KR20180061338A - 동물에서의 개선된 모듈러 항원 수송 분자 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 적어도 하나의 전좌 모듈, 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈을 포함하는, 개선된 MAT(iMAT: improved MAT) 분자로서도 언급되는, (단리된) 재조합 단백질에 관한 것이고, 여기서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 이러한 iMAT 분자는 예를 들면, 말을 제외한 동물에서의, 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 알레르기 및/또는 감염성 질환의 치료요법 및/또는 예방 및/또는 감염성 질환의 전염의 예방을 위한 백신으로서 특히 유용하다. 본 발명은 추가로 이러한 iMAT 분자를 암호화하는 핵산, 상응하는 벡터 및 1차 세포 또는 세포주에 관한 것이다.
Description
발명의 분야
본 발명은, 적어도 하나의 전좌 모듈(translocation module), 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈을 포함하는, 개선된 MAT(iMAT: improved MAT) 분자로서도 언급되는, (단리된) 재조합 단백질에 관한 것이고, 여기서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. iMAT 분자는 실질적으로 감소된 제조 노력으로 생산될 수 있고, 종-특이적이고, 보다 안전하고 면역학적으로 매우 효과적이다. 이러한 (단리된) 재조합 단백질은 예를 들면, 말(equine)을 제외한 동물에서의, 바람직하게는 반추동물, 돼지, 사람, 개 및/또는 고양이에서의 알레르기 및/또는 감염의 치료요법 및/또는 예방 및/또는 감염의 전염 예방을 위한 백신으로서 특히 유용하다.
발명의 배경
Crameri 등으로부터의 선행 기술 출판물은 배경을 보다 상세하게 기술한다(Crameri R. et al., Allergy 2007, 62: 197-206). 간략하게, 항원-제시 세포(APC: antigen-presenting cell)에 의한 항원의 처리는 2개의 상이한 경로에 의해 일어난다. 세포 내부에서 발생하는 항원은 세포 표면 상의 MHC I(주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex) 클래스 I, MHC 클래스 I) 분자에 의해 제시되는 반면, 세포외 항원은 세포 표면 상의 MHC II(주요 조직적합성 복합체 클래스 II, MHC 클래스 II) 분자에 의해 제시된다.
둘 다의 메커니즘은 항원에 대한 숙주에 의한 면역 반응을 개시한다. 주요 조직적합성 클래스 II 분자는 CD4+ T 세포에 대한 펩타이드를 제시하는 세포 표면 당단백질이다. 세포질 세망(ER: endoplasmic reticulum)에서, MHC-II 분자는 ER에서 MHC-II에의 펩타이드 결합을 방지하는 불변 쇄(Ii)라고 명명된 II형 막관통 단백질과 회합하게 된다. Ii 동종삼량체(homotrimer)는 ER에서 3개의 MHC 클래스 II αβ 이량체와 회합하고, 이는 클래스 II 분자에 대한 내인적 펩타이드의 결합을 방지한다. Ii의 N-말단 세포질 도메인은 ER에서의 이의 유지 또는 골지(Golgi)를 통한 엔도솜-리소좀 경로로의 클래스 II αβ 이량체의 표적화를 유도하는 표적화 모티프를 함유한다. Ii의 후속적 단백질분해성 분해는 펩타이드-결합 그루브(groove)에서 클래스 II αβ 이량체에 결합된 작은 단편 CLIP(클래스 II 회합된 Ii 펩타이드)를 남긴다. 특화된 구획에서의 클래스 II αβ/CLIP 복합체와 클래스 II-관련된 αβ 이량체와의 상호작용은 CLIP을 방출시키고, 클래스 II 분자가 외인성 단백질로부터 유도된 펩타이드에 결합하게 한다. MHC-II 제시 경로로부터 일반적으로 배제된, 내인성으로 합성된 단백질은 이들이 Ii 융합 단백질로서 발현될 때 펩타이드-MHC-II 복합체로서 효율적으로 제시될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 특성은 Ii-cDNA 융합 라이브러리로 형질감염된 세포주로부터 MHC-II 제한된 항원을 암호화하는 유전자를 클로닝하는데 활용되었다. MHC-II 처리 및 제시 경로를 표적으로 하는 효율적인 알레르기 백신은 전좌가능한 Ii-알레르겐 융합을 사용하여 달성되었다. 모듈러 항원 전좌(MAT) 기술이라고 명명하는 개념은 세포외 단백질을 세포질 단백질로 전환시키는 TAT-유도된 전좌 펩타이드, 융합 단백질을 엔도솜/리소좀 구획으로 표적화하기 위한 Ii의 처음 110개의 아미노산, 및 특정 면역 반응의 유도를 위한 항원에 기초한다.
면역 반응을 조절하기 위해 모듈러 항원 수송(MAT) 분자, 관련 작제물, 방법 및 이의 용도를 제공하는 개념은 WO 2004/035793(미국 특허 US 2005/0281816)에 개시되어 있다. 이러한 문헌은 항원의 에피토프를 세포에 도입하여 이러한 MAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응을 결정하기 위한 3-부분-분자(three-part-molecule)인 MAT 분자의 유용성을 기술한다. 상기 문헌에는 각종 전좌 모듈, 표적화 모듈 및 항원 모듈이 기술되어 있다. 이러한 기술 및 이의 근본적인 방법은 첫 번째로 세포외 공간으로부터 표적 세포의 세포내 공간으로 효율적으로 항원을 전달할 수 있게 하고, 두 번째로, 세포 내부에 도착한 후에 항원 제시를 위해 후속적으로 처리하기 위한 세포 소기관(organelle)에 상기 항원을 효율적으로 도달되게 한다. 일반적으로, 2-단계 프로세스는 대상체에서의 면역 반응의 표적화된 효율적인 조절을 위해 이용될 수 있다. MAT 분자의 사용은 예를 들면, 문헌[Martinez-Gomez JM et al. [Allergy 2009, 64 (1): 172-178]; Rose H (Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess, 2009, 96, 319-327)]에 뿐만 아니라 최근 문헌[Senti G et al. [J Allergy Clin Immunol., 2012, 129 (5): 1290-1296]]에도 개시되어 있다. MAT 기술에 기초하여, 주요 고양이 알레르겐 Fel d1을 TAT-유도된 단백질 전좌 도메인에 그리고 MHC 클래스 II 경로를 표적으로 하는 절단된 불변 사람 쇄에 융합시켰다. 면역원성은 마우스에서 평가되었고, 한편 잠재적 안전성 문제는 고양이-비듬-알레르기 환자로부터 호염기구 반응성에 기초한 적합한 시험에 의해 평가되었다. 이러한 모델 화합물의 가능한 용도가 입증되었다. 상기 문헌들에 MAT 분자가 종래의 알레르겐-특이적 면역 치료요법(SIT)에서 재조합 알레르겐 또는 알레르겐 추출물보다 목적하는 면역 반응, 즉, 감감작화(hyposensitization)를 유도하는데 더 안전하고 더 효율적인 것으로 예상된다고 기술되어 있다. Senti G. 등에 의한 최근 공보에서, 3회 주사 후 내성(tolerance)을 유도하는 사람에서의 고양이 비듬 알레르기에 대한 림프내 면역 치료요법이 기술되었다. 상기 문헌에는, MAT-Fel d1을 이용한 제1-사람-내 임상학적 연구가 기술되었고, 이는 단지 3회 주사의 림프내 주사 후에 안전성 및 알레르겐 내성의 유도를 입증하였다.
추가의 선행 기술은 다음과 같다:
Gadermaier G 등[Molecular Immunology 2010, 47: 1292-1298]은 아르테미시아(Artemisia) 화분 알레르기의 면역 치료요법에 대한 Art v1의 시스테인-안정화된 폴드의 표적화를 기술한다. 저자는 저알레르기성 분자의 생성을 목적으로 하는 Art v1 번역후 변형을 표적으로 하기 위해 유전자 조작 접근법을 사용하였다: (i) 데펜신 도메인의 디설파이드 가교(bridge)는 부위-특이적 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)에 의해 방해되었고, (ii) 돌연변이체 작제물은 비-당화된 단백질의 생산을 위해 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되었다. 그러나, 목적은 명백하게 단지 단일 시스테인 잔기를 세린으로 교환하여 - 한편 (시스테인 잔기를 함유하는 경우라도) 인식된 T-세포 에피토프를 온전하게(즉, 비변형됨) 유지하면서 IgE-결합(즉, 저알레르기성 분자를 생성함)을 폐지하기 위해 Art v1 데펜신 도메인의 3-차원 폴드(fold)를 조작하는 것이었다.
말의 알레르기성 질환에 대한 제3 하베메이어(Havemeyer) 연구의 보고[Holar, Iceland, June 2007, Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008, 126: 351-361]는 곤충 물림 과민성(IBH: insect's bite hypersensitivity) 및 재발성 기도 폐쇄(RAO: recurrent airway obstruction)의 면역학적 및 유전학적 양상들에 중점을 두었다. 이러한 연구에서는 IBH에 대항하는 SIT에 대한 신규한 접근법, 이들 중에서도 바이러스 벡터(vector)의 사용 또는 모듈러 항원 전좌(MAT) 분자에 커플링된 알레르겐을 사용한 단백질 백신접종(vaccination)이 논의되었다.
문헌[SIAF Annual Reports 2010 and 2011]에서 Crameri R은 IBH-이환된(affected) 말의 백신접종을 위한 MAT 기술의 사용을 보고한다.
Zhao 등(Int J Clin Exp Med 2015;8(4):6436-6443)은 WO 2004/035793에 개시된 MAT 구조를 갖는 모자이크 융합 단백질 및 Der p1을 암호화하는 T 세포 에피토프의 3개의 절편을 항원 모듈로서 이용한 실험 결과를 보고하였다. 이들은 단백질 발현을 위한 융합 유전자를 형성하기 위해 선형 방식으로 이들 서열을 재조립하였다. 이들은 Der p1 단백질과 비교하여 더 강한 알레르기성(초알레르기성(hyperallergenicity))을 나타내는 이들의 작제물을 기술한다.
그러나, 주요 문제는 선행 기술에서 기술된 MAT 분자를 생산 및 제조할 때에 발생하였다. 특히 우수 제조 기준(GMP: good manufacturing practice) 하에 MAT 분자의 제조를 위해 다운스트림 처리(DSP: downstream process)를 개발하는데 사용된 표준 방법은 적용될 수 없었다. 분명히 이의 이례적인 물리화학적 특성으로 인해 MAT 분자의 동종 분자 종들을 정제할 수 없었다.
몇몇의 정제 방법은 상이한 분리 원리(예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, RP-HPLC)가 시험되었지만 선행 기술에서 기술된 MAT 분자로는 적용될 수 없었다(본원의 실시예 4 참조). 재조합 단백질의 순도의 측정하기 위해 적용되는 방법으로는 일반적으로 크로마토그래피 분리, 예를 들면, RP-HPLC 및 전기영동 분리(예를 들면, 모세관 구역 전기영동, 등전점 맞춤(isoelectric focusing), 환원 또는 비-환원 조건 하에서의 SDS-PAGE)가 포함된다. 또한, 이들 분석 방법은 분자-특이적 적응(adaptation) 없이 MAT 분자에 적용될 수 없었다. 순도의 평가를 위해, 적응된 특이적 SDS-PAGE 시험 절차를 개발하여야 한다. 이러한 시험 절차는 환원제 및 리튬 도데실 설페이트(LDS)를 이용하여 샘플을 조제하고, 75℃까지 가열하고, 전기영동 분리 후 다중, 재생가능한 선명한 밴드(sharp band)를 수득함을 포함한다. 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염료를 이용한 염색은 겔에서 선형 정량적 거동(밀도측정)을 유도한다. MAT 분자에서 알레르겐 모듈의 검출을 가능하게 하는 모노클로날 항체를 사용하는 것은 주요한 밴드 및 몇몇의 부수적 밴드를 나타내었다. 모든 밴드는 제2 겔을 제1 겔의 삭제된 밴드로 재-적재(re-loading) 후에 또한 원래 겔에서와 같이 동일한 위치에 재생가능하게 이동한다. 놀랍게도, 명백하게 보다 낮은 분자량 및 보다 높은 분자량을 갖는 이들 밴드의 전부에서, 전장(full length) MAT 분자는 겔 외부로의 밴드의 삭제, 및 이들의 트립신 소화 및 질량 분광계에 의한 후속적인 분석(nanoLC/ESI-MS-MS)에 의해 확인하였다. 이들 실험으로부터, SDS-PAGE에서 MAT 분자의 상이한 폴딩 변이체의 비전형적인, 이례적인 거동을 결론내릴 수 있다("겔 시프팅(gel shifting)"). 추가로, MAT 분자의 모든 배치(batch)에서 단백질의 다량체 형태가 검출될 수 있고, 이는 단량체 형태로부터 분리하기 어려웠다.
예를 들면, 경제적 측면 때문에, 뿐만 아니라 규제 요구사항 때문에, (i) MAT 분자의 제조 공정 및 (ii) 순도 측정의 표준 분석 방법에 대한 이들의 적합성을 개선시키는 것이 필요하다. 추가로, 상기 MAT 분자를 특정 표적 종, 예를 들면, 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에 적응시키기 위해, MAT 기술 이내의 면역학적 표적화의 적응이 요구된다. 이러한 종 특이성은 포유동물 종들 사이에 상동성 Ii 아미노산 서열의 차이가 존재하므로 상기 iMAT 분자에서 나타내어질 필요가 있다(도 10). 그러나, 특히 CLIP 영역에서의 MHC 클래스 II의 αβ 서브유닛에의 Ii 융합 단백질(iMAT)의 적절한 결합은 상기 iMAT 분자에서 항원과 관련된 최적의 면역학적 기능에 요구된다. 상기 MHC 클래스 II 분자에의 적절한 결합은 iMAT 내의 Ii 서열이 가능한 한 본래 서열과 유사하면 달성된다.
추가로, MAT 분자는 공지의 주요 알레르겐에 의해 유발되는 알레르기(예를 들면, Fel d1에 의한 사람에서의 고양이 비듬 알레르기)에서 용이하게 사용된다. 그러나, 임상 현장, 예를 들면, 알레르기에서 선행 기술의 MAT 분자를 이용하는 것은 어려운 것으로 보이고, 여기서, 예를 들면 다양한 비-가교-반응성 알레르겐은 관련되는 것으로 공지되어 있지만, 알레르기를 유발시키는데 이러한 알레르겐의 중요성은 공지되어 있지 않다(즉, 주요 알레르겐은 공지되어 있지 않다).
또한, 선행 기술은 1개 초과(예를 들면, 2, 3, 4개 또는 그 이상)의 알레르겐이 단백질 제조를 방해하는 융합 단백질의 소정 크기를 초과하지 않으면서 (i)MAT 분자로 내장될 수 있는 방법을 기술하지 않는다.
본 발명의 근본을 이루는 목적은 약제학적 조성물 중의 활성제(active agent), 예를 들면, 백신으로서 유용한 개선된 MAT 분자, 및 말을 제외한 동물에서의 이들의 상응하는 치료학적 및/또는 예방학적 용도를 제공하는 것이고, 이는 선행 기술의 문제를 극복한다.
본 발명의 요약
한 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도, 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 알레르기의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 그리고/또는 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 그리고/또는 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 전염의 예방 방법에서 사용하기 위한, 그리고/또는 매개체에 의한 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 전염의 예방 방법에서 사용하기 위한,
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌(translocation)를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈,
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈, 및
(iii) 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 개선된 MAT(iMAT) 분자로서,
적어도 항원 모듈(들)에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 하나(n개)의 (단리된) 재조합 단백질, 바람직하게는 개선된 MAT(iMAT) 분자를 제공함으로써 해결하였다.
예방 및/또는 치료를 필요로 하는 말을 제외한 동물의 상응하는 예방 및/또는 치료 방법, 및 말을 제외한 동물의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물/의약의 제조를 위한 용도는 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다.
바람직하게는, 적어도 하나의 항원 모듈에서, 모든 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환된다. 보다 바람직하게는 전체 iMAT 분자에서, 모든 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환된다.
바람직하게는, 모든 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것은 아닌 경우, 짝수개의 시스테인 잔기가 전체 iMAT 분자에 남는다.
바람직하게는, 상기 모듈의 전부는 임의로 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에서 임의로 추가의 스페이서(spacer) 모듈(들)에 의해 서로에 대해 공유결합적으로 링크된다.
보다 바람직하게는, 상기 모듈의 전부는 서로 공유결합적으로 링크되고, 어떠한 추가의 스페이서 모듈(들)도 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 전혀 존재하지 않는다.
다른 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 서열번호 2 또는 서열번호 3에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상에 관련된, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, iMAT 분자를 제공함으로써 해결하였다. 추가의 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 서열번호 14 내지 서열번호 23에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는 iMAT 분자를 제공함으로써 해결하였다. 바람직한 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 서열번호 24 내지 서열번호 83에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하거나, 바람직하게는 이들 중 어느 하나로 이루어진 iMAT 분자를 제공함으로써 해결하였다.
다른 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공함으로써 해결하였다.
다른 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 말을 제외한 동물, 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 하나 이상의 알레르기; 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 벼룩 물림에 대한 알레르기; 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 소정 음식 구성성분에 대한 알레르기; 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 아토피성 피부염; 바람직하게는 고양이에서의 알레르기성 기도 염증 및/또는 폐쇄의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질, 또는 본원에 개시되고 청구된 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공함으로써 해결하였다. 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 말을 제외한 동물, 바람직하게는 개 및/또는 고양이의 상응하는 예방 및/또는 치료 방법, 및 말을 제외한 동물, 바람직하게는 개 및/또는 고양이의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물/의약의 제조를 위한 용도가 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다.
다른 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 말을 제외한 동물, 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 하나 이상의 감염성 질환의 예방 및/또는 치료 방법, 및/또는 매개체에 의한, 바람직하게는 흡혈 곤충, 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기에 의한 말을 제외한 동물, 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 하나 이상의 감염성 질환의 전염의 예방 방법에서 사용하기 위한, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질 또는 본원에 개시되고 청구된 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물을 제공함으로써 해결하였다. 감염성 병원체 및/또는 감염성 질환은 캄필로박터, 심장 사상충, 에를리히아증, 리슈마니아증, 트리파노소마증, 보렐리아증, 슈말렌베르크-, 청설- 및/또는 웨스트나일 바이러스 감염, 피부 백선증 및/또는 바이러스(예를 들면, 로타-, 코로나바이러스) 및/또는 기생충(예를 들면, 연충) 및/또는 원생동물(예를 들면, 콕시디아증, 크립토스포리디움증)에 의한 소화관 및/또는 기타 장기의 감염, 및/또는 이들의 전-증상(pre-patent) 단계로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 말을 제외한 동물, 바람직하게는 반추동물, 돼지, 사람, 개 및/또는 고양이의 상응하는 예방 및/또는 치료 방법 및 말을 제외한 동물, 바람직하게는 반추동물, 돼지, 사람, 개 및/또는 고양이의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 조성물/의약의 제조를 위한 용도는 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다.
추가의 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공함으로써 해결하였다.
추가의 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 개시되고 청구된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 벡터를 제공함으로써 해결하였다.
또한 추가의 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 개시되고 청구된 적어도 하나의 핵산 및/또는 본원에 개시되고 청구된 적어도 하나의 벡터를 포함하는 1차 세포 또는 세포주를 제공함으로써 해결하였다. 놀랍게도, 본원에 개시되고 청구된 본 발명에 따른 iMAT 분자는 적절한 선행 기술의 MAT 분자 보다 이들을 우수하게 하는 하기 물리화학적 및/또는 면역학적 특징들을 갖는다:
(i)
최종 iMAT 분자의 안정성을 손상시키지 않기 위해 인실리코(in silico)에서 선택된 항원 모듈(들), 바람직하게는 전체 iMAT 분자에서 적어도 하나의 시스테인 잔기, 바람직하게는 모든 시스테인 잔기의 상이한 아미노산 잔기로의 치환은 본 발명에 따른 iMAT 분자를 표준 분석 방법뿐만 아니라 생물약제(biopharmaceutical)에 대한 표준 정제 절차의 적용에도 놀랍게 적합하게 한다.
(ii)
iMAT 분자, 즉 제1 전좌 모듈, 제2 표적화 모듈 및 제3 항원 모듈의 사이에 임의의 추가의 스페이서 모듈이 없는, 즉 이러한 제1, 제2 및/또는 제3 모듈의 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 추가의 스페이서 모듈이 전혀 없는, iMAT 분자의 모듈, 즉 제1 전좌 모듈, 제2 표적화 모듈 및 제3 항원 모듈의 바람직한 직접적 공유결합적 링크는 본 발명에 따른 iMAT 분자의 우수한 특징 이외에도 기여한다: 3-차원 구조에서 보다 강성(rigid)인 것으로 생각되고 따라서 입체구조적(conformational) IgE 에피토프를 형성할 수 없는 상기 iMAT 분자는 훨씬 더 저알레르기성 - 사실상 알레르기항원성(allergenicity)이 전혀 없는 정도이다.
(iii)
(유사(quasi)) N-말단 또는 C-말단 His-태그(tag)의 바람직한 존재는 면역 및/또는 면역 지속기간을 모니터링하기 위한 대용 마커(surrogate marker)로서 사용될 수 있는 본 발명에 따른 iMAT 분자를 초래하고, 이는 이러한 태그 모듈이 임의로 전좌 모듈로부터의 하나 이상의 인접한 아미노산 잔기들과 함께, 표적 대상체에서 iMAT 분자의 일반 구조에 대해 특이적인 특이적 면역학적으로 검출가능한 신호(예를 들면, 항체)를 유도하는데 사용될 수 있기 때문이다(본원의 실시예 1 참조). 추가로, 이러한 태그 모듈의 존재는 본 발명에 따른 iMAT 분자를 함유하는 샘플에서, 예를 들면, 아연- 또는 코발트-충전된 고체 지지체를 사용하여 단백질을 분리하는데 사용될 수 있고, 따라서 추가로 정제 처리 동안 응집 없이 본 발명에 따른 iMAT 분자를 생산할 가능성을 개선시킨다. 하나(n개)의 (유사) N-말단 His-태그가 바람직하다.
(iv)
본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 표적화 모듈은 바람직하게는 종-특이적이고, 즉 개, 고양이, 소, 양, 염소 또는 돼지에 대한 상기 iMAT 분자의 의도된 적용의 경우에, 표적화 모듈, 예를 들면, 개 불변 쇄가 적절히 선택된다. 이러한 종-특이적 표적화에 의해, MHC 클래스 II 분자에 대한 본 발명에 따른 iMAT 분자의 최적화된 결합 특징이 성공적으로 달성될 수 있다.
(v)
본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 알레르겐인 것이 바람직하다. 이는 음식 및/또는 곰팡이(진균류 및/또는 이들의 포자), 화분, 집먼지 또는 사료 진드기(및/또는 이들의 배설물) 및/또는 벼룩, 바람직하게는 나무, 잔디, 초본, 돼지풀로부터의 화분 및/또는 십자화과 화분 및/또는 아스페르길루스, 알테르나리아, 보트리티스, 세르코스포라, 클라도스포리움, 쿠르불라리아, 드레크슬레라, 유로티움, 헬민토스포리움, 에피코쿰, 에리시페 / 오이디움, 푸사리 움, 리치테이미아, 니그로스포라, 페니실리움, 페리코니아, 페로노스포라, 폴리트 린시움, 사카로폴리스포라(이전에 또한 파에니아 또는 마이크로폴리스포라), 써모 악티노마이세스, 스템필리움, 토룰라 속의 진균류 및/또는 이들의 포자 및/또는 아 카루스, 글리코파구스, 티로파구스, 더마토파고이데스, 유로글리푸스, 레피도글리 푸스, 블로미아 속의 진드기(또는 이들의 배설물) 및/또는 세라토필러스, 크테노세 팔리데스, 풀렉스, 아르카에오프실라 속의 벼룩으로부터 유도될 수 있다. 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 더마토파고이데스 알레르겐인 것이 보다 바람직하다. 알레르겐은 하기 기준에 따라 선택될 수 있다: 대상체에서 알레르기를 유발하는 주요 알레르겐이 알려져 있지 않은 경우, 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 본원의 실시예 5 및 실시예 6에 예시적으로 그리고 상세하게 기술된 바와 같은 생물정보학 접근법에 의해 선택될 수 있다. 이러한 수단에 의해, 개선된 MAT 분자가 달성될 수 있고, 이는 특히, 예를 들면, 말을 제외한 동물, 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 알레르기의 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로서 유용하다. 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 또한 하나 이상의 감염성 질환(들)에 관련된 병원체의 항원일 수 있다. 이는 캄필로박터, 디로필라리아, 에를리히아, 레이슈마니아, 트립파노소 마, 보렐리아, 오르토부니아바이러스, 오르비바이러스, 플라비바이러스, 로타바이러스, 코로나바이러스, 트리코파이톤, 마이크로스포룸 속; 쿠페리아, 하에몬쿠스, 오스테르타기아, 트리코스트론길루스, 딕티오카울루스, 메타스트론길루스와 같은 기타 연충; 및/또는 에이메리아, 이소스포라, 크립토스포리디움, 기아르디아와 같은 위장 침습(gastrointestinal infestation)을 이용한 원생동물로부터 유도될 수 있다 - 또한 기생충의 경우에는 전-증상 단계로부터 유도된 항원도 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 iMAT 분자에서 적어도 하나의 항원 모듈은 또한 예를 들면, 쿨리시다에, 세라토포고니다에, 플레보토미나에 익소디다에 및/또는 시미시다에에 속하는, 하나 이상의 감염성 질환(들)의 전염에 관여하는 매개체의 항원(예를 들면, 타액 구성성분)일 수 있다. 이러한 수단에 의해, 개선된 MAT 분자가 달성될 수 있고, 이는 특히 예를 들면, 말을 제외한 동물, 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 감염성 질환의 치료 및/또는 예방 및/또는 전염의 예방을 위한 백신으로서 유용하다.
(vi)
상기 iMAT 분자 중 하나에만 1개 초과의 알레르겐의 서열 모티프, 즉 모자이크 융합 단백질을 포함하는 신규한 iMAT 분자의 생산이 달성될 수 있다. 알레르겐 항원 모듈에 내장된 펩타이드 서열의 선택은 생물정보학 도구에 의해 관련된 주요 알레르겐에서 검출된 팬(pan) 알레르기성 모티프에 기초한다. 이러한 접근법에 의해, 이러한 iMAT 분자의 크기는 적합한 발현 시스템에서 효율적인 생산을 가능하게 하기에 충분히 낮게 유지될 수 있다.
특히, 본 발명은 크로마토그래피 분리 기술에 쉽게 적용할 수 있고 개선된 안정성을 나타내는, 개선된 용해도를 나타내는 (단리된) 재조합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 (단리된) 재조합 단백질은 바람직하게는 원하는 면역 학적 효과를 유도하는데 높은 활성 및 효능을 나타내고, 즉 대상체에서의 알레르겐에 대한 면역 반응을 유리하게 종 특이적으로 조절하는 것이 가능해지고, 예를 들면, 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서, 피부, 호흡 및/또는 위장 시스템과 같은 상이한 표적 장기에서 알레르겐 특이적 IgE 매개된 과민성 반응이 조절될 수 있다. 그리고/또는 말을 제외한 동물, 바람직하게는 반추동물, 돼지, 사람, 개 및/또는 고양이에서의 감염성 질환의 예방 및/또는 치료 및/또는 매개체에 의한 감염성 질환의 전염의 예방이 가능해진다.
치료학적 알레르겐의 알레르기항원성은 가장 중요하고, 이는 유해 사건을 유도할, 예를 들면, 아나필락시스(anaphylaxis)를 유도할 가능성의 척도이다. 선행 기술 MAT 분자와 관련하여, 상응하는 천연 알레르겐과 비교하여 이들의 알레르기항원성에 대한 상충되는 결과가 선행 기술에 보고되었다. Senti G 등(J Allergy Clin Immunol. 2012, 129(5): 1290-1296)은 진피내 및 피내 시험에서뿐만 아니라 CAST(Cellular Antigen Stimulation Test: 세포 항원 자극 시험) 검정에서도 MAT-Fel d1의 저알레르기항원성을 입증하였다. Fel d1을 포함하는 MAT 분자와 알레르겐 사이의 감도의 정량적 차이는 각각 100-, 23- 및 16-배였다. MAT-Fel d1이 분명히 저알레르기항원성이었지만, 일부 알레르기항원성이 남아있었다. 대조적으로, Zhao 등(Int J Clin Exp Med 2015; 8(4): 6436-6443)은 이들의 MAT-Der p1 작제물이 천연 Der p1 단백질에 비해 훨씬 더 강한 알레르기항원성(고알레르기항원성)을 나타내는 것으로 기술한다.
놀랍게도, 본원에 개시되고 청구된 개선된 MAT 분자의 안전성은 이러한 관점에서 우수하다. 놀랍게도 본 발명에 따른 iMAT 분자는 보통 강한 히스타민 방출을 유발하는 천연 알레르겐과는 대조적으로, 사실상 히스타민 방출 반응을 전혀 나타내지 않는다. 따라서, iMAT 분자는 선행 기술(상기 참조)에서 기술된 바와 같이 MAT 분자와 비교하여 안전성에 관해서 우위를 나타낸다.
선행 기술 MAT 분자와 대조적으로 iMAT 분자의 이러한 놀라운 안전성 특성의 결과는 탈감작화(desensitizing) 단백질로서 사용되는 iMAT 분자가 병원체에 대한 백신과 유사하게 사용될 수 있다는 것이다. iMAT 분자를 포함하는 백신은 알레르기성 유해 사건과 관련하여 알레르겐 특성을 보이지 않으므로 전형적인 치료학적 알레르겐에서와 같이 상향-투약을 필요로 하지 않는다. 이미 치료 과정에서 iMAT 분자의 첫 번째 주사의 용량은 효능 고려사항만에 기초하여 선택되고 잠재적인 알레르기성 역 반응을 고려해야만 하는 것은 아니다. 이는 천연 알레르겐과 비교하여, MAT의 알레르기항원성이 소정 수준으로 감소되기만 하므로 선행 기술에 기술되어 있는 MAT 분자를 사용하여 수행할 수 없었다. 그러나, 선행 기술에 기술되어 있는 MAT 분자는 여전히 알레르겐이고; 대조적으로 iMAT 분자는 알레르겐이 아니다. 이러한 개선된 특성의 이점은 생물약제 함량이 높은 예를 들면, 3회 피하 또는 림프내 주사(예를 들면, 3회의 1㎍ 내지 1000㎍, 바람직하게는 3회의 10㎍ 내지 50㎍의 iMAT 단백질)를 이용하여 보다 효능적인 치료 용법을 가능하게 한다.
iMAT 분자의 알레르기항원성이 결여된 것은 종래 기술에 기술되어 있는 MAT 분자와 대조적으로 링커 아미노산 잔기[즉, 제1, 제2 및/또는 제3 모듈(들) 사이의 스페이서 모듈(들)]가 이러한 iMAT 분자 내의 상이한 모듈들을 분리하는데 사용된다는 사실에 의해 설명될 수 있다.
펩타이드 또는 단백질 링커에 의해 연결된 2개 이상의 기능성 폴리펩타이드를 함유하는 조작된 융합 단백질은 단백질의 기능(예를 들면, 면역계에 의한 에피토프 인식)에 중요하다는 것이 선행 기술에 공지되어 있다[Klein JS et al., Protein Eng Des Sel. 2014, 27(10): 325-330]. 기능성 단위들 사이의 이격(separation) 거리는 에피토프 접근 및 결합활성(avidity)을 이용하여 결합하는 능력에 영향을 미칠 수 있다.
모듈들 사이, 특히 표적화 도메인과 항원 모듈 사이의 아미노산 잔기 링커가 상실된 본 발명의 iMAT 분자는 보다 강성인 구조를 유도하고, 알레르겐 모듈의 입체구조적 에피토프는 부정확한 폴딩으로 인하여 형성되지 않을 수도 있는 것으로 추정된다. 고 친화성 수용체에 의한 호염기구(예를 들면, IgE)의 표면 상에 결합된 항체의 가교 링크는 활성화 및 히스타민 방출을 유도하는데 필요하다. 그러나, 미스폴딩된(misfolded) 알레르겐은 이러한 가교 링크를 유도하지 못할 수도 있다. 따라서, 제1, 제2 및 제3 모듈 사이에 추가의 스페이서 모듈/링커가 없는 iMAT 분자는 입체구조적 IgE 에피토프를 형성할 수 없고, 이는 본 발명에 따른 iMAT 분자를 비-알레르기성이 되게 한다. 따라서, 한 특정 실시형태에서는 본 발명의 iMAT 분자에 제1, 제2 및 제3 모듈 사이에 임의의 추가의 스페이서 모듈 또는 링커가 결여되어 있다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명의 실시형태를 추가로 상세하게 기술하기 전에, 본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같은 단일 형태 하나 및 상기("a", "an", 및 "the")는 문맥에서 달리 명확하게 나타내지 않더라도 복수 언급을 포함하는 것임을 주지해야만 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 일반적인 숙련가 중 하나에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 모든 주어진 범위 및 값은 달리 지시되거나 또는 당해 기술 분야의 숙련가에 의해 공지되어 있지 않더라도 1 내지 5% 만큼 변할 수 있고, 따라서, 용어 "약"은 보통 명세서 및 청구범위에서 생략되었다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료는 본원에서 기술된다. 본원에 언급된 모든 공보는 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 공보에 보고된 물질, 부형제, 담체, 및 방법론을 기술하고 개시하는 목적을 위해 본원에 인용에 의해 포함된다. 본원의 어떤 것도 본 발명이 이전 발명에 의한 개시보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 구성되지 않아야 한다.
