EA041116B1 - Улучшенные транспортные молекулы модулярного антигена и их применение у животных - Google Patents

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к (изолированным) рекомбинантным белкам, которые также называются улучшенными MAT (iMAT) молекулами, включающим по меньшей мере один транслокационный модуль, по меньшей мере один нацеливающий модуль и по меньшей мере один антигенный модуль, где по меньшей мере один остаток цистеина является замещенным с помощью другого аминокислотного остатка. Молекулы iMAT могут быть получены с помощью существенно сниженных производственных усилий и являются специфическими для вида, безопасными и иммунологически весьма эффективными. Такие (изолированные) рекомбинантные белки являются полезными, в частности, в качестве вакцин, например, для терапии и/или для профилактики аллергий и/или инфекций, и/или для профилактики передачи инфекций у животных, предпочтительно жвачных, свиней, людей, собак и/или котов, но исключая лошадей.

Предпосылки создания изобретения

В опубликованном документе уровня техники от Crameri и др. описаны более подробно предпосылки создания изобретения (Crameri R. и др., Allergy 2007, 62: 197-206). Вкратце, процессинг антигенов с помощью антиген-презентирующих клеток (АРС) происходит двумя различными путями. Антигены, которые находятся внутри клетки, презентируются МНС I (главный комплекс гистосовместимости класса I, МНС класса I) молекулами на поверхности клеток, в то время как внеклеточные антигены презентируются МНС II (главный комплекс гистосовместимости класса II, МНС класса II) молекулами на поверхности клетки.

Оба механизма инициируют иммунный ответ хозяина на антиген. Молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II являются гликопротеинами клеточной поверхности, которые представляют пептиды к CD4+T клеткам. В эндоплазматическом ретикулюме (ER), МНС-II молекулы становятся ассоциированными с трансмембранным белком типа II, обозначаемым как инвариантная цепь (Ii), предотвращающим связывание пептида с МНС-II в ER. Ii гомотримеры связываются в ER с αβ димерами 3 МНС класса II и это предотвращает связывание эндогенных пептидов с молекулами класса II. Nконцевой цитоплазматический домен Ii содержит нацеливающие мотивы, что приводит к его удержанию в ER, или к нацеливанию αβ димеров класса II в эндосомальный-лизосомальный путь посредством Гольджи. Последующее протеолитическое разложение Ii оставляет небольшой фрагмент CLIP (ассоциированный Ii пептид класса II), связанный с αβ димерами класса II в бороздке связывания пептида. Взаимодействие комплексов класса II αβ/CLIP с HLA-DM, αβ димера, связанного с классом II, в специализированном компартменте, высвобождает CLIP и предоставляет возможность молекулам класса II связывать пептиды, имеющие происхождение из экзогенных белков. Было показано, что белки, синтезируемые эндогенно, как правило, исключенные из пути презентации МНС-II, могут быть эффективно представлены в виде комплексов пептид-МНС-II, если они экспрессируются в виде Ii слитых белков. Это свойство может использоваться для клонирования генов, кодирующих МНС-П-рестриктированные антигены из клеточных линий, транфектированных слитыми библиотеками Ii-кДНК. Получают эффективные аллерговакцины, нацеленные на путь МНС-II процессинга и презентации, используя способные к транслокации слияния Ii-аллерген. Концепция, обозначаемая как технология транслокации модулярного антигена (MAT), основана на слитом белке, состоящем из имеющего происхождение из ТАТ транслокаторного пептида, превращающего внеклеточные в цитоплазматические белки, первых 110 аминокислот из Ii для нацеливания слитых белков в эндосомальные/лизосомальные компартменты, и антигена для индукции специфических иммунных ответных реакций.

Концепция обеспечения молекул транспортации модулярного антигена (МАТ) для модуляции иммунных реакций, связанных с ними конструкций, способа и их применения является раскрытой в WO 2004/035793 (эквивалентная заявка США US 2005/0281816). Этот документ описывает полезность молекулы МАТ, которая состоит из трех частей, для введения эпитопов антигенов в клетки, определяя, таким образом, иммунный ответ, который подвергается модуляции с помощью такой молекулы МАТ. В данном документе описываются различные транслокационные модули, нацеливающие модули, а также антигенные модули. Эта технология и лежащий в ее основе метод позволяют, во-первых, эффективно передавать антигены из внеклеточного пространства во внутриклеточное пространство клетки-мишени, и, вовторых, обеспечивают возможность для антигенов после поступления их внутрь клетки эффективно достигать клеточных органелл для того, чтобы впоследствии подвергаться процессингу для презентации антигена. Как правило, этот двухэтапный процесс можно использовать для целенаправленной, эффективной модуляции иммунного ответа у субъекта. Использование МАТ молекул раскрывается, например, у Martinez-Gomez JM и др. [Allergy 2009, 64(1): 172-178]; Rose H (Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim Langen Hess, 2009, 96, 319-327), а также позднее у Senti G и др. [J Allergy Clin Immunol., 2012, 129(5): 1290-1296]. Ha основе технологии MAT главный кошачий аллерген Fel dl подвергали слиянию с транслокационным доменом белка, который имеет происхождение от ТАТ, и с укороченной инвариантной цепью человека для нацеливания на путь класса II МНС. Иммуногенность оценивали у мышей, в то время как потенциальные проблемы безопасности были оценены с помощью соответствующих тестов на основе реактивности базофилов, полученных от пациентов с аллергией на кошачью

- 1 041116 шерсть. Было продемонстрировано возможное применение этого модельного соединения. В данном источнике описывается, что ожидается, что молекулы МАТ являются более безопасными и более эффективными в отношении индукции желаемого иммунного ответа, а именно, снижения чувствительности к антигенам, чем рекомбинантные аллергены или экстракты аллергенов при использовании традиционной специфической для аллергена иммунотерапии (SIT). В недавней публикации Senti G. и др. была описана внутрилимфатическая иммунотерапия для лечения аллергии на кошачью шерсть у людей, которая индуцировала толерантность после трех инъекций. В данном способе было описано первое клиническое исследование для человека при использовании MAT-Fel d1, которое продемонстрировало безопасность и индукцию толерантности к аллергену после осуществления только трех внутрилимфатических инъекций. Дополнительные источники уровня техники являются следующими:

Gadermaier G. и др. (Molecular Immunology 2010, 47: 1292-1298) описывает нацеливание стабилизированной цистеином складки Art v1 для иммунотерапии аллергии на пыльцу полыни. Авторы использовали подходы генной инженерии для нацеливания посттрансляционных модификаций Art v1 с целью создания гипоаллергенной молекулы: (i) дисульфидные мостики домена дефензина были разорваны с помощью сайт-направленного мутагенеза и (ii) полученные мутантные конструкции экспрессировали в E.coli для получения негликозилированных белков. Тем не менее, задача заключалась только в манипуляциях с трехмерной складкой домена дефензина Art v1 для устранения IgE-связывания (т. е. создание гипоаллергенной молекулы) путем замены единичных остатков цистеина на серин при сохранении интактными (т.е. немодифицированными) эпитопов, которые распознаются Т-клетками (даже если таковые содержат остатки цистеина).

Доклад о работе третьего Havemeyer семинара по аллергенным заболеваниям лошадей (H0lar, Iceland, June 2007, Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008, 126: 351-361) был сфокусирован на иммунологических и генетических аспектах гиперчувствительности к укусам насекомых (IBH) и рецидивирующей обструкцией дыхательных путей (RAO). На этом семинаре обсуждались новые подходы для осуществления SIT против IBH, в частности, использование вирусных векторов или вакцинации белками при использовании аллергенов, слитых с молекулами модулярных транслокационных антигенов (МАТ). В ежегодных отчетах SIAF 2010 и 2011 гг. Crameri R сообщает о применении МАТ технологии для вакцинации подверженных IBH лошадей. Zhao и др. (Int J Clin Exp Med 2015;8(4):6436-6443) описали результаты экспериментов с мозаичными слитыми белками с МАТ структурой, описанной в WO 2004/035793 и 3 сегментами эпитопа Т-клетки, кодирующего Der p1 в качестве модуля антигена. Они повторно собирали эти последовательности линейным образом для образования слитого гена для экспрессии белка. Они описывают их конструкцию как проявляющую более сильную аллергенность (гипераллергенность) по сравнению с Der p1 белком.

Однако основные проблемы возникали при производстве и изготовлении МАТ молекул, описанных в уровне техники. В частности, стандартные способы, используемые при разработке процесса выделения и очистки (DSP) при изготовлении МАТ молекул с применением надлежащей существующей производственной практики (GMP), не могут быть применены. Не удалось очистить гомогенные молекулярные виды МАТ молекулы, что, очевидно, связано с их аномальными физико-химическими свойствами.

Некоторые известные способы очистки не могут быть применены (см., пример 4 в настоящем описании) при использовании МАТ молекул, описанных в предшествующем уровне техники, несмотря на то, что исследовали различные принципы разделения (например, гель-фильтрационная хроматография, ВЭЖХ с обратной фазой). Способы, применяемые для определения чистоты рекомбинантных белков, в целом включают хроматографическое разделение, например, ВЭЖХ с обратной фазой и электрофоретическое разделение (например, капиллярный электрофорез, зональный электрофорез, изоэлектрическое фокусирование, ДСН-ПАГЭ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях). Кроме того, эти аналитические методы не могут быть использованы для МАТ молекул без специфической для молекулы адаптации. Для оценки чистоты должна быть разработана адаптированная специфическая ДСН-ПАГЭ процедура исследования. Такая процедура исследования включает приготовление образца с восстанавливающим агентом и додецилсульфатом лития (LDS) и нагревание до 75°С, что приводит к получению множественных, воспроизводимых четких полос после электрофоретического разделения. Окрашивание при использовании синего красителя Кумасси приводит к линейному количественному поведению (денситометрия) в гелях. С помощью моноклонального антитела, которое позволяет осуществлять обнаружение модуля аллергена в молекуле МАТ, проявляли основную полосу и несколько слабых полос. Все полосы мигрировали воспроизводимым образом до того же положения, что и в исходном геле, также после повторной загрузки второго геля с вырезанными полосами первого геля. Удивительно, но во всех этих полосах с кажущейся более низкой и более высокой молекулярной массой МАТ молекулы полной длины были идентифицированы путем вырезания полос из геля, их переваривания трипсином и последующего анализа с помощью масс-спектрометрии (наноЖХ/ЭРИ-МС-МС). Из этих экспериментов можно сделать вывод о нетипичном, аномальном поведением различных вариантов фолдинга МАТ молекул в ДСНПАГЭ (гелевый сдвиг). Кроме того, во всех партиях МАТ молекул могут быть обнаружены многомерные формы белка, которые было трудно отделить от мономерных форм.

Например, для экономических аспектов, а также для нормативных требований необходимо улуч

- 2 041116 шить (I) процесс изготовления МАТ молекул и (II) их пригодность для стандартных аналитических способов определения чистоты. Кроме того, для адаптации МАТ молекул к специфическим целевым видам, таким как жвачные, свиньи, собаки и/или коты, требуется адаптация иммунологического нацеливания в рамках технологии МАТ. Эту видовую специфичность необходимо представлять в указанных iMAT молекулах, поскольку существуют отличия в гомологиях аминокислотных последовательностей между видами млекопитающих (фиг. 10). Тем не менее, правильное связывание Ii слитого белка (iMAT) с αβ субъединицами МНС класса II, в особенности в CLIP области, необходимо для оптимальной иммунологической функции по отношению к антигену в указанных iMAT молекулах. Правильное связывание с указанными молекулами МНС класса II достигается, если Ii последовательность в iMAT имеет сходство с оригинальной настолько, насколько это возможно.

Кроме того, MAT молекулы легко используются при аллергиях, которые вызываются известным основным аллергеном (например, аллергии на кошачью шерсть у людей, вызываемые Fel d1). Тем не менее, является сложным использовать МАТ молекулы предшествующего уровня техники в клинических условиях, таких как аллергии, при которых, например, как известно, участвуют различные не реагирующие перекрестно аллергены, но важность таких аллергенов для стимуляции аллергии неизвестна (т.е. основные аллергены не известны).

Кроме того, в известном уровне техники не описано, как больше одного аллергена (например, 2, 3, 4 или больше) могут быть встроены в (i) MAT молекулы без превышения определенного размера слитого белка, что препятствует производству белка.

Задача, которая лежит в основе изобретения, представляет собой предоставление улучшенных МАТ молекул, которые являются полезными в качестве активных агентов в фармацевтической композиции, такой как вакцины, и их соответствующие терапевтические и/или профилактические применения у животных, исключая лошадей, которые преодолевают проблемы, существующие в области техники.

Раскрытие изобретения

Краткое изложение сущности изобретения

В одном аспекте, задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения (изолированного) рекомбинантного белка, предпочтительно улучшенной молекулы MAT (iMAT), включающей:

(I) по меньшей мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, (II) по меньшей мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, и (III) по меньшей мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по меньшей мере от одного полного или частичного эпитопа, по меньшей мере одного антигена, предпочтительно по меньшей мере одного аллергена, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая отличается тем, что, по меньшей мере, в антигенном(ых) модуле(ях) по меньшей мере один остаток цистеина замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты, для применения в способе предотвращения и/или лечения одной или нескольких аллергий у животных, исключая лошадей, и/или для применения в способе предотвращения и/или лечения одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, и/или для применения в способе профилактики передачи одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, и/или для применения в способе профилактики передачи одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, с помощью векторов.

Соответствующие способы предотвращения и/или лечения животных, исключая лошадей, которые в этом нуждаются, и применения для приготовления фармацевтической композиции/лекарственного средства для предотвращения и/или лечения животных, исключая лошадей, также охватываются объемом настоящего изобретения.

Предпочтительным является, когда по меньшей мере в одном антигенном модуле все остатки цистеина замещены с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина, и/или аспарагиновой кислоты. Более предпочтительно в цельной молекуле iMAT все остатки цистеина замещены с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты.

Предпочтительно, когда не все остатки цистеина замещены с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина, и/или аспарагиновой кислоты, даже некоторое количество остатков цистеина остается в цельной молекуле iMAT.

Предпочтительно, когда все такие модули ковалентно связаны друг с другом, необязательно с помощью дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) между двумя или более соседними, необяза- 3 041116 тельно всеми из таких, как первый, второй и/или третий модули.

Более предпочтительно, когда все такие модули ковалентно связаны друг с другом и никакого(их) дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) не присутствует между двумя или более соседними модулями из таких, как первый, второй и/или третий модули, вообще.

В другом аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения молекулы iMAT, касающейся одной или нескольких аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOs: 2 или 3, предпочтительно включающей одну или несколько аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOs: 4 или 5. В дальнейшем аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения молекулы iMAT, включающей одну или несколько аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOs: 14-23. В предпочтительном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения молекулы iMAT, включающей, предпочтительно состоящей из одной или нескольких аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOs: 24-83.

В другом аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения вакцины или иммуногенной композиции или фармацевтической композиции, содержащей (выделенный) рекомбинантный белок, как раскрыто или заявлено в данной заявке.

В другом аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрыто или заявлено в данной заявке, или вакцины или иммуногенной композиции или фармацевтической композиции, как раскрыто или заявлено в данной заявке для применения в способе предотвращения и/или лечения одной или нескольких аллергий у животных, предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей; предпочтительно аллергий на укус блох предпочтительно у собак и/или котов; аллергий на определенные пищевые компоненты предпочтительно у собак и/или котов; атопического дерматита предпочтительно у собак и/или котов; аллергического воспаления и/или обструкции дыхательных путей предпочтительно у котов. Соответствующие способы предотвращения и/или лечения животных, предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей, которые в этом нуждаются, и применения для приготовления фармацевтической композиции/лекарственного средства для предотвращения и/или лечения животных, предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей, также охватываются объемом настоящего изобретения.

В другом аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрыто или заявлено в данной заявке, или вакцины или иммуногенной композиции или фармацевтической композиции, как раскрыто или заявлено в данной заявке для применения в способе предотвращения и/или лечения одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, и/или предотвращения передачи одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, с помощью векторов, предпочтительно с помощью насекомых, которые питаются кровью, мух, мошек, клещей и/или комаров. Инфекционный патоген и/или инфекционное заболевание могут представлять собой одно или несколько выбранных из кампилобактера, сердечного гельминта, эрлихиоза, лейшманиоаз, трипаномиаза, боррелиоза, вируса Шмалленберга, африканской катаральной лихорадки и/или вируса Западного Нила, дерматофитоза, и/или инфекций пищеварительной системы, и/или других органов, вызванных вирусами (например, рота-, коронавирус), и/или паразитов (например, гельминты), и/или простейших (например, кокцидиоз, криптоспоридиоз), и/или их стадий паразитарной инкубации. Соответствующие способы предотвращения и/или лечения животных, предпочтительно жвачных, свиней, людей, собак и/или котов, но исключая лошадей, которые в этом нуждаются, и применения для приготовления фармацевтической композиции/лекарственного средства для предотвращения и/или лечения животных, предпочтительно жвачных, свиней, людей, собак и/или котов, но исключая лошадей, также охватываются объемом настоящего изобретения.

В дальнейшем аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения нуклеиновой кислоты, которая кодирует (изолированный) рекомбинантный белок, как раскрыто или заявлено в данной заявке.

В дальнейшем аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения вектора, который включает по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, как раскрыто или заявлено в данной заявке.

В дополнительном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения первичной клетки или линии клеток, включающей по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, как раскрыто или заявлено в данной заявке и/или по меньшей мере один вектор, как раскрыто или заявлено в данной заявке.

Неожиданно было обнаружено, что молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, как раскрыто или заявлено в данной заявке, обладают физико-химическими и/или иммунологическими характеристиками, которые обеспечивают им преимущества по сравнению с МАТ молекулами с известного уровням техники:

(I) Замена по меньшей мере одного остатка цистеина, предпочтительно всех остатков цистеина, с

- 4 041116 помощью другого аминокислотного остатка в антигенном(ых) модуле(ях), предпочтительно цельной молекулы iMAT, которая является выбранной in silico так, чтобы не нарушать стабильность заключительной молекулы iMAT, обеспечивает молекулу iMAT в соответствии с настоящим изобретением, которая неожиданно является приемлемой для применения стандартных процедур очистки для биофармацевтических средств, а также для стандартных аналитических способов.

(II) Предпочтительная непосредственная ковалентная связь модулей молекулы iMAT, то есть первого транслокационного модуля, первого нацеливающего модуля и третьего антигенного модуля, без каких-либо дополнительных спейсерных модулей между такими модулями, то есть без дополнительных спейсерных модулей между двумя или более соседними модулями, такими как первый, второй и/или третий модули, вообще осуществляет свой вклад в получение дополнительных к указанным улучшенных характеристик молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением: такие молекулы iMAT, которые считаются более жесткими в отношении трехмерной структурны и, следовательно, не способны образовывать конформационные IgE эпитопы, являются еще более гипоаллергенными - фактически вплоть до полного отсутствия аллергенности.

(III) Предпочтительное присутствие (n) (квази) N-терминальной или С-терминальной His-метки приводит к получению молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением, которые можно использовать в качестве суррогатного маркера для мониторинга иммунитета и/или длительности иммунитета, поскольку такой модуль метки, необязательно совместно с одним или несколькими соседними аминокислотными остатками из транслокационного модуля, можно использовать для индуцирования специфического сигнала, который определяется иммунологически (например, антитело) у целевого субъекта, то есть является специфическим для структуры молекул iMAT (см. пример 1 далее в настоящей заявке). Дополнительно присутствие такого модуля метки можно использовать для разделения белков в образце, который включает молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, например, с использованием цинк - или кобальт-заряженных твердых носителей, и, следовательно, дополнительно повышает возможность получения молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением с отсутствием аггрегации в процессе очистки. Предпочтительной является (n) (квази) N-терминальная His-метка.

(IV) По меньшей мере один нацеливающий модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является специфическим для вида, то есть в случае предполагаемого применения таких молекул iMAT у собак, кошек, крупного рогатого скота, овец, коз или свиней нацеливающий модуль, например инвариантную цепь собаки, выбирают соответственно. С помощью такого специфического для вида нацеливания могут быть успешно достигнуты оптимизированные характеристики молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением для связывания с молекулами МНС класса II.

(V) По меньшей мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно представляет собой аллерген. Он может иметь происхождение из пищи и/или плесени (грибов и/или их спор), пыльцы, домашней пыли или амбарных клещей (и/или их фекалий) и/или блох, предпочтительно из пыльцы с деревьев, трав, травянистых растений, амброзии и/или пыльцы растений крестоцветных и/или грибов и/или их спор родов aspergillus, alternaria, botrytis, cercospora, cladosporium, curvularia, drechslera, eurotium, helminthosporium, epicoccum, erysiphe/oidium, fusarium, lichtheimia, nigrospora, penicillium, periconia, peronospora, polythrincium, saccharopolyspora фанее также faenia или micropolyspora), thermoactinomyces, stemphylium, torula и/или клещей (или их фекалий) родов acarus, glycophagus, tyrophagus, dermatophagoides, euroglyphus, lepidoglyphus, blomia и/или блох родов Ceratophyllus, Ctenocephalides, Pulex, Archaeopsylla. По меньшей мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением более предпочтительно представляет собой аллерген Dermatophagoides. Аллерген можно выбирать в соответствии со следующими критериями: если основные аллергены, которые вызывают аллергию у субъектов, не известны, то по меньшей мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением может быть выбран с помощью биоинформационного подхода, как описано иллюстративно и подробно изложено в примерах 5 и 6 в данной заявке. Таким образом могут быть получены улучшенные молекулы МАТ, которые могут быть использованы специфически в качестве вакцин, например, для лечения и/или предотвращения аллергий у животных, предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей. По меньшей мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением также может представлять собой антиген патогена, который принимает участие в одном или нескольких инфекционном(ых) заболевании(ях). Он может иметь происхождение из родов Campylobacter, Dirofilaria, Ehrlichia, Leishmania, Trypanosoma, Borrelia, Orthobunyavirus, Orbivirus, Flavivirus, Rotavirus, Coronavirus, Trichophyton, Microsporum; других гельминтов, таких как Cooperia, Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Dictyocaulus, Metastrongylus; и/или простейших с желудочно-кишечными проявлениями, таких как Eimeria, Isospora, Cryptosporidium, Giardia - в случае паразитов также могут применяться антигены, имеющие происхождение из стадий паразитарной инкубации. По меньшей мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением также может представлять собой антиген (например, компонент слюны) вектора, вовлеченного в передачу одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий), например, относящихся к семействам Culicidae, Ceratopogonidae, Phlebotominae Ixodidae

- 5 041116 и/или Cimicidae. Таким образом, могут быть получены улучшенные молекулы МАТ, которые могут быть использованы специфически в качестве вакцин, например, для лечения и/или предотвращения и/или предотвращения передачи инфекционных заболеваний у животных, предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей.

(VI) Может быть обеспечено получение новых молекул iMAT, которые содержат мотивы последовательностей более одного аллергена только в одной из указанных молекул iMAT, то есть мозаичные слитые белки. Выбор пептидных последовательностей, встроенных в модуль аллергена, основывается на поливалентных аллергенных мотивах, обнаруженных в релевантных основных аллергенах с помощью биоинформационных подходов. С помощью этого подхода размер таких молекул iMAT можно поддерживать достаточно низким для предоставления возможности эффективной продукции в подходящих экспрессионных системах.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает (выделенные) рекомбинантные белки, которые проявляют улучшенную растворимость, которые являются легко пригодными для хроматографических методов разделения и которые проявляют улучшенную стабильность.

Дополнительно (выделенные) рекомбинантные белки в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно демонстрируют высокие активности и эффективности относительно индуцирования желательных иммунологических эффектов, а именно, становится возможным благоприятное специфическое для вида модулирование иммунного ответа на аллергены у субъекта, например, у животных, более предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей, аллерген-специфические IgE опосредованные реакции гиперчувствительности могут быть модулированы в различных целевых органах, каких как кожа, дыхательная и/или желудочно-кишечная система. Также становится возможной и/или профилактика и/или лечение инфекционных заболеваний и/или предотвращение передачи инфекционных заболеваний с помощью векторов у животных, предпочтительно жвачных, свиней, людей, собак и/или котов, но исключая лошадей.

Аллергенность терапевтического аллергена является чрезвычайно важной, она является показателем потенциальных возможностей индуцирования побочных эффектов, например, провоцирования анафилактической реакции. Что касается известных из уровня техники молекул МАТ противоречивые результаты относительно их аллергенности по сравнению с соответствующими нативными аллергенами были описаны в известном уровне техники. Senti G и др. (J Allergy Clin Immunol. 2012, 129(5): 1290-1296) продемонстрировали гипоаллергенность MAT-Fel d1 в исследовании путем теста стимуляции клеточного антигена (CAST), а также во внутридермальном и во внутрикожном тесте. Количественное различие в чувствительности между аллергеном и молекулой МАТ, содержащей Fel d1 составляло 100-, 23- и 16-раз, соответственно. Несмотря на то, что MAT-Fel d1 была явно гипоаллергенной, некоторая аллергенность оставалась. В отличие от этого Zhao и др. (Int J Clin Exp Med 2015; 8(4): 6436-6443) описали, что их MAT-Der p1 конструкция проявляет даже еще более сильную аллергенность (гпиераллергенность) по сравнению с нативным Der p1 белком.

Неожиданно безопасность улучшенных молекул МАТ, как описано и заявлено в настоящей заявке, является лучшей в этом аспекте. В отличие от нативных аллергенов, которые обычно вызывают сильное высвобождение гистамина, неожиданно молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением фактически проявляют ответ без высвобождения гистамина вообще. Таким образом, молекулы iMAT являются лучшими в отношении безопасности по сравнению с молекулой МАТ, как описано в известном уровне техники (см. выше).

