每种CyDye进行Cy2、Cy3以及Cy5最小标记，接着用pH 4-7IPG条带进行等电聚焦。在8M脲，2％CHAPS，0.5％IPG缓冲液，18mM DTT中复水步骤期间应用Cy2、Cy3以及Cy5标记的样品。在10到20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE梯度凝胶中进行第二维分离。在电泳之后，通过一个Typhoon 9410凝胶成像器扫描凝胶，并且用Image Master Platinum 2.0软件分析斑点图像。选择呈现超过1.5倍的体积比差异，p<0.05(斯图登t测试)的斑点以用于鉴别。将2D DIGE凝胶银染色，并且将斑点切除以用于MALDI-TOF MS或MALDI-TOF MS/MS分析。两个斑点(图15上的编号1666和编号1669)呈现来自六周营养饥饿的培养物的CF与对数期培养物相比增加的丰度。这些斑点通过MALDI-TOF MS和MALDI-TOF MS/MS鉴别为Rv1284。平行地，这些斑点还由于来自营养饥饿培养物的溶解物中的增加而被选择，并且通过MS确认为Rv1284。

实例12：一种预防性TB疫苗接种模型中的Rv1284免疫反应和保护.

将CB6F1和B5C3F1小鼠群组用5μg的配制于CAF01佐剂中的Rv1284接种疫苗三次，或用活疫苗牛分枝杆菌BCG接种疫苗一次。为了测量疫苗诱导的反应，在第三次疫苗接种之后2周，从个体动物抽取血液并且分离PBMC。用2μg的疫苗抗原(Rv1284)或一种对照抗原(Rv0287)刺激5×10⁶个PBMC 72小时，并且通过ELISA测量细胞培养基中的释放的IFN-γ(图12A和B)。在两种小鼠品系中，用Rv1284进行疫苗接种诱导一种显著抗原特异性免疫反应。

在第三次疫苗接种之后六周，用毒性结核分枝杆菌Erdman对所有动物进行气雾剂攻击，并且六周后将其处死。通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图12C和D)。与生理盐水对照组相比，Rv1284疫苗接种显著减少两种品系中的细菌数目(log₁₀减小＝0.43，在CB6F1中，和0.54，在B6C3F1中)。

实例13：一种预防性TB疫苗接种模型中的H1+Rv1284的保护性功效.

将FVB(H2^q)小鼠群组用5μg的配制于CAF01佐剂中的H1融合蛋白或H1+Rv1284接种疫苗三次。对照组接受三次生理盐水注射。在第三次疫苗接种/注射之后六周，用毒性结核分枝杆菌Erdman对所有动物进行气雾剂攻击，并且六周后将其处死。通过平板接种肺匀浆的稀释液并且对菌落的数目进行计数来测定个体动物的肺中的细菌数目(图13)。用H1融合蛋白对FVB小鼠进行疫苗接种仅减少细菌数目一半(log₁₀减小＝0.32)，而H1+Rv1284的混合物减少细菌数目6.6倍(log₁₀减小＝0.82)。统计上，H1+Rv1284接种疫苗的动物具有比生理盐水注射的群组和H1接种疫苗的群组两者都显著更低的细菌负荷。

实例14：在用单一蛋白质进行暴露后疫苗接种之后Ag85B、ESAT-6以及Rv1284的免疫反应.

根据实例3中描述的方案，将小鼠感染、用抗生素处理并且接种疫苗。此处，将小鼠群组用Ag85B、ESAT6或者Rv1284接种疫苗三次，三者都配制于基于脂质体的佐剂CAF01中。将对照小鼠以一种类似方式用盐水接种疫苗。在最后疫苗接种之后一周，从肺获得淋巴细胞，并且将其用于用对应的疫苗抗原(即Ag85B、ESAT6或Rv1284，以及TB10.4，作为感染驱动的反应的一个量度)进行6小时体外培养。对于细胞内细胞因子通过染色测量疫苗或感染驱动的反应，并且测定CD4T细胞反应者的累积频率、表达、IFN-γ、IL-2、TNF-α或者三者的任何组合。用Ag85B、ESAT-6或Rv1284进行疫苗接种都诱导显著疫苗特异性CD4T细胞反应(图14)，这在对照动物中无法在相当水平下测量到。相比之下，TB10.4感染驱动的CD4T细胞反应低，但考虑到在这个具体时间点细菌负荷仍相对低，这是预期的。

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Claims

1.一种融合蛋白，它由SEQ ID NO 18的氨基酸序列组成并且同时是免疫原性的。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白或权利要求1中限定的氨基酸序列在制备用于针对由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacteriumafricanum)或牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)造成的感染进行疫苗接种的药物组合物中的用途。

3.一种疫苗，所述疫苗包含融合蛋白，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO18的氨基酸序列组成并且同时是免疫原性的。

4.根据权利要求3所述的疫苗，另外包含佐剂。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其中该佐剂选自下组，该组由以下各项组成：阳离子脂质体、Quil A、聚I:C、氢氧化铝、弗氏不完全佐剂、IFN-γ、IL-2、IL-12、单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯(TDB)、胞壁酰二肽(MDP)以及单霉菌酰甘油(MMG)或其组合。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其中所述阳离子脂质体是二甲基二(十八烷基)溴化铵。

7.根据权利要求3-6中任一项所述的疫苗，所述疫苗用于使动物对由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌或牛分枝杆菌造成的结核免疫。

8.根据权利要求3-6中任一项所述的疫苗，所述疫苗用于使人类对由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌或牛分枝杆菌造成的结核免疫。

9.融合蛋白在制备用于使动物对由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌或牛分枝杆菌造成的结核免疫的疫苗中的用途，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO18的氨基酸序列组成并且同时是免疫原性的。

10.融合蛋白在制备用于使人类对由结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌或牛分枝杆菌造成的结核免疫的疫苗中的用途，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO18的氨基酸序列组成并且同时是免疫原性的。