용어 "단리된 재조합 단백질", "재조합 단백질" 및/또는 "개선된 MAT(iMAT) 분자"는 본 발명 중에서 상호교환적으로 사용된다. 이들은 전부 동일한 의미를 갖는다.
용어 "모듈"은 본 발명 중에서 특정한 아미노산 서열, 예를 들면 정의된 기능을 갖는, 폴리펩타이드, 보통 짧은 아미노산/펩타이드 서열의 부분, 단위 또는 모이어티(moiety)를 말한다.
용어 "세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 (단리된) 재조합 단백질, 바람직하게는 개선된 MAT(iMAT) 분자의 전좌(translocation)를 가능하게 하는 아미노산 서열인 제1 모듈"은 또한 본원에서 "전좌 모듈" 또는 "전좌 서열"로서 상호교환적으로 나타내어지고, 본 발명 중에서 세포의 내부에, 특히 진핵생물 세포, 보다 구체적으로 문헌에 공지되어 있는 바와 같은 표면 상의 MHC 클래스 II 분자 및/또는 표면 상의 MHC 클래스 I 분자를 발현하는 세포의 내부에 화물(cargo) 분자의 수송을 촉진시키는 특정한 아미노산 서열, 예를 들면 아미노산 서열, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 및 다른 클래스들의 물질, 예를 들면 핵산 또는 약제학적 활성 성분(API)을 나타낸다.
전좌 모듈의 존재에 의해, 상기 세포로의 상기 화물 분자의 진입을 촉진시킬 수 있다.
전좌 모듈로서 유용한 아미노산 서열은 선행 기술에 기술되어 있다. 예를 들면, US 7,653,866은 단순 헤르페스 바이러스로부터 유도된 HIV-tat 분자 또는 단백질 VP22를 포함하는 몇몇의 유용한 전좌 서열을 개시한다. 세포의 내부로의 제공된 표적 분자의 진입을 촉진시키는 이러한 원리는 다양한 연구에서 적절한 특허 및 비-특허 문헌에 다양한 연구로 다수 기술되어 있다. 추가로, 적합한 전좌 서열로는 동종단백질 서열, 류신 지퍼 서열, 아르기닌-풍부(rich) 및/또는 리신-풍부 서열, 및 분비 신호 서열의 부재에도 불구하고 분비되는 단백질 또는 폴리펩타이드의 다양한 다른 서열이 포함된다. 바이러스 펩타이드 서열, 예를 들면, 단백질 HIV 전사 활성화인자 단백질(HIV tat)이 특히 유용하다. Tat 서열 또는 Tat 펩타이드는 다양한 변형을 포함하는 선행 기술에 기술되었다. Tat의 펩타이드 서열에 대한 선행 기술에 기술된 모든 변형은 일반적으로 전좌 모듈로서 적합하다. 다른 예로는 VP22 펩타이드뿐만 아니라 초파리(드로소필라(drosophila)) 항상성(homeotic) 단백질 안테나페디아(antennapedia)로부터 유도된 안테나페디아 펩타이드도 포함된다. 추가로, 다른 동종단백질을 사용할 수 있다. 적합한 동종단백질의 다양한 예는 선행 기술에 기술되어 있다. 추가로, 사람 cFos-(139-164), 또는 사람 cJun-(252-279)과 같은 류신 지퍼 단백질을 사용할 수 있다. 또한, 아르기닌-풍부 및/또는 리신-풍부 펩타이드는 HIV-1 rev(34-50) 또는 바이러스 또는 효모로부터 유도된 다른 펩타이드와 같은 서열을 포함하는 전좌 모듈로서 적합하다. 물론, 폴리아르기닌-풍부 및/또는 폴리리신-풍부 펩타이드는 합성으로 제조될 수 있다. 상기 폴리아르기닌-풍부 및/또는 폴리리신-풍부 펩타이드는 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 적합한 예는 적절한 선행 기술에 기술되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 전좌 모듈은, 그러나 여전히 기능성인, 즉, 효과적으로 세포 진입을 촉진시킬 수 있는 최소 서열 대신에, 상기 예시된 바와 같이 완전한 단백질 서열로 이루어지지 않는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어진다. 적합한 최소 서열은, 예를 들면 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR(서열번호 1)이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 전좌 모듈은 HIV-tat, VP22 및/또는 안테나페디아 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들로 이루어지고, 단 이러한 적어도 하나의 전좌 모듈은 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 전좌를 위한 모듈로서 기능성이다.
용어 "항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 (단리된) 재조합 단백질, 바람직하게는 개선된 MAT(iMAT) 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 제2 모듈"은 또한 본원에서 "표적화 모듈" 또는 "표적화 서열"로서 상호교환적으로 나타내어지고, 본 발명 중에서 항원의 처리 및/또는 항원을 이용한 MHC 분자의 적재에 관여하는 이러한 세포 소기관에의 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질의 세포내 수송을 가능하게 하고/이러한 수송을 촉진시키는 특정한 아미노산 서열을 나타낸다.
특히, 이러한 세포 소기관은 세포질 세망, 골지 기관, 트랜스-골지 네트워크, 리소좀, 엔도솜 및 MHC II 구획을 포함한다. 이들 세포내 소기관은 처리, 예를 들면, 항원의 수송 및/또는 처리, 항원 또는 처리된 항원으로 MHC II 분자의 제조 및/또는 적재, 및/또는 이러한 항원이 적재된 MHC II 분자의 세포 표면으로의 수송에 관여한다.
다수의 서열은 선행 기술에 공지되어 있다. 유용한 표적화 서열의 중요한(prominent) 예로는 Ii 불변 쇄 또는 MHC II 감마 쇄로서도 공지되어 있는 MHC 클래스 II 분자의 불변 쇄가 포함된다. 불변 쇄의 다양한 변이는 특허 및 비-특허 문헌에 기술되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 불변 쇄는 면역 반응은 조절되어야만 하는 종으로부터 그리고/또는 iMAT 분자가 세포내로 표적화되어야만 하는 종으로부터 선택된다. 포유동물 종 사이에 상동성 Ii 아미노산 서열의 차이가 존재하므로 이러한 종 특이성은 상기 iMAT 분자에서 나타내어질 필요가 있다(도 10). 그러나, 특히 CLIP 영역에서의 MHC 클래스 II의 αβ 서브유닛에의 Ii 융합 단백질(iMAT)의 적절한 결합은 상기 iMAT 분자에서 항원과 관련된 최적의 면역학적 기능에 요구된다. 상기 MHC 클래스 II 분자에의 적절한 결합은 iMAT 내의 Ii 서열이 가능한 한 본래 서열과 유사하면 달성된다.
예를 들면, 개, 고양이, 소, 양, 염소 또는 돼지에 대한, 선택된 바람직한 불변 쇄는 개, 고양이, 소, 양, 염소 또는 돼지 불변 쇄이다. 개 및 고양이의 경우, 바람직한 불변 쇄는 서열번호 2(개) 및 서열번호 3(고양이)에 따른 아미노산 서열 또는 이들의 단편이고, 단 이러한 단편은 이의 세포내 수송 기능(도 10에 나타낸 바와 같은 처음 110개의 아미노산)을 유지한다.
표적화 서열의 다른 적합한 예로는 표적화 모듈로서 적합한 서열을 포함하는 리소좀 막 단백질이 포함된다. 즉, 리소좀을 표적화하는 것을 가능하게 하는 서열 모티프를 갖는 리소좀에서 일어나는 다수의 막 단백질. 이들 그룹의 단백질은 그 중에서도 lamp 1, lamp 2, lamp 3, limp II 및 lap을 포함한다. 추가로, 테트라스판(tetraspan) 단백질은 선행 기술에서 표적화 모듈로서 공지되어 있다. 추가의 단백질은 표적화 특성을 나타내는 엔도솜/리소좀 구획에서 발견될 수 있다. 숙련가는 이에 따른 적합한 표적화 서열을 결정하는 방법을 알고 있다.
다른 실시형태에서, 적어도 하나의 표적화 모듈은 개, 고양이, 소, 양, 염소 또는 돼지 불변 쇄 또는 이의 단편을 포함하고, 바람직하게는 이들로 이루어지고, 단 이러한 단편은 이들의 세포내 수송 기능을 유지한다.
한 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 표적화 모듈은 서열번호 4(개)를 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 개 불변 쇄이다.
한 추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 표적화 모듈은 서열번호 5(고양이)를 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 고양이 불변 쇄이다.
용어 "적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 제3 모듈로서, 이러한 (단리된) 재조합 단백질, 바람직하게는 개선된 MAT(iMAT) 분자(대상체, 바람직하게는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서)에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 제3 모듈"은 또한 본원에 "항원 모듈" 또는 "항원 서열"로서 상호교환적으로 나타내고, 본 발명 중에서 에피토프/항원에 대항하는 면역 반응을 조절하고, 대상체, 바람직하게는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 면역 반응의 특이성을 결정하도록 하는 특정한 아미노산 서열을 말한다.
이러한 문맥에서, 이러한 항원 모듈(들)은 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌 및/또는 아스파르트산으로 치환된 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다. 따라서, 면역 반응은 항원의 변화되지 않은 아미노산 서열에 노출된, 대상체, 바람직하게는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이의 면역 반응과 비교하여 상이하다.
상기 방법에 기초한 항원에 관련된 제한은 없다. 상기 방법은 예를 들면 병원체에 대항하여, 예를 들면, 바이러스, 박테리아, 진균류, 기생충, 원생동물 등에 대항하여 대상체의 면역 시스템을 활성화시키는데 사용될 수 있고, 즉 매우 일반적으로는 백신으로서 사용될 수 있다. 추가로, 상기 방법은 이러한 병원체에 대항하여 직접적으로 사용될 뿐만 아니라, 바이러스, 박테리아, 진균류, 기생충, 원생동물 등에 관련된 매개체-감염 질환(vector-borne disease)의 전염를 예방하는 숙주 면역 시스템을 활성화시키는데 사용될 수 있다. 추가로, 상기 방법은 변성된 세포, 예를 들면 종양 세포 등에 대항하여 면역 시스템을 활성화하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이는 또한 한편으로는 예를 들면, 식품으로부터 유도된 알레르겐 및/또는 공기 알레르겐(aeroallergen), 예를 들면, 곰팡이(진균류 및/또는 이들의 포자), 화분, 동물 털, 집먼지 또는 사료 진드기(및/또는 이들의 배설물), 곤충 독성 등에 대항하여 대상체의 면역 시스템의 탈감작화를 위해, 또는 예를 들면, 관절염, 류마티즘, 당뇨병, SLE(systemic lupus erythematosus: 전신성 홍반성 루푸스) 등과 같은 자가면역 반응이 존재하는 경우, 면역 시스템의 표적화된 억제를 위해, 그리고 이식 거부 반응을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 명확히 언급되지 않고 너무 강하거나 너무 약한 면역 반응과 관련되어 있는 추가의 장애는 마찬가지로 본원에 개시되거나 청구된 iMAT 분자로 치료될 수 있다.
원칙적으로 면역 반응을 조절할 수 있는 항원의 모든 타입을 본 발명의 목적을 위한 항원 모듈로서 사용하는 것이 가능하다. 현재 이미 공지되어 있는 항원 및 향후에 발견될 항원 둘 다가 적합하다. 이러한 상황에서, 항원은 또한 현재 기술 분야에 공지되어 있는 통상의 면역화 방법으로 면역 반응을 유도하지 않지만, 본 발명에 기술된 신규한 방법의 적용시 대상체에 의한 면역 반응을 유도하는 것일 수 있다. 추가로, 용어 항원은 에피토프(들)로서도 공지되어 있는 항원성 결정인자/항원성 결정인자들을 포함하는 항원성 단편을 포함한다. 따라서, 항원 모듈은 전체 분자, 예를 들면, 단백질일 수 있거나, 적어도 하나의 항원성 결정인자 또는 에피토프를 포함하는 펩타이드와 같은 분자의 일부, 즉 이의 단편이다. 적어도 하나의 항원성 결정인자 또는 에피토프는 항원에 대항하여 면역 반응을 유발할 수 있다. 에피토프는 하나 또는 하나 초과의 아미노산 또는 펩타이드 또는 면역 반응을 유발할 수 있는 다른 구조, 예를 들면, 당 구조, 인산화된 아미노산 등 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 항원은 연속적 에피토프(즉, 입체구조에 의존하지 않음, 예를 들면, 천연 및 변성 단백질로 존재함) 또는 불연속적 에피토프(즉, 입체구조에 의존함, 예를 들면, 단지 천연으로만 존재함, 폴딩됨, 그러나 변성 단백질로 존재하지 않음)일 수 있다. 단백질 및 펩타이드뿐만 아니라, 당 구조, 지질, 예를 들면, 리포폴리사카라이드, 리포테이코산 및 박테리아 막의 다른 구성성분(CD1b는 예를 들면 당 구조 및 지질에 결합한다), 핵산, 예를 들면, CpG 모티프를 포함하는 DNA, 유기 물질, 예를 들면, 라텍스 또는 본 발명의 목적을 위한 항원으로서의 약제학적 활성 물질을 사용할 수 있다. 항원은 모든 가능한 생물 형태(life form), 예를 들면, 동물, 식물, 진균류, 기생충, 단세포 또는 다세포 미생물, 바이러스 및 다른 생물 형태로부터 유도될 수 있다. 항원은 생물학적 재료로부터 단리되었거나, 재조합 항원으로서 제조되었거나, 합성에 의해, 예를 들면, 펩타이드 합성에 의해 제조되었을 수 있다. 합성으로 제조된 항원은 자연에서 발생하거나 자연에서 발생하지 않지만 화학적 합성에 의해 수득될 수 있는 물질일 수 있다. 그러나, 몇몇의 상황에서 항원으로서 적합한 비-자연 발생 물질의 예로는 예를 들면, 의약에 존재하는 합성으로 제조된 물질, 또는 자연에서 발생되지 않는 아미노산 서열을 갖는 합성 펩타이드, 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic) 등이 있다. 자연 발생 또는 합성 또는 재조합 항원은 분자 생물학, 효소, 화학적 및/또는 기타 방법에 의해 변형되어 특정 적용을 위해 보다 유리한 특성을 이들에 부여할 수 있다. 이들 유리한 특성은 그 중에서도 항원으로서의 보다 높거나 보다 낮은 활성, 항원으로서의 보다 광범위하거나 보다 특이적인 작용, 친수성 또는 소수성 용매에서의 보다 우수한 용해도, 세포 막에 대한, 소기관의 막에 대한, 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)에 대한, 혈액-CSF 장벽 등에 대한 항원 모듈의 보다 큰 투과성, 생체내에서의 또는 시험관내에서의 보다 높거나 보다 낮은 반감기, 보다 낮거나 보다 높은 독성, iMAT 분자 등 형태로 항원을 적용한 후 생체내에서의 또는 시험관내에서의 항원의 보다 우수한 검출능일 수 있다. 다수의 항원을 하나의 항원 모듈로 조합하는 것이 본 발명의 목적을 위해 추가로 가능하다. 이를 위해, 동일한 항원이 항원 모듈에서 하나 초과의 카피로 존재하는 것이 가능하거나, 예를 들면 동일한 항원의 상이한 변형이 항원 모듈에서 조합되는 것이 가능하다. 항원 모듈에서 항원, 예를 들면 항원 1, 및 다른 항원, 예를 들면, 항원 2의 조합 등도 또한 가능하다. 추가의 조합, 예를 들면, 하나 초과의 카피의 항원 1 및 단일 카피의 항원 2는 또한 항원 모듈 등으로 조합될 수 있다. 또한 추가로 하나 이상의 상이한 및/또는 하나 이상의 동일한 항원 모듈이 iMAT 분자에 존재하게 될 수 있다. 원칙적으로, 하나 이상의 상이한 항원으로부터 유도된 단일 또는 다중, 동일한 또는 변경된 카피의 항원의 모든 가능한 조합이 본 발명의 목적을 위해 조합될 수 있음이 생각될 수 있다.
한 바람직한 실시형태에서, 항원 모듈은 적어도 하나의 항원으로부터 유도된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하고, 여기서, 이러한 항원은 알레르겐이다. 적어도 하나의 에피토프는 알레르겐에 대항하는 면역 반응을 유발할 수 있고, 이에 의해 에피토프는 하나 또는 하나 초과의 구조, 예를 들면, 펩타이드를 포함할 수 있고, 면역 반응을 유발할 수 있다. 에피토프는 알레르겐의 연속적 에피토프 또는 불연속적 에피토프일 수 있다. 에피토프는 바람직하게는 적어도 8개의 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 적어도 13개의 아미노산 길이이다. 항원 모듈은 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하지만, 또한 서로 동일하거나 상이할 수 있는 2개 이상의 전체 또는 부분 에피토프를 포함할 수 있다. 추가로, 항원 모듈은 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프에 인접한 추가의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 에피토프는 자연 발생 에피토프일 수 있거나, 이의 아미노산 서열에서 변형되고/되거나 하나 이상의 번역 후 변형에 의해 변형된 에피토프일 수 있다.
한 실시형태에서, 적어도 하나의 제3 항원 모듈은 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 하나 이상의 감염성 질환(들)에 관련된 병원체의 적어도 하나의 항원으로부터 유도된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함한다. 이는 캄필로박터, 디로필라리아, 에를리히아, 레이슈마니아, 트립파노소마, 보렐리아, 오르토부니아바이러스, 오르비바이러스, 플라비바이러스, 로타바이러스, 코로나바이러스, 트리코파이톤, 마이크로스포룸 속; 쿠페리아, 하에몬쿠스, 오스테르타기아, 트리코스트론길루스, 딕티오카울루스, 메타스트론길루스와 같은 기타 연충; 및/또는 에이메리아, 이소스포라, 크립토스포리디움, 기아르디아와 같은 위장 침습을 이용한 원생동물로부터 유도될 수 있다 - 또한 기생충의 경우에는 전-증상 단계로부터 유도된 항원도 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 iMAT 분자에서의 적어도 하나의 항원 모듈은 또한 예를 들면, 쿨리시다에, 세라토포고니다에, 플레보토미나에 익소디다에 및/또는 시미시다에에 속하는, 하나 이상의 감염성 질환(들)의 전염에 관여하는 매개체의 항원(예를 들면, 타액 구성성분)일 수도 있다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 제3 항원 모듈은 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서 하나 이상의 알레르기(들)를 유발하는 적어도 하나의 알레르겐으로부터 유도된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함한다. 이는 음식 및/또는 곰팡이(진균류 및/또는 이들의 포자), 화분, 집먼지 또는 사료 진드기(및/또는 이들의 배설물), 바람직하게는 나무, 잔디, 초본, 돼지풀로부터의 화분 및/또는 십자화과 화분 및/또는 아스페르길루스, 알테르나리아, 보트리티스, 세르코스포라, 클라도스포리움, 쿠르불라리아, 드레크슬레라, 유로티움, 헬민토스포리움, 에피코쿰, 에리시페/오이디움, 푸사리움, 리치테이미아, 니그로스포라, 페니실리움, 페리코니아, 페로노스포라, 폴리트린시움, 사카로폴리스포라(이전에 또한 파에니아 또는 마이크로폴리스포라), 써모악티노마이세스, 스템필리움, 토룰라 속의 진균류 및/또는 이들의 포자 및/또는 아카루스, 글리코파구스, 티로파구스, 더마토파고이데스, 유로글리푸스, 레피도글리푸스, 블로미아 속의 진드기(또는 이들의 배설물) 및/또는 세라토필러스, 크테노세팔리데스, 풀렉스, 아르카에오프실라 속의 벼룩으로부터 유도된 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프일 수 있다.
한 바람직한 실시형태에서, 이는 바람직하게는 진드기, 보다 바람직하게는 더마토파고이데스 속으로부터 유도된 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프이다.
더마토파고이데스 속의 알레르겐의 예는 종, 알레르겐 및 UNIPROT 등록 번호를 밝히는 도 9(도 9a 및 도 9b)에 나타내어진다.
추가의 바람직한 실시형태에서, 이러한 적어도 하나의 알레르겐은 서열번호 11(전장) 및 서열번호 18(iMAT 형태)에 따른 Der f 15이다. 항원 모듈의 바람직한 특정 서열은 서열번호 7 내지 서열번호 23, 바람직하게는 서열번호 14 내지 서열번호 23(iMAT 형태)에 따른 아미노산 서열이다.
본 발명 중에서 "(단리된) 재조합 단백질" 및/또는 "iMAT 분자"와 연관된 용어 "(…)에 의해 조절되는 면역 반응" 또는 상호교환적으로 "면역조절성 면역 반응"은 면역원성 및/또는 면역관용성(tolerogenic) 면역 반응을 말한다.
용어 "하이브리드 iMAT" 또는 "iMAT 하이브리드" 또는 "모자이크-유사 iMAT"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 iMAT 분자의 제3 모듈에 2개 이상의 항원 유래의 하나 초과의 전체 또는 부분 에피토프 서열을 포함하는 iMAT 분자를 말한다. 바람직하게, 상기 항원은 2개 이상의 알레르겐, 보다 바람직하게는 상이한 알레르겐 유래의 2개 이상의 짧은 펩타이드 서열이고, 이는 (대상체, 바람직하게는 동물에서의) 이러한 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정한다.
본 발명 중에서 용어 "알레르겐"은 천연 형태에서 비정상적으로 격렬한 면역 반응을 생성하는 항원의 타입을 말하고, 여기서, 면역 시스템은 그렇지 않으면 대상체에게 해로울 수 있는 모든 인지되는 위협을 제거하기 위해 대항한다(fights off). 전형적으로, 이러한 종류의 반응은 알레르기로서 공지되어 있는 표현형을 초래한다. 다양한 타입의 알레르겐은 선행 기술에 기술되어 있고, 식품, 약물, 동물성 제품 또는 천연 또는 합성 재료가 포함된다. 바람직하게는, 적어도 5마리의 대상체, 바람직하게는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 이의 천연 형태로 특이적 IgE 반응을 유발하는 경우, 단백질은 알레르겐인 것으로 간주된다. 의심을 회피하기 위해, "적어도 하나의 알레르겐으로부터 유도된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 (제3) 항원 모듈"과 관련된 "알레르겐"은 더 이상 천연 형태로 존재할 필요가 없고, 이는 또한 바람직하고 - 다시 말해서 본 발명 중에서 용어 "알레르겐"은 또한 명백하게는 본원에 기술되고 청구된 바와 같이 iMAT 분자의 부분으로서 비-천연 아미노산 서열을 말하고, 이는 적어도 5명의 대상체, 바람직하게는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서 더 이상 특이적 IgE 반응을 유발하지 않는다.
용어 치료학적 알레르겐의 "알레르기항원성"은 유해 사건을 유도하는, 예를 들면, 아나필락시스를 유발하는 잠재력의 측정값이다. 예시적으로 포유동물에서의 알레르기의 경우, 개에서의 알레르기항원성을 측정하는 검정은 문헌(Griffin et al. [Griffin CE. Diagnosis of canine atopic dermatitis DOI: 10.1002/9781118738818.ch10])에 기술되어 있다. 이러한 문헌은 알레르겐 유발 시험, 특히 피부를 표적으로 하는 이러한 시험으로서의 절차에서 알레르겐 특이적 IgE 매개된 과민증의 측정을 기술한다. 재조합 알레르겐의 생물학적 평가를 위해 그리고 유전적으로 조작된 저알레르기성 유도체의 검증(validation)을 위해 진피내 피부 시험을 사용한다. 개에서의 진피내 시험은 개의 진피에 소량의 알레르겐 용액의 주사를 직접적으로 투여함으로써 수행한다. 이는 소형-게이지(gauge)(27게이지)의 니들 및 각각의 부위에의 0.05 내지 0.1mL의 주사로 수행된다. 양성 반응은 홍반의 존재, 팽만, 발진(wheal)의 높이 및 크기에 의해 임의로 해석된다. 진피내 시험의 이점은 높은 감도이다. 이는 시험이 알레르기항원성에 대한 정량적 측정을 제공해야만 하는 경우 특히 중요하다. 본 발명에 따른 iMAT 분자를 이용하여 그리핀(Griffin) 등에 의한 상기 시험을 수행하면, 이들 iMAT 분자는 예를 들면, 고양이 및 개와 같은 감작화된 개체에서의 양성 반응에 도달하기 위한 동일한 시험에서 적용된 상응하는 천연의 본래 알레르겐과 비교하여 10-, 100- 내지 1000-배 또는 심지어 보다 높은 몰 농도의 알레르기성 구성성분을 나타낸다.
용어 "에피토프"는 또한 본원에서 "항원성 결정인자"로서 상호교환적으로 나타내고, 본 발명 중에서 B-세포 또는 T-세포 중 어느 하나의 면역 시스템에 의해 인지되는 항원의 부분을 나타낸다. 에피토프는 이들이 결합된 MHC 분자의 수단에 의해 항원 제시 세포의 표면에 제시된다.
용어 "대상체"는 또한 본원에서 "개체" 및/또는 "유기체" 및/또는 "숙주"로서 상호교환적으로 나타내어지고, 본 발명 중에서 바람직하게는 말을 제외한 동물, 및/또는 사람, 예를 들면, 반추동물, 돼지, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이를 나타낸다. 용어 "반추동물"은 본 발명 중에서 소, 염소 및 양을 포함하는 반추하는 포유동물을 포함한다. 따라서, 보스, 카프라 및/또는 오비스 속의 구성원들은 "소", "염소" 및/또는 "양" 종을 상호교환적으로 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "동물"은 포유동물을 포함한다. 상기 동물은 반추동물 또는 "개" 종(예를 들면, 개, 늑대, 여우, 코요테, 재칼)으로서 상호교환적으로 나타내어지는 속 또는 캐니스 속의 구성원, "고양이" 종(예를 들면, 사자, 호랑이, 집 고양이, 야생 고양이, 기타 대형 고양이과 동물, 및 치타 및 스라소니를 포함하는 기타 고양이과 동물)으로서 상호교환적으로 나타내어지는 속 또는 펠리스 속의 구성원, 또는 돼지, 즉 "돼지" 종으로서 상호교환적으로 나타내어지는 수스(Sus) 속의 구성원으로 이루어지는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 함께 본 발명 중에서 동등한 것으로 사용된다. 펩타이드 또는 단백질은 본 발명의 목적을 위해 펩타이드 링크를 통한 적어도 2개의 아미노산의 공유 결합을 의미한다. 용어 "아미노산" 및 용어 "아미노산 잔기"는 본 출원에서 동등한 것으로서 사용되고, 즉 두 용어의 의미는 동일하다. 용어 아미노산/아미노산 잔기 및 펩타이드/단백질은 본 출원에서 가능한 가장 넓은 정의의 형태로 사용된다.
이와 관련하여, 용어 "재조합 단백질"은 진핵생물 또는 원핵생물 시스템에서 유전자 조작 및 발현에 의해 수득될 수 있는 폴리펩타이드를 나타낸다. 추가로, 상기 용어는 인공적 (예를 들면, 고체-상) 합성으로 수득된 폴리펩타이드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "상이한 아미노산 잔기"는 달리 언급되지 않는 한 시스테인 이외에 공지의 아미노산 잔기를 나타낸다. 예를 들면, 상기 아미노산 잔기는 자연 발생 아미노산 잔기, 예를 들면, 세린 또는 이소류신일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "선형"은 2차 구조가 결여되어 있는 본 발명에 따른 단백질을 말한다. 이러한 단백질은 종종 랜덤-코일 입체구조를 나타내는 것으로 추정되고, 여기서 단지 고정된 상관관계는 펩타이드 결합에 의한 인접한 아미노산 잔기의 연결(joining)이다.
한 바람직한 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 단량체성 형태 및/또는 선형으로 존재한다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 예방학적 및/또는 치료학적 치료를 포함하는 목적하는 임상학적 결과를 수득하기 위한 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질, 및/또는 상응하는 백신 및/또는 면역원성 조성물 및/또는 약제학적 조성물의 투여를 말한다.
본원에 사용된 용어 "면역 치료요법"은 예를 들면, 예방학적 및/또는 치료학적 백신접종에 의한 대상체의 치료학적 및/또는 예방학적 치료를 말한다.
"하나 이상의 감염성 질환(들)의 전염"과 관련하여 본원에 사용된 용어 "매개체"는 살아있는 유기체를 나타내고, 본원에서 용어 "생물학적 매개체", "생물학적 보균자(carrier)" 및/또는 "질환 보균자"와 상호교환적으로 사용되고, 예를 들면, 흡혈 곤충, 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기이다.
추가로, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 추가로 적어도 하나의 태그 모듈을 함유하는 것이 가능하고 바람직하다. 즉, 하나 이상의 상이한 및/또는 동일한 태그 모듈이 본원에 개시되거나 청구된 (단리된) 재조합 단백질의 일부인 것이 가능하고 바람직하다. 태그 모듈은 흔히 20개 이하의 아미노산으로 이루어지는 짧은 펩타이드 또는 아미노산으로 구성되지 않은 기능성 그룹, 예를 들면, 비오틴 또는 디곡시게닌일 수 있다. 적합한 태그 모듈로는 4 내지 12개 이상의 히스티딘 서열, 바람직하게는 직접적으로 연속적인 히스티딘 잔기, 바람직하게는 5, 6 또는 7개의 연속적인 히스티딘 잔기를 함유하는 익히 공지되어 있는 바람직한 His-태그가 포함된다. 다른 적합한 태그 모듈로는 HA-태그, FLAG-태그, GST-태그 또는 Strep-태그가 포함된다. 태그는 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질에서 어디든 존재할 수 있지만, 한 바람직한 실시형태에서는 태그 모듈은 (단리된) 재조합 단백질의 (유사) N-말단에 그리고/또는 C-말단에 존재한다.
태그 모듈은 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질을 단리하는데 유용하고, 추가로 이러한 (단리된) 재조합 단백질의 존재를 시험관내에서 또는 생체내에서 검출하는 것을 가능하게 한다. 추가로, 태그 모듈은, 인접한 모듈 또는 상이한 모듈을 이격시키는 링커로부터 임의로 하나 이상의 인접한 아미노산 잔기와 함께 면역 및/또는 면역의 지속기간을 위한 대용 마커로서 사용될 수 있는 표적 대상체에서의 특이적 면역학적으로 검출가능한 신호(예를 들면, 항체)를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질을 이용한 면역 치료요법은 자연적으로 존재하는 항원, 바람직하게는 알레르겐에 대한 노출 후 자연 면역 반응으로부터 질적으로 분명하지 않은 표적 대상체에서 항원-특이적, 바람직하게는 알레르겐-특이적 면역 반응을 유발한다. 따라서, 항원 모듈에 결합하는 항체는 iMAT 유도된 면역 조절 효과의 효율성을 위한 대용 마커의 목적에 적합하지 않다. 이러한 장애는 - 임의로 인접한 아미노산 잔기와 함께 C-말단 및/또는 (유사) N-말단 태그 모듈에 의해 수득되는 고유한, 항원-특이적 면역학적 신호를 측정함으로써 제거될 수 있다. 따라서, 이에 따른 적합한 대용 마커를 제공할 수 있다.
한 바람직한 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 적어도 하나의 태그 모듈, 바람직하게는 적어도 하나의 His-태그를 추가로 포함하고, 여기서 이러한 적어도 하나의 태그 모듈은 바람직하게는 (단리된) 재조합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에, 보다 바람직하게는 하나의 메티오닌 잔기 후의 N-말단에 존재한다.
또한, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질의 모듈, 즉 적어도 하나의 전좌 모듈, 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈은 이러한 모듈 중 적어도 2개 사이에 위치한 하나 이상의 스페이서 모듈에 의해 임의로 이격될 수 있다.
스페이서 모듈은 특히, 펩타이드 서열 또는 유기 분자일 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있는 다수의 스페이서 분자는 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 추가로, 본 발명의 목적을 위해 향후에 개발되거나 발견될 스페이서 분자도 사용할 수 있다. 적합한 스페이서 모듈은 그 중에서도 펩타이드 스페이서, 가교링커(corsslinker), 천연 또는 합성 중합체, 예를 들면 핵산, 치환된 또는 치환되지 않은 탄화수소 등이다.
커플링은 공유결합적(바람직함) 및 비-공유결합적 링크 둘 다에 의해 일어날 수 있다. 스페이서 모듈은 그 중에서도 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질의 다양한 모듈을 이들의 기능성과 관련하여 서로에 대한 역 효과(adverse effect)를 갖지 않도록 하는 간격으로 서로 분리하는 과업을 갖는다. 본 발명의 목적을 위한 (단리된) 재조합 단백질의 모듈은 화학적 및/또는 효소적 반응에 의해, 예를 들면, 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 하나 이상의 스페이서 모듈에 의해 커플링될 수 있다. 따라서, 요구되는 경우 스페이서 모듈에 의해 서로 연결되는 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질의 모듈을 분리할 수 있다.
그러나, 한 바람직한 실시형태에서 특히 상기 항원 모듈이, 적어도 하나의 알레르겐인 적어도 하나의 항원의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 경우, 임의의 이러한 추가의 스페이서 모듈, 즉 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈의 2개 이상의 인접한 모듈 사이의 추가의 스페이서 모듈은 전혀 존재하지 않는다.