Результатом такого неожиданного свойства безопасности молекул iMAT в отличие от известных с уровня техники молекул МАТ является тот факт, что молекулы iMAT, используемые в качестве десенсибилизирующих белков, могут использоваться подобно вакцинам к патогенам. Отсутствует необходимость повышения дозировки, как это имеет место с классическими терапевтическими аллергенами, поскольку вакцины, содержащие молекулы iMAT, не проявляют аллергенных свойств по отношению к аллергическим побочным эффектам. Уже дозу первой инъекции молекулы iMAT при осуществлении курса лечения выбирают только из соображений эффективности и не принимают во внимание возможных аллергических побочных реакций. Этого нельзя осуществить при использовании молекул МАТ, описанных в известном уровне техники, поскольку аллергенность МАТ, по сравнению с нативным аллергеном, только уменьшая до определенного уровня. Тем не менее, молекулы МАТ, описанные в известном уровне техники, все еще являются аллергенами; молекулы iMAT в отличие от этого таковыми не являются. Преимуществом такого улучшенного свойством является более эффективная схема лечения, возможная, например, с тремя подкожными или внутрилимфатическими инъекциями с высоким содержанием биофармацевтического препарата (например, 3 раза 1 мкг до 100 мкг, предпочтительно 3 раза 10 мкг до 50 мкг iMAT белка).

Отсутствие аллергенности молекул iMAT может быть объяснено тем фактом, что в отличие от молекул МАТ, описанных в известном уровне техники, отсутствуют линкерные аминокислотные остатки [то есть спейсерный(е) модуль(и) между первым, вторым и/или третьим модулем(ями)], используемые для разделения различных модулей в таких молекулах iMAT.

Из уровня техники известно, что сконструированные слитые белки, содержащие два или больше

- 6 041116 функциональных полипептидов, соединенные пептидным или белковым линкером, такой линкер является важным для функционирования (например, распознавание эпитопа иммунной системой) белков [Klein

JS и др., Protein Eng Des Sel. 2014, 27(10): 325-330]. Разделительное расстояние между функциональными единицами может оказывать влияние на доступность эпитопа и способность связываться с авидностью.

Полагают, что в молекулах iMAT согласно настоящему изобретению, в которых отсутствуют аминокислотные линкеры между модулями, в особенности между целевым доменом и антигенным модулем, что приводит к более жесткой структуре, конформационные эпитопы аллергенового модуля не могут образовываться вследствие неправильной укладки. Перекрестное связывание антител, связываемых на поверхности базофилов (например, IgE) с помощью его рецепторов с высокой аффинностью, необходимо для индукции активации и высвобождения гистамина. Тем не менее, аллергены с неправильной укладкой не способны индуцировать такое перекрестное связывание. Таким образом, молекулы iMAT без дополнительных спейсерных модулей/линкеров между первым, вторым и третьим модулем не могут образовывать конформационные IgE эпитопы, которые придают молекулам iMAT в соответствии с настоящим изобретением неаллергенность. Таким образом, в специфическом варианте осуществления в молекулах iMAT согласно настоящему изобретению отсутствуют какие-либо дополнительные спейсерные модули или линкеры между первым, вторым и третьим модулем.

Подробное описание изобретения

Перед тем как варианты осуществления в соответствии с настоящим изобретением будут описаны подробно, следует отметить, что как используется в данной заявке и в приложенных пунктах формулы, формы единственного числа какой-либо и данный включают в себя ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют те же значения, которые обычно понятны среднему специалисту в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Все приведенные диапазоны и значения могут варьировать в пределах от 1 до 5%, если не указано иное, или иным образом не является известным специалисту в данной области техники, поэтому термин приблизительно, как правило, опускается в описании и формуле изобретения. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, могут быть использованы в практике или при испытании настоящего изобретения, предпочтительные способы, устройства и материалы, будут описаны далее. Все публикации, упомянутые в настоящем описании, включены в данную заявку в качестве ссылки с целью описания и раскрытия веществ, наполнителей, носителей и методик, как описано в публикациях, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Ничто в данной заявке не должно быть истолковано как допущение того, что изобретение не имеет права датировать такое раскрытие задним числом на основании предшествующего изобретения.

Термины изолированный рекомбинантный белок, рекомбинантный белок и/или улучшенная молекула MAT (iMAT) используются попеременно в описании данного изобретения. Все они имеют идентичное значение. Термин модуль в описании настоящего изобретения относится к специфической аминокислотной последовательности, например, к части, блоку или фрагменту полипептида, обычно коротким аминокислотным / пептидным последовательностям, которые имеют определенную функцию. Термин первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, позволяющую осуществлять транслокацию (изолированного) рекомбинантного белка, предпочтительно улучшенной молекулы MAT (iMAT), из внеклеточного пространства внутрь клеток в данной заявке также взаимозаменяемо может быть сформулирован как транслокационный модуль или последовательность транслокации, и в контексте настоящего изобретения относится к специфической аминокислотной последовательности, которая способствует транспорту молекулы переносчика, например, аминокислотной последовательности, пептида, полипептида, белка и веществ других классов, таких как нуклеиновые кислоты или фармацевтически активные ингредиенты (API), внутрь клеток, в частности эукариотических клеток, более конкретно клеток, которые экспрессируют молекулы МНС класса II на своей поверхности и/или молекулы МНС класса I на своей поверхности, как является известным в литературе.

С помощью присутствия транслокационного модуля является возможным способствовать поступлению указанной молекулы переносчика в клетки. Аминокислотные последовательности, полезные в качестве транслокационных модулей, описываются в уровне техники. Например, US 7653866 раскрывает несколько полезных последовательностей транслокации, включающих HIV-tat молекулу или белок VP22, который имеет происхождение от вируса простого герпеса. Этот принцип содействия поступлению данной целевой молекулы внутрь клеток описывается в ряде различных исследований в соответствующей патентной и непатентной литературе. Кроме того, приемлемые последовательности транслокации включают последовательности гомеопротеина, последовательности лейциновых застежек или обогащенные лизином и обогащенные аргинином последовательности, а также различные другие последовательности белков или полипептидов, которые секретируются, несмотря на отсутствие сигнальной последовательности секреции. Особенно полезными являются вирусные пептидные последовательности, например, белок активатора транскрипции HIV (HIV tat). Последовательность Tat или Tat пептид были описаны в уровне техники, включая их различные модификации. Все вариации, которые описаны в уровне техники для

- 7 041116 пептидных последовательностей Tat, являются в общем случае приемлемыми в качестве транслокационных модулей. Другие примеры включают VP22 пептид, а также пептиды Antennapedia (сложный локус, в котором локализованы гомеозисные мутации), имеющие происхождение от гомеотического белка антеннапедия Drosophila. Кроме того, могут использоваться другие гомеопротеины. Различные примеры приемлемых гомеопротеинов описываются в уровне техники. Кроме того, могут использоваться белки лейциновых застежек, подобные человеческому cFos-(139-164), или человеческому cJun-(252-279). Кроме того, обогащенные аргинином и/или обогащенные лизином пептиды являются приемлемыми в качестве транслокационных модулей, включая последовательности, подобные HIV-1 rev (34-50), или другие пептиды, которые имеют происхождение от вирусов или дрожжей. Конечно, пептиды, обогащенные полиаргинином и/или полилизином, могут быть получены синтетически. Указанные обогащенные полиаргинином и/или полилизином пептиды могут включать дополнительные аминокислоты. Предпочтительные примеры описываются в соответствующем уровне техники.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, один транслокационный модуль включает, предпочтительно состоит из, аминокислотную последовательность, которая не состоит из полной белковой последовательности, как иллюстрируется выше, но вместо этого содержит минимальную последовательность, которая все еще остается функциональной, то есть такой, которая является способной эффективно содействовать поступлению в клетки. Приемлемые минимальные последовательности, например, представляют собой аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1).

В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один транслокационный модуль включает, предпочтительно состоит из HIV-tat, VP22 и/или Antennapedia или их частичных последовательностей, при условии, что такой по меньшей мере один транслокационный модуль является функциональным в качестве модуля для транслокации из внеклеточного пространства внутрь клеток.

Термин второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять видоспецифическое внутриклеточное нацеливание (изолированного) рекомбинантного белка, предпочтительно улучшенной молекулы MAT (iMAT), на клеточные органеллы, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или загрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, в данной заявке также взаимозаменяемое называется нацеливающим модулем или нацеливающей последовательностью, и в контексте настоящего изобретения относится к специфической аминокислотной последовательности, которая позволяет осуществлять/способствует внутриклеточному транспорту (изолированных) рекомбинантных белков, как раскрывается и заявлено в данной заявке, к таким клеточным органеллам, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или загрузку МНС молекул антигенами.

В частности, такие клеточные органеллы включают эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, сеть транс-Гольджи, лизосомы, эндосомы и компартменты МНС класса II. Такие внутриклеточные органеллы являются вовлеченными в такие процессы, как, например, транспорт и/или процессинг антигенов, получение и/или загрузка молекул МНС II антигенами или процессированными антигенами, и/или транспорт молекул МНС II, нагруженных такими антигенами, на свою поверхность.

Ряд последовательностей является известным в уровне техники. Примечательный пример полезных нацеливающих последовательностей включает инвариантную цепь молекулы МНС класса II, которая также является известной как Ii инвариантная цепь или МНС II гамма цепь. Различные варианты инвариантной цепи описываются в патентной и непатентной литературе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения инвариантная цепь является выбранной из видов, у которых иммунный ответ должен подвергаться модулированию, и/или из видов, у которых молекула iMAT должна быть нацеленной на внутриклеточное пространство.

Эта видовая специфичность должна быть представлена в указанных молекулах iMAT, поскольку существует гомология Ii аминокислотных последовательностей между видами млекопитающих (фиг. 10). Тем не менее, надлежащее связывание Ii слитого белка (iMAT) с αβ субъединицами МНС класса II специфически в CLIP участке необходимо для оптимальной иммунологической функции по отношению к антигену в указанных молекулах iMAT. Надлежащее связывание с указанными молекулами МНС класса II достигается в том случае, если Ii последовательность в iMAT имеет сходство с оригинальной максимально, насколько это возможно.

Например, для собак, котов, крупного рогатого скота, овец, коз или свиней предпочтительная выбранная инвариантная цепь представляет собой инвариантную цепь собаки, кошки, крупного рогатого скота, овцы, козы или свиньи. Для собак и котов, предпочтительная инвариантная цепь представляет собой аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2 (собачья) и SEQ ID NO: 3 (кошачья) или их фрагментов, при условии, что такие фрагменты сохраняют их внутриклеточную транспортную функцию (например, первые 110 аминокислот, как показано на фиг. 10).

Другие приемлемые примеры для нацеливания последовательностей включают лизосомальные мембранные белки, которые включают последовательности, приемлемые в качестве нацеливающих модулей. Существует ряд мембранных белков, которые образуются в лизосомах и имеют последовательности мотивов, которые позволяют осуществлять нацеливание на лизосому. Эти группы белков включают,

- 8 041116 среди прочих, lamp 1, lamp 2, lamp 3, limp II и lap. Кроме того, белки тетраспанина являются известными в уровне техники в качестве нацеливающих модулей. Дополнительные белки можно обнаружить в эндосомальных/лизосомальных компартментах, эти белки демонстрируют свойства нацеливания. Специалист в данной области техники знает, как определить приемлемые нацеливающие последовательности соответственно.

В другом варианте осуществления по меньшей мере один нацеливающий модуль содержит, предпочтительно состоит из инвариантной цепи собаки, кошки, крупного рогатого скота, овцы, козы или свиньи или их фрагментов при условии, что такие фрагменты сохраняют их внутриклеточную транспортную функцию.

В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один нацеливающий модуль представляет собой инвариантную цепь собаки, которая содержит, предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 4 (собачья). В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один нацеливающий модуль представляет собой кошачью инвариантную цепь, которая содержит, предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 5 (кошачья).

Термин третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение, по меньшей мере, от одного полного или частичного эпитопа, по меньшей мере, одного антигена, предпочтительно по меньшей мере одного аллергена, который определяет специфичность иммунного ответа модулируемого с помощью такого (изолированного) рекомбинантного белка, предпочтительно улучшенной молекулы MAT (iMAT) (у субъекта, предпочтительно животного, более предпочтительно жвачного животного, свиньи, собаки и/или кошки, но исключая лошадь), который в данной заявке также взаимозаменяемо упоминается как антигенный модуль или антигенная последовательность, в контексте настоящего изобретения относится к специфической аминокислотной последовательности, которая предоставляет возможность модулировать иммунный ответ против эпитопа/антигена и которая определяет специфичность иммунного ответа у субъекта, предпочтительно животного, более предпочтительно жвачного животного, свиньи, собаки и/или кошки, но исключая лошадь.

В этом контексте такой(ие) антигенный(ые) модуль(и) включает(ют) по меньшей мере один остаток цистеина, который замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина, и/или аспарагиновой кислоты. Таким образом, иммунный ответ отличается от иммунного ответа субъекта, предпочтительно животного, более предпочтительно жвачного животного, свиньи, собаки и/или кошки, но исключая лошадь, который подвергается воздействию неизмененной аминокислотной последовательности антигена.

Не существует никаких ограничений, связанных с антигенами на основе данного способа. Этот способ может быть использован, например, для активации иммунной системы субъекта против патогенных микроорганизмов, таких как, например, вирусы, бактерии, грибы, паразиты, простейшие и т.д., то есть в самом общем виде, в качестве вакцины. Кроме того, этот способ может быть использован не только непосредственно против таких патогенных микроорганизмов, но и для активации иммунной системы хозяина для предотвращения передачи трансмиссивных заболеваний, включающих заболевания, которые вызываются вирусами, бактериями, грибами, паразитами, простейшими и т.д. Кроме того, этот способ может использоваться для активации иммунной системы против дегенеративных клеток, таких как, например, опухолевые клетки и т.д. Тем не менее, он также может быть использован, с другой стороны, для десенсибилизации иммунной системы субъекта против аллергенов, таких как, например, пищевые аллергены и/или аэроаллергены, например, аллергены из плесени (грибов и/или их спор), пыльцы, шерсти животных, домашней пыли или амбарных клещей (и/или их фекалий), токсинов насекомых и т.д., или для целенаправленного подавления иммунной системы, например, если присутствуют аутоиммунные реакции, такие как, например, артрит, ревматизм, диабет, СКВ (системная красная волчанка) и т.д., а также для подавления реакций отторжения трансплантата. Дополнительные расстройства, которые не были упомянуты и которые являются связанными с иммунной реакцией, которая является слишком сильной или слишком слабой, точно также можно лечить с помощью молекул iMAT, как раскрыто и заявлено в данной заявке.

Является возможным использовать в качестве антигенных модулей для целей настоящего изобретения, в принципе, все типы антигенов, способных модулировать иммунный ответ. Как антигены, которые в настоящее время являются известными, так и антигены, которые будут обнаружены в будущем, являются приемлемыми. В некоторых случаях антигены могут быть также такими, которые не приводят к иммунному ответу при использовании обычных способов иммунизации, известных в данной области техники в настоящее время, но которые при использовании нового способа, описанного в настоящем изобретении, приводят к иммунному ответу у субъекта. Кроме того, термин антиген включает антигенные фрагменты, содержащие антигенную детерминанту/антигенные детерминанты, который(ые) также является(ются) известным(и) как эпитоп(ы). Таким образом, антигенный модуль представляет собой всю молекулу, например, белок, или представляет собой часть молекулы, т.е. ее фрагмент такой, как пептид, охватывающий по меньшей мере одну антигенную детерминанту или эпитоп. По меньшей мере одна антигенная детерминанта или эпитоп способны вызывать иммунный ответ, направленный против анти- 9 041116 гена. Эпитоп может содержать одну или более чем одну аминокислоту или пептид, или другую структуру, способную вызывать иммунный ответ, такую как структуры сахаров, фосфорилированных аминокислот и т.д., или их комбинации. Антиген может представлять собой детерминанту непрерывного типа (т.е. такой, который не зависит от конформации, например, представлен в нативных и денатурированных белках) или детерминанту прерывистого типа (т.е. такой, который зависит от конформации, например, представлен только в нативной, свернутой форме, но не присутствует в денатурированных белках). Можно использовать не только белки и пептиды, но и структуры сахаров, липидов, например, липополисахариды, липотейхоевые кислоты и другие компоненты бактериальных мембран (CD1b, например, связывает структуры сахаров и липиды), нуклеиновые кислоты, такие как, например, ДНК, содержащие мотивы CpG, различные органические вещества, такие как, например, латекс или фармацевтически активные вещества, такие как антиген для целей настоящего изобретения. Антиген может быть получен из всех возможных жизненных форм, таких как, например, животные, растения, грибы, паразиты, одноклеточные или многоклеточные микроорганизмы, вирусы и другие формы жизни. Антигены могут быть выделены из биологического материала, могут быть получены в виде рекомбинантных антигенов или получены путем синтеза, например путем пептидного синтеза. Синтетически полученные антигены могут представлять собой вещества, которые встречаются в природе, или те, которые не встречаются в природе, но могут быть получены путем химического синтеза. Примеры веществ, которые не встречаются в природе, но которые, однако, пригодны в качестве антигена при некоторых обстоятельствах, например, синтетически полученные вещества, которые присутствуют в лекарственных средствах, или синтетические пептиды, включающие аминокислотные последовательности, которые не встречаются в природе, или пептидомиметики и т.д. Встречающиеся в природе или синтетические, или рекомбинантные антигены могут быть модифицированы с помощью молекулярной биологии, ферментативных, химических и/или других способов для того, чтобы придать им свойства, которые являются более выгодными для конкретного варианта применения. Эти полезные свойства, в частности, могут представлять собой большую или меньшую активность в качестве антигена, более широкое или более специфическое действие в качестве антигена, лучшую растворимость в гидрофильных или гидрофобных растворителях, большую способность к проникновению антигенных модулей для клеточных мембран, для мембран органелл, для гематоэнцефалического барьера и т.д., более высокий или более низкий период полураспада in vivo или in vitro, более низкую или более высокую токсичность, лучшую способность к выявлению антигена in vivo или in vitro после применения антигена в виде молекулы iMAT и т.д. Кроме того, для целей настоящего изобретения является возможным объединить множество антигенов в одном модуле антигена. Для этого является возможным для идентичных антигенов присутствовать в количестве более чем одна копия в антигенном модуле, или является возможным, например, для различных вариантов одного и того же антигена, чтобы они были объединены в антигенном модуле.

Комбинация антигенов, например антигена 1, и других антигенов, например антигена 2, в антигенном модуле также является возможной и т.д. Дополнительные комбинации, такие как, например, антиген 1 в количестве более чем одна копия, и антигена 2 в единственном количестве, также могут быть объединены в антигенном модуле и т.д. Также дополнительно является возможным для одного или нескольких различных и/или одного или более одинаковых антигенных модулей присутствовать в молекуле iMAT. Является возможным, в принципе, для всех возможных комбинаций одного или множества, чтобы присутствовали идентичные или измененные копии антигенов, которые имеют происхождение от одного или более различных антигенов, которые будут объединены для целей настоящего изобретения. В предпочтительном варианте реализации антигенный модуль включает по меньшей мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение по меньшей мере от одного антигена, где такой антиген представляет собой аллерген. По меньшей мере один эпитоп может вызывать иммунный ответ против аллергена, в соответствии с чем эпитоп может содержать одну или более чем одну структуру, например пептид, способный вызвать иммунный ответ. Эпитоп может представлять собой непрерывный эпитоп или прерывистый эпитоп аллергена. Эпитопы предпочтительно могут состоять по меньшей мере из восьми аминокислот в длину, предпочтительно по меньшей мере десяти аминокислот в длину, более предпочтительно по меньшей мере 13 аминокислот в длину. Антигенный модуль включает по меньшей мере один полный или частичный эпитоп, а также может содержать два или более полных или частичных эпитопа, которые могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Кроме того, антигенный модуль может включать дополнительные аминокислотные последовательности, примыкающие по меньшей мере к одному полному или частичному эпитопу. Эпитоп может представлять собой существующий в природе эпитоп или может быть модифицированным эпитопом, который либо модифицирован в своей аминокислотной последовательности, либо при использовании одной или более посттрансляционных модификаций.

В одном варианте осуществления по меньшей мере один (третий) антигенный модуль включает по меньшей мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение по меньшей мере от одного антигена патогена, который принимает участие в одном или нескольких инфекционном(ых) заболевании(ях) животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей. Он может иметь происхождение из родов Campylobacter, Dirofilaria, Ehrlichia, Leishmania, Trypano

- 10 041116 soma, Borrelia, Orthobunyavirus, Orbivirus, Flavivirus, Rotavirus, Coronavirus, Trichophyton, Microsporum; других гельминтов, таких как Cooperia, Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Dictyocaulus, Metastrongylus; и/или простейших с желудочно-кишечными проявлениями, таких как Eimeria, Isospora, Cryptosporidium, Giardia - в случае паразитов также могут применяться антигены, имеющие происхождение из стадий паразитарной инкубации. По меньшей мере один антигенный модуль в молекулах iMAT в соответствии с настоящим изобретением также может представлять собой антиген (например, компонент слюны) вектора, вовлеченного в передачу одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий), например, относящийся к семействам Culicidae, Ceratopogonidae, Phlebotominae, Ixodidae и/или Cimicidae.

В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один (третий) антигенный модуль включает по меньшей мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение по меньшей мере от одного аллергена, который вызывает одну или более аллергий у животных, более предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей. Он может представлять собой по меньшей мере один полный или частичный эпитоп по меньшей мере одного аллергена, который имеет происхождение из пищи и/или плесени (грибов и/или их спор), пыльцы, домашней пыли или амбарных клещей (и/или их фекалий), предпочтительно из пыльцы с деревьев, трав, травянистых растений, амброзии и/или пыльцы растений крестоцветных и/или грибов и/или их спор родов aspergillus, alternaria, botrytis, cercospora, cladosporium, curvularia, drechslera, eurotium, helminthosporium, epicoccum, erysiphe/oidium, fusarium, lichtheimia, nigrospora, penicillium, periconia, peronospora, polythrincium, saccharopolyspora (ранее также faenia или micropolyspora), thermoactinomyces, stemphylium, torula и/или клещей (или их фекалий) родов acarus, glycophagus, tyrophagus, dermatophagoides, euroglyphus, lepidoglyphus, blomia и/или блох родов Ceratophyllus, Ctenocephalides, Pulex, Archaeopsylla. В предпочтительном варианте осуществления он представляет собой, предпочтительно по меньшей мере один полный или частичный эпитоп, по меньшей мере одного аллергена, который имеет происхождение от клещей, более предпочтительно из рода dermatophagoides.

Примеры аллергенов рода dermatophagoides представлены на фиг. 9 (9А и 9В), идентифицируя виды, аллерген и номер доступа UNIPROT.

В другом предпочтительном варианте осуществления, такой по меньшей мере один аллерген представляет собой Der f 15 в соответствии с SEQ ID NO: 11 (полная) и SEQ ID NO: 18 (iMAT форма). Предпочтительные специфические последовательности антигенных модулей представляют собой аминокислотные последовательности в соответствии с SEQ ID NOS: 7-23, предпочтительно SEQ ID NOs: 14-23 (iMAT формы).

Термин иммунный ответ, который модулируется путем или, взаимозаменяемо, иммуномодуляторный иммунный ответ в связи с (изолированным) рекомбинантным белком и/или молекулой iMAT в контексте настоящего изобретения относится к иммуногенным и/или толерогенным иммунным ответам.

Термин гибрид iMAT или iMAT гибрид или мозаичная iMAT используются взаимозаменяемо. Эти термины относятся к молекуле iMAT, которая включает в своем третьем модуле, более одной полной или частичной эпитопной последовательности из двух или больше антигенов. Предпочтительно указанные антигены представляют собой два или больше аллергенов, более предпочтительно две или больше короткие пептидные последовательности из различных аллергенов, которые определяют специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT (у субъекта, предпочтительно животного).

Термин аллерген в контексте настоящего изобретения относится к типу антигена, который в нативной форме вызывает слишком энергичный иммунный ответ, при котором иммунная система отбивает все выявленные угрозы, которые иначе были бы безвредны для субъекта. Как правило, эти виды реакций приводят к фенотипу, известному как аллергии. Различные типы аллергенов являются описанными в предшествующем уровне техники, включая пищевые продукты, лекарственные препараты, продукты животного происхождения, природные или синтетические материалы. Предпочтительно белок считается аллергеном в том случае, когда он вызывает в нативной форме специфический IgE ответ по меньшей мере у пяти субъектов, предпочтительно животных, более предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей. Во избежание сомнения, аллерген в связи с по меньшей мере одним третьим антигенным модулем, включающим по меньшей мере один полный или частичный эпитоп, который имеет происхождение по меньшей мере от одного аллергена уже не нуждается в том, чтобы находиться в нативной форме, которая также является предпочтительной, другими словами, термин аллерген в контексте настоящего изобретения также явным образом относится к ненативным аминокислотным последовательностям в составе молекул iMAT, как описано и заявлено в данной заявке, и которые не уже не вызывают специфического IgE ответа по меньшей мере у пяти субъектов предпочтительно животных, более предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей.

Термин аллергенность терапевтического аллергена является показателем потенциального индуцирования побочных эффектов, например, провоцирования анафилактической реакции. Для примера аллергии у млекопитающих, исследование для определения аллергенности у собак описано в Griffin и др. [Griffin СЕ. Diagnosis of canine atopic dermatitis DOI: 10.1002/9781118738818.ch10]. В этом документе

- 11 041116 описано измерение аллерген-специфической IgE опосредованной гиперчувствительности в таких процедурах, как аллергеновые провокационные тесты, в особенности такие тесты, нацеленные на кожу. Интрадермальные кожные тесты используют для биологической оценки рекомбинантных аллергенов и для валидации генетически сконструированных гипоаллергенных производных. Интрадермальное тестирование на собаках осуществляют путем инъекционного введения небольших количеств растворов аллергенов непосредственно в кожу собаки. Это осуществляют с помощью игл небольшого калибра (калибр игл по шкале Гейдж 27) и в каждый участок инъецируют 0,5-0,1 мл. Положительные реакции в произвольном порядке интерпретируются путем наличия эритемы, припухлости, высоты и размера аллергической папулы. Преимуществом интрадермального теста является высокая чувствительность. Является чрезвычайно важным, если тест будет доставлять количественный показатель для аллергенности. При осществлении указанного теста согласно Griffin и др. с применением молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением, эти молекулы iMAT проявляют в 10-, 100- - 1000-раз или даже больше более высокую молярную концентрацию аллергенного компонента по сравнению с соотвествующим натуральным, нативным аллергеном, применяемым в аналогичном тесте, для достижения положительной реакции у чувствительных индивидуумов, как, например, у котов и собак.

Термин эпитоп, который в данной заявке также взаимозаменяемо упоминается как антигенная детерминанта, в контексте настоящего изобретения относится к части антигена, которая распознается иммунной системой, либо В-клетками, либо Т-клетками. Эпитопы являются представленными на поверхности антигенпрезентирующих клеток с помощью молекул МНС, с которым они являются связанными.

Термин субъект, который в данной заявке также взаимозаменяемо упоминается как индивидуум и/или организм и/или хозяин, в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к животным и/или людям, например, жвачным, свиньям, более предпочтительно собакам и/или котам, но исключая лошадей. Термин жвачные, в контексте настоящего изобретения охватывает жвачных млекопитающих, включая крупный рогатый скот, коз и овец. Следовательно, представители родов Bos, Capra и/или Ovis, взаимозаменяемо обозначаются как виды крупного рогатого скота, коз и/или овец. Термин животное, как используется в настоящей заявке, включает млекопитающих. Животное может быть выбрано из группы, состоящей из жвачных или представителей родов Canis или взаимозаменяемо обозначается как виды собачьих (например, собаки, волки, лисы, койоты, шакалы), или представители родов Felis или взаимозаменяемо обозначается как виды кошачьих (например, львы, тигры, домашние коты, дикие коты, другие большие кошки, и других кошачьих, включая гепарды и рысь) или свиней, то есть представители родов Sus взаимозаменяемо обозначается как виды свиней.

Термины пептид и белок используются как эквиваленты в контексте настоящего изобретения. Пептид или белок для целей настоящего изобретения означает ковалентное соединение, по крайней мере, двух аминокислот посредством пептидной связи. Термин аминокислота и термин аминокислотный остаток используются в качестве эквивалентов в настоящей заявке, то есть смысл этих двух терминов одинаковый. Термины аминокислота/аминокислотный остаток и пептид/белок используются в настоящей заявке в форме максимально широкого определения. В связи с этим, термин рекомбинантный белок относится к полипептиду, который может быть получен с помощью генной инженерии и путем экспрессии в эукариотических или прокариотических системах. Кроме того, указанный термин охватывает полипептиды, полученные искусственным путем (например, с помощью твердофазного синтеза).

Как используется в данной заявке термин отличный аминокислотный остаток относится к известному аминокислотному остатку, кроме цистеина, если не указано иное. Например, указанный остаток аминокислоты может представлять собой природный аминокислотный остаток, такой как серин или изолейцин. Как используется в данной заявке, термин линейная форма относится к белкам в соответствии с настоящим изобретением, у которых отсутствует вторичная структура. Такие белки часто предполагаются как такие, которые обладают неупорядоченной конформацией, в которой единственное закрепленная взаимосвязь представляет собой соединение смежных аминокислотных остатков посредством пептидной связи.

В предпочтительном варианте осуществления (изолированный) рекомбинантный белок, как раскрыто или заявлено в данной заявке, присутствует в мономерной форме и/или линейной форме.

Как используется в данной заявке, термин лечение относится к введению (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрывается и заявлено в данной заявке, и/или соответствующих вакцин и/или иммуногенных композиций, и/или фармацевтических композиций для того, чтобы получить желательные клинические результаты, включая профилактическое и/или терапевтическое лечение.

Как используется в данной заявке, термин иммунотерапия относится к терапевтическому и/или профилактическому лечению субъекта, например, путем профилактической и/или терапевтической вакцинации.

Как используется в данной заявке, термин вектор в связи с передачей одного или более инфекционного(ых) заболевания(ий) относится к живому организму и в данной заявке попеременно используется с термином биологический вектор, биологический носитель и/или носитель заболевания, таким, как жуки, мухи, мошки, клещи и/или комары, которые питаются кровью. Кроме того, является воз

- 12 041116 можным и предпочтительным, чтобы (изолированный) рекомбинантный белок, как описано и заявлено в данном изобретении, дополнительно содержал по крайней мере один модуль-метку. То есть, является возможным и предпочтительным, чтобы один или несколько различных и/или идентичные модулейметок являлись частью (изолированного) рекомбинантного белка, как описано и заявлено в данной заявке. Модули-метки могут представлять собой короткие пептиды, которые часто включают вплоть до 20 аминокислот или функциональных групп, которые не состоят из аминокислот, такие как, например, биотин или дигоксигенин. Приемлемые модули-метки включают в себя хорошо известную и предпочтительную His-метку, содержащую последовательность гистидина в количестве от 4 до 12 или более, предпочтительно непосредственно соседние остатки гистидина, предпочтительно 5, 6 или 7 последовательных остатков гистидина. Другие приемлемые модули включают в себя НА-метку, FLAG-метку, GSTметку или Strep-метку. Несмотря на то, что метка может присутствовать в любом месте (изолированного) рекомбинантного белка, как описано и заявлено в данной заявке, в предпочтительном варианте осуществления модуль метки присутствует на (квази) N-терминальном конце и/или на С-терминальном конце (изолированного) рекомбинантного белка.

Модули метки являются полезными для изоляции (изолированных) рекомбинантных белков, как описано и заявлено в данной заявке, и дополнительно позволяют обнаруживать присутствие таких (изолированных) рекомбинантных белков in vitro или in vivo. Кроме того, модуль метки, необязательно, вместе с одним или несколькими соседними аминокислотными остатками из соседнего модуля, или линкер, который разделяет друг от друга различные модули, может быть использован для того, чтобы индуцировать специфический иммунологически определяемый сигнал (например, антитело) у субъекта, представляющего интерес, который может быть использован в качестве суррогатного маркера иммунитета и/или длительности иммунитета.

Иммунотерапии при использовании (изолированных) рекомбинантных белков, как описано и заявлено в данной заявке, вызывает специфический для антигена, предпочтительно специфический для аллергена, иммунный ответ у исследуемых субъектов, который является качественно неотличимым от естественного иммунного ответа после воздействия существующих в природе антигенов, предпочтительно аллергенов. Таким образом, антитела, связывающиеся с антигенным модулем, являются непригодными в качестве суррогатного маркера эффективности индуцированного молекулой iMAT иммунного модулирующего эффекта. Это препятствие может быть устранено путем определения уникального специфического для антигена иммунологического сигнала, полученного с помощью С-терминального и/или (квази) N-терминального модуля метки - необязательно вместе с соседними аминокислотными остатками. Следовательно, является возможным обеспечить подходящие суррогатные маркеры.

В предпочтительном варианте реализации (изолированный) рекомбинантный белок, как раскрывается и заявлено в данной заявке, дополнительно включает по крайней мере один модуль метки, предпочтительно по крайней мере одну His-метку, где такой по крайней мере один модуль метки предпочтительно представляет собой N-терминальный и/или С-терминальный конец (изолированного) рекомбинантного белка, более предпочтительно N-терминальный конец после одного остатка метионина.

Кроме того, модули (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрывается и заявлено в данной заявке, в частности по крайней мере один транслокационный модуль, по крайней мере один нацеливающий модуль и по крайней мере один антигенный модуль, могут необязательно быть разделены одним или более спейсерными модулями, расположенными между по крайней мере двумя такими модулями.

Спейсерные модули могут представлять собой, в частности, пептидные последовательности или органические молекулы. Многочисленные спейсерные молекулы, которые могут быть использованы для целей данного изобретения, являются известными в области техники. Кроме того, также является возможным использовать для целей данного изобретения спейсерные молекулы, которые могут быть усовершенствованы или раскрыты в будущем. Приемлемые спейсерные модули представляют собой, среди прочих, пептидные спейсеры, поперечно-сшивающие агенты, природные или синтетические полимеры, такие как, например, нуклеиновые кислоты, замещенные или незамещенные углеводороды и подобные им.

Соединение может осуществляться как за счет ковалентных (предпочтительно), так и нековалентных связей. Спейсерные модули имеют задачу, в частности, разделения различных модулей (изолированного) рекомбинантного белка, как описано и заявлено в данной заявке, друг от друга в пространстве таким образом, что они не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга с точки зрения их функциональных возможностей. Модули (изолированного) рекомбинантного белка для целей настоящего изобретения могут быть соединены одним или несколькими спейсерными модулями, которые могут подвергаться расщеплению с помощью химических и/или ферментативных реакций, например, протеазами. Таким образом, можно разделить модули (изолированного) рекомбинантного белка, как описано и заявлено в данном изобретении, которые соединены спейсерными модулями, друг от друга, по мере необходимости.

Однако в предпочтительном варианте реализации, в частности когда антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение от по крайней мере одного полного или частичного эпитопа, по крайней мере одного антигена, который представляет собой по

- 13 041116 крайней мере один аллерген, никаких таких дополнительных спейсерных модулей, то есть, никаких модулей между двумя или более соседними модулями такого первого, второго и/или третьего модулей не присутствует вообще.

Любое желательное изменение размещения индивидуальных модулей (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрывается и заявлено в данной заявке, является в общем случае возможным. Каждый модуль может присутствовать один или более раз в (изолированном) рекомбинантном белке. Минимальное требование представляет собой присутствие по крайней мере одного транслокационного модуля, по крайней мере одного нацеливающего модуля и по крайней мере одного антигенного модуля. Дополнительные модули, такие как модули метки, спейсерные модули и т.д., могут факультативно присутствовать, но это не является обязательным. Все модули могут присутствовать один или несколько раз в (изолированном) рекомбинантном белке, как раскрывается и заявлено в данной заявке. Если модули присутствуют более чем один раз, то они могут присутствовать в виде идентичных копий или в виде различных версий модуля в каждом случае в единственном экземпляре или более чем в одном экземпляре. Также является возможным для совершенно разных модулей одного и того же класса модулей, например, модуля His-метки и модуля биотиновой метки, присутствовать в (изолированном) рекомбинантном белке, как раскрывается и заявлено в данной заявке. Оба модуля функционально осуществляют одну и ту же задачу (модуль метки) в (изолированном) рекомбинантном белке, но не должны иметь ничего общего с точки зрения их молекулярной структуры.

В предпочтительном варианте реализации является возможным, чтобы две или более копий одного из модулей являлись присутствующими в (изолированном) рекомбинантном белке, как раскрывается и заявлено в данной заявке. То есть, могут присутствовать две или более копий идентичных или различных антигенных модулей. В качестве альтернативы, (изолированный) рекомбинантный белок может содержать два различных антигенных модуля для модулирования иммунного ответа у субъекта.

Две или более идентичные копии антигенного модуля в рекомбинантном белке могут, например, вызывать улучшенный иммунный ответ на такой релевантный антиген. Два или более различных антигенных модуля могут, например, соединяться в один (изолированный) рекомбинантный белок для того, чтобы модулировать одновременно иммунный ответ на два или более различных антигенов. Два или более различных транслокационных модулей могут использоваться в (изолированном) рекомбинантном белке, как раскрывается и заявлено в данной заявке. Например, Tat последовательность и VP22 последовательность могут служить для того, чтобы сделать транслокацию более эффективной, поскольку транслокация (изолированного) рекомбинантного белка потом осуществляется эффективно в более широком спектре различных типов клеток или типов тканей. Также является возможным, например, использовать два или более модулей метки в одном (изолированном) рекомбинантном белке, например His-метку и FLAG-метку, в соответствии с этим, например, His-метка используется для рекомбинантного белка, а, например, FLAG-метка служит для определения (изолированного) рекомбинантного белка. Является возможным также использовать два или более различных модулей в одном (изолированном) рекомбинантном белке, например, последовательность из инвариантной цепи молекулы МНС II и дополнительный нацеливающий модуль группы манноза 6-фосфата. Например, инвариантная цепь действует в качестве нацеливающего модуля на MIIC, а группа манноза 6-фосфата опосредует нацеливание на липосому. Таким образом, является возможным повышать эффективность презентации антигена или ряда различных эпитопов антигена, презентированного с помощью антиген-презентирующих клеток в целом. Кроме того, молекула iMAT в соответствии с настоящим изобретением может охватывать две или более различных инвариантных цепей, которые имеют происхождение от идентичных или различных видов, позволяя, таким образом, использовать белки в соответствии с настоящим изобретением у различных видов.

Положение отдельных модулей в (изолированных) рекомбинантных белках, как раскрывается и заявлено в данной заявке, также можно варьировать по желанию, до тех пор, пока присутствуют по крайней мере один транслокационный модуль, по крайней мере один нацеливающий модуль и по крайней мере один антигенный модуль. Также возможно для всех или некоторых из модулей в (изолированном) рекомбинантном белке, например, присутствовать не в виде линейного последовательного расположения модулей, а в виде круговой или разветвленной структуры модуля, либо в форме дендримеров, либо в виде комбинации линейной и/или разветвленной и/или круговой и/или дендритной части молекулы. Существуют ряд коммерческих поставщиков экспрессионных векторов, поставляющих специфические векторы, которые делают возможным получение круговых слитых белков с помощью таких механизмов, как, например, IMPACT™-TWIN система от New England Biolabs, Beverly, MA, США. Разветвленные модули могут быть получены путем синтеза, например, пептидов, в которых, начиная от поли-L-лизина новый остаток лизина присоединен к каждой свободной аминогруппе каждого из последующих остатков лизина. Таким образом, можно создать пептидную структуру с практически любой степенью разветвленности. Впоследствии является возможным синтезировать, например, транслокационные модули и/или нацеливающие модули на разветвленной основной структуре пептида. Дополнительные модули также могут быть соединены на линейной, круговой или разветвленной основной структуре пептида путем лигирования белка. Кроме того, можно ввести группы биотина, например, в пептид основной структуры в

- 14 041116 процессе синтеза пептида, а модули затем могут быть присоединены к этим группам биотина с помощью, например, стрептавидина, системы Strep метки или с помощью системы PinPoint™ (соответственно, IBA GmbH, Gottingen, Германия и Promega Biosciences Inc., San Louis Obispo, CA, США). Модули, присоединенные таким путем, затем соединяются с помощью нековалентных связей с основной структурой пептида.

Антигенный модуль молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением может быть выбран с помощью биоинформационного подхода, как описано иллюстративно и подробно изложено в примерах 5 и 6 в настоящей заявке. Таким образом, молекулы iMAT могут быть пригодными специфически в качестве вакцин, например, для лечения и/или предотвращения аллергических заболеваний на основании участия аллерген-специфических IgE опосредованных реакций гиперчувствительности в различных целевых органах, таких как кожа, дыхательные пути - а также желудочно-кишечный тракт, такие как атопический дерматит (AD), пищевые аллергии и/или аллергическая астма у субъектов, предпочтительно животных, более предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей.

В предпочтительном варианте осуществления, (выделенный) рекомбинантный белок относится к, содержит, предпочтительно состоит из одной или нескольких аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOs: 24-83. (Выделенные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в настоящей заявке, являются особенно полезными в способе, который, специфически, относится к терапии и/или профилактике у субъектов, таких как животные, более предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей, страдающими от аллергических заболеваний на основании участия аллергенспецифических IgE опосредованных реакций гиперчувствительности в различных целевых органах, например, кожа, дыхательные пути - а также желудочно-кишечный тракт.

В ветеринарии аллергии являются чрезвычайно важными для домашних животных.

Собаки и коты страдают от таких заболеваний, как, например, собачий атопический дерматит или кошачий атопический дерматит или кошачья астма. Собачий или кошачий атопический дерматит (AD) определяется как генетически предрасположенное воспалительное и зудящее аллергическое кожное заболевание с характерными клиническими проявлениями. Наиболее часто оно связано с IgE антителами на аллергены окружающей среды. Атопический фенотип можно наблюдать у животных с IgEопосредованным заболеванием кожи, пищевой аллергией, или состоянием, называемым неатопический дерматит (ALD). ALD определяется как зудящее заболевание кожи у собак с характерными особенностями AD, но с отрицательными тестами на IgE антитела. Кошачий атопический дерматит во многом сходен с собачьим атопическим дерматитом. Общие клинические признаки для собачьего атопического дерматита включают сезонный или несезонный зуд в анамнезе, наружный отит, рецидивирующий и хронический воспалительный дерматит, в особенности в подмышечных, паховых и сгибательных кожных поверхностях, рецидивирующие бактериальные инфекции, шелушение кожи лица и/или лизание и жевание стоп.

Этиология и патогенез AD является комплексным и в него вовлечены генетическая предрасположенность, нарушение нормальной барьерной функции кожи и иммунологические отклонения. Полагают, что животные с AD генетически предрасположены к сенсибилизации на аллергены в окружающей среде. Аллергены представляют собой белки, которые, при вдыхании или абсорбировании через кожу, дыхательные пути, или ЖКТ, вызывают аллерген-специфическую продукцию IgE. Эти аллергенспецифические молекулы IgE прикрепляют сами себя к тканевым тучным клеткам или базофилам с помощью Fcε рецепторов на этих клетках. Когда эти примированные клетки снова вступают в контакт со специфическим аллергеном, то дегрануляция тучных клеток приводит к высвобождению протеолитических ферментов, гистамина, брадикининов, и других вазоактивных аминов, что приводит к воспалению (покраснение, отек и зуд). Кожа является первичным целевым органом у собак и котов, но ринит и астма также могут встречаться в ~15% пораженных животных. Клещи известны как одна с основных причин аллергических заболеваний, таких как атопический дерматит и астма, например, у собак и котов. Общепринято, что десенсибилизирующая терапия, в которой используются вещества, вызывающие аллергические реакции, в качестве терапевтических средств для аллергических заболеваний, рассматривается как наиболее важное базовое лекарственное средство. В частности, десенсибилизирующая терапия широко используется для таких заболеваний, как поллиноз, аллергия на домашнюю пыль, и грибковые аллергии, которые индуцируются антигенами, такими как вдыхаемые аллергены, которых сложно избежать. Тем не менее, для десенсибилизирующей терапии существует риск развития побочных эффектов, в особенности, анафилактической реакции, вследствие воздействия сенсибилизирующих антигенов, следовательно, требуется введение безопасных терапевтических антигено-подобных молекул iMAT.

Что касается аллергических заболеваний, вызываемых клещами, некоторые виды были описаны как релевантные: Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Euroglyphus maynei, Dermatophagoides siboney, Dermatophagoides microceras, Lepidoglyphus destructor, Blomia tropicalis, Tyrophagus putrescentiae, Glycophagus domesticus, Acarus siro. Тем не менее, два типа клещей, Dermatophagoides pteronyssinus и Dermatophagoides farinae, были описаны как основные источники аллергенов в домашней пыли (Thomas, WR. и др., Chang Gung Med J 2004; 27:563-569). Основные клещевые аллергены были

- 15 041116 фракционированы из этих клещей.

Группа 1 и 2 аллергенов Dermatophagoides sp. индуцирует высокие титры IgE и Th2 цитокинов в 80% пациентов с аллергиями. Аллергены Der p 3, 5, 6, 7 и 8 индуцируют IgE приблизительно в 50% субъектов обычно в низких титрах. Аллергены 92/98 кДа парамиозин (группа 11) связывают IgE в 80% субъектов с аллергиями и ферменты хитиназы 98 и 60 кДа (Der f 15 и 18) связывают IgE из приблизительно 70 и 54% субъектов с аллергиями и представляют собой важные аллергены для аллергических собак (McCall С и др., Vet Immunol Immunopath 2001; 78: 231-247).

В целом, описано, что различные аллергены с окружающей среды, таких пыльца трав, деревьев, сорняков, домашней пыли, пылевые и амбарные клещи и плесень и/или споры плесени, а также эпидермальные антигены и антигены насекомых способствуют сенсибилизации собак при собачьем атопическом дерматите (Hill и др. Vet Immunol Immunopathol, 2001; 81(3-4): 169-186).

Как было описано выше, атопический фенотип также может индуцироваться пищевыми аллергиями, гиперчувствительность с различными клиническими проявлениями. Кроме изменений со стороны желудочно-кишечного тракта (например, гастроэнтерит, диарея или рвота), пищевая гиперчувствительность часто проявляется у животных в виде зудящего дерматита и/или дерматоза лица и шеи, милиарного дерматита, генерализованного образования чешуек или симметрической аллопеции. В особенности, у котов все формы эозинофильной гранулёмы могут быть последствием гиперчувствительности на определенные пищевые аллергены.

Наиболее распространенные пищевые аллергены имеют происхождение из мяса, молока, рыбы, а также из сои и/или, в самых общих чертах, консервированных продуктах и обезвоженных продуктах питания. В особенности, описано, что последние из перечисленных также вовлечены в аллергические реакции на добавки и/или амбарные клещи (Guaguere E и др. EJCAP, 2009, 19 (3), 234-241; Jackson НА, EJCAP, 2009, 19 (3), 230-233).

Существующие в настоящее время возможности терапевтического лечения в ветеринарии ограничены симптоматическим (например, кортикоиды) лечением и/или исключением обуславливающего(их) пищевого(ых) компонентов(ов). Тем не менее, следует обратить особое внимание на отсутствие отрицательного воздействия на рациональное сочетание питательных веществ в питании. В последнее время доступно питание, содержащее гидролизированные белки. Белки расщепляются - следовательно, являются менее аллергенными, что является более эффективным и хорошо переносится. Тем не менее, это питание является дорогостоящим и малоаппетитным, что может быть основным ограничением для соблюдения животными.

Аллергено-специфическая иммунотерапия для лечения пищевых аллергий у животных, предпочтительно собак и/или котов, еще не применяется до настоящего времени.

В дальнейшем варианте осуществления, (выделенные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в настоящей заявке, являются особенно полезными в способе, который, в частности, относится к терапии и/или профилактике у котов, страдающих от аллергического воспаления и/или обструкции дыхательных путей (аллергическая астма).

У котов самопроизвольно развивается эозинофильное воспаление дыхательных путей и гиперреактивность дыхательных путей, которая очень сходна с аллергической астмой у человека, то есть кошачья аллергическая астма представляет собой хронической воспалительное нарушение нижних дыхательных путей, которое может проявляться острыми, угрожающими для жизни клиническими симптомами.

Типичное лечение включат только паллиативное лечение (например, бронходилятаторы и/или кортикостероиды), но в настоящее время отсутствует лечение, направленное на причину заболевания. В некоторых пилотных исследованиях под руководством Carol Reinero разрабатывали направленную аллерген-специфическую иммунотерапию на модели у животных индуцированной бермудской травой аллергической астмы у котов. Кошачья аллергическая астма является комплексным заболеванием, но, несомненно, воздействие переносимых воздухом аллергенов играет решающую роль в этиологии заболевания. Клинической ремиссии можно достичь путем устранения воздействия аэроаллергенов. Полагают, что основные антигены, вовлеченные в запуск кошачьей аллергической астмы, до сих пор не были идентифицированы. Различные потенциальные агенты присутствуют в среде обитания кошек, например пыльца, плесень, пыль с гигиенического наполнителя для кошачьего туалета, парфюмерные изделия, комнатные освежители воздуха, дезодоранты для ковровых покрытий, лак для волос, аэрозольные очистители или сигаретный дым. При скрининге с использованием сыворотки или интрадермальных кожных тестов, аллергизованные в естественных условиях коты, которые содержатся в доме, имеют реакционно-способные IgE на многие аллергены, аналогичные указанным при аллергической астме у людей, то есть в основном на домашние пылевые и амбарные клещи и/или пыльцу (Prost С, Rev Fr Allergol Immunol Clin, 2008, 48 (5), 409-413).

В дальнейшем варианте осуществления, (выделенные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в настоящей заявке, являются особенно полезными в способе, который специфически относится к терапии и/или профилактике у котов и/или собак, страдающие от AD, вызванного укусами блох (FAD). FAD является одним из наиболее тяжелых кожных аллергий, вызываемых нападениями блох у собак и котов. FAD может иметь проявления как по типу гиперчувствительности немедленного типа и по типу

- 16 041116 отсроченных реакций гиперчувствительности. Типично реакция гиперчувствительности немедленного типа у животного, чувствительного к FAD, включает образование аллергической папулы в месте укуса блохи. Такие аллергические папулы могут превращаться в папулу с чешуйкой, что характерно для реакций гиперчувствительности замедленного типа. Реакции гиперчувствительности на укусы блох могут встречаться у генетически предрасположенных животных, а также у животных, сенсибилизированных путем предварительного подвергания укусам блок. Кроме того, укусы блох могут вызывать связанные с расцарапыванием вторичные инфекции вследствие воспалительного раздражения эритем, папул, чешуек и аллопеции хозяина. В ранее опубликованных работах было обнаружено, что домашние животные иногда становятся десенсибилизированными на укусы блох, хотя ранее у них была аллергия на эти укусы блох. Таким образом, кроме уничтожения блох, чрезвычайно важной проблемой становится облегчение дистресса животных. Существующие в настоящее время терапии для этого заболевания включают десенсибилизирующцю терапию или использование некоторых типов фармакологического воздействия. Тем не менее, каждый из этих типов подходов имеет определенные недостатки. Например, антигистаминные лекарственные средства могут вызывать сонливость, сухость во рту, затруднения при мочеиспускании и запоры; в то время как классическая десенсибилизирующая терапия может вызывать угрожающий жизни анафилактический шок. Другими недостатками этих терапий являются высокая возможность рецидивирования и потребность в длительном лечении. Таким образом, необходимы новые, терапевтические подходы и их следует разрабатывать для преодоления нежелательных побочных реакций. Эффективное лечение FAD является очень сложным, или практически недостижимым. FAD поражает около 15% котов и собак в эндемических областях распространения блох. В географическом регионе для эффективной борьбы с блохами необходимо лечить всех животных. Одно из терапевтических подходов, предложенное исследователями, включает десенсибилизацию животных, используя аллергены блох. Тем не менее, для такого лечения необходимы надежные, точно определенные препараты аллергенов блох. Цельные препараты антигенов блох используются для диагностики и десенсибилизации животных с FAD. Коммерчески доступные цельные экстракты блох, тем не менее, содержат только незначительную часть белков слюны и, таким образом, являются непредсказуемыми относительно их содержания специфических аллергенов и, следовательно, имеют ограниченную полезность. В известном из уровня техники патенте США 7629446 а также в McDermott MJ и др. (Molecular Immunology 2000, 37: 361-375) описано открытие аллергена Cte f 1 в качестве основного аллергена при FAD. В этой публикации, они описали клонирование кДНК и охарактеризовали белок слюны блох, Cte f 1, основной аллерген для аллергии собак и котов на блохи. Нативный Cte f 1 имеет рассчитанный молекулярный вес 18 кДа и pI 9,3. Массспектрометрический анализ указывает на то, что в нативной молекуле отсутствуют постртрансляционные модификации и что все 16 цистеинов задействованы во внутримолекулярные дисульфидные связи. Тем не менее, в той же публикации, авторы описаны несколько изоформ рекомбинантного белка. 16 цистеинов в секретируемом белке приводит к появлению этих изоформ, что делает очитку, и, следовательно, приготовление такого продукта чрезвычайно сложной или даже невозможной в соответствии с GMP.