본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질의 개체 모듈의 임의의 목적하는 배열은 일반적으로 가능하다. 각각의 모듈은 (단리된) 재조합 단백질에서 1회 이상 존재할 수 있다. 최소의 요구조건은 적어도 하나의 전좌 모듈, 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈의 존재이다. 추가의 모듈, 예를 들면 태그 모듈, 스페이서 모듈 등은 임의로 존재할 수 있지만, 존재할 필요는 없다. 모든 모듈은 본원에 개시되거나 청구된 (단리된) 재조합 단백질에서 1회 이상 존재할 수 있다. 모듈이 1회 초과로 존재하는 경우, 이들은 동일한 카피의 형태로 존재할 수 있거나, 모듈의 상이한 버젼은 각각의 경우에 단일 카피로 또는 하나 초과의 카피로 존재할 수 있다. 모듈, 예를 들면 His-태그 모듈 및 비오틴-태그 모듈의 동일한 클래스의 전체적으로 상이한 모듈이 본원에 개시되거나 청구된 (단리된) 재조합 단백질에 존재하는 것도 가능하다. 모듈 둘 다가 (단리된) 재조합 단백질에서 기능적으로 동일한 작업(태그 모듈)을 실행하지만, 이들의 분자 구조의 관점에서 공통점이 있어야 할 필요는 없다.
한 바람직한 실시형태에서, 모듈 중 하나의 2개 이상의 카피가 본원에 개시되거나 청구된 (단리된) 재조합 단백질에 존재하는 것이 가능하다. 즉, 동일한 또는 상이한 항원 모듈의 2개 이상의 카피가 존재할 수 있다. 대안으로, (단리된) 재조합 단백질은 대상체에서 면역 반응을 조절하기 위한 2개의 상이한 항원 모듈을 함유할 수 있다.
재조합 단백질에서 항원 모듈의 2개 이상의 동일한 카피는 예를 들면 이러한 관련 항원에 대한 향상된 면역 반응을 야기할 수 있다. 2개 이상의 상이한 항원 모듈은 예를 들면 2개 이상의 상이한 항원에 대하여 면역 반응을 동시에 조절하기 위해 하나의 (단리된) 재조합 단백질에서 조합될 수 있다. 2개 이상의 상이한 전좌 모듈이 본원에 개시되거나 청구된 (단리된) 재조합 단백질에서 사용될 수 있다. 예를 들면, Tat 서열 및 VP22 서열은 전좌를 보다 효율적으로 만드는 역할을 하는데, 이는 이에 따른 (단리된) 재조합 단백질의 전좌가 보다 광범위한 스펙트럼(spectrum)의 상이한 세포 유형 또는 조직 유형에서 효율적으로 일어나기 때문이다. 또한, 예를 들면 하나의 (단리된) 재조합 단백질에서 2개 이상의 태그 모듈을 사용할 수 있고, 예를 들면, His-태그 및 FLAG-태그이고, 이러한 경우에 예를 들면 His-태그는 재조합 단백질을 단리하기 위해 사용되고, 예를 들면 FLAG-태그는 (단리된) 재조합 단백질을 검출하는 역할을 한다. 하나의 (단리된) 재조합 단백질에서 2개 이상의 상이한 표적화 모듈을 사용할 수 있고, 예를 들면, MHC II 분자의 불변 쇄로부터의 서열 및 추가의 표적화 모듈로서 만노스 6-포스페이트 그룹을 사용할 수 있다. 예를 들면, 불변 쇄는 MIIC 내로의 표적화 모듈로서 작용하고, 만노스 6-포스페이트 그룹은 리소좀 내로의 표적화를 매개하고, 따라서 항원 제시의 효율 또는 항원-제시 세포 전체에 의해 제시된 항원의 상이한 에피토프의 수를 증가시킬 수 있다. 추가로, 본 발명의 iMAT 분자는 동일한 또는 상이한 종 유래의 2개 이상의 상이한 불변 쇄를 포함할 수 있고, 따라서 본 발명에 따른 단백질을 상이한 종으로 사용하는 것을 가능하게 한다.
본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질 내에 개체 모듈의 위치는 또한 적어도 하나의 전좌 모듈, 적어도 하나의 표적화 모듈 및 적어도 하나의 항원 모듈이 존재하는 한, 목적하는 대로 변화될 수 있다. 또한, (단리된) 재조합 단백질의 모듈의 전부 또는 일부는, 예를 들면 모듈의 선형 순차적 배열의 형태로 존재하지 않고, 원형으로 또는 분지화된(branched) 모듈 구조로 또는 그렇지 않으면 덴드리머(dendrimer) 형태로, 또는 선형 및/또는 분지화된 및/또는 원형 및/또는 덴드리머 분자 부분의 조합으로 존재할 수 있다. 이들 메커니즘, 예를 들면 IMPACTTM-TWIN 시스템(제조원: New England Biolabs, Beverly, MA, USA)에 의해 원형 융합 단백질을 제조할 수 있게 하는 특이적 벡터를 공급하는 발현 벡터의 시판 공급업자가 존재한다. 분지화된 모듈은 예를 들면 펩타이드를 합성함으로써 제조될 수 있고, 여기서 폴리 L-라이신으로부터 출발하여 신규한 라이신 잔기는 후속적인 라이신 잔기 각각의 유리 아미노 그룹 둘 다에 부착된다. 이러한 방식으로, 사실상 임의의 범위로 분지화된 펩타이드 구조를 생성할 수 있다. 이어서, 예를 들면 전좌 모듈 및/또는 표적화 모듈을 후속적으로 분지된 펩타이드 기본 구조 상에 합성할 수 있다. 추가의 모듈은 또한 선형, 원형 또는 분지화된 펩타이드 기본 구조 상에 단백질 라이게이션(ligation)에 의해 커플링될 수 있다. 또한, 예를 들면 비오틴 그룹을 펩타이드 합성 동안 펩타이드 기본 구조 내로 도입할 수 있고, 이어서 모듈은 이들 비오틴 그룹에, 예를 들면 스트렙트아비딘, Strep 태그 시스템을 통해 또는 PinPointTM 시스템을 통해 부착될 수 있다(각각 IBA GmbH, Gottingen, Germany and Promega Biosciences Inc., San Louis Obispo, CA, USA). 이어서, 이러한 방식으로 부착된 모듈은 비-공유결합적 링크를 통해 펩타이드 기본 구조에 커플링된다.
본 발명에 따른 iMAT 분자의 항원 모듈은 본원의 실시예 5 및 실시예 6에 예시적으로 그리고 상세하게 기술된 바와 같은 생물정보학 접근법에 의해 선택될 수 있다. 이는 iMAT 분자가 대상체, 바람직하게는 말의 제외한 동물, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 아토피성 피부염(AD), 음식 알레르기 및/또는 알레르기성 천식과 같은, 예를 들면, 피부, 호흡기 - 및 위장 시스템와 같은 상이한 표적 기관에서의 알레르겐 특이적 IgE 매개된 과민증 반응의 참여에 기초한 알레르기성 질환의 치료요법 및/또는 예방을 위한 백신으로서 특히 유용해질 수 있음을 의미한다.
한 바람직한 실시형태에서, 상기 (단리된) 재조합 단백질은 서열번호 24 내지 서열번호 83에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하고, 바람직하게는 이들로 이루어지는 것에 관한 것이다.
본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 특히 상이한 표적 기관, 예를 들변, 피부, 호흡기 - 및 위장 시스템에서의 알레르겐 특이적 IgE 매개된 과민증 반응의 참여에 기초한 알레르기성 질환을 앓고 있는 말을 제외한 동물과 같은 대상체, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 치료요법 및/또는 예방을 특이적으로 해결하기 위한 방법에서 유용하다.
수의학에서 알레르기는 특히 반려 동물의 분야에서 매우 중요하다.
개 및 고양이는 예를 들면, 개 아토피성 피부염 또는 고양이 아토피성 피부염 또는 고양이 천식과 같은 이러힌 잘환을 앓는다.
개 또는 고양이 아토피성 피부염(AD)은 특징적 임상학적 특성들을 갖는 유전적으로 취약한 염증성 및 소양성 알레르기성 피부 질환으로서 정의되었다. 가장 흔하게는 환경적 알레르겐에 대한 IgE 항체와 관련되어 있다. 아토피성 표현형은 IgE-매개된 피부 질환, 음식 알레르기 또는 "아토피성-유사 피부염"(ALD: atopic-like dermatitis)이라고 칭하는 병태에서 나타내어질 수 있다. ALD는 AD의 특징적 특성을 갖는 개에서의 소양성 피부 질환으로서 정의되지만, IgE 항체에 대해서는 음성 검사로서 정의된다. 고양이 아토피성 피부염은 개 아토피성 피부염과 다수의 유사성을 갖는다. 개 아토피성 피부염에서의 통상의 임상학적 징후로는 계절성 또는 비-계절성 소양증, 외이도염, 특히 겨드랑이, 서혜부 및 굴근 피부 표면에서의 재발성 및 만성 염증성 피부염, 재발성 세균 감염, 피부 마찰(skin rubbing) 및/또는 발 핥기 및 씹기(foot licking and chewing)의 병력이 포함된다.
AD의 병인 및 발병은 복잡하고, 유전적 소인, 피부의 정상적인 장벽 기능의 손상 및 면역학적 이상을 포함한다. AD를 갖는 동물은 유전환경에서의 알레르겐에 대해 민감하게 되는 것에 대해 유전적으로 취약한 것으로 생각된다. 알레르겐은 흡입하거나 피부, 호흡관 또는 GI 관을 통해 흡수되는 경우에 알레르겐-특이적 IE 생산을 일으키는 단백질이다. 이들 알레르겐-특이적 IgE 분자는 이들 분자 자신을 이러한 세포 상의 Fcε 수용체를 통해 조직 비만 세포 또는 호염기구에 부착시킨다. 이들 프라이밍된 세포가 특정 알레르겐과 다시 접촉하게 되는 경우, 비만 세포 탈과립(degranulation)은 단백질분해 효소, 히스타민, 브라디키닌 및 기타 혈관작용성(vasoactive) 아민의 방출을 초래하고, 이는 염증(홍반, 부종 및 소양증)을 유도한다. 피부는 개 및 고양이에서의 1차 표적 기관이지만, 이환 동물의 약 15%에서 비염 및 천식이 발생할 수도 있다.
진드기는 예를 들면, 개 및 고양이에서 아토피성 피부염 및 천식과 같은 알레르기성 질환의 주요 원인으로서 공지되어 있다. 종래, 알레르기성 질환의 치료학적 제제로서 알레르기의 원인 물질을 사용하는 탈감작화 치료요법이 가장 중요한 기본 구제법(remedy)으로서 간주된다. 특히, 탈감작화 치료요법은 회피하기 어려운 흡입 알레르겐과 같은 항원에 의해 유도되는 화분증, 집 먼지 알레르기 및 진균 알레르기와 같은 질환에 대해 광범위하게 수행된다. 그러나, 탈감작화 치료요법은 항원을 민감하게 하는 작용으로 인해 특히 아나필락시스에서의 부작용의 위험이 있으므로 iMAT 분자와 같은 안전한 치료학적 항원의 투여가 필요하다.
진드기 알레르기성 질환에 관해서, 몇몇의 종들이 더마토파고이데스 프테로니시누스, 더마토파고이데스 파리나에, 유로글리푸스 메이네이, 더마토파고이데스 시보니, 더마토파고이데스, 마이크로세라스, 레피도글리푸스 데스트룩토르, 블로미아 트로피칼리스, 티로파구스 푸트레센티아에, 글리코파구스 도메스티쿠스, 아카루스 시로와 관련되어 있다고 기술되어 왔다. 그러나, 더마토파고이데스 프테로니시누스 및 더마토파고이데스 파리나에의 2개의 유형의 진드기가 집먼지에서의 주요 알레르겐 공급원으로서 보고되어 왔다(Thomas, WR. et al., Chang Gung Med J 2004; 27:563-569). 주요 진드기 알레르겐은 이들 진드기로부터 분획화되었다.
더마토파고이데스 종(sp.)의 그룹 1 및 그룹 2 알레르겐은 알레르기 환자의 80%에서 IgE 및 Th2 사이토카인의 높은 역가를 유도한다. 알레르겐 Der p 3, 5, 6, 7 및 8은 대상체의 약 50%에서 보통 보다 낮은 역가로 IgE를 유도한다. 92/98kDa 파라미오신(그룹 11) 알레르겐은 알레르기 대상체의 80%에서 IgE에 결합하고, 98 및 60kDa 키티나제 효소(Der f 15 및 18)는 알레르기 대상체의 약 70% 및 54%에서 IgE에 결합하고, 알레르기성 개에 대해 중요한 알레르겐이다(McCall C et al., Vet Immunol Immunopath 2001;78: 231-247).
일반적으로, 잔디, 나무, 잡초의 화분, 집먼지, 먼지 및 저장 진드기(storage mite) 및 곰팡이 및/또는 곰팡이 포자와 같은 각종 환경적 알레르겐뿐만 아니라 표피 및 곤충 항원도 개 아토피성 피부염에서의 개의 감작화에 기여하는 것으로 기술되어 왔다(Hill et al. Vet Immunol Immunopathol, 2001;81(3-4):169-186).
상기 기술된 바와 같이 - 아토피성 표현형은 또한 다수의 임상학적 징후를 갖는 과민증인 음식 알레르기에 의해 유도될 수 있다. 위장 변화(예를 들면, 위장염, 설사 또는 구토) 이외에도, 음식 과민증은 흔히 동물에서 소양성 피부염 및/또는 얼굴 및 목의 피부염, 속립성 피부염, 일반화된 스케일링(scaling) 또는 대칭성 탈모증으로서 나타난다. 특히 고양이에서 호산구성 육아종의 모든 실체(entity)는 소정 음식 알레르겐에 대한 과민증의 결과일 수 있다.
가장 흔한 음식 알레르겐은 육류, 우유, 어류뿐만 아니라 또한 대두 및/또는 보다 일반적으로 통조림 식품 및 건조 식품으로부터 유도된다. 특히 후자에서는 첨가제 및/또는 저장 진드기에 대한 알레르기의 관여도 보고된다(Guaguere E et al. EJCAP, 2009, 19 (3), 234-241; Jackson HA, EJCAP, 2009, 19 (3), 230-233).
현재, 수의학적 치료학적 옵션은 증상적(예를 들면, 코르티코이드) 치료 및/또는 원인이 되는 식량(들)을 제거하는 것으로 제한된다. 그러나, 식이의 영양학적 균형에 역으로 영향을 미치지 않도록 주의를 기울여야만 한다. 보다 최근에는 가수분해된 단백질을 함유하는 식이가 이용가능하다. 단백질이 분해되고 - 따라서 알레르기성이 더 적어지고, 이는 효과적이고 내성이 좋아진다. 그러나, 이들 식이는 값이 비싸고 맛이 약한 경향이 있고, 이는 동물의 순응에 대한 시장의 제한일 수 있다.
식품 알레르기성 동물, 바람직하게는 개 및/또는 고양이를 치료하기 위한 알레르겐 특이적 면역 치료요법은 아직 적용되지 않았다.
한 추가의 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 특히 알레르기성 기도 염증 및/또는 폐쇄(알레르기성 천식)를 앓고 있는 고양이에서의 치료요법 및/또는 예방을 구체적으로 해소하기 위한 방법으로서 유용하다.
고양이는 자발적으로 사람 알레르기성 천식과 매우 유사한 호산구성 기도 염증 및 기도 과-반응성을 발달시킨다, 즉 고양이 알레르기성 천식은 급성, 생명을 위협하는 임상학적 징후로 나타날 수 있는 하부 기도의 만성 염증성 장애이다.
전형적인 치료는 완화 치료(예를 들면, 기관지 확장제 및/또는 코르티코스테로이드)만을 포함하지만, 현재는 원인 치료가 이용가능하지 않다. 캐롤 레이네로(Carol Reinero) 주변의 대학 그룹에 대한 일부 시범(pilot) 연구는 고양이에서의 유도된 버뮤다 잔디 알레르기성 천식의 동물 모델에서 알레르겐 특이적 면역 치료요법을 해소하였다.
고양이 알레르기성 천식은 복합 질환이지만, 공기 알레르기겐에 대한 명확한 노출은 병인학에서 중추적인 역할을 한다. 공기 알레르겐에 대한 노출을 제거함으로써 임상학적 완화를 달성할 수 있다. 그러나, 고양이 알레르기성 천식을 유발하는 것과 관련된 주요 항원은 지금까지 명확하게 밝혀지지 않았다. 고양이의 습관적 환경, 예를 들면, 화분, 곰팡이, 고양이 쓰레기로부터의 먼지, 향수, 실내 청정제, 카펫 탈취제, 헤어 스프레이, 에어로졸 클리너 또는 담배 연기에 다수의 잠재적 제제(agent)가 존재한다. 혈청 또는 피내 피부 검사를 사용하여 스크리닝했을 때, 실냉에서 키우는(kept in-house) 자연적 알레르기성 고양이는 사람 알레르기성 천식과 연루된 다수의 동일한 알레르겐, 주로 집먼지 및 저장 진드기 및/또는 화분에 IgE 반응성을 가졌다(Prost C, Rev Fr Allergol Immunol Clin, 2008, 48 (5), 409-413).
추가의 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 특히 벼룩 물림에 의해 야기된 AD(FAD)를 앓고 있는 고양이 및/또는 개에서의 치료요법 및/또는 예방을 구체적으로 해소하기 위한 방법에서 유용하다.
FAD는 개 및 고양이에서 벼룩 침습에 의해 야기된 가장 중증의 피부 알레르기 중 하나이다. FAD는 즉각적 및 지연된 형태의 과민증 둘 다의 증상을 가질 수 있다. 전형적으로, FAD에 민감성인 동물에서의 즉각적 과민성 반응은 벼룩 물림의 부위에의 발진 형성을 포함한다. 이러한 발진은 지연된 형태의 과민증을 나타내는 가피(crust)를 갖는 구진(papule)으로 진행될 수 있다. 벼룩 물림에 대한 과민성 반응은 유전적으로 취약한 동물에서 그리고 벼룩 물림에 대한 이전의 노출에 의해 감작화된 동물에서 발생할 수 있다. 또한, 벼룩 물림은 숙주의 홍반, 구진, 가피 및 탈모의 염증성 자극의 결과로서 스크래치-관련된 2차 감염을 야기할 수 있다. 이전의 연구는 애완동물이 일단 벼룩 물림에 대해 알레르기성이면 벼룩 물림에 대해 드물게 탈감작화되었음을 발견하였다. 따라서, 벼룩 제거 이외에도 동물의 고통을 경감시키는 것이 어려운 문제가 된다. 이러한 질환에 대한 현재 치료요법은 탈감작화 치료요법 또는 몇몇의 유형의 약리학적 개재의 사용을 포함한다. 그러나, 이들 치료학적 접근법의 각각은 몇몇의 단점을 갖는다. 예를 들면, 항-히스타민 의약은 나른함(drowsiness), 구갈, 배뇨 곤란 및 변비를 증가시킬 수 있고; 반면 전형적인 탈감작화 치료요법은 생명을 위협하는 아나필락시스성 쇼크를 야기할 수 있다. 이들 치료요법의 다른 단점은 도짐(recrudescence) 가능성이 높고 장기간 치료가 필요하다는 것이다. 따라서, 원치 않는 역 반응을 극복하기 위해서 신규한 효과적인 치료학적 접근법이 필요하고, 이를 개발해야만 한다. FAD의 효과적인 치료는 달성하기 불가능하지는 않더라도 어려웠다. FAD는 벼룩 풍토성 지역에서 고양이와 개의 약 15%에 피해를 입히고, 빈도는 매년 증가하고 있다. 지리적 영역에서, 효과적인 벼룩 제어는 모든 동물의 치료를 요구한다. 연구자들이 제안한 한 치료는 벼룩 알레르겐을 사용하는 동물의 탈감작화를 포함한다. 그러나, 벼룩 알레르기겐의 신뢰할 수 있고 정의된 조제(preparation)가 이러한 치료에 필요하다. 전체 벼룩 항원 조제는 FAD로 동물을 진단하고 감작화하는데 사용되어 왔다. 그러나, 상업적으로 이용가능한 전체 벼룩 추출물은 타액 단백질을 작은 부분으로서만 포함하고, 따라서 이들의 특정 알레르겐 함량이 예측할 수 없고, 따라서 제한된 유용성을 갖는다. 선행 기술 미국 특허 제7,629,446호뿐만 아니라 문헌[McDermott MJ et al. (Molecular Immunology 2000, 37: 361-375)]은 FAD에서 주요 알레르겐으로서 알레르겐 Cte f 1의 발견을 기술하고 있다. 이러한 공보에서, 이들은 벼룩 알레르기성 개 및 고양이에 대한 주요 알레르겐인 벼룩 타액 단백질, Cte f 1의 cDNA의 클로닝 및 특성확인을 기술한다. 본래 Cte f 1은 18kDa의 계산된 분자량 및 9.3의 pI를 갖는다. 질량 분광측정 분석은 본래 분자가 번역 후 변형을 갖지 않고 16개의 시스테인 모두가 분자내 디설파이드 결합에 관여함을 나타낸다. 그러나, 동일한 공보에서 저자는 재조합 단백질의 몇몇의 이소형(isoform)을 보여준다. 분비된 단백질에서의 16개의 시스테인은 이들 이소형의 발생을 유도하고, 이는 GMP 조건 하에서의 정제가 어려워지거나 심지어 불가능한 생성물이 제조되게 한다.
벼룩 물림에 실험적으로 감작화된 연구 개에서, Cte f 1은 주요 알레르겐이다. 진피내 피부 시험에서 그리고 고체상 ELISA에서 항원으로서 이. 콜라이(E. coli) 생산된 rCte f 1을 이용하여, IgE는 이들 실험적으로 감작화된 FAD 개의 100%에서 검출될 수 있다. 또한, 14마리의 감작화된 개 유래의 혈청을 사용하여 수행한 경쟁 ELISA는 3종의 상이한 발현 시스템(이. 콜라이, 피. 파스토리스 및 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포)에서 생산된 rCte f 1이 본래 Cte f 1에의 항원 특이적 IgE의 결합의 약 95%를 억제할 수 있음을 입증하였다.
Cte f 1을 포함하는 면역치료학적 접근법의 치료학적 잠재력은 J. Jin 등에 의해 입증되었다(Jin J. et al. Vaccine 28 (2010) 1997-2004). 이들은 DNA 백신 및 이의 동족체(cognate) 암호화된 단백질 항원(Cte f 1)의 동시적 공동-면역접종(co-immunization)이 뮤린 모델에서 FAD로부터 동물을 보호하는 잠재력을 나타냄을 보고하였다. 추가로, 이들의 연구에서 이들은 벼룩 침습 후 고양이에서의 확립된 FAD를 치료하기 위해 이러한 프로토콜을 임상학적으로 시험하였다. 이들은 2개의 공동-면역접종 후 이들 FAD 고양이에서의 피부염의 치료학적 개선을 보여주는 데이터를 제시하였다.
시스테인을 다른 아미노산 잔기로 치환하는 변형된 Cte f 1 서열을 포함하는 iMAT 분자는 최적화된 종 특이적 면역-조절성 효과를 달성하기 위해 고양이 또는 개 불변 쇄와 함께 알레르겐 모듈로서 iMAT 분자에 포함될 수 있다. 놀랍게도, 이들 분자는 (i) 적합한 발현 시스템에서 효율적인 재조합 단백질 생산을 가능하게 하고, (ii) 비만 세포와 같은 이펙터(effector) 세포는 변형되지 않은 Cte f 1과 비교하여 훨씬 더 높은 농도로 활성화되므로 실질적으로 감소된 안전성 위험을 갖고, (iii) 단지 3회의 주사 후 지속적 면역학적 효과 및 장기 지속성 임상학적 개선을 유도한다.
추가의 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 특히 박테리아에 의해 야기된 감염성 질환을 앓고 있는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 치료요법 및/또는 예방을 구체적으로 해소하기 위한 방법에서 유용하다.
그람-음성 세균 캄필로박터는 가축 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 돼지, 반추동물에서 위장염의 가장 흔한 박테리아성 원인이다. 임상학적 징후는 대부분 어린 포유동물에서 보다 심각하다. 장염 이외에도 다양한 종에서 유산 및 불임이 보고되었다. 감염은 주로 섭취를 통한 것이고 - 진입시 세균은 다양한 콜로니 형성(colonization) 및 독성 결정인자의 발현으로 숙주 방어를 극복할 필요가 있다. 이들 중 다수는 항원성 표면 또는 외막 단백질이고, 예를 들면, 위장관의 상피 세포와의 이들의 상호 작용은 콜로니 형성, 즉 숙주의 감염에 필수적이다.
이러한 의학적 문제를 해결하기 위해서, 본원에 개시되고 청구된 캄필로박터증 전용(dedicated) (단리된) 재조합 단백질에서 적어도 하나의 항원 모듈은 캄필로박터 종으로부터 유도된 항원, 예를 들면 플라겔린, 표면-노출된 단백질(CadF 및 PEB1) 또는 기타 표면 단백질로부터 선택될 수 있다. 개선된 MAT 분자는 예를 들면, 캄필로박터증의 치료요법 및/또는 예방을 위한 특히 백신으로서 유용할 수 있다. 본 발명에 따른 치료는 iMAT 분자를 자손에게 투여하는 것을 포함할 수 있고/있거나 임산부의 치료도 포함할 수 있다.
한 추가의 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 특히 바이러스에 의해 야기된 감염성 질환을 앓고 있는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 치료요법 및/또는 예방을 구체적으로 해소하기 위한 방법에서 유용하다.
예를 들면, 웨스트 나일 바이러스(WNV)는 플라비비리다에 과에서 플라비바이러스 속의 일본 뇌염 바이러스 혈청군(serocomplex) 내에 그룹화된 모기-전염된 양성-가닥의 RNA 바이러스이다. WNV는 또한 웨스트 나일 열(West Nile Fever)로 명명되는 질환 증후군의 원인성 제제이다. 새는 천연 병원소(reservoir) 숙주이고, WNV는 모기-새-모기 전염 주기로 자연에서 유지된다. 그러나, 사람, 말, 개, 고양이 및 반추동물이 민감성인 것으로 기술되어 왔다. 대부분의 WNV 감염은 임상학적으로 잠재성을 유지하지만(WNV는 잠재적으로 신경침습성 바이러스이다), 이는 뇌수막염 또는 뇌염을 야기할 수 있다. 동물에서 WNV는 주로 인지되지 않은 상태를 유지하지만, 동물들은 부전마비, 운동실조, 횡와(recumbency), 및 근육 섬유다발수축을 포함하는 WNV에 의해 야기된 중증의 신경학적 징후로 인하여 안락사될 수 있고, 반면 다른 것들은 경미 내지 중증의 회색질 뇌척수염을 나타낸다.
추가의 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 특히 매개체, 예를 들면, 흡혈 곤충, 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기에 의한 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 감염성 질환의 전염의 예방을 구체적으로 해소하기 위한 방법에서 유용하다.
병원체는 다양한 생물활성 분자를 함유하는 절지동물 타액과 함께 포유동물 숙주의 피부로 전달된다. 이들 타액 구성성분은 지혈 및 면역 반응을 변화시킬 수 있고 병원체가 감염을 유도하는 능력에 기여할 수 있다. 혈액-공급 절지동물의 타액선 내의 감염성 미생물의 존재 자체는 예를 들면, 감염된 모기에서의 아피라제 또는 항-트롬비나제의 농도 변화와 같은 타액 조성을 변화시킨다. 매개체-관련된 또는 타액 구성성분은 예를 들면, 혈관-활성을 변화시키고/시키거나 숙주의 면역 반응을 조절하고/하거나 감염성 질환의 전염에 결정적으로 중요할 수 있다. 절지동물의 타액 구성성분에 대한 숙주의 백신접종은 모래파리 타액 단백질 및 리슈마니아 종의 전염에 대해 나타낸 바와 같이 바이러스 전염을 방해할 수 있다. 그러나, 이들 백신은 전임상학적 연구(WHO PD-VAC 2014 - Status of Vaccine Research and Development of Vaccines for Leishmaniasis)를 통과하지 못했다.
절지동물 타액 항원은 본 발명에 따른 iMAT 분자의 항원 모듈에서 사용되기에 매우 적합하고, 구체적으로는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 매개체, 예를 들면 바이러스, 진균 및/또는 기생충에 의한 감염성 병원체의 전염 및/또는 이들의 전-증상 단계를 예방하기 위한 숙주 면역 시스템을 활성화하기 위한 백신으로서 유용할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 특히 진균류에 의해 야기된 감염성 질환을 앓고 있는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 치료요법 및/또는 예방을 구체적으로 해소하기 위한 방법에서 유용하다.
피부사상균증 또는 백선증은 동물 및 사람에서 발생하는 털의 그리고 피부의 표피상의 각화된 세포층의 진균 감염이다. 동물친화성(zoophilic) 또는 호지성(geophilic) 피부사상균의 그룹에 속하는 마이크로스포룸 속 또는 트리코파이톤 속의 몇몇의 종은 포유동물에서의 임상학적 감염을 야기할 수 있다. 진균 및/또는 이들의 포자의 다양한 표면 항원은 본 발명에 따른 iMAT 분자의 항원 모듈에 사용하기에 매우 적합하고, 특히 백신, 예를 들면 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 피부사상균증의 치료요법 및/또는 예방을 위한 백신으로서 유용할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 특히 기생충에 의해 야기된 감염성 질환을 앓고 있는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 치료요법 및/또는 예방을 구체적으로 해소하기 위한 방법에서 유용하다.
포유동물을 감염시키는 기생충은 흔히 볼 수 있고(ubiquitous), 전세계에 걸쳐 임상학적으로 중요하다. 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에의 주요 기생충 위협은 예를 들면, 쿠페리아, 하에몬쿠스, 오스테르타기아, 트리코스트론길루스, 딕티오카울루스, 메타스트론길루스이다. 기생충에서의 구충제 저항성의 증가 수준이 전세계적으로 보고된다. 원생동물, 예를 들면 크립토스포리디움의 경우, 숙주에서 기생충 침습 및/또는 번식(reproduction)을 지속적으로 억제하는 약물은 거의 없다. 주로 신생 또는 어린 포유동물이 영향을 받고 결과는 선천적 및 후천적 면역 반응에 의존한다.
성체 기생충 및 전증상 단계로부터 유도되는 항원은 본 발명에 따른 iMAT분자의 항원 모듈에서 사용되는 다른 예이고, 백신으로서, 구체적으로는 예를 들면, 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 기생충 감염의 치료요법 및/또는 예방을 위한 백신으로서 유용할 수 있다.
본 발명에 따른 치료는 새끼에의 iMAT 분자의 투여를 포함할 수 있고/있거나, 또한 임신부의 치료를 포함할 수 있다.
특히, 개, 고양이, 소, 양, 염소 또는 돼지 종에서의 면역 반응을 조절하는 경우, 적어도 하나의 표적화 모듈은 바람직하게는 각각의 불변 쇄이다.
한 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 표적화 모듈은 서열번호 2 또는 4에 따른 개 불변 쇄이다. 다른 바람직한 실시형태에서 적어도 하나의 표적화 모듈은 서열번호 3 또는 5에 따른 고양이 불변 쇄이다.
한 유리한 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은, 예를 들면 재조합 알레르겐은 특히 봉입체(inclusion body)를 통해 생산되는 경우에 응집체를 형성하는 경향이 있으므로 단량체성 형태로 존재한다. 상기 (단리된) 재조합 단백질의 전체 서열에서 적어도 하나, 바람직하게는 모든 시스테인 잔기를 치환함으로써, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌 및/또는 아스파르트산으로 치환함으로써, 분자간 디설파이드 결합 형성을 방지할 수 있고, 따라서 임의의 응집, 특히 분자간 및/또는 분자내 결합의 임의의 비-천연 형성이 회피된다. 즉, 시스테인 잔기가 전혀 없는 (단리된) 재조합 단백질은 응집되지 않는다. 결과적으로, 단백질은 쉽게 발현되며 향상된 표적화 및 MHC 제시를 입증한다.
또한, 예를 들면, 야생형 알레르겐의 아미노산 서열에서의 시스테인 잔기가 단독으로 또는 조합으로 돌연변이된 알레르겐의 이러한 시스테인-불포함 변이체는 상응하는 야생형 알레르겐과 비교하여 감소된 IgE 반응성을 나타내고, 동시에 T-림프구에 대한 실질적으로 유지되는 반응성을 갖고, 따라서 저알레르기성이다.
따라서, 본 발명은 예를 들면, 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서의 벼룩 물림; 소정 식품 구성성분에 대한 알레르기 및/또는 아토피성 피부염 및/또는 알레르기성 기도 염증 및/또는 폐쇄를 유발하는 알레르겐의 이러한 저알레르기성 변이체에 관한 것이고, 여기서 상기 변이체에서 야생형 알레르겐의 시스테인 잔기는 단독으로 또는 조합으로 돌연변이되었다.
또한, 본 발명에 따른 iMAT 분자를 포함하는 샘플에서 예를 들면, 아연- 또는 코발트-하전된 고체 지지체를 이용하여 단백질을 분리하기 위한 태그 모듈의 존재는 정제 프로세스 동안 응집 없이 융합 단백질을 생산할 가능성을 추가로 향상시킨다. 전형적으로, 태그 모듈은 5 내지 6개의 연속적 히스티딘 잔기의 폴리히스티딘 태그를 포함한다.