В подопытных собак, экспериментально сенсибилизированных на укусы блох, Cte f 1 представляет собой основной аллерген. Используя продуцируемый Е. coli rCte f 1 в качестве антигена в интрадерамальном кожном тесте и в твердофазном ELISA, IgE может быть обнаружен в 100% этих экспериментально сенсибилизированных FAD собак. Дополнительно, конкурентный ELISA, осуществляемый с использованием сыворотки из 14 сенсибилизированных собак продемонстрировал, что rCte f 1, продуцируемый в трех различных экспрессионных системах (Е. coli, P. pastoris и инфицированные бакуловирусом клетки насекомых) может ингибировать приблизительно 95% связывания антигенспецифических IgE с нативным Cte f 1.

Терапевтические возможности иммунотерапевтических подходов, содержащих Cte f 1, был продемонстирован J. Jin и др. (Jin J. и др. Vaccine 28 (2010) 1997-2004). Они описали, что одновременная совместная иммунизация с помощью ДНК вакцины и ее когнатного кодируемого белкового антигена (Cte f 1) проявляет потенциал защищать животных от FAD на модели у мышей. Кроме того, в их исследовании, они клинически тестировали этот протокол для лечения подтвержденных FAD у котов после нападения клопов. Они представили данные, указывающие на терапевтическое улучшение дерматита у этих FAD котов после двух совместных иммунизаций.

Молекулы iMAT, содержащие модицифированную Cte f 1 последовательность с замещенными цистеинами на другие аминокислотные остатки, могут включаться в молекулу iMAT в качестве аллергенного модуля совместно с либо кошачьей или собачьей инвариантной цепью для достижения оптимизированного специфического для вид иммуно-модулирующего эффекта. Неожиданно эти молекулы (I) предоставляют возможность эффективного получения рекомбинантного белка в подходящих экспрессионных системах, (II) имеют существенно уменьшенный риск безопасности, поскольку эффекторные клетки, а также тучные клетки активируются при значительно более высоких концентрациях по сравнению с немодифицировванным Cte f 1 и (III) индуцируют длительный иммунологический эффект и продолжительное клиническое улучшение только после трех инъекций.

В дальнейшем варианте осуществления (выделенные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в настоящей заявке, являются особенно полезными в способе, который специфически относится к

- 17 041116 терапии и/или профилактике у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, страдающих от инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями.

Грамотрицательная бактерия Campylobacter является наиболее распространенной причиной гастроэнтерита у домашних животных, например собак, котов, свиней, жвачных. Клинические симптомы в большинстве случаев более тяжелые у молодых млекопитающих. Кроме энтерита также описаны выкидыши и бесплодие у различных видов. Инфекция проникает в организм пероральных путем - для проникновения бактериям необходимо преодолеть защитные механизмы хозяина с экспрессией различных колонизирующих и вирулентных детерминант. Многие из них являются антигеннными поверхностными или наружными белками мембран, их взаимодействие, например, с эпителиальными клетками желудочно-кишечного тракта является существенно важным для колонизации, то есть инфицирования хозяина. Для решения этой медицинской проблемы по меньшей мере один антигенный модуль в кампилобактериозном специально выведенном (выделенном) рекомбинантном белке, как описано и заявлено в настоящей заявке, может быть выбран из антигенов, которые имеют происхождение из видов Campylobacter, например флагеллина, поверхностно-расположенных белков (CadF и РЕВ1) или других поверхностных белков. Улучшенные молекулы МАТ могут быть пригодны специфически в качестве вакцин, например, для лечения и/или предотвращения кампилобактериоза. Лечение в соответствии с настоящим изобретением может включать введение молекулы iMAT потомкам и/или также может включать лечение беременной самки.

В дальнейшем варианте осуществления, (выделенные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в настоящей заявке, являются особенно полезными в способе, который специфически относится к терапии и/или профилактике у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, страдающих от инфекционных заболеваний, вызываемых вирусами.

Например, вирус Западного Нила (WNV) представляет собой вирус с положительной одноцепочечной РНК, который передается москитами и сгруппирован в пределах серокомплекса вируса японского энцефалита Flavivirus в семействе Flaviviridae. WNV является возбудителем синдрома заболевания, также известного под названием лихорадки Западного Нила. Птицы являются природным источником, и WNV поддерживается в природе в цикле передачи москиты - птицы - москиты. Тем не менее, в качестве чувствительных описаны люди, лошади, собаки, коты, а также жвачные животные. Несмотря на то, что большинство WNV инфекций остаются клинически латентными - WNV является потенциальным нейроинвазивным вирусом, он может вызывать менингит или энцефалит. У животных WNV часто остается нераспознанным, но животные могут быть подвержены эвтаназии вследствие тяжелых неврологических симптомов, вызываемых WNV - включая парез, атаксию, опрокидывание и мышечную фасцикуляцию, в то время как у других проявляется от легкого до тяжелого полиэнцефаломиелита.

В дальнейшем варианте осуществления (выделенные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в настоящей заявке, являются, в частности, полезными в способе, специфически направленном на предотвращение передачи инфекционных заболеваний у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, с помощью векторов, например насекомых, которые питаются кровью, мух, мошек, клещей и/или комаров.

Патогены доставляются в кожу хозяина, который представляет собой млекопитающее, вместе со слюной членистоногих, которая содержит широкий спектр биологически активных молекул. Эти компоненты слюны способны изменять гемостаз и иммунные реакции и могут осуществлять свой вклад в способность патогена вызывать инфекцию. Наличие инфекционных микроорганизмов в слюнных железах членистоногих, которые сами питаются кровью, изменяет состав слюны, например, вызывает изменения в концентрации, например, апиразы или антитромбиназы у инфицированных москитов. Векторассоциированные или компоненты слюны, например, могут изменять активность сосудов и/или модулировать иммунный ответ хозяина и являться чрезвычайно важными для передачи инфекционных заболеваний. Вакцинация хозяина от компонентов слюны членистоногих может препятствовать передаче вируса, как показано для белков слюны москитов и передачи видов лейшмании. Тем не менее, до настоящего времени эти вакцины не прошли доклинических испытаний (WHO PD-VAC 2014 - Статут разработки и исследования вакцин для вакцин от Leishmaniasis).

Антигены слюны членистоногих являются хорошо пригодными для применения в антигенном модуле молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением и могут применяться специфически в качестве вакцин для активации иммунной системы хозяина для предотвращения передачи инфекционных патогенов с помощью векторов, например, вирусов, грибов и/или паразитов и/или их стадий паразитарной инкубации у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей.

В дальнейшем варианте осуществления (выделенные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в настоящей заявке, являются особенно полезными в способе, который, специфически, относится к терапии и/или профилактике у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, страдающих от инфекционных заболеваний, вызываемых грибами.

Дерматомикоз или лишай представляет собой грибковую инфекцию волос и поверхностных слоев ороговевших клеток кожи, которая возникает у животных и человека. Несколько видов рода Microsporum

- 18 041116 или рода Trichophyton, принадлежащих к группам зоофильных и геофильных дерматофитов, могут вызывать клинические инфекций у млекопитающих. Разнообразные поверхностные антигены грибов и/или их споры являются приемлемыми для того, чтобы использоваться в антигенном модуле молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением и могут применяться специфически в качестве вакцин, например, для лечения и/или предотвращения дерматофитоза у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей.

В дальнейшем варианте осуществления (выделенные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в настоящей заявке, являются особенно полезными в способе, который, специфически, относится к терапии и/или профилактике у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, страдающих от инфекционных заболеваний, вызываемых паразитами.

Паразиты, поражающие млекопитающих, являются повсеместно распространёнными и клинически значимыми по всему миру. Основными паразитарными угрозами для жвачных, свиней, собак и/или котов, являются, например, Cooperia, Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Dictyocaulus, Metastrongylus. О повышении уровня устойчивости к гельминтам у паразитов сообщается во всем мире. Для простейших, например, Cryptosporidium несколько препаратов последовательно ингибируют заражением паразитами и/или размножение в организме-хозяине. Главным образом поражаются новорожденные или молодые млекопитающие и исход зависит от врожденных и адаптивных иммунных ответных реакций.

Антигены, имеющие происхождение от взрослых паразитов, а также стадий паразитарной инкубации, являются еще одним примером в антигенном модуле молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением и могут быть полезными специфически в качестве вакцин, например, для лечения и/или предотвращения паразитарной инфекции у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей.

Лечение в соответствии с настоящим изобретением может включать введение молекулы iMAT потомкам и/или также может включать лечение беременной самки.

В особенности, в случае модуляции иммунного ответа у видов собак, кошек, крупного рогатого скота, овей, коз или свиней по меньшей мере один нацеливающий модуль предпочтительно представлять собой соответствующую инвариантную цепь.

В предпочтительном варианте осуществления, по меньшей мере, один нацеливающий модуль представляет собой инвариантную цепь собаки в соответствии с SEQ ID NO: 2 или 4. В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один нацеливающий модуль представляет собой кошачью инвариантную цепь в соответствии с SEQ ID NO: 3 или 5. В предпочтительном варианте осуществления изобретения (изолированный) рекомбинантный белок, как описано и заявлено в данной заявке, присутствует в мономерной форме, поскольку, например, рекомбинантные аллергены имеют тенденцию к образованию агрегатов, в частности, если получены при использовании телец включения. Путем замены по крайней мере одного, предпочтительно всех цистеиновых остатков во всей последовательности (изолированного) рекомбинантного белка, предпочтительно путем замены на серин, лейцин, изолейцин, аргинин, метионин и/или аспарагиновую кислоту, можно предотвратить образование межмолекулярных дисульфидных связей, устраняя, таким образом, любую агрегации, в частности, любое неестественное образование межмолекулярных и/или внутримолекулярных связей. То есть, (изолированный) рекомбинантный белок, будучи полностью лишенным остатков цистеина, не подвергается агрегации. Следовательно, такой белок легко экспрессируется и демонстрирует улучшенные нацеливание и МНС презентацию.

Кроме того, такие свободные от цистеина варианты, например, аллергены, в которых остатки цистеина в аминокислотной последовательности аллергенов дикого типа были мутированы по отдельности или в комбинациях, обладают пониженной IgE реактивностью по сравнению с соответствующими аллергенами дикого типа, и в то же время существенно сохраняют реакционную способность по отношению к Т-лимфоцитам и, таким образом, являются гипоаллергенными.

Таким образом, изобретение относится к таким гипоаллергенным вариантам аллергенов, вызывающим, например, аллергии на укус блох; к определенным пищевым компонентам и/или атопического дерматита и/или аллергического воспаления и/или обструкции дыхательных путей у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, где в вариантах остатки цистеина аллергенов были мутированы по отдельности или в комбинации.

Кроме того, наличие модуля метки для разделения белков в образце, включающем в себя молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением, например, при использовании твердого носителя на основе заряженного цинка или кобальта, дополнительно улучшает возможность получения гибридных белков без агрегации в процессе очистки. Как правило, модуль метки включает в себя полигистидиновую метку из пяти - шести последовательных остатков гистидина.

(Выделенные) рекомбинантные белки, как описано и заявлено в настоящей заявке, являются полезными в фармацевтической композиции. Например, (выделенные) рекомбинантные белки предназначены для применения в вакцине. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает вакцинные композиции, содержащие один или несколько (выделенных) рекомбинантных белков, как описано и заявлено в настоящей заявке. Такая вакцинная композиция может использоваться терапевтически и/или профилакти

- 19 041116 чески у животных, более предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей, страдающими от аллергических заболеваний, на основании участия аллерген-специфических IgE опосредованных реакций гиперчувствительности в различных целевых органах, таких как кожа, дыхательная и желудочнокишечная системы; или такая вакцинная композиция может использоваться терапевтически и/или профилактически у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, страдающих от инфекционных заболеваний, индуцированных патогенами, например, вирусами, грибами и/или паразитами и/или их стадиями паразитарной инкубации. Дополнительно способ может быть использован не только против таких патогенов, но также может активировать иммунную систему хозяина, чтобы предотвратить передачу заболевания с помощью векторов, например насекомых, которые питаются кровью, мух, мошек, клещей и/или комаров.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается вакцина для субъектов, таких как животные, более предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей, для лечения и/или предотвращения атопического дерматита и/или аллергической астмы, вызываемого в ответ, например, на воздействие клещей dermatophagoides. В дальнейшем варианте осуществления настоящего изобретения, обеспечивается вакцина для субъектов, таких как животные, более предпочтительно котов, но исключая лошадей, для лечения и/или предотвращения аллергической астмы, которая вызвана ответом, например, на плесень (грибы и/или их споры), пыльцу, домашнюю пыль или амбарных клещей (и/или их фекалий).

В дальнейшем варианте осуществления настоящего изобретения, обеспечивается вакцина для субъектов, таких как животные, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, для лечения и/или предотвращения инфекционных заболеваний, которые вовлекают, например, роды Campylobacter, Dirofilaria, Ehrlichia, Leishmania, Trypanosoma, Borrelia, Orthobunyavirus, Orbivirus, Flavivirus, Rotavirus, Coronavirus, Trichophyton, Microsporum; других гельминтов, таких как Cooperia, Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Dictyocaulus, Metastrongylus; и/или простейших с желудочнокишечными проявлениями, таких как Eimeria, Isospora, Cryptosporidium, Giardia - в случае паразитов также могут применяться антигены, которые имеют происхождение из стадий паразитарной инкубации. Дополнительно, может обеспечиваться вакцина для активации иммунной системы хозяина для предотвращения передачи заболеваний с помощью векторов, например, относящихся к семействам Culicidae, Ceratopogonidae, Phlebotominae Ixodidae и/или Cimicidae и/или другими насекомыми, которые питаются кровью.

Фармацевтическая композиция, например, в форме вакцины, на основании (выделенных) рекомбинантных белков предпочтительно предназначена для сублингвального введения, подкожной и/или внутрикожной инъекции, инъекции в лимфатические узлы и/или для введения через слизистые оболочки, в особенности, слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта или дыхательной системы.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, фармацевтические композиции вводят парентерально.

Молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением могут использоваться как фармацевтический препарат или в качестве вакцины для модификации, например, аллергических нарушений. Например, атопический дерматит и/или аллергическую астму можно лечить с помощью таких молекул iMAT.

Низкие количества (от 1 до 1000 мкг, относящиеся к весу исключительно одного или более антигенных модулей) рекомбинантных молекул iMAT, содержащих аллергены атопического дерматита и/или аллергической астмы, имеющие происхождение от клещей рода dermatophagoides, например, которые вводят 1-5 раз подкожно, интрадермально или непосредственно в лимфатический узел, индуцируют сильный и длительный иммунный ответ у котов и/или собак, что приводит к предотвращению заболевания и/или уменьшению клинических симптомов.

В одном предпочтительном варианте осуществления молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением вводят в комбинации, по крайней мере, с одним адъювантом. Адъювант включает в себя, но не ограничиваются такими, как один или несколько из следующих: квасцы, БЦЖ, гидроксид алюминия, фосфат алюминия, фосфат кальция, липидные эмульсии, липиды или полимерные нано- или микросферы, мицеллы, липосомы, сапонин, липид А или дипептид, бактериальные продукты, хемокины, цитокины и гормоны, хитозан, крахмал, альгинат, производные целлюлозы (например, этилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза), нуклеиновые кислоты или конструкции нуклеиновой кислоты. Один или более из этих компонентов могут быть добавлены для усиления или модификации иммунного ответа. В качестве альтернативы, молекулу iMAT можно вводить без адъюванта, либо в водной форме.

Молекулы iMAT можно вводить в дозе от приблизительно 1 до 1000 мкг (эта и последующие дозы относятся к весу исключительно одного или более антигенного модуля) и более предпочтительно в дозе от приблизительно 10 до приблизительно 100 мкг и еще более предпочтительно в дозе от приблизительно 20 до приблизительно 50 мкг, хотя оптимальная доза может варьировать в зависимости от вводимого антигена, предпочтительно аллергена, веса субъекта, иммунной системы субъекта и так далее. Эффективное лечение во многих случаях может быть достигнуто при использовании одного введения. В некоторых вариантах осуществления обработка включает в себя от 1 до 15 введений. В предпочтительных

- 20 041116 вариантах осуществления обработка включает в себя от 1 до 5 введений и более предпочтительно от 1 до введений. Для начальных этапов лечения введения могут быть периодическими, например, в течение курса нескольких дней, один или два раза в месяц или год, или несколько раз в год. Для поддержания иммунного ответа введения могут осуществляться с интервалом от нескольких месяцев до нескольких лет.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения (изолированные) рекомбинантные белки, как раскрывается и заявлено в данной заявке, являются предназначенными для введения в лимфатические узлы. В процессе непосредственного введения в лимфатический узел соответствующий лимфатический узел может быть визуализирован во время процедуры инъекции, например, с помощью ультразвука, для того, чтобы контролировать местоположение иглы и изменения в лимфатических узлах, такие, как опухание. Инъекции в нижнечелюстные, подмышечные, паховые и/или подколенные лимфатические узлы является предпочтительными благодаря легкости ультразвукового определения местоположения и инъекции.

В данной области техники известно, что некоторые идентифицированные белки из клещей в фекалиях и из тел цельных клещей индуцируют IgE реактивность и патологические кожные реакции и реакции дыхательной системы у собак и/или котов [Allergome (www.allergome.org)]. Таким образом, полагают, что лечение может быть успешным только в том случае, если большинство релевантных аллергенов включены в лекарственное средства для специфической иммунотерапии. Тем не менее, неожиданно только 1, 2, 3 или 4 таких молекул iMAT в соответствии с настоящим изобретением, каждая из которых содержит различные антигенные модули, например, клещей или мозаичной конструкции эпитопов является достаточным для индукции иммуномодуляции и/или клинического улучшения у заболевших субъектов, если такие молекулы iMAT инъецируют 1-5 раз подкожно, интрадермально и/или непосредственно в лимфатический узел.

В предпочтительном варианте осуществления, используется одна молекула iMAT и ее достаточно для индукции терапевтического эффекта и/или предотвращения развития аллергенспецифических IgE опосредованных реакций гиперчувствительности в различных целевых органах, таких как кожа, дыхательные пути и/или желудочно-кишечная система, например, у животных, более предпочтительно собак и/или котов, но исключая лошадей. Предотвращение и/или лечение инфекционных заболеваний и/или предотвращение передачи инфекционных заболеваний с помощью векторов может осуществляться у животных, предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей.

В другом предпочтительном варианте осуществления, используется комбинация 2, 3 или 4 молекул iMAT с помощью одновременного, последовательного и/или хронологически смещенных совместных введений.

В предпочтительном варианте осуществления используется одна молекула iMAT и ее достаточно для индукции терапевтического эффекта и/или предотвращения и/или предотвращения передачи инфекционных заболеваний у животных, более предпочтительно жвачных, свиней, собак и/или котов, но исключая лошадей, например, индуцированных вирусами, грибами и/или паразитами и/или их стадиями паразитарной инкубации и/или передачи таких инфекционных заболеваний, например, с помощью насекомых, которые питаются кровью, мух, мошек, клещей и/или комаров.

В другом предпочтительном варианте осуществления, используется комбинация 2, 3 или 4 молекул iMAT с помощью одновременного, последовательного и/или хронологически смещенных совместных введений.

В зависимости от термодинамической оценки (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрыто или заявлено в данной заявке, его стабильность зависит от мутации цистеина, в частности, замены различным(и) аминокислотным(и) остатком(ами). Например, это может быть замена Cys на Ser. Однако стабильность может быть выше при использовании отличного от Ser аминокислотного остатка для того, чтобы достичь желаемой стабильности и растворимости. То есть, в то время как первый выбор может представлять собой замену цистеина на Ser, в случае нестабильности аминокислотный остаток, отличный от Ser должен заменить Cys.

Для того чтобы выбрать аминокислотные остатки для стабилизации в качестве замены для остатков цистеина в целевых последовательностях, выбирают трехэтапный подход:

1. Моделирование третичной структуры целевого белка, включая терминальные гексагистидиновые метки, последовательность iMAT и первичную аминокислотную последовательность белка, который представляет интерес. Моделирование может осуществляться при использовании нативной последовательности и включать замены цистеина.

2. Итеративное определение стабильности белка на основе точечных замен, таких, как замена остатка цистеина отличным аминокислотным остатком, например, Ser и/или Ile, и категоризация для определения стабилизирующих замен путем анализа всех доступных трехмерных структур.

3. Повторное моделирование стабилизированной структуры и подтверждение стабильности путем повторения этапов 1 и 2.

Трехмерные белковые структуры имеют решающее значение для понимания функции белка на молекулярном уровне и представляют большой интерес для рациональной разработки многих различных

- 21 041116 типов биологических экспериментов, таких как сайт-направленный мутагенез. Тем не менее, количество структурно охарактеризованных белков является малым по сравнению с числом известных белковых последовательностей. Можно идентифицировать гомологичный белок с известной структурой (матрица) для данной последовательности белка (целевая последовательность). В этих случаях моделирование гомологии оказалось способом выбора для создания надежной 3D-модели белка из его первичной аминокислотной последовательности. Модель построения гомологии включает четыре основных этапа: (1) идентификация структурной(ых) матрицы(матриц), (2) выравнивание целевой последовательности и структуры (структур) матриц (матрицы), (3) построение модели и (4) качественная оценка модели. Эти этапы могут повторяться до достижения удовлетворительного результата моделирования. В тех случаях, когда точная модель гомологии не может быть определена, используются вычислительные подходы для определения структуры белка из первичной структуры (аминокислотные последовательности). De novo или ab initio способы основываются на физических принципах и пытаются имитировать процесс сворачивания. Такие способы должны исследовать большое количество конформаций и требуют очень точных энергетических функций для идентификации структур в глобальном минимуме свободной энергии. Многие способы используют комбинацию этих описанных принципов. Доступность вычислительных средств обеспечивает достаточно точные оценки влияния аминокислотных замен на стабильность белков и имеет решающее значение в широком диапазоне применений. В частности, такие инструменты имеют потенциал стимулирования и поддержания белковой инженерии и конструкторских проектов, посвященных созданию модифицированных белков. Стабильность белка можно рассматривать с точки зрения термодинамической стабильности белка, которая быстро и обратимо развертывает и свертывает белок. В этих случаях стабильность белка представляет собой разницу в свободной энергии Гиббса между свернутым и развернутым состояниями. Единственными факторами, влияющими на стабильность, являются относительные свободные энергии свернутого и развернутого состояний. Чем больше и более позитивна разница свободной энергия фолдинга, тем более стабильным является белок для денатурации. Разница свободной энергии фолдинга, как правило, является небольшой, порядка 5-15 ккал/моль для глобулярного белка. Тем не менее, с другой стороны, стабильность белка можно рассматривать как свойство белка, чтобы выдерживать высокие температуры или условия растворения. Это связано с термодинамической стабильностью, а также с обратимостью или необратимостью свертывания/развертывания (кинетическая стабильность).

Для прогнозирования термодинамических изменений стабильности, вызванных точечными заменами в белках, несколько различных подходов могут быть применены для изучения воздействия таких замен на структуру и функции белков [Pires DE и др., Bioinformatics 2014, 30(3): 335-342]. Такие подходы могут быть широко классифицированы на те, которые стремятся понять влияние замен в аминокислотной последовательности белка самого по себе, и те, которые используют обширную структурную информацию. Подходы, основанные на структуре, как правило, пытаются спрогнозировать либо направление изменения стабильности белка при заменах, либо фактическую величину свободной энергии (AAG).

Результаты для каждого конкретного белка и его соответствующих моделей подвергаются статистическому анализу с точки зрения количества возникновений специфических замен при использовании балльной системы, которая нивелирует замену, которая основывается на возникновениях в используемых моделях и изменении свободной энергии стабильности белка (AAG), определяя тем самым наиболее дестабилизирующие остатки (если таковые имеются) в структуре, в которую они вводятся, и возможные замены. Показатель рассчитывается путем определения самой низкой AAG (AAG < 0) в каждом положении, которое представляет интерес, в каждой модели и назначения соответствующих линейных значений и кумулятивных значений AAG для каждого потенциального положения замены, и результаты потом оцениваются для определения согласованности между моделями. Поскольку расчетные модели белка обладают различными свойствами (вероятность предсказания правильной трехмерной структуры), весовой коэффициент может применяться для того, чтобы установить приоритеты результатов, полученных от более точных моделей. Остаток, который имеет значимое (на основе AAG) дестабилизирующее влияние (если таковой имеется) заменяется; получают новые модели и повторно подвергают их итеративному анализу до тех пор, пока не будет достигнуто устойчивое состояние. Кроме того, генерируемые модели оцениваются путем анализа xyz координат с помощью анализа главного компонента для определения потенциальных структурных неправильных фолдингов из-за замены аминокислот в специфических положениях.

Еще в одном дополнительном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения способа идентификации аминокислотных замен в предварительно определенной аминокислотной последовательности, позволяющего осуществлять стабилизацию такой предварительно определенной аминокислотной последовательности, который включает следующие этапы:

(I) моделирование трехмерной/третичной структуры целевой предварительно определенной аминокислотной последовательности;

(II) итеративное определение стабильности белка на основе точечных замен, таких как замена остатков цистеина отличным аминокислотными остатками, предпочтительно остатками серина и/или изо-

- 22 041116 лейцина, и категоризации на основе изменений свободной энергии стабильности белка (AAG) для определения стабилизирующих замен путем анализа всех доступных трехмерных/третичных структур, (III) повторное моделирование замещенной трехмерной/третичной структуры аминокислотной последовательности и подсчет ее стабильности путем повторения (II) и (III) до тех пор, пока не будет достигнуто стабильное состояние;

Еще в одном дополнительном аспекте задача, которая лежит в основе изобретения, была неожиданно решена путем обеспечения (изолированного) рекомбинантного белка, как раскрыто или заявлено в данной заявке, где полная или частичная аминокислотная последовательность стабилизирована с помощью способа идентификации аминокислотных замен в предварительно определенной аминокислотной последовательности, как раскрыто или заявлено в данной заявке (см. пример 5, а также пример 6 в данной заявке).

Последовательности

Следующие белковые последовательности подробно описаны и раскрыты таким образом в настоящем изобретении (ак или АК является сокращением для аминокислот):

SEQ ID NO: 1 относится к подходящей минимальной аминокислотной последовательности для одного транслокационного модуля в соответствии с настоящим изобретением, который все еще остается функциональным, то есть способен эффективно способствовать проникновению в клетку -> ТАТ последовательность;

SEQ ID NOs: 2-5 Инвариантные цепи (полные последовательности и ПОак):

SEQ ID NO: 2 относится к полной аминокислотной последовательности инвариантной цепи собаки;

>gi|545496086|Canis_lupus_familiaris|XP_536468.5|

ПРЕДСКАЗАНО: HLA класса II гистосовместимости гамма цепь антитена изоформа XI [Canis lupus familiaris]

SEQ ID NO: 3 относится к полной аминокислотной последовательности инвариантной цепи кошки;

>gi|41094965 l|Felis_catus|XP_003981534.11 ПРЕДСКАЗАНО: HLA класса II гистосовместимости гамма цепь антитена изоформа XI [Felis catus]

SEQ ID NO: 4 относится к первым 110 ак аминокислотной последовательности инвариантной цепи собаки;

SEQ ID NO: 5 относится к первым 110 ак аминокислотной последовательности инвариантной цепи кошки;

SEQ ID NO: 6 относится к N-терминальному маркеру из 22 ак

SEQ ID NOs: 7-13	Аллергены, полные последовательности:
SEQ ID NO: 7	относится к полной аминокислотной последовательности Der f 1 аллергена; >Q58A71 Der f 1 аллерген препрофермент Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли)
SEQ ID NO: 8	относится к полной аминокислотной последовательности Der f 2 аллергена; >Q00855 аллерген Der f 2 группа 2 клеща (Аллерген Der f II) (аллерген Der f 2) Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли)
SEQ ID NO: 9	относится к полной аминокислотной последовательности Der f 23 аллергена; >A0A088SAW7 Der f 23 аллерген Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли)

- 23 041116

SEQ ID NO: 10 относится к полной аминокислотной последовательности

Der f 18р аллергена; >Q86R84 60 кДа аллерген

Der f 18р Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли)

SEQIDNO:11 относится к полной аминокислотной последовательности Der f 15 аллергена;

>Q9U6R7 98 кДа HDM аллерген (Der f 15 аллерген) (Группа 15 аллерген Der f 15) Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли)

SEQ ID NO: 12 относится к полной аминокислотной последовательности аллергена Zen 1 белка;

>I7HDR2 Zen 1 белок Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли)

SEQ ID NO: 13 относится к полной аминокислотной последовательности Cte f 1 аллергена;

>Q94424 Антиген слюны 1 (FS-I) (аллерген Cte f 1) Ctenocephalides felis (Блоха кошачья)

SEQ ID NOs: 14-20 Аллергены, IMAT Формы (короткие):

SEQ ID NO: 14

SEQ ID NO: 15

SEQ ID NO: 16

SEQ ID NO: 17

SEQ ID NO: 18

SEQ ID NO: 19

SEQ ID NO: 20 относится к iMAT Форме (короткой) последовательности Der f 1 аллергена; относится к iMAT Форме (короткой) последовательности Der f 2 аллергена; относится к iMAT Форме (короткой) последовательности Der f 23 аллергена; относится к iMAT Форме (короткой) последовательности Der f 18р аллергена; относится к iMAT Форме (короткой) последовательности Der f 15 аллергена; относится к iMAT Форме (короткой) последовательности Zen 1 белка аллергена; относится к iMAT Форме (короткой) последовательности Cte f 1 аллергена а;

аминокислотной аминокислотной аминокислотной аминокислотной аминокислотной аминокислотной аминокислотной

- 24 041116

SEQ ID NOs: 21-23 Аллергены из Гибридов 1, 2, и 3 - IMAT Формы (короткие):

SEQ ID NO: 21 относится к iMAT Форме (короткой) Гибрид 1 аллерген

SEQ ID NO: 22 относится к iMAT Форме (короткой) Гибрид 2 аллерген

SEQ ID NO: 23 относится к iMAT Форме (короткой) Гибрид 3 аллерген

SEQ ID NOs: 24-44 iMAT для кошек (с N-терминальным или С-
SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:	24 25 26	терминальным Гекса-Гистидином или без Гекса-
Гистидина /Метионина (1МАТ_Чистый)):	с с	N- С-
относится к Der f 1 молекуле iMAT (кошки)
терминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
относится к Der f 1 молекуле iMAT (кошки)
терминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
относится к Der f 1 молекуле iMAT (кошки) без метки;
SEQ ID NO:	27	относится к Der f 2 молекуле iMAT (кошки) терминальной Гекса-Гистидиновой меткой;	с	N-
SEQ ID NO: SEQ ID NO:	28 29	относится к Der f 2 молекуле iMAT (кошки) терминальной Гекса-Гистидиновой меткой; относится к Der f 2 молекуле iMAT (кошки) без метки;	с	С-
SEQ ID NO:	30	относится к Der f 23 молекуле iMAT (кошки) терминальной Гекса-Гистидиновой меткой;	с	N-
SEQ ID NO: SEQ ID NO:	31 32	относится к Der f 23 молекуле iMAT (кошки) с терминальной Гекса-Гистидиновой меткой; относится к Der f 23 молекуле iMAT (кошки) без метки;	С-
SEQ ID NO:	33	относится к Der f 18р молекуле iMAT (кошки) терминальной Гекса-Гистидиновой меткой;	с	N-
SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 35	относится к Der f 18р молекуле iMAT (кошки) с терминальной Гекса-Гистидиновой меткой; относится к Der f 18р молекуле iMAT (кошки) без метки;	С-

- 25 041116

SEQ ID NO: 36	относится к Der f 15 молекуле iMAT (кошки) c Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 37	относится к Der f 15 молекуле iMAT (кошки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 38	относится к Der f 15 молекуле iMAT (кошки) без метки;
SEQ ID NO: 39	относится к молекуле iMAT Zen 1 белка (кошки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 40	относится к молекуле iMAT Zen 1 белка (кошки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 41	относится к молекуле iMAT Zen 1 белка (кошки) без метки;
SEQ ID NO: 42	относится к молекуле iMAT Cte f 1 белка (кошки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 43	относится к молекуле iMAT Cte f 1 белка (кошки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 44	относится к молекуле iMAT Cte f 1 белка (кошки) без метки;

SEQ ID NOs: 45-65 iMAT для собак (с N-терминальным или С-терминальнам

Гекса-Гистидином или без Гекса-Гистидина/Метионина (IMAT Чистый)):

SEQ ID NO: 45 относится к Der f 1 молекуле iMAT (собаки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 46 относится к Der f 1 молекуле iMAT (собаки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 47 относится к Der f 1 молекуле iMAT (собаки) без метки;

SEQ ID NO: 48 относится к Der f 2 молекуле iMAT (собаки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 49 относится к Der f 2 молекуле iMAT (собаки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 50 относится к Der f 2 молекуле iMAT (собаки) без метки;

- 26 041116

SEQ ID NO: 51 относится к Der f 23 молекуле iMAT (собаки) c Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 52 относится к Der f 23 молекуле iMAT (собаки) с Cтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 53 относится к Der f 23 молекуле iMAT (собаки) без метки;

SEQ ID NO: 54 относится к Der f 18p молекуле iMAT (собаки) c Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 55 относится к Der f 18p молекуле iMAT (собаки) с Cтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 56 относится к Der f 18p молекуле iMAT (собаки) без метки;

SEQ ID NO: 57

SEQ ID NO: 58

SEQ ID NO: 59 относится к Der f 15 молекуле iMAT (собаки) c Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

относится к Der f 15 молекуле iMAT (собаки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

относится к Der f 15 молекуле iMAT (собаки) без метки;

SEQ ID NO: 60 относится к молекуле iMAT Zen 1 белка (собаки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 61 относится к молекуле iMAT Zen 1 белка (собаки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 62 относится к молекуле iMAT Zen 1 белка (собаки) без метки;

SEQ ID NO: 63 относится к молекуле iMAT Cte f 1 белка (собаки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 64 относится к молекуле iMAT Cte f 1 белка (собаки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 65 относится к молекуле iMAT Cte f 1 белка (собаки) без метки;

- 27 041116

SEQ ID NOs: 66-74 гибрид/мозаичные iMAT для кошки (N-терминальный или С-терминальный Гекса-Гистидин или без ГексаГистидина /Метионина (1МАТ_Чистый)):

SEQ ID NO: 66 относится к молекуле iMAT Гибрида 1 (кошки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 67 относится к молекуле iMAT Гибрида 1 (кошки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 68 относится к молекуле iMAT Гибрида 1 (кошки) без метки (состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 21);

SEQ ID NO: 69 относится к молекуле iMAT Гибрида 2 (кошки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 70 относится к молекуле iMAT Гибрида 2 (кошки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 71 относится к молекуле iMAT Гибрида 2 (кошки) без метки (состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 22);

SEQ ID NO: 72 относится к молекуле iMAT Гибрида 3 (кошки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 73 относится к молекуле iMAT Гибрида 3 (кошки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 74 относится к молекуле iMAT Гибрида 3 (кошки) без метки (состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 23);

SEQ ID NOs: 75-83 гибрид/мозаичные iMAT для собаки (N-терминальный или С-терминальный Гекса-Гистидин или без ГексаГистидина/Метионина (1МАТ_Чистый)):

SEQ ID NO: 75 относится к молекуле iMAT Гибрида 1 (собаки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

SEQ ID NO: 76 относится к молекуле iMAT Гибрида 1 (собаки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;

- 28 041116

SEQ ID NO: 77	относится к молекуле iMAT Гибрида 1 (собаки) без метки (состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 21);
SEQ ID NO: 78	относится к молекуле iMAT Гибрида 2 (собаки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 79	относится к молекуле iMAT Гибрида 2 (собаки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 80	относится к молекуле iMAT Гибрида 2 (собаки) без метки (состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 22);
SEQ ID NO: 81	относится к молекуле iMAT Гибрида 3 (собаки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 82	относится к молекуле iMAT Гибрида 3 (собаки) с Стерминальной Гекса-Гистидиновой меткой;
SEQ ID NO: 83	относится к молекуле iMAT Гибрида 3 (собаки) без метки (состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 23);

SEQ ID NOs: 84-88 Неизбыточные Гибридные Аллергены:

SEQ ID NO: 84	относится к A1KXC1DERFA DFP1 (UNIPROT база данных);
SEQ ID NO: 85	относится к A0A088SAS1DERFA Der f 28 аллерген (UNIPROT база данных);
SEQ ID NO: 86	относится к B7U5T1DERFA Der f 6 аллергену (UNIPROT база данных);
SEQ ID NO: 87	относится к T2B4F3DERPT LytFM (UNIPROT база данных);
SEQ ID NO: 88	относится к A7XXV2 DERFA Der f 2 аллергену (UNIPROT база данных);

SEQ ID NOs: 89-90 Различные последовательности:

- 29 041116

SEQ ID NO: 89 относится к Cui o2 молекуле iMAT c N-терминальным ГЕКСА-ГИСТИДИНОМ;

SEQ ID NO: 90 относится к Cui оЗ молекуле iMAT c N-терминальным ГЕКСА-ГИСТИДИНОМ.

SEQ ID NOs: 91-102 Пептидные компоненты Гибридов:

SEQ ID NO: 91 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 10,

SEQ ID NO: 92 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 85,

SEQ ID NO: 93 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 88,

SEQ ID NO: 94 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 86,

SEQ ID NO: 95 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 87,

SEQ ID NO: 96 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: И,

SEQ ID NO: 97 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 7,

SEQ ID NO: 98 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 10,

SEQ ID NO: 99 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 12,

SEQ ID NO: 100 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 9,

SEQ ID NO: 101 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 11,

SEQ ID NO: 102 относится к пептидной части гибрида, который имеет

происхождение SEQ ID NO: 8.

Гибрид/мозаичные молекулы iMAT:

В специфическом аспекте настоящего изобретения молекулы iMAT дополнительно улучшены, если компоненты (аминокислотные последовательности /эпитопы) более одного аллергена включены в антигенный модуль. Для этой цели можно применять основной принцип описанного выше биоинформационного подхода к отбору (пример 5) иным путем. Вместо отбора полных аллергенов на основании подсчета совпадений пептидов аллергенов, обнаруженных в базе данных аллергенов, только наиболее часто встречающиеся пептиды нескольких из таких аллергенов используются для конструирования антигенного модуля iMAT (см., например, пример 6). Таким образом, такая молекула iMAT состоит из антигенного модуля пептидов, которые имеют происхождение из нескольких аллергенов. Это позволяет расширить спектр одной молекулы iMAT по отношению к ее целевому иммунологическому профилю, и, таким образом, это является полезным для разработки фармацевтического препарата.

В качестве дальнейшей стадии конструирования гибридной молекулы iMAT, добавляют ТАТ и нацеливающий домен, и необязательно His-метку. В завершение, цистеиновые остатки заменяют на более стабилизирующие остатки, как описано в примерах 5 и 6.

Гибрид I.

Предшественник белка выбирают из перечня предшественников белков, в соответствии с пептидами, занимающими верхние позиции рейтинга, и используют в качестве каркасного белка (SEQ ID NO: 84) для встраивания других пептидов, занимающих верхние позиции рейтинга, из других антигенов (SEQ ID NOS: 10, 11, 85, 86, 87, 88). Последовательность сигнального пептида удаляют из каркасного белка. Необязательно дополнительные соседние N- или С-терминальные аминокислоты вставляют в пределах исходной последовательности каркасного белка и заменяют части исходной последовательности каркасного белка, как описано ниже.

Компоненты следующих белков применяют для конструирования гибрида 1:

SEQ ID NO: 84 (A1KXC1DERFA DFP1 OS=Dermatophagoides farina)

SEQ ID NO: 10 (Q86R84DERFA 60 кДа аллерген Der f 18p

OS=Dermatophagoides farinae GN=Der f 18 PE=2 SV=1)

SEQ ID NO: 85 (A0A088SAS1DERFA Der f 28 аллерген OS=Dermatophagoides farinae PE=2 SV=1)

- 30 041116

SEQ ID NO: 88: (A7XXV2_DERFA Der f 2 аллерген OS=Dermatophagoides farinae

PE=4 SV=1)

SEQ ID NO: 86 (B7U5T1DERFA Der f 6 аллерген OS=Dermatophagoides farinae

PE=2 SV=1)

SEQ ID NO: 87 (T2B4F3DERPT LytFM OS=Dermatophagoides pteronyssinus

GN=lytFM PE=4 SV=1)

SEQ ID NO: 11 (Q9U6R7DERFA 98 кДа HDM аллерген OS=Dermatophagoides farinae PE=2 SV=1)

Скелет Гибрида 1:

SEQ ID NO: 84 (A1KXC1 18-400, без замененных частей ниже)

[Замена 1 для: SEQ ID NO: 84 АА 39-52]:

SEQ ID NO: 10 (Q86R84AA 97-110) то есть GNAKAMIAVGGSTM (SEQ ID NO:

91)

[Замена 2 для: SEQ ID NO: 84 AA 261-274]:

SEQ ID NO: 85 (A0A088SASl_AA 611-624) то есть MMKIYQQQQQQHHP (SEQ

ID NO: 92)

[Замена 3 для: SEQ ID NO: 84 AA 234-246]:

SEQ ID NO: 88 (A7XXV2 AA 48-61) то есть FLVYIHIANNEIKK (SEQ ID NO: 93)

[Замена 4 для: SEQ ID NO: 84 AA 53-65]:

SEQ ID NO: 86 (B7U5T1AA 166-178) то есть IVDGDKVTIYGWG (SEQ ID NO:

94)

[Замена 5 для: SEQ ID NO: 84 AA 276-289]:

SEQ ID 87: (T2B4F3AA 134-147) то есть REENIWSDHIANVA (SEQ ID NO: 95)

[Замена 6 для: SEQ ID NO: 84 AA 203-216]:

SEQ ID NO: 11 (Q9U6R7AA 469-482) то есть TPTTPTPAPTTSTP (SEQ ID NO: 96)

После того, как цистеиновые остатки заменены на наиболее стабилизирующие остатки, применяют биотехнологический способ, описанный в примерах 5 и 6, это приводит к получению SEQ ID NO: 21.

Скелет гибрида 1 образован с помощью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 84. Дальнейшие пептидные компоненты антигенного модуля гибрида 1 SEQ ID NOs: 91-96 встраивают в каркасную последовательность, которая имеет происхождение из SEQ ID NO: 84. Эти дополнительные пептидные компоненты антигенного модуля гибрида 1 SEQ ID NOs: 91-96 могут быть перестроены в любом порядке/в другом порядке (по сравнению с порядком замены, описанным выше). Любой такой перестроенный пептидный порядок на основании вышеописанных антигенов/ аллергенов охватывается объемом настоящего изобретения.

Гибрид 2.

Выбирают полные аллергены и/или занимающие верхние позиции рейтинга пептиды и сплайсируют совместно для получения модуля аллергена для данной молекулы iMAT, описанной ниже.

Компоненты следующих белков применяют для конструирования гибрида 2 в представленном предпочтительном порядке, при котором часть 1 представляет собой N-конец. Дальнейшие части добавляют в соответствии с порядком, представленным ниже, к С-концу предыдущей партии. В случае гибрида 2 представлено 5 дальнейших частей. Всего присутствует 6 частей. Часть 1: SEQ ID NO: 7 (Q58A71 Der f 1 аллерген препрофермент Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 99321) то есть

TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNT

SLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPN SQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDN GYQPNYHAVNIVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIE QYPYVVIM (SEQ ID NO: 97)

Часть 2: SEQ ID NO: 10 (Q86R84 60 кДа аллерген Der f 18p Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 277-304) то есть FTQTDGFLSYNELCVQIQAETNAFTITR (SEQ ID NO: 98)

- 31 041116

Часть 3: SEQ ID NO: 12 (I7HDR2 Zen 1 белок Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 181-220) то есть EPTTPTPEPTTKTPEPTTKTPEPSTPTPEPTTKTPEPTTK (SEQ ID NO:

99)

Часть 4: SEQ ID NO: 9 (A0A088SAW7 Der f 23 аллерген Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 22-91) то есть DIDHDDDPTTMIDVQTTTVQPSDEFECPTRFGYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT (SEQ ID NO: 100)

Часть 5: SEQ ID NO: 11 (Q9U6R7 98 кДа HDM аллерген (Der f 15 аллерген) (Группа 15 аллерген Der f 15) Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 437-463) то есть SPTTPTTTPSPTTPTTTPSPTTPTTTP(SEQ ID NO: 101)

Часть 6: SEQ ID NO: 8 (Q00855 аллерген Der f 2 группы 2 клещей (Аллерген Der f II) (аллерген Der f 2) Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 18-146) то есть

DQVDVKDCANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQNTKTAKIEI

KASLDGLEIDVPGIDTNACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVT

VKLIGDNGVLACAIATHGKIRD (SEQ ID NO: 102)

После того, как цистеиновые остатки заменены на наиболее стабилизирующие остатки, применяют биотехнологический способ, описанный в примерах 5 и 6, это приводит к получению SEQ ID NO: 22.

Тем не менее вышеописанные пептидные компоненты антигенного модуля гибрида 2 могут быть перестроены в любом порядке /в другом порядке (по сравнению с порядком замены, описанным выше). Любой такой перестроенный пептидный порядок на основании вышеописанных антигенов/ аллергенов охватывается объемом настоящего изобретения.

Гибрид 3.

Компоненты следующих белков применяют для конструирования гибрида 3 в представленном предпочтительном порядке, при котором часть 1 представляет собой N-конец. Дальнейшие части добавляют в соответствии с порядком, представленным ниже, к С-концу предыдущей партии. В случае гибрида 3 представлено 4 дальнейшие части. Всего присутствует 5 частей. Часть 1: SEQ ID NO: 7 (Q58A71 Der f 1 аллерген препрофермент Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 99-321) то есть

TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNT

SLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGVVEERSYPYVAREQQCRRPN SQHYGISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVIIGIKDLRAFQHYDGRTIIQHDN GYQPNYHAVNIVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIE QYPYVVIM (SEQ ID NO: 97)

Часть 2: SEQ ID NO: 10 (Q86R84 60 кДа аллерген Der f 18p Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 277-304) то есть FTQTDGFLSYNELCVQIQAETNAFTITR (SEQ ID NO: 98)

Часть 3: SEQ ID NO: 11 (Q9U6R7 98 кДа HDM аллерген (Der f 15 аллерген) (Группа 15 аллерген Der f 15) Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 437-463) то есть SPTTPTTTPSPTTPTTTPSPTTPTTTP (SEQ ID NO: 101)

Часть 4: SEQ ID NO: 8 (Q00855 аллерген Der f 2 группы 2 клещей (Аллерген Der f II) (аллерген Der f 2) Dermatophagoides farinae (Американский клещ домашней пыли) АК 18-146) то есть

DQVDVKDCANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPFTLEALFDANQNTKTAKIEI

KASLDGLEIDVPGIDTNACHFMKCPLVKGQQYDIKYTWNVPKIAPKSENVVVT

VKLIGDNGVLACAIATHGKIRD (SEQ ID NO: 102)

После того, как цистеиновые остатки заменены на наиболее стабилизирующие остатки, применяют биотехнологический способ, описанный в примерах 5 и 6, это приводит к получению SEQ ID NO: 23.

Тем не менее, вышеописанные пептидные компоненты антигенного модуля гибрида 3 могут быть перестроены в любом порядке/в другом порядке (по сравнению с порядком частей, описанным выше). Любой такой перестроенный пептидный порядок на основании вышеописанных антигенов/ аллергенов охватывается объемом настоящего изобретения.

Дальнейшие специфические аспекты настоящего изобретения:

Изобретение обеспечивает аминокислотную последовательность/улучшенную молекулу MAT (iMAT), включающую:

(I) по меньшей мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, (II) по меньшей мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, и (III) по меньшей мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, который имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности, предпочтительно эпитопа, по меньшей мере одного ан-

- 32 041116 тигена, предпочтительно по меньшей мере одного аллергена, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая отличается тем, что, по меньшей мере, в антигенных модулях по меньшей мере один остаток цистеина замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты, для применения в способе предотвращения и/или лечения одной или нескольких аллергий у животных, исключая лошадей, и/или для применения в способе предотвращения и/или лечения одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, и/или для применения в способе профилактики передачи одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, и/или для применения в способе профилактики передачи одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, с помощью векторов.

Изобретение дополнительно обеспечивает способ предотвращения и/или лечения одной или нескольких аллергий у животных, исключая лошадей, и/или способ предотвращения и/или лечения одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, и/или способ профилактики передачи одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, предпочтительно с помощью векторов, который включает введение терапевтически эффективного количества аминокислотной последовательности/ улучшенной молекулы MAT (iMAT), включающей:

(I) по меньшей мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, (II) по меньшей мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, и (III) по меньшей мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, который имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности, предпочтительно эпитопа, по меньшей мере одного антигена, предпочтительно по меньшей мере одного аллергена, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая отличается тем, что, по меньшей мере, в антигенных модулях по меньшей мере один остаток цистеина замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты.

В специфическом аспекте по меньшей мере один антигенный модуль все остатки цистеина замещены с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты. Предпочтительно все остатки цистеина в цельной молекуле iMAT замещены с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты.

В дальнейшем аспекте все такие модули ковалентно связанны друг с другом, необязательно с помощью дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) между двумя или более соседними модулями, необязательно между всеми такими первым, вторым и/или третьим модулями.

В предпочтительном аспекте все такие модули ковалентно связанны друг с другом и никакого(никаких) дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) между двумя или более соседними модулями, такими как первый, второй и/или третий модули, не присутствует вообще.

В другом аспекте по меньшей мере один второй модуль включает инвариантную цепь, выбранную из видов собачьих, кошачьих, бычьих, овечьих, козьих, и/или свиней или ее частичной последовательности, при условии, что такой по меньшей мере один второй модуль функционирует в качестве модуля, который позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами. Предпочтительная последовательность инвариантной цепи собаки представляет собой SEQ ID NO: 2. Предпочтительная последовательность инвариантной цепи кошки представляет собой SEQ ID NO: 3.

В предпочтительном аспекте по меньшей мере один второй модуль включает, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 4 (собачья) или SEQ ID NO: 5 (кошачья). SEQ ID NOs: 4 и 5 представляют 110 аминокислотных остатков инвариантных цепей из SEQ ID NOs: 2 и 3 соответственно.

В дальнейшем предпочтительном аспекте по меньшей мере один второй модуль включает, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 4 (собачья) или SEQ ID NO: 5 (кошачья) или их фрагментов, при условии, что такие фрагменты сохраняют их внутриклеточную транспортную функцию.

В дальнейшем аспекте по меньшей мере один антигенный модуль включает по меньшей мере одну полную или частичную аминокислотную последовательность, предпочтительно эпитоп, который имеет происхождение по меньшей мере от одного аллергена, который вызывает аллергию у животных, исклю- 33 041116 чая лошадей, предпочтительно по меньшей мере одну полную или частичную аминокислотную последовательность, предпочтительно эпитоп, по меньшей мере одного аллергена, который имеет происхождение предпочтительно от аллергий на укус блох, предпочтительно у собак и/или котов; аллергий на определенные пищевые компоненты, предпочтительно у собак и/или котов; атопического дерматита, предпочтительно у собак и/или котов; аллергического воспаления и/или обструкции дыхательных путей, предпочтительно у котов.