본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 약제학적 조성물에 유용하다. 예를 들면, (단리된) 재조합 단백질은 백신에 사용하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명은 본원에 개시되고 청구된 하나 이상의 (단리된) 재조합 단백질을 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 이러한 백신 조성물은 피부, 호흡기 및 위장 시스템과 같은 상이한 표적 기관에서의 알레르겐 특이적 IgE 매개된 과민증 반응의 참여에 기초한 알레르기성 질환을 앓고 있는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서 치료학적으로 그리고/또는 예방학적으로 사용될 수 있거나; 또는 이러한 백신 조성물은 병원체, 예를 들면 바이러스, 진균 및/또는 기생충에 의해 유도된 감염성 질환 및/또는 이들의 전증상 단계를 앓고 있는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서 치료학적으로 그리고/또는 예방학적으로 사용될 수 있다. 추가로, 상기 방법은 이러한 병원체에 대해 지시되는 것뿐만 아니라, 매개체, 예를 들면 흡혈 곤충, 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기에 의한 질환의 전염을 예방하기 위해 숙주 면역 시스템을 활성화시킬 수도 있다.
따라서, 본 발명의 한 바람직한 실시형태에서는 예를 들면, 더마토파고이데스 진드기에 대한 노출의 반응에 의해 야기되는 알레르기성 천식 및/또는 아토피성 피부염을 치료하고/하거나 예방하기 위해 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이와 같은 대상체를 위한 백신이 제공된다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 예를 들면 곰팡이(진균 및/또는 이들의 포자), 화분, 집먼지 또는 사료 진드기(및/또는 이들의 배설물)에 대한 반응에 의해 야기되는 알레르기성 천식을 치료하고/하거나 예방하기 위해 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 고양이와 같은 대상체를 위한 백신이 제공된다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 예를 들면 캄필로박터, 디로필라리아, 에를리히아, 레이슈마니아, 트립파노소마, 보렐리아, 오르토부니아바이러스, 오르비바이러스, 플라비바이러스, 로타바이러스, 코로나바이러스, 트리코파이톤, 마이크로스포룸 속; 쿠페리아, 하에몬쿠스, 오스테르타기아, 트리코스트론길루스, 딕티오카울루스, 메타스트론길루스와 같은 기타 연충; 및/또는 에이메리아, 이소스포라, 크립토스포리디움, 기아르디아와 같은 위장 침습을 이용한 원생동물과 관련된 감염성 질환을 치료하고/하거나 예방하기 위해 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이와 같은 대상체를 위한 백신이 제공된다 - 또한 기생충의 경우에는 전-증상 단계로부터 유도된 항원도 사용될 수 있다. 추가로, 백신은 예를 들면 쿨리시다에, 세라토포고니다에, 플레보토미나에 익소디다에 및/또는 시미시다에 과에 속하는 매개체 및/또는 흡혈 곤충에 의한 질환의 전염을 예방하기 위한 숙주 면역 시스템을 활성화시키기 위해 제공될 수 있다.
상기 (단리된) 재조합 단백질의 예를 들면, 백신 형태로의 약제학적 조성물은 설하 투여, 피하 및/또는 피내 주사, 림프절에의 주사용 그리고/또는 점막을 통한, 특히 위장관의 또는 호흡기 시스템의 점막을 통한 투여용으로 고안되는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 비경구 투여된다.
본 발명에 따른 iMAT 분자는 예를 들면, 알레르기성 장애를 변형시키기 위한 약제로서 또는 백신으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 아토피성 피부염 및/또는 알레르기성 천식은 이러한 iMAT 분자에 의해 치료될 수 있다.
더마토파고이데스 속의 진드기로부터 유발되는 아토피성 피부염 및/또는 알레르기성 천식의 알레르겐을 포함하는 소량(하나 이상의 항원 모듈 단독의 중량을 기준으로 하여 1 내지 1000μg)의 재조합 iMAT 분자는 예를 들면 피하, 피내 또는 림프절에 직접 1 내지 5회 주사되면 고양이 및/또는 개에서 강하고 장기 지속적인 면역 반응을 유도하여 질환의 예방 및/또는 임상학적 증상의 개선을 유도한다.
한 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 iMAT 분자는 적어도 하나의 애주번트(adjuvant)와 병용하여 투여된다. 애주번트로는 하기 중 하나 이상이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 백반, BCG, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 칼슘 포스페이트, 지질 에멀젼, 지질 또는 중합체성 나노 또는 마이크로스피어(microsphere), 미셸(micelle), 리포솜, 사포닌, 지질 A 또는 뮤라밀 디펩타이드, 박테리아성 제품, 케모카인, 사이토카인 및 호르몬, 키토산, 전분, 알기네이트, 셀룰로스 유도체(예를 들면, 에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 핵산 또는 핵산 작제물. 이들 구성성분들 중 하나 이상이 면역 반응을 향상시키거나 변형시키기 위해 부가될 수 있다. 대안으로, iMAT 분자는 애주번트 부재 하에 또는 수성 형태로 투여될 수 있다.
iMAT 분자는 약 1μg 내지 1000μg(이러한 및 후속 용량은 단지 하나 이상의 항원 모듈의 중량을 언급함)의 용량으로, 보다 바람직하게는 약 10μg 내지 약 100μg의 용량으로, 보다 더 바람직하게는 약 20μg 내지 약 50μg의 용량으로 투여될 수 있지만, 최적 용량은 주사되는 항원, 바람직하게는 알레르겐, 대상체의 체중 및 대상체의 면역 시스템 등에 따라 다를 수 있다. 다수의 경우에 효과적인 치료는 1회 투여로 달성될 수 있다. 몇몇 실시형태들에서, 치료는 1 내지 15회 투여를 포함한다. 바람직한 실시형태들에서, 치료는 1 내지 5회 투여, 보다 바람직하게는 1 내지 3회 투여를 포함한다. 초기 치료를 위해 투여는 주기적, 예를 들면 수일의 과정으로, 1개월 또는 1년에 1 또는 2회, 또는 1년에 수회일 수 있다. 면역 반응의 유지를 위해, 투여는 수개월 또는 수년 간격으로 수행될 수 있다.
본 발명의 한 바람직한 실시형태에서, 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질은 림프절내(lymphatic intranodal) 투여를 위해 고안된다. 림프절 내로의 직접 주사 동안, 각각의 림프절은 주사 절차 동안, 예를 들면 초음파에 의해 가시화되어 니들의 위치 및 림프절 내의 변화, 예를 들면 팽윤을 모니터링할 수 있다. 하악골, 겨드랑이, 서혜부 및/또는 슬와 림프절 내로의 주사는 초음파 안내된 위치 및 주사의 용이성으로 인하여 바람직하다.
배설물에서의 진드기로부터 그리고 전체 진드기 몸체로부터 동정된 몇몇의 단백질은 개 및/또는 고양이에서 IgE 반응성 및 병리학적 피부 및 호흡기 반응을 유도함이 당해 기술 분야에 공지되어 있다[Allergome (www.allergome.org)]. 따라서, 관련 알레르겐의 대부분이 특정한 면역 치료요법을 위한 의약에 포함되는 경우, 치료는 단지 성공적일 수 있음이 예상된다. 그러나, 놀랍게도 예를 들면, 진드기의 상이한 항원 모듈 또는 에피토프의 모자이크-유사 작제물을 각각 포함하는 본 발명에 따른 이러한 iMAT 분자가 1 내지 5회 피하, 피내 및/또는 직접적으로 림프절 내로 주사되는 경우, 단지 1, 2, 3 또는 4의 이러한 iMAT 분자는 이환 대상체의 면역조절 및/또는 임상학적 개선을 유도하는데 충분하다.
한 바람직한 양태에서, 단일 iMAT 분자가 사용되고, 이는 예를 들면 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 피부, 호흡기 및/또는 위장 시스템과 같은 상이한 표적 기관에서의 알레르겐 특이적 IgE 매개된 과민증 반응의 발병의 예방 및/또는 치료학적 효과의 유도에 충분하다. 감염성 질환의 예방 및/또는 치료요법 및/또는 매개체에 의한 감염성 질환의 전염 예방은 말을 제외한 동물, 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서 달성될 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 2, 3 또는 4의 iMAT 분자의 조합은 동시에, 순차적으로 및/또는 연대순으로 시차를 둔(chronologically staggered) 공동-투여의 수단에 의해 사용된다.
한 바람직한 실시형태에서, 단일 iMAT 분자가 사용되고, 이는 예를 들면, 바이러스, 진균 및/또는 기생충에 의해 유도되는 말을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 반추동물, 돼지, 개 및/또는 고양이에서 감염성 질환 및/또는 이들의 전증상 단계의 치료학적 효과의 유도 및/또는 예방 및/또는 전염의 예방 및/또는 예를 들면, 흡혈 곤충, 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기에 의한 이러한 감염성 질환의 전염의 예방에 충분하다.
다른 바람직한 실시형태에서, 2, 3 또는 4의 iMAT 분자의 조합은 동시에, 순차적으로 및/또는 연대순으로 시차를 둔 공동-투여의 수단에 의해 사용된다.
본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질의 열역학적 평가에 따라, 안정성은 시스테인 돌연변이, 즉 상이한 아미노산 잔기(들)의 치환에 의해 영향을 받는다. 예를 들면, 치환은 Cys 대 Ser 치환일 수 있다. 그러나, 안정성은 목적하는 안정성 및 용해도를 달성하기 위해 Ser 아미노산보다 상이한 아미노산 잔기를 사용하여 더 높을 수 있다. 즉, 제1 선택은 Cys의 Ser으로의 치환일 수 있지만, 불안정성의 경우 Ser 이외의 다른 아미노산 잔기는 Cys를 대체하여야만 한다.
표적화된 서열에서 시스테인 잔기에 대한 대체물로서 아미노산 잔기를 안정화시키는 선택을 위해 3개의 단계 접근법이 선택된다:
1.
말단 헥사-히스티딘 태그, iMAT 서열 및 목적하는 단백질의 1차 아미노산 서열을 포함하는 표적화된 단백질의 3차 구조의 모델링. 모델링은 본래 서열로 그리고 시스테인 치환으로 수행될 수 있다.
2.
단일 점(point) 치환, 예를 들면, 시스테인 잔기의 상이한 아미노산 잔기, 예를 들면, Ser 및/또는 Ile으로의 치환, 및 모든 이용가능한 3차원 구조를 분석하여 대체물의 안정화를 측정하기 위한 스코어링(scoring)을 기초로 한 단백질 안정성의 반복 측정.
3.
안정화된 구조의 리모델링 및 단계 1 및 2를 반복함으로써의 안정성의 입증.
3-차원 단백질 구조는 분자 수준의 단백질 기능을 이해하는데 중요하고, 다수의 상이한 유형의 생물학적 실험, 예를 들면, 부위-지시된 돌연변이 유발의 합리적인 고안에서 매우 흥미롭다. 그러나, 구조적으로 특성확인된 단백질의 수는 공지된 단백질 서열의 수와 비교하여 작다. 제공된 단백질 서열(표적)에 대해 공지된 구조(템플레이트(template))를 갖는 상동성 단백질을 확인할 수 있다. 이러한 경우, 상동성 모델링은 이의 1차 아미노산 서열로부터의 단백질의 신뢰성 있는 3D 모델을 생성하기 위한 선택 방법인 것으로 증명되었다. 상동성 모델을 구축하는 것은 4개의 주요 단계를 포함한다: (1) 구조적 템플레이트(들)의 확인, (2) 표적 서열 및 템플레이트 구조(들)의 정렬, (3) 모델 구축 및 (4) 모델 품질 평가. 이들 단계는 만족스러운 모델링 결과가 달성될 때까지 반복할 수 있다. 정확한 상동성 모델이 결정될 수 없는 경우, 1차 구조(아미노산 서열)로부터 단백질 구조를 결정하는 계산적 접근법이 사용된다. "드 노보(De novo)" 또는 "압 이니티오(ab initio)" 방법은 물리적 원리를 기초로 하고, 폴딩 처리를 모방하려고 시도한다. 이러한 방법은 다수의 입체구조를 샘플링하여야 하고, 자유 에너지의 전역 최소값에서 구조를 확인하는 매우 정확한 에너지 기능을 요구한다. 다수의 방법은 이들 기술된 원리의 조합을 사용한다.
단백질의 안정성에 대한 아미노산 치환의 영향의 합리적으로 정확한 추정을 생성하는 계산적 수단의 유용성은 광범위한 적용에서 결정적인 중요성이 있다. 특히, 이러한 도구는 변형된 단백질의 생성에 특정된 단백질 조작 및 고안 프로젝트를 자극하고 지지하는 잠재성을 갖는다.
단백질 안정성은 신속하게 가역적으로 언폴드(unfold)하고 리폴드(refold)하는 단백질의 열역학적 안정성의 관점에서 간주될 수 있다. 이들 경우에서, 단백질의 안정성은 폴딩된 상태와 언폴딩된 상태 사이의 깁스(Gibbs) 자유 에너지의 차이이다. 안정성에 영향을 미치는 유일한 인자는 폴딩된 상태와 언폴딩된 상태의 상대적 자유 에너지이다. 폴딩 자유 에너지 차이가 더 크고 보다 양(positive)일수록, 단백질이 변성에 대해 더 안정하다. 폴딩 자유 에너지 차이는 구상 단백질에 대해 전형적으로 5 내지 15kcal/mol의 정도로 작다. 그러나, 반면에 단백질 안정성은 혹독한(harsh) 온도 또는 용매 조건을 견디는 단백질 특성으로서 간주될 수 있다. 이는 열역학적 안정성뿐만 아니라 폴딩/언폴딩의 가역성 또는 비가역성(운동학적 안정성)에 관련된다.
단백질에서 단일 위치 치환에 의해 야기되는 열역학적 안정성 변화를 예측하기 위해, 몇몇의 상이한 접근법이 단백질 구조 및 기능에 대한 이러한 치환의 영향을 연구하기 위해 적용될 수 있다[Pires DE et al., Bioinformatics 2014, 30(3):335-342]. 이러한 접근법은 단백질 단독의 아미노산 서열로부터의 치환의 효과를 이해하기 위해 추구하는 방법 및 광범위한 구조적 정보를 활용하는 방법으로 광범위하게 분류될 수 있다. 구조-기반 접근법은 전형적으로 치환에 대한 단백질 안정성 변화의 지시 또는 실제 자유 에너지 값(ΔΔG)을 예측하기 위해 시도된다.
각각의 특이적 단백질에 대한 결과 및 이의 상응하는 모델은, 사용된 모델에서의 발생 및 단백질 안정성 자유 에너지 변화(ΔΔG)에 기초하여 대체물을 등급화하는, 스코어링 시스템을 사용하여 특이적 치환의 출현 수의 관점에서 통계학적으로 분석하고, 이에 의해 가장 불안정하게 만드는 잔기(존재하는 경우)를 인풋(input) 구조 및 가능한 대체물 내에서 결정한다. 스코어는 각각의 모델에서 목적하는 각각의 위치에서 가장 낮은 ΔΔG(ΔΔG<0)를 측정하고, 각각의 잠재적 대체 위치에 대한 상응하는 선형 값 및 누적 ΔΔG의 값을 할당하여 계산하고, 이어서 결과를 모델들 중에서의 일관성(consistency)을 측정하기 위해 평가한다. 계산된 단백질 모델은 상이한 품질(정확한 3-차원 구조를 예상할 확률)을 갖기 때문에, 가중치(weighting) 인자는 보다 정확한 모델로부터의 결과를 우선순위 매기기 위해 시행될 수 있다. 중요한(ΔΔG에 기초함) 불안정하게 만드는 잔기(존재하는 경우)는 치환되고; 새로운 모델이 생성되고, 정상 상태에 도달할 때까지 반복적으로 재-분석된다. 추가로, 생성된 모델은 주요한 구성성분 분석을 통해 xyz 좌표를 분석하여 특정 위치에서의 아미노산의 대체로 인한 잠재적 구조적 미스폴딩(misfolding)을 측정하기 위해 평가된다.
또한 추가의 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 하기 단계를 포함하는 이러한 사전결정된 아미노산 서열의 안정화를 가능하게 하는 사전결정된 아미노산 서열에서의 아미노산 치환을 확인하는 방법을 제공함으로써 해결하였다:
(i) 표적화된 사전결정된 아미노산 서열의 3-차원/3차 구조의 모델링,
(ii) 단일 점 치환, 예를 들면 시스테인 잔기의 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린 및/또는 이소류신 잔기로의 치환을 기초로 하는 단백질 안정성의 반복 측정, 및 모든 이용가능한 3-차원/3차 아미노산 서열 구조를 분석함으로써 치환 안정화를 측정하는 단백질 안정성 자유 에너지 변화(ΔΔG)를 기초로 하는 스코어링 시스템,
(iii) 정상 상태에 도달할 때까지 단계 (ii) 및 (iii)를 반복함으로써 치환된 3-차원/3차 아미노산 서열 구조의 리모델링 및 이의 안정성의 계산;
또한 추가의 양상에서, 본 발명의 근본을 이루는 목적은 놀랍게도 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질을 제공함으로써 해결하였고, 여기서, 이의 전체 또는 부분 아미노산 서열은 본원에 개시되고 청구된 사전결정된 아미노산 서열에서 아미노산 치환을 동정하는 방법에 의해 안정화되었다(본원 실시예 5 및 실시예 6을 참조한다).
서열
하기 단백질 서열은 본 발명에 상세히 개시되어 있다(aa 또는 AA는 아미노산의 약어이다):
서열번호 1은 여전히 기능성이고, 즉 세포 진입을 효과적으로 촉진할 수 있는 본 발명에 따른 하나의 전좌 모듈에 대한 적합한 최소의 아미노산 서열 → TAT 서열에 관한 것이고;
서열번호 2 내지 서열번호 5
불변 쇄(전장 서열 및 110aa):
서열번호 2는 전장 개 불변 쇄 아미노산 서열에 관한 것이고;
>gi|545496086|Canis_lupus_familiaris|XP_536468.5|
예측됨: HLA 클래스 II 조직적합성 항원 감마 쇄 이소형 X1
[개 루푸스 파밀리아리스]
서열번호 3은 전장 고양이 불변 쇄 아미노산 서열에 관한 것이고;
>gi|410949651|Felis_catus|XP_003981534.1|
예측됨: HLA 클래스 II 조직적합성 항원 감마 쇄 이소형 X1
[고양이 카투스]
서열번호 4는 개 불변 쇄 아미노산 서열의 처음 110개 aa에 관한 것이고;
서열번호 5는 고양이 불변 쇄 아미노산 서열의 처음 110개 aa에 관한 것이고;
서열번호 6은 22 aa의 N-말단 마커에 관한 것이고;
서열번호 7 내지 서열번호 13
알레르겐, 전장 서열:
서열번호 7은 전장 Der f 1 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;
>Q58A71 Der f 1 알레르겐 프리프로엔자임 더마토파고이데스
파리나에(미국형 집먼지 진드기)
서열번호 8은 전장 Der f 2 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;
>Q00855 진드기 그룹 2 알레르겐 Der f 2(알레르겐 Der f II)
(알레르겐 Der f 2) 더마토파고이데스 파리나에(미국 집먼지
진드기)
서열번호 9는 전장 Der f 23 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;
>A0A088SAW7 Der f 23 알레르겐 더마토파고이데스 파리나에
(미국형 집먼지 진드기)
서열번호 10은 전장 Der f 18p 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;
>Q86R84 60kDa 알레르겐 Der f 18p 더마토파고이데스 파리나
에(미국형 집먼지 진드기)
서열번호 11은 전장 Der f 15 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;
>Q9U6R7 98kDa HDM 알레르겐(Der f 15)(그룹 15 알레르겐 Der
f 15) 더마토파고이데스 파리나에(미국형 집먼지 진드기)
서열번호 12는 전장 Zen 1 단백질 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;
>I7HDR2 Zen 1 단백질 더마토파고이데스 파리나에(미국 집먼
지 진드기)
서열번호 13은 전장 Cte f 1 알레르겐 아미노산 서열에 관한 것이고;
>Q94424 타액 항원 1(FS-I)(알레르겐 Cte f 1) 크테노세팔리
데스 펠리스(고양이 벼룩)
서열번호 14 내지 서열번호 20
알레르겐,
IMAT
형태(짧음):
서열번호 14는 Der f 1 알레르겐 아미노산 서열의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 15는 Der f 2 알레르겐 아미노산 서열의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 16은 Der f 23 알레르겐 아미노산 서열의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 17은 Der f 18p 알레르겐 아미노산 서열의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 18은 Der f 15 알레르겐 아미노산 서열의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 19는 Zen 1 단백질 알레르겐 아미노산 서열의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 20은 Cte f 1 알레르겐 아미노산 서열의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 21 내지 서열번호 23
하이브리드
1, 2 및 3 유래의 알레르겐 - IMAT 형태(짧음):
서열번호 21은 하이브리드 1 알레르겐의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 22는 하이브리드 2 알레르겐의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 23은 하이브리드 3 알레르겐의 iMAT 형태(짧음)에 관한 것이고;
서열번호 24 내지 서열번호 44
고양이에 대한 iMAT(N-말단 또는 C-말단
헥
사-히스티딘 존재 또는 헥사-히스티딘/메티오닌 부재(IMAT_Pure)):
서열번호 24는 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 1 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 25는 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 1 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 26은 태그 부재의 Der f 1 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 27은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 2 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 28은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 2 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 29는 태그 부재의 Der f 2 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 30은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 23 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 31은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 23 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 32는 태그 부재의 Der f 23 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 33은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 18p iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 34는 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 18p iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 35는 태그 부재의 Der f 18p iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 36은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 15 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 37은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 15 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 38은 태그 부재의 Der f 15 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 39는 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Zen 1 단백질 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 40은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Zen 1 단백질 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 41은 태그 부재의 Zen 1 단백질 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 42는 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Cte f 1 단백질 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 43은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Cte f 1 단백질 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 44는 태그 부재의 Cte f 1 단백질 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 45 내지 서열번호 65
개에 대한 iMAT(N-말단 또는 C-말단
헥사
-히스티딘 존재 또는
헥사
-히스티딘/메티오닌 부재(
IMAT
_Pure)):
서열번호 45는 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 1 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 46은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 1 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 47은 태그 부재의 Der f 1 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 48은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 2 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 49는 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 2 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 50은 태그 부재의 Der f 2 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 51은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 23 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 52는 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 23 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 53은 태그 부재의 Der f 23 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 54는 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 18p iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 55는 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 18p iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 56은 태그 부재의 Der f 18p iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 57은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 15 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 58은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 15 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 59는 태그 부재의 Der f 15 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 60은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Zen 1 단백질 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 61은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Zen 1 단백질 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 62는 태그 부재의 Zen 1 단백질 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 63은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Cte f 1 단백질 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 64는 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Cte f 1 단백질 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 65는 태그 부재의 Cte f 1 단백질 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 66 내지 서열번호 74
고양이에 대한
하이브리드
/모자이크-유사 iMAT(N-말단 또는 C-말단
헥사
-히스티딘 또는
헥사
-히스티딘/메티오닌 부자(IMAT_Pure)):
서열번호 66은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 1 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 67은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 1 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 68은 태그 부재의 하이브리드 1 iMAT 분자(고양이)(서열번호 1, 서열번호 5 및 서열번호 21로 이루어짐)에 관한 것이고;
서열번호 69는 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 2 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 70은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 2 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 68은 태그 부재의 하이브리드 2 iMAT 분자(고양이)(서열번호 1, 서열번호 5 및 서열번호 22로 이루어짐)에 관한 것이고;
서열번호 72는 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 3 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 73은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 3 iMAT 분자(고양이)에 관한 것이고;
서열번호 74는 태그 부재의 하이브리드 3 iMAT 분자(고양이)(서열번호 1, 서열번호 5 및 서열번호 23으로 이루어짐)에 관한 것이고;
서열번호 75 내지 서열번호 83
개에 대한
하이브리드
/모자이크-유사 iMAT(N-말단 또는 C-말단
헥사
-히스티딘 또는
헥사
-히스티딘/메티오닌 부재(
IMAT
-Pure)):
서열번호 75는 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 1 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 76은 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 1 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 77은 태그 부재의 하이브리드 1 iMAT 분자(개)(서열번호 1, 서열번호 4 및 서열번호 21로 이루어짐)에 관한 것이고;
서열번호 78은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 2 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 79는 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 2 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 80은 태그 부재의 하이브리드 2 iMAT 분자(개)(서열번호 1, 서열번호 4 및 서열번호 22로 이루어짐)에 관한 것이고;
서열번호 81은 N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 3 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 82는 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 하이브리드 3 iMAT 분자(개)에 관한 것이고;
서열번호 83은 태그 부재의 하이브리드 3 iMAT 분자(개)(서열번호 1, 서열번호 4 및 서열번호 23으로 이루어짐)에 관한 것이고;
서열번호 84 내지 서열번호 88
비-중복(non-redundant)
하이브리드
알레르겐:
서열번호 84는 A1KXC1_DERFA DFP1(UNIPROT 데이터베이스)에 관한 것이고;
서열번호 85는 A0A088SAS1_DERFA Der f 28 알레르겐(UNIPROT 데이터베이스)에 관한 것이고;
서열번호 86은 B7U5T1_DERFA Der f 6 알레르겐(UNIPROT 데이터베이스)에 관한 것이고;
서열번호 87은 T2B4F3_DERPT LytFM(UNIPROT 데이터베이스)에 관한 것이고;
서열번호 88은 A7XXV2_DERFA Der f 2 알레르겐(UNIPROT 데이터베이스)에 관한 것이고;
서열번호 89 내지 서열번호 90
다양한 서열들:
서열번호 89는 N-말단 헥사-히스티딘을 갖는 Cul o2 iMAT 분자에 관한 것이고;
서열번호 90은 N-말단 헥사-히스티딘을 갖는 Cul o3 iMAT 분자에 관한 것이고;
서열번호 91 내지 102
하이브리드의
펩타이드
구성성분:
서열번호 91은 서열번호 10으로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 92는 서열번호 85로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 93은 서열번호 88로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 94는 서열번호 86으로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 95는 서열번호 87로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 96은 서열번호 11로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 97은 서열번호 7로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 98은 서열번호 10으로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 99는 서열번호 12로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 100은 서열번호 9로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 101은 서열번호 11로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 102는 서열번호 11로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이고,
서열번호 102는 서열번호 8로부터 유도된 하이브리드의 펩타이드 부분에 관한 것이다.
하이브리드/모자이크-유사 iMAT 분자들:
본 발명의 특정 양상에서, iMAT분자는 하나 초과의 알레르겐의 구성성분(아미노산 서열/에피토프)이 항원 모듈 내로 포함되는 경우에 추가로 개선된다. 이러한 목적을 위해, 기술된 생물정보학 선택 접근법(실시예 5)의 기본 원리를 상이한 방식으로 적용할 수 있다. 알레르겐 데이터베이스에서 발견되는 알레르겐 펩타이드의 히트 카운트(hit count)에 기초하여 완전한 알레르겐을 선택하는 대신에, iMAT 항원 모듈을 조작하기 위해 몇몇의 이러한 알레르겐의 가장 많은 펩타이드만을 사용한다(예를 들면, 실시예 6을 참조한다). 따라서, 이러한 iMAT 분자는 몇몇의 알레르겐으로부터 유래하는 펩타이드의 항원 모듈로 이루어진다. 이는 이의 표적화된 면역학적 프로파일과 관련하여 단일 iMAT 분자의 스펙트럼을 넓히고, 따라서 약리학적 약물 개발에 유리하다.
하이브리드 iMAT 분자의 조작시 추가의 단계로서 TAT 및 표적화 도메인 그리고 임의로 His-태그가 부가된다. 최종적으로, 시스테인 잔기는 실시예 5 및 실시예 6에 기술된 바와 같은 대부분의 안정화 잔기에 의해 대체된다.
하이브리드 I
단백질 전구체는 최상위 펩타이드에 상응하는 전구 단백질의 목록으로부터 선택되고 다른 항원(서열번호 10, 11, 85, 86, 87, 88) 유래의 다른 최상위 펩타이드를 내장시키기 위한 스캐폴드 단백질(서열번호 84)로서 사용된다. 신호 펩타이드 서열이 스캐폴드 단백질로부터 제거된다. 임의로, 추가의 인접한 N- 또는 C-말단 아미노산이 스캐폴드 단백질의 원래 서열 내에 삽입되고 하기 기술된 바와 같이 스캐폴드 단백질의 원래 서열의 일부를 대체한다.
하기 단백질의 구성성분들을 사용하여 하이브리드 1을 작제한다:
서열번호 84 (A1KXC1_DERFA DFP1 OS=더마토파고이데스 파리나)
서열번호 10 (Q86R84_DERFA 60 kDa 알레르겐 Der f 18p OS=더마토파고이데스 파리나에 GN=Der f 18 PE=2 SV=1)
서열번호 85 (A0A088SAS1_DERFA Der f 28 알레르겐 OS=더마토파고이데스 파리나에 PE=2 SV=1)
서열번호 88: (A7XXV2_DERFA Der f 2 알레르겐 OS=더마토파고이데스 파리나에 PE=4 SV=1)
서열번호 86 (B7U5T1_DERFA Der f 6 알레르겐 OS=더마토파고이데스 파리나에 PE=2 SV=1)
서열번호 87 (T2B4F3_DERPT LytFM OS=더마토파고이데스 프테로니시누스 GN=lytFM PE=4 SV=1)
서열번호 11 (Q9U6R7_DERFA 98kDa HDM 알레르겐 OS=더마토파고이데스 파리나에 PE=2 SV=1)
하이브리드 1의 백본(backbone):
서열번호 84 (A1KXC1 18-400, 하기 대체 부분 부재)
[서열번호 84 AA 39-52에 대한 대체 1]:
서열번호 10 (Q86R84_AA 97-110), 즉 GNAKAMIAVGGSTM (서열번호 91)
[서열번호 84 AA 261-274에 대한 대체 2]:
서열번호 85 (A0A088SAS1_AA 611-624), 즉 MMKIYQQQQQQHHP (서열번호 92)
[서열번호 84 AA 234-246에 대한 대체 3]:
서열번호 88 (A7XXV2_AA 48-61), 즉 FLVYIHIANNEIKK (서열번호 93)
[서열번호 84 AA 53-65에 대한 대체 4]:
서열번호 86 (B7U5T1_AA 166-178), 즉 IVDGDKVTIYGWG (서열번호 94)
[서열번호 84 AA 276-289에 대한 대체 5]:
서열번호 87 (T2B4F3_AA 134-147), 즉 REENIWSDHIANVA (서열번호 95)
[서열번호 84 AA 203-216에 대한 대체 6]:
서열번호 11 (Q9U6R7_AA 469-482), 즉 TPTTPTPAPTTSTP (서열번호 96)
시스테인 잔기가 실시예 5 및 실시예 6에 기술된 생체공학 프로세스를 적용하는 대부분의 안정화 잔기로 대체된 후, 이는 서열번호 21을 초래한다.
하이브리드 1의 백본은 아미노산 서열 서열번호 84에 의해 형성된다. 하이브리드 1 항원 모듈 서열번호 91 내지 96의 추가의 펩타이드 구성성분은 서열번호 84로부터 유도된 백본 서열에 내장된다. 하이브리드 1 항원 모듈 서열번호 91 내지 96의 이들 추가의 펩타이드 구성성분은 임의의 순서로/상이한 순서로(상기 기술된 대체의 순서와 비교하는 경우) 배열될 수 있다. 상기 기술된 항원/알레르겐에 기초한 임의의 이러한 재-배열된 펩타이드 순서는 본 발명에 의해 구상된다.
하이브리드 2:
완전한 알레르겐 및/또는 최상위 펩타이드가 선택되어 함께 스플라이싱되어(spliced) 하기 기술되는 주어진 IMAT 모듈에 대한 알레르겐 모듈이 수득된다.
하기 단백질의 구성성분들을 사용하여 도시된 특정 순서로 하이브리드 2를 작제하고, 이에 의해 부분 1은 N-말단이다. 추가의 부분은 이전 부분의 C-말단에 하기 순서에 따라 부가된다. 하이브리드 2의 경우, 이들은 5개의 추가의 부분이다. 총 6개의 부분이 존재한다.
부분 1: 서열번호 7 (Q58A71 Der f 1 알레르겐 프리프로엔자임 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 99-321), 즉 TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPNYHAVNIVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM (서열번호 97)
부분 2: 서열번호 10 (Q86R84 60 kDa 알레르겐 Der f 18p 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 277-304), 즉 FTQTDGFLSYNELCVQIQAETNAFTITR (서열번호 98)
부분 3: 서열번호 12 (I7HDR2 Zen 1 단백질 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 181-220), 즉 EPTTPTPEPTTKTPEPTTKTPEPSTPTPEPTTKTPEPTTK (서열번호 99)
부분 4: 서열번호 9 (A0A088SAW7 Der f 23 알레르겐 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 22-91), 즉 DIDHDDDPTTMIDVQTTTVQPSDEFECPTRFGYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT (서열번호 100)
부분 5: 서열번호 11 (Q9U6R7 98kDa HDM 알레르겐 (Der f 15 알레르겐) (그룹 15 알레르겐 Der f 15) 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 437-463), 즉 SPTTPTTTPSPTTPTTTPSPTTPTTTP (서열번호 101)
부분 6: 서열번호 8 (Q00855 진드기 그룹 2 알레르겐 Der f 2 (알레르겐 Der f II)(알레르겐 Der f 2) 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 18-146), 즉 DQVDVKDCANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQNTKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTNACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKLIGDNGVLACAIATHGKIRD (서열번호 102)
시스테인 잔기가 실시예 5 및 실시예 6에 기술된 생체공학 프로세스를 적용하는 대부분의 안정화 잔기로 대체된 후, 이는 서열번호 22를 초래한다.