В предпочтительном аспекте такой по меньшей мере один антиген, предпочтительно по меньшей мере один аллерген, представляет собой Der f 15 аллерген в соответствии с SEQ ID NO: 11 или 18. В предпочтительном аспекте такой по меньшей мере один антигенный модуль включает, предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 18.

В специфическом аспекте такой по меньшей мере один антиген, предпочтительно по меньшей мере один аллерген, представляет собой, который имеет происхождение из пищи и/или плесени (грибов и/или их спор), пыльцы, домашней пыли или амбарных клещей (и/или их фекалий) и/или блох, предпочтительно из пыльцы с деревьев, трав, травянистых растений, амброзии и/или пыльцы растений крестоцветных и/или грибов и/или их спор родов aspergillus, alternaria, botrytis, cercospora, cladosporium, curvularia, drechslera, eurotium, helminthosporium, epicoccum, erysiphe/oidium, fusarium, lichtheimia, nigrospora, penicillium, periconia, peronospora, polythrincium, saccharopolyspora (ранее также faenia или micropolyspora), thermoactinomyces, stemphylium, torula и/или клещей (или их фекалий) родов acarus, glycophagus, tyrophagus, dermatophagoides, euroglyphus, lepidoglyphus, blomia и/или блох родов Ceratophyllus, Ctenocephalides, Pulex, Archaeopsylla., и более предпочтительно представляет собой аллерген Dermatophagoides.

В еще другом специфическом аспекте по меньшей мере один антигенный модуль включает по меньшей мере одну полную или частичную аминокислотную последовательность, предпочтительно эпитоп, который имеет происхождение по меньшей мере от одного антигена патогена, вызывающего одно или несколько инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, предпочтительно по меньшей мере одну полную или частичную аминокислотную последовательность, предпочтительно эпитоп, по меньшей мере одного антигена патогена, вызывающего одно или несколько инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, выбранных из рода Campylobacter, Dirofilaria, Ehrlichia, Leishmania, Trypanosoma, Borrelia, Orthobunyavirus, Orbivirus, Flavivirus, Rotavirus, Coronavirus, Trichophyton, Microsporum; Cooperia, Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Dictyocaulus, Metastrongylus; Eimeria, Isospora, Cryptosporidium, Giardia, где предпочтительно по меньшей мере один антигенный модуль также может представлять собой антиген вектора, вовлеченного в передачу одного или нескольких инфекционных заболеваний у животных, исключая лошадей, предпочтительно an антиген, выбранную из компонентов слюны векторов, выбранных из насекомых, которые питаются кровью, мух, мошек, клещей и/или комаров.

В предпочтительном аспекте молекула iMAT дополнительно включает по меньшей мере один модуль метки, предпочтительно по меньшей мере одну His-метку. Предпочтительно такой по меньшей мере один модуль метки присутствует на N-терминальном конце. В другом предпочтительном специфическом аспекте такой по меньшей мере один модуль метки присутствует на С-терминальном конце. В другом предпочтительном специфическом аспекте такой по меньшей мере один модуль метки присутствует на N-терминальном конце и С-терминальном конце.

В специфическом предпочтительном аспекте молекула iMAT включает один модуль метки, предпочтительно одну His-метку, на N-терминальном конце после одного остатка метионина.

В другом специфическом предпочтительном аспекте отсутствует модуль метки в молекулах iMAT.

В дальнейшем аспекте по меньшей мере один первый модуль включает, предпочтительно состоит из, аминокислотной последовательности HIV-tat, VP22 и/или Antennapedia или ее частичной последовательности, при условии, что такой по меньшей мере один первый модуль является функциональным в качестве модуля для транслокации молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, наиболее предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1).

В другом аспекте молекула iMAT представлена в мономерной форме и/или в линейной форме.

В дальнейшем аспекте по меньшей мере один третий модуль включает, предпочтительно состоит из любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 14-23.

В предпочтительном аспекте молекула iMAT содержит, предпочтительно состоит из, одну или несколько аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOS: 24-83.

Особенно предпочтительная молекула iMAT содержит, предпочтительно состоит из, SEQ ID NO: 36 (Der f 15 молекула iMAT кошки) или SEQ ID NO: 57 (Der f 15 молекула iMAT собаки). Дальнейшие предпочтительные молекулы iMAT (содержащие N-терминальную His-метку) выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81. Дальнейшие предпочтительные молекулы iMAT (содержащие С-терминальную His-метку) выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82. Дальнейшие предпочтительные молекулы iMAT (без His-метки) выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83.

- 34 041116

Дальнейшие предпочтительные молекулы iMAT (гибридные/мозаичные iMAT) выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 66-83. Дальнейшие предпочтительные гибридные молекулы iMAT представляют собой 66, 69, 72, 75, 78, 81 (с N-терминальной His-меткой). Особенно предпочтительной является SEQ ID NO: 66 и/или 75. Дальнейшие предпочтительные специфические гибридные молекулы iMAT представляют собой 67, 70, 73, 76, 79, 82 (с С-терминальной His-меткой). Особенно предпочтительной является SEQ ID NO: 67 и/или 76. Дальнейшие предпочтительные специфические гибридные молекулы iMAT представляют собой 68, 71, 74, 77, 80, 83 (без His-метки). Особенно предпочтительной является SEQ ID NO: 68 и/или 77.

В дальнейшем аспекте животное выбирают из жвачных, включая крупный рогатый скот, козы, овцы, такие как представители родов Bos, Capra и/или Ovis, представители родов Canis, такие как собаки, волки, лисы, койоты, шакалы, представители родов Felis, такие как львы, тигры, домашние коты, дикие коты, другие большие кошки, и других кошачьих, включая гепарды и рысь, и/или представители родов Sus, такие как свиней, где предпочтительно животное выбирают из котов и/или собак.

Изобретение обеспечивает аминокислотную последовательность, содержащую:

(I) по меньшей мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, предпочтительно указанный первый модуль включает, более предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 1, (II) по меньшей мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, предпочтительно указанный второй модуль включает, более предпочтительно состоит из, SEQ ID NO: 4 или 5;

(III) по меньшей мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, который имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности, предпочтительно эпитопа, по меньшей мере одного антигена, предпочтительно по меньшей мере одного аллергена, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая отличается тем, что, по меньшей мере, в антигенных модулях по меньшей мере один остаток цистеина замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина, и/или аспарагиновой кислоты. Третий модуль предпочтительно включает, более предпочтительно состоит из любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 14-23.

Изобретение обеспечивает улучшенную молекулу MAT (iMAT), включающую:

(I) по меньшей мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, предпочтительно указанный первый модуль включает, более предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 1, (II) по меньшей мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, предпочтительно указанный второй модуль включает, более предпочтительно состоит из, SEQ ID NO: 4 или 5;

(III) по меньшей мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, который имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности, предпочтительно эпитопа, по меньшей мере одного антигена, предпочтительно по меньшей мере одного аллергена, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая отличается тем, что, по меньшей мере, в антигенных модулях по меньшей мере один остаток цистеина замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты. Третий модуль предпочтительно включает, более предпочтительно состоит из любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 14-23.

В специфическом аспекте по меньшей мере один антигенный модуль все остатки цистеина замещены с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина, и/или аспарагиновой кислоты, предпочтительно все остатки цистеина в цельной молекуле iMAT замещены с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина, и/или аспарагиновой кислоты.

В дальнейшем аспекте все такие модули ковалентно связанны друг с другом, необязательно с помощью дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) между двумя или более соседними модулями, необязательно между всеми такими первым, вторым и/или третьим модулями.

В предпочтительном аспекте все такие модули ковалентно связаны друг с другом, и никако- 35 041116 го(никаких) дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) между двумя или более соседними модулями такими, как первый, второй и/или третий модули, не присутствует вообще.

В дальнейшем предпочтительном аспекте по меньшей мере один второй модуль включает, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 4 (собачья) или SEQ ID NO: 5 (кошачья) или их фрагментов, при условии, что такие фрагменты сохраняют их внутриклеточную транспортную функцию. SEQ ID NOs: 4 и 5 представляют 110 аминокислотных остатков инвариантных цепей из SEQ ID NOs: 2 и 3 соответственно. В более предпочтительном аспекте по меньшей мере один второй модуль включает, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 4 (собачья) или SEQ ID NO: 5 (кошачья).

В дальнейшем аспекте по меньшей мере один антигенный модуль включает по меньшей мере одну полную или частичную аминокислотную последовательность, предпочтительно эпитоп, который имеет происхождение по меньшей мере от одного аллергена, который вызывает аллергию у животных, исключая лошадей, предпочтительно по меньшей мере одну полную или частичную аминокислотную последовательность, предпочтительно эпитоп, по меньшей мере одного аллергена, который имеет происхождение предпочтительно от аллергий на укус блох, предпочтительно у собак и/или котов; аллергий на определенные пищевые компоненты, предпочтительно у собак и/или котов; атопического дерматита, предпочтительно у собак и/или котов; аллергического воспаления и/или обструкции дыхательных путей, предпочтительно у котов.

В специфическом аспекте такой по меньшей мере один антиген включает аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 11 или 18. В предпочтительном аспекте такой по меньшей мере один антиген, предпочтительно по меньшей мере один аллерген, представляет собой Der f 15 аллерген в соответствии с SEQ ID NO: 11 или 18. В дальнейшем предпочтительном аспекте такой по меньшей мере один антигенный модуль включает, предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 18. В дальнейшим предпочтительном аспекте молекула iMAT содержит, предпочтительно состоит из (одну) аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NOs: 24-83 (одна из этих альтернатив). В дальнейшем предпочтительном аспекте молекула iMAT содержит, предпочтительно состоит из любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 36-38 (Der f15 молекула iMAT кошки), наиболее предпочтительно SEQ ID NO: 36, или молекула iMAT содержит, предпочтительно состоит из любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 57-59 (Der f15 молекула iMAT собаки), наиболее предпочтительно SEQ ID NO: 57.

В предпочтительном аспекте молекула iMAT дополнительно включает по меньшей мере один модуль метки, предпочтительно по меньшей мере одну His-метку. Предпочтительно такой по меньшей мере один модуль метки присутствует на N-терминальном конце. В специфическом предпочтительном аспекте молекула iMAT включает один модуль метки, предпочтительно одну His-метку, на N-терминальном конце после одного остатка метионина. Предпочтительные молекулы iMAT с N-терминальной Hisметкой содержат, предпочтительно состоят из любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81.

В другом специфическом предпочтительном аспекте такой по меньшей мере один модуль метки присутствует на С-терминальном конце. В другом специфическом предпочтительном аспекте такой по меньшей мере один модуль метки присутствует на N-терминальном конце и С-терминальном конце. Предпочтительные молекулы iMAT с С-терминальной His-меткой содержат, предпочтительно состоят из любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82.

В другом специфическом предпочтительном аспекте отсутствует модуль метки. Предпочтительные молекулы iMAT совершенно без любой метки содержат, предпочтительно состоят из любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83.

В дальнейшем аспекте по меньшей мере один первый модуль включает, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности HIV-tat, VP22 и/или Antennapedia или ее частичной последовательности, при условии, что такой по меньшей мере один первый модуль является функциональным в качестве модуля для транслокации молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, наиболее предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1).

В другом аспекте молекула iMAT представлена в мономерной форме и/или в линейной форме.

В дальнейшем специфическом аспекте молекула iMAT представляет собой гибридную молекулу iMAT (мозаичную молекулу iMAT). Предпочтительно такая гибридная молекула iMAT включает аминокислотную последовательность в соответствии с любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 21-23. Более специфически, такая гибридная молекула iMAT содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности в соответствии с любой из последовательностей, представленных в SEQ ID NOs: 66-83.

Изобретение дополнительно обеспечивает аминокислотную последовательность, которая содержит, предпочтительно состоит из одной или нескольких аминокислотных последовательностей в соответствии

- 36 041116 с SEQ ID NOs: 24-83. Изобретение дополнительно обеспечивает молекулу iMAT, которая содержит, предпочтительно состоит из одной или нескольких аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NOs: 24-83.

Изобретение дополнительно обеспечивает аминокислотную последовательность/молекулу iMAT, которая содержит, предпочтительно состоит из одной или нескольких аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 24-83.

Особенно предпочтительная аминокислотная последовательность/молекула iMAT содержит, предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 36 (Der f15 молекула iMAT кошки) или SEQ ID NO: 57 (Der f 15 молекула iMAT собаки). Дальнейшие предпочтительные аминокислотные последовательности /молекулы iMAT (содержащие N-терминальную His-метку) выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81. Дальнейшие предпочтительные аминокислотные последовательности/молекулы iMAT (содержащие С-терминальную His-метку) выбирают из группы, состоящей из: SEQ ID NOs: 25, 28, 31, 34, 37, 40, 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82. Дальнейшие предпочтительные аминокислотные последовательности/молекулы iMAT (без Hisметки) выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 26, 29, 32, 35, 38, 41, 44, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83.

Дальнейшие предпочтительные аминокислотные последовательности/молекулы iMAT (гибридные/мозаичные iMAT) выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 66-83. Дальнейшие предпочтительные гибридные молекулы iMAT представляют собой 66, 69, 72, 75, 78, 81 (с N-терминальной Hisметкой).

Дальнейшие предпочтительные гибридные молекулы iMAT представляют собой 67, 70, 73, 76, 79, 82 (с С-терминальной His-меткой). Дальнейшие предпочтительные гибридные молекулы iMAT представляют собой 68, 71, 74, 77, 80, 83 (без His-метки).

Изобретение обеспечивает аминокислотную последовательность/улучшенную молекулу MAT (iMAT), включающую:

(I) по меньшей мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, предпочтительно указанный первый модуль включает, более предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 1, (II) по меньшей мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, предпочтительно указанный второй модуль включает, более предпочтительно состоит из, SEQ ID NO: 4 или 5 (III) по меньшей мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, который имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности, предпочтительно эпитопной последовательности, любой комбинации двух или более антигенов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 84, 85, 86, 87 и 88, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая отличается тем, что, по меньшей мере, в антигенных модулях по меньшей мере один остаток цистеина замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты. В предпочтительном аспекте антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности, предпочтительно эпитопной последовательности, любой комбинации двух или более антигенов, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 10, 11, 84, 85, 86, 87 и 88 (Гибрид 1). В специфическом аспекте антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности, предпочтительно эпитопной последовательности, любой комбинации двух или более антигенов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9,10, 11 и 12 (Гибрид 2).

В специфическом аспекте антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности, предпочтительно эпитопной последовательности, любой комбинации двух или более антигенов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 10 и 11 (Гибрид 3).

Таким образом, изобретение специфически обеспечивает аминокислотную последовательность/улучшенную молекулу MAT (iMAT), включающую:

(I) по меньшей мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, предпочтительно указанный первый модуль включает, более предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 1, (II) по меньшей мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на

- 37 041116 органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, предпочтительно указанный второй модуль включает, более предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 4 или 5, (III) по меньшей мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность на основании каркаса, которая имеет происхождение SEQ ID NO: 84, содержащая любую комбинацию одного или нескольких пептидов в соответствии с SEQ ID NOs: 91-96 (в любом порядке), встроенных в указанную каркасную последовательность, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая отличается тем, что, по меньшей мере, в антигенных модулях по меньшей мере один остаток цистеина замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты.

В предпочтительном аспекте порядок пептидных последовательностей в скелете, который имеет происхождение SEQ ID NO: 84 в третьем модуле, является таким: SEQ ID NO: 91, за которой следует SEQ ID NO: 92, за которой следует SEQ ID NO: 93, за которой следует SEQ ID NO: 94, за которой следует SEQ ID NO: 95, за которой следует SEQ ID NO: 96, начиная с N-конца. В наиболее предпочтительном аспекте третий модуль включает, предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 21.

В дальнейшем специфическом аспекте порядок пептидных последовательностей в скелете, который имеет происхождение SEQ ID NO: 84 в третьем модуле, является таким: SEQ ID NO: 93, за которой следует SEQ ID NO: 91, за которой следует SEQ ID NO: 92, за которой следует SEQ ID NO: 94, за которой следует SEQ ID NO: 96, за которой следует SEQ ID NO: 95, начиная с N-конца. Дальнейшие аспекты настоящего изобретения относятся к любой другой комбинации и порядку пептидов в соответствии с SEQ ID NOs: 91-96, встроенных в каркасную последовательность, которая имеет происхождение из SEQ ID NO: 84.

Таким образом, изобретение дополнительно обеспечивает аминокислотную последовательность/улучшенную молекулу MAT (iMAT), включающую:

(I) по меньшей мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, предпочтительно указанный первый модуль включает, более предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 1, (II) по меньшей мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, предпочтительно указанный второй модуль включает, более предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 4 или 5, (III) по меньшей мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, который имеет происхождение из любой комбинации двух или более пептидов в соответствии с SEQ ID NOs: 97-102 (в любом порядке), который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая отличается тем, что, по меньшей мере, в антигенных модулях по меньшей мере один остаток цистеина замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты. В предпочтительном аспекте порядок пептидных последовательностей в третьем модуле является таким: SEQ ID NO: 97, за которой следует SEQ ID NO: 98, за которой следует SEQ ID NO: 99, за которой следует SEQ ID NO: 100, за которой следует SEQ ID NO: 101, за которой следует SEQ ID NO: 102, начиная с N-конца. В наиболее предпочтительном аспекте третий модуль включает, предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 22.

В дальнейшем специфическом аспекте порядок пептидных последовательностей в третьем модуле является таким: SEQ ID NO: 99, за которой следует SEQ ID NO: 98, за которой следует SEQ ID NO: 102, за которой следует SEQ ID NO: 100, за которой следует SEQ ID NO: 101, за которой следует SEQ ID NO: 97, начиная с N-конца. Дальнейшие аспекты настоящего изобретения относятся к любой другой комбинации и порядку пептидов в соответствии с SEQ ID NOs: 97-102.

Таким образом, изобретение дополнительно обеспечивает аминокислотную последовательность/улучшенную молекулу MAT (iMAT), включающую: (I) по меньшей мере один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы iMAT из внеклеточного пространства внутрь клеток, предпочтительно указанный первый модуль включает, более предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 1, (II) по меньшей мере один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы iMAT на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, предпочтительно процессированными антигенами, предпочтительно указанный второй модуль включает, более предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 4 или 5, (III) по меньшей мере один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, который имеет происхождение из любой комбинации двух или более

- 38 041116 пептидов в соответствии с SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102 (в любом порядке), который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы iMAT, которая отличается тем, что, по меньшей мере, в антигенных модулях по меньшей мере один остаток цистеина замещен с помощью другого аминокислотного остатка, предпочтительно серина, лейцина, изолейцина, аргинина, метионина и/или аспарагиновой кислоты. В предпочтительном аспекте порядок пептидных последовательностей в третьем модуле, является таким: SEQ ID NO: 97, за которой следует SEQ ID NO: 98, за которой следует SEQ ID NO: 101, за которой следует SEQ ID NO: 102, начиная с Nконца. В наиболее предпочтительном аспекте третий модуль включает, предпочтительно состоит из SEQ ID NO: 23.

В дальнейшем специфическом аспекте порядок пептидных последовательностей в третьем модуле является таким: SEQ ID NO: 102, за которой следует SEQ ID NO: 98, за которой следует SEQ ID NO: 101, за которой следует SEQ ID NO: 97, начиная с N-конца. Дальнейшие аспекты настоящего изобретения относятся к любой другой комбинации и порядку пептидов в соответствии с SEQ ID NOs: 97, 98, 101 и 102.

Изобретение дополнительно обеспечивает вакцину или иммуногенную композицию или фармацевтическую композицию, содержащую аминокислотную последовательность/молекулу iMAT в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение дополнительно обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислоту/молекулу iMAT в соответствии с настоящим изобретением.

Дополнительно изобретение обеспечивает вектор, который включает по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением.

Кроме того, изобретение обеспечивает первичную клетку или линию клеток, которая включает по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением и/или по меньшей мере один вектор в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение дополнительно обеспечивает способ идентификации улучшенных молекул МАТ, который включает стадии:

а) выбор белка в качестве аллергенного модуля в молекулах iMAT и

б) конструирование молекулы iMAT с указанными аллергенами, которая является термодинамически стабильной и может быть эффективно получена при использовании белковой инженерии.

Изобретение специфически обеспечивает способ идентификации улучшенных молекул МАТ, который включает стадии:

а) выбор белка в качестве аллергенного модуля в молекулах iMAT, который представляет собой аллерген и, таким образом, имеет высокий потенциал вызывать гиперчувствительность у пораженных субъектов и, таким образом, также может быть мишенью для индукции толерантности, и

б) конструирование молекулы iMAT с указанными аллергенами, которая является термодинамически стабильной и может быть эффективно получена при использовании белковой инженерии и может подвергаться дополнительному анализу с помощью стандартных способов для того, чтобы обеспечить достаточно высокое качество (то есть идентичность, чистоту и эффективность).

В специфическом аспекте способа стадия а) включает выбор аллергена(ов) на основании поисков локальных гомологий пептидов, который имеет от данных белков по отношению к известным аллергенным белкам, экспортирование аминокислотных последовательностей белков, которые предположительно имеют аллергенные свойства, из общедоступных баз данных (например, UNIPROT), определение избыточностей путем анализа гомологий последовательностей в экспортируемом наборе данных, элиминацию высокогомологичных аналогов последовательностей (оставшиеся последовательности служили в качестве канонической базы данных последовательностей вероятных допустимых антигенов для последующего анализа), in silico расщепление белков на пептиды длиной от 6 до 15 аминокислот (со смещением одном аминокислоты), осуществление локального попарного выравнивания белков и соответствующих пептидов, масштабирование полученных при выравнивании совпадений путем установки балла самовыравнивания данного белка на уровне единицы и совпадений при выравнивании соответствующих пептидов соответственно, подсчет количества соответствий при выравнивании, которое превышает заданный порог для каждого пептида, сравнение локального попарного выравнивания для случайно сгенерированных баз данных белковых последовательностей с неизвестными аллергенными свойствами, масштабирование и подсчет совпадений, вычитание полученных значений для неаллергического белка от таких результатов для аллергена, расчет кумулятивных баллов совпадений для каждого белка на основании количества совпадений для всех соответствующих пептидов, отбор белков с наивысшими значениями в качестве кандидатов для антигенного модуля iMAT.

В специфическом аспекте способа стадия б) включает идентификацию аминокислотных замен в предварительно определенной аминокислотной последовательности, что позволяет стабилизировать предварительно определенную аминокислотную последовательность предпочтительно, который включает стадии:

(I) моделирование трехмерной/третичной структуры целевой предварительно определенной амино-

- 39 041116 кислотной последовательности, (II) итеративное определение стабильности белка на основании одноточечных замен, таких как замена цистеиновых остатков другими аминокислотными остатками, предпочтительно остатками серина и/или изолейцина, и категоризации на основе изменений свободной энергии стабильности белка (AAG) для определения стабилизирующих замен путем анализа всех доступных трехмерных/третичных структур аминокислотных последовательностей, (III) повторное моделирование замещенной трехмерной/третичной структуры аминокислотной последовательности и расчет ее стабильности путем повторения стадий (II) и (III), до тех пор, пока не будет достигнуто стабильное состояние.

Краткое описание фигур

Фиг. 1: показывает ДНС-ПААГ для MAT-Fel d1 (IVN201) при восстанавливающих условиях; А) исходный ДНС-ПААГ (10 мкг белка на дорожку, окрашивание по Кумасси) и В) ДНС-ПААГ с полосами, которые были вырезаны из геля А и повторно загружены на ДНС-ПААГ (окрашивание серебром);

Фиг. 2: показывает ДНС-ПААГ для Fel d1 при восстанавливающих условиях; NuPAGE® 4-12% BisTris гель. Дорожки: 1) Маркер: SeeBlue Plus2 предварительно окрашенный стандарт 2) 5 мкг Fel d1; 3) 5 мкг Fel dl;

Фиг. 3: показывает ВЭЖХ хроматограмму с обращенной фазой градиент 0,1% ТФК/ацетонитрил а) нативный белок (MAT-Fel d1) без добавок (левая колонка); b) MAT-Fel d1, денатурированный путем добавлений хлорида гуанидина плюс DTT (правая колонка);

Фиг. 4: показывает молекулу MAT-Fel d1 и ее диаграмму гидрофобности Кайт Дулитл;

Фиг. 5: показывает NuPAGE® ДНС-ПААГ-Систему (4-12% Bis-Tris Гели, 1х MES-буфер для прогона, 35 мин, 200 В). Дорожки: 1) Лизоцим, 1 мкг белка окисл. 2) Белок маркера PageRuler Prestained; 3) MAT-Fel d1 (5 мкг), окисленный с помощью йодацетамида (окисл.); 4) iMAT-Culо4 (окисл.); 5) Белок маркера PageRuler Prestained; 6) MAT-Fel d1 (5 мкг) восстановленный; 7) iMAT-Cul o4 восстановленный; 8) лизоцим восстановленный;

Фиг. 6: показывает ВЭЖХ хроматограмму с обращенной фазой градиент 0,1% ТФК/ацетонитрил. Пик показывает нативный (окисленный) белок (iMAT-Cul o4) без добавок;

Фиг. 7: показывает результаты следующих экспериментов: белки и Adju-Phos®, которые инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин при осторожном перемешивании. После инкубирования, образцы центрифугировали в течение 3 мин и последовательно анализировали с помощью ДСНПААГ Дорожки 1) Белок маркера pageRuler Prestained; 2) Супернатант iMAT-Cul о3; 3) Осадок iMAT-Cul о3 в Мочевине 4) Супернатант iMAT-Cul о3; 5) Осадок iMAT-Cul о3 в Мочевине; 6) пустая дорожка; 7) Супернатант iMAT-Cul o2 8) Осадок iMAT-Cul o2 в Мочевине 9) Супернатант iMAT-Cul o2 10) Осадок iMAT-Cul o2 в Мочевине; 11) пустая дорожка; 12) Супернатант iMAT-Cul o4; 13) Осадок iMAT-Cul o4 в Мочевине 14) Супернатант iMAT-Cul o4; 15) Осадок iMAT-Cul o4 в Мочевине; (2, 3, 7, 8, 12, 13 вес./об. замораживание/оттаивание); (4, 5, 9,10, 14,15 после процесса двукратного замораживания/оттаивания);

Фиг. 8: показывает диаграмму гидрофобности Кайт-Дулитл для молекулы МАТ относительно молекулы iMAT в генерической части соответствующих слитых белков [то есть, без соответствующего (их) антигенного(ых) модуля(ей)]. Индекс гидрофобности показан на оси ординат по отношению к положению аминокислоты по оси X. Положительные числа в индексе указывают на гидрофобность. Сдвиг диаграммы молекулы iMAT в начале диаграммы гидрофобности по отношению к молекуле МАТ обусловлен дополнительным присутствием N-терминальной His-метки и одного остатка метионина в молекуле iMAT, а также отсутствием какого-либо спейсерного(ых) модуля(ей);

Фиг. 9: показывает примеры аллергенов рода dermatophagoides, идентифицирующих виды, аллерген и депозитный номер uniprot. (a) Аллергены из D. pteronyssinus, (b) Аллергены из D. farinae;.