그러나, 하이브리드 2 항원 모듈의 상기 펩타이드 구성성분은 임의의 순서로/상이한 순서로(상기 기술된 대체의 순서와 비교하는 경우) 배열될 수 있다. 상기 기술된 항원/알레르겐에 기초한 임의의 이러한 재-배열된 펩타이드 순서는 본 발명에 의해 구상된다.
하이브리드 3
하기 단백질의 구성성분들을 사용하여 도시된 특정 순서로 하이브리드 3을 작제하고, 이에 의해 부분 1은 N-말단이다. 추가의 부분은 이전 부분의 C-말단에 하기 순서에 따라 부가된다. 하이브리드 3의 경우, 이들은 4개의 추가의 부분이다. 총 5개의 부분이 존재한다.
부분 1: 서열번호 7 (Q58A71 Der f 1 알레르겐 프리프로엔자임 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 99-321), 즉 TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDNGYQPNYHAVNIVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM (서열번호 97)
부분 2: 서열번호 10 (Q86R84 60 kDa 알레르겐 Der f 18p 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 277-304), 즉 FTQTDGFLSYNELCVQIQAETNAFTITR (서열번호 98)
부분 3: 서열번호 11 (Q9U6R7 98kDa HDM 알레르겐 (Der f 15 알레르겐) (그룹 15 알레르겐 Der f 15) 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 437-463), 즉 SPTTPTTTPSPTTPTTTPSPTTPTTTP (서열번호 101)
부분 4: 서열번호 8 (Q00855 진드기 그룹 2 알레르겐 Der f 2 (알레르겐 Der f II) (알레르겐 Der f 2) 더마토파고이데스 파리나에 (미국형 집먼지 진드기) AA 18-146), 즉 DQVDVKDCANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQNTKTAKIEIKASLDGLEIDVPGIDTNACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVTVKLIGDNGVLACAIATHGKIRD (서열번호 102)
시스테인 잔기가 실시예 5 및 실시예 6에 기술된 생체공학 프로세스를 적용하는 대부분의 안정화 잔기로 대체된 후, 이는 서열번호 23을 초래한다.
그러나, 하이브리드 3 항원 모듈의 상기 펩타이드 구성성분은 임의의 순서로/상이한 순서로(상기 기술된 대체의 순서와 비교하는 경우) 배열될 수 있다. 상기 기술된 항원/알레르겐에 기초한 임의의 이러한 재-배열된 펩타이드 순서는 본 발명에 의해 구상된다.
본 발명의 추가의 특정 양상들:
본 발명은 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 알레르기의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 그리고/또는 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 그리고/또는 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 전염의 예방 방법에서 사용하기 위한, 그리고/또는 매개체에 의한 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 전염의 예방 방법에서 사용하기 위한,
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈,
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈, 및
(iii) 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자로서,
적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자에 관한 것이다.
본 발명은 추가로
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈,
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈, 및
(iii) 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는, 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 알레르기의 예방 및/또는 치료 방법, 및/또는 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 예방 및/또는 치료 방법, 및/또는 말을 제외한 동물에서의 바람직하게는 매개체에 의한 하나 이상의 감염성 질환의 전염의 예방 방법으로서,
적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 알레르기의 예방 및/또는 치료 방법, 및/또는 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 예방 및/또는 치료 방법, 및/또는 말을 제외한 동물에서의 바람직하게는 매개체에 의한 하나 이상의 감염성 질환의 전염의 예방 방법에 관한 것이다.
특정 양상에서, 적어도 하나의 항원 모듈은 모든 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌 및/또는 아스파르트산으로 치환된다. 바람직하게는 전체 iMAT 분자의 모든 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌 및/또는 아스파르트산으로 치환된다.
추가의 양상에서, 이러한 모듈은 전부 2개 이상의 인접한 모듈 사이에서, 임의로 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 모두의 사이에서 임의로 추가의 스페이서 모듈(들)에 의해 서로에 대해 공유결합적으로 링크된다.
한 바람직한 양상에서, 이러한 모듈은 전부 서로에 대해 공유결합적으로 링크되고, 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 추가의 스페이서 모듈(들)은 전혀 존재하지 않는다.
다른 양상에서, 적어도 하나의 제2 모듈은 개, 고양이, 소, 양, 염소 및/또는 돼지 종으로부터 선택되는 불변 쇄 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 단 이러한 적어도 하나의 제2 모듈은 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 모듈로서 기능성이다. 한 바람직한 개 불변 쇄 서열은 서열번호 2이다. 바람직한 고양이 불변 쇄 서열은 서열번호 3이다.
한 바람직한 양상에서, 적어도 하나의 제2 모듈은 서열번호 4(개) 또는 서열번호 5(고양이)에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들 서열로 이루어진다. 서열번호 4 및 서열번호 5는 각각 서열번호 2 및 서열번호 3의 불변 쇄의 110개의 아미노산 잔기를 제시한다.
다른 바람직한 양상에서, 적어도 하나의 제2 모듈은 서열번호 4(개) 또는 서열번호 5(고양이)에 따른 아미노산 서열 또는 이들의 단편을 포함하고, 바람직하게는 이들 서열로 이루어지고, 단 이러한 단편은 이들의 세포내 수송 기능을 유지한다.
추가의 양상에서, 적어도 하나의 항원 모듈은 말을 제외한 동물에서 알레르기를 유발하는 적어도 하나의 알레르겐으로부터 유도되는, 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프, 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서 벼룩 물림에 대한 알레르기; 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서 소정 식품 구성성분에 대한 알레르기; 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서 아토피성 피부염; 바람직하게는 고양이에서 알레르기성 기도 염증 및/또는 폐쇄로부터 유도되는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프를 포함한다.
바람직한 양상에서, 이러한 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐은 서열번호 11 또는 서열번호 18에 따른 Der f 15 알레르겐이다. 바람직한 양상에서, 이러한 적어도 하나의 항원 모듈은 서열번호 18을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 18로 이루어진다.
한 특정 양상에서, 이러한 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐은 음식 및/또는 곰팡이(진균류 및/또는 이들의 포자), 화분, 집먼지 또는 사료 진드기(및/또는 이들의 배설물) 및/또는 벼룩, 바람직하게는 나무, 잔디, 초본, 돼지풀로부터의 화분 및/또는 십자화과 화분 및/또는 아스페르길루스, 알테르나리아, 보트리티스, 세르코스포라, 클라도스포리움, 쿠르불라리아, 드레크슬레라, 유로티움, 헬민토스포리움, 에피코쿰, 에리시페 / 오이디움, 푸사리움, 리치테이미아, 니그로스포라, 페니실리움, 페리코니아, 페로노스포라, 폴리트린시움, 사카로폴리스포라(이전에 또한 파에니아 또는 마이크로폴리스포라), 써모악티노마이세스, 스템필리움, 토룰라 속의 진균류 및/또는 이들의 포자 및/또는 아카루스, 글리코파구스, 티로파구스, 더마토파고이데스, 유로글리푸스, 레피도글리푸스, 블로미아 속의 진드기(또는 이들의 배설물) 및/또는 세라토필러스, 크테노세팔리데스, 풀렉스, 아르카에오프실라 속의 벼룩으로부터 유도될 수 있고, 보다 바람직하게는 더마토파고이데스 알레르겐이다.
또 다른 특정 양상에서, 적어도 하나의 항원 모듈은 말을 제외한 동물에서 하나 이상의 감염성 질환을 유발하는 병원체의 적어도 하나의 항원으로부터 유도된 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프, 바람직하게는 캄필로박터, 디로필라리아, 에를리히아, 레이슈마니아, 트립파노소마, 보렐리아, 오르토부니아바이러스, 오르비바이러스, 플라비바이러스, 로타바이러스, 코로나바이러스, 트리코파이톤, 마이크로스포룸; 쿠페리아, 하에몬쿠스, 오스테르타기 아, 트리코스트론길루스, 딕티오카울루스, 메타스트론길루스; 에이메리아, 이소스 포라, 크립토스포리디움, 기아르디아 속으로부터 선택되는 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환을 유발하는 병원체의 적어도 하나의 항원의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프를 포함하고, 여기서 바람직하게는 적어도 하나의 항원 모듈은 또한 말을 제외한 동물에서 하나 이상의 감염성 질환의 전염에 관여하는 매개체의 항원, 바람직하게는 흡혈 곤충, 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기로부터 선택되는 매개체의 타액 구성성분으로부터 선택되는 항원일 수 있다.
한 바람직한 양상에서, iMAT 분자는 추가로 적어도 하나의 태그 모듈, 바람직하게는 적어도 하나의 His-태그를 포함한다. 바람직하게, 이러한 적어도 하나의 태그 모듈은 N-말단에 존재한다. 다른 바람직한 특정 양상에서, 이러한 적어도 하나의 태그 모듈은 C-말단에 존재한다. 다른 바람직한 특정 양상에서, 이러한 적어도 하나의 태그 모듈은 N-말단에 그리고 C-말단에 존재한다.
한 특정한 바람직한 양상에서, iMAT 분자는 하나의 메티오닌 잔기 후 N-말단에 하나의 태그 모듈, 바람직하게는 하나의 His-태그를 포함한다.
다른 특정한 바람직한 양상에서는 iMAT 모듈에 태그 모듈은 존재하지 않는다.
한 추가의 양상에서, 적어도 하나의 제1 모듈은 HIV-tat, VP22 및/또는 안테나페디아의 아미노산 서열 또는 이들의 부분 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들 서열로 이루어지고, 단 이러한 적어도 하나의 제1 모듈은 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 전좌를 위한 모듈로서 기능성이고, 가장 바람직하게는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (서열번호 1)이다.
다른 양상에서, iMAT 분자는 단량체성 형태로 및/또는 선형으로 존재한다.
추가의 양상에서, 적어도 하나의 제3 모듈은 서열번호 14 내지 서열번호 23 중 어느 하나를 포함하고, 바람직하게는 서열번호 14 내지 서열번호 23 중 어느 하나로 이루어진다.
한 바람직한 양상에서, iMAT 분자는 서열번호 24 내지 서열번호 83에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하고, 바람직하게는 이들 아미노산 서열 중 하나 이상으로 이루어진다.
특히 바람직한 iMAT 분자는 서열번호 36(Der f15 iMAT 분자 고양이) 또는 서열번호 57(Der f15 iMAT 분자 개)를 포함하고, 바람직하게는 이들 서열로 이루어진다. 추가의 바람직한 iMAT 분자(N-말단 His-태그 포함)는 서열번호 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 iMAT 분자(C-말단 His-태그 포함)는 서열번호 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 iMAT 분자(His-태그 부재)는 서열번호 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 iMAT 분자(하이브리드/모자이크-유사 iMAT)는 서열번호 66 내지 서열번호 83으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 하이브리드 iMAT 분자는 66, 69, 72, 75, 78, 81(N-말단 His-태그 존재)이다. 서열번호 66 및/또는 75가 특히 바람직하다. 추가의 바람직한 특정 하이브리드 iMAT 분자는 67, 70, 73, 76, 79, 82(C-말단 His-태그 존재)이다. 서열번호 67 및/또는 76이 특히 바람직하다. 추가의 바람직한 특정 하이브리드 iMAT 분자는 68, 71, 74, 77, 80, 83(His-태그 부재)이다. 서열번호 68 및/또는 77이 특히 바람직하다.
추가의 양상에서, 상기 동물은 보스(Bos), 카프라(Capra) 및/또는 오비스(Ovis) 속의 구성원과 같은 소, 염소, 양을 포함하는 반추동물, 캐니스(Canis) 속의 구성원, 예를 들면 개, 늑대, 여우, 코요테, 재칼, 펠리스(Felis) 속의 구성원, 예를 들면 사자, 호랑이, 집 고양이, 야생 고양이, 기타 대형 고양이과 동물, 및 치타 및 스라소니를 포함하는 기타 고양이과 동물, 및/또는 수스(Sus) 속의 구성원, 예를 들면, 돼지로부터 선택되고, 여기서 바람직하게는 상기 동물은 고양이 및/또는 개로부터 선택된다.
본 발명은
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈(바람직하게는 상기 제1 모듈은 서열번호 1을 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진다),
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈(바람직하게는 상기 제2 모듈은 서열번호 4 또는 서열번호 5를 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진다) 및
(iii) 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 아미노산 서열로서,
적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열에 관한 것이다. 상기 제3 모듈은 바람직하게는 서열번호 14 내지 서열번호 23 중 어느 하나를 포함하거나, 보다 바람직하게는 이들 서열 중 어느 하나로 이루어진다.
본 발명은
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈(바람직하게는 상기 제1 모듈은 서열번호 1을 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진다),
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈(바람직하게는 상기 제2 모듈은 서열번호 4 또는 서열번호 5를 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진다) 및
(iii) 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 개선된 MAT(iMAT) 분자로서,
적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 개선된 MAT(iMAT) 분자에 관한 것이다. 상기 제3 모듈은 바람직하게는 서열번호 14 내지 23 중 임의의 하나를 포함하고, 보다 바람직하게는 이들 서열 중 임의의 하나로 이루어진다.
한 특정 양상에서, 적어도 하나의 항원 모듈은 모든 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환된다. 바람직하게, 전체 iMAT 분자에서의 모든 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌 및/또는 아스파르트산으로 치환된다.
추가의 양상에서, 상기 모듈의 전부는 임의로 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에서, 임의로 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 모두의 사이에서 임의로 추가의 스페이서 모듈(들)에 의해 서로에 대해 공유결합적으로 링크된다.
한 바람직한 양상에서, 상기 모듈의 전부는 서로 공유결합적으로 링크되고, 어떠한 추가의 스페이서 모듈(들)도 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 전혀 존재하지 않는다.
다른 바람직한 양상에서, 적어도 하나의 제2 모듈은 서열번호 4(개) 또는 서열번호 5(고양이)에 따른 아미노산 서열 또는 이들의 단편을 포함하고, 바람직하게는 이들 서열 또는 이들의 단편으로 이루어지고, 단 이러한 단편은 이들의 세포내 수송 기능을 유지한다. 서열번호 4 및 서열번호 5는 각각 서열번호 2 및 서열번호 3의 불변 쇄의 110개의 아미노산 잔기를 제시한다. 보다 바람직한 양상에서, 적어도 하나의 제2 모듈은 서열번호 4(개) 또는 서열번호 5(고양이)에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들 서열로 이루어진다.
추가의 양상에서, 적어도 하나의 항원 모듈은 말을 제외한 동물에서 알레르기를 유발하는 적어도 하나의 알레르겐으로부터 유도된 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프, 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 벼룩 물림에 대한 알레르기; 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 소정 식품 구성성분에 대한 알레르기; 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 아토피성 피부염; 바람직하게는 고양이에서의 알레르기성 기도 염증 및/또는 폐쇄로부터 유도되는 적어도 하나의 알레르겐의 에피토프를 포함한다.
한 특정 양상에서, 상기 적어도 하나의 항원은 서열번호 11 또는 서열번호 18에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양상에서, 상기 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐은 서열번호 11 또는 서열번호 18에 따른 Der f 15 알레르겐이다. 다른 바람직한 양상에서, 상기 적어도 하나의 항원 모듈은 서열번호 18을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 18로 이루어진다.
추가의 한 바람직한 양상에서, iMAT 분자는 서열번호 24 내지 83에 따른 한(1개의) 아미노산 서열(이들 대안 중 하나)을 포함하고, 바람직하게는 상기 아미노산 서열로 이루어진다. 추가의 바람직한 양상에서, iMAT 분자는 서열번호 36 내지 38 중 임의의 하나(Der f15 iMAT 분자 고양이), 가장 바람직하게는 서열번호 36을 포함하고, 바람직하게는 상기 서열로 이루어지거나, 또는 상기 iMAT 분자는 서열번호 57 내지 59 중 임의의 하나(Der f15 iMAT 분자 개), 가장 바람직하게는 서열번호 57을 포함하고, 바람직하게는 상기 서열로 이루어진다.
바람직한 양상에서, iMAT 분자는 적어도 하나의 태그 모듈, 바람직하게는 적어도 하나의 His-태그를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 적어도 하나의 태그 모듈은 N-말단에 존재한다. 특정한 바람직한 양상에서, 상기 iMAT 분자는 하나의 메티오닌 잔기 후 N-말단에 하나의 태그 모듈, 바람직하게는 하나의 His-태그를 포함한다.
N-말단 His-태그를 갖는 바람직한 iMAT 분자는 서열번호 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81 중 임의의 하나를 포함하고, 바람직하게는 상기 중 하나로 이루어진다.
다른 특정한 바람직한 양상에서, 상기 적어도 하나의 태그 모듈은 C-말단에 존재한다. 다른 특정한 바람직한 양상에서, 상기 적어도 하나의 태그 모듈은 N-말단에 그리고 C-말단에 존재한다. C-말단 His-태그를 갖는 바람직한 iMAT 분자는 서열번호 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82 중 어느 하나를 포함하고, 바람직하게는 상기 중 어느 하나로 이루어진다.
다른 특정한 바람직한 양상에서, 태그 모듈은 존재하지 않는다. 어떠한 태그도 갖지 않는 바람직한 iMAT 분자는 서열번호 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83 중 어느 하나를 포함하고, 바람직하게는 상기 중 어느 하나로 이루어진다.
추가의 양상에서, 적어도 하나의 제1 모듈은 HIV-tat, VP22 및/또는 안테나페디아의 아미노산 서열 또는 이들의 부분 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들로 이루어지고, 단 상기 적어도 하나의 제1 모듈은 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전자를 위한 모듈로서 기능성이고, 가장 바람직하게는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR(서열번호 1)이다.
다른 양상에서, iMAT 분자는 단량체성 형태로 그리고/또는 선형으로 존재한다.
추가의 특정한 양상에서, 상기 iMAT 분자는 하이브리드 iMAT 분자(모자이크-유사 iMAT 분자)이다. 바람직하게, 이러한 하이브리드 iMAT 분자는 서열번호 21 내지 서열번호 23 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 하이브리드 iMAT 분자는 서열번호 66 내지 83 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이들 서열 중 어느 하나로 이루어진다.
본 발명은 추가로 서열번호 24 내지 83에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, 바람직하게는 이들 서열 중 하나 이상으로 이루어지는 아미노산 서열에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 서열번호 24 내지 83에 따른 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, 바람직하게는 이들 서열 중 하나 이상으로 이루어지는 iMAT 분자에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 서열번호 24 내지 서열번호 83으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이들 서열로 이루어지는 아미노산 서열/iMAT 분자에 관한 것이다.
특히 바람직한 아미노산 서열/iMAT 분자는 서열번호 36(Der f15 iMAT 분자 고양이) 또는 서열번호 57(Der f15 iMAT 분자 개)를 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어진다. 추가의 바람직한 아미노산 서열/iMAT 분자(N-말단 His-태그 포함)는 서열번호 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 아미노산 서열/iMAT 분자(C-말단 His-태그 포함)는 서열번호 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 아미노산 서열/iMAT 분자(His-태그 부재)는 서열번호 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 아미노산 서열/iMAT 분자(하이브리드/모자이크-유사 iMAT)는 서열번호 66 내지 83으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 바람직한 하이브리드 iMAT 분자는 66, 69, 72, 75, 78, 81(N-말단 His-태그 포함)이다. 추가의 바람직한 하이브리드 iMAT 분자는 67, 70, 73, 76, 79, 82(C-말단 His-태그 포함)이다. 추가의 바람직한 하이브리드 iMAT 분자는 68, 71, 74, 77, 80, 83(His-태그 부재)이다.
본 발명은
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈(바람직하게는 상기 제1 모듈은 서열번호 1을 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진다),
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈(바람직하게는 상기 제2 모듈은 서열번호 4 또는 서열번호 5를 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진다) 및
(iii) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 84, 85, 86, 87, 및 88로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 항원의 임의의 조합의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프 서열로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자로서,
적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자에 관한 것이다.
한 바람직한 양상에서, 상기 항원 모듈은 서열번호 10, 11, 84, 85, 86, 87, 및 88로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 항원의 임의의 조합의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프 서열로부터 유도된 아미노산 서열이다(하이브리드 1).
한 특정 양상에서, 상기 항원 모듈은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11 및 12로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 항원의 임의의 조합의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프 서열로부터 유도된 아미노산 서열이다(하이브리드 2).
한 특정 양상에서, 상기 항원 모듈은 서열번호 7, 8, 10 및 11로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 항원의 임의의 조합의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프 서열로부터 유도된 아미노산 서열이다(하이브리드 3).
따라서, 본 발명의 구체적으로
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈(바람직하게는 상기 제1 모듈은 서열번호 1을 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진다),
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈(바람직하게는 상기 제2 모듈은 서열번호 4 또는 서열번호 5를 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진다) 및
(iii) 서열번호 84로부터 유도된 백본 서열에 내장된 (임의의 순서로) 서열번호 91 내지 96에 따른 펩타이드 중 하나 이상의 임의의 조합을 포함하는 상기 백본에 기초한 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자로서,
적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자에 관한 것이다.
바람직한 양상에서, 상기 제3 모듈에서 서열번호 84로부터 유도된 백본 내의 펩타이드 서열의 순서는 N-말단으로부터 출발하여 서열번호 91, 이어서 서열번호 92, 이어서 서열번호 93, 이어서 서열번호 94, 이어서 서열번호 95, 이어서 서열번호 96이다. 가장 바람직한 양상에서, 제3 모듈은 서열번호 21을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 21로 이루어진다.
추가의 특정한 양상에서, 상기 제3 모듈에서 서열번호 84로부터 유도된 백본 내의 펩타이드 서열의 순서는 N-말단으로부터 출발하여 서열번호 93, 이어서 서열번호 91, 이어서 서열번호 92, 이어서 서열번호 94, 이어서 서열번호 96, 이어서 서열번호 95이다. 본 발명의 추가의 양상은 임의의 추가의 조합 및 서열번호 84로부터 유도된 백본 서열에 내장된 서열번호 91 내지 96에 따른 펩타이드의 순서에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 추가로
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈(바람직하게는 상기 제1 모듈은 서열번호 1을 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진다),
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈(바람직하게는 상기 제2 모듈은 서열번호 4 또는 서열번호 5를 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진다) 및
(iii) (임의의 순서로) 서열번호 97 내지 102에 따른 펩타이드 중 2개 이상의 임의의 조합으로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자로서,
적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자에 관한 것이다. 한 바람직한 양상에서, 상기 제3 모듈 내의 펩타이드 서열의 순서는 N-말단으로부터 출발하여 서열번호 97, 이어서 서열번호 98, 이어서 서열번호 99, 이어서 서열번호 100, 이어서 서열번호 101, 이어서 서열번호 102이다. 가장 바람직한 양상에서, 상기 제3 모듈은 서열번호 22를 포함하고, 바람직하게는 서열번호 22로 이루어진다.
추가의 특정 양상에서, 상기 제3 모듈 내의 펩타이드 서열의 순서는 N-말단으로부터 출발하여 서열번호 99, 이어서 서열번호 98, 이어서 서열번호 102, 이어서 서열번호 100, 이어서 서열번호 101, 이어서 서열번호 97이다. 본 발명의 추가의 양상은 임의의 추가의 조합 및 서열번호 97 내지 102에 따른 펩타이드의 순서에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 추가로
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈(바람직하게는 상기 제1 모듈은 서열번호 1을 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진다),
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈(바람직하게는 상기 제2 모듈은 서열번호 4 또는 서열번호 5를 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진다) 및
(iii) (임의의 순서로) 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 101, 및 서열번호 102에 따른 펩타이드 중 2개 이상의 임의의 조합으로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자로서,
적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자에 관한 것이다. 한 바람직한 양상에서, 상기 제3 모듈 내의 펩타이드 서열의 순서는 N-말단으로부터 출발하여 서열번호 97, 이어서 서열번호 98, 이어서 서열번호 101, 이어서 서열번호 102이다. 가장 바람직한 양상에서, 상기 제3 모듈은 서열번호 23을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 23으로 이루어진다.
한 추가의 특정 양상에서, 상기 제3 모듈 내의 펩타이드 서열의 순서는 N-말단으로부터 출발하여 서열번호 102, 이어서 서열번호 98, 이어서 서열번호 101, 이어서 서열번호 97이다. 본 발명의 추가의 양상은 임의의 추가의 조합 및 서열번호 97, 98, 101 및 102에 따른 펩타이드의 순서에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 아미노산 서열/iMAT 분자를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 아미노산/iMAT 분자를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 핵산 및/또는 본 발명에 따른 적어도 하나의 벡터를 포함하는 1차 세포 또는 세포주에 관한 것이다.
본 발명은 추가로
a) iMAT 분자에서 알레르겐 모듈로서 단백질을 선택하는 단계, 및
b) 열역학적으로 안정하고, 단백질 조작에 의해 효율적으로 생산될 수 있는 상기 알레르겐을 이용하여 iMAT 분자를 작제하는 단계
를 포함하는, 개선된 MAT 분자의 동정 방법에 관한 것이다.
본 발명은 구체적으로
a) 알레르겐이고, 따라서 또한 이환 대상체에서의 과민증을 야기하는 높은 잠재성을 갖고, 따라서 내성 유도를 위한 표적일 수 있는 iMAT 분자에서 알레르겐 모듈로서 단백질을 선택하는 단계, 및
b) 열역학적으로 안정하고, 단백질 조작에 의해 효율적으로 제조될 수 있고, 추가로 충분한 양의 품질(즉, 정체, 순도 및 효력)을 보장하는 표준 방법으로 분석될 수 있는 상기 주요 알레르겐을 이용하여 iMAT 분자를 작제하는 단계
를 포함하는, 개선된 MAT 분자의 동정 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 특정 양상에서, 단계 a)는 하기를 포함한다:
- 공지의 알레르기성 단백질에 대한 주어진 단백질로부터 유도된 펩타이드의 국부 상동성 조사에 기초하여 (하나의) 알레르겐(들)을 선택함,
- 공개적으로 이용가능한 데이타베이스(예를 들면, UNIPROT)로부터 알레르기항원성 특성을 갖는 것으로 의심되는 단백질의 아미노산 서열을 이출함,
- 이출된 데이터세트 내에서의 서열 상동성 분석에 의해 중복(redundancy)을 측정함,
- 높은 상동 서열 대응부(counterpart)를 제거함(나머지 서열은 후속적인 분석을 위해 가능한 유용한 항원의 정규 서열 데이터베이스로서의 역할을 한다),
- (1개의 아미노산 이동을 이용하여) 단백질을 6 내지 15개의 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드로 인실리코(in silico) 절단함,
- 단백질 및 상응하는 펩타이드의 국부-짝(local-pairwise) 정렬을 수행함,
- 하나에 대한 주어진 단백질의 자기-정렬 스코어를 설정하고 이에 따른 상응하는 펩타이드의 히트를 정렬함으로써 수득된 정렬 히트(hit)의 스케일링,
- 각각의 펩타이드에 대해 주어진 역치를 초과하는 정렬 히트의 수를 계수함,
- 공지의 알레르기항원성 특성을 갖지 않는 단백질 서열의 무작위로 생성된 데이터베이스에 대해 국부-짝 정렬을 비교함,
- 히트의 스케일링 및 계수,
- 알레르겐 결과의 것으로부터 "비-알레르기성 단백질" 계수를 뺄셈함,
- 모든 상응하는 펩타이드에 대한 히트의 수에 기초한 각각의 단백질에 대한 누적 히트 스코어를 계산함,
- 가장 높은 계수를 갖는 단백질을 iMAT 항원 모듈 후보로서 선택함.
상기 방법의 특정 양상에서, 단계 b)는 바람직하게는
(i) 표적화된 사전결정된 아미노산 서열의 3-차원/3차 구조의 모델링 단계,
(ii) 단일 점 치환, 예를 들면 시스테인 잔기의 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린 및/또는 이소류신 잔기로의 치환을 기초로 하는 단백질 안정성의 반복 측정, 및 모든 이용가능한 3-차원/3차 아미노산 서열 구조를 분석함으로써 치환 안정화를 측정하는 단백질 안정성 자유 에너지 변화(ΔΔG)를 기초로 하는 스코어링 시스템 단계,
(iii) 정상 상태에 도달할 때까지 단계 (ii) 및 (iii)를 반복함으로써 치환된 3-차원/3차 아미노산 서열 구조의 리모델링 및 이의 안정성의 계산 단계
를 포함하는, 이러한 사전결정된 아미노산 서열의 안정화를 가능하게 하는 사전결정된 아미노산 서열에서의 아미노산 치환을 확인하는 것을 포함한다.
도 1:
환원 조건 하의 MAT-Fel d1(IVN201)의 SDS-PAGE를 보여준다; 도 1a) 원래 SDS-PAGE(레인당 10μg의 단백질, 쿠마시 염색) 및 도 1b) 겔 A로부터 절단되고 SDS-PAGE 상에 재적재된 밴드를 갖는 SDS-PAGE(은색 염색).
도 2: 환원 조건 하의 Fel d1의 SDS-PAGE를 보여준다; NuPAGE® 4-12% Bis-Tris 겔. 레인: 1) 마커: SeeBlue Plus2 사전-염색된 표준 2) 5μg Fel d1; 3) 5μg Fel d1.
도 3: RP-HPLC 크로마토그램 0.1% TFA/아세토니트릴 농도구배(gradient)를 나타낸다; 도 3a) 첨가제 없이 본래 단백질(MAT-Fel d1)(왼쪽 그래프); 도 3b) 구아니디늄 클로라이드 플러스 DTT의 첨가에 의해 변성된 MAT-Fel d1(오른쪽 그래프).
도 4: MAT-Fel d1 분자 및 이의 카이트 둘리틀(Kyte Doolittle) 소수성 플롯을 도시한다.
도 5: NuPAGE® SDS-PAGE-시스템(4 내지 12% Bis-Tris 겔, 1x MES-실행 완충액, 35분, 200V). 레인: 1) 리소자임, 1μg 단백질 ox; 2) PageRuler 사전염색된 단백질 래더(Ladder); 3) 요오드아세트아미드(ox.)로 산화된 MAT-Fel d1(5μg); 4) iMAT-Cul o4(ox.); 5) PageRuler 사전-염색된 단백질 래더; 6) 환원된 MAT-Fel d1(5μg); 7) 환원된 iMAT-Cul o4; 8) 환원된 리소자임.
도 6: RP-HPLC 크로마토그램 0.1% TFA/아세토니트릴 농도구배를 나타낸다. 피크는 첨가제 없는 본래 (산화된) 단백질(iMAT-Cul o4)을 반영한다.
도 7: 다음 실험 결과를 나타낸다: RT에서 30분 동안 온화하게 혼합되면서 인큐베이션된 단백질 및 Adju-Phos®. 인큐베이션 후, 샘플을 3분 동안 원심분리하였고, 후속적으로 SDS-Page 레인으로 분석하였다: 1) pageRuler 사전염색된 단백질 래더; 2) iMAT-Cul o3 상청액; 3) 우레아 중의 iMAT-Cul o3 펠렛(pellet); 4) iMAT-Cul o3 상청액 ; 5) 우레아 중의 iMAT-Cul o3 펠렛; 6) 비어 있음; 7) iMAT-Cul o2 상청액; 8) 우레아 중의 iMAT-Cul o2 펠렛; 9) iMAT-Cul o2 상청액; 10) 우레아 중의 iMAT-Cul o2 펠렛; 11) 비어 있음; 12) iMAT-Cul o4 상청액; 13) 우레아 중의 iMAT-Cul o4 펠렛; 14) iMAT-Cul o4 상청액; 15) 우레아 중의 iMAT-Cul o4 펠렛; (2, 3, 7, 8, 12, 13 w/o 동결 해동); (2회 동결 해동 처리 후 4, 5, 9, 10, 14, 15).
도 8: 각 융합 단백질의 일반적 부분에서 iMAT 분자에 대한 MAT 분자의 카이트-두리틀(Kyte-Doolittle) 소수성 플롯을 나타낸다[즉, 각 항원 모듈(들) 부재]. 소수성 지수는 X-축 상의 아미노산 위치에 대해 Y-축 상에 나타낸다. 지수에서 양의 수는 소수성을 나타낸다. MAT 분자와 비교하여 소수성 플롯의 시작에서 iMAT 분자의 그래프의 이동은 iMAT 분자에서 His-태그 및 하나의 메티오닌 잔기의 추가의 N-말단 존재뿐만 아니라 임의의 스페이서 모듈(들)의 부재로 인한 것이다.
도 9: 종, 알레르겐 및 uniprot 등록 번호를 동정하는 더마토파고이데스 속의 알레르겐의 예를 보여준다. (도 9a) 디. 프테로니시누스로부터의 알레르겐, (도 9b) 디. 파리나에로부터의 알레르겐.
도 10: 개 및 고양이 유래의 불변 쇄의 N-말단 서열 정렬을 보여준다. CLIP 서열은 회색으로 명암처리되어 있다.
도 11: 다감작화된 말(말 1)에서의 5개의 농도의 iMAT-Cul o2 및 iMAT-Cul o3 및 각각의 알레르겐의 히스타민 방출 시험을 보여준다(실시예 2에서의 검정의 상세설명).