Фиг. 10: показывает выравнивание N-концевой последовательности инвариантных цепей из собаки и кота. CLIP последовательность заштрихована серым цветом;

Фиг. 11: показывает анализ высвобождения гистамина (подобности анализа приведены в примере 2) 5 концентраций iMAT-Cul o2 и iMAT-Cul о3 и соответствующих аллергенов у полисенсибилизированной лошадей (Лошадь 1).

Примеры

Приведенные ниже примеры служат для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения, но они не должны трактоваться как такие, которые ограничивают объем изобретения, которое раскрыто в данной заявке.

Пример 1. Суррогатный маркер для иммунитета/длительности иммунитета

Введение (изолированного) рекомбинантного белка, как описано и заявлено в настоящей заявке, животному, например, жвачным животным, свиньям, более предпочтительно собаке и/или коту, но исключая лошадь, вызывает иммунный ответ на аллерген и/или эпитоп, который присутствует в антигенном модуле. Кроме того, С- или N-терминальная метка, например, His-метка, ТАТ модуль вместе с соседними аминокислотными остатками из соседнего модуля используют для того, чтобы обнаружить уникальный иммунологический сигнал на специфический продукт (например, образование антител или Т

- 40 041116 клеточный ответ) у целевого субъекта, который используют в качестве суррогатного маркера иммунитета или длительности иммунитета. Это суррогатный маркер, в качестве специфического для лечения иммунологического параметра, позволяет осуществлять оценку иммунитета или модуляции иммунитета, или длительности иммунитета, или длительности иммунной модуляции после введения. Таким образом, конкретный показатель иммунного ответа, который запускается (изолированным) рекомбинантным белком в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой индукцию терминальной метки (необязательно с соседними аминокислотными остатками) специфических антител, таких как IgG антитела. В качестве альтернативы или дополнительно к этому, этот индикатор представляет собой индукцию антител, специфических к соединению спейсера и модуля, как описано и заявлено в данной заявке, или к соединению между двумя модулями.

Единичная молекула iMAT, такая как SEQ ID NO: 57 (Der f 15 молекула iMAT (собаки) с Nтерминальной Гекса-Гистидиновой меткой) или комбинация одной или нескольких молекул iMAT, выбранных из SEQ ID NOs: 45, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, содержащих различные антигенные модули в соответствии с настоящим изобретением, применяются для лечения профилактически или терапевтически собаки, страдающей от или имеющей риск развития аллергических заболеваний, в особенности атопического дерматита. У таких собак вышеописанные молекулы iMAT вводят, как описано в примере 3. В образцах сыворотки, которые имеют происхождение из крови, отобранной у этих леченных с помощью iMAT собак, можно определить иммунологическую реакцию при лечении с помощью iMAT к N-концу iMAT белков по отношению к продукции антитела, более специфически, специфические IgG. Для изменения используют техники стандартного ELISA (Твердофазный иммуноферментный анализ), для этого достаточными количествами синтезированного пептида, содержащего SEQ ID NO: 6, покрывают на поверхности ELISA планшет. После этого образцы сыворотки леченных животных инкубировали на таких планшетах и определяли специфическое связывание IgG с указанным пептидом с помощью вторичного биотинилированного антитела, специфического к IgG у котов или собак соответственно, с последующим применением соответсвующей системы для обнаружения, например стрептавидин-пероксидазы и 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМВ) в качестве субстрата.

С помощью такого анализа ELISA, определяют начало иммунного ответа, вызываемого с помощью iMAT иммунотерапии, а также продолжительность иммунитета и наблюдают в динамике. Схему терапевтической вакцинации, то есть количество и схему бустерных инъекций, определяют с помощью этого суррогатного параметра при клинических испытаниях.

Пример 2. Гипоаллергенность

Аллергенность терапевтического аллергена является чрезвычайно важной, она является показателем потенциальных возможностей индуцирования побочных эффектов, например, провоцирования анафилактической реакции. Для примера аллергии у млекопитающих, аллерген-специфическую IgE опосредованную гиперчувствительность исследуют с помощью процедур, таких как аллергеновые провокационные тесты, в особенности такие тесты, нацеленные на кожу [Griffin СЕ. Diagnosis of canine atopic dermatitis DOI: 10.1002/9781118738818.ch10]. Интрадермальные кожные тесты используют для биологической оценки рекомбинантных аллергенов и для валидации генетически сконструированных гипоаллергенных производных.

Интрадермальное тестирование на собаках осуществляют путем инъекционного введения небольших количеств растворов аллергенов непосредственно в кожу собаки. Это обычно осуществляют с помощью игл небольшого калибра (калибр игл по шкале Гейдж 27) и в каждый участок инъецируют 0,5 0,1 мл. Положительные реакции в произвольном порядке интерпретируются путем наличия эритемы, припухлости, высоты и размера аллергической папулы. Преимуществами интрадермальных тестов является высокая чувствительность. Является чрезвычайно важным, если тест будет обеспечивать количественный показатель для гипоаллергенности. В указанных тестах, молекулы МАТ проявляют в 10-, 100- 1000-раз или даже больше более высокую молярную концентрацию аллергенного компонента по сравнению с натуральным, нативным аллергеном, применяемым в аналогичном тесте, для достижения положительной реакции у чувствительных индивидуумов, например, у котов и собак.

Что касается молекул, МАТ противоречивые результаты относительно их аллергенности по сравнению с соответствующими нативными аллергенами были описаны в известном уровне техники. Senti G и др. (J Allergy Clin Immunol. 2012, 129(5):1290-1296) продемонстрировали гипоаллергенность MAT-Fel d1 в исследовании путем теста стимуляции клеточного антигена (CAST), а также в внутридермальном и во внутрикожном тесте. Количественное различие в чувствительности между аллергеном и молекулой МАТ, содержащей Fel d1 составляло 100-, 23- и 16-раз соответственно. Несмотря на то, что MAT-Fel d1 была явно гипоаллергеной, оставалась некоторая аллергенность. В отличие от этого Zhao и др. Int J Clin Exp Med 2015; 8(4):6436-6443 описали, что их МАТ-Der p1 конструкция проявляет даже еще более сильную аллергенность (гипераллергенность) по сравнению с нативным Der p1 белком.

Неожиданно улучшенные молекулы МАТ, как описано и заявлено в настоящей заявке, проявляют явное превосходство в этом аспекте. Тестировали безопасность 2 молекул iMAT, приготовленных в соответствии с настоящим изобретением, содержащих Cul o2 и Cul о3 в антигенном модуле соответственно. Свежеполученную кровь лошади, сенсибилизированной к этим аллергенам и страдающей от гипер- 41 041116 чувствительности к укусам насекомых (IBH), использовали в тесте высвобождения гистамина (HRT) как описано ниже. Как показано на фиг. 11, нативный аллергены стимулирует сильное высвобождение гистамина, в то время как, неожиданно, две различные молекулы iMAT (iMAT-Cul о3 и iMAT-Cul o2) проявляют фактически отсутствие ответа вообще.

Таким образом, молекулы iMAT проявляют явное превосходство относительно безопасности по сравнению с молекулой МАТ, как описано в известном уровне техники (см. выше).

Тест высвобождения гистамина (HRT): Свежеполученную кровь субъектов приготавливали для проверки реакционной способности базофилов на (выделенные) рекомбинантные белки/молекулы iMAT, как описано и заявлено в настоящей заявке. Вкратце серийные 10-кратные разведения (например, в пределах от 10 до 0,001 нМ конечной концентрации аллергена) молекулы iMAT и/или рекомбинантных аллергенов получали в буфере PIPES (AppliChem, Дармштадт, Германия), рН 7,4. Промытые красные и белые клетки крови, полученные из крови при ингибировании коагуляции при использовании Na-ЭДТА, инкубировали с индивидуальными разведениями в течение 1 ч при 37°С. Реакцию останавливали путем инкубации на льду в течение 20 мин и супернатант, содержащий высвобожденный гистамин, собирали из каждого образца после центрифугирования. Максимальное содержание гистамина получали путем кипячения клеток крови в течение 10 мин на водяной бане (максимальное выделение). Инкубация буфера для высвобождения с промытыми клетками крови служила в качестве отрицательного контроля (спонтанное высвобождение). Концентрацию гистамина определяли при использовании конкурентного радиоиммуноанализа (LDN Нордхорн, Германия) в соответствии с инструкциями производителя.

В качестве альтернативы еще один тест активации базофилов представляет собой анализ стимуляции клеточного антигена ELISA CAST®, который также можно рассматривать как in vitro тест провокации аллергии. Этот анализ осуществляли в соответствии с инструкциями производителя (Buhlmann Laboratories AG, Allschwil, Швейцария). В анализе CAST® осажденные из крови лейкоциты субъектов с аллергией одновременно примировали с помощью цитокина IL-3 и стимулировали при использовании молекул iMAT и/или рекомбинантных аллергенов. Клетки базофилов наряду с другими вырабатывают аллергический медиатор, сульфидолейкотриен LTC4, и его метаболиты LTD4 и LTE4. Такие свежесинтезированные сульфидолейкотриены (SLT), впоследствии подвергали оценке в тесте ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).

Потенциал молекул iMAT в отношении индукции неблагоприятных событий, например провокация анафилаксии как побочного эффекта введения, может быть оценен in vitro с помощью этих анализов путем сравнения эффектов молекулы iMAT (содержащей аллерген) по сравнению с соответствующим рекомбинантным аллергеном, взятым отдельно.

Сниженная дегрануляция базофилов, например выделение гистамина и/или сульфидолейкотриенов, при использовании молекул iMAT по сравнению с рекомбинантным аллергеном указывает на более низкий потенциал для побочных эффектов, то есть лучший профиль безопасности молекул iMAT. Указанная HRT (или CAST®) может использоваться в качестве теста in vitro провокации для 1-го типа аллергических реакций у субъекта. Специфическое для аллергена высвобождение гистамина указывает на актуальность соответствующего аллергена для активации базофильных клеток и, таким образом, может быть использовано в качестве количественного параметра для специфической для аллергена сенсибилизации субъекта.

Можно ожидать, что никаких связанных с аллергеном побочных реакций не будет наблюдаться, если субъектов, страдающих от аллерген-специфической IgE опосредованной гиперчувствительности, будут лечить с помощью соответствующих молекул iMAT, содержащих релевантные аллергены в iMATантигенном модуле. Это делает десенсибилизирующую терапию, в которой применяются iMAT белки, особенно пригодной для лечения опасных для жизни заболеваний.

Результатом такого неожиданного свойства безопасности молекул iMAT в отличие от молекул МАТ является то, что молекулы iMAT, используемые в качестве десенсибилизирующих белков, могут использоваться подобно вакцинам к патогенам. Отсутствует необходимость повышения дозировки, как это имеет место с классическими терапевтическими аллергенами, поскольку вакцины, содержащие молекулы iMAT, не проявляют аллергенных свойств по отношению к аллергическим побочным эффектам. Уже дозу первой инъекции молекулы iMAT при осуществлении курса лечения выбирают только из соображений эффективности и не принимают во внимание возможных аллергических побочных реакций. Этого нельзя осуществить при использовании молекул МАТ, описанных в известном уровне техники, поскольку аллергенность МАТ, по сравнению с нативным аллергеном, только снижается до определенного уровня. Тем не менее, молекулы МАТ все еще остаются аллергенами; молекулы iMAT в отличие от них таковыми не являются. Преимуществом такого улучшенного свойством является более эффективная схема лечения, возможная, например, с тремя подкожными или внутрилимфатическими инъекциями с высоким содержанием биофармацевтического препарата (например, 3 раза 1 до 100 мкг, предпочтительно 3 раза 10 до 50 мкг iMAT белка).

Отсутствие аллергенности молекул iMAT может быть объяснено тем фактом, что в отличие от молекул МАТ, описанных в известном уровне техники, отсутствуют линкерные аминокислотные остатки

- 42 041116

[то есть спейсерный(е) модуль(и) между первым, вторым и/или третьим модулем(ями)], используемые для разделения различных модулей в таких молекулах iMAT. Из уровня техники известно, что сконструированные слитые белки, содержащие два или больше функциональных полипептидов, соединенные пептидным или белковым линкером, имеют важное значение для функции (например, распознавание эпитопа иммунной системой) белков [Klein JS и др., Protein Eng Des Sel. 2014, 27(10): 325-330]. Разделительное расстояние между функциональными единицами может оказывать влияние на доступность эпитопа и способность связываться с авидностью. Если отсутствующие аминокислотные остатки линкера между модулями, в особенности между целевым доменом и антигенным модулем, приводит к более жесткой структуре, конформационные эпитопы аллергенового модуля не могут образовываться вследствие неправильной укладки. Перекрестное связывание антител, связываемых на поверхности базофилов (например, IgE) с помощью его рецепторов с высокой аффинностью необходимо для индукции активации и высвобождения гистамина. Тем не менее, аллергены с неправильной укладкой неспособны индуцировать такое перекрестное связывание. Таким образом, молекула iMAT без линкера не может образовывать конформационные IgE эпитопы, что делает молекулы iMAT неаллергенными.

Пример 3. Терапевтическая вакцина/профилактика атопического дерматита у собак и/или котов

Единичную молекула iMAT или комбинацию молекул iMAT, содержащих различные антигенные модули в соответствии с настоящим изобретением, применяли для лечения профилактически или терапевтически собаки и/или кота, страдающего от или имеющего риск развития атопического дерматита (AD).

В первом примере молекула iMAT в соответствии с SEQ ID NO: 36 (Der f 15) вводили в подколенный лимфатический узел котов, страдающих от атопического дерматита.

Во втором примере молекула iMAT в соответствии с SEQ ID NO: 66 (Гибрид 1) вводили в подколенный лимфатический узел котов, страдающих от атопического дерматита.

В третьем примере молекула iMAT в соответствии с SEQ ID NO: 57 (Der f 15) вводили в подколенный лимфатический узел собак, страдающих от атопического дерматита.

В четвертом примере молекула iMAT в соответствии с SEQ ID NO: 81 (Гибрид 3) вводили в подколенный лимфатический узел собак, страдающих от атопического дерматита.

В каждом случае шерсть над лимфатическим узлом пораженного животного сбривали и хирургически подготавливали. При использовании пальпации и/или под контролем УЗИ 25 G иглу вводили в лимфатический узел. Инъецируемая молекула iMAT адсорбируется на адъюванте. Адъювант состоит, например, из фосфата алюминия (Adju-Phos®, Brenntag Biosector, Дания). Маточный раствор молекулы iMAT представлял собой замороженный раствор, например, с концентрацией 375 мкг/мл белка во флаконах, каждый из которых содержал 500 мкл, для размораживания перед использованием.

После размораживания раствора молекулы iMAT 400 мкл раствора смешивали, например, с 200 мкл адъюванта. Этот заключительный препарат оставляли при комнатной температуре, например, в течение 60 мин перед внутрилимфатической инъекцией, чтобы обеспечить абсорбцию молекулы iMAT, например, на Adju-Phos®, например 50 мкл смеси, содержащей 12,5 мкг молекулы iMAT, удаляли в шприц на 500 мкл для инъекции в лимфатический узел. Этот препарат вначале вводили типично в день 0, день 28 и день 56 в дозе в диапазоне от 10 до 50 мкг (по отношению к весу только одного или нескольких антигенных модулей) на инъекцию и молекулу iMAT. На протяжении всего периода лечения и/или после него эффективность лечения или предотвращения AD исследовали клинически с помощью количественной, полуколичественной или качественной оценки зуда, поражений кожи и лекарственного средств в балах (Hobi S, Mueller RS; Tierarztliche Praxis. Ausgabe K, Kleintiere/ Heimtiere 2014, 42(3):167-173).

Эти клинические параметры сравнивали с клиническими симптомами индивидуальной собаки и/или кошки перед началом терапевтического вмешательства. Альтернативно, сравнение с собаками и/или котами, которые страдают от AD, но которых не лечили или лечили с помощью плацебо, может продемонстрировать эффективность лечения и/или предотвращения клинических признаков AD, опосредованных молекулой iMAT.

Альтернативно или дополнительно, интрадермальный провокационный тест с определенными аллергенами dermatophagoides может применяться у указанных собак и/или котов. Сниженная реакция (немедленная и/или поздняя фаза реактивности) указывает на терапевтический и/или профилактический эффект введения молекулы iMAT.

Кроме того, модуляцию различных компонентов иммунной системы мониторят, например, изменение титров специфических для аллергена IgE и IgG антител свидетельствует о терапевтическом и/или профилактическом эффектах. Помимо изменений уровней IgE, неожиданно было обнаружено увеличение специфического для аллергена IgG при лечении собаки и/или кошки от AD при использовании молекулы iMAT. Эти антитела блокируют опосредованную IgE анафилаксию in vivo, и, как предполагается, ингибируют не только индуцированное аллергеном высвобождение медиаторов воспаления из базофилов и тучных клеток, а также опосредованную IgE презентацию аллергена Т-клеткам. Среди индуцированных молекулами iMAT IgG антител, которые специфически связываются с аллергеном, некоторые специфические для аллергена подтипы, как предполагается, могут играть важную защитную роль, посколь- 43 041116 ку они конкурируют со специфическими для аллергена IgE антителами и могут предотвратить активацию CD4 Т-клеток путем ингибирования опосредованной IgE презентации антигена. Кроме того, подмножество IgG, который секретируется, способствует значительному снижению количества тучных клеток и эозинофилов, что сопровождается уменьшением высвобождения медиаторов воспаления.

Специфическая для аллергена иммунотерапия может модулировать различные компоненты иммунной системы. Клеточные изменения включают в себя уменьшение индуцированной аллергеном пролиферации Т-клеток, что указывает на индукцию периферической толерантности в специфических для аллергена Т-клетках и уменьшение специфического для антигена Th2-доминирующего иммунного ответа в пользу реакции Th1 с увеличением продукции IFN-γ. Ключевой тип клеток, который отвечает за координацию этого иммунологического переключения, представляет собой гетерогенную популяцию Т-клеток, называемых регуляторными Т-клетками (T_reg). На клеточном уровне решающим фактором для успешной аллергенной иммунотерапии является периферическая индукция 1-го типа T_reg клеток. Функциональные исследования, которые проводили на T_reg клетках 1-го типа, специфических для узнавания антигенов, показали, что модуляция Th1 и Th2 ответов на Treg клетки 1-го типа в основном зависит от секреции цитокина IL-10, который имеет иммуносупрессивные свойства. Действительно, IL-10 ингибирует пролиферативный ответ периферических Т-клеток против специфических аллергенов и играет центральную роль в индукции Т-клеточной анергии. In vitro IL-10 усиливает экспрессию регуляторного фактора FoxP3, модулирует функцию эозинофилов и снижает количество провоспалительных медиаторов, которые высвобождаются тучными клетками.

Другой возможный маркер исключительно хорошей клинической эффективности указанной иммунотерапии, опосредованной молекулами iMAT, представляет собой определение изменения количества или характера специфических для аллергена Т-клеток. В соответствии с этим, например, исследование окрашивания Bet v1 тетрамера, уровней и характеристик циркулирующих специфических для пыльцы березы CD4+ Т-клеток может потенциально сопоставляться с таковыми до и после SIT. В последнее время трансформирующий фактор роста (TGF)-e также был определен в качестве ключевого цитокина в успешном осуществлении SIT. Многие действия могут быть учтены для определения его релевантности, такие как подавление специфических Th1, Th2 и Th17 клеток, индукция FoxP3 и супрессорной функции T_reg. Кроме того, TGF-β подавляет экспрессию FcεRI на клетках Лангерганса и подавляет синтез IgE. Эти иммунологические ответные реакции, опосредованные иммунологически релевантными Т-клетками, могут быть измерены в экспериментах ex vivo, применяя культуры мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) и обнаружения их цитокинов, как описано Nuttall и др. (T.J. Nuttall и др., Veterinary immunology and Immunopathology 84 (2002); 143-150).

Пример 4. Сравнение молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением с молекулой МАТ уровня техники в соответствии с WO 2004/035793 (эквивалентная заявка США US 2005/0281816)

Для оценки чистоты белка МАТ проводили электрофорез в полиакриламидном геле при использовании додецилсульфата натрия (ДСН-ПАГЭ) (Thompson J и др., J Biol Chem 2002, 277: 34310-343). Способ, включающий подготовку образцов в присутствии восстанавливающего агента, додецилсульфата лития (LDS) и нагревании при 75°С, приводит к получению воспроизводимых нескольких четких полос после электрофоретического разделения. Окрашивание при использовании Кумасси голубого дает линейные количественные (денситометрия) характеристики гелей, загруженных 200-1000 нг белка. При использовании моноклонального антитела, определяющего аллергенный модуль в молекуле МАТ с Fel d1 в качестве аллергенного модуля (MAT-Fel d1), было показано, что основная полоса и 13 мелких полос все содержат белок MAT-Fel d1. Небольшие полосы мигрируют в том же положение, что и на исходном геле, также после повторной загрузки на гель (фиг. 1). Несколько различных методов, таких как различные режимы температуры и прописи состава буфера для подготовки образца перед началом ПАГЭ, обеспечивают получение одного и того же изображения полосы.

Во всех этих полосах наличие белка MAT-Fel d1 полной длины (цельный) и только следов белков клетки-хозяина может быть продемонстрировано после того, как каждую полосу вырезают из геля, переваренного трипсином, и затем подвергают анализу с помощью масс-спектрометрии (нано ЖХ/ЭРИ-МС). Из этих экспериментов можно сделать вывод об аномальной особенности (сдвиг геля), например, различных вариантов сворачивания MAT-Fel d1 в ДСН-ПАГЭ. Это означает, что MAT-Fel d1 в анализируемом препарате не является приемлемым в качестве биофармацевтической молекулы, в частности, для клинического и/или коммерческого биофармацевтического производства, так как его чистота не может быть определена с помощью стандартных методов (например, ДСН-ПАГЭ), но только с помощью модифицированной процедуры, описанной выше.

В отличие от этого явления сдвига геля MAT-Fel d1 молекулы, Fel d1 как таковой не проявляет такую аномальную функцию в ДСН-ПАГЭ (фиг. 2, дорожки 2 и 3). Fel d1 демонстрирует одну четкую полосу при ожидаемой молекулярной массе (19,6 кДа).

Еще одну аномальную особенность можно наблюдать при анализе при использовании ВЭЖХ с обратной фазой. Ни одного пика MAT-Fel d1 не наблюдали в данном аналитическом методе (фиг. 3), а также не наблюдали ни одного белка как в нативной конформации, так и в денатурированной форме, инду- 44 041116 цированной хаотропными и восстанавливающими условиями. Тем не менее для GMP сертифицированного биофармацевтического изготовления наличие одной изоформы биомолекулы в продаваемых фармацевтических препаратах является обязательным.

Эти наблюдения в ДСН-ПАГЭ и анализе ВЭЖХ с обратной фазой можно объяснить физикохимическими свойствами на основе аминокислотной последовательности. Анализ диаграммы гидрофобности Кайт и Дулитл [Kyte J, Doolittle RF, Journal of Molecular Biology 1982, 157(1), 105-132] выявил соседние крайние гидрофобные и гидрофильные домены (фиг. 4), которые могут быть ответственны за это аномальное поведение.

В частности, гидрофобный участок нацеливающего домена слитого белка является подобным трансмембранным сегментам мембранных белков, которые являются известными в данной области техники, чтобы вызвать такую аномальную функцию [Rath А и др., Proc Natl Acad Sci USA. 2009, 106(6): 1760-1765].

Миграция на ДСН-ПАГЭ, которая не коррелирует с молекулярной массой формулы, называемая сдвиг геля, как представляется, является общей для мембранных белков. Это означает, что предписанный метод ДСН-ПАГЭ, который представляет собой разделение молекул исключительно в соответствии с их молекулярной массой, независимо от их нативной 2D- или 3D-структуры, не применяется в этих случаях. В приведенной выше работе (PNAS статья) авторы исследуют аномальную подвижность геля для спиральных мембранных белков при использовании библиотеки дикого типа и мутантных последовательностей спираль-петля-спираль (шпилька), которые имеют происхождение от трансмембранных сегментов 3 и 4 муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости человека (CFTR), включая связанные с болезнью фенотипические замены остатков. Они обнаружили, что эти шпильки мигрируют при скоростях от минус 10 до плюс 30% по сравнению с молекулярными массами в соответствии с фактическими формулами на основе ДСН-ПАГЭ и загружали детергент при соотношении от 3,4-10 г ДСН/г белка. Кроме того, они показали, что сдвиги мутантных гелей сильно коррелируют с изменениями в загрузочной способности шпильки ДСН и со спиральностью шпильки, что свидетельствует о том, что поведение сдвига геля возникает при измененном связывании детергента. В некоторых случаях эта дифференциальная сольватация при использовании ДСН может быть результатом замещения контактов белок-детергент контактами белок-белок, что подразумевает тот факт, что связывание детергента и свертывание являются тесно связанными друг с другом. ДСН-ПАГЭ (фиг. 5), а также анализ ВЭЖХ с обратной фазой (фиг. 3 и 6) МАТ и iMAT белков выявили существенные различия в модели миграции или элюирования, соответственно. Окисленные формы MAT-Fel d1 не показали ни одной четкой полосы на геле ДСН-ПАГЭ (дорожка 3), но продемонстрировали несколько размытых полос с большими и меньшими кажущимися молекулярными массами, чем фактическое значение 32,2 кДа для MAT-Fel d1. В отличие от этого в качестве примера молекула iMAT с антигенным модулем аллергена culicoides obsoletus (iMATCul o4) продемонстрировала одну четкую полосу (М = 41,6 кДа) в окисленных условиях. Кроме того, хроматограмма ВЭЖХ с обратной фазой показала единственный пик (фиг. 6). При восстанавливающих условиях молекула MAT-Fel d1 в ДСН-ПАГЭ выявила основную полосу, которая мигрировала при приблизительно известной молекулярной массе, но в дополнение к этому вновь возникало несколько минорных полос, описанных на фиг. 1, которые были известны как такие, которые содержат полную последовательность MAT-Fel d1 (фиг. 5, дорожка 6). Это признак, который является характерным для аномальной особенности MAT-Fel d1. В дополнение к этому хроматограмма ВЭЖХ с обратной фазой для MATFel d1 при восстанавливающих условиях (фиг. 3, правый график) демонстрирует, по крайней мере, 3 различных изоформы MAT-Fel. В противовес этому молекулы iMAT выявляют характеристики, которые, очевидно, являются показательными для единственной изоформы в ДСН-ПАГЭ (фиг. 5, дорожка 7), а также в ВЭЖХ с обратной фазой (фиг. 6).

Восстанавливающие условия приводят к расщеплению дисульфидных мостиков в молекуле МАТ, и, таким образом, молекулы МАТ и iMAT должны вести себя подобным образом при восстанавливающих условиях, если дисульфидные мостики являются ответственными исключительно за аномальные характеристики МАТ. Тем не менее, это не так, поскольку аномальный сдвиг геля и появление изоформ в ВЭЖХ с обратной фазой при исследовании молекулы МАТ по-прежнему присутствует при восстанавливающих условиях. Тем не менее, молекула iMAT не проявляет такого сдвига геля и имеет пик в хроматограмме ВЭЖХ с обратной фазой в нативной (окисленной) форме белка. Кроме того, диаграммы гидрофобности Кайт и Дулитл молекул МАТ и iMAT практически идентичны на N-терминальном конце, охватывающем последовательность His-метки, ТАТ и нацеливающего домена (фиг. 8). Таким образом, специалист в данной области техники не будет мотивирован конструировать молекулу МАТ в соответствии с известным уровнем техники с остатками цистеина, замещенными другими аминокислотными остатками с тем, чтобы преодолеть недостатки известного уровня техники.

Молекулы iMAT могут быть сконструированы в соответствии с процедурами биоинформационного инжиниринга в соответствии с примером 5, приведенным ниже, и получены с помощью рекомбинантной технологии экспрессии в E.coli. В качестве примера три молекулы iMAT, как показано на фиг. 7, были стабильными в буфере (20 мМ цитрата, 1 М аргинина, рН 6,0), после двукратного замораживания и оттаивания и могут быть адсорбированы на Adju-Phos® (Brenntag, Дания) в качестве адъюванта, так что

- 45 041116 молекулы iMAT могут быть использованы в качестве вакцины. Эти белки могут быть десорбированы из

Adju-Phos® при отсутствии деградации в той же буферной системе (фиг. 7).

Пример 5. Биоинформационный инжиниринг молекул iMAT: Отбор белков для антигенного модуля и оптимизация полной молекулы iMAT

Для того чтобы эффективно лечить, например, собак и/или котов с аллергическими нарушениями с помощью iMAT технологии, дополнительно является целесообразным:

а) выбрать белок в качестве аллергенного модуля в молекулах iMAT, который представляет собой аллерген и, таким образом, имеет высокий потенциал вызывать гиперчувствительность у пораженных субъектов и, таким образом, также может быть мишенью для индукции толерантности, и

б) сконструировать молекулу iMAT с указанными аллергенами, которая является термодинамически стабильной и может быть эффективно получена при использовании белковой инженерии и может подвергаться дополнительному анализу с помощью стандартных способов для того, чтобы обеспечить достаточно высокое качество (то есть идентичность, чистоту и эффективность).

Для выполнения этих требований выбран биоинформационный подход к выбору аллергена, подлежащего включению в молекулу iMAT в соответствии с настоящим изобретением. Целью отбора является (I) выбрать один или более аллергенов, которые предполагаются как релевантные для данного аллергического нарушения, т.е., чтобы большинство индивидуумов, страдающих от аллергического нарушения, подвергалось сенсибилизации в отношении соответствующего аллергена, и (II) выбрать аллерген с наибольшей вероятностью включения характеристик линейных эпитопов аллергена, т.е. включения большого числа коротких пептидных последовательностей (от 7 до 13 аминокислотных остатков), гомологичных таковым для опубликованных аллергенов.

Для того чтобы выбрать соответствующие антигены для фармацевтических препаратов, было выбрано сравнение гомологии на основе локальных выравниваний с последовательностями известных аллергенов. Часто обнаружение эпитопа для распознавания антителом (в основном конформационные эпитопы) достигается за счет функционального анализа (например, микрочипы), а для эпитопов Т-клеток (линейные эпитопы) путем подсчета вероятности связывания пептида с МНС молекулами. Терапевтический принцип iMAT технологии, среди прочих, основывается на эндоцитозе и деградации под действием кислотно-зависимых протеаз в эндосомах с последующим связыванием классом II МНС и презентацией антигена. Таким образом, другой - не экспериментальный, но биоинформационный подход выбран для отбора аллергена, который основывается на локальных поисках гомологии пептидов, которые имеют происхождение от данных белков, по отношению к известным аллергенным белкам, большинство из которых, как известно, вызывают аллергию у людей. Аминокислотные последовательности белков, которые предполагаются как такие, которые имеют аллергенные свойства, экспортированы из общедоступных баз данных (например, UNIPROT) и избыточность определена путем анализа гомологии последовательностей в экспортируемом наборе данных. Высоко гомологичные аналоги последовательности были устранены, и полученные оставшиеся последовательности служили в качестве канонической базы данных последовательностей вероятных допустимых антигенов для последующего анализа. Для определения белков с путативно высоким аллергенным потенциалом, белки in silico подвергали расщеплению на пептиды с длиной от 6 до 15 аминокислот со смещением одной аминокислоты.

Затем проводили последующее попарное выравнивание, например, для белков dermatophagoides и соответствующих пептидов с базой данных канонических последовательностей. После этого проводили масштабирование полученных при выравнивании совпадений путем установки балла самовыравнивания данного белка на уровне единицы, и совпадений при выравнивании соответствующих пептидов, соответственно. Далее количество соответствий при выравнивании, которые превышали заданный порог, подсчитывали для каждого и сравнивали пептид путем локального попарного выравнивания для случайно сгенерированных баз данных белковых последовательностей без известных аллергенных свойств, а затем подвергали масштабированию и подсчету. Полученные значения для неаллергического белка вычитали из таких результатов для аллергена и подсчитывали кумулятивные баллы совпадений для каждого белка на основе количества совпадений для всех соответствующих пептидов. Белки с самыми высокими значениями выбирали в качестве кандидатов для антигенного модуля iMAT.

Каждый из отобранных аллергенов интегрировали в отдельную iMAT молекулу в качестве антигенного модуля и после этого полную молекулу iMAT оптимизировали для термодинамической устойчивости путем итеративного моделирования трехмерной структуры белков и вычисление изменений свободных энергий после замены единичных аминокислот. Физико-химические свойства и стабильность подвергались влиянию путем замены различных аминокислотных остатков в пределах первичной аминокислотной последовательности.

Результаты описанных в данной заявке анализов (поиск антигена и моделирование) трансформировали в аминокислотные последовательности iMAT, приемлемые для фармакологического производства и применения. В специфическом примере с помощью этого подхода биоинформационного инжиниринга идентифицировали Zen 1 и Der f 15 как релевантные для аллергического нарушения - атопического дерматита, вызываемого белками, которые имеют происхождение из видов клещей dermatophagoides farinae. Кроме того, с помощью биоинформативного анализа обнаружены стабильные молекулы iMAT с цистеи- 46 041116 нами, замененными другими аминокислотными остатками. Примеры таких стабильных молекул iMAT представляют собой SEQ ID NO: 39 (Zenl собаки) и SEQ ID NO: 57 (Der f 15 собаки).

Пример 6 - Конструирование мозаичных молекул iMAT в соответствии с изобретением

Предполагается, что молекула iMAT в соответствии с изобретением дополнительно улучшается, если компонент более чем одного аллергена включен в антигенный модуль. Для этой цели можно применять основной принцип описанного выше биоинформационного подхода к отбору (пример 5) иным образом. Вместо отбора полных аллергенов на основе подсчета совпадений пептидов аллергенов, обнаруженных в базе данных аллергенов, только наиболее часто встречающиеся пептиды нескольких из таких аллергенов используются для конструирования антигенного модуля iMAT. Таким образом, такая iMAT молекула состоит из пептидов антигенного модуля, которые имеют происхождение от нескольких аллергенов. Это позволяет расширить спектр одной молекулы iMAT по отношению к ее целевому аллергическому профилю и, таким образом, это является полезным для разработки фармакологического препарата.

Для того, чтобы найти короткие пептидные последовательности, которые соответствуют критериям для такой мозаичной iMAT молекулы, белки, например, из dermatophagoides, были проанализированы путем сравнения гомологии, как описано выше. Вкратце, in silico расщепленные белки с длиной пептида 6-15 аминокислотных остатков локально подвергали выравниванию с базой данных канонических последовательностей связанных с аллергенами белков и случайным образом сгенерированной базой данных, не связанных с аллергией белков. Определяли ряд отличий существенных гомологии для каждого пептида, найденного в канонической базе данных. Впоследствии каждый пептид подвергали локальному выравниванию со случайным образом сгенерированной базой данных увеличивает втрое размер канонической базы данных, чтобы уменьшить число ложных положительных совпадений. Верхняя часть (например, десятый процентиль) оставшихся гомологии для каждой длины пептида является особенно приемлемой для того, чтобы служить в качестве основы для проведения конструирования мозаичных или гибридных молекул iMAT, которые несут аллерген. Для конструирования мозаичной молекулы iMAT белка выбирали предшественника (например, из списка белков-предшественников, занимающих верхние позиции рейтинга) в качестве каркасного белка для введения пептидов топ рейтинга. При этом удаляется сигнальная пептидная последовательность из каркасного белка, и пептиды топ рейтинга, необязательно, с дополнительными смежными N- или С-терминальными аминокислотами, могут встраиваться в исходную последовательность каркасного белка или могут заменять части исходной последовательности каркасного белка. Положение для вставки или замены определяется при использовании подобия или референтного положения пептида в соответствующем белке предшественника. В качестве следующего шага, добавляются His-метка, ТАТ и домен нацеливания. В завершение, остатки цистеина заменяются наиболее стабилизирующими остатками, как описано выше.

В специфическом примере (гибрид 1), с помощью этого подхода биоинформационного инжиниринга идентифицировали комбинацию SEQ ID NO: 84 (A1KXC1_DERFA DFP1 OS=Dermatophagoides farina), SEQ ID NO: 10 (Q86R84_DERFA 60 кДа аллерген Der f 18p OS=Dermatophagoides farinae GN=Der f 18 PE=2 SV=1), SeQ ID NO: 85 (A0A088SAS1DERFA Der f 28 аллерген OS=Dermatophagoides farinae PE=2 SV=1), SEQ ID NO: 88: (A7XXV2_DERFA Der f 2 аллерген OS=Dermatophagoides farinae PE=4 SV=1), SEQ ID NO: 86 (B7U5T1_DERFA Der f 6 аллерген OS=Dermatophagoides farinae PE=2 SV=1), SEQ ID NO: 87 (T2B4F3_DERPT LytFM OS=Dermatophagoides pteronyssinus GN=lytFM PE=4 SV=1), SEQ ID NO: 11 (Q9U6R7_DERFA 98 кДа HDM аллерген OS=Dermatophagoides farinae PE=2 SV=1) которая является релевантной для аллергического нарушения - атопического дерматита, вызываемого белками, которые имеют происхождение из видов клещей dermatophagoides farinae. Кроме того, с помощью биоинформативного анализа обнаружены стабильные молекулы iMAT с цистеинами, замененными другими аминокислотными остатками. Примерами таких стабильных молекул мозаичные молекулы iMAT являются SEQ ID NOS: 75 (Гибрид 1 собаки) и SEQ ID NO: 66 (Гибрид 1 кошки).

Пример 7 — Терапевтическая вакцина/профилактика аллергической астмы у котов

Одна молекула iMAT или комбинация молекул iMAT, содержащих различные антигенные модули, в соответствии с настоящим изобретением, могут применяться для лечения профилактически или терапевтически кота (кошки), страдающего от или имеющего риск развития аллергической астмы. У котов молекулы iMAT в соответствии с настоящим изобретением вводят, как описано в примере 3.

Взрослых котов с известной из анамнеза аллергической астмой включали в исследование, то есть котов, для которых описано проявление таких клинических признаков, как приступы спастического кашля, свистящее дыхание и одышка с затруднением выдоха.

Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF) собирали перед началом лечения и, например, 2, 3, и 6 месяца во время /после исследования. BALF использовали для цитологического исследования и подсчета ядросодержащих клеток. Котов усыпляли, например, с помощью кетамина НИ внутривенно. Жидкость бронхоальвеолярного лаважа собирали путем осторожного вставления, например, полипропиленового катетера 7 Fr (френч) через эндотрахеальную трубку. После достижения ощущения сопротивления, через катетер проводили лаваж вплоть до 20 мл аликвоты нагретого стерильного солевого раствора и отбирали обратно путем ручного отсасывания. После центрифугирования и ресуспендирования, приго- 47 041116 тавливали цитологический мазок собранных BALF клеток, присутствие значительного количества эозинофилов является подтверждением диагноза кошачьей астмы. При подсчете отдельных видов клеток можно количественно оценить соотношение (%) эозинофилов в BAL жидкостях.

Альтернативно или дополнительно, применяя определенные рекомбинантные аллергены, интрадермальный провокационный тест, кожную инъекционную пробу или также аллерген-специфическое IgE и/или IgG определение в BAL жидкости или сыворотки, можно мониторить в указанных котов (Norris и др., Vet Immunol Immunopathol. 2003, 96(3-4): 119-127). Уменьшение ответной реакции (незамедлительное и/или реакционная способность поздней фазы) и/или изменения титров антител указывает на эффективность терапии и/или предотвращения при лечении молекулами iMAT.

Использовали клинические симптомы, такие как частота дыхания и баллы для оценки дыхательного усилия/затруднения. Указанную систему респираторных баллов также можно применять, например, в ответ на ингаляторную провокацию. Вкратце котов, которые дышат самостоятельно и находятся в сознании, герметической камере подвергали воздействию аэрозольных рекомбинантных аллергенов в течение различных временных промежутков и/или различных концентраций. Альтернативно, можно определять количественные показатели гиперреактивности дыхательных путей у анестезированных котов.

Измерения пневмотахографом можно осуществлять на момент включения в исследование и в бронхо-провокационном протоколе, например, дозозависимый эффект легочной резистентности на метахолин и/или выбранные рекомбинантные аллергены.

Таким образом, на протяжении всего периода лечения и/или после него эффективность лечения или предотвращения аллергической астмы исследовали клинически с помощью количественной, полуколичественной или качественной оценки.

Параметры могут сравнивать для индивидуального кота с тяжестью перед началом терапевтического вмешательство. Альтернативно, сравнение с котами с аллергической астмой, которых не лечили или лечили с помощью плацебо, демонстрирует эффективность лечения и/или предотвращения клинических симптомов кошачьей аллергической астмы, опосредованного молекулами iMAT.

Пример 8. Терапевтическая вакцина/профилактика аллергии, вызванной мелкими насекомыми, у котов и/или собак

Единичную молекулу iMAT или комбинацию молекул iMAT, содержащих различные антигенные модули в соответствии с настоящим изобретением, можно применять для лечения профилактически или терапевтически кота и/или собаки, страдающего или имеющего риск развития атопического дерматита на укусы блох.

В первом примере молекулу iMAT в соответствии с SEQ ID NO: 42 (Cte f 1 кошки) вводили в подколенный лимфатический узел котов, страдающих или имеющих риск развития атопического дерматита на укусы блох. Во втором примере молекулу iMAT в соответствии с SEQ ID NO: 63 (Cte f 1 собаки) вводили в подколенный лимфатический узел собак, страдающих или имеющих риск развития атопического дерматита на укусы блох. Другие детали лечения были такими, как описано в примере 3 выше. Эффективность указанного iMAT лечения оценивали с помощью интрадермального теста (IDT), Т-клеточных анализов и измерения блошиных аллерген-специфических IgE и IgG (Gerber J.D. Vaccine 1990-128(6):536-542) у леченных котов и/или собак перед и после iMAT лечения, как описано Jin (Jin J и др., Vaccine 28 (2010) 1997-2004). Интрадермальные тесты (IDTs) осуществляли согласно протоколу Hillier и DeBoer, (DeBoer D.J., Hillier, A. Veterinary Immunology and Immunopathology 2001, 81 (3-4), 271-276). Через 4 недели после последней иммунизации котам и/или собакам инъецировали 100 мкл PBS, содержащего 100 мкг блошиного экстракта, в кожу в латеральной грудной области котов и/или собак интрадермально; гистамин использовали в качестве положительного контроля, BSA использовали в качестве иррелевантного стимулятора, и солевой раствор использовали в качестве отрицательного контроля. Размер реактивного волдыря на коже отмечали маркерным карандашом и измеряли перпендикулярно и горизонтально через 20 мин после провокации с помощью микрометра. Результаты рассчитывали в виде среднего значения для трех измерений. Уменьшение ответной реакции (немедленная и/или в поздней фазе реактивность) и/или изменения титров антител или Th1 или Treg скошенных Т-клеточных ответов указывает на терапевтические и/или профилактические эффекты лечения с применением молекулы iMAT.

-

Claims (15)

1. Ссылки (1) 3^rd Havemeyer workshop, Holar, Iceland, June 2007, Veterinary Immunology and Immunotherapy 2008, 126: 351-361 (2) Allergome (www.allergome.org) (3) Crameri R. и др., Allergy 2007, 62: 197-206 (4) DeBoer, D.J., Hillier, A. Veterinary Immunology and Immunopathology 2001, 81(3-4): 271-276 (5) Gadermaier G и др., Molecular Immunology 2010, 47: 1292-1298 (6) Gerber ,J.D. Vaccine 1990-12- 8(6):536-542 (7) Griffin CE. Diagnosis of canine atopic dermatitis in Veterinary Allergy DOI:

   10.1002/9781118738818. chlO (8) Guaguere E и др. EJCAP, 2009, 19 (3), 234-241 (9) Hill и др. Vet Immunol Immunopathol, 2001;81(3-4): 169-186 (10) Hobi S, Mueller RS; Tierarztliche Praxis. Ausgabe K, Kleintiere/ Heimtiere

   2014, 42(3):167-173 (11) Jackson HA, EJCAP, 2009, 19 (3), 230-233 (12) Jin J. и др. Vaccine 2010, 28: 1997-2004 (13) Klein JS и др., Protein Eng Des Sei 2014, 27(10): 325-330 (14) Kyte J, Doolittle RF, Journal of Molecular Biology 1982, 157(1): 105-132 (15) Martinez-Gomez JM и др., Allergy 2009, 64(1): 172-178 (16) McCall С и др., Vet Immunol Immunopath 2001;78:231-247 (17) McDermott MJ и др. Molecular Immunology 2000, 37: 361-375 (18) Norris и др., Vet Immunol Immunopathol. 2003, 96(3-4): 119-127 (19) Nuttall T.J. и др., Veterinary immunology and Immunopathology 2002; 84:

   143-150 (20) Pires DE и др. Bioinformatics 2014,30(3): 335-342 (21) Prost C, Rev Fr Allergol Immunol Clin, 2008, 48(5), 409-413 (22) Rath А и др., PNAS 2009, 106(6): 1760-1765 (23) Rose H, Arb Paul Ehrlich Inst Bundesinstitut Impfstoffe Biomed Arzneim

   Langen Hess 2009, 96: 319-327 (24) Senna G и др., Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2011, 11(4):375-380 (25) Senti G и др., J Allergy Clin Immunol. 2012, 129(5): 1290-1296 (26) SIAF Annual Report 2010 (27) SIAF Annual Report 2011 (28) Thomas WR и др., Chang Gung Med J 2004; 27: 563-569 (29) Thompson J и др., J Biol Chern 2002, 277: 34310-34331 (30) US 2005/0281816 (31) US 7,629,446 (32) US 7,653,866 (33) WHO PD-VAC 2014 - Status of Vaccine Research and Development of

   Vaccines for Leishmaniasis (34) WO 2004/035793 (35) Zhao и др. Int J Clin Exp Med 2015;8(4):6436-6443

   ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Молекула модульного транспортера антигена (МАТ), предназначенная для лечения или профилактики одной или нескольких аллергий у животных, исключая лошадей, включающая:

   (I) один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы МАТ из внеклеточного пространства внутрь клеток, (II) один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы МАТ на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов, и/или нагрузку МНС молекул антигенами, (III) один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по меньшей мере от одного эпитопа по меньшей мере одного аллергена, который определяет специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы МАТ,

   - 49 041116 где указанный первый модуль включает SEQ ID NO: 1;

   где второй модуль состоит из SEQ ID NOs: 4 или 5 и где третий модуль состоит из любой последовательности, представленной в SEQ ID NOs: 14-23.
2. 2. Молекула МАТ по п.1, где третий модуль включает SEQ ID NO: 18.
3. 3. Молекула МАТ по п.1, где все модули ковалентно связаны друг с другом и где никакого(никаких) дополнительного(ых) спейсерного(ых) модуля(ей) между двумя или более соседними модулями из указанного первого, второго и/или третьего модулей не присутствует.
4. 4. Молекула МАТ по п.1, которая дополнительно включает один модуль His-метки на Nтерминальном конце и/или С-терминальном конце, предпочтительно одну His-метку на N-терминальном конце после одного остатка метионина.
5. 5. Молекула МАТ по п.1, которая включает любую из последовательностей SEQ ID NO: 24-83.
6. 6. Молекула МАТ по п.5, где указанная последовательность включает SEQ ID NO: 36 (Der f15 молекула MAT кошки), SEQ ID NO: 37 (Der f15 молекула MAT кошки), SEQ ID NO: 38 (Der f15 молекула MAT кошки), SEQ ID NO: 57 (Der f15 молекула MAT собаки), SEQ ID NO: 58 (Der f15 молекула MAT собаки), SEQ ID NO: 59 (Der f15 молекула MAT собаки).
7. 7. Молекула MAT по п.5, которая содержит SEQ ID NO: 68 или SEQ ID NO: 77.
8. 8. Молекула модульного транспортера антигена (MAT), предназначенная для лечения или профилактики одной или нескольких аллергий у животных, исключая лошадей, включающая:

   (I) один первый модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять транслокацию молекулы МАТ из внеклеточного пространства внутрь клеток, содержащий SEQ ID NO: 1;

   (II) один второй модуль, который имеет аминокислотную последовательность, которая позволяет осуществлять специфическое для вида внутриклеточное нацеливание молекулы МАТ на органеллы клетки, которые являются вовлеченными в процессинг антигенов и/или нагрузку МНС молекул антигенами, включающий SEQ ID NO: 4 или 5; и (III) один третий модуль в качестве антигенного модуля, который имеет аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности любой комбинации двух или более аллергенов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 84, 85, 86, 87 и 88, которые определяют специфичность иммунного ответа, модулируемого с помощью такой молекулы МАТ, где, по меньшей мере, в антигенных модулях все цистеиновые остатки замещены различными аминокислотными остатками.
9. 9. Молекула МАТ по п.8, где антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности любой комбинации двух или более аллергенов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, 11, 84, 85, 86, 87 и 88 (Гибрид 1), или где антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности любой комбинации двух или более аллергенов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 и 12 (Гибрид 2), или где антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение по меньшей мере от одной полной или частичной аминокислотной последовательности любой комбинации двух или более аллергенов, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 10 и 11 (Гибрид 3).
10. 10. Молекула МАТ по п.9, где антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность на основании каркаса, которая имеет происхождение SEQ ID NO: 84, содержащую любую комбинацию одного или нескольких пептидов в соответствии с SEQ ID NOs: 91-96, встроенных в указанную каркасную последовательность, или где антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение из любой комбинации двух или более пептидов в соответствии с SEQ ID NOs: 97-102, или где антигенный модуль представляет собой аминокислотную последовательность, которая имеет происхождение из любой комбинации двух или более пептидов в соответствии с SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 102.
11. 11. Молекула модульного транспортера антигена (МАТ), предназначенная для лечения или профилактики одной или нескольких аллергий у животных, исключая лошадей, включающая аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 36 (Der f15 молекула МАТ кошки), SEQ ID NO: 37 (Der f15 молекула MAT кошки), SEQ ID NO: 38 (Der f15 молекула MAT кошки), SEQ ID NO: 57 (Der f15 молекула MAT собаки), SEQ ID NO: 58 (Der f15 молекула MAT собаки), SEQ ID NO: 59 (Der f15 молекула MAT собаки), SEQ ID NO: 66 (гибрид 1 MAT кошки), SEQ ID NO: 67 (гибрид 1 MAT кошки), SEQ ID NO: 68 (гибрид 1 MAT кошки), SEQ ID NO: 75 (гибрид 1 MAT собаки), SEQ ID NO: 76 (гибрид 1 MAT собаки) и/или SEQ ID NO: 77 (гибрид 1 MAT собаки).
12. 12. Иммуногенная композиция, содержащая молекулу МАТ по любому из пп.1-11.
13. 13. Вакцина для лечения или профилактики одной или нескольких аллергий у животных, исключая лошадей, содержащая молекулу МАТ по любому из пп.1-11.
14. 14. Нуклеиновая кислота, которая кодирует молекулу МАТ по любому из пп.1-11.
15. 15. Вектор, обеспечивающий экспрессию молекулы МАТ по любому из пп.1-11, который содержит

    -