도 2: 환원 조건 하의 Fel d1의 SDS-PAGE를 보여준다; NuPAGE® 4-12% Bis-Tris 겔. 레인: 1) 마커: SeeBlue Plus2 사전-염색된 표준 2) 5μg Fel d1; 3) 5μg Fel d1.
도 3: RP-HPLC 크로마토그램 0.1% TFA/아세토니트릴 농도구배(gradient)를 나타낸다; 도 3a) 첨가제 없이 본래 단백질(MAT-Fel d1)(왼쪽 그래프); 도 3b) 구아니디늄 클로라이드 플러스 DTT의 첨가에 의해 변성된 MAT-Fel d1(오른쪽 그래프).
도 4: MAT-Fel d1 분자 및 이의 카이트 둘리틀(Kyte Doolittle) 소수성 플롯을 도시한다.
도 5: NuPAGE® SDS-PAGE-시스템(4 내지 12% Bis-Tris 겔, 1x MES-실행 완충액, 35분, 200V). 레인: 1) 리소자임, 1μg 단백질 ox; 2) PageRuler 사전염색된 단백질 래더(Ladder); 3) 요오드아세트아미드(ox.)로 산화된 MAT-Fel d1(5μg); 4) iMAT-Cul o4(ox.); 5) PageRuler 사전-염색된 단백질 래더; 6) 환원된 MAT-Fel d1(5μg); 7) 환원된 iMAT-Cul o4; 8) 환원된 리소자임.
도 6: RP-HPLC 크로마토그램 0.1% TFA/아세토니트릴 농도구배를 나타낸다. 피크는 첨가제 없는 본래 (산화된) 단백질(iMAT-Cul o4)을 반영한다.
도 7: 다음 실험 결과를 나타낸다: RT에서 30분 동안 온화하게 혼합되면서 인큐베이션된 단백질 및 Adju-Phos®. 인큐베이션 후, 샘플을 3분 동안 원심분리하였고, 후속적으로 SDS-Page 레인으로 분석하였다: 1) pageRuler 사전염색된 단백질 래더; 2) iMAT-Cul o3 상청액; 3) 우레아 중의 iMAT-Cul o3 펠렛(pellet); 4) iMAT-Cul o3 상청액 ; 5) 우레아 중의 iMAT-Cul o3 펠렛; 6) 비어 있음; 7) iMAT-Cul o2 상청액; 8) 우레아 중의 iMAT-Cul o2 펠렛; 9) iMAT-Cul o2 상청액; 10) 우레아 중의 iMAT-Cul o2 펠렛; 11) 비어 있음; 12) iMAT-Cul o4 상청액; 13) 우레아 중의 iMAT-Cul o4 펠렛; 14) iMAT-Cul o4 상청액; 15) 우레아 중의 iMAT-Cul o4 펠렛; (2, 3, 7, 8, 12, 13 w/o 동결 해동); (2회 동결 해동 처리 후 4, 5, 9, 10, 14, 15).
도 8: 각 융합 단백질의 일반적 부분에서 iMAT 분자에 대한 MAT 분자의 카이트-두리틀(Kyte-Doolittle) 소수성 플롯을 나타낸다[즉, 각 항원 모듈(들) 부재]. 소수성 지수는 X-축 상의 아미노산 위치에 대해 Y-축 상에 나타낸다. 지수에서 양의 수는 소수성을 나타낸다. MAT 분자와 비교하여 소수성 플롯의 시작에서 iMAT 분자의 그래프의 이동은 iMAT 분자에서 His-태그 및 하나의 메티오닌 잔기의 추가의 N-말단 존재뿐만 아니라 임의의 스페이서 모듈(들)의 부재로 인한 것이다.
도 9: 종, 알레르겐 및 uniprot 등록 번호를 동정하는 더마토파고이데스 속의 알레르겐의 예를 보여준다. (도 9a) 디. 프테로니시누스로부터의 알레르겐, (도 9b) 디. 파리나에로부터의 알레르겐.
도 10: 개 및 고양이 유래의 불변 쇄의 N-말단 서열 정렬을 보여준다. CLIP 서열은 회색으로 명암처리되어 있다.
도 11: 다감작화된 말(말 1)에서의 5개의 농도의 iMAT-Cul o2 및 iMAT-Cul o3 및 각각의 알레르겐의 히스타민 방출 시험을 보여준다(실시예 2에서의 검정의 상세설명).
실시예
다음 실시예는 추가로 본 발명을 예시하기 위해 수행되지만; 동일한 것이 본원에 개시된 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해되어서는 안된다.
실시예
1 - 면역 / 면역의 지속기간에 대한 대용
마커
말을 제외한 동물, 예를 들면, 반추동물, 돼지, 보다 바람직하게는 개 및/또는 고양이에의 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질의 투여는 항원 모듈에 존재하는 알레르겐 및/또는 에피토프에 대한 면역학적 반응을 생성시킨다. 추가로, C- 또는 N- 말단 태그, 예를 들면, HIS-태그는 인접한 모듈로부터 인접한 아미노산 잔기와 함께, 표적 대상체에서의 고유한 생성물-특이적 면역학적 신호(예를 들면, 항체- 또는 T-세포 반응)을 검출하기 위해 사용되고, 이는 면역 또는 면역의 지속기간에 대한 대용 마커로서 사용된다. 이러한 대용 마커는, 치료-특이적 면역학적 파라미터로서, 면역 또는 면역 조절 또는 투여 후 면역 지속기간 또는 면역 조절 기간을 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 (단리된) 재조합 단백질에 의해 유발된 면역 반응에 대한 특이적 지시인자(indicator)는 말단-태그(임의로 인접한 아미노산 잔기를 갖는) 특이적 항체, 예를 들면, IgG 항체의 도입이다. 대안으로 또는 추가로, 지시인자는 스페이서와 본원에 기술되고 청구된 모듈의 연결부(junction) 또는 2개의 모듈 사이의 연결부에 대해 특이적인 항체의 도입이다.
본 발명에 따른 상이한 항원 모듈을 함유하는, 서열번호 57(N-말단 헥사-히스티딘 태그를 갖는 Der f 15 iMAT 분자(개))과 같은 단일 iMAT 분자 또는 서열번호 45, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72로부터 선택되는 하나 또는 몇몇의 iMAT 분자의 조합은 알레르기성 질환, 특히 아토피성 피부염을 앓고 있거나 이러한 질환의 위험이 있는 개를 예방학적으로 또는 치료학적으로 치료하기 위해 사용된다. 상기 개에서, 상기 iMAT 분자는 실시예 3에 기술된 바와 같이 투여된다. 이들 iMAT 치료된 개로부터의 채혈로부터 유도된 혈청 샘플에서, 항체 생산, 보다 구체적으로는 특이적 IgG에 관한 iMAT 단백질의 N-말단에 대항하는 iMAT 치료시 면역학적 반응을 측정할 수 있다. 측정은 표준 ELISA(효소 링크된 면역흡착 검정) 기술을 사용하고, 이에 의해 서열번호 6을 포함하는 충분한 양의 합성된 펩타이드를 ELISA 플레이트의 표면 상에 코팅한다. 이어서, 치료된 동물의 혈청 샘플을 상기 플레이트 상에서 인큐베이션하고, 상기 펩타이드에 대한 IgG의 특이적 결합은 각각 고양이 또는 개에서 IgG에 대해 특이적인 2차 비오티닐화된 항체에 의해 검출하고, 이어서 상응하는 검출 시스템, 예를 들면 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 및 기질로서의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 적용한다.
이러한 ELISA 시험을 이용하여, iMAT 면역 치료요법에 의해 유발된 면역의 개시 및 면역의 지속기간을 측정하고, 시간 경과에 따라 관찰한다. 치료학적 백신접종 용법, 즉 부스터(booster) 주사의 수 및 스케쥴은 임상학적 발병 동안 이러한 대용 파라미터에 의해 측정한다.
실시예
2 -
저알레르기항원성
치료학적 알레르겐의 알레르기항원성은 가장 중요하고, 이는 유해 사건을 유도, 예를 들면, 아나필락시스를 유발할 잠재성의 척도이다. 포유동물에서의 알레르기에 대한 예시로, 알레르겐 특이적 IgE 매개된 과민증은 알레르겐 유발 시험, 특히 피부를 표적으로 하는 시험으로서의 절차에서 연구된다[Griffin CE. Diagnosis of canine atopic dermatitis DOI: 10.1002/9781118738818.ch10].
재조합 알레르겐의 생물학적 평가를 위해 그리고 유전적으로 조작된 저알레르기항원성 유도체의 검증을 위해 진피내 피부 시험을 사용하였다.
개에서의 진피내 시험은 개의 진피에 직접적으로 소량의 알레르겐 용액의 주사를 투여함으로써 수행한다. 이는 일반적으로 소형-게이지(27게이지)의 니들 및 각각의 부위에의 0.05 내지 0.1mL의 주사로 수행된다. 양성 반응은 홍반의 존재, 팽만, 발진(wheal)의 높이 및 크기에 의해 임의로 해석된다.
진피내 시험의 이점은 높은 감도이다. 이는 시험이 저알레르기항원성에 대한 정량적 측정을 제공해야만 하는 경우 특히 중요하다. 상기 시험에서, 상기 MAT 분자는 고양이 및 개와 같은 감작화된 개체에서의 양성 반응에 도달하기 위한 동일한 시험에서 적용된 천연의 본래 알레르겐과 비교하여 10-, 100- 내지 1000-배 또는 심지어 보다 높은 몰 농도의 알레르기성 구성성분을 나타낸다.
MAT 분자와 관련하여, 상응하는 본래 알레르겐과 비교하여 이들의 알레르기항원성에 대한 상충되는 결과가 선행 기술에 보고되었다. Senti G 등(J Allergy Clin Immunol. 2012, 129(5): 1290-1296)은 진피내 및 피내 시험에서뿐만 아니라 CAST(Cellular Antigen Stimulation Test: 세포 항원 자극 시험) 검정에서도 MAT-Fel d1의 저알레르기항원성을 입증하였다. Fel d1을 포함하는 MAT 분자와 알레르겐 사이의 감도의 정량적 차이는 각각 100-, 23- 및 16-배였다. MAT-Fel d1이 분명히 저알레르기항원성이었지만, 일부 알레르기항원성이 남아있었다. 대조적으로, Zhao 등(Int J Clin Exp Med 2015; 8(4): 6436-6443)은 이들의 MAT-Der p1 작제물이 천연 Der p1 단백질에 비해 훨씬 더 강한 알레르기항원성(고알레르기항원성)을 나타내는 것으로 기술한다.
놀랍게도, 본원에 개시되고 청구된 개선된 MAT 분자는 이러한 관점에서 명백한 우수성을 보여준다. 각각 항원 모듈에 Cul o2 및 Cul o3을 포함하는 본 발명에 따라 제조된 2개의 iMAT 분자의 안전성이 시험된다. 이들 알레르겐에 대해 감작화되고 곤충 물림 과민증(IBH)을 앓고 있는 말의 신선혈(freshly withdrawn blood)을 하기 기술된 바와 같은 히스타민 방출 시험(HRT)에 사용한다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 천연 알레르겐은 강한 히스타민 방출을 유발하고, 반면에 놀랍게도 2개의 상이한 iMAT 분자(iMAT-Cul o3 및 iMAT-Cul o2)는 사실상 반응을 전혀 나타내지 않는다.
따라서, iMAT 분자는 선행 기술에 기술된 바와 같은 MAT 분자와 비교하여 안전성과 관련하여 명백한 우수성을 보여준다(상기 참조).
히스타민 방출 시험(HRT): 본원에 개시되고 청구된 (단리된) 재조합 단백질 / iMAT 분자에 대한 호염기구 반응성을 시험하기 위해 대상체의 신선혈을 제조한다. 간략하게, iMAT 분자 및/또는 재조합 알레르겐의 10-배 일련의 희석물(예를 들면, 10nM 내지 0.001nM 최종 알레르겐 농도의 범위)을 PIPES 완충액(AppliChem, Darmstadt, Germany), pH 7.4에서 제조한다. Na-EDTA 응고-저해된 혈액으로부터 수득된 세척된 적혈구 및 백혈구를 개별 희석물로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 상기 반응을 20분 동안의 빙상 인큐베이션에 의해 정지시키고, 방출된 히스타민을 함유하는 상청액을 원심분리 후 각각의 샘플로부터 수집한다. 최대 히스타민 함량은 혈구를 10분 동안 수욕에서 비등시킴으로써 수득한다(최대 방출). 세척된 혈구를 사용하는 방출 완충액의 인큐베이션은 음성 대조군(자발적 방출)으로서의 역할을 한다. 히스타민 농도는 경쟁적 RIA(LDN Nordhorn, Germany)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 측정한다.
대안으로, 다른 호염기구 활성화 시험은 세포 항원 자극 시험 CAST® ELISA이고, 이는 또한 시험관내 알레르기 유발 시험으로서 간주될 수 있다. 이러한 검정은 제조업자의 지침에 따라 수행한다[Buhlmann Laboratories AG, Allschwil, Switzerland]. CAST®에서, 알레르기 대상체의 혈액으로부터 침강된 백혈구를 동시에 사이토킨 IL-3으로 프라이밍하고, iMAT 분자 및/또는 재조합 알레르겐으로 자극시킨다. 호염기구 세포는 특히 알레르기성 매개인자, 설파이도류코트리엔 LTC4, 및 이의 대사물질 LTD4 및 LTE4를 생성한다. 이들 신선하게 합성된 설파이도류코트리엔(sLT)은 후속적으로 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay: 효소 링크된 면역흡착 검정) 시험에서 측정된다.
유해 사건을 유도하는, 예를 들면, 투여의 부작용으로서 아나필락시스를 유발하는 iMAT 분자의 잠재성은 각 재조합 알레르겐 단독에 대한 iMAT 분자(알레르겐 함유)의 효과와 비교하여 이들 검정으로 시험관내 평가될 수 있다.
재조합 알레르겐과 비교하여 감소된 호염기구 탈과립, 예를 들면 iMAT 분자에 의한 히스타민 및/또는 설파이도류코트리엔 방출은 유해한 효과에 대한 낮은 잠재성, 즉 iMAT 분자의 우수한 안전성 프로파일을 지시한다.
상기 HRT(또는 CAST®)는 대상체에서 1형 알레르기 반응에 대한 시험관내 유발 시험으로서 사용될 수 있다. 알레르겐 특이적 히스타민 방출은 호염기성 세포 활성화에 대한 각각의 알레르겐의 관련성을 지시하고, 따라서 대상체의 알레르겐 특이적 감작화에 대한 정량적 파라미터로서 사용될 수 있다.
알레르겐 특이적 IgE 매개된 과민증을 앓고 있는 대상체가 iMAT-항원 모듈에서 관련 알레르겐을 포함하는 상응하는 iMAT 분자로 치료되면 알레르겐 관련 유해 반응이 발생하지 않는 것으로 예상될 수 있다. 이는 iMAT 단백질을 적용하는 탈감작화 치료요법을 특히 생명을 위협하는 질환의 치료에 적절하게 한다.
MAT 분자와 대조적으로 iMAT 분자의 이러한 놀라운 안전성 특성의 결과는 탈감작화 단백질로서 사용된 iMAT 분자가 병원체에 대항하는 백신과 유사하게 사용될 수 있다는 것이다. 전형적 치료학적 알레르겐과 같은 상향-투약(up-dosing)이 필요하지 않고, 이는 iMAT 분자를 포함하는 백신이 알레르기성 유해 사건과 관련하여 알레르겐 특성을 나타내지 않기 때문이다. 이미 치료 과정에서 iMAT 분자의 제1 주사의 용량은 효능 고려사항만을 기초로 하여 선택되고, 잠재적 알레르기성 유해 반응을 고려할 필요가 없다. 이는 선행 기술에서 기술된 MAT 분자를 사용하여 수행될 수 없고, 이는 MAT의 알레르기항원성이 본래 알레르겐과 비교하여 단지 소정 수준까지만 감소되었기 때문이다. 그러나, MAT 분자는 여전히 알레르겐이고; 대조적으로 iMAT 분자는 그렇지 않다. 이들 개선된 특성의 이점은, 예를 들면, 높은 생물약제 함량(예를 들면, 1μg 내지 100μg 3회, 바람직하게는 10μg 내지 50μg의 iMAT 단백질 3회)을 갖는 3회의 피하 또는 림프내 주사로 보다 효과적인 치료 용법을 가능하게 한다.
iMAT 분자의 알레르기항원성의 결여는 선행 기술에 기술된 MAT 분자와 대조적으로 어떠한 링커 아미노산 잔기[즉, 제1, 제2 및/또는 제3 모듈(들) 사이의 스페이서 모듈(들)]도 상기 iMAT 분자에서 상이한 모듈을 분리하는데 사용되지 않는다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 펩타이드 또는 단백질 링커에 의해 연결된 2개 이상의 기능성 폴리펩타이드를 함유하는 조작된 융합 단백질이 단백질의 기능(예를 들면, 면역 시스템에 의한 에피토프 인식)에 있어서 중요하다는 것이 선행 기술에 공지되어 있다[Klein JS et al., Protein Eng Des Sel. 2014, 27(10): 325-330]. 기능성 유닛 사이의 분리 거리는 에피토프 접근 및 결합력(avidity)을 갖는 결합 능력에 영향을 미칠 수 있다. 모듈 사이, 특히 표적화 도메인 및 항원 모듈 사이의 아미노산 잔기 링커의 결실이 보다 강성(rigid) 구조를 유도하는 경우, 알레르겐 모듈의 입체구조적 에피토프는 부정확한 폴딩으로 인하여 형성되지 않을 수 있다. 이의 높은 친화도 수용체에 의해 호염기구(예를 들면, IgE)의 표면 상에 결합된 항체의 가교 링크는 활성화 및 히스타민 방출을 유도하는데 필요하다. 그러나, 미스폴딩된 알레르겐은 이러한 가교 링크를 유도할 수 없다. 따라서, 링커가 없는 iMAT 분자는 iMAT 분자를 비-알레르기성이 되게 하는 입체구조적 IgE 에피토프를 형성할 수 없다.
실시예
3 - 개 및/또는
고양이에서의
아토피성 피부염의 치료학적 백신/예방
단일 iMAT 분자 또는 본 발명에 따른 상이한 항원 모듈을 함유하는 iMAT 분자의 조합은 아토피성 피부염(AD)을 앓고 있거나 AD의 위험이 있는 개 및/또는 고양이를 예방학적으로 또는 치료학적으로 치료하기 위해 사용된다.
제1 실시형태에서, 서열번호 36(Der f 15)에 따른 iMAT 분자를 아토피성 피부염을 앓고 있는 고양이의 슬와 림프절에 투여한다.
제2 실시형태에서, 서열번호 66(하이브리드 1)에 따른 iMAT 분자를 아토피성 피부염을 앓고 있는 고양이의 슬와 림프절에 투여한다.
제3 실시형태에서, 서열번호 57(Der f 15)에 따른 iMAT 분자를 아토피성 피부염을 앓고 있는 개의 슬와 림프절에 투여한다.
제4 실시형태에서, 서열번호 81(하이브리드 3)에 따른 iMAT 분자를 아토피성 피부염을 앓고 있는 개의 슬와 림프절에 투여한다.
각각의 경우에, 이환 동물의 림프절 위의 털을 클립핑하고, 시술적으로 준비한다. 안내를 위해 촉진 및/또는 초음파를 사용하여 25 G 니들을 림프절 내로 삽입한다. 주사된 iMAT 분자는 애주번트로 흡수된다. 애주번트는 예를 들면, 알루미늄 포스페이트(Adju-Phos®, Brenntag Biosector, Denmark)로 이루어진다. iMAT 분자 스톡은 바이알 중의 375μg/mL 단백질 농도의 냉동된 용액이고, 각각 사용하기 전에 해동되어 500μL를 포함한다.
iMAT 분자 용액을 해동한 후, 400μL의 용액을, 예를 들면 200μL의 애주번트와 혼합한다. 이러한 최종 제형은 예를 들면 Adju-Phos®에 대해 iMAT 분자를 흡수시킬 수 있도록 하는 림프내 주사 전에 실온에서 60분 동안 유지된다. 예를 들면, 12.5μg iMAT 분자를 포함하는 50μL의 혼합물을 림프절 주사를 위해 500μL 시린지로 제거한다. 이러한 제조물은 우선 전형적으로 0일, 28일 및 56일에 주사 및 iMAT 분자당 10μg 내지 50μg의 용량(하나 이상의 항원 모듈 단독 중량을 언급함)으로 투여된다.
치료 기간에 걸쳐 그리고/또는 그 후에, 소양증, 피부 병변 및 투약 스코어의 정량적, 반-정량적 또는 정성적 평가에 의해 AD의 치료 또는 예방의 효능을 임상학적으로 조사한다(Hobi S, Mueller RS; Tierarztliche Praxis, Ausgabe K, Kleintiere/Heimtiere 2014, 42 (3): 167-173).
이들 임상학적 파라미터를 치료학적 개입의 시작 이전에 개체 개 및/또는 고양이의 임상학적 징후와 비교한다. 대안으로, 치료되지 않거나 위약 치료된 AD 이환 개 및/또는 고양이에 대한 비교는 AD의 임상학적 징후의 iMAT 분자-매개된 치료 및/또는 예방의 효능을 입증할 수 있다.
대안으로 또는 추가로 소정 더마토파고이데스 알레르겐을 사용한 피내 유발 시험은 상기 개 및/또는 고양이에서 사용될 수 있다. 감소된 반응(즉시 및/또는 후기 반응성)은 iMAT 분자 투여의 치료 및/또는 예방 효과를 나타낸다.
추가로, 면역 시스템의 상이한 구성성분의 조절을 모니터링하고, 예를 들면, 알레르겐 특이적 IgE 및 IgG 항체 역가의 변화는 치료 및/또는 예방 효과를 나타낸다.
IgE 수준의 변화를 제외하고는, 알레르겐-특이적 IgG의 증가는 놀랍게도 개 및/또는 고양이를 AD에 대해 상기 iMAT 분자를 사용하여 치료하는 경우 발견된다. 이들 항체는 생체내 IgE-매개된 아나필락시스를 차단하고, 호염기구 및 비만 세포로부터의 염증 매개인자의 알레르겐-유도된 방출을 저해할 뿐만 아니라 T 세포에 대한 IgE-매개된 알레르겐 제시를 저해하는 것으로 보인다. 특히 알레르겐에 특이적으로 결합하는 iMAT-유도된 IgG 항체 중에서, 몇몇의 알레르겐-특이적 서브타입은 중요한 "보호" 역할을 하는 것으로 시사되었고, 이는 이들이 알레르겐-특이적 IgE 항체와 경쟁하고, IgE-매개된 항원 제시를 억제함으로써 CD4+ T 세포의 활성화를 방지할 수 있기 때문이다. 추가로, 분비된 IgG 서브세트는 비만 세포 및 호산구의 현저한 감소를 촉진시키고, 염증성 매개인자의 감소된 방출을 동반한다.
알레르겐-특이적 면역 치료요법은 면역 시스템의 상이한 구성성분을 조절할 수 있다. 세포 변형은 알레르겐-특이적 T 세포에서 말초 내성의 유도를 지시하는 알레르겐-유도된 T-세포 증식의 감소, 및 증가된 IFN-γ 생산을 갖는 Th1 반응을 위한 항원-특이적 Th2-우세한 면역 반응의 감소로 이루어진다. 이러한 면역학적 전환(switch)을 조정할 책임이 있는 주요 세포 타입은 이종성(heterogeneous) T-세포 집단이고, 조절성 T 세포(Treg)라고 칭한다. 세포 수준에서, 성공적인 알레르겐 면역 치료요법을 위한 중요한 인자는 1형 Treg 세포의 말초 유도이다. 항원 인식에서 특이적인 1형 Treg 세포에 대한 기능적 연구는 1형 Treg 세포에 의한 Th1 및 Th2 반응의 조절이 대부분 사이토카인 IL-10의 분비에 의존하고, 이는 면역억제 특성을 가짐을 밝혔다. 사실상, IL-10은 특이적 알레르겐에 대항하는 말초 T 세포의 증식 반응을 저해하고, T-세포 무반응(anergy)의 유도에서 중요한 역할을 한다. 시험관내에서, IL-10은 조절성 인자 FoxP3의 발현을 향상시키고, 호산구 기능을 조절하고, 비만 세포에 의해 방출된 염증-촉진 매개체를 감소시킨다.
상기 iMAT 분자-매개된 면역 치료요법의 중요한 임상학적 효능의 다른 가능한 마커는 알레르겐-특이적 T 세포의 수 또는 특성의 변화의 검출이다. 예를 들면, Bet v1 테트라머 염색 연구를 기초로 하여, 순환하는 자작나무 화분-특이적 CD4+ T 세포의 수준 및 특성은 잠재적으로 SIT 전후와 비교할 수 있다. 최근, 형질전환 성장 인자(TGF)-β는 또한 성공적인 SIT에서 주요 사이토카인으로서 확인되었다. 다수의 작용은 이의 관련성, 예를 들면 특이적 Th1, Th2 및 Th17 세포의 억제, FoxP3의 유도 및 Tregs의 억제 기능을 설명할 수 있다. 추가로, TGF-β는 랑게르한스 세포에서 FcεRI 발현을 하향조절하고, IgE 합성을 억제한다. 이들 면역학적 관련 T 세포 매개된 면역학적 반응은 Nuttall 등(T.J. Nuttall et al., Veterinary immunology and Immunopathology 84 (2002) 143-150)에 의해 기술된 바와 같이 말초혈 단핵구(PBMC) 배양 및 이의 사이토카인 검출을 적용하는 생체외 실험에서 측정할 수 있다.
실시예
4 - WO 2004/035793(US
등가범위
US 2005/0281816)에 따른 선행 기술 MAT 분자와 본 발명에 따른 iMAT 분자의 비교
MAT 단백질의 순도의 평가를 위해, 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 시험 절차를 확립하였다[Thompson J et al., J Biol Chem 2002, 277: 34310-34331]. 환원제, 리튬 도데실설페이트(LDS)를 사용하고 75℃에서 가열한 샘플 제조를 포함하는 방법은 전기영동 분리 후 재생가능한 다중의 선명한 밴드를 초래하였다. 쿠마시 블루를 사용한 염색은 200 내지 1000ng의 단백질이 적재된 겔에서 선형 정량적(밀도측정) 특성을 제공한다. 알레르겐 모듈(MAT-Fel d1)로서 Fel d 1를 사용하여 MAT 분자에서 알레르겐 모듈을 검출하는 모노클로날 항체를 사용하여, 주요 밴드 및 13개의 경미한 밴드 모두 MAT-Fel d1 단백질을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 경미한 밴드는 또한 겔 상의 재-적재 후 원래 겔 상에서와 동일한 위치로 이동한다(도 1). PAGE 이전의 샘플 제조를 위한 몇몇의 상이한 방법, 예를 들면 상이한 온도 및 완충액 조성물 프로토콜은 동일한 밴드 패턴을 생성하였다.
이들 밴드 모두에서, 각 밴드가 겔에서 절단된 후에, 트립신에 의해 소화되고, 후속적으로 질량 분광계(nanoLC/ESI-MS)에 의해 분석되어 전장(완전한) MAT-Fel d1 단백질 및 단지 미량의 숙주 세포 단백질의 존재가 입증될 수 있다. 이들 실험으로부터, 예를 들면 SDS-PAGE에서 MAT-Fel d1의 상이한 폴딩 변이체의 이례적인 특성(겔 이동)을 결론지을 수 있다. 이는 분석된 제조물에서 MAT-Fel d1이 생물약제 분자로서, 특히 임상학적 및/또는 시판 생물약제 제조를 위해 적합하지 않음을 의미하는데, 이는 이의 순도가 표준 방법(예를 들면, SDS-PAGE)으로 뿐만 아니라 상기 설명된 변형된 절차로 측정될 수 없기 때문이다.
MAT-Fel d1 분자의 이러한 겔 이동 현상과 대조적으로, 이와 같은 Fel d1은 SDS PAGE에서 이러한 이례적인 특성을 나타내지 않는다(도 2, 레인 2 및 3). Fel d1은 예상된 분자량(19,6 kD)에서 하나의 선명한 밴드를 나타낸다.
추가의 이례적인 특성은 RP-HPLC 분석에서 관찰될 수 있다. 이 분석 방법에서 MAT-Fel d1의 어떠한 단일 피크도 단백질의 본래 입체구조에서도 또는 무질서 및 환원 조건에 의해 유도된 변성된 형성에서도 나타나지 않았다(도 3). 그러나, GMP 인증된 생물약제 제조를 위해 생체분자의 단일 이소형이 시판 약제학적 제제에서 의무적이다.
SDS-PAGE 및 RP-HPLC 분석에서 이러한 관찰은 아미노산 서열에 기초한 물리화학적 특성에 의해 설명될 수 있다. 카이트 & 두리틀 소수성 플롯(Kyte & Doolittle hydrophobicity plot)에서의 분석[Kyte J, Doolittle RF, Journal of Molecular Biology 1982, 157(1), 105-132]은 인접한 극단 소수성 및 친수성 도메인(도 4)을 나타내었고, 이는 이러한 이례적인 거동의 원인일 수 있다.
특히, 융합 단백질의 표적화 도메인의 소수성 영역은 막 단백질의 막관통 분절과 유사하고, 이는 이러한 이례적인 특성을 야기하는 것으로 당해 기술 분야에 공지되어 있다[Rath A et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009, 106(6): 1760-1765].
"겔 이동"이라고 칭하는 화학식의 분자량과 상관관계가 없는 SDS-PAGE 상의 이동은 막 단백질에서 공통적인 것으로 나타난다. 이는 이들의 비변성 2D- 또는 3D-구조에 독립적으로 단지 이들의 분자량에 따른 분자의 분리인 SDS-PAGE 방법의 전제조건이 이들 경우에 적용되지 않음을 의미한다. 상기 인용된 작업(PNAS article)에서, 저자는 질환-표현형 잔기 치환을 포함하는, 사람 낭성 섬유증 막관통 전도 조절제(CFTR)의 막관통 분절 3 및 4로부터 유도된 야생형 및 돌연변이 나선-고리-나선("헤어핀") 서열의 라이브러리를 사용하는 나선 막 단백질의 이례적인 겔 이동성을 조사한다. 저자는 이들 헤어핀이 이들의 SDS-PAGE 상의 실제 화학식의 분자량에 대해 마이너스 10% 내지 플러스 30%의 속도로 이동하고, 3.4 내지 10g SDS/g 단백질 범위 비로 세제(detergent)를 적재한다는 것을 발견하였다. 이들은 추가로 돌연변이 겔 이동이 강력하게 헤어핀 SDS 적재 용량의 변화와 그리고 헤어핀 헬리시티(helicity)와 상호관련된다는 것을 입증하였고, 이는 겔 이동 거동이 변경된 세제 결합에 기인한다는 것을 나타낸다. 몇몇의 경우에, SDS에 의한 이러한 차별적 용매화는 단백질-세제 접촉이 단백질-단백질 접촉으로 대체될 수 있고, 이는 세제 결합 및 폴딩이 친밀하게 링크된다는 것을 의미한다.
MAT 및 iMAT 단백질의 SDS PAGE(도 5)뿐만 아니라 RP-HPLC 분석(도 3 및 6)은 이동 패턴 또는 용리에서 각각 실질적 차이를 나타낸다. MAT-Fel d1의 산화된 형태는 SDS-PAGE 겔(레인 3)에서 하나의 선명한 밴드가 아니라 MAT-Fel d1의 실제 32.2 kD 보다 더 크고 더 작은 분명한 분자량을 갖는 몇몇의 확산 밴드를 나타낸다. 대조적으로, 예로서 쿨리코이데스 오브솔레투스 알레르겐의 항원 모듈(iMAT-Cul o4)을 갖는 iMAT 분자는 산화된 조건 하에 하나의 선명한 밴드(M=41.6kD)를 나타낸다. 또한, RP-HPLC 크로마토그램은 단일 피크를 나타낸다(도 6).
환원 조건 하에, SDS-PAGE에서 MAT-Fel d1은 대략적으로 공지된 분자량에서 이동하는 주요 밴드를 나타내지만, MAT-Fel d1의 완전한 서열을 포함하는 것으로 공지된 도 1에 기술된 추가의 수개의 경미한 밴드도 다시 나타난다(도 5, 레인 6). 이는 MAT-Fel d1의 이례적인 특성을 특징으로 하는 특성(attribute)이다. 추가로, 환원 조건 하의 MAT-Fel d1의 RP-HPLC 크로마토그램(도 3, 오른쪽 그래프)은 MAT-Fel d1의 적어도 3개의 상이한 이소형을 나타낸다. 대조적으로 iMAT 분자는 SDS-PAGE(도 5, 레인 7)에서 뿐만 아니라 RP-HPLC(도 6)에서 단일 이소형을 분명히 나타내는 특성을 나타낸다.
환원 조건은 MAT 분자에서 디설파이드 가교의 절단을 유도하고, 따라서 MAT 및 iMAT 분자는 디설파이드 가교가 단독으로 MAT의 이례적인 특징에 원인이 되는 경우, 환원 조건 하에서와 같이 거동하여야만 한다. 그러나, 이는 상기 케이스가 아닌데, 이는 이례적인 겔 이동 및 MAT 분자의 RP-HPLC에서의 이소형의 발생이 여전히 환원 조건 하에 존재하기 때문이다.
그러나, iMAT 분자는 이러한 겔 이동을 나타내지 않고, 단백질의 본래 (산화된) 형태로 RP-HPLC 크로마토그램에서 피크를 나타낸다. 추가로, MAT 및 iMAT 분자의 카이트-두리틀 플롯은 His-태그, TAT 및 표적화 도메인의 서열을 커버하는 N-말단에서 거의 동일하다(도 8). 결과적으로, 당해 기술 분야의 숙련가에게 선행 기술의 단점을 극복하기 위해 다른 아미노산 잔기로 치환된 시스테인 잔기를 사용한 선행 기술에 따른 MAT 분자를 작제하는데 동기부여하지 못할 것이다.
iMAT 분자는 하기 실시예 5에 따라서 "생물정보학적 조작" 절차에 의해 작제될 수 있고, 이. 콜라이에서의 재조합 발현 기술에 의해 생산될 수 있다. 예로서, 도 7에 나타낸 바와 같은 3개의 iMAT 분자는 2회 냉동 및 해동 후 완충액(20mM 시트레이트, 1M 아르기닌, pH 6.0)에서 안정하고, 애주번트로서 Adju-Phos®(Brenntag, Denmark)에 흡수될 수 있었고, 이에 따라 iMAT 분자는 백신으로서 사용될 수 있다. 단백질은 동일한 완충액 시스템에서 분해 없이 Adju-Phos®로부터 탈착될 수 있다(도 7).
실시예
5 - 전장
iMAT
분자의 "생물정보학 조작": 항원 모듈을 위한 단백질의 선택 및 전장 iMAT 분자의 최적화
iMAT 기술을 효과적으로 사용하여, 예를 들면 알레르기성 장애를 갖는 개 및/또는 고양이를 치료하기 위해, 하기가 추가로 권고된다:
a) 알레르겐이고, 따라서 또한 이환 대상체에서의 과민증을 야기하는 높은 잠재성을 갖고, 따라서 내성 유도를 위한 표적일 수 있는 iMAT 분자에서 알레르겐 모듈로서 단백질을 선택하는 것, 그리고
b) 열역학적으로 안정하고, 단백질 조작에 의해 효율적으로 제조될 수 있고, 추가로 충분한 양의 품질(즉, 정체, 순도 및 효력)을 보장하는 표준 방법으로 분석될 수 있는 상기 주요 알레르겐을 이용하여 iMAT 분자를 작제하는 것.
이들 요구사항을 충족시키기 위해, 본 발명에 따른 iMAT 분자에 포함되는 알레르겐을 선택하기 위해 생물정보학 접근법이 선택되었다. 선택의 목적은 (i) 주어진 알레르기성 장애에서 관련성이 있는 것으로 예측되는, 즉 알레르기성 장애를 앓고 있는 개체의 대부분이 각각의 알레르겐에 대해 감작화되는 하나 이상의 알레르겐을 선택하는 것이고, (ii) 알레르겐 특성의 선형 에피토프를 포함할, 즉 공개된 알레르겐에서와 동일한 짧은 펩타이드 서열(7 내지 13개 아미노산 잔기)의 고위수를 포함할 가능성이 가장 높은 알레르겐을 선택하는 것이다.
약제학적 제제를 위한 적합한 항원을 선택하기 위해, 공지된 알레르겐에 대한 국부 서열 정렬에 기초한 상동성 비교가 선택된다. 종종 항체 인식을 위한 에피토프(대부분 입체구조적 에피토프) 검출은 기능적 분석(예를 들면, 펩타이드 마이크로어레이)에 의해 달성되고, 또는 T-세포 에피토프(선형 에피토프)에 대해서는 MHC 분자에 대한 펩타이드 결합 가능성의 계산에 의해 달성된다. iMAT 기술의 치료학적 원리는 그 중에서도 엔도솜에서 산-의존성 프로테아제에 의한, 이어서 MHC 클래스 II 결합 및 항원 제시에 의한 세포내이입(endocytosis) 및 분해에 기초한다.
따라서, 상이한 - 비 실험적이지만 생물정보학적인 - 알레르겐 선택을 위한 접근법이 선택되고, 이는 공지의 알레르기성 단백질에 대한 주어진 단백질로부터 유도된 펩타이드의 국부 상동성 조사에 기초하고, 이들 중 대부분은 사람에서 알레르기를 일으키는 것으로 알려져 있다. 알레르기항원성 특성을 갖는 것으로 의심되는 단백질의 아미노산 서열은 공공의 이용가능한 데이터베이스(예를 들면, UNIPROT)로부터 이출되고, 중복(redundancies)은 이출된 데이터세트 내에서의 서열 상동성의 분석에 의해 측정된다. 높은 상동성 서열 카운터파트를 제거하고, 수득한 나머지 서열은 후속적인 분석을 위해 가능한 유용한 항원의 정규 서열 데이터베이스로서 역할을 하였다. 추정되는 높은 알레르겐 잠재성을 갖는 단백질을 측정하기 위해, 단백질을 6 내지 15개의 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드로 하나의 아미노산 이동으로 인실리코 절단한다. 이어서, 예를 들면, 더마토파고이데스 단백질 및 정규 서열 데이터베이스에 상응하는 펩타이드의 국부-짝 정렬을 수행하였다. 이후에, 수득된 정렬 히트의 스케일링은 이에 따른 상응하는 펩타이드의 하나 및 정렬 히트에 대한 제공된 단백질의 자기-정렬 스코어를 설정함으로써 수행한다. 그 후, 제공된 역치를 초과하는 정렬 히트의 수를 각각의 펩타이드에 대해 계수하고, 공지되지 않은 알레르겐 특성을 사용하여 단백질 서열의 무작위로 생성된 데이터베이스에 대해 국부-짝 정렬로 비교하고, 후속적으로 스케일링하고 계수한다. 수득한 "비 알레르기성 단백질" 계수를 알레르겐 결과의 것으로부터 빼고, 모든 상응하는 펩타이드의 히트 수에 기초한 각 단백질에 대한 누적 히트 스코어를 계산한다. 가장 높은 계수를 갖는 단백질이 iMAT 항원 모듈 후보로서 선택된다.
선택된 알레르겐 각각은 항원 모듈로서 개별적인 iMAT 분자로 통합되고, 후속적으로 전장 iMAT 분자는 3-차원 단백질 구조의 반복 모델링에 의해 열역학적 안정성에 대해 최적화되었고, 단일 아미노산의 치환 후 자유 에너지 변화의 계산하였다. 물리화학적 특성 및 안정성은 1차 아미노산 서열 내의 상이한 아미노산 잔기(들)를 치환함에 의해 영향을 받는다.
본원에 기술된 분석(항원 조사 및 모델링)의 결과로서, 약리학적 제조 및 적용에 적합한 iMAT 아미노산 서열로 형질전환된다.
한 특정 실시형태에서, 이러한 생물정보학적 조작 접근법은 Zen 1 및 Der f 15가 진드기 종 더마토파고이데스 파리나에로부터 유도된 단백질에 의해 유발된 알레르기성 장애 아토피성 피부염에서 관련되어 있음을 확인시켜준다. 또한, 생물정보학 분석은 시스테인이 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 안정한 iMAT 분자를 나타낸다. 이러한 안정한 iMAT분자의 예로는 서열번호 39(개 Zen 1) 및 서열번호 57(개 Der f 15)이 있다.
실시예
6 - 본 발명에 따른 모자이크-유사
iMAT
분자의
작제
하나 초과의 알레르겐의 구성성분이 항원 모듈 내로 포함되는 경우, 본 발명에 따른 iMAT 분자는 추가로 개선된다는 것이 예상된다. 이러한 목적을 위해, 상이한 방식으로 상기 기술된 생물정보학 선택 접근법(실시예 5)의 기본 원리를 적용할 수 있다. 알레르겐 데이터 베이스에서 발견되는 알레르겐 펩타이드의 히트 계수에 기초한 완전한 알레르겐을 선택하는 대신에, 몇몇의 이러한 알레르겐의 가장 매우 풍부한 펩타이드만을 사용하여 iMAT 항원 모듈을 조작한다. 따라서, 이러한 iMAT 분자는 몇몇의 알레르겐으로부터 유래한 펩타이드의 항원 모듈로 이루어진다. 이는 이의 표적화된 알레르기성 프로파일에 대하여 단일 iMAT 분자의 스펙트럼을 광범위하게 하고, 따라서 약리학적 약물 개발에 유리하다.
예를 들면, 더마토파고이데스 유래의 이러한 모자이크-유사 iMAT 단백질에 적격인 짧은 펩타이드 서열을 발견하기 위해, 상기 기술된 상동성 비교에 의해 분석한다. 간략하게, 6 내지 15개 아미노산 잔기의 펩타이드 길이를 갖는 인실리코 절단된 단백질은 알레르겐-관련된 단백질의 정규 서열 데이터베이스 및 비-알레르기-관련된 단백질의 무작위 데이터베이스로 국부로 정렬된다. 정규 데이터베이스 내에 발견되는 각각의 펩타이드에 대해 유의한 상동성의 차이의 수가 결정된다. 후속적으로, 각각의 펩타이드는 거짓 양의 히트를 감소시키기 위해 무작위 데이터베이스를 삼중으로 정규 데이터베이스의 크기로 국부적으로 정렬하였다. 각각의 펩타이드 길이에 대한 남아있는 상동성의 상부(예를 들면, 10번째 백분위수)는 iMAT 분자를 포함하는 모자이크-유사 또는 하이브리드 알레르겐의 작제를 위한 염기로서 수행되는데 특히 적합하다. 모자이크-유사 iMAT 분자를 작제하기 위해, 단백질 전구체를 (예를 들면 최상위 펩타이드에 상응하는 전구체 단백질의 열거로부터) 최상위 펩타이드를 내장시키기 위한 스캐폴드 단백질로서 선택한다. 신호 펩타이드 서열은 스캐폴드 단백질로부터 제거되고, 임의로 추가의 인접한 N- 또는 C-말단 아미노산을 갖는 최상위 펩타이드는 스캐폴드 단백질의 원래 서열 내에 삽입될 수 있거나, 스캐폴드 단백질의 원래 서열의 부분을 대체할 수 있다. 삽입 또는 대체를 위한 위치는 상응하는 전구체 단백질에서 유사한 정렬 또는 펩타이드의 참조 위치를 사용하여 결정한다. 다음 단계로서, His-태그, TAT 및 표적화 도메인을 부가한다. 최종적으로 시스테인 잔기는 상기 기술된 잔기를 가장 안정화시킴에 의해 대체된다.
특정 실시형태(하이브리드 1)에서, 이러한 생물정보학 조작 접근법은 서열번호 84(A1KXC1_DERFA DFP1 OS=더마토파고이데스 파리나), 서열번호 10(Q86R84_DERFA 60 kDa 알레르겐 Der f 18p OS=더마토파고이데스 파리나에 GN=Der f 18 PE=2 SV=1), 서열번호 85(A0A088SAS1_DERFA Der f 28 알레르겐 OS=더마토파고이데스 파리나에 PE=2 SV=1), 서열번호 88(A7XXV2_DERFA Der f 2 알레르겐 OS=더마토파고이데스 파리나에 PE=4 SV=1), 서열번호 86(B7U5T1_DERFA Der f 6 알레르겐 OS=더마토파고이데스 파리나에 PE=2 SV=1), 서열번호 87(T2B4F3_DERPT LytFM OS=더마토파고이데스 프테로니시누스 GN=lytFM PE=4 SV=1), 서열번호 11(Q9U6R7_DERFA 98kDa HDM 알레르겐 OS=더마토파고이데스 파리나에 PE=2 SV=1)의 조합이 진드기 종 더마토파고이데스 파리나에로부터 유도된 단백질에 의해 유발된 알레르기성 장애 아토피성 피부염과 관련되어 있음을 확인시켜준다. 또한, 생물정보학 분석은 시스테인이 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 안정한 iMAT 분자를 나타낸다. 이러한 안정한 모자이크-유사 iMAt 분자의 예로는 서열번호 75(개 하이브리드 1) 및 서열번호 66(고양이 하이브리드 1)이 있다.
실시예
7 -
고양이에서의
알레르기성 천식의 치료학적 백신/예방
본 발명에 따른 상이한 항원 모듈을 함유하는 단일 iMAT 분자 또는 iMAT 분자들의 조합은 알레르기성 천식을 앓고 있거나 알레르기성 천식의 위험이 있는 고양이의 예방학적 또는 치료학적 치료를 위해 사용할 수 있다. 고양이에서 본 발명에 따른 iMAT 분자는 실시예 3에 기술된 바와 같이 투여된다.
공지의 알레르기성 천식 병력을 갖는 성체 고양이, 즉 경련성 기침 에피소드, 천명 및 호흡 곤란과 같은 임상학적 징후를 나타내는 것으로 보고된 고양이가 본 연구에 포함될 것이다.
치료 개시 전에 그리고 예를 들면, 치료 동안/치료 2, 3 및 6개월 후에 기관지폐포 세척액(BALF)을 수집한다. BALF는 세포 검사 및 유핵 세포 계수에 사용된다.
고양이는 예를 들면, 정맥내로의 케타민 HCl을 이용하여 진정시킨다. 기관지폐포 세척액은 예를 들면, 기관내 튜브를 통해 7 Fr 폴리프로필렌 카테터를 온화하게 삽입함으로써 수집한다. 저항이 느껴지면, 최대 20ml 분획의 따뜻한 멸균 염수로 카테터를 통해 세척하고 수동 흡인으로 회수한다. 원심분리 및 재현탁 후, 수집된 BALF 세포의 스미어(smear) 세포검사를 준비하고, 상당수의 호산구의 존재가 고양이 천식의 진단을 지지한다. 분화 세포 수는 BAL 액에서 호산구의 비율(%)을 정량적으로 평가할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 소정 재조합 알레르겐을 사용하여 BAL 액 또는 혈청에서 진피내 유발 시험, 피부 자극(prick) 시험 또는 또한 알레르겐 특이적 IgE 및/또는 IgG 측정을 상기 고양이에서 모니터링할 수 있다(Norris et al., Vet Immunol Immunopathol. 2003, 96 (3-4): 119-127). 감소 된 반응 (즉시 및/또는 후기 반응성) 및/또는 항체 역가의 변화는 iMAT 분자 처리의 치료 및/또는 예방 효과를 나타낸다.
호흡 노력/난이도를 설명하기 위한 호흡률 및 스코어와 같은 임상학적 징후가 사용된다. 상기 "호흡 스코어링 시스템"은 또한 예를 들면, 에어로졸 챌린지에 대한 응답으로 사용될 수 있다. 간략하게, 밀봉된 챔버에서 깨어있는 자발적으로 호흡하는 고양이는 상이한 시간 길이 및/또는 에어로졸화된 재조합 알레르겐의 상이한 농도에 노출된다. 대안으로, 기도 과민-반응성의 정량적 측정이 마취된 고양이에서 수행될 수 있다. 호흡유량계(Pneumotachograph) 측정은 기저선 및 기관지 유발 프로토콜, 예를 들면, 메타콜린 및/또는 선택된 재조합 알레르겐에 대한 폐 내성의 용량 반응에서 수행할 수 있다.
따라서, 치료 기간에 걸쳐 그리고/또는 그 후에, 치료의 효능 또는 알레르기성 천식의 예방은 정량적, 반-정량적 또는 정성적 평가에 의해 임상학적으로 조사된다.
파라미터는 치료학적 개입 시작 전의 중증도와 개체 고양이에서 비교할 수 있다. 대안으로, 위약으로 치료되거나 치료되지 않은 알레르기성 천식을 갖는 고양이와의 비교는 iMAT 분자-매개된 치료의 효능 및/또는 고양이 알레르기성 천식의 임상학적 징후의 예방을 입증한다.
실시예
8 - 고양이 및/또는 개에서의 벼룩 알레르기의 치료학적 백신/예방
본 발명에 따른 상이한 항원 모듈을 함유하는 단일 iMAT 분자 또는 iMAT 분자들의 조합은 벼룩 아토피성 피부염을 앓고 있거나 벼룩 아토피성 피부염의 위험이 있는 고양이 및/또는 개의 예방학적 또는 치료학적 치료를 위해 사용할 수 있다.
제1 실시형태에서, 서열번호 42(고양이 Cte f 1)에 따른 iMAT 분자를 벼룩 아토피성 피부염을 앓고 있거나 이의 위험이 있는 고양이의 슬와 림프절에 투여한다.
제2 실시형태에서, 서열번호 63(개 Cte f 1)에 따른 iMAT 분자를 벼룩 아토피성 피부염을 앓고 있거나 이의 위험이 있는 개의 슬와 림프절에 투여한다.
추가의 치료 상세설명은 상기 실시예 3에 기술된 바와 같다.
상기 iMAT 치료의 효능은 Jin((Jin J et al., Vaccine 28 (2010) 1997-2004))에 의해 기술된 바와 같은 iMAT 치료의 전 및 후에 치료된 고양이 및/또는 개에서의 진피내 시험(IDT), T-세포 분석 및 벼룩 알레르겐 특이적 IgE 및 IgG의 측정에 의해 평가한다(Gerber ,J.D. Vaccine 1990-12- 8(6):536-542). 진피내 시험(IDT)는 문헌[Hillier and DeBoer, (DeBoer, D.J., Hillier, A. Veterinary Immunology and Immunopathology 2001, 81 (3-4), 271-276)]으로부터의 프로토콜에 따라 수행한다. 마지막 면역접종의 4주 후, 고양이 및/또는 개에게 고양이 및/또는 개의 피부 외측 흉부 피부에 벼룩 추출물 100㎍을 함유하는 100㎕ PBS를 피부내로 주사하고; 히스타민을 양성 대조군으로 사용하고, BSA를 무관한 자극제로서 사용하고, 염수를 음성 대조군으로서 사용한다. 피부의 반응성 수포(bleb)의 크기는 마커 펜으로 표시하고, 마이크로 미터에 의해 챌린지 후 20분 이내에 수직 및 수평으로 측정한다. 그 결과는 3개의 측정값의 평균으로서 계산된다. 감소 된 반응(즉시 및/또는 후기 반응성) 및/또는 항체 역가 또는 Th1 또는 Treg 왜곡된(skewed) T-세포 반응의 변화는 iMAT 분자 처리의 치료 및/또는 예방 효과를 나타낸다.
참조문헌
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Ser Glu Ile Ser Phe Leu Ser Asp Trp Phe His Lys Ile Arg Thr Arg
485 490 495
Phe Asn Ile Phe
500
<210> 13
<211> 176
<212> PRT
<213> Ctenocephalides felis
<400> 13
Met Asn Tyr Cys Phe Leu Val Phe Leu Val Tyr Leu Val Phe Ala Val
1 5 10 15
Asn Gly Glu Asp Ile Trp Lys Val Asn Lys Lys Cys Thr Ser Gly Gly
20 25 30
Lys Asn Gln Asp Arg Lys Leu Asp Gln Ile Ile Gln Lys Gly Gln Gln
35 40 45
Val Lys Ile Gln Asn Ile Cys Lys Leu Ile Arg Asp Lys Pro His Thr
50 55 60
Asn Gln Glu Lys Glu Lys Cys Met Lys Phe Cys Lys Lys Val Cys Lys
65 70 75 80
Gly Tyr Arg Gly Ala Cys Asp Gly Asn Ile Cys Tyr Cys Ser Arg Pro
85 90 95
Ser Asn Leu Gly Pro Asp Trp Lys Val Ser Lys Glu Cys Lys Asp Pro
100 105 110
Asn Asn Lys Asp Ser Arg Pro Thr Glu Ile Val Pro Tyr Arg Gln Gln
115 120 125
Leu Ala Ile Pro Asn Ile Cys Lys Leu Lys Asn Ser Glu Thr Asn Glu
130 135 140
Asp Ser Lys Cys Lys Lys His Cys Lys Glu Lys Cys Arg Gly Gly Asn
145 150 155 160
Asp Ala Gly Cys Asp Gly Asn Phe Cys Tyr Cys Arg Pro Lys Asn Lys
165 170 175
<210> 14
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from Q58A71 Der f 1 allergen preproenzyme
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
<400> 14
Thr Ser Ala Ile Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ile
20 25 30
Gly Ser Leu Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr
35 40 45
Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val
50 55 60
Asp Arg Ala Ser Gln His Gly Arg His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro
85 90 95
Tyr Val Ala Arg Glu Gln Gln Ser Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr
100 105 110
Gly Ile Ser Asn Tyr Ile Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile
115 120 125
Arg Glu Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly
130 135 140
Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile
145 150 155 160
Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val
165 170 175
Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser
180 185 190
Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala Gly
195 200 205
Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile Met
210 215 220
<210> 15
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from Q00855 Mite group 2 allergen Der f 2
(Allergen Der f II) (allergen Der f 2) Dermatophagoides farinae
(American house dust mite)
<400> 15
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Ser Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val
1 5 10 15
Met Val Asp Gly Ile His Gly Ser Asp Pro Leu Ile Ile His Arg Gly
20 25 30
Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys
35 40 45
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp
50 55 60
Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Ile His Phe Met Lys Leu Pro Leu
65 70 75 80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
85 90 95
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Ile Gly
100 105 110
Asp Asn Gly Val Leu Ala Leu Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile Arg
115 120 125
Asp
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<211> 70
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from A0A088SAW7 Der f 23 allergen Dermatophagoides
farinae (American house dust mite)
<400> 16
Asp Ile Asp His Asp Asp Asp Pro Thr Thr Met Ile Asp Val Gln Thr
1 5 10 15
Thr Thr Val Gln Pro Ser Asp Glu Phe Glu Leu Pro Thr Arg Phe Gly
20 25 30
Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro Leu Lys Phe Tyr Ile Ile Ser Asn
35 40 45
Trp Glu Ala Ile His Lys Ser Leu Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu
50 55 60
Lys Glu Leu Thr Ile Thr
65 70
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<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from Q86R84 60 kDa allergen Der f 18p
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
<400> 17
Ser Asn Ile Arg Pro Asn Val Ala Thr Leu Glu Pro Lys Thr Val Leu
1 5 10 15
Tyr Tyr Glu Ser Trp Val His Trp Arg Gln Gly Glu Gly Lys Met Asp
20 25 30
Pro Glu Asp Ile Asp Thr Ser Leu Met Thr His Ile Val Tyr Ser Tyr
35 40 45
Phe Gly Ile Asp Ala Ala Thr His Glu Ile Lys Leu Leu Asp Glu Tyr
50 55 60
Leu Met Lys Asp Leu His Asp Met Glu His Phe Thr Gln His Lys Gly
65 70 75 80
Asn Ala Lys Ala Met Ile Ala Val Gly Gly Ser Thr Met Ser Asp Gln
85 90 95
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Val Glu His Tyr Arg Glu Thr Phe Val Val
100 105 110
Ser Thr Val Asp Leu Met Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gly Val Met Ile
115 120 125
Asp Trp Ser Gly Met Gln Ala Lys Asp Ser Asp Asn Phe Ile Lys Leu
130 135 140
Leu Asp Lys Phe Asp Glu Lys Phe Ala His Thr Ser Phe Val Met Gly
145 150 155 160
Val Thr Leu Pro Ala Thr Ile Ala Ser Tyr Asp Asn Tyr Asn Ile Pro
165 170 175
Ala Ile Ser Asn Tyr Val Asp Phe Met Asn Val Leu Ser Leu Asp Tyr
180 185 190
Thr Gly Ser Trp Ala His Thr Val Gly His Ala Ser Pro Phe Pro Glu
195 200 205
Gln Leu Lys Thr Leu Glu Ala Tyr His Lys Arg Gly Ala Pro Arg His
210 215 220
Lys Met Val Met Ala Val Pro Phe Tyr Ala Arg Thr Trp Ile Leu Glu
225 230 235 240
Lys Met Asn Lys Gln Asp Ile Gly Asp Lys Ala Ser Gly Pro Gly Pro
245 250 255
Arg Gly Gln Phe Thr Gln Thr Asp Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Glu Leu
260 265 270
Ser Val Gln Ile Gln Ala Glu Thr Asn Ala Phe Thr Ile Thr Arg Asp
275 280 285
His Asp Asn Thr Ala Ile Tyr Ala Val Tyr Val His Ser Asn His Ala
290 295 300
Glu Trp Ile Ser Phe Glu Asp Arg His Thr Leu Gly Glu Lys Ala Lys
305 310 315 320
Asn Ile Thr Gln Gln Gly Tyr Ala Gly Met Ser Val Tyr Thr Leu Ser
325 330 335
Asn Glu Asp Val His Gly Val Arg Gly Asp Lys Asn Pro Leu Leu His
340 345 350
Ala Ile Gln Ser Asn Tyr Tyr His Gly Val Val Thr Glu Pro Thr Val
355 360 365
Val Thr Leu Pro Pro Val Thr His Thr Thr Glu His Val Thr Asp Ile
370 375 380
Pro Gly Val Phe His Leu His Glu Glu Gly Phe Phe Arg Asp Lys Thr
385 390 395 400
Tyr Ser Ala Thr Tyr Tyr Glu Ile Lys Lys Gly Asp Phe Gly Leu Glu
405 410 415
Lys Thr Val His His Leu Ala Asn His Leu Gln Ala Phe Asp Glu Val
420 425 430
Ser Arg Thr Arg Ile Asp His Thr Lys Ile Pro Gly Ser
435 440 445
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from Q9U6R7 98kDa HDM allergen (Der f 15 allergen)
(Group 15 allergen Der f 15) Dermatophagoides farinae (American
house dust mite)
<400> 18
Ser Ile Lys Arg Asp His Asn Asp Tyr Ser Lys Asn Pro Met Arg Ile
1 5 10 15
Val Leu Tyr Val Gly Thr Trp Ser Val Tyr His Lys Val Asp Pro Tyr
20 25 30
Thr Ile Glu Asp Ile Asp Pro Phe Lys Ser Thr His Leu Met Tyr Gly
35 40 45
Phe Ala Lys Ile Asp Glu Tyr Lys Tyr Thr Ile Gln Val Phe Asp Pro
50 55 60
Tyr Gln Asp Asp Asn His Asn Ser Trp Glu Lys Arg Gly Tyr Glu Arg
65 70 75 80
Phe Asn Asn Leu Arg Leu Lys Asn Pro Glu Leu Thr Thr Met Ile Ser
85 90 95
Leu Gly Gly Trp Tyr Glu Gly Ser Glu Lys Tyr Ser Asp Met Ala Ala
100 105 110
Asn Pro Thr Tyr Arg Gln Gln Phe Ile Gln Ser Val Leu Asp Phe Leu
115 120 125
Gln Glu Tyr Lys Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly
130 135 140
Ser Arg Leu Gly Asn Pro Lys Ile Asp Lys Gln Asn Tyr Leu Ala Leu
145 150 155 160
Val Arg Glu Leu Lys Asp Ala Phe Glu Pro His Gly Tyr Leu Leu Thr
165 170 175
Ala Ala Val Ser Pro Gly Lys Asp Lys Ile Asp Arg Ala Tyr Asp Ile
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Lys Glu Leu Asn Lys Leu Phe Asp Trp Met Asn Val Met Thr Tyr Asp
195 200 205
Tyr His Gly Gly Trp Glu Asn Phe Tyr Gly His Asn Ala Pro Leu Tyr
210 215 220
Lys Arg Pro Asp Glu Thr Asp Glu Leu His Thr Tyr Phe Asn Val Asn
225 230 235 240
Tyr Thr Met His Tyr Tyr Leu Asn Asn Gly Ala Thr Arg Asp Lys Leu
245 250 255
Val Met Gly Val Pro Phe Tyr Gly Arg Ala Trp Ser Ile Glu Asp Arg
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Leu Gly Asp Pro Ala Lys Gly Met Ser Pro Pro Gly
275 280 285
Phe Ile Ser Gly Glu Glu Gly Val Leu Ser Tyr Ile Glu Leu Ser Gln
290 295 300
Leu Phe Gln Lys Glu Glu Trp His Ile Gln Tyr Asp Glu Tyr Tyr Asn
305 310 315 320
Ala Pro Tyr Gly Tyr Asn Asp Lys Ile Trp Val Gly Tyr Asp Asp Leu
325 330 335
Ala Ser Ile Ser Ser Lys Leu Ala Phe Leu Lys Glu Leu Gly Val Ser
340 345 350
Gly Val Met Val Trp Ser Leu Glu Asn Asp Asp Phe Lys Gly His Leu
355 360 365
Gly Pro Lys Asn Pro Leu Leu Asn Lys Val His Asn Met Ile Asn Gly
370 375 380
Asp Glu Lys Asn Ser Phe Glu Ile Ile Leu Gly Pro Ser Thr Thr Thr
385 390 395 400
Pro Thr Pro Thr Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Thr Thr
405 410 415
Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr
420 425 430
Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr
435 440 445
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Ala Pro Thr Thr Ser Thr Pro Ser
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Pro Thr Thr Thr Glu His Thr Ser Glu Thr Pro Lys Tyr Thr Thr Tyr
465 470 475 480
Val Asp Gly His Leu Ile Lys Ser Tyr Lys Glu Gly Asp Ile Pro His
485 490 495
Pro Thr Asn Ile His Lys Tyr Leu Val Ile Glu Phe Val Asn Gly Gly
500 505 510
Trp Trp Val His Ile Met Pro Ser Pro Pro Gly Thr Ile Trp Ser Gln
515 520 525
Glu Lys Leu Thr Ser Ile Gly Glu
530 535
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<211> 478
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from I7HDR2 Zen 1 protein Dermatophagoides farinae
(American house dust mite)
<400> 19
Asn Pro Arg Phe Lys Arg Asp Asn Arg Asp Asp Val Leu Lys Gln Thr
1 5 10 15
Glu Glu Leu Ile Lys Ser Ala Gln Asp Val Leu Glu Lys Leu Pro Asp
20 25 30
Ser Asp Leu Lys Asp Glu Ile Ala Glu Lys Leu Ala Thr Met Lys His
35 40 45
Tyr Lys His Glu Leu Glu Asn Ala Lys Asn Pro Ile Lys Ile Ala His
50 55 60
Phe Glu Leu Glu Leu Leu Thr Met Phe Lys Lys Phe Gln Ser Leu Leu
65 70 75 80
Asn Glu Ala Asn Glu Ile Ile Lys Ser Leu Thr Thr Thr Thr Thr Glu
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100 105 110
Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Pro
115 120 125
Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro
130 135 140
Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro
145 150 155 160
Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr
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180 185 190
Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr Pro Glu
195 200 205
Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr
210 215 220
Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro
225 230 235 240
Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr Pro
245 250 255
Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Thr Lys Lys Pro Asn
260 265 270
Arg Asp Asp Val Leu Lys Gln Ala Glu Glu Leu Ile Lys Arg Ala Glu
275 280 285
Asp Val Phe Glu Lys Leu Pro Asp Ser Asp Leu Lys Asn Glu Ile Ala
290 295 300
Glu Lys Leu Ala Thr Met Lys Asn Tyr Lys His Glu Leu Glu Asn Ala
305 310 315 320
Lys Asn Pro Ile Lys Ile Ala His Leu Glu Ser Glu Leu Leu Thr Met
325 330 335
Phe Lys Met Phe Gln Ser Leu Leu Asn Glu Ala Asp Glu Ile Ile Arg
340 345 350
Ser Leu Thr Thr Thr Thr Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro
355 360 365
Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn
370 375 380
Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro
385 390 395 400
Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr
405 410 415
Thr Pro Glu Pro Thr Thr Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr
420 425 430
Leu Asn Ser Thr Thr Pro Glu Pro Thr Thr Ser Asn Ser Thr Thr Ser
435 440 445
Glu Pro Thr Asn Ser Ile Asn Arg Lys Thr Ser Glu Ile Ser Phe Leu
450 455 460
Ser Asp Trp Phe His Lys Ile Arg Thr Arg Phe Asn Ile Phe
465 470 475
<210> 20
<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from Q94424 Salivary antigen 1 (FS-I) (allergen
Cte f 1) Ctenocephalides felis (Cat flea)
<400> 20
Glu Asp Ile Trp Lys Val Asn Lys Lys Arg Thr Ser Gly Gly Lys Asn
1 5 10 15
Gln Asp Arg Lys Leu Asp Gln Ile Ile Gln Lys Gly Gln Gln Val Lys
20 25 30
Ile Gln Asn Ile Leu Lys Leu Ile Arg Asp Lys Pro His Thr Asn Gln
35 40 45
Glu Lys Glu Lys Leu Met Lys Phe Leu Lys Lys Val Leu Lys Gly Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
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Ile Pro Asn Ile Leu Lys Leu Lys Asn Ser Glu Thr Asn Glu Asp Ser
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Lys Leu Lys Lys His Met Lys Glu Lys Ser Arg Gly Gly Asn Asp Ala
130 135 140
Gly Ile Asp Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Arg Pro Lys Asn Lys
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from Hybrid1
<400> 21
Gln Ser His Gln Tyr Tyr His Thr Ser Gly Leu Arg Asn Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Tyr Tyr Arg Ser Gly Asn Ala Lys Ala Met Ile Ala Val Gly Gly
20 25 30
Ser Thr Met Ile Val Asp Gly Asp Lys Val Thr Ile Tyr Gly Trp Gly
35 40 45
Ser Gly Leu Gly Tyr Gly Leu Gly Tyr Gly Leu Gly Tyr Gly Gln Ala
50 55 60
Val Ala Leu Ala Pro Ala Gln Ala Val Gly Tyr Val Ala Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Val Ala Val Gln Ala Pro Ala Val Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Pro
85 90 95
Ala Val Gln Thr Val Ala Val Gln Ala Pro Ala Val Ser Tyr Ala Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Val Ala Val Gln Ala His Thr Ala Gln Val Ser Gly Pro
115 120 125
Ile His Ala Ala Ile Glu Ser Arg Arg Thr Val Glu Val Ile Asp Gly
130 135 140
Pro Ser Thr Gly Asp Ala Pro Val Ala Ser Thr Val Val Ile Gly Pro
145 150 155 160
Asn Val Gln Pro Ile Asn Leu Glu Phe Gln Thr Gln Ala Ser Pro Leu
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Ala Pro Thr Thr Ser Thr Pro Asp Leu Leu Arg Gln Asp Ile Val Lys
195 200 205
Pro Val Val Gln Asp Val His Glu Phe Leu Val Tyr Ile His Ile Ala
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Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val Gln Glu Ser Val His Gln Ile Leu Pro
225 230 235 240
Arg Gly Gln Met Met Lys Ile Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Gln His His
245 250 255
Pro Gln Arg Glu Glu Asn Ile Trp Ser Asp His Ile Ala Asn Val Ala
260 265 270
Gln Ala Ala Pro Ala Ile Ser Ala Val Arg Val Ala Ala Ala Pro Ala
275 280 285
Val Ala Tyr Ala Ala Pro Ala Val Ser Thr Val Ser Ala Ala Pro Ala
290 295 300
Ala Ile Gly Val Ile Gly Val Gln Pro Val Ala Gly Tyr Ile Gly Tyr
305 310 315 320
Gly Ala Gly Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Val Ala Lys
325 330 335
Tyr Gly Thr Gly Tyr Gly Leu Thr Ser Gly Leu Ile Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Tyr Gly Ser Ser Tyr Ser Val Gln Pro Ala Ser Tyr Gly Thr Gly Tyr
355 360 365
Gly Tyr Thr Thr Tyr Ser Ser Asp Ala Tyr Pro Ile Arg Lys Lys
370 375 380
<210> 22
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from Hybrid2
<400> 22
Thr Ser Ala Ser Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr
35 40 45
Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val
50 55 60
Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro
85 90 95
Tyr Val Ala Arg Glu Gln Gln Ser Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr
100 105 110
Gly Ile Ser Asn Tyr Ser Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile
115 120 125
Arg Glu Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly
130 135 140
Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile
145 150 155 160
Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val
165 170 175
Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser
180 185 190
Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala Gly
195 200 205
Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile Met Phe
210 215 220
Thr Gln Thr Asp Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Glu Leu Ser Val Gln Ile
225 230 235 240
Gln Ala Glu Thr Asn Ala Phe Thr Ile Thr Arg Glu Pro Thr Thr Pro
245 250 255
Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro
260 265 270
Glu Pro Ser Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro
275 280 285
Thr Thr Lys Asp Ile Asp His Asp Asp Asp Pro Thr Thr Met Ile Asp
290 295 300
Val Gln Thr Thr Thr Val Gln Pro Ser Asp Glu Phe Glu Ser Pro Thr
305 310 315 320
Arg Phe Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro Ile Lys Phe Tyr Ile
325 330 335
Ser Ser Asn Trp Glu Ala Ile His Lys Ser Ser Pro Gly Asn Thr Arg
340 345 350
Trp Asn Glu Lys Glu Leu Thr Ser Thr Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr
355 360 365
Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro
370 375 380
Thr Thr Thr Pro Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Leu Ala Asn Asn Glu
385 390 395 400
Ile Lys Lys Val Met Val Asp Gly Ile His Gly Ser Asp Pro Ser Ile
405 410 415
Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn
420 425 430
Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly
435 440 445
Leu Glu Ile Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Leu His Phe Met
450 455 460
Lys Ile Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp
465 470 475 480
Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val
485 490 495
Lys Leu Ile Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Ser Ala Ile Ala Thr His
500 505 510
Gly Lys Ile Arg Asp
515
<210> 23
<211> 407
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_Allergen from Hybrid3
<400> 23
Thr Ser Ala Ser Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Ser Leu Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr
35 40 45
Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val
50 55 60
Asp Ile Ala Ser Gln His Gly Leu His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro
85 90 95
Tyr Val Ala Arg Glu Gln Gln Ser Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr
100 105 110
Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile
115 120 125
Arg Glu Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly
130 135 140
Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile
145 150 155 160
Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val
165 170 175
Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser
180 185 190
Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala Gly
195 200 205
Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile Met Phe
210 215 220
Thr Gln Thr Asp Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Glu Leu Ser Val Gln Ile
225 230 235 240
Gln Ala Glu Thr Asn Ala Phe Thr Ile Thr Arg Ser Pro Thr Thr Pro
245 250 255
Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr
260 265 270
Thr Pro Thr Thr Thr Pro Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Ser Ala Asn
275 280 285
Asn Glu Ile Lys Lys Val Met Val Asp Gly Ile His Gly Ser Asp Pro
290 295 300
Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp
305 310 315 320
Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu
325 330 335
Asp Gly Leu Glu Ile Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Ser His
340 345 350
Phe Met Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr
355 360 365
Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val
370 375 380
Thr Val Lys Leu Ile Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Ser Ala Ile Ala
385 390 395 400
Thr His Gly Lys Ile Arg Asp
405
<210> 24
<211> 351
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_NTERM Cat from Q58A71 Der f 1 allergen preproenzyme
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
<400> 24
Met His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg
1 5 10 15
Arg Arg Met Glu Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu
20 25 30
Pro Ile Leu Gly Gln Arg Pro Ala Ala Pro Glu Ser Lys Ser Ser Arg
35 40 45
Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala
50 55 60
Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu
65 70 75 80
Asp Lys Leu Thr Val Thr Ala Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg
85 90 95
Met Lys Leu Pro Lys Pro Ala Lys Pro Leu Asn Lys Leu Arg Val Ala
100 105 110
Thr Pro Met Leu Met Gln Thr Met Pro Val Arg Gly Leu Leu Gln Ala
115 120 125
Thr Ser Ala Ile Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp
130 135 140
Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ile
145 150 155 160
Gly Ser Leu Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr
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Asp Arg Ala Ser Gln His Gly Arg His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly
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Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro
210 215 220
Tyr Val Ala Arg Glu Gln Gln Ser Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Ser Asn Tyr Ile Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile
245 250 255
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260 265 270
Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile
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Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val
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Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile Met
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Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
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Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gly Gln Arg
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr
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165 170 175
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Gly Arg His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Gln
195 200 205
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210 215 220
Gln Ser Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn Tyr Ile
225 230 235 240
Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile Arg Glu Ala Leu Thr Gln
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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<223> IMAT_PURE Cat from Q58A71 Der f 1 allergen preproenzyme
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
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50 55 60
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65 70 75 80
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Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile Met
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(Allergen Der f II) (allergen Der f 2) Dermatophagoides farinae
(American house dust mite)
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245 250 255
Asp
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_CTERM Cat from Q00855 Mite group 2 allergen Der f 2
(Allergen Der f II) (allergen Der f 2) Dermatophagoides farinae
(American house dust mite)
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Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Asp Gln
1 5 10 15
Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gly Gln Arg
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Pro Ala Ala Pro Glu Ser Lys Ser Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly
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His
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_PURE Cat from Q00855 Mite group 2 allergen Der f 2 (Allergen
Der f II) (allergen Der f 2) Dermatophagoides farinae (American
house dust mite)
<400> 29
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Asp Gln Arg
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Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gly Gln Arg Pro
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Ala Ala Pro Glu Ser Lys Ser Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe
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130 135 140
Ser Asp Pro Leu Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala
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Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile Arg Asp
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_NTERM Cat from A0A088SAW7 Der f 23 allergen Dermatophagoides
farinae (American house dust mite)
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Met His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg
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<223> IMAT_CTERM Cat from A0A088SAW7 Der f 23 allergen Dermatophagoides
farinae (American house dust mite)
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Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Asp Gln
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Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gly Gln Arg
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Pro Ala Ala Pro Glu Ser Lys Glu Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly
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<223> IMAT_PURE Cat from A0A088SAW7 Der f 23 allergen Dermatophagoides
farinae (American house dust mite)
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<223> IMAT_NTERM Cat from Q86R84 60 kDa allergen Der f 18p
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
<400> 33
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Pro Ile Leu Gly Gln Arg Pro Ala Ala Pro Glu Ser Lys Ser Ser Arg
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Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu
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245 250 255
Asp Trp Ser Gly Met Gln Ala Lys Asp Ser Asp Asn Phe Ile Lys Leu
260 265 270
Leu Asp Lys Phe Asp Glu Lys Phe Ala His Thr Ser Phe Val Met Gly
275 280 285
Val Thr Leu Pro Ala Thr Ile Ala Ser Tyr Asp Asn Tyr Asn Ile Pro
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Ala Ile Ser Asn Tyr Val Asp Phe Met Asn Val Leu Ser Leu Asp Tyr
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485 490 495
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500 505 510
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<211> 573
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_CTERM Cat from Q86R84 60 kDa allergen Der f 18p
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
<400> 34
Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Asp Gln
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Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gly Gln Arg
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Pro Ala Ala Pro Glu Ser Lys Ser Ser Arg Gly Ala Leu Tyr Thr Gly
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gly Val Met Ile Asp Trp Ser Gly Met Gln
245 250 255
Ala Lys Asp Ser Asp Asn Phe Ile Lys Leu Leu Asp Lys Phe Asp Glu
260 265 270
Lys Phe Ala His Thr Ser Phe Val Met Gly Val Thr Leu Pro Ala Thr
275 280 285
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<223> IMAT_PURE Cat from Q86R84 60 kDa allergen Der f 18p
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
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(American house dust mite)
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<223> IMAT_CTERM Cat from Q94424 Salivary antigen 1 (FS-I) (allergen
Cte f 1) Ctenocephalides felis (Cat flea)
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_PURE Cat from Q94424 Salivary antigen 1 (FS-I) (allergen Cte
f 1) Ctenocephalides felis (Cat flea)
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Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Asp Gln Arg
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<213> Artificial sequence
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<223> IMAT_NTERM Dog from Q58A71 Der f 1 allergen preproenzyme
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
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<223> IMAT_CTERM Dog from Q58A71 Der f 1 allergen preproenzyme
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
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340 345 350
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_PURE Dog from Q58A71 Der f 1 allergen preproenzyme
Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
<400> 47
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<223> IMAT_NTERM Dog from Q00855 Mite group 2 allergen Der f 2
(Allergen Der f II) (allergen Der f 2) Dermatophagoides farinae
(American house dust mite)
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_CTERM Dog from Q00855 Mite group 2 allergen Der f 2
(Allergen Der f II) (allergen Der f 2) Dermatophagoides farinae
(American house dust mite)
<400> 49
Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Asp Gln
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<220>
<223> IMAT_PURE Dog from Q00855 Mite group 2 allergen Der f 2 (Allergen
Der f II) (allergen Der f 2) Dermatophagoides farinae (American
house dust mite)
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Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile Leu Gly Gln Arg Pro
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> IMAT_NTERM Dog from A0A088SAW7 Der f 23 allergen Dermatophagoides
farinae (American house dust mite)
<400> 51
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<223> IMAT_CTERM Dog from A0A088SAW7 Der f 23 allergen Dermatophagoides
farinae (American house dust mite)
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farinae (American house dust mite)
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Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
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Dermatophagoides farinae (American house dust mite)
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(Group 15 allergen Der f 15) Dermatophagoides farinae (American
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Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile Arg Asp
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> iMAT-Cul o2 relates to a Cul o2 iMAT molecule [with n-terminal
HEXA-HISTIDINE]:
<400> 89
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Thr Pro Met Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly
115 120 125
Gln His Leu Ile Gln Ala Glu Leu Pro Asp Ser Pro Leu Asn Ile Val
130 135 140
Lys Glu Phe Asp Asp Asp Gly Arg Asn Asn Asn Asn Gln Asn Asp Phe
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Trp Asn Ile Pro Ser Phe Met Ser Ala Gln His Asn Ile
165 170 175
Thr Phe Thr Asp Met Thr Ser Ser Tyr Asn Ile Val Gln Asn Lys Asp
180 185 190
Asp Lys Trp Arg Gly Asp Lys Ile Val Ile Leu Tyr Asp Pro Gly Lys
195 200 205
Phe Pro Ala Leu Leu Glu His Gln Gly Gln Leu Tyr Arg Arg Asn Gly
210 215 220
Gly Val Pro Gln Glu Gly Asn Leu Gln Glu His Ile Asp Ile Leu Ala
225 230 235 240
Glu His Ile Asn Lys Leu Ile Pro Asp Thr Gln Phe Ser Gly Ile Gly
245 250 255
Val Ile Asp Phe Glu Ser Trp Arg Pro Ile Phe Arg Gln Asn Ser Gly
260 265 270
Val Leu Gln Pro Tyr Lys Asp Leu Ser Tyr Lys Leu Val His Arg Asp
275 280 285
His Lys Leu Trp Asn Arg Lys Arg Val Glu Ile Glu Ala Ala Arg Leu
290 295 300
Phe Glu Ala Ala Gly Arg Thr Phe Val Glu Glu Thr Ile Asn Val Ala
305 310 315 320
Lys Ile Leu Arg Pro Lys Ala Lys Trp Gly Tyr Tyr Gly Phe Pro Tyr
325 330 335
Ser Phe Asn Met Asn Gly Gly Ala Asn Met Asn Glu Asp Ser Pro Ala
340 345 350
Asn Val Lys Glu Glu Asn Asp Gln Ile Lys Trp Leu Trp Asp Ile Val
355 360 365
Asp Val Val Leu Pro Ser Val Tyr Leu Asn Asn Lys Ile Thr Ser Ala
370 375 380
Gln Arg Val Gln Phe Val Arg Gly Arg Met Arg Glu Gly Tyr Arg Val
385 390 395 400
Ala Lys Met Ser Lys Lys Ser Pro Lys Pro Pro Val Leu Ala Tyr Leu
405 410 415
Arg Tyr Val Tyr Thr Asp Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asn Glu Asp Leu
420 425 430
Lys Gln Ala Ile Lys Val Ser Lys Glu Gln Lys Ser Lys Gly Met Ile
435 440 445
Phe Trp Gly Ser Ser Tyr Asp Val Lys Thr Lys Glu Gln Ser Ile Asp
450 455 460
Phe Arg Lys Tyr Val Asp Asn Asn Leu Gly Pro Ile Val Leu Leu Ala
465 470 475 480
Asn Asn Lys Ser Pro Lys Val Leu Thr Pro Asn Leu Ala
485 490
<210> 90
<211> 372
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> iMAT-Cul o3 relates to a Cul o3 iMAT molecule [with n-terminal
HEXA-HISTIDINE]:
<400> 90
Met His His His His His His Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg
1 5 10 15
Arg Arg Met Glu Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Val
20 25 30
Pro Ile Leu Gly Gln Arg Pro Ala Ala Pro Glu Arg Lys Ser Ser Arg
35 40 45
Gly Ala Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala
50 55 60
Gly Gln Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Phe Gln Gln Gln Gly Arg Leu
65 70 75 80
Asp Lys Leu Thr Val Thr Ala Gln Asn Leu Gln Leu Glu Lys Leu Arg
85 90 95
Met Lys Leu Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Lys Ile Arg Val Ala
100 105 110
Thr Pro Met Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Glu Gly Leu Ser His Gly
115 120 125
Thr Asp Phe Ser Asp Arg Lys Leu Ser Arg Arg Gln Ile Glu Pro Asn
130 135 140
Val Tyr Gln Asn Ile Pro His Ile Gly Ser Asn His Asp Gly Arg Asn
145 150 155 160
Ser Pro Ala Ser Pro Ser Asp Ala Lys Ile Leu Pro Met Ser Thr Lys
165 170 175
Arg Lys Asn Leu Ile Leu Arg Val His Asn Arg Leu Arg Asn Lys Val
180 185 190
Ala Leu Gly Gln Leu Pro Gly Tyr Pro Lys Ala Val Arg Met Pro Ile
195 200 205
Leu Arg Trp Asp Asp Glu Leu Ala Tyr Leu Ala Glu Leu Asn Val Lys
210 215 220
Gln Ser Glu Met Lys His Asp Gln Ser Arg Asn Thr Asp Lys Phe Arg
225 230 235 240
Tyr Ala Gly Gln Asn Leu Ala Tyr Ile Gly Gly Gly Lys Glu Pro Asn
245 250 255
Ala Val Arg Ile Lys Thr Leu Val Arg Ala Trp Phe Asp Glu Tyr Lys
260 265 270
Asp Ala Asn Ser Ser Phe Ile Asp Lys Tyr Arg Ser His Pro Asn Gly
275 280 285
Lys Ala Ile Gly His Phe Thr Ala Met Val Gln Asp Arg Thr Asp Thr
290 295 300
Val Gly Ile Ala Ile Leu Arg His Thr Lys Asn Thr Tyr Phe Phe Leu
305 310 315 320
Ala Ile Asn Tyr Ser Phe Thr Asn Met Val Lys Asp Lys Val Tyr Thr
325 330 335
Arg Gly Ala Lys Ser Ser Ser Lys Ser Arg Thr Gly Ser Ser Pro Val
340 345 350
Tyr Lys Gly Leu Ser Lys Pro His Glu Tyr Val Asn Pro Asp Pro Asp
355 360 365
Glu Asp Leu Asp
370
<210> 91
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO: 10 (Q86R84_AA 97-110)
i.e.:
<400> 91
Gly Asn Ala Lys Ala Met Ile Ala Val Gly Gly Ser Thr Met
1 5 10
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO: 85 (A0A088SAS1_AA
611-624) i.e.:
<400> 92
Met Met Lys Ile Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Gln His His Pro
1 5 10
<210> 93
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO: 88 (A7XXV2) AA 48-61)
i.e.:
<400> 93
Phe Leu Val Tyr Ile His Ile Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys
1 5 10
<210> 94
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO: 86 (B7U5T1_AA 166-178)
i.e.:
<400> 94
Ile Val Asp Gly Asp Lys Val Thr Ile Tyr Gly Trp Gly
1 5 10
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID 87: (T2B4F3_AA 134-147)
i.e.:
<400> 95
Arg Glu Glu Asn Ile Trp Ser Asp His Ile Ala Asn Val Ala
1 5 10
<210> 96
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO: 11 (Q9U6R7_AA 469-482)
i.e.:
<400> 96
Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Ala Pro Thr Thr Ser Thr Pro
1 5 10
<210> 97
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO 7 (Q58A71 Der f 1
allergen preproenzyme Dermatophagoides farinae (American house
dust mite) AA 99-321) i.e.:
<400> 97
Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys
20 25 30
Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr
35 40 45
Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val
50 55 60
Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ile Glu Tyr Ile Gln Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro
85 90 95
Tyr Val Ala Arg Glu Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr
100 105 110
Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asp Val Lys Gln Ile
115 120 125
Arg Glu Ala Leu Thr Gln Thr His Thr Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly
130 135 140
Ile Lys Asp Leu Arg Ala Phe Gln His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile
145 150 155 160
Gln His Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val
165 170 175
Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser
180 185 190
Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln Ala Gly
195 200 205
Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile Met
210 215 220
<210> 98
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO 10 (Q86R84 60 kDa
allergen Der f 18p Dermatophagoides farinae (American house dust
mite) AA 277-304) i.e.:
<400> 98
Phe Thr Gln Thr Asp Gly Phe Leu Ser Tyr Asn Glu Leu Cys Val Gln
1 5 10 15
Ile Gln Ala Glu Thr Asn Ala Phe Thr Ile Thr Arg
20 25
<210> 99
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO 12 (I7HDR2 Zen 1
protein Dermatophagoides farinae (American house dust mite) AA
181-220) i.e.:
<400> 99
Glu Pro Thr Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro
1 5 10 15
Thr Thr Lys Thr Pro Glu Pro Ser Thr Pro Thr Pro Glu Pro Thr Thr
20 25 30
Lys Thr Pro Glu Pro Thr Thr Lys
35 40
<210> 100
<211> 70
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO 9 (A0A088SAW7 Der f 23
allergen Dermatophagoides farinae (American house dust mite) AA
22-91) i.e.:
<400> 100
Asp Ile Asp His Asp Asp Asp Pro Thr Thr Met Ile Asp Val Gln Thr
1 5 10 15
Thr Thr Val Gln Pro Ser Asp Glu Phe Glu Cys Pro Thr Arg Phe Gly
20 25 30
Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro Cys Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn
35 40 45
Trp Glu Ala Ile His Lys Ser Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu
50 55 60
Lys Glu Leu Thr Cys Thr
65 70
<210> 101
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO 11 (Q9U6R7 98kDa HDM
allergen (Der f 15 allergen) (Group 15 allergen Der f 15)
Dermatophagoides farinae (American house dust mite) AA 437-463)
i.e.:
<400> 101
Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr
1 5 10 15
Thr Pro Ser Pro Thr Thr Pro Thr Thr Thr Pro
20 25
<210> 102
<211> 129
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> artificial peptide derived from SEQ ID NO 8 (Q00855 Mite group 2
allergen Der f 2 (Allergen Der f II) (allergen Der f 2)
Dermatophagoides farinae (American house dust mite) AA 18-146)
i.e.:
<400> 102
Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn Asn Glu Ile Lys Lys Val
1 5 10 15
Met Val Asp Gly Cys His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly
20 25 30
Lys Pro Phe Thr Leu Glu Ala Leu Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys
35 40 45
Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Leu Asp Gly Leu Glu Ile Asp
50 55 60
Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Phe Met Lys Cys Pro Leu
65 70 75 80
Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys
85 90 95
Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Leu Ile Gly
100 105 110
Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Gly Lys Ile Arg
115 120 125
Asp
Claims (28)
- 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 알레르기의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 그리고/또는 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 예방 및/또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 그리고/또는 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 전염의 예방 방법에서 사용하기 위한, 그리고/또는 매개체에 의한 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 전염의 예방 방법에서 사용하기 위한,
(i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌(translocation)를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈,
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈, 및
(iii) 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하는, 개선된 MAT(iMAT) 분자로서,
적어도 항원 모듈(들)에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 개선된 MAT(iMAT) 분자. - 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 모듈에서, 모든 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되고, 여기서, 바람직하게는 전체 iMAT 분자에서, 모든 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는, iMAT 분자.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 모듈의 전부가 서로에 대해 공유결합적으로 링크되고, 여기서 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 추가의 스페이서(spacer) 모듈(들)이 전혀 존재하지 않는, iMAT 분자.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제2 모듈이 개, 고양이, 소, 양, 염소 또는 돼지 종으로부터 선택되는 불변 쇄 또는 이의 부분 서열을 포함하고, 단, 이러한 적어도 하나의 제2 모듈이 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 모듈로서 기능성인, iMAT 분자.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제2 모듈이 서열번호 4(개) 또는 서열번호 5(고양이)의 아미노산 서열 또는 이들의 단편 중 하나 이상을 포함하거나, 바람직하게는 이들 아미노산 서열 중 하나 이상으로 이루어지고, 단, 이러한 단편들은 이들의 세포내 수송 기능을 유지하는, iMAT 분자.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 모듈이 말을 제외한 동물에서 알레르기를 유발하는 적어도 하나의 알레르겐으로부터 유도된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프, 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 벼룩 물림에 대한 알레르기; 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 소정 음식 구성성분에 대한 알레르기; 바람직하게는 개 및/또는 고양이에서의 아토피성 피부염; 바람직하게는 고양이에서의 알레르기성 기도 염증 및/또는 폐쇄로부터 유도된 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하는, iMAT 분자.
- 제6항에 있어서, 이러한 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐이 Der f 15 알레르겐(서열번호 11 및/또는 서열번호 18)인, iMAT 분자.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항원 모듈이 말을 제외한 동물에서 하나 이상의 감염성 질환을 유발하는 병원체의 적어도 하나의 항원으로부터 유도된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프, 바람직하게는 캄필로박터, 디로필라리아, 에를리히아, 레이슈마니아, 트립파노소마, 보렐리아, 오르토부니아바이러스, 오르비바이러스, 플라비바이러스, 로타바이러스, 코로나바이러스, 트리코파이톤, 마이크로스포룸, 쿠페리아, 하에몬쿠스, 오스테르타 기아, 트리코스트론길루스, 딕티오카울루스, 메타스트론길루스; 에이메리아, 이소 스포라, 크 립토스포리디움, 기아르디아 속으로부터 선택되는 말을 제외한 동물에서 하나 이상의 감염성 질환을 유발하는 병원체의 적어도 하나의 항원으로부터 유도된 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프를 포함하고, 여기서, 바람직하게는 상기 적어도 하나의 항원 모듈은 또한 말을 제외한 동물에서의 하나 이상의 감염성 질환의 전염에 관여하는 매개체, 바람직하게는 흡혈 곤충, 파리, 각다귀, 진드기 및/또는 모기로부터 선택되는 매개체의 항원일 수 있는, iMAT 분자.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 태그 모듈, 바람직하게는 적어도 하나의 His-태그를 추가로 포함하고, 여기서 이러한 적어도 하나의 태그 모듈은 N-말단에 그리고/또는 C-말단에 존재하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 하나의 태그 모듈, 바람직하게는 하나의 His-태그가 하나의 메티오닌 잔기 후에 N-말단에 존재하는, iMAT 분자.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 모듈이 HIV-tat, VP22 및/또는 안테나페디아(Antennapedia)의 아미노산 서열 또는 이의 부분 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이들로 이루어지고, 단, 상기 적어도 하나의 제1 모듈이 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 위한 모듈로서 기능성이고, 가장 바람직하게는 이러한 적어도 하나의 제1 모듈이 서열번호 1을 포함하거나, 바람직하게는 서열번호 1로 이루어지는, iMAT 분자.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 모듈이 서열번호 14 내지 서열번호 23 중 어느 하나를 포함하거나, 바람직하게는 이들 중 어느 하나로 이루어지는, iMAT 분자.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 24 내지 서열번호 83 중 어느 하나를 포함하거나, 바람직하게는 이들 중 어느 하나로 이루어지는, iMAT 분자.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 보스(Bos), 카프라(Capra) 및/또는 오비스(Ovis) 속의 구성원과 같은 소, 염소, 양을 포함하는 반추동물, 캐니스(Canis) 속의 구성원, 예를 들면 개, 늑대, 여우, 코요테, 재칼, 펠리스(Felis) 속의 구성원, 예를 들면 사자, 호랑이, 집 고양이, 야생 고양이, 기타 대형 고양이과 동물, 및 치타 및 스라소니를 포함하는 기타 고양이과 동물, 및/또는 수스(Sus) 속의 구성원, 예를 들면, 돼지로부터 선택되고, 여기서 바람직하게는 상기 동물은 고양이 및/또는 개로부터 선택되는, iMAT 분자.
- (i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈(바람직하게는 상기 제1 모듈은 서열번호 1을 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진다),
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈(바람직하게는 상기 제2 모듈은 서열번호 4 또는 서열번호 5를 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진다) 및
(iii) 적어도 하나의 항원, 바람직하게는 적어도 하나의 알레르겐의 적어도 하나의 전체 또는 부분 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하고,
상기 적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환됨으로써 바람직하게는 상기 제3 모듈이 서열번호 14 내지 서열번호 23 중 어느 하나를 포함하거나, 이들 중 어느 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자. - 제14항에 있어서, 상기 제2 모듈이 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진, 아미노산 서열/iMAT 분자.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 제3 모듈이 서열번호 14 내지 서열번호 23 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 18로 이루어진, 아미노산 서열/iMAT 분자.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모듈의 전부가 서로에 대해 공유결합적으로 링크되고, 여기서 상기 제1, 제2 및/또는 제3 모듈 중 2개 이상의 인접한 모듈 사이에 추가의 스페이서(spacer) 모듈(들)이 전혀 존재하지 않는, 아미노산 서열/iMAT 분자.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 태그 모듈, 바람직하게는 적어도 하나의 His-태그를 추가로 포함하고, 여기서 이러한 적어도 하나의 태그 모듈은 N-말단에 그리고/또는 C-말단에 존재하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 하나의 태그 모듈, 바람직하게는 하나의 His-태그가 하나의 메티오닌 잔기 후에 N-말단에 존재하는, 아미노산 서열/iMAT 분자.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열/iMAT분자가 서열번호 24 내지 서열번호 83 중 어느 하나를 포함하거나, 바람직하게는 이들 중 어느 하나로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열/iMAT 분자가 서열번호 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81 중 어느 하나를 포함하거나, 바람직하게는 이들 중 어느 하나로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열/iMAT 분자가 서열번호 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82 중 어느 하나를 포함하거나, 바람직하게는 이들 중 어느 하나로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열/iMAT 분자가 서열번호 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83 중 어느 하나를 포함하거나, 바람직하게는 이들 중 어느 하나로 이루어지거나, 또는 상기 아미노산 서열/iMAT 분자가 서열번호 36(Der f15 iMAT 분자 고양이), 서열번호 37(Der f15 iMAT 분자 고양이), 서열번호 38(Der f15 iMAT분자 고양이), 또는 서열번호 57(Der f15 iMAT 분자 개), 서열번호 58(Der f15 iMAT 분자 개), 서열번호 59(Der f15 iMAT 분자 개)를 포함하거나, 바람직하게는 이들로 이루어지는, 아미노산 서열/iMAT 분자.
- 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열/iMAT 분자가 서열번호 66 내지 서열번호 83(하이브리드/모자이크-유사 iMAT) 중 어느 하나를 포함하거나, 바람직하게는 이들 중 어느 하나로 이루어지거나, 또는 바람직하게는 상기 아미노산 서열/iMAT 분자가 서열번호 66, 69, 72, 75, 78, 81 중 어느 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 66 또는 서열번호 75, 또는 서열번호 67, 70, 73, 76, 79, 82 중 어느 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 67 또는 서열번호 76, 또는 서열번호 68, 71, 74, 77, 80, 83 중 어느 하나, 보다 바람직하게는 서열번호 68 또는 서열번호 77을 포함하거나, 바람직하게는 이들 중 어느 하나로 이루어지는, 아미노산 서열/iMAT 분자.
- (i) 세포외 공간으로부터 세포의 내부로의 iMAT 분자의 전좌를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제1 모듈(바람직하게는 상기 제1 모듈은 서열번호 1을 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진다),
(ii) 항원의 처리 및/또는 항원, 바람직하게는 처리된 항원으로의 MHC 분자의 적재에 관여하는 세포 소기관으로의 상기 iMAT 분자의 종-특이적 세포내 표적화를 가능하게 하는 아미노산 서열인 적어도 하나의 제2 모듈(바람직하게는 상기 제2 모듈은 서열번호 4 또는 서열번호 5를 포함하거나, 보다 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 5로 이루어진다) 및
(iii) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 84, 85, 86, 87, 및 88로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 항원의 임의의 조합의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열인 항원 모듈로서, 상기 iMAT 분자에 의해 조절되는 면역 반응의 특이성을 결정하는 적어도 하나의 제3 모듈을 포함하고,
적어도 항원 모듈에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 바람직하게는 세린, 류신, 이소류신, 아르기닌, 메티오닌, 및/또는 아스파르트산으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자. - 제21항에 있어서, 상기 항원 모듈이 서열번호 10, 11, 84, 85, 86, 87, 및 88(하이브리드 1)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 항원의 임의의 조합의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프로부터 유도된 아미노산 서열이거나, 또는 상기 항원 모듈이 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12(하이브리드 2)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 항원의 임의의 조합의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토피 서열로부터 유도된 아미노산 서열이거나, 또는 상기 항원 모듈이 서열번호 7, 8, 10 및 11(하이브리드 3)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 항원의 임의의 조합의 적어도 하나의 전체 또는 부분 아미노산 서열, 바람직하게는 에피토프 서열로부터 유도된 아미노산 서열인, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자.
- 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 항원 모듈이 서열번호 91 내지 서열번호 96에 따른 펩타이드들 중 하나 이상의 임의의 조합을 포함하는 서열번호 84로부터 유도된 백본 서열에 내장된 상기 백본에 기초한 아미노산 서열이거나, 또는 상기 항원 모듈이 서열번호 97 내지 서열번호 102에 따른 펩타이드들 중 2개 이상의 임의의 조합으로부터 유도된 아미노산 서열이거나, 또는 상기 항원 모듈이 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 101 및 서열번호 102에 따른 펩타이드들 중 2개 이상의 임의의 조합으로부터 유도된 아미노산 서열인, 아미노산 서열/개선된 MAT(iMAT) 분자.
- 서열번호 24 내지 서열번호 83 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 36(Der f15 iMAT 분자 고양이), 서열번호 37(Der f15 iMAT 분자 고양이), 서열번호 38(Der f15 iMAT 분자 고양이), 서열번호 57(Der f15 iMAT 분자 개), 서열번호 58(Der f15 iMAT 분자 개), 서열번호 59(Der f15 iMAT 분자 개), 서열번호 66(하이브리드 1 iMAT 고양이), 서열번호 67(하이브리드 1 iMAT 고양이), 서열번호 68(하이브리드 1 iMAT 고양이), 서열번호 75(하이브리드 1 iMAT 개), 서열번호 76(하이브리드 1 iMAT 개) 및/또는 서열번호 77(하이브리드 1 iMAT 개)을 포함하거나, 바람직하게는 이들로 이루어지는, 아미노산 서열.
- 제14항 또는 제24항에 따른 iMAT 분자 또는 아미노산 서열을 포함하는, 백신 또는 면역학적 조성물 또는 약제학적 조성물.
- 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 iMAT 분자 또는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산.
- 제26항에 따른 적어도 하나의 핵산을 포함하는 벡터.
- 제26항에 따른 적어도 하나의 핵산 및/또는 제27항에 따른 적어도 하나의 벡터를 포함하는 1차 세포 또는 세포주.